CZ278551B6 - Polymeric medicament, process for preparing thereof and pharmaceutical compositions based thereon - Google Patents
Polymeric medicament, process for preparing thereof and pharmaceutical compositions based thereon Download PDFInfo
- Publication number
- CZ278551B6 CZ278551B6 CS8597A CS9785A CZ278551B6 CZ 278551 B6 CZ278551 B6 CZ 278551B6 CS 8597 A CS8597 A CS 8597A CS 9785 A CS9785 A CS 9785A CZ 278551 B6 CZ278551 B6 CZ 278551B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gly
- phe
- leu
- mol
- polymer
- Prior art date
Links
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 110
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 107
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 claims abstract description 71
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 46
- -1 p-nitrophenyl ester Chemical class 0.000 claims abstract description 28
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims abstract description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 3
- STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 7-Cyan-hept-2t-en-4,6-diinsaeure Natural products C1=2C(O)=C3C(=O)C=4C(OC)=CC=CC=4C(=O)C3=C(O)C=2CC(O)(C(C)=O)CC1OC1CC(N)C(O)C(C)O1 STQGQHZAVUOBTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N Daunomycin Natural products CCC1(O)CC(OC2CC(N)C(O)C(C)O2)c3cc4C(=O)c5c(OC)cccc5C(=O)c4c(O)c3C1 WEAHRLBPCANXCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N daunorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 STQGQHZAVUOBTE-VGBVRHCVSA-N 0.000 claims description 50
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 46
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 45
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 claims description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 26
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 claims description 22
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 claims description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 17
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 16
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 claims description 14
- PQFMNVGMJJMLAE-QMMMGPOBSA-N L-tyrosinamide Chemical compound NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 PQFMNVGMJJMLAE-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 13
- 229960001924 melphalan Drugs 0.000 claims description 13
- UTVXFQMLZSPQLB-DHVFOXMCSA-N (3s,4r,5s,6s)-2-amino-6-methyloxane-3,4,5-triol Chemical compound C[C@@H]1OC(N)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O UTVXFQMLZSPQLB-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 11
- 108010009504 Gly-Phe-Leu-Gly Proteins 0.000 claims description 10
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 claims description 10
- WEZDRVHTDXTVLT-GJZGRUSLSA-N 2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[(2-aminoacetyl)amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 WEZDRVHTDXTVLT-GJZGRUSLSA-N 0.000 claims description 9
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 claims description 9
- WMGHDYWNHNLGBV-ONGXEEELSA-N Gly-Phe-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 WMGHDYWNHNLGBV-ONGXEEELSA-N 0.000 claims description 9
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 claims description 8
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N n-(2-hydroxypropyl)-2-methylprop-2-enamide Chemical group CC(O)CNC(=O)C(C)=C OKPYIWASQZGASP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N Bestatin Chemical compound CC(C)C[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](O)[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-MCIONIFRSA-N 0.000 claims description 7
- VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N Bestatin Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 VGGGPCQERPFHOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229940009456 adriamycin Drugs 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 229950009811 ubenimex Drugs 0.000 claims description 7
- QAMMIGULQSIRCD-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Tyr Chemical compound C([C@H](NC(=O)C[NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 QAMMIGULQSIRCD-IRXDYDNUSA-N 0.000 claims description 6
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 6
- MSWZFWKMSRAUBD-CBPJZXOFSA-N 2-amino-2-deoxy-D-mannopyranose Chemical compound N[C@@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-CBPJZXOFSA-N 0.000 claims description 5
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 claims description 5
- 150000004985 diamines Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 claims description 4
- GWCJMBNBFYBQCV-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GWCJMBNBFYBQCV-XPUUQOCRSA-N 0.000 claims description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- DLMYFMLKORXJPO-FQEVSTJZSA-N (2R)-2-amino-3-[(triphenylmethyl)thio]propanoic acid Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(SC[C@H](N)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 DLMYFMLKORXJPO-FQEVSTJZSA-N 0.000 claims description 3
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 3
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 claims description 2
- IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N Gly-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 IGOYNRWLWHWAQO-JTQLQIEISA-N 0.000 claims description 2
- FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N Gly-Phe-Phe Chemical compound C([C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FEUPVVCGQLNXNP-IRXDYDNUSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000007098 aminolysis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003096 antiparasitic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940125687 antiparasitic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002327 cardiovascular agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940125692 cardiovascular agent Drugs 0.000 claims description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 2
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 2
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 claims description 2
- 108010077435 glycyl-phenylalanyl-glycine Proteins 0.000 claims description 2
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 claims description 2
- TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N Gly-Leu-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 TVUWMSBGMVAHSJ-KBPBESRZSA-N 0.000 claims 2
- 108010066198 glycyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 claims 2
- XWTNPSHCJMZAHQ-QMMMGPOBSA-N 2-[[2-[[2-[[(2s)-2-amino-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]acetyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XWTNPSHCJMZAHQ-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims 1
- SOTXLXCVCZAKFI-FXQIFTODSA-N Ala-Val-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SOTXLXCVCZAKFI-FXQIFTODSA-N 0.000 claims 1
- PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N 0.000 claims 1
- JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N Gly-Phe Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-VIFPVBQESA-N 0.000 claims 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- NHCKESBLOMHIIE-IRXDYDNUSA-N Phe-Gly-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 NHCKESBLOMHIIE-IRXDYDNUSA-N 0.000 claims 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims 1
- 230000002141 anti-parasite Effects 0.000 claims 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 claims 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 claims 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 claims 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 claims 1
- FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N methacrylamide Chemical compound CC(=C)C(N)=O FQPSGWSUVKBHSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims 1
- 238000012673 precipitation polymerization Methods 0.000 claims 1
- IMCGHZIGRANKHV-AJNGGQMLSA-N tert-butyl (3s,5s)-2-oxo-5-[(2s,4s)-5-oxo-4-propan-2-yloxolan-2-yl]-3-propan-2-ylpyrrolidine-1-carboxylate Chemical compound O1C(=O)[C@H](C(C)C)C[C@H]1[C@H]1N(C(=O)OC(C)(C)C)C(=O)[C@H](C(C)C)C1 IMCGHZIGRANKHV-AJNGGQMLSA-N 0.000 claims 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 182
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract 1
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 92
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 63
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 60
- VHSHLMUCYSAUQU-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropyl methacrylate Chemical compound CC(O)COC(=O)C(C)=C VHSHLMUCYSAUQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 54
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 48
- 239000000047 product Substances 0.000 description 44
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 29
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 20
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 18
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 239000000637 Melanocyte-Stimulating Hormone Substances 0.000 description 13
- 108010007013 Melanocyte-Stimulating Hormones Proteins 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 13
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000012704 polymeric precursor Substances 0.000 description 12
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 8
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HFPMXDMZJUJZBX-AWEZNQCLSA-N Deacetylcolchicine Chemical compound C1([C@@H](N)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC HFPMXDMZJUJZBX-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 7
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 7
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GUGHGUXZJWAIAS-QQYBVWGSSA-N Daunorubicin hydrochloride Chemical compound Cl.O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(C)=O)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 GUGHGUXZJWAIAS-QQYBVWGSSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 6
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 6
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 229950004157 sarcolysin Drugs 0.000 description 6
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 6
- MXZROAOUCUVNHX-UHFFFAOYSA-N 2-Aminopropanol Chemical compound CCC(N)O MXZROAOUCUVNHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 5
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 5
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 5
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 5
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 5
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 5
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N Hydroquinone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1 QIGBRXMKCJKVMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- SGDBTWWWUNNDEQ-UHFFFAOYSA-N Merphalan Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- HWJHWSBFPPPIPD-UHFFFAOYSA-N ethoxyethane;propan-2-one Chemical compound CC(C)=O.CCOCC HWJHWSBFPPPIPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- CBOJBBMQJBVCMW-NQZVPSPJSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-amino-3,4,5,6-tetrahydroxyhexanal;hydrochloride Chemical compound Cl.O=C[C@H](N)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO CBOJBBMQJBVCMW-NQZVPSPJSA-N 0.000 description 3
- 102000004172 Cathepsin L Human genes 0.000 description 3
- 108090000624 Cathepsin L Proteins 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- IYUKFAFDFHZKPI-DFWYDOINSA-N methyl (2s)-2-aminopropanoate;hydrochloride Chemical compound Cl.COC(=O)[C@H](C)N IYUKFAFDFHZKPI-DFWYDOINSA-N 0.000 description 3
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 125000006847 BOC protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000024924 glomerular filtration Effects 0.000 description 2
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- GNOSSFVOMTYCFF-UHFFFAOYSA-N methyl 2-[[3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoyl]amino]propanoate Chemical compound COC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)OC(C)(C)C GNOSSFVOMTYCFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003114 pinocytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008884 pinocytosis Effects 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 238000001226 reprecipitation Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 2
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N thionyl chloride Chemical compound ClS(Cl)=O FYSNRJHAOHDILO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N (-)-demecolcine Chemical compound C1=C(OC)C(=O)C=C2[C@@H](NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-HNNXBMFYSA-N 0.000 description 1
- FQOWJGGXNSRNJS-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-(2-methylprop-2-enoylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(C)=C FQOWJGGXNSRNJS-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- STOPANFMPLJRSQ-SFHVURJKSA-N (4-nitrophenyl) (2s)-2-[[2-(2-methylprop-2-enoylamino)acetyl]amino]-3-phenylpropanoate Chemical compound C([C@H](NC(=O)CNC(=O)C(=C)C)C(=O)OC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)C1=CC=CC=C1 STOPANFMPLJRSQ-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- NACSMDAZDYUKMU-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 NACSMDAZDYUKMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RNHDAKUGFHSZEV-UHFFFAOYSA-N 1,4-dioxane;hydrate Chemical compound O.C1COCCO1 RNHDAKUGFHSZEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HXKKHQJGJAFBHI-UHFFFAOYSA-N 1-aminopropan-2-ol Chemical compound CC(O)CN HXKKHQJGJAFBHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NRXDUMDULDHIEA-VIFPVBQESA-N 2-[[(2s)-4-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]pentanoyl]amino]acetic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O NRXDUMDULDHIEA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- JTXMVXSTHSMVQF-UHFFFAOYSA-N 2-acetyloxyethyl acetate Chemical compound CC(=O)OCCOC(C)=O JTXMVXSTHSMVQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MWOOKDULMBMMPN-UHFFFAOYSA-N 3-(2-ethyl-1,2-oxazol-2-ium-5-yl)benzenesulfonate Chemical compound O1[N+](CC)=CC=C1C1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 MWOOKDULMBMMPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WUIABRMSWOKTOF-OYALTWQYSA-O 3-[[2-[2-[2-[[(2s,3r)-2-[[(2s,3s,4r)-4-[[(2s,3r)-2-[[6-amino-2-[(1s)-3-amino-1-[[(2s)-2,3-diamino-3-oxopropyl]amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2r,3s,4s,5r,6r)-4-carbamoyloxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)ox Chemical compound OS(O)(=O)=O.N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C WUIABRMSWOKTOF-OYALTWQYSA-O 0.000 description 1
- 244000186140 Asperula odorata Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N Demecolcine Natural products C1=C(OC)C(=O)C=C2C(NC)CCC3=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C3C2=C1 NNJPGOLRFBJNIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N Diazomethane Chemical compound C=[N+]=[N-] YXHKONLOYHBTNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008526 Galium odoratum Nutrition 0.000 description 1
- KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N Gly-Gly-Phe Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 KAJAOGBVWCYGHZ-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 108010033576 Transferrin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000007238 Transferrin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- HQWVJMQORGEHRN-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-n-[2-[(2-aminoacetyl)amino]ethyl]acetamide Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.NCC(=O)NCCNC(=O)CN HQWVJMQORGEHRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007259 addition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- MVYYDFCVPLFOKV-UHFFFAOYSA-M barium monohydroxide Chemical compound [Ba]O MVYYDFCVPLFOKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229960004395 bleomycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical group 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000001739 density measurement Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 125000004177 diethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000003107 drug analog Substances 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- MXWRJMIKMODSCY-UHFFFAOYSA-N ethane;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.CC MXWRJMIKMODSCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 1
- 210000003191 femoral vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000002344 fibroplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- GBCAVSYHPPARHX-UHFFFAOYSA-M n'-cyclohexyl-n-[2-(4-methylmorpholin-4-ium-4-yl)ethyl]methanediimine;4-methylbenzenesulfonate Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1CCCCC1N=C=NCC[N+]1(C)CCOCC1 GBCAVSYHPPARHX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LRPSOLYZVWRIEV-NSHDSACASA-N n-[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]-2-methylprop-2-enamide Chemical compound CC(=C)C(=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 LRPSOLYZVWRIEV-NSHDSACASA-N 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006855 networking Effects 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 229920013730 reactive polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- ILWRPSCZWQJDMK-UHFFFAOYSA-N triethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN(CC)CC ILWRPSCZWQJDMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
Vynález se týká polymerních léčiv, obsahujících inertní syntetický polymerní nosič, spojený pomocí biodegradabilního spaceru s nízkomolekulární bioaktivní molekulou a způsobu jejich přípravy.
Četná nízkomolekulární léčiva, používaná v chemoterapii, pronikají rychle do nejrůznějších druhů buněk náhodnou difúzí buněčnou membránou. Tento nedostatek selektivity snižuje jejich použitelnost pro požadovanou Cílovou tkáň a někdy způsobuje nežádoucí vedlejší jevy. Záchyt v buňce je rychlý, takže terapeutický účinek netrvá dlouho. Navíc léčivo může být rychle odstraněno z krevního řečiště glomerulární filtrací.
Kovalentní navázání nízkomolekulárních bioaktivních molekul na rozpustné polymerní nosiče brání jak glomerulární filtraci, tak i průniku do buněk prostou difúzí. Záchyt se omezuje na buňky, schopné pohlcovat substráty selektivním mechanismem, .známým pod jménem pinocytóza, kdy část membrány, ohraničující buňku, se vchlípí dovnitř buňky, přičemž pohlcuje makromolekulu. Poté se část buněčné membrány oddělí směrem dovnitř, takže se vytvoří intracelulární organela, obsahující zachycený materiál.
Tento rozdíl v mechanismu záchytu poskytuje potenciální metodu, umožňující průnik do intracelulárního prostoru. Malé molekuly, které vstupují do buněk- v důsledku difúze, mají tendenci vniknout do všech částí buňky, zatímco makromolekuly po pinocytóze jsou transportovány v intracelulárních organelách (pinosomech) přímo do lysosomálního kompartmentu, kde se nachází řada hydrolytických enzymů.
Pinocytózní záchyt polymerního léčiva, které obsahuje takovou vazbu mezi léčivem a nosičem, která podléhá hydrolýze na lysosomech, poskytuje tudíž mechanismus pro řízené intracelulární uvolňování bioaktivní molekuly, která vede k jejímu objevení se uvnitř cytoplasmy cílové buňky. Teoretické úvahy, vedoucí k navržení takového systému léčiv, byly nedávno přehledně uvedeny v práci J. Kopečka Syntéza na míru připravovaných rozpustných polymerních nosičů v Recent Advances in Drug Delivery Systems (Plenům Press, 1984).
Při navrhování takového systému je třeba splnit dvě kritéria. Za prvé, je třeba navrhnout vazbu mezi léčivem a nosičem, schopnou podléhat řízené lysosomální hydrolýze, ale zároveň stálou vůči účinku enzymů v krevním řečišti. Za druhé, polymerní léčivo musí být schopné specifického záchytu v těchto cílových buňkách, kde je požadován terapeutický účinek, při současném mininálním záchytu v jiných buňkách.
Ačkoliv pinocytózní proces poskytuje určitý stupeň selektivity vůči makromolekulám, který může být optimalizován 'měnou molekulové hmotnosti, je větší cílové selektivity možno dosáhnout tehdy, zabuduje-li se do molekuly specifický determinant. Buňky obsahují specifické receptory a antigeny na svém povrchu, které poznají určité molekuly nebo jejich části, známé jako specifické determinanty, a reagují s nimi. Vysoké buněčné špecificity je možno dosáhnout tím, že se do polymerního léčiva zabuduje determinant, který je rozeznáván typem buněk, pro něž se požaduje léčivý účinek.
-1CZ 278551 B6
To znamená, že systém pro řízené dávkování léčiv, který umožní specifický cílový účinek, po němž bude následovat intracelulární uvolňování léčiva, musí mít tyto rysy:
(a) musí obsahovat polymerní nosič, který přednostně podléhá lysosomální hydrolýze, aby se usnadnilo vylučování polymeru z těla, (b) musí obsahovat degradabilní vazbu mezi léčivem a nosičem, resistentní vůči extracelulární hydrolýze, ale podléhající řízené lysosomální hydrolýze, (c) musí obsahovat specifický determinant.
Takovou molekulu je možno znázornit schematicky tímto způsobem:
kde specifický determinant léčivo připojené biodegradabilní vazbou volitelná biodegradabilní příčná vazba v polymerním nosiči
Ačkoliv se jako nosičů používalo přírodních makromolekul, syntetické polymery poskytují ty výhody, že molekulová hmotnost se dá snadněji přizpůsobit, aby bylo dosaženo optimální buněčné selektivity a že na rozdíl od mnoha přírodních makromolekul nejsou iidunogenní. Rovněž se dají snadněji připravit v komerčním měřítku.
Syntetické polymery, založené na N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu (HPMA), byly navrženy jako potenciální nosiče léčiv, viz US pat. č. 4,062.831 a 4,097.470; tyto polymery jsou rozpustné ve vodném prostředí a mají dobrou biokompatibilitu. Navíc, v důsledku zabudování p-nitrofenylesterů, N-methakryloyloligopeptidů, mohou být kombinovány s mnoha léčivy, obsahujícími primární
-2CZ 278551 B6 aminoskupinu. Polymerní . řetězce mohou být sírovány pod bodem gelace, aby se dosáhlo optimální molekulové hmotnosti a aby, díky přítomnosti biodegradabilních příčných vazeb, byl zajištěn způsob degradace polymeru, usnadňující jeho vylučování z těla.
Jelikož lysosomální enzymy obsahují řadu proteináz, schopných hydrolyzovat peptidické vazby, zdálo ' by se, že přímé připojení bioaktivní molekuly na polymerní řetězec pomocí amidické vazby poskytne možnost lysosomální hydrolýzy. V praxi tomu však tak není. Bylo však zjištěno, že peptidické spacery, umístěné mezi léčivem a nosičem, podléhají degradaci účinkem lysosomálních enzymů v širokém rozsahu rychlostí. Vazba, která se štěpí, je obvykle vazba mezi léčivem a sousední aminokyselinou, ačkoliv vždycky tomu tak není. Ukazuje se, že hydrolýza, tj. rychlost uvolňování léčiva, značně závisí na počtu a povaze aminokyselinových zbytků v peptidickém spaceru. Obecně spacery, obsahující méně než tři aminokyseliny, nepodléhaly lysosomální hydrolýze. Peptidické spacery, navržené tak, aby odpovídaly známé substrátové specifitě thiolových proteináz, které, jak je známo, jsou obsaženy v lysosomech, jsou štěpeny obzvlášť: účinně.
Dále bylo ukázáno, že modifikace glykoproteinů, vedoucí ke vzniku oligosacharidových vedlejších řetězců, zakončených galaktózou, vede k prudkému vzrůstu ukládání glykoproteinů v parenchymálních jaterních buňkách. Galaktózová jednotka působí jako specifický determinant, který reaguje s receptory, umístěnými na plazmatické membráně jaterních buněk. Tato okolnost nabízí potenciální mechanismus pro cílené působení léčiv v případě hepatomu, tj. druhu rakoviny, který se zvlášť těžko léčí. Navíc, galaktózamin, navázaný na kopolymery HPMA pomocí amidické vazby, poskytuje podobný účinek a tím naznačuje, že receptory na membránách hepatocytů rozeznávají galaktózové jednotky nejenom, jsou-li vázány glykosidickou vazbou, ale také, když tyto jednotky jsou přítomny jako N-acylgalaktózamin. Je známa řada dalších rozeznávacích systémů, například N-acetylglukózamin/manózový rozeznávací systém Kupfférových buněk a makrofágů a fosfohexózový rozeznávací” systém fibroplastů.
Jiný možný mechanismus cílení spočívá v navázání polymemího léčiva na protilátku, která je specificky rozeznávána buňkami, majícími odpovídající membránové antigeny. Molekuly léčiv byly též navazovány přímo na imunoglobulin, ale to může vést ke ztrátě aktivity léčiva, ztrátě aktivity protilátky anebo rozpustnosti konjugátu. Ukázalo se, že zavedení polymemího meziřetězce mezi léčivo a polymer značně zjednodušuje uvedené problémy.
Další mechanismus cílení látek je založen na vazbě proteinu nebo hormonu na polymer, například transferinu nebo hormonu, stimulujícího melanocyty, který se váže specificky na typ cílové buňky.
Zatímco potřeba syntézy cílených polymerních léčiv s hydrolyzovatelnými peptidickými spacery byla uváděna již dříve (viz práci Kopečka, citovanou již dříve), peptidické spacery, schopné řízeného intracelulárního uvolňování léčiv vhodnou rychlostí, unikaly pozornosti výzkumných pracovníků.
Jak bylo uvedeno dříve, rychlost lysosomální hydrolýzy pep
-3CZ 278551 B6 tidického spaceru závisí na počtu a povaze aminokyselinových zbytků. V tom se projevují jak prostorové, tak strukturní fakto ry
Rychlost koncové hydrolýzy spaceru, obsahujícího 2 až 4 aminokyselinové zbytky, obecně závisí na počtu přítomných zbytků, což se přičítá prostorové interakci mezi polymerním řetězcem a enzymem. Pro peptid dané délky rychlost hydrolýzy závisí na povaze (a sekvenci) aminokyselinových zbytků. Tato závislost je způsobena substrátovou speciíicitou lysosomálních enzymů, odpovědných za štěpení peptidického spaceru a část enzymu, kde probíhá interakce se substrátem, je známá jako aktivní místo enzymu. Aktivní místo hraje dvojí úlohu - váže substrát a zároveň katalýzu je reakci, například štěpení. Výzkum struktur komplexů proteolytických enzymů s peptidy ukazuje, že aktivní místo těchto enzymů je relativně velké a je vázáno na několik aminokyselinových zbytků v peptidu.
Degradabilita jednotlivé vazby v peptidickém řetězci tudíž závisí nejen na povaze struktury poblíž štěpené vazby, ale také na povaze aminokyselinových zbytků, relativně vzdálených od štěpené vazby, avšak hrajících důležitou úlohu tím, že udržují enzym v určité poloze během hydrolýzy. Detailní struktura aktivních míst lysosomálních enzymů nebyla zatím určena, což se projevilo jako překážka v přípravě peptidických spacerů, které podléhají lysosomální hydrolýze vhodnou rychlostí a jsou určeny pro použití v pol.ymerních léčivech.
Vynález se zakládá na objevu takových peptidických sekvencí, které mohou působit jako spacery, schopné lysosomální hydrolýzy uspokojivou rychlostí tak, že umožní řízené intracelulární uvolňování léčiv, ale které jsou nadále resistentní vůči extracelulární hydrolýze, a mohou rovněž být použity pro vazbu specifických determinant. Dále byly vyvinuty systémy, umožňující snadné štěpení základního polymemího nosiče. Biodegradability je dosaženo tím, že do hlavního polymemího řetězce jsou zavedeny oligopeptidické sekvence, obsahující biodegradovatelné vazby. Hydrolýza těchto vazeb je zvláště citlivá vůči sterické zábraně, způsobené polymerními řetězci, více nežli hydrolýza koncových jednotek z peptidických vedlejších řetězců.
Podstatou tohoto vynálezu je polymerní léčivo, tvořené inertním syntetickým, polymerním nosičem na bázi opakujících se jednotek (N—(2-hydroxypropyl)-methakrylamidu, který je pomocí aminokyselinových nebo peptidových spacerů spojený s biologicky aktivní molekulou, a pomocí stejných nebo jiných spacerů popřípadě spojen se směrující jednotkou, a který je popřípadě zesíťován, vyznačené tím, že sestává z (a) 5,0 až 99,7 mol.% jednotek, odvozených z N-(2 droxypropyl) methakrylamidu, vzorce
OH ch3 - C - CO - NH - ch2 -CH -ch3,
-4CZ 278551 B6 (b) 0,2 až 20,0 mol% jednotek, odvozených z N-methakryloylovaného peptidu, vzorce
CH9
II ch3 - C - CO - [NH - R - CO] - [B] kde -[NH-R-CO]- je zbytek, odvozený od Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, GlyPhe-Phe, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, GlyLeu-Ala, Gly-Phe-Tyr, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Phe-PheLeu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Ala-GlyVal-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe a Gly-Gly-Phe-LeuGly-Phe, a -[B] je biokativní molekula, a (c) 0,1 až 94,8 mol% jednotek vzorce
| ch3 | ch0 II - c - | co - | NH - | [D] | |
| nebo | CH0 11 | ||||
| ch3 | II - c - | co - | [D] | ||
| nebo | ch9 II | ||||
| ch3 | - c - | co - | [NH - | R - CO] - D |
kde — [D] je determinant a -[NH-R-CO]- je zbytek, odvozený od Leu, Phe, Gly-Gly, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Phe-Phe-Leu, GlyLeu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe·, Ala-Gly-Val-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe, Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe.
Polymerni léčivo podle vynálezu může dále obsahovat (d) do 5 mol.% jednotek vzorce
CH3 - C - CO - [NH - R - CO] - [L] - [CO - R - NH] - CO - C - CH3 kde -[NH-R-CO] je zbytek, odvozený od Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-LeuGly, Gly-Phe-Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-PheGly-Phe, Ala-Gly-Val-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe a Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe a -[L]- je spojovací skupinou, a dále může obsahovat
-5CZ 278551 B6 (e) jako jednotky, schopné radioaktivního značení, do 2 mol.% jednotek vzorce
NH9
I
CH, CO
II 2 I
CH3- C - CO - NH - CH - CH2 - C6H4 - OH
Ne všechny kombinace oligopeptidových sekvencí, uvedených pod (b) a biologicky aktivních molekul, nebo molekul léčiv, podléhají intracelulární lysosomální hydrolýze; například, jak je uvedeno dále, kombinace Gly-Gly s daunomycinem nepodléhá této hydrolýze a proto by se neměl Gly-Gly používat jako peptidický spacer s daunomycinem. Gly-Gly je však přijatelný spacer pro ostatní léčiva, například pro deacetylkolchicin a kolcemid.
Jak bylo ukázáno v souvislosti s bodem (c), determinant je možno připojit přímo k polymernímu řetězci buď amidovou nebo esterovou vazbou, t.j. bez spaceru, nebo může být vázán přes aminokyselinový nebo peptidový spacer. Úvahy ovlivňující výběr vazby, která má být použita pro určitý determinant, jsou složité a závisí mimo jiné na charakteru a počtu jednotek, nesoucích léčivo, nebo na tom, má-li polymer jednoduchý řetězec, nebo je větvený a ovšem na charakteru determinantu. Převládajícím požadavkem je, aby byl determinant dostupný pro specifické receptory na cílených buňkách, což je ve značné míře funkcí geometrie molekuly polymerního léčiva.
Biologicky aktivní molekula, přítomná v polymerním léčivu, je především protirakovinná látka, protimikrobiální látka, protiparazitická látka, protizánětlivá látka, kardiovaskulární léčivo nebo léčivo s účinkem na nervovou soustavu. Zvláštní přednost mají např. daunomycin, puromycin, adriamycin, isopropylester melfalanu (sarkolysin), bleomycin, desferioxamin, bestatin a tritylcystein.
Determinantem je především monosacharid, disacharid, oligosacharid nebo O-methakryloylovaná sacharidová jednotka, jež jsou přednostně vázány amidovou vazbou, protilátky jako IgG (krysí imunoglobulin) a anti-0 protilátka, nebo protein, např. transferin, nebo hormon, stimulující melanocyty (MSH). Zvláště vhodné determinanty jsou galaktoza, galaktozamin, glukozamin, manozamin a fukosylamin.
Skupina L, tvořící spojku mezi polymerními řetězci, má s výhodou složení typu - A -. ΝΗ(Οι.ζ]χ NH-A -, kde A je aminokyselina a x je celé číslo od 1 do 12, a je připojena k sousedním peptidickým spacerům amidickými vazbami. Zvlášť výhodné vazebné skupiny jsou ty, v nichž x je 6 a aminokyselina A je Phe, Tyr, Ala, Gly nebo Leu, a ty, v nichž x je 2 a aminokyselina A je Ala.
Zvlášť výhodné provedení vynálezu zahrnuje jednoduché nebo zesítěné řetězce specifikovaného polymeru s daunomycinem jako
-6CZ 278551 B6 bioaktivní molekulou, galaktozou, galaktozaminem, nebo fukosylaminem jako determinantem, Gly-Phe-Leu-Gly jako peptidickým spacerem mezi polymerním nosičem a jak daunomycinem, tak i galaktozaminem, a volitelně s Gly-Phe~Leu-Gly jako peptidickým spacerem obsaženým v příčné vazbě a -(Phe)NH-fCH2..).gNH(Phe)- jako spojující skupinou.
Vynález rovněž, zahrnuje syntézu polymerních léčiv, jak uvedeno v popisu vynálezu.
Protože tentýž oligopeptidický spacer je možno použít jak pro vazbu bioaktivní molekuly, tak pro vazbu determinantu, a příprava těchto sloučenin je jednodušší než těch, v nichž tyto spacery jsou různého druhu, nejprve popíšeme postup syntézy polymerního nosiče se stejným spacerem. Syntéza probíhá v zásadě ve dvou stupních.
Počáteční stupeň zahrnuje kopolymerizaci HPMA a p-nitrofenyl esteru N-methakryloylovaného oligopeptidu (začlenění N-methakryloyltyrosinamidu je rovněž možné, aby se získala jednotka, umožňující radioaktivní značení), čímž se získá polymerní prekurzor, obsahující na peptidických postranních řetězcích koncové p-nitrofenoxyskupiny, odštěpující se při následující adiční reakci. Druhý stupeň zahrnuje postupnou adici reaktivního léčiva, reaktivního determinantu a volitelně diaminového síťovadla. Jestliže polymerní nosič léčiva je požadován ve formě jednoduchého řetězce, léčivo a determinant se postupně adují na polymerní prekurzor v libovolném pořadí. Jestliže je požadován zesítěný produkt, pak vhodné síťující činidlo, léčivo a determinant se adují postupně na polymerní prekurzor, opět v libovolném pořadí.
Výše uvedený postup je možno znázornit následovně:
HPMA + MA-AT-QNp
Kopolymerizace
ONp = p-nitrofenoxy
MA = methakryloyl (d) = léčivo determinant
-7CZ 278551 B6
Produkt s jednoduchým řetězcem í—Ύνί—© /Avv-®
©ΆΙΑ—i zesítěný ©-44Λ—/ produkt
V případech, kdy léčivo a determinant nemají stejné vazebné jednotky, je možno použít dvou syntetických postupů.
Pro ty případy, kdy vazebné skupiny léčiva a determinantu obsahují společné aminokyselinové zbytky, sousedící s nosičem, polymerní prekurzor, obsahující tyto aminokyseliny, se postupně nechá reagovat s aminokyselinou nebo peptidylovým derivátem determinantu a volitelně, v případě, že je požadován zesítovaný produkt, s diaminovým síťovadlem.
1) AA]_ - ©
HPMA + MA~/WuONp
2) ΑΑχ - ©
3) AA2 - ©
Produkt s jednoduchým řetězcem
Zesítěný produkt
ΙΛ-ΑΑ2
1-AA-l
Ý1A—AA-l - ©
AA2 - ©
AA^—ΛΜ— aa2
Alternativně lze připravit polymerizovatelnou formu determinantu reakcí N-methakryloyl oligopeptidu, obsahujícího požadovanou aminokyselinovou sekvenci s determinantem. Takto modifikovaný determinant se zabuduje do polymerního prekurzoru kopolymerižací. Polymerní prekurzor se potom nechá reagovat s reaktivním léčivem a volitelně, když je požadován zesítěný produkt, s diaminovým síťovadlem.
-8CZ 278551 B6
Tento postup je možno znázornit následovně.
HPMA + MA-^-ONp + ΜΑ-37}-Τ ' Kopolymerizace
V
1) h2 N 1 |—nh2
2) ©
Produkt s jednoduchým řetězcem
C/VH-pRA-®
-W-®
Je rovněž možné připravit polymerní prekurzory, podobné těm, které jsou popsány výše, ale obsahují peptidické postranní řetězce, ukončené nikoliv p-nitrofenyl esterovými skupinami, ale skupinami karboxylovými. V přítomnosti vhodného činidla je možno připojit léčiva a determinanty k těmto polymerním prekurzorům pomocí koncových karboxylových skupin; v tomto případě se během adice uvolňuje hydroxylová a nikoli p-nitrofenoxylová skupina.
Léčiva a determinanty, obsahující reaktivní aminoskupiny, poskytují produkty, identické s těmi, které se získají z polymerních prekurzorů s koncovými p-nitrofenylesterovými skupinami, tj. reaktivní molekula je vázána na postranní řetězec pomocí amidické vazby. Avšak polymerní prekurzory, obsahující koncové karboxylové skupiny, na rozdíl od prekurzorů, obsahujících koncové p-nitrofenylesterové skupiny, rovněž reagují s léčivy a determinanty, obsahujícími reaktivní hydroxyskupiny za vzniku produktů, v nichž reaktivní molekula je vázána na postranní řetězec pomocí esterové vazby.
Polymerní prekurzory s postranními řetězci, ukončenými karboxylovými skupinami, mohou být připraveny (a) zásaditou hydrolýzou odpovídajícího polymerního prekurzorů s postranními řetězci, ukončenými p-nitrofenylesterovými skupinami, jejichž příprava byla popsána výše, (b) kopolymerizací HPMA libovolným syntetickým postupem, popsaným výše pro přípravu polymerního prekurzorů s koncovými p-nitrofenylesterovými skupinami, ale s použitím neesterifikovaného N-methakryloylovaného peptidu jako komonomeru. Výsledný kopolymer je pak možno reagovat s vhodným léčivem a determinantem.
. Metody, s jejichž pomocí je možno připravit polymerní prekurzory s postranními řetězci, ukončenými karboxylovými skupinami, je možno znázornit následovně:
-9CZ 278551 B6
ΗΡΜΑ + Ma-AV^-OH
Kopolymerizace (b)
ΜΑ-3ΤΓ-Τ í—4¼—OH /—'TD --0
Vhodná činidla pro adici reaktivního léčiva anebo determinantu k polymerním prekurzorům, obsahujícím karboxylové skupiny, zahrnují karbodiimidy, jako například dicyklohexylkarbodiimid, v organických rozpouštědlech a N-cyklohexyl-N'-(2-morfolinoethyl) -karbodiimid metho-p-toluensulfonát ve vodných roztocích a Woodwardovo činidlo, (N-ethyl-5-fenylisoxazolium-3'-sulfonát).
Pořadí, v němž se některé nebo všechny reaktivní determinanty reaktivního léčiva a sítující činidlo přidávají k polymerním prekurzorům při použití některého z postupů popsaných výše,' není rozhodující. Množství použitých reakčních složek musí ovšem být takové, aby poskytlo požadovaný molární obsah každé komponenty v polymeru v rozmezí, vytčeném výše. Celková molekulová hmotnost je určena polymerizačnimi podmínkami, zvláště koncentrací iniciátoru, přítomností přenášečů a koncentrací komonomerních p-nitrof enoxyskupin.
Produkty s jednoduchým řetězcem podle vynálezu mají s výhodou molekulovou hmotnost v rozmezí 5 000 až 60 000, výhodněji 20 000 až 40 000; zesítěhé produkty výhodně v rozmezí 10 000 až 500 000, výhodněji 30 000 až 400 000.
Výchozí materiály, potřebné k provedení výše popsaných syntéz, jsou budto běžně k dostání anebo mohou být připraveny obecnými metodami, známými těm, kdo má zkušenosti v daném oboru.
Peptidické deriváty, potřebné pro kopolymerizaci s N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidem (HPMA), mohou tedy být připraveny a kopolymerizace může být uskutečněna následovně:
(i) Komerčně dostupný dipeptid (obsahující první dva aminokyselinové zbytky požadovaného peptidického spaceru) je N-methakryloylován, jak je popsáno například v Makromol. Chem. 177, 2833 (1976). (N-methakryloylovaný tyrosinamid pro účely radioaktivního značení může být získán stejným způsobem).
(ii) N-methakryloylovaný dipeptid je pak esterifikován p-nitrofenolem, jako je popsáno například v Makromol Chem. 178, 2169
-10CZ 278551 B6 (1977). (Methakryloylované p-nitrofenylové estery Leu a Phe, poskytující aminokyselinové spacery, vhodné k použití pro determinant, mohou být připraveny stejným způsobem).
(iii) Peptidický řetězec N-methakryloylováného dipeptidyl-p-nitrofenylesteru je pak prodloužen (pokud dipeptíd není Gly-Gly, kdy dipeptíd sám je jedním ze spacerů, kterých se dá použít pro vazbu determinant) připojením oligopeptidu, obsahujícího potřebné aminokyselinové zbytky, za vzniku požadované peptidické sekvence, jak je popsáno například v Makromol. Chem. 182, 1917 (1981).
(iv) N-methakrylovaný oligopeptid, získaný z (iii), může být kopolymerizován s HPMA za vzniku polymerního prékurzoru s postranními řetězci, obsahujícími koncové karboxylové skupiny, nebo může být reesterifikován p-nitrofenolem. V druhém případě N-methakryloylovaný peptidyl-p-nitrofenylester může být kopolymerizován s HPMA, jak je popsáno například v J. Polymer Sci., Polymer Symp. 66,15 (1979), nebo pokud léčivo a determinant mají, mít různé spacery, může být podroben reakci s determinantem za vzniku M-methakryloylovaného oligopeptidického determinantu a pak kopolymerizován s N-methakryloylovaným esterem s HPMA, jak je popsáno například v Biochem. Biophys. Acta, 757, 518 (1983).
Příprava N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu je popsána v Angew. Makromol. Chem. 70, 109 (1978); k vazbě vhodná léčiva a determinanty jsou vesměs komerčně dostupné. Aminokyselinové a peptidylové deriváty léčiv a determinantů mohou být připraveny metodami, popsanými v Makromol. Chem. 184, 1997 (1983) a síťovací činidla mohou být připravena, jak je popsáno například v Makromol. Chem. 182, 1899 (1981).
Vynález také zahrnuje farmaceutické kompozice, které obsahují nejméně jedno polymerní léčivo podle vynálezu a inertní fyziologicky přípustný nosič. Polymerní léčivo lze podávat perorálně nebo jako injekce, např. intraperitoneálně, intrávenozně nebo intramuskulárně.
Kterékoliv z běžných složek a aditiv lékových forem je možno v podstatě použít i pro polymerní léčivo podle vynálezu. V případě injekcí se doporučuje použít jako nosiče sterilní vodná prostředí .
V dalším jsou uvedeny příklady, objasňující předmět vynálezu, aniž by jej nějak omezovaly.
Příklady 22 až 35 se týkají biologického zkoušení polymerní ch léčiv podle vynálezu a jejich analogů a zbývající příklady se týkají syntéz těchto polymerních léčiv.
Jak bylo uvedeno, příklady 22 až 35 se týkají biologických zkoušek analogů polymerních léčiv podle tohotc 'ynálezu, přičemž tyto analogy jsou sloučeniny, obsahující znak (s) a v některých případech jeden nebo oba volitelné znaky (d) a (e) sloučenin podle vynálezu, ale obsahují pouze jeden ze znaků (b) a (c) a nikoliv oba. V těchto příkladech byly použity analogy spíše než sloučeniny podle vynálezu, aby mohl být jasněji ukázán vliv změny znaků (b) a (c) jednotlivě.
-11CZ 278551 B6
Příklad 1
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím daunomycin, vázaný na tetrapeptidový spacer, galaktózamin, vázaný na dipeptidový spacer, a tyrosinamid, vázaný přímo na hlavní řetězec.
HPMA
Ma-Tyr-NH2 (1)
Ma-Gly-Glyga1aktó z amin (2)
MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (3) daunomycin
-- kopolymerizace
--------------:-----------y •Tyr-NH2
Gly-Gly-gal
Gly-Phe-LeuGly-ONp (4)
Příprava MA-Tyr-NH2 (1).
MA-Tyr-NH2 byl připraven reakcí 3,4 g (0,017 mol) p-nitrofenylmethakrylátu a 3,0 g (0,017 mol) Tyr-NH2 v dimethylformamidu za míchání reakční směsi při 25 'C po dobu 16 hodin. Po odpaření rozpouštědla byl viskózní olej smísen se suchým éterem a malým množstvím hydrochinonu. Výtěžek byl 3 g pevné látky (t.t. 194 až 196 °C; krystalizované z ethanolu). Molární extinkční koeficient e 280 nm = 1,7 * 1q3 (ethanol).
Příprava MA-Gly-Gly-galaktózaminu (2).
Do směsi 3,5 g (1,08 . 10“2 mol) MA-Gly-Gly-ONp (p-nitrofenylesteru methakryloylglycylglycinu) a 2,8 g (1,3 .10 2 mol) hydrochloridu galaktózaminu v 18 ml dimethylformamidu bylo pomalu přidáno 1,8 ml (1,3 . 10“2 mol) triethylenaminu a reakční směs byla míchána při 25 °C po dobu 16 hodin. Hydrochlorid triethylaminu byl pak odfiltrován a zbytek reakční směsi byl odpařen na viskózní olej. Po přidání ethanolu a ochlazení byl získán surový produkt. Po překrystalizování bylo získáno 1,5 g produktu; t.t. 112 °C (ethanol).
Příprava MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (3).
Směs obsahující 4,1 g (1,0 . 10-2 mol) MA-Gly-Phe-ONp (připraven podle J. Polym. Sci. 66, 15 (1979) v 50 ml dioxanu, 2,1 g (1,1 . 10“2 mol) H-Leu-Gly-OH v 50 ml vody a 1,8 g (2,2 . 10“2 mol) NaHCO3 byla míchána za teploty místnosti po dobu 48 hodin. Rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku, až byl objem směsi
-12CZ 278551 B6 jedna čtvrtina původního objemu, a po přidání malého množství inhibitoru (hydrochinonu) byla reakční směs okyselena' zředěnou kyselinou chlorovodíkovou na pH 2. Surový produkt byl extrahován do ethylacetátu a vysrážen diethyléterem. Výtěžek byl 74 % MA-Gly-Phe-Leu-Gly-OH; t.t. 145 až 150 °C. TLC analýza prokázala, že produkt neobsahuje nečistoty. (poznámka: doporučuje se použít pro další reakční krok surový produkt, protože čistá látka během čištění snadno polymerizuje).
MA-Gly-Phe-Leu-Gly-OH byl v množství 4,6 g (1,0 . 10”2 mol) esterifikován p-nitrofenolem (1,1 . 10 2 mol) v 55 ml THF pomocí dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) (1,1 - 10“2 mol). Po 3 hodinách při 15 ’C a 12 hodinách při 25 °C byla odfiltrována dicyklohexylmočovina a zbývající roztok byl odpařen za sníženého tlaku. Zbytek po přidání suchého éteru ztuhnul a po překrystalizování ze směsi aceton-éter (3 : 1) poskytnul MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp ve výtěžku 76 % a v analytické čistotě; t. t. 124 až 128°C. Analýza na aminokyseliny dala poměr Gly : Leu : Phe = 2,0 : 1,0 : 0,99.
Příprava reaktivního polymerního prekurzoru (4).
Kopolymerizace HPMA + MA-Tyr-NH2 (1) + MA-Gly-Gly-galaktózamin (2) + MA-Gly-Phe-Leu-Gly-OMp (3)
K roztoku 2,5 g (1,75 . 10“2 mol) HPMA (92 mol. %), 0,047 g (1,90 . 10“4 mol) MA-Tyr-NH2 (1 mol. %) a 0,555 g (9,54 . 10“4 mol) MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (5 mol. % v 25 ml acetonu byl přidán roztok 0,138 g (3,82 . 10 4 mol) MA-Gly-Gly-galaktózaminu (2 mol. %) v 1 ml DMSO. Poté byl přidán roztok 0,153 g azobisisobutyronitrilu ve 3 ml acetonu. Směs byla nalita do ampulí, ampule byly probublány dusíkem a zataveny a směs byla polymerizována při 50 “C po dobu 24 hodin. Vysrážený polymer byl oddělen a přečištěn rozpuštěním v methanolu a přesrážením v acetonu. Výtěžek byl 1,9 g (60 %). Produkt obsahoval 4,7 mol. % postranních řetězců -Gly-Phe-Leu-ONp (stanoveno z ^274 nm ~ . 103 v DMSO),
1,8 mol. % postranních řetězců -Gly-Gly-galaktózamin (stanoveno pomocí GPC po kyselé hydrolýze) a 1,0 mol.. % postranních řetězců -Tyr-NH2. Váhový střed molární hmotnosti M^ aminolyzovaného polymeru byl 22 000; stupeň polydisperzity molárních hmotností Mw/Mn= 1,4 . (Mn je číselný střed molární hmotnosti).
Příprava polymeru, obsahujícího daunomycin (5). Navázání daunomycinu na polymerní prekurzor.
Roztok 0,16 g (2,8 . 10“4 mol) hydrochloridu daunomycinu v 1 mol DMSO byl přidán k roztoku 1,0 g kopolymeru (4), jenž obsahoval 2,8 . 10“4mol reaktivních p-nitrofenoxy svrpin, ve 4 ml dimethylsulfoxidu (DMSO). Poté bylo přidáno 0,028 g (2,8 . 10“4 mol) triethylaminu. Směs byla míchána za teploty místnosti v temnu po dobu 16 hodin, načež bylo po odstranění případného zbytku - ONp skupin přidáno 20 μΐ aminopropanolu. Polymer byl vysrážen nalitím reakční směsi po kapkách do 400 ml směsi aceton/diethyl/ éter (9 :'l), sraženina byla odfiltrována, pečlivě promyta acetonem a éterem a vysušena. Polymer byl přečištěn dvojitou gelovou
-13CZ 278551 B6 filtrací na Sephadexu LH-20 (2 x 100 cm) s použitím metanolu jako eluentu. Metanol byl odpařen za sníženého tlaku a čistý polymer byl izolován lyofilizací z vodného roztoku. Výtěžek 0,75 g. Polymer obsahoval 3,5 mol. % postranních řetězců, ukončených daunomycinem (10,2 hmot. % daunomycinu) 1,8 mol. % postranních řetězců, ukončených galaktózaminem (1,8 hmot. % galaktózamínu) a 1 mol. % postranních řetězců Tyr-NH2. Polymer obsahoval méně než 0,1 % nenavázaného daunomycinu, vztaženo na množství navázaného daunomycinu.
Stanovení nenavázaného daunomycinu: Volný DNM byl stanoven extrakcí ethylacetátem; 1,5 mg polymeru bylo rozpuštěno v 1 ml vody a třepáno se směsí 1 ml pufru (0,2 M Na2CO3/NaHCO3, pH 9,8) a 2 ml ethylacetátu. Organická vrstva byla oddělena, vysušena malým množstvím suchého MgSO4 a koncentrace DNM byla stanovena spektrofotometricky při 485 nm (e = 1,0 . 104 v ethylacetátu).
Příklad 2
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím daunomycin á galaktózamin, vázané na tetrapeptidový spacer, a tyrosinamid, vázaný přímo na hlavní polymerní řetězec.
f-tyrosinamid ( -Gly-Phe-Leu-Gly-ONp
1) Daunomycin
........ 2) Galaktózamin___
Í -tyrosinamid
-Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin
-Gly-Phe-Leu-Gly-galaktózamin
Kopolymer HPMA, MA-tyrosinamidu a MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (0,1 g, 2,85 . 10-5 mol -ONp skupin) byl rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (0,4 ml) a byl přidán roztok daunomycinhydrochloridu (8,5 mg,
1,5 . 10“5 mol v dimethylsulfoxidu (0,1 ml) s následným přidáním triethylaminu (1,5 mg, 1,5 . 10-5 mol). Směs byla míchána za teploty místnosti 90 minut a poté byl přidán roztok galaktózaminhydrochloridu (6,5 mg, 3,0 . 10~5 mol) v dimethylsulfoxidu — R (0,1 ml) s následným přidáním triethylaminu (3,0 mg, 3,0 . 10 mol). Směs byla míchána 16 hodin za teploty místnosti a pak nalita do směsi aceton/diethylester (9 : 1). Vysrážený polymer byl odfiltrován, důkladně promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymer byl čištěn dialýzou v dialyzační trubici proti zředěné kyselině a poté proti vodě. Čistý polymer byl izolován lyofilizací a obsahoval 2,17 mol. % postranních řetězců, ukončených daunomycinem, tj. 7,5 hmot % aktivního produktu, a 1,8 mol.
-14CZ 278551 B6 % postranních řetězců, ukončených galaktózaminem, tj. 2,0 hmot. % galaktózaminu.
Příklad 3
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím daunomycin, vázaný—-na dipeptidový . spacer, a tyrosinamid, vázaný přímo na hlavní polymerní řetězec.
HPMA
MA-Tyr-NH2
MA-Tyr-Gly-ONp (6) .kopolymerizace
---Tyr-NH2 -Gly-Gly-ONp (7) daunomycin —------—s>
-Tyr-NH2 -Gly-Gly-DNM (8) p-Nitrofenylester methakryloylglycylglycinu (6) byl připraven podle Makromol. Chem. 177, 2833 (1976). Příprava polymerního prekurzoru byla provedena stejně jako v příkladu 1. Mw/Mn= 1,4 (aminolysovaný prekurzor).
Příprava polymeru, obsahujícího daunomycin (8).
K roztoku 0,50 g polymerního prekurzoru (7), obsahujícího
5,5 mol. % Gly-Gly-ONp postranních řetězců (1,8 . 10“4 mol skupin ONp) ve 2 ml DMSO, bylo přidáno 0,038 g (1,35 . 10-4 mol) hydrochloridu daunomycinu v 0,3 ml DMSO a poté 0,014 g (1,35 . 10“4 mol) triethylaminu. Další postup byl stejný, jako v příkladu 1. Výtěžek: 0,38 g polymeru, který obsahoval 3,1 mol. % postranních řetězců -Gly-Gly-daunomycin (10,2 hm. % daunomycinu);
e 485 nm = 9 800 (H2O).
Příklad 4
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím daunomycin a anti-0 protilátky, navázané na tetrapeptidový postranní řetězec, a tyrosinamid, vázaný přímo na hlavní polymerní řetězec.
> :/r-NH2 '-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp
I (9) daunomycin '-Tyr-NH2
-Gly-Phe-Leu-Gly-DNM -Gly-Phe-Leu-Gly-ONp ' (10)
Anti- 0 protilátky vodný pufr, pH 8,0
-Tyr-NH2
-Gly-Phe-Leu-Gly-DNM
-Gly-Phe-Leu-Gly-anti-0
-15CZ 278551 B6
Ma-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (3) byl připraven, ' jak bylo popsáno v příkladu 1, a polymerní prekurzor (9) byl připraven kopolymerizací HPMA a (3) postupem, popsaným v příkladu 1. Polymerní prekurzor (9) obsahoval 8,0 mol. %__ -Gly-Phe-Leu-Gly-ONp postranních řetězců a 1 mol. % Tyr-NH2 . Mw aminolyžovaného prekurzoru (9) = 17 000; =1,3.
Příprava kopolyméru s daunomycinem a volnými reaktivními skupinami.
K roztoku 0,31 g polymerního prekurzoru (9) (obsah ONp skupin 1,35 . 10-4 mol) v 1,2 DMSO bylo přidáno 0,028 g (5,1 . 10-5 mol) hydrochloridu daunomycinu v 0,1 ml DMSO a 0,0052 g (5 . 10~5 mol) triethylaminu. Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 60 minut a potom nakapána do 400 ml směsi acetonéter (3:1), aby se kopolymer vysrážel. Polymer obsahoval 2,5 mol. % postranních řetězců, ukončených daunomycinem a 4,3 mol.% postranních řetězců, zakončených nezreagovanou skupinou ONp.
Vázání anti-0 protilátek na polymer, obsahující daunomycin.
mg kopolyméru, popsaného v předchozím odstavci, bylo rozpuštěno při 5 °C v 0,5 ml zředěné chlorovodíkové kyseliny (pH 3,0). Potom bylo přidáno 0,6 ml Sorensenova pufru (pH 8,0), obsahujícího 0,15 M NaCl, načež bylo přikapáno 0,67 ml roztoku protilátek anti-0 v témže pufru (roztok obsahoval 39,5 mg proteinu). Reakce probíhala po dobu 30 minut při 5 Ό. Během následujících 30 minut byla teplota postupně zvýšena na 20 °C. (Na počátku reakce byl molární poměr reaktivních skupin ONp : NH2 =1 : 1 a koncentrace makromolekul byla 6,6 hm. %). Po hodině reagování byl přidán roztok 20 μΐ l-aminopropan-2-olu v 0,2 ml Sorensenova pufru (pH 8,0), obsahující 0,15 M NaCl. Po 10 minutách byla reakční směs převedena do Viskingovy dialyzační trubice a dialyzována proti fyziologickému roztoku, upravenému fosfátovým pufrem na pH 7,2.
Příklad 5
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím puromycin a galaktózamin, vázané na tetrapeptidový spacer.
Tyr-NH2 j-Gly-Phe-Phe-Leu· puromycin
-Gly-Phe-Phe-Leugalaktózamin (14)
Příprava Ma-Gly-Phe-Phe-Leu-ONp.
Směs, obsahující 4,1 g (1,0 . 10-2 mol) MA-Gly-Phe-ONp (viz příklad 1) v 50 ml dioxanu a 3,06 g (1,1 . 10 2 mol. _Sigma) H-Phe-Leu-OH v 50 ml dioxanu a 1,85 g NaHCO3 (2,2 . 10“2 mol) v 50 ml vody, byla míchána za teploty místnosti po dobu 45 h. Další postup byl podobný jako při přípravě (3) v příkladu 1.
-16CZ 278551 B6
Surový produkt MA-Gly-Phe-Leu-OH (výtěžek 51 %) byl esterifikován p-nitrofenolem metodou, popsanou v příkladu 1. Čistý produkt byl získán v 50 % výtěžku po překrystalizování ze směsi aceton/éter 3 : 9). Analýza na aminokyseliny dala poměr Gly : Phe : Leu =
1,0 : 1,98 : 1,0.
Příprava polymerního prekurzoru (13).
Kopolymerizace HPMA (95 mol. %) s MA-Tyr-NH2 (1 mol. %) a MA-Gly-Phe-Phe-Leu-ONp (12) (5,0 mol. %) podle postupu, popsaného v příkladu 1, poskytla polymerní prekurzor s obsahem 3,0 mol. % postranních řetězců -Gly-Phe-Phe-Leu-ONp s 1,0 mol. % postranních řetězců Tyr-NH2 . = 23 000; ΐ^/ϊ^ = 1,3.
Navázání puromycinu a galaktózaminu.
K roztoku 0,36 g polymerního prekurzoru (13), obsahujícího
6,5 . 10_5mol ONp skupin v 1,4 ml DMSO, byl přidán roztok 0,026 g (4,4 . 10-5 mol) dihydrochloridu puromycinu v 0,1 ml DMSO a 0,0088 g (8,8 . 10~5 mol) triethylaminu. Po 30 minutách míchání při teplotě místnosti bylo do směsi přidáno 0,094 g (4,4 . 10 mol) galaktózaminu a 0,044 g (4,4 . 10-5 mol) triethylaminu. Reakční směs byla míchána 16 hodin a potom bylo přidáno 10 μΐ aminopropanolu.
Polymer byl okamžitě, vysrážen ve 400 ml acetonu, promyt a vysušen. Polymer byl přesrážen z roztoku v metanolu acetonem a přečištěn dialýzou vodného roztoku ve Viskingově dialyzační trubici. Po isolaci produktu lyofilizací bylo získáno 0,265 g polymeru, obsahujícího 1,3 mol. % postranních řetězců, zakončených puromycinem (3,7 hm. % puromycinu; stanoveno pomocí molárního extinkačního koeficientu e272nm = 2,0 . 104, etanol), a 1,0 mol. % postranních řetězců, zakončených galaktózaminem. (1,0 hm. % galaktózaminu). Čistota produktu, t.j. přítomnost nízkomolekulárního puromycinu, byla kontrolována extrakcí polymeru do ethylenacetátu podle popisu v ' příkladě 1 a potvrzena GPC na Sephadexu G-15.
Příklad 6
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím deacetylkolchicin, vázaný na tripeptidový spacer, a malé množství Tyr-NH2.
-Tyr-NH2
-Ala-Val-Ala-ONp (16) deacetylcolchicin
------------>
-Tyr-NH2
-Ala-Val-Ala-deacetylcolchicin (17)
-17CZ 278551 B6
Příprava MA-Ala-Val-Ala-ONp (15).
g (0,17 mol) alaniňu bylo rozpuštěno v 40 ml metanolu a k roztoku bylo při -15 °C pomalu přidáno 20 g thionylchloridu. Po 1 hodině za teploty místnosti a 2 h varu byl odstraněn metanol a 12 g Ala-OMe.HCl bylo isolováno pomocí diethyléteru.
Do roztoku 10 g (0,086 mol) valinu a 3,4 g (0,086 mol) NaOH ve směsi dioxan - voda (2 : 1) bylo pomalu přidáno při. o °C za intenzivního míchání 20,5 g (0,094 mol) di-tert-butyldikarbonátu. Reakční směs byla míchána další hodinu při teplotě místnosti, dioxan byl odstraněn za sníženého tlaku a po okyselení směsi na pH 2 až 3 byl získán BOC-Val-OH. Surový produkt, sestávající z 18 g viskózního oleje, byl získán po odpaření rozpouštědla z ethylacetátového extraktu.
Kondensace BOC-Val-OH s Ala-OMe.HCl byla provedena metodou směsného anhydridu; 12 g (0,055 mol) BOC-Val-OH bylo rozpuštěno v 40 ml suchého THF a k roztoku, ochlazenému na -15 ’C, bylo přidáno 7,7 g (0,055 mol) Ala-OMe.HCl a 5,6 g (0,055 mol) triethylaminu. Reakční směs byla pak míchána při teplotě místnosti dalších 16 hodin. THF byl odpařen a produkt byl extrahován ethylacetátem. Rekrystalizace z éteru poskytla 8,1 g analyticky čistého BOC-Val-Ala-OMe, t.t. 138 až 148 °C.
Odstranění BOC skupiny bylo provedeno rozpuštěním 8,1 g BOC-Val-Ala-OMe v 60 ml methanolu a přidáním 20 ml 30 % methanolického HC1. Po 2 hodinách míchání bylo rozpouštědlo odpařeno á byl isolován surový HCl.Val-Ala-OMe.
N-methakryloylalanin byl připraven Schotten-Baumanovou acylací. Kondensace MA-Ala-OH (5,35 g; 0,034 mol) s' HC1.Val-Ala-OMe (8,1 g) byla provedena v dimethylformamidu pomocí dicyklohexylkarbodiimidu (7,0 g) v přítomnosti triethylaminu (3,4 g). Rekrystalizací z CH2C12 (s přídavkem penthanu) bylo získáno 9,5 g MA-Ala-Val-Ala-OMe.
g MA-Ala-Val-Ala-OMe bylo hydrolyzováno v methanolu s malým přebytkem 2N BaOH a po odstranění methanolu okyseleno kyselinou citrónovou na pH 3; 4 g surového produktu bylo použito v následující reakci.
Z 3,6 g MA-Ala-Val-Ala-OH (0,012 mol), 1,5 g (0,012 mol) p-nitrofenolu a 2,5 g (0,0125 mol) dicyklohexylkarbodiimidu v 50 ml tetrahydrofuranu bylo připraveno 2,0 g (výtěžek 40 %) MA-Ala-Val-Ala-ONp; t.t. 174 až 176 °C, který byl překrystalizován z ethylacetátu/hexanu. Molární extinkční koeficient ^74 nm = 9 300 (DMSO). ·
Příprava polymerního prekurzoru.
Kopolymerizace HPMA (95 mol. %), MA-Tyr-NH2 (1 mol. %) a MA-Ala-Val-Ala-ONp (4 mol. %) poskytla polymerní prekurzor, který obsahoval 2,9 mol. % postranních řetězců s ONp skupinami. M^. = 27 000; M^/Mn = 1,4 (stanoveno pro aminolyzovaný prekurzor).
Směs deacetylkolchicinu a isodeacetylkolchicinu byla připravena reakcí trimethylkolchicinové kyseliny s diazomethanem, zná
-18CZ 278551 B6 mým postupem .(Biochemistry 25, 2463 (1966).
Vázání deacetylkolchicinu.
K roztoku 0,41 g polymerního prekurzoru (16), obsahujícího 4,0.10-5 mol ONp skupin, v 1,6 ml DMSO bylo přidáno 0,021 g (6,0.10-5 mol) deacetylkolchicinu v DMSO. Směs byla míchána po dobu 20 hodin za teploty místnosti v temnotě a potom byl polymer vysrážen v acetonu. Přečištění bylo provedeno ultrafiltrací (membrána UM-02) ve vodě s 20 % methanolu. Polymerní produkt byl isolován lyofilizací a obsahoval 2,7 mol. % postranních řetězců, ukončených deacetylkolchicinem. (Vypočítáno z molárního extinkčního koeficientu ε 35θ nm = 1,6 . 104 (ethanol)).
Příklad 7
Příprava větveného polymeru, obsahujícího daunomycin a galaktózamin, připravený následnou aminolýzou.
-Tyr-NH2 ,-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp • (18)
1. H(Phe)-NH(CH2)6NH-(Phe)H
2. daunomycin
3. galaktózamin ---------------------------------->
-Tyr-NH2
-Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin) '-Gly-Phe-Leu-Gly-gal
-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe-NH(CH2)6NH-Phe-Gly-Leu-Phe-Gly ' (19)
Polymerní prekurzor (18) byl připraven kopolymerizací HPMA (90 mol. %), MA-Tyr-NH2 (1 mol. %), a MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (9,0 mol. %). Polymerní prekurzor (18) obsahoval 8,0 mol. % postranních řetězců, ukončených skupinami ONp.Mw = 17 000; Mw/Mn = 1,3 (stanoveno pro aminolyzovaný prekurzor).
0,2 g polymerního prekurzoru (18) (8,0 mol. % postranních řetězců, obsahujících skupiny ONp) v 0,8 ml DMSO (9,8 . 10-5 mol ONp) bylo přidáno k roztoku 0,0045 g (1,1 . 10-5 mol) N,N'-bis-(H-Phe)hexamethylendiaminu v 0,2 ml DMSO. Směs byla r.:·-liána za teploty místnosti po 5 minut a potom bylo postupně přidáno 0,036 g (6,3 . 10-5 mol) hydrochloridu daunomycinu, rozpuštěného v 0,3 ml DMSO a 0,0064 g (6,3 . 10-5 mol) triethylaminu. Směs byla míchána po dobu 60 minut a poté byl přidán roztok hydrochloridu galaktózaminu (0,018 g; 8,5 . 10-5 mol) a triethylamin (0,0086 g; 8,5 . 10-5 mol). Směs byla míchána po dalších 16 hodin
-19CZ 278551 B6 a polymer byl vysrážen v acetonu. Polymer byl přečištěn nejprve gelovou filtrací s použitím Sephadexu LH-20 a methanolu a poté dialýzou ve Viskingově dialyzační trubici proti vodě. Čistý polymer byl isolován lyofilizací. Polymerní produkt obsahoval 2,8 mol. % postranních řetězců, zakončených daunomycinem (7,8 hm. % daunomycinu - stanoveno z e 485 nm = 9,8 . 103 v DMSO) a 3,9 mol.
% postranních_řetězců, zakončených ga1aktózaminem. Výtěžek polymeru 0,15 g; = 110 000; Í^/Mn 4,0 (Mw aminolyzovaného prekurzoru byla 17 000; ί^/ΐ^ =1,3).
Příklad 8
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím bleomycin a Tyr-NH2 tyrosinamid.
-Tyr-NH2
-Gly-Leu-piy-ONp (20) bleomycin ------------>
-Tyr-NH2
-Gly-Leu-Gly-bleomycin (21)
Methakryloylglycylleucylglycin p-nitrofenylester byl připraven postupem, popsaným v příkladě 6 pro sloučeninu (15).
Polymerní prekurzor byl získán kopolymerizací HPMA (94 mol. %), MA-Tyr-NH2 (1 mol. %) a MA-Gly-Leu-Gly-ONp (5 mol. %). Polymerní prekurzor (20) obsahoval 4,3 mol. % postranních řetězců, zakončených skupinami ONp.
K roztoku 0,137 g prekurzoru (20) (3,8 . 10~5 moj skupin ONp) v 0,55 ml dimethylsulfoxidu byl přidán roztok 0,047 g (3,8.10-5 mol) sulfátu bleomycinu a 0,0038 g (3,8 . 10-5 mol) triethylaminu v 0,3 ml DMSO. Reakční směs byla míchána po dobu 12 hodin a polymer byl poté isolován přídavkem 20 μΐ aminopropanolu a vysrážením v acetonu. Po dvou dnech dialýzy za použití Viskingovy trubice byl polymer lyofilizován. Výtěžek 0,102 g. Polymerní produkt obsahoval 3,1 mol. % postranních řetězců, ukončených bleomycinem (stanoveno kinetickým měřením koncentrace ONp skupin).
Příklad 9
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím hormon, stimulující melanocyty (MSH), navázaný na dipeptidový spacer.
-Gly-Gly-ONp (22)
MSH ------------>
-Gly-Gly-MSH )
-20CZ 278551 B6
K roztoku 0,20 g polymerního prekurzoru (22) (5,0 mol. % Gly-Gly-ONp), který obsahoval 6,6 . 10”5 mol ONp skupin, v 0,8 ml DMSO byl přidán roztok 0,005 g (3,0 . 10~5 mol) hormonu, stimulujícího melanocyty, v 0,3 ml DMSO. Po 16 hodinách míchání bylo přidáno 10 μΐ aminopropanolu a polymerní produkt byl výsrážen v acetonu. Po přečištění pomocí dialýzy a lyofilizace byl produkt analyzován na obsah vázaného MSH. Polymerní produkt (23) obsahoval 1,3 hm. % MSH (stanoveno spektroskopicky: pro 0,347 mg/ml MSH ve vodě je A1 =1,49).
J 278.mii ’
Příklad 10
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím desferioxamin, vázaný na tetrapeptidový spacer.
1-Tyr-NH2 i-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (24) desferioxamin -------------->
'-Tyr-NH2
-Gly-Phe-Leu-Gly- > desferioxamin) > (25)
Polymerní prekurzor (24), obsahující 4,3 mol. % postranních řetězců s ONp skupinami (0,20 g; 5,3 . 10-5 mol ONp skupin), byl rozpuštěn v 0-,8 ml DMSO a bylo k němu přidáno 0,070 g (1,06 . 10“4 mol) desferioxaminu a 0,011 g (1,06 . 10~4 mol) triethylaminu v 0,2 ml DMSO. Po 16 hodinách míchání za teploty místnosti byl polymerní produkt výsrážen v 200 ml acetonu. Přečištění bylo provedeno dialýzou ve vodě, obsahující 20 % metanolu, pomocí Viskingovy dialyzační trubice. ......
Obsah desferioxaminu byl počítán z kinetických měření, kterými se stanoví obsah ONp skupin v reakční směsi. Polymerní produkt obsahoval 3,9 mol. % postranních řetězců s vázaným desferioxaminem (12,4 hm. % desferioxaminu).
Příklad 11
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím bestatin a galaktózamin vázané na tetrapeptidový spacer.
-Tyr-NH2
-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (26)
1. bestatin
2. galaktózamin ---------------->
-Tyr-NH2
-Gly-Phe-LeuGly-bestati.i
-Gly-Phe-LeuGly-gal (27)
0,150 g polymerního prekurzoru (18), jež obsahoval 6,8 . 10~5 mol ONp skupin, bylo rozpuštěno v 0,6 ml DMSO a byl přidán roztok 0,030 g (1,3 . 10“4 mol) galaktózaminu a 0,014 g (1,3 .
-21CZ 278551 B6 mol) triethylaminu v 0,2 ml DMSO. Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti po dobu 16 hodin, produkt byl vysrážen v 200 ml acetonu a čištěn dialýzou po dobu 3 dnů. Lyofilizovaný produkt (0,111 g) byl analyzován na -obsah galaktózaminu (viz příklad 1). Množství navázaného bestatinu bylo vypočítáno z kinetických měření sledováním množství ONp skupin v reakční směsi. Polymerní produkt (27) obsahoval 1,4 mol. % postranních řetězců, ukončených bestatinem (2,4 hm. % bestatinu) a 5,4 mol. % postranních řetězců, ukončených galaktózaminem (5,5 hm. % galaktózaminu).
Příklad 12
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím adriamycin a mannosamin, vázané na tetrapeptidový spacer.
-Tyr-NH2
-Gly-Leu-Leu-Gly-ONp (28)
1. adriamycin
2. mannosamin -------------->
-Tyr-NH2 '-Gly-Leu-Leu-Glyi adriamycin
-Gly-Leu-Leu-GlymannOsamin (29)
Methakryloylglycylleučylglycin p-nitrofenylester byl připraven podobným postupem, jako sloučenina (3) v příkladě 1.
Polymerní prekurzor (28) byl připraven kopolymerizací HPMA (89,5 mol. %), Ma-Tyr-NH2 (1 mol. %) a MA-Gly-Leu-Leu-Gly-ONp (9,5 mol. %). Polymer obsahoval 8,1 mol. % tetrapeptidových postranních řetězců, ukončených skupinami ONp. = 17 000;
= 1,3 (stanoveno pro aminolyzovaný prekurzor).
Polymerní produkt (29) byl připraven z 0,4 g polymerního prekurzoru (28), obsahujícího 1,8 . 10-4 mol skupin ONp a rozpuštěného v 1,6 ml DMSO. K roztoku bylo přidáno 0,06 g (1,1 . 10~4 mol) triethylaminu. Následující postup byl tentýž, jako v příkladě 1. Polymerní produkt obsahoval 3,2 mol. % postranních řetězců, obsahujících adriamycin (9,6 hm. % adriamycinu) a 4,1 mol. % postranních řetězců, obsahujících mannosamin. Výtěžek byl 0,31 g. Obsah sacharidových zbytků byl stanoven po kyselé hydrolýze pomocí GPC s použitím známé metody (Anal. Biochem. 73, 532 (1976).
Příklad 13
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím bleomycin, navázaný na tripeptidový spacer.
rGly-Phe-Tyr-ONp > (30) bleomycin --------------------->·
-Gly-Phe-Tyr-bleomycin ' (31)
-22CZ 278551 B6
Reaktivní monomer MA-Gly-Phe-Tyr-ONp a polymerňí prekurzor (30) byly připraveny podle Makromol. Chem. 182, 799 (1981). Polymerní prekurzor obsahoval 8,5 mol. % postranních řetězců s ONp skupinami. Í^/Mj^ = 1,3 (stanoveno pro aminolyzovaný prekurzor).
Vázání bleomycinu na polymerňí prekurzor bylo provedeno podle procedury, popsané v příkladě 8. Polymerňí produkt (31) obsahoval 5,7 mol. % postranních řetězců s bleomycinem.
Příklad 14
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím puromycin a fukosylamin, vázané na tripeptidový spacer.
i-Gly-Phe-Phe-ONp (32)
1.puromycin
l.fucosylamin
-Gly-Phe-Phe-puromycin
-Gly-Phe-Phe-fucosylamin (33)
Reaktivní monomer MA-Gly-Phe-ONp a polymerňí prekurzor (32) byly připraveny podle Makromol. Chem. 182, 799 (1981). Polymerňí prekurzor obsahoval 12,9 mol. % postranních řetězců s ONp skupinami. Mw = aminolyzovaného prekuržoru bylo 14 000; Í^/Mj^ = 1,28. K roztoku 0,25 g polymemího prekuržoru (32) 1,64 . 10~4 mol skupin ONp) v 1 ml DMSO byl přidán roztok 0,029 g (4,9 . 10~5 mol) dihydrochloridu puromycinu a 0,010 g (9,8 . 10“5 mol) triethylaminu v 0,25 ml DMSO. Reakce probíhala po dobu 1 hodiny a potom bylo do směsi přidáno 0,015 g (9,0 . 10“5 mol) fukosylaminu v 0,1 ml DMSO). Následující postup byl podobný postupu, popsanému v příkladě 5. Polymerňí produkt (33) obsahoval 4,1 mol. % postranních řetězců, ukončených puromycinem a 6,7 mol. % postranních řetězců, ukončených fukosylaminem.
Příklad 15
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím transferin, vázaný na dipeptídový spacer.
-Gly-Gly-ONp (34) transferin ------------->
-Gly-Gly-transferin (35)
27,4 g pclvmerního prekuržoru (34), jenž obsahoval 11,4 mol. % postranních řetězců Gly-Gly-ONp, bylo rozpuštěno v 0,25 ml zředěné chlorovodíkové kyseliny (pH 3,0). Bylo přidáno 1,25 ml Sorensenova pufru (pH 8), obsahujícího 0,1 M NaCl a poté roztok 14,2 mg transferinu v 0,5 ml téhož pufru. Po 45 minutách bylo ke směsi přidáno 10 μΐ l-amino-2-propanolu, rozpuštěného v 0,2 ml Sorensenova pufru. Po 30 minutách byla reakce zastavena a směs byla převedena do Viskingovy dialyzační trubice a dialyzována proti fyziologickému roztoku s fosfátovým pufrem (pH 7,2).
-23CZ 278551 B6
Příklad 16
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím IgG, vázaný na dipeptidový spacer.
-Gly-Gly-OH
IgG ------>
-Gly-Gly-IgG
Kopolymer HPMA a MA-Gly-Gly-OH (15,0 mg; 5,0 . 10-6 mol COOH skupin) byl rozpuštěn v Sorensenově pufru s pH 5 (75 μΐ) a při teplotě 1 °C byl přidán roztok.0,002 mg N-cyklohexyl-N'-(2-morfolinoethyD-karbodiimidu v témž pufru (40 μΐ). Směs byla míchána po 15 minut a potom k ní bylo pomalu přidáno 60,0 mg IgG ve 235 μΐ téhož pufru. Směs byla dále míchána po 5 hodin a ponechána stát přes noc při 4 ’C. Surová reakční směs byla dialyzována proti fyziologickému roztoku s fosfátovým pufrem (pH 7,2).
Příklad 17
Příprava větveného polymeru, obsahujícího puromycin a galaktózamin, vázané na tripeptidový spacer.
\ -Gly-Phe-Tyr-ONp 1. H-Ala-Gly-HN(CH2)gNH-Gly-Ala-H
2. puromycin ' (36) 3. galaktózamin
------------------------------------------------>
/-Gly-Phe-Tyr-puromycin)
S-Gly-Phe-Tyr-gal<
) -Gly-Phe-Tyr-Ala-Gly-HN(CH2)6NH-Gly-Ala-Tyr-Phe-Gly- ( < (37)5
Polymerní prekurzor (36), obsahující 4,8 mol. % postranních řetězců se skupinami ONp, byl připraven podle Makromol. Chem. 182, 1899 (1981).
2,0 g polymerního prekurzoru (36), jenž obsahoval 5,9 . 10-4 mol skupin ONp, bylo rozpuštěno v 8 ml DMSO a postupně byl přidán roztok 0,038 g (9,8 . 10-5mol)dihydrochloridu 1,2-bis)alanylglycylamino)ethanu v 0,2 ml DMSO a 0,020 g (2,0 . 10-4 mol)triethylaminu. Po 20 minutovém míchán?' byl k reakční směsi přidán roztok 0,120 g (2 . 10“4 mol) dihydrochloridu puromycinu v ml DMSO a 0,040 g (4 . 10“4) triethylaminu. Po hodinovém míchání reakční směsi byl přidán roztok 0,129 g (6,0 . 10~4 mol) hydrochloridu galaktózaminu a 0,060 g (6,0 . 10“4mol) triethylaminu v 1 ml DMSO. Směs byla míchána dalších 16 hodin při teplotě místnosti. Produkt byl isolován a přečištěn, jak bylo popsáno v příkladu 5. Produkt
-24CZ 278551 B6 obsahoval 1,5 mol % postranních řetězců, zakončených galaktózaminem.
Příklad 18
Příprava větveného polymeru, obsahujícího puromycin a fukosylamin, vázané na tripeptidový spacer.
-Gly-Phe-Phe-ONp (38)
1. H-Gly-HN(CH2)6NH-Gly-H
2. puromycin
3. fucosylamin
-Gly-Phe-Phe-puromycin
-Gly-Phe-Phe-fucosylamin
-Gly-Phe-Phe-Gly-HN(CH2)θΝΗ-Gly-Phe-Phe-Gly(36)
Polymerní prekurzor (38), obsahující 4,8 mol. % postranních řetězců se skupinami ONp, byl připraven podle Makromol. Chem. 182, 1899 (1981).
2,0 g polymerního prekurzoru (38), obsahujícího 5,9 . 10-4 mol skupin, bylo rozpuštěno v 8 ml DMSO a k roztoku byl postupně přidán roztok 0,029 g (9,8 . 10-5 mol) 1,2-bis(glycylamino)ethan diacetátu v 0,2 ml DMSO, připravený podle Makromol. Chem. 182, 1899 (1981), a 0,020 g (2,0 . 10~4 mol) triethylaminu. Síťování bylo prováděno po dobu 5 minut. Do směsi bylo potom přidáno 0,120 g (2,0 . 10-4 mol) dihydrochloridu puromycinu v 1 ml DMSO a 0,040 g (4 . 10-4 mol) triethylaminu. Reakční směs byla míchána 16 hodin při teplotě místnosti. Produkt byl isolován a přečištěn podle postupu, popsaného v příkladě 5. Produkt obsahoval 1,4 mol. % postranních řetězců, zakončených puromycinem (4,2 hm. % puromycinu) a 3,0 mol. % postranních řetězců, zakončených fukosylaminem.
Příklad 19
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím daunomycin, vázaný na tetrapeptidový spacer, a galaktózu, vázanou přímo na polymerní řetězec.
—Gal
-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (40) daunomycin
------------->
-Gal
-Gly-Phe-Leu-Glydaunomycin (41)
-25CZ 278551 B6
Příprava polymerního prekurzoru (40).
Ve 13,0 ml dimethylsulfoxidu bylo rozpuštěno 0,71 g (5 103 mol) 1,2,3,4-di-0-isopropyliden-6-0-methakryloyl-a-D-galakto pyranózy (připravené podle J. Chem. Soc.' (London) C, 1913 (1986)). K tomuto roztoku bylo přidáno 3 mg ázobisisobutyronitrilu (1,8 . 10“4 mol) v 1,8 ml dimethylsulfoxidu a nato 291 mg MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (5 . 10“4 mol) v 1 ml DMSO, jenž byl připraven podle metody, popsané v příkladě 1. Směs byla probublána dusíkem a potom polymerizována v zatavené ampuli při 60 °C po 30 hodin. Výsledný polymer byl přesrážen éterem a deacetonován rozpuštěním v 80% vodné kyselině mravenčí po 20 hodin při teplotě místnosti. Výtěžek polymerního prekurzoru po odpaření mravenčí kyseliny byl 1,2 g; obsah skupin ONp byl 9,5 mol. % a obsah galaktózy byl 52 mol. %.
Vázání daunomycinu na polymerní prekurzor (40).
V 1,6 ml DMSO bylo rozpuštěno 374 mg (1,6 . 10”4 mol) polymerního prekurzoru (40) a k roztoku bylo přidáno 50 mg (8 . 10-5 mol) hydrochloridu daunomycinu v 0,3 ml DMSO a 0,0111 ml (8 .
10-5 mol) místnosti a produkt rozpuštěna triethylaminu. Reakční směs byla míchána při teplotě minut. Potom bylo přidáno 20 μΐ aminopropanolu byl ihned vysrážen v 200 ml acetonu. Sraženina byla v metanolu a polymerní frakce byla oddělena na 100 x 2,5 cm koloně se Sephadexem LH-20, promyté methanolem. Výtěžek byl 0,28 g; obsah tetrapeptidových postranních řetězců, zakončených daunomycínem, byl 3,5 mol. %.
Příklad 20
| Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím isopropylester melfalanu, vázaný na tripeptidový spacer, a galaktózu, vázanou přímo na hlavní řetězec | |
| k-AcGalaktóza /-Gly-Phe-ONp | Glycylmelfalan (-AcGalaktóza isopropylester ( (Gly-Me-ipe) ( -Gly-Phe-Gly-Me-ipe |
| / (42) | ........... > \ ( (43) |
| kyselina mravenčí | /-Galaktóza |
| )-Gly-Phe-Gly-Me-Ipe |
/ (44)
Příprava isopropylesteru melfalanu (Me-ipe).
Roztok 5 g melfalanu v 20 % HC1 v isopropylalkoholu byl vařen 5 hodin pod zpětným chladičem. Po ochlazení v chladničce byly izolovány bílé krystaly analyticky čistého produktu a vysušeny ve vakuu; t.t. 200 až 201 °C. Roztok Me-ipe v 50 ml diethyléteru byl probubláván NH3 3 hodiny; rozpouštědlo bylo potom odpařeno a olejovitý produkt byl použit v dalším stupni syntézy.
-26CZ 278551 B6 •Příprava isopropylesteru glycylmelfalanu (Gly-Me-ipe).
Gly-Me-ipe byl připraven reakcí 3,03 g BOC-Gly-OH s 6,0 g Me-ipe v 50 ml tetrahydrofuranu s použitím DCC metody. Chrániči skupiny BOC byla odstraněna v 15% metanolickém HC1 a volná fáze byla připravena probubláváním suspenze Gly-Me-ipe hydrochloridu v diethyléteru amoniakem. Chlorid amonný byl odfiltrován a olejovitý produkt byl isolován po odpaření rozpouštědla.
Příprava polymerního prekurzorů (42).
Polymerní prekurzor (42) byl připraven radikálovou srážecí kopolymerizací DCM (1,2,3,4-di-0-isopropyliden-6-0-methakryloyl-α-D-galaktopyranózy) a p-nitrofenylesteru methakryloylglycylphenylalaninu (MA-Gly-Phe-ONp) (připraven dle Makromol. Chem. 178, 2169 (1977)) podle postupu, popsaného v příkladě 1.
Polymerační směs: HPMA 3,43 (85 mol. %) MA-Gly-Phe-ONp 0,926 g (8 mol. %) DGM 0,65 g (7 mol. 5%) azobisisobutyronitril 0,24 g .Polymerizace byla prováděna 24 hodin při 50 °C v 44 ml acetonu.
Vázání Gly-Me-ipe na polymerní prekurzor (42).
Ve 20 ml dimethylsulfoxidu byly rozpuštěny 3 g polymerního prekurzorů (42) a k roztoku bylo přidáno 0,816 g Gly-Me-ipe. Směs byla míchána za teploty místnosti 3 dny a polymer byl potom vysrážen v acetonu a dvakrát přesrážen z metanolu do směsi acetonu a diethyléteru (1:1). Chráněná galaktóza, vázaná na polymerním nosiči, byla deacetonylována v 80% kyselině mravenčí (viz příklad 19) a polymerní léčivo bylo isolováno lyofilizací a přesrážením z metanolu do směsi aceton-diethyléter (1 : 1). Výtěžek polymeru 2,9 g. Obsah léčiva, vázaného na polymerním nosiči (Isopropylesteru melfalanu): 106 mg/g polymeru (vypočítáno z elementární analýzy po odečtení obsahu chloru). Molekulová hmotnost polymerního nosiče: = 35 000. Nepřítomnost nízkomolekulárních látek (volného léčiva) byla prokázána GPC s použitím Sephadexu G-25, jako náplně kolon.
Příklad 21
Příprava polymeru s jednoduchým řetězcem, obsahujícím isopropylester melfalanu, vázaný na tetrapeptidový spacer, a galaktózu, vázanou na hlavní řetězec.
| (-AcGalaktóza | Leucylglycylmelfalan isopropylester (Leu-Gly-Me-ipe) |
| í-Gly-Phe-ONp | ------------------------------------------> |
| )-AcGalaktóza | kyselina mravenčí /-Galaktóza -----------------:-------------> 2 |
-Gly-Phe-Leu-Gly-Me-ipe /-Gly-Phe-Leu-Glyi / Me-ipe (43) ) (46)
-27CZ 278551 B6
Příprava isopropylesteru leucylglýcylmelfalanu.
V 35 ml THF bylo reagováno 3,1 g BOC-Leu-Gly-OH s 3,7 g Me-ipe s použitím DCC metody. Produkt BOC-Leu-Gly-Me-ipe byl krystalizován z acetonu. Chránící skupina BOC byla odstraněna probubláváním amoniaku přes suspenzi hydrochloridu v diethyléteru. Čistý olej ovitý produkt byl izolován po oddělení chloridu amonného a odpaření rozpouštědla. Polymerní prekurzor (42) byl připraven metodou, popsanou v příkladě 20.
Vázání isopropylesteru leucylglycylmelfalanu na polymerní prekurzor.
Reakce byla provedena postupem, podobným jako v příkladě 18. K roztoku 1,5 g polymerního prekurzoru (42) v 10 ml DMSO bylo přidáno 0,5 g Leu-Gly-Me-ipe a směs byla míchána 3 dny. Polymer (45) byl vysrážen v směsi aceton-diethyléter (1:1) a dvakrát přesrážen z metanolu do téže směsi. Deacetonylace galaktózy a izolace a charakterizace polymeru (46) byly provedeny způsobem, popsaným v příkladě 18. polymerního nosiče 35 000; obsah léčiva (isopropylesteru melfalanu, vázaného na polymer): 118 mg/g polymeru. Nepřítomnost volného léčiva byla kontrolována GPC (Sephadex G-25).
Příklad 22 až 25
Vliv různých peptidových spacerů na účinnost téhož léčiva.
Příklad 22
Vliv na aktivitu L1210 myší leukémie in vitro.
Tyto pokusy byly provedeny se třemi analogy HPMS, které neobsahovaly specifické determinanty. Všechny tři analogy obsahovaly daunomycin jako biologicky aktivní část a peptidový spacer k léčivu podle bodu (b). V detailu vypadaly analogy takto:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Gly-daunomycin (b) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin (c) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Phe-Leu-daunomycin.
Myší leukémie L1210 byla uchovávána jako suspenzní kultura v mediu RPMI 40, obsahujícím 10 % koňského séra, inaktivovaného teplem. Za těchto podmínek trvá zdvojení počtu buněk 15 až 20 hodin při hustotě buněk až přibližně 1 . 105 buněk/ml. Hustoty buněk byly stanoveny pomocí Coulter počítače.
Při hodnocení cytotoxicity polymerního léčiva buňky byly nasazeny do 10 ml zkumavek a byla měřena počáteční hustota buněk. Různá polymerní léčiva byla přidána v různých koncentracích a buňky byly uchovávány v kultivační komoře po dalších 72 hodin před dalším měřením hustoty buněk.
Počet buněk, nalezených ve zkumavkách, obsahujících polymerní léčivo, byl vyjádřen jako procento buněk, nalezených ve zku-28CZ 278551 B6 mavkách, inkubovaných po stejnou dobu (72 h) bez přídavku léčiva. Výsledky jsou znázorněny graficky na obrázku 1 přiložených výkresů, v němž jsou vyneseny křivky procentického růstu buněk proti koncentraci daunomycinu v μg/ml. Výsledky ukazují·, že všechny tři analogy byly cytotoxické vůči myší leukémii L1210 in vitro do jisté míry, ale analogy (b) a (c) vykazovaly lepší inihibiční efekt, než analog (a).
Příklad 23
Vliv na aktivitu myší leukémie L1210 in vitro.
Experimenty byly provedeny s třemi HPMA analogy, neobsahujícími specifické determinanty. Všechny tři analogy obsahovaly sarkolysin (melfalan-ipe) jako biologicky aktivní část a peptidové spacery k léčivu podle bodu (b). Tyto analogy byly zkoušeny v detailním složení:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Leu-Gly-sarkolysin;
(b) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-sarkolysin;
(c) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Gly-sarkolysin.
Postup experimentu byl stejný jako v příkladě 22.
Výsledky jsou znázorněny graficky na obrázku 2 připojených výkresů, v němž křivky představují .závislosti procentického růstu buněk na koncentraci sarkolysinu v μg/ml·. Výsledky ukazují, že všechny tři analogy byly do jisté míry cytotoxické vůči myší leukémii L1210 in vitro, avšak analog (c) měl podstatně lepší inhibiční účinek, než analogy (a) a (b), které při nízkých koncentracích stimulovaly růst.
Příklad 24
Vliv na aktivitu myší leukémie L1210 in vivo.
Následující experimenty byly provedeny se dvěma HPMA analogy, které neobsahovaly specifické determinanty; obě látky měly jednoduchý řetězec a obsahovaly daunomycin jako biologicky aktivní součást a peptidové spacery podle bodu (b). Detailní struktura analogů byla následující:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin (b) HPMA se substituenty -Gly-Gly-daunomycin.
Myší leukémie L1210 byla naočkována (105 živých buněk) intraperitonálně myším DBA2 ve dni nula. Kopolymery HPMA byly podávány ve dnech 1. 2. a 3. Bylo zaznamenáno přežití všech zvířat. Kontrolní (neléčená) zvířata uhynula vždy mezi 15. a 20. dnem. Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce.
-29CZ 278551 B6
Tabulka 1
| Léčba | Dávka | Střední doba přežití dny | Dlouhodobé přežití (-50 dní) |
| Analog (a) | 5 mg/kg | 32 | 3/5 |
| Analog (a) | 2 mg/kg | 31 | 2/5 |
| Analog (b) | 5 mg/kg | 18 | 1/5 - |
| Analog (b) | 8 mg/kg (x 1) | 16 | 1/5 |
| + 5 mg/kg (x 1) | |||
| Žádná | 17 | 2/10 |
Z tabulky 1 je zřejmé, že přežití zvířat při podávání analogu (b). Oproti tomu, zvířata (a) přežívala znatelně déle a značná část jich době.
se neprodloužilo léčená analogem přežila dlouhoPříklad 25
Vliv na rychlost uvolňování léčiva in vitro.
Byly připraveny dva HPMA analogy, s jednoduchým řetězcem, které neobsahovaly specifické determinanty. Oba analogy obsahovaly daunomycin jako biologicky aktivní součást, vázaný na konci peptidického spaceru. Detailní složení analogů bylo:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin (b) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Phe-Leu-daunomycin.
Každý analog (25 mg v 1,5 ml) byl inkubován s 1 ml roztoku enzymu při 37 °C. Enzymový roztok obsahoval přečištěný lysosomální enzym kathepsin L (3,8 . 10-7 mol/1) v fosfátovém pufru (pH 6,0), obsahujícím 5 mM glutationu a 1 mM EDTA.
Uvolňování léčiva bylo měřeno v různých časových intervalech extrakcí při odpovídající vlnové délce. Vzorky inkubační směsi (0,15 ml) byly odebírány a přidány k 1,5 ml pufru (pH 9,8) a 1,5 ml ethylacetátu. Po pěti minutách intensivního třepání byl odebrán vzorek (1 ml) ethylacetátové vrstvy a extinkce byla měřena při 485 nm.
Výsledky jsou graficky znázorněny na obrázku 3 připojených výkresů, v němž jsou vyneseny křivky množství uvolněného analogu v procentech původně přítomného léčiva proti času v hodinách. Výsledky ukazují, že rychlost uvolňování daunomycinu je podstatně vyšší, byl-li použit jako spacer léčiva -Gly-Phe-Leu-Gly-, než byl-li použit -Gly-Phe-Phe-Leu.
Příklad 26 až 28
Vliv různých léčiv, které mají stejné peptidové spacery.
-30CZ 278551 B6
Příklad 26
Vliv na aktivitu myší leukémie L1210 in vitro.
Experimenty byly prováděny se čtyřmi HPMA analogy, které neobsahovaly determinanty; všechny látky měly jednoduchý řetězec a obsahovaly různá léčiva. Spacery všech čtyř léčiv byly v souhlase s vynálezem: dvě měly spacery -Gly-Phe-Leu-Gly- a dvě spacery -Gly-Leu-Phe-. Detailní složení analogů bylo:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin a tyrosinamid (b) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-puromycin a tyrosinamid (c) HPMA se substituenty -Gly-Leu-Phe-sarkolysin a (d) HPMA se substituenty -Gly-Leu-Phe-tritylcystein.
Experimentální postup byl tentýž jako v příkladě 22.
Výsledky jsou graficky znázorněny na obrázku 4 připojených výkresů, v němž jsou křivky, získané vynesením procent buněk, které přežívaly po 72 hodinách, proti koncentraci polymerního léčiva v mg/ml. Výsledky ukazují, že do jisté míry jsou všechny čtyři polymerní léčiva cytotoxická vůči leukémii L1210 in vitro, ale že daunomycin s peptidovou vazbou byl podstatně účinnější než puromycin, a tritylcystein byl mírně účinnější než sarkolysin.
Příklad 27
Vliv na aktivitu myší leukémie L1210 in vitro.
Byly připraveny dva analogy HPMA, které neobsahovaly determinanty. Analogy obsahovaly rozdílná léčiva, ale spacer léčiv byl tentýž ve všech případech v souladu s vynálezem. Detailní struktura analogů byla:
(a) HPMA se substituenty -Gly-Gly-deacetylkolchicin a (b) HPMA se substituenty -Gly-Gly-kolcemid.
Experimentální postup je popsán v příkladě 22.
Výsledky jsou graficky znázorněny na obrázku 5 připojených výkresů, v němž byly křivky získány vynesením procentického růstu buněk proti koncentraci polymerního léčiva v mg/ml. Výsledky ukazují, že oba analogy byly cytotoxické vůči myší leukémii L1210 in vitro, ale že analog (b) měl vyšší inhibiční účinek, než analog (a).
Příklad 28
Vliv na rychlost uvolňování léčiva in vitro v přítomnosti enzymů.
Byly připraveny dva analogy HPMA s jednoduchým řetězcem, které neobsahovaly determinanty. Analogy obsahovaly rozdílná léčiva, ale spacer léčiva byl v obou případech stejný a byl v souladu s vynálezem. Detailní struktura analogů byla:
-31CZ 278551 B6 (a) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin a tyrosinamid.
(b) HPMA se substituenty -Gly-Phe-Leu-Gly-puromycin a tyrosinamid.
Obě látky byly zkoumány s použitím dvou různých roztoků enzymů, a to (1) směsi lysosomálních enzymů, izolovaných z krysích jater podle metody Troueta a spol. (1974) v pufru (pH 5,5), obsahujících 1 mM EDTA, 5 mM redukovaného glutathionu a 0,2 % Triton X-100, a (2) přečištěný lysosomální enzym kathepsin L (3,8 . 107 mol/1) ve fosfátovém pufru (pH 6,0), obsahujícím 5mM glutathion a 1 mM EDTA.
Každý analog (25 mg v 1,5 ml) byl inkubován s 1 ml roztoku enzymu. Uvolněné léčivo bylo měřeno v různých časových intervalech extrakcí volného léčiva a změřením absorbance spektrofotometricky při odpovídající vlnové délce. Vzorky inkubační směsi (0,15 ml) byly odebírány a přidány k 1,5 ml pufru (pH 9,8) a 1,5 ml ethylacetátu. Po pěti minutách intenzivního třepání byl odebrán vzorek (1 ml) ethylacetátové vrstvy a extinkce byla změřena při 485 nm pro daunomycin a nebo při 272 nm pro puromycin.
Výsledky jsou graficky znázorněny na obrázku 6 připojených výkresů, v němž byly křivky Získány vynesením množství uvolněného léčiva v procentech původně přítomného léčiva v analogu proti času v hodinách. Výsledky, získané se směsí lysosomálních enzymů (1), jsou vyneseny jako prázdné kroužky a výsledky s přečištěným enzymem kathepsinem L (2) jako vyplněné kroužky.
Tyto výsledky ukazují:
(a) rozdíly v rychlosti ' uvolňování puromycinu a daunomycinu, mající stejný peptidový spacer a (b) rozdíly ve schopnosti přečištěného lysosomálního enzymu a směsi lysosomálních enzymů, získaných z různých zdrojů, degradovat tentýž peptidový spacer, nesoucí totéž koncové léčivo.
(Trouet, A. (1974) Methods in Enzymology, (Fleisher, S. and Packer, L. Eds.), Vol. XXXI, str. 323 až 329, Academie Press, New York. EDTA = ethylendiaminotetraoctová kyselina, Triton X-100 = kvartérní amoniové povrchově aktivní činidlo).
Příklady 29 až 34
Vliv přítomnosti specifických determinantů.
Příklad 29
Vliv na rychlost záchytu polymerů melanomovými buňkami in vitro.
analog, obsahující hormon, stimulující determinant z hormonu, stimulujícího spacer k determinantu byl -Gly-GlyByl připraven HPMA melanocyty (MSH) jako α-malanocyty; peptidový v souladu s vynálezem. Analog byl větveného typu (přes MSH) a ne-32CZ 278551 B6 obsahoval biologicky aktivní součást. Přípravek analogu byl označen radionuklidem 125I a jeho schopnost vázat buňky myšího melanomu Cloně M3 591 byla srovnávána se schopností kontrolního HPMA polymeru, obsahujícího tyrosinamidové substituenty a žádné substituenty determinatu. Tři vzorky kultury byly naočkovány 2 . 106 buněk a inkubovány po tři dny před experimentem. Ke kulturám bylo přidáno 100 μΐ každého polymeru a tyto byly inkubovány až do 60 minut. V daných intervalech byly kultury terminovány a z média byl odebrán vzorek; byl stanoven celkový počet buněk a počet buněk, spojených s radioaktivitou.
Výsledky jsou graficky znázorněny na obrázku 7 připojených výkresů, v němž byly získány křivky vynesením záchytu v μΐ media na mg buněčného proteinu proti času v minutách. Výsledky ukazují, že analog, obsahující MSH, vykazoval vyšší vázání buněk melanomu ve srovnání s kontrolním polymerem.
Příklad 30
Vliv na rychlost spotřeby polymeru lidským fibrovatelem in vitro.
HPMA analog, obsahující apotransferin (75 μΐ, 580 μg/ml), byl značkován radiochemicky jodogenní metodou; -Gly-Gly- byl použit jako spacer k determinantu ve shodě s vynálezem. Látka neobsahovala biologicky aktivní součást. Chromatografie prokázala, že analog měl molární hmotnost asi 260 000, odpovídající vzorci polymer(apotransferin)3.
Po čtyřech dnech pěstování subkultury (buněčný konfluent) byly buňky fibroblastu (lidská pokožka) promyty a inkubovány předem určenou dobu v Hankově vyváženém roztoku solí (3 ml), obsahujícím analog, značený radionuklidem (200 μΐ, ^g/ml j r Počty buněk byly stanoveny ve vzorcích prostředí (1 ml) ve dvou oddělených skupinách, aby se rozlišilo mezi vázáním a internalizací. Skupina byla štěpena trypsinem, aby byla odstraněna vazba ligandu k transferinovému receptoru; skupina 2 nebyla takto upravována. Vzorky obou skupin byly rozpuštěny ve vodném NaOH a byla v nich stanovena radioaktivita a množství proteinu. Rychlost záchytu byla srovnávána s kontrolním HPMA polymerem, obsahujícím -Gly-PhePhe-Leu-aminopropanolové substituenty a žádné substituenty determinantu .
Výsledky jsou graficky znázorněny na obrázku 8 přiložených výkresů, v němž byly křivky získány vynesením záchytu v μΐ media na mg buněčného proteinu proti času v hodinách. Výsledky ukazují, že polymer, obsahující apotransferin, vykazoval zvýšenou interna.iJ žací a vazebnou internalizací vůči lidským fibroblastům ve srovnaní s kontrolním polymerům.
Příklad 31
Vliv na záchyt polymeru lidským hepatomem in vitro
Byla připravena řada HPMA analogů, obsahujících galaktózu jako specifický determinant, v nichž byla galaktóza vázána přímo
-33CZ 278551 B6 na polymerní řetězec esterovou vazbou. Analogy obsahovaly vzrůstající množství galaktózy v rozmezí 0 až 99 mol. %; biologicky aktivní součásti nebyly přítomny. Analogy byly značeny 125I pomocí chloraminu T a byla zkoušena jejich schopnost pronikat do buněk lidského hepatomu (Hep G2) in vitro. Buňky byly pěstovány v jednovrstvých kulturách v EMEM, obsahujícím 10 % plodového hovězího séra. Vždy tři kultury byly naočkovány s 2 . 106 buněk a inkubovány 3 dny před použitím k pokusu. Buňky byly inkubovány s každým analogem (100 μΐ) po dobu 15 sekund. Potom byl odebrán vzorek média a jednovrstvé buňky byly důkladně promyty. K rozpuštění buněk bylo přidáno 2,5 ml M NaOH a byly odebrány vzorky pro stanovení obsahu radioaktivní značky a celkového proteinu.
Výsledky jsou graficky znázorněny na obrázku 9, v němž byly získány křivky vynesením záchytu v % countů x 103 mg buněčného proteinu proti mol. % galaktózy v každém analogu. Výsledky ukazují, že záchyt HPMA kopolymerů s galaktózou lidským hepatomem je úměrná mol. % přítomné galaktózy.
Příklad 32
Vliv na aktivitu myší leukémie L1210 in vitro.
Pokusy byly provedeny se dvěma HPMA kopolymery, z nichž jeden je předmětem tohoto vynálezu. Obě sloučeniny obsahovaly daunomycin jako biologicky aktivní součást s -Gly-Phe-Leu,Glyjako spacer léčiva. Sloučenina podle tohoto vynálezu obsahovala dále fukosylamin jako determinant a -Gly-Phe-Leu-Gly- jako spacer determinantu.
Experimentální postup byl stejný jako v příkladě 22.
Výsledky jsou graficky znázorněny na obrázku 10, v němž byly křivky získány vynesením procentického růstu buněk proti koncentraci daunomycinu v μg/ml. Výsledky ukazují, že cytotoxicita polymerního léčiva vůči myší leukémii L1210 in vitro významně vzroste, je-li v molekule přítomen fukosylamin jako determinant.
Příklad 33
Vliv na cílení polymeru in vivo.
Byly připraveny dva HPMA kopolymery, které měly následující strukturu a složení:
-Tyr-NH2 (1,7 mol %)
-Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin , (3,5 mol %)
Polymer 1
-Tyr-Nri2 (1,8 mol %)
-Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin (2,2 mol %)
-Gly-Phe-Leu-Gly-galaktózamin (1,9 mol %)
Polymer 2
-34CZ 278551 B6
Polymer 2 je předmětem tohoto vynálezu, polymer 1 nikoliv.
Oba HPMA polymery byly značeny radionuklidem 125I pomocí chloraminu T. Tato radiaktivní značka je stálá v biologickém· prostředí a proto umožňuje sledovat osud polymeru in vivo.
Polymer (přibližně 100 μg v 0,1 ml pufru) byl injekčně podán do femorální žíly samce krysího plemene Wistar (250 až 350 g), udržovaného v anestézii a po 30 minutách bylo zvíře usmrceno a měřeno rozdělení radioaktivity v jeho těle.
Dosažené výsledky jsou znázorněny v tabulce 2
Tabulka 2
| Rozdělení v těle | % změřené radioaktivity | |
| Polymer 1 | Polymer 2 | |
| Slezina | 0,51 | 0,19 |
| Ledviny | 4,39 | 4,83 |
| Plíce | 1,34 | 1,37 |
| Játra | 4,97 | 23,20 |
| Krev | 88,77 | 70,38 |
Z výsledků vyplývá, že připojení i malého množství galaktózaminu (1,9 mol %) účinně směruje významnou část HPMA kopolymeru do krysích jater během 30 minut od nitrožilního podání.
Příklad 34
Vliv na aktivitu myší leukémie L1210 in vivo.
Pokusy byly provedeny se dvěma HPMA analogy, z nichž jeden je předmětem tohoto vynálezu. Oba analogy obsahovaly daunomycin jako biologicky aktivní součást, -Gly-Phe-Leu-Gly- jako spacer léčiva a zbytky tyrosinamidu. Polymer podle vynálezu obsahoval ještě fukózu jako determinant; spacer determinantu byl -Gly-PheLeu-Gly-. Detailní struktura polymerů byla:
Š-Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin \-Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin
-Tyr-NH2 (-Gly-Phe-Leu-Gly-fukóza <-Tyr-NH2
Polymer 1 ‘ Polymer 2
Myší leukémie L1210 byla naočkována (105 živých buněk) intraperitoneálně myším DBA2 v den nula. Zvířata byla potom rozdělena do dvou skupin, které byly léčeny odděleně. Zvířata první skupiny byla léčena polymerem 1, zvířata druhé skupiny polymerem 2; v obou skupinách byla podávána dávka, ekvivalentní 7,5 g daunomycinu/kg. Bylo zaznamenáváno přežití zvířat v obou skupinách.
-35CZ 278551 B6
Výsledky prokázaly, že zvířata ve skupině 2, léčená polymerem podle vynálezu, přežívala nejméně dvakrát tak dlouho jako zvířata ve skupině 1, léčená polymerem bez determinantu; tak v jedné řadě pokusů přežilo dlouhodobě ve skupině 2 57 % zvířat, ve srovnání se skupinou 1, kde dlouhodobě přežilo pouze 25 % zvířat.
Příklad 35
Vliv různých peptidových spacerů u téhož léčiva a specifického determinantu.
Pokusy byly provedeny se dvěma HPMA kopolymery, které byly oba ve shodě s předmětem vynálezu. Oba kopolymery Obsahovaly daunomycin jako biologicky aktivní součást a anti-0 protilátku jako determinant. U každého z polymerů byl použit tentýž peptidový spacer u léčiva i determinantu, ale spacery se lišily v obou polymerech. Detailní struktura kopolymerů byla:
-Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin
-Gly-Phe-Leu-Gly anti-0 protilátka
Polymer 1
-Gly-daunomycin
-Gly-Gly-anti-0 protilátka
Polymer 2
Aktivita kopolymerů byla zkoušena proti T-lymfocytům in vivo měřením poklesu reakce na anti-ovčí červené krvinky u myší. Dosažené výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.
Tabulka 3
| Polymer 1 | Polymer 2 | |
| Celková dávka anti-0 protilátky na myš (mg) | 3,0 | 3,0 |
| Celková dávka daunomycinu na myš (mg) | 0,4 | 0,6 |
| % potlačení imunitní reakce | 98 | 0 |
Jak lze vidět z výsledků, polymer 1, obsahující -Gly-PheLeu-Gly-spacery k léčivu a determinantu je značně účinnější při zabíjení T-lymfocytů, než odpovídající polymer 2, který obsahuje -Gly-Gly-spacer.
Claims (7)
1. Polymerní léčivo, tvořené inertním syntetickým polymemím nosičem na bázi opakujících se jednotek N-(2-hydroxypropyl)~ -methakrylamidu, který je pomocí aminokyselinových nebo peptidových spacerů spojený s biologicky aktivní molekulou a pomocí stejných nebo jiných spacerů popřípadě spojen se směrující jednotkou a který je popřípadě zesítován, vyznačené tím, že sestává z (a) 5,0 až 99,7 mol. % jednotek, odvozených z N-(2-hydroxypropyl)methakry1amidu vzorce ch3
(b)
0,2 až 20,0 mol. % jednotek, odvozených z N-methakryloylovaného peptidu vzorce
CH9
II
CH3 -C-CO- [NH-R-CO] - [B] kde -[NH-R-CO] je zbytek odvozený od Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, GlyLeu-Phe, Gly-Leu-Ala, Gly-Phe-Tyr, Ala-Val-Ala, Gly-PheLeu-Gly, Gly-Phe-Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Ala-Gly-Val-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-PheLeu-Gly-Phe a Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe, a -[B] je bioaktivní molekula a (c) 0,1 až 94,8 mol % jednotek vzorce
CH3 - C - CO - NH - [D] nebo
CHO
II
CH3 - C - CO - [D] nebo
CH3 - C - CO - [NH - R - CO] - D
-37CZ 278551 B6 kde -[D] je determinant a -[NH-R-CO]- je zbytek, odvozený od Leu, Phe, Gly-Gly, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-PheAla, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-LeuGly, Gly-Phe-Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Ala-GlyrVal-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, GlyPhe-Leu-Gly-Phe, Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe.
2. Polymerní léčivo podle nároku 1, vyznačené tím, že obsahuje (d) do 5 mol. % jednotek vzorce kde -[NH-R-CO] je zbytek, odvozený od Gly-Leu-Gly, Gly-ValAla, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Phe-Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-PheTyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Ala-Gly-Val-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe a Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe, a -[L]- je spojovací skupina.
3. Polymerní léčivo podle nároků 1 a 2, vyznačené tím, že obsahuje (e) jako jednotky schopné radioaktivního značení do 2 mol.% jednotek vzorce
CH, CO
II I
CH3 - C - CO - NH - CH - CH2 - C6H4 - OH
4. Polymerní léčivo podle nároků 1 až 3, vyznačené tím, že determinant je vybraný ze skupiny, sestávající z monosacharidu, disacharidu nebo oligosacharidu, vázaného amidovou nebo esterovou vazbou, protilátky, hormonu, případně jiného proteinu.
5. Polymerní léčivo podle nároku 4, vyznačené tím, že sacharidový determinant je vybraný ze skupiny, sestávající z galaktozy, galaktozaminu, glukozaminu, mannosaminu nebo fukosylaminu.
6. Polymerní léčivo podle nároků 1 až 3, vyznačené tím, že determinant je IgG nebo anti-O-protilátka.
7. Polymerní léčivo podle nároků 1 až 6, vyznačené tím, že biologicky aktivní molekula je vybraná ze skupiny, sestávající z antibiotik, cytostatik, imunosupresiv, antiparasitik, bakteriostatik, protizánětlivých látek, kardiovaskulárních látek a psychofarmak.
-38CZ 278551 B6
Polymerní léčivo podle nároku 7, vyznačené tím, že biologicky aktivní molekula je vybraná ze skupiny, sestávající z daunomycinu, puromycinu, adriamycinu, isopropylester melfalanu, bleomycinu, desferoxaminu,. bestatinu a tritylcysteinu.
Polymerní léčivo podle nároků 2 až 8, vyznačené tím, že spojovací skupina L je typu -A -NH(CH2)XNH -A-, kde x je celé číslo 1 až 12 a A je aminokyselina,'a je připojena k sousedním peptidovým skupinám amidovými vazbami.
.Polymerní léčivo podle nároku 9, vyznačené tím, že x je 6 a aminokyselina A je Phe, Tyr, Ala, Gly nebo Leu.
.Polymerní léčivo podle nároku 9, vyznačené tím, že x je 2 a aminokyselina A je Ala.
.Polymerní léčivo podle nároků 1 až 11, vyznačené tím, že jako biologicky aktivní molekulu obsahuje daunomycin, determinant je vybraný ze skupiny, sestávající z galaktózy, galaktozaminu a fukosylaminu, a kde, v případě, že je sloučenina zesíťovaná, je síťovacím spacerem Gly-Phe-Leu-Gly a spojovací skupinou -(Phe)NH(CH2)gNH(Phe)-.
.Způsob přípravy polymerního léčiva podle nároků 1 až 12, vyznačený tím, že se monomery, vybrané ze skupiny, sestávající z N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, p-nitrofenyl esteru N-methakryloylovaného peptidu podrobí radikálové kopolymeraci v roztoku či radikálové srážecí polymerizaci, a na výsledný kopolymer se postupnou adicí naváže biologicky aktivní molekula a popřípadě polymeranalogickou reakcí reaktivní determinant a případně se podrobí reakci s diaminovým síizovadlem aminolýzou v roztoku.
podle nároku vybrané ze skupiny, methakrylamidu,
13, vyznačený sestáváj ící p-nitrofenylesteru, .Způsob přípravy léčiva tím, že se monomery, z N-2(hydroxypropyl) N-methakryloylovaného peptidu polymerují s N-methakryloylovaným determinantem a výsledný kopolymer se podrobí reakci s biologicky aktivní molekulou a případně diaminovým síťovadlem za vzniku esterových nebo amidických vazeb.
.Způsob podle nároků 13 a 14, vyznačený tím, že kopolymerizačni směs obsahuje N-methakryloylovaný tyrosinamid jako látku, schopnou radioaktivního značení.
.Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje nejméně jedno polymerní léčivo podle bodů 1 až 12 a inertní fyziologicky přípustný ne'-ič.
.Farmaceutická kompozice podle bodu 16, vyznačená tím, že nosičem je sterilní vodné prostředí a kompozice je sestavena pro injekční aplikaci.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS8597A CZ278551B6 (en) | 1985-01-04 | 1985-01-04 | Polymeric medicament, process for preparing thereof and pharmaceutical compositions based thereon |
| SK9785A SK9785A3 (en) | 1985-01-04 | 1985-01-04 | Polymeric remedy and preparation method thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS8597A CZ278551B6 (en) | 1985-01-04 | 1985-01-04 | Polymeric medicament, process for preparing thereof and pharmaceutical compositions based thereon |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ9785A3 CZ9785A3 (en) | 1994-01-19 |
| CZ278551B6 true CZ278551B6 (en) | 1994-03-16 |
Family
ID=5332511
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS8597A CZ278551B6 (en) | 1985-01-04 | 1985-01-04 | Polymeric medicament, process for preparing thereof and pharmaceutical compositions based thereon |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ278551B6 (cs) |
| SK (1) | SK9785A3 (cs) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19930177A1 (de) * | 1999-06-30 | 2001-01-11 | Syntesome Ges Fuer Medizinisch | Intermolekular assoziierende Verbindungen und diese umfassende Aggregate |
| US8871512B2 (en) | 2010-10-27 | 2014-10-28 | Empire Technology Development Llc | Biocompatible polymerizable acrylate products and methods |
| US9174871B2 (en) | 2012-11-02 | 2015-11-03 | Empire Technology Development Llc | Cement slurries having pyranose polymers |
| US9212245B2 (en) | 2012-12-04 | 2015-12-15 | Empire Technology Development Llc | High performance acrylamide adhesives |
| US9238774B2 (en) | 2012-11-02 | 2016-01-19 | Empire Technology Development Llc | Soil fixation, dust suppression and water retention |
-
1985
- 1985-01-04 CZ CS8597A patent/CZ278551B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1985-01-04 SK SK9785A patent/SK9785A3/sk unknown
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19930177A1 (de) * | 1999-06-30 | 2001-01-11 | Syntesome Ges Fuer Medizinisch | Intermolekular assoziierende Verbindungen und diese umfassende Aggregate |
| DE19930177B4 (de) * | 1999-06-30 | 2007-02-08 | Nikolai Vladimirovich Bovin | Intermolekular assoziierende Verbindungen und deren Verwendung |
| US8871512B2 (en) | 2010-10-27 | 2014-10-28 | Empire Technology Development Llc | Biocompatible polymerizable acrylate products and methods |
| US9428532B2 (en) | 2010-10-27 | 2016-08-30 | Empire Technology Development Llc | Methods for making biocompatible polymerizable acrylate products |
| US9174871B2 (en) | 2012-11-02 | 2015-11-03 | Empire Technology Development Llc | Cement slurries having pyranose polymers |
| US9238774B2 (en) | 2012-11-02 | 2016-01-19 | Empire Technology Development Llc | Soil fixation, dust suppression and water retention |
| US9212245B2 (en) | 2012-12-04 | 2015-12-15 | Empire Technology Development Llc | High performance acrylamide adhesives |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| SK278506B6 (en) | 1997-08-06 |
| SK9785A3 (en) | 1997-08-06 |
| CZ9785A3 (en) | 1994-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0187547B1 (en) | Synthetic polymeric drugs | |
| Duncan et al. | Anticancer agents coupled to N-(2-hydroxypropyl) methacrylamide copolymers. I. Evaluation of daunomycin and puromycin conjugates in vitro | |
| Kopeček et al. | Targetable polymeric prodrugs | |
| US6620916B1 (en) | Modified physiologically active proteins and medicinal compositions containing the same | |
| Ulbrich et al. | Polymeric drugs based on conjugates of synthetic and natural macromolecules: I. Synthesis and physico-chemical characterisation | |
| US7041818B2 (en) | DDS compound and method for measurement thereof | |
| EP0955064B1 (en) | Process for producing drug complexes | |
| US9289510B2 (en) | Polymeric drug delivery conjugates and methods of making and using thereof | |
| US6933352B2 (en) | Amphiphilic compounds having a dendritic branch structure | |
| US20030171262A1 (en) | Drug complex | |
| Hoes et al. | Biological properties of adriamycin bound to biodegradable polymeric carriers | |
| EP1463529B1 (en) | Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy | |
| CZ278551B6 (en) | Polymeric medicament, process for preparing thereof and pharmaceutical compositions based thereon | |
| Kopecek | Synthesis of tailor-made soluble polymeric drug carriers | |
| Ulbrich et al. | Polymer‐bound derivatives of sarcolysin and their antitumour activity against mouse and human leukaemia in vitro | |
| Pola et al. | Polymer—Doxorubicin Conjugate with a Synthetic Peptide Ligand Targeted on Prostate Tumor | |
| Sintov et al. | Polymeric drug delivery of enzymatically degradable pendant agents: Peptidyl-linked procainamide model system studies | |
| Lapicque et al. | Polysaccharidic prodrugs for enzymatically controlled release | |
| EP0489220A1 (en) | Cytotoxic N,N'-bis (succinyl-peptide-) derivatives of 1,4-bis (aminoalkyl)-5,8-dihydroxyanthraquinones and antibody conjugates thereof | |
| Vepřek | Desing and synthesis of Tn-bearing glycodendrimers and their interaction with components of innate and adaptive immunity | |
| CZ2003605A3 (en) | pH sensitive polymeric conjugates of anthracycline cancerostatic for targeted therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20050104 |