CZ250997A3

CZ250997A3 - Způsob potahování povrchu předmětu kyselinou hyaluronovou, jejím derivátem nebo semisyntetickým polymerem

Info

Publication number: CZ250997A3
Application number: CZ972509A
Authority: CZ
Inventors: Marco Morra; Clara Cassinelli; Luca Benedetti; Lanfranco Callegaro
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers, S.R.L.
Priority date: 1995-02-07
Filing date: 1996-02-07
Publication date: 1998-01-14
Also published as: AU704047B2; PL321781A1; CN1141149C; PL182804B1; CA2212519C; BR9607516A; CN1173824A; JPH10513378A; JP2008080153A; NZ302264A; HUP9702114A3; EP0808181B1; NO973648D0; ATE219381T1; MX9706054A; HUP9702114A2; NO313687B1; CZ293637B6; AU4788496A; EP0808181A1

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká způsobu potahování povrchu předmětu kyselinou hyaluronovou nebo jejím derivátem a způsobu potahováním povrchu předmětu semisyntetickým polymerem. Podle tohoto postupu je možné navázat polymer vhodným způsobem na povrch předmětu vyrobeného z rozmanitých materiálů. Povrchy, které jsou ošetřeny způsobem podle předloženého vynálezu, Se vyznačují vysokým stupněm šmáčitelnosti a kluzkosti ve vodném prostředí a zlepšenými vlastnostmi při interakcích s biologickými fázemi. Jsou například schopny inhibovat ádhezi buněk bakterií přítomných v biologických kapalinách.

Dosavadní stav techniky

Hyaluronová kyselina je přírodní mukopolysachatid přítomný v různých koncentracích prakticky ve Všech tkáních. Jak je každému odborníkovi z oblasti techniky známo, vodné roztoky kyseliny hyaluronové, nebo jejich solí nebo derivátů nebo obecně pplýsacharidů, se vyznačují značnou viskozitou, kluzkostí a schopností snižovat tření. Tyto vlastnosti jsou dány přítomností a funkcí pólysacharidů stejné skupiny, jako je kyselina hyaluronová, v tělech lidí a dalších živočichů [Michels R.G. a spol.: Sodium hyaluronate in anterior and posterior segment surgery, Physicochemieal and Pharmacological Characteristics of Hyaluronic Acid, 1 až 15, 1989.].

Kvůli těmto Vlastosťem byly polysacharidy této skupiny, jako je kyselina hyaluronová (jak přírodní polysacharidy tak polysacharidy získané chemičkou syntézou z přírodních sloučenin), rozsáhle Zkoumány. Zvláště velké úsilí bylo věnováno identifikování způsobů, kterými mohou být tenké vrstvy kyseliny hyáluronově (Hyalektinová frakce, jak je popsáno v evropském patentu č. o 138 572) nebo jejích derivátů (USA patent číslo i#'

·.<

• ·· *

&

♦ ·« «· «··· • · · · · » * • « * · · · ♦ · · » φ · » φ • · · β φ ·» * * φφ ·

851 521) permanentně fixovány na povrchu jiných materiále. Cílem tohoto výzkumu bylo vytvořit předměty se zlepšenými povrchovými vlastnostmi, při čemž si zachovávají celkové vlastnosti materiálu, ž něhož jsou vyrobeny (tento materiál zde bude dále označován jako substrát). Kvůli vysokému stupni hydrofilnosti je hyaluronóvá kyselina a její deriváty zvláště vhodná pro výrobu předmětů, jejichž využití vyžaduje, aby jejich povrchy odolávaly adhezi těch buněk, které jsou přítomny v tkáních nebo biologických kapalinách. Takové povrchy jsou zvláště zajímavé při aplikacích, při nichž adheze mezi materiály a buňkami může způsobit poškození biologických tkání [Kaufman H.E. a spol.: Science 189. 525 (1977).).

Modifikace povrchů materiálů kyselinou hyaluronovou nebo jejími deriváty byla pro mnoho výzkumníků obtížná. Jedna z prvních věcí, které si Člověk všimne, je to, že roztoky kyseliny hyalur ono vé mají dost vysoké povrchové napětí, stejné nebo jen nepatrně nižší než voda [F.H.Silver a spol.: Journal of Applied Biomateřials 5, 89 (1994).]. Je velmi dobře známo, že pro získání homogenního potažení aplikací roztoku musí mít aplikovaný materiál povrchové napětí nižší než má substrát, aby se dosáhlo stejnoměrné úplné potažení. Navíc téměř všechny polymerní materiály, které se mohóu používat jako substráty, mají povrchové napětí menší než voda> což je vlastnost, která zabraňuje vytvoření tenké vrstvy kyseliny hyaluronové potahující stejnoměrně substrát [Garbasši F. a spol.: Polymer Surfaces, from Physics to Technology, Wiley, Chichester, 304 (1994).].

Mělo by být uvedeno, že kyselina hyáluronová je rozpustná ve vodě, takže jakýkoliv předmět získaný jednoduše potažením vrstvou roztoku kyseliny hyaluronové při styku s vodnými roztoky, včetně biologických kapalin, okamžitě ztrácí Svůj potah. Deriváty kyseliny hyaluronové, i ty, které nejsou rozpustné ve vodě, jsou v mnóha případech mimořádně hydrofilní a mají silnou tendenci bobtnat v přítomnosti vody nebo vodných roztoků [H. N. Joshi a E.M. Topp, InternationJourn. of Pharm. 80, 213 až 225 (1992) . ]. Ve vodných prostředích tato vlastnost rychle způ-

* ··♦♦ sobuje odchlípnutí hydrofilní povrchové vrstvy aplikované na substrát jediným potahovacím postupem použitím roztoku. Z těchto důvodů byly studovány způsoby, které zahrnují chemickou vazbu mezi povrchem substrátu a kyselinou hyaluronovou nebo jejími deriváty.

Přítomnost stabilní chemické vazby zabraňuje povrchové vrstvě, aby se rozpouštěla a propůjčuje jí pevnější, déle trvající povrchové vlastnosti vzhledem k předmětu. Realizace chemické vazby mezi substrátem a povrchovou vrstvou vyžaduje přítomnost vhodných chemických skupin na obou stranách. Zatímco chemická struktura kyseliny hyaluronové zajišťuje přítomnost různých vhodných funkcí, povrch většiny syntetických materiálů není přo tento typ operace zvláště vhodný. Proto způsoby vytvoření chemické vazby mezi povrchovou Vrstvou kyseliny hyaluronové nebo jejími deriváty a syntetickým substrátem obvykle sestávají ze dvou stupňů. V prvním stupni se na povrch zavedou vhodné chemické skupiny. Potom Se ve druhém stupni indukuje reakce mezi chemickými skupinami zavedenými na povrch substrátu a kyselinou hyaluronovou nebo jejími deriváty. Například USA patenty 4 657 820, 4 663 233, 4 722 867, 4 801 475, 4 810 586, 4 959 074, 5 023 114 a 5 037 677 popisují použití mezivrstvy mezi substrátem á potahem hyaluronovou kyselinou. Mezivrštva fyzicky ulpívá na substrátu a obsahuje chemické skupiny, které jsou vhodné pro tvorbu vazby s chemickými skupinami kyseliny hyaluronové. Pro usnadnění rozšíření a zajištění stejnoměrného potažení substrátu kyselinou hyaluronovou popisují shora uvedené patenty také použití albuminu, který, jestliže se přidá ke kyselině hyaluronové, zlepšuje její schopnost stejnoměrně zvlhčovat mezivrštvu.

Jiné dokumenty popisují použití technologie plazmy pro za- <

Vedení reaktivních skupin do substrátu. Tato technika [Garbassi F. a spol.; Polymer Surfaces, from Physics to Technology, ·..

Wiley, Chichester, 6, 1994;] umožňuje modifikovat povrch póly- >_ mernlch materiálů rychlým, účinným způsobem. Například mezinárodní patentová přihláška č. WO 94/06485 popisuje zavedení • · · · · ·« ♦ * «· · funkčních skupin na povrch polymerňího materiálu ošetřením methanolovou plazmou. Ošetřený materiál sé pak uvede dč> kontaktu s epichlorhydrinóvým roztokem, který zajišťuje přítomnost skupin vhodných pro reakci s půlysačharidy.

Jiné články [Acta Physiologica Scandinava 116. 201 (1982) , Journal of Biomédical Materials Research 18, 953 (1984) , Elán a spol.] popisují ošetření kyslíkovou plazmou, po které následuje aplikace 3-glycidoxypropyltrimethoxysilanu. Takto ošetřené povrchy se používají pro tvorbu koválentních vazeb s polysacharidy.

I když shora uvedené způsoby jsou obecně uspokojivé, každý z nich nese s sebou některé obtíže. Zvláště použití mezivrstvy si žádá, aby prostředek byl přizpůsoben povaze substrátu tak, aby se co možná nejvíce zvýšila adheze. V případě výroby předmětů z nových materiálů nebo z materiálů, které jsou vzácně používány, zabere mnoho času a úsilí identifikování nejvhodnějšího prostředku pro mezivrtstvu. Jestliže jsóu předměty, které mají být potaženy, složeny z různých materiálů, je obtížné aplikovat vhodnou mezivrštvu pro každou složku a při tom se vyhnout překrýtí a vystoupením mezivrstev v nevhodných místech. Navíc může být nežádoucí použít albumin pro zvýšení smáčitelnosti substrátu, zvláště v případě produktů, které jsou uvažovány pro biolékařské aplikace.

Pokud jde o další uvedené příklady, je výhodné vyhnout se použití ěpičhlorhydrinu a 3-glyeidoxypropyltrimethoxysilanu, protože tyto dvě sloučeniny představují velká zdravotní rizika. Podle klasifikace nebezpečných chemikálií podle Evropské unie jsou tyto sloučeniny kódovány jako Ř45 a R40, což znamená zdravotní riziko, jak je uváděno ve většině katalogů chemických produktů a reakčních činidel. Toto označení znamená, ža prvé, že tento produkt může způsobit rakovinu a, za druhé, že zde existuje riziko irreversibilních účinků.

Obecněji - celkový počet reakcí, který zahrnuje funkční * ♦··» skupiny imobilizované na povrchu a velkých molekulách, jako jsou polysácharidy, je vážně omezen vlivěm, který je obecně znám jako sterická zábrana. Velká velikost polysacharidových molekul zabraňuje nebo překáží kontaktu mezi reaktivními skupij namij takže pravděpodobnost efektivního reaktivního setkání je * rozhodně nízká.

Mezi další způsoby popsané v oblasti techniky patří reakce mezi polysácharidy á aminovými skupinami. Japonský patent č. 04 126 074 (27. dubna 1992) popisuje použití ošetření amoniakovou plazmou pro zavedení aminových skupin na povrch polymerních substrátů. Aminové skupiny se pák nechají zreagovat s kyselinou hyaluronovou nebo jinými polysácharidy pomocí kondenzačního činidla. V patentu USA č. 4 810 784 se povrch předmětu vyrobeného z polymerrtího materiálu Ošetří reaktivními roztoky, takže se přímo na povrch zavedou negativní elektrostatické náboje. Takto ošetřený povrch Se uvede do kontaktu s vodným roztokem polyethyleniminu (PEI), polymeru, který Se vyznačuje přítomností amihóvých skupin a positivního elektrostatického náboje. Interakce mezi raznými náboji naváže PEI na modifikovaný povrch. Vyrobí se tak povrch bohatý na aminové skupiny. Heparin a další polysácharidy se navážou na aminóvaný povrch po ošetření dusitanovými roztoky. V organické chemii je známou skutečností, že působení dusitanů způsobuje tvorbu aldehydových skupin. Ty reagují s áminovaným povrchem a irreversibilně navážou polyšácharid na povrch. Stejná reakce se používá tehdy, jestliže se aldehydóvé skupiny zavádějí mírnou oxidací jodistaněm [C. Brink a spol.: Colloids and Surfaces, 149. 66 (1992).].

Reakce mezi PEI a jakýmikoliv aldehydovými skupinami přítomnými nebo zavedenými na polysacharid se někdy používá také pro navázání polysacharidu v různých konformacích ná povrch předmětu [E. Ostenberg a spol.: Journal of Biomeďical Materials Research 29. 741 (1995).,]. Patente. 5 409 696 popisuje modifikaci povrchu materiálů ošetřením plazmou obsahující vodní páru a následnou reakci ošetřeného povrchu s PEI. Takto získaný povrch jě bčhatý na aminové skupiny a je schopen navázat hepařiň 'v*·

a další polysacháridy irreversibilně působením kondenzačních Činidel. Reakce mezi karboxyskupinami polysacharidu a aminovými skupinami povrchu je typicky podpořená ethyldimethylaminopropyl-karbodiimidem (EDO). Bylo popsáno [P.V. Nárayanan: Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition 6, 181 (1994).] použití tohoto postupu pro potahování vnitřku trubic, o kterých se předpokládá, že přijdou do styku s krví.

Výzkum ukázal, že způsoby popsaně v citovaných patentech a článcích nejsou plně uspokojivé, pokud jde o výrobu předmětů š povrčhy modifikovanými kyselinou hyaluronovou nebo jejími deriváty. Ve skutečnosti zavedení funkčních skupin aminového typu pomočí anion i ové plazmy, jak je to popsáno v japonském patentu 04 126 074 (27. dubna 1992), není pro způsob výroby velmi praktické. Odborníci z oblasti techniky vědí, že hustota funkčních skupin zavedených tímto způsobem na povrch substrátu je dost nízká a příliš závisí na přesné geometrii reaktoru použitého pro ošetření plazmou, na povaze substrátu, na přítomnosti přísad a/nebo znečištěnin na povrchu a uvnitř substrátu a na podmínkách skladování substrátu před a po ošetření. Z těchto důvodů je tento způsob těžko aplikovatelný v průmyslové výrobě. Tento negativní aspekt, který je rozpoznán odborníky pracujícími v oblasti techniky a ve shora uvedených USA patentech č. 4 810 874 a 5 409 696, působí proti použití PEI, který Umožňuje získat vysokou hustotu aminových skupin. I když tyto poslední způsoby efektivně řeší problémy prvního stupně procesu, to znamená zavedení reaktivních skupin na povrch iňateriálu, nejsou tolik účinné ve druhém stupni, který zahrnuje navázání kyseliny hyaluronově nebo jejích derivátů na povrch. Skutečně, jak bylo již dříve uvedeno, USA patent 4 810 874 doporučuje aktivaci heparinu nebo jiných polysacharidů chemickým ošetřením. Není tedy možné použít polysacharid jako takový, ale je nutné ho nejdříve modif ikovat chemickým působením, což znamená mimořádné náklady, pokud jde o čas, reakční činidla, laboratorní práci a ukládání odpadu. Navíc, na rozdíl od jiných polysacharidů, kyselina hyaluronová je jenom mírně citlivá na parciální oxidační reakce, které umožňují, aby na polysacharid byly zavedeny reaktivní

999 9

9

9 <£>

· 9

9 9« skupiny typu aldehýdových skupin (J.Ě.Šcott a M.J. Tigwell: Biochem. J. 173. 103 (1978), B.J.Kvam a spol.: Carbohydrate Research 230, 1 (1992).]. Pokud jde o USA patent č. 4 409 696, jestliže se provádí navržený proces, neVyrobí áe povrchová struktura schopná plně využít vnitřní vlastnosti hyaluronové kyseliny. Jestliže se však použije způsob, který je popsán v USA patentu 5 409 696, jak je zde dále uvedeno ve srovnávací testovací řádě, není možné získat povrchové struktury schopné inhibovat adhezi buněk. Podobné výsledky se pozorují tehdy, když se místo hyálUronové kyseliny používají její semisýntetiCké estery rozpustné ve vodě (Evropská patentová přihláška 0 216 453.). Jestliže se používá tento způsob, zřejmě způsob, při němž se tvoří vazba mezi aroinovaiiým povrchem a polysacharidem, neumožňuje využít v plném rozsahu hydrofilní vlastnosti kyseliny hyaluronové nebo jejích derivátů.

Nesmí být přehlédnuto, že tento způsob, který je předmětem USA patentů 5 409 696, lze aplikovat pouze na modifikace povrchu polymerních materiálů, jak je naznačeno názvem Imobiližovaná antitrombogenní činidla s polymerními povrchy ošetřenými radiofrekvenční plazmou a pokyny pro práci. V obvyklé biolékařské a chirurgické praxi se často používají keramické nebo kovově materiály, takže lze předpokládat, že ná tyto substráty lze aplikovat také tyto modifikované Způsoby. Tento popis ukazuje, že musí být navržen způsob, při kterém by se mohly tvořit chemické vazby, jednoduše a spolehlivě, mezi substráty jakékoliv povahy a kyselinou hyaluronovou nebo jejími deriváty takovým způsobem, aby bylo možné v co největším rozsahu využít vnitřní vlastnosti kyseliny hyaluronové a jejích derivátů.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se zvláště týká způsobů potahování bidlékářských předmětů tenkou vrstvou kyseliny hyaluronové, jejího derivátu nebo semisyntetického polymeru, při čemž tato tenká vrstva je stabilně navázána ha nosný materiál. Tímto způsobem se vyrobí kompózitová struktura, která má vlastnosti ma999 ·· ♦ 99 9 · · 9 ···· 9 9 · *9 * · · 9« 9 9 999 • 9 9 9 9 9

9 99« «99 99 «9 teriálu použitého pro výrobu předmětu, zatímco povrch má vlastnosti jako tenká vrstva kyseliny haluronové, jejího derivátu nebo uvedeného syntetického polymeru. Tyto vlastnosti mohou povrchům materiálů ošetřeným způsobem podlé předloženého vynálezu udělit vysoký stupeň hydrofilnosti. Například povrchy předmětů ošetřené způsoby podle předloženého vynálezu jsou schopny zabránit adhezi buněk přítomných v biologických kapalinách a snižovat bakteriální adhezi. Navíc pak potažení předmětu materiálem přirozeného původu podle předloženého vynálezu zajišťuje lepší vlastnosti při interakcích s biologickými fázemi .

V následující části popisu jšóu stručně popsány připojené obrázky. Předloženému vynálezu bude plněji porozuměno z podrobného popisu dále zde uvedeného a z doprovázejících obrázků, které jsou uvedeny jenom jako ilustrace a nejsou tedy omezeními předloženého vynálezu:

obr. lá: ESCÁ spektrum vzorku 1, příklad 1 obr. lb: ESCA spektrum vzorku 2, příklad 1 obr. 2a: Cis maximum získané ESCA analýzou vzorku oceli umístěného v PEI roztoku obr. 2b: Cis maximum získané ESCA analýzou vzorku oceli upraveného kyselinou hyaluronovou, jak popsáno v příkladu 4 obr. 3a: obraz z optického mikroskopu ukazující nepřilnulé L-929 fibroblasty na povrchu vzorku A, příklad 6 (200x zvětšení) obr. 3b: obraz z optického mikroskopu ukazující přilnulé L-929 fibroblasty na povrchu vzorku. B, příklad 6 (20ox zvětšení) obr. 4a: obřaz z optického mikroskopu ukazující nepřilnulé L-929 fibroblasty na povrchu vzorku D, příklad 6 (200x zvětšení) obr. 4b: obraz z optického mikroskopu ukazující přilnulé L-929 fibroblasty na povrchu vzorku F, příklad 6 (200X zvětšeni) obr. 5a: obraz z optického mikroskopu ukazující přilnulé

• ·«

* ϊ,.

L-929 fibroblasty na povrchu titanu.(2OOx zvětšení) obr. 5b: óbráž z optického mikroskopu ukazující nepřilnulé μ - L-929 fibroblasty na povrchu - titanu modifikovaného ’*f esteremykyseliný hyaluronóvě,^ jak jě to popsáno „v ». ►. příkladu 6 (200x zvětšení) · · ·, obr. 6a: .óbráž z optického ? mikroskopu ukazuj ící nepřilnulé . { -. . L-929 fibroblasty na povrchu nitroočních čoček modi- - > fikovaných kyselinou hyaluronovou, jak je to popsáno .* ·. · v. přikladu ,10 /(50x zvětšení) j _Λ ... y>„ ' /

-obr..6b: obraz i optického mikroskopu· ukazuj ící.;přilnulé * ‘ ¹ Ϊ ’ L-929 fibroblasty na povrchu'; nemodifikovaných nitroočních čoček (5ΌΧ zvětšení) ¹ ' obr.' 7 a: obraz » z i optického! mikroskopu -ukazující nepřilnulé >· Ij ' L-929 fibroblasty ha povrchu-nitroočních čoček modi3 ' í , fikovaných.kyselinou hyaluronovou, jak je to popsáno '·* í v'přikladu'lG+(200xjzvětšení) _t ;

obr. 7b: obraz z optického ’mikroskopu ukazující přilnulé L-929 fibroblasty na povrchu nemodifikovaných nitroočních čoček (200x zvětšení)

Ί ·»*·« ¹ ' ι J

Jiné předměty a další rozsah aplikovatelnosti předloženého vynálezu'budou zřejmé z.dále uvedeného podrobného popisu. Tomu ^! by-Však mělo*být rozuměno tak, rže tento podrobný, popis a specifické příklady, i když ukazují výhodná provedení.podle vynáíe' ^r zu, jsou uvedený jenům.jako ilustrace; protože ž./tohoto popisu jsóu‘zřejmé různé zrněný 'a různé modifikacev duchu a rozsahu vynálezu, t* ·. , -· .. . , .._a- .

V obecných pojmech předložený .vynález poskytuje potahování předmětu vrstvou kyseliny hya lur ono vé nebo jejího derivátu (například- jako je polysacharid obsahující karboxylové skupiny) nebo šémisyntetického polymeru; jak je popsáno níže, tvorbou • Chemické Vazby s’ povrchem substrátu. - Autoři vynálezu diskutovali dva rozdílné způsoby,.· které jsou-výhodné a které jsou částí předloženého objevu. Tyto způsoby jsou níže uváděny jako způsob A” a způsob B”. · < * “ J / ,. *··· ;?_Λ ».*' , * ;'J ·. υ *

-ájá '•$|í

• · · :r ii prvním stupni reakčního způsobu.

'.Ί' ¹ ; V dřůhém stupni vynalezeného způsobu A Sé reakční produkt teakee hyalúróhqvéikyšéiiňýf jejího derivátu'ňebó šěmisyntetického polymeru s alkoxysilanovým kondenzačním činidlem apliku je ve formě ‘roztoku na povrch substrátů pódle normálních fyzikálních způsobů potahování · Během odstraňováni rozpouštědla⁵ z potahuj ícího roztoku, když- je potahóvací» roztok v kontaktu,še Substrátem a možnost· probíhání’reakce jé velmi vysoká, še vy'tvoří vazba mézi alkoxysilanovouⁱ skupinou 'ůvedéhéhó reakčního produktu'a substrátem. ‘Pokusy úkázalyjt že, účinnost způsobu-A ' jé překvapivě ' vyšší , jestliže^ se provádí - ve dvou popsaných stupních^ přisrovňání š tradičními způsoby popsanými'v oblasti techniky; ^jmenovitě těrniý* které zahrnují* reakci’ mezi funkčními ¹ ·. ’ u -fc ' W < li * ^ř ’ r* .·»

Skupinami inióbilizóvanými na povrchu ’á' funkčními .skupinami přítomnými’'v“ polýšačháridové mákfómplékůlěl vir .v·- \ ς'Λ,κ*'· 1 ' , , . -v , .. ·’ ·<· · 1 /. ,. hq

Podle způsobu⁴ A podle předloženého vynálezu ise tedy kyselina hyaluronová, její derivát nebo semisyntetický polymer nechá zreagovat ve vodném roztoku nebo obečhě·vejvhodném rózpóuštědle -s molekulou alkóxýsilánového kondenzačního činidlu, které se.může navázat ná kyselinu hyaíuronovou', její' derivát nebo semi syntetický polymer-na- jednom konci a na substrát¹ na druhém konci. ^e Λ- - ' -^rt· i *'· - '·/ ^L ’ i í

Jt v· ý

Jak bylo poznamenáno, způsobem A podle vynálezu se kyselina hýaluronová', její derivát’nebo semisyritetický'polymer’nechá zreagovat se”sloučeninou patřící do^vskupiny alkoxysilanů. Tyto sloučeniny jsou odbořhíkům z oblasti techniky známy-jako kondenzační’ činidia, kťěřá se mohou používat pro zvýšení adhezních vlaštribšti mezi organickými a anorganickými materiály [ (Silanová kóděn začni činidla)E. P. Plueddemann, Plenům Press,= New York, 1982.]. Příklady‘těchto alkoxysilánových kondenzačních činidel jsou molekuly obsahující atomy halogenu, jako je chlorpřopyltrimethóxýsilan, molekuly obsahující něhášyeené organické skupiny , jako je vinýltriěfhóxyšilan a WťhákryloXypropyltrimethoxysilan, molekuly obsahující merkaptanové skupiny; jako^fje

,.í »*»« »» ··«· prvním stupni reakčního způsobu.

V druhém stupni vynalezeného způsobu A se reakční produkt reakce hyalurohové kyseliny, jejího derivátu nebo semisyntetického polymeru s alkoxysi lanovým kondenzačním Činidlem apliku j e ve formě roztoku na povrch substrátu podle normálních fyzikálních způsobů potahování. Během odstraňování rozpouštědla z potahujícího roztoku, když je potahovací roztok v kontaktu se substrátem a možnost probíhání reakce je velmi vysoká, se vytvoří vazba mezi alkoxysilanovou skupinou uvedeného reakčního produktu a substrátem. Pokusy ukázaly, že účinnost způsobu A je překvapivě vyšší, jestliže se provádí ve dvou popsaných stupních, při .srovnání s tradičními způsoby popsanými v oblasti techniky, jmenovitě těmi,.které zahrnují reakci mezi funkčními skupinami imobilizováriými na povrchu a funkčními skupinami přítomnými v polysaeharidové makromolekule.

Podle způsobu A podle předloženého vynálezu se tedy kyselina hyaluronová, její derivát nebo semisyntetický polymer ne^čhá zreagovat ve vodném roztoků nebo obecně vé vhodném rozpouštědle s molekulou alkoxysilanového kondenzačního činidla, které se může navázat na kyselinu hyaluronovou, její derivát nebo semisyntetický polymer ha jednom konci a na substrát na druhém kónci.

Jak bylo poznamenáno, způsobem A podle vynálezu sě kyselina hýaluronóvá, její derivát nebo semisyntetický polymer nechá zreagovat se sloučeninou patřící do skupiny alkoxysilanů. Tyto sloučeniny jsou odborníkům z oblasti techniky známy jako kondenzační činidla, která se mohou používat pro zvýšeni adhezních vlastností mezi organickými a anorganickými materiály [(Silanová kodenzační činidla”), E. P. Plueddeiriann, Plenům Press, New York, 1982.]. Příklady těchto alkoxysilanových kondenzačních činidel jsou molekuly obsahující atomy halogenu, jako je chlorpropyltrimethoxysi lanmolekuly obsahuj ící nenasycené organické skupiny, jako je vinyltriethoxysilana methakryloxypropyltrimethoxysilan, molekuly obsahující merkaptanové Skupiny, jako je • 444 · · · 44 · * * · 4 · 44 4444 < 9 4 4 4 4 « 44 444 «44 4« «4 ₉ markaptopropyltrimethoxysilan, a molekuly obsahující aminové skupiny, jako je aminopropyltrimetfioxysilan a aminoethylaminoprópyltrimethoxysilan. Vynalezený způsob však není omezen na tyto specifické typy alkoxysilanových kondenzačních činidel.

Způsobem A podle vynálezu může reakce kyseliny hyaluronové, jejího derivátu nebo semisyntetického polymeru a alkoxysilanu vyžadovat použití jedné nebo více molekul, které umožňují reakci mezi funkčními skupinami kyseliny hyaluronové, jejího derivátu nebo semisyntetického polymeru a funkčními skupinami alkoxysilanu. Tato skupina sloučenin zahrnuje, mimo jiné, sloučeniny patřící k diimidové skupině, která spadá pod genetickou definici kondenzačních činidel, jako je cyklohexylkarbodiimid a ethyldiaminopropylkarbodiimid, a všechny takové sloučeniny, jako je karbonyldiimidazol a dikarbonýldiimida2ol, které lze definovat jako bifunkční činidla, známá jako činidla v oblasti syntézy proteinových sloučenin. Molekuly, které katalýzu jí nebo usnadňují reakci mezi funkčními skupinami kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu a funkčními skupinami alkoxysilanu, se také mohou používat ve vynalezeném způšóbu. Některými ilustračními příklady jsou N-hydroxysukcinimid, hydroxysulfosukcinimid, hydrát 1-hydroxybenzotriazolu a podobné sloučeniny, které mají stejnou funkci. Je třeba poznamenat, že použití těchto sloučenin je možné také ve způsobu B podle předloženého vynálezu, ják bude popsáno níže.

Podle způsobů A se substrát, který má být potažen, upraví ošetřením plazmou tak, aby lépe reagoval s takto vytvořeným reakčním produktem obsahujícím kyselinu hyaluronovou, její derivát nebo semisyntetický polymer. Bez omezení nějakou specifickou teorií se věříj že ošetření substrátu plazmou má tkaový účinek, že se zvyšuje povrchové napětí substrátu, takže še stejnoměrně zvýší smáčitelnost roztoku obsahujícího kyselinuhyaluro—rióvouaalkoxysilan- a-další-molekuly .--Navíc-to -umožníaby„_____ funkční skupiny byly schopny zvýšit reakci š alkoxysilahem, aby byl zaveden ha povrch substrátu. Zvláště se používá takové ošetření, při kterém dojde k zavedení hydroxylových skupin a kar• 9 9999

9999

9 • 999 • · 9 • 99

9 9

9 9 « 9 9 9

9 9

999 99 boxy skupin a obecně takových funkcí, které jsou definovány jako kyseliny v obvyklých chemických termínech. Jelikož existuje mnoho chemických funkcí, které mohou zvyšovat reakci mezi povrchem substrátu, a silanovým kondenzačním činidlem, podmínky ošetření plazmou jsou mnohem méně omezující, než je tomu v případě ošetření běžně popisovaných v oblasti techniky. Některými příklady vhodných ošetření jsou ty, které používají plazmu kyslíku, vzduchu, dusíku, argonu a dalších vzácných plyne, vody, alkoholů a směsí uvedených plynů a par. Povaha Substrátu není omezující a je dána pouze možností vzniku, po ošetření plazmou, povrchových funkčních skupin schopných zvyšovat reakci sě sílaném.

Podle jedné zvláště výhodné formy předloženého vynalezené, ?ř ho způsobu A dochází k reakci kyseliny hyaluronové nebo jejího J derivátu a alkoxysliánového kondenzačního činidla ve vodném roztoku, při čemž koncentrace kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu je 0,01 až 2, s výhodou .0,1 až 1,2 % hmotn. Alkoxysilanem je s výhodou aminosilan přítomný ve stechiometrickém množství, které je vypočteno podle reakčního plánu, nebo v mírném nadbytku. V těchto výhodných příkladech reakční roztok s $ výhodou obsahuje také ethyldiaminopropylkařbodiimid ve stechiometrickém množství vypočteném podle reakce mezi kar boxy skupinami dostupnými na hyaluronové kyselině nebo jejím derivátu a aminovými skupinami aminosilanu, nebo v mírném nadbytku. Při reakci je přítomen N-hydřoxysukcinimid v množství mezi 10 a 100 % hmotn. při srovnání s molární koncentrací karbodiimidu. Po několikahodinové reakci za teploty místnosti se roztok aplikuje na povrch předmětu, který byl právě ošetřen plazmou, podle způsobů normálně používaných pro aplikaci tenkých povrchových vrstev roztoku. Ošetřeni plazmou Se s výhodou provádí kyslíkovou nebo vzduchovou plazmou s výkonem 1 až 400 W, s výhodou mezi 10 a 150 W> tlakem mezi 1,33 Pa a 1,33 kPa a dobou ošetření mezi 1 vteřinou a 1 h, s výhodou mezi 10 vteřinami a 30 minutami. Rozpouštědlo se odpaří ve vakuu nebo bez vakua, s nebo bez zahřívání. Operace, které se provádějí v tomto stupni, Závisejí ná nutnosti vytvořit nutné podmínky pro umožnění reakce ť c c c c ς c c í t c

v cc i

v c

t ;

c c

f 1c

ti cr c v c c

V f'í.

c, e

í n‘ í c c- c

c. í e c

CC

V c

c c

:ř mezi reaktivními konci álkoxysilanového kondenzačního činidla a funkčními skupinami přítomnými na povrchu -substrátu po osetření plazmou,/Na konci těchto operací še ihohou jakékoliv reakčrií zbytky á molekuly, které nejsou stabilně·navázány, odstranit dalším promýváním nebo podobným: způsobem· \

t. -ty,, řt,.-**· ; - Ϊ¹ w.n-f·-· .ξ·*,- : -jpB;-·!'· · i. -^λ 'Αττί* ' f£-^· —f' * Η -rťt , ' “řr. “ /: ‘‘ —’

Podle jiného provedení podle předloženého vynálezu (způsob B), sě materiál substrátů jakéhokoliv druhu ošetří plazmou vzduchu, kyslíku, argonu, dusíku nebo jiných plynů nebo par, které jsou schopný zavést kyš1íkáté funkce na povrch a/nebo vykazují čistící účinek a odstraňují organické zneČištěhíhyPoužití; plazmyobsahující vodní'páru, jak.je>nárokováno.v USA„patentu 5' 409 '696, .však' není v tomto způsobu podle předloženého vynálezů potřebné. '<= f ·, yj·* *··*·*. 'ň =, vt ' 4 . ý,-.3by. ' / >„· i t t .Povrch- takto, ošetřeného·materiálu se vystaví:působení .vod-, ného roztoku PÉI · (hebo.j iné polykaťiontové látky,’ jako* je pdly-. lysin hebo podobně) ,.f takže se vytvoří vysokájpovrchová končen-. trace*aminových skupin. Takto získaný materiál se nechái zreagovat s-kyselinou hyaluronóvóu,:.jejím derivátem,nebo semisyntétickým polymerem [napři, jinými polysacharidy, které obsahují karboxylové skupiny]::v;přítomnosti kondenzačních; činidel·,' jako je EDC, ve vodném roztoku, nebo dicyklohexylkarbodiimidu (ĎCC) , v organických rozpouštědlech. Je přítomna také molekula, která je schopna Zvýšit reakci.podporovanou EDC. .Tato_sskupina molekul· zahrnuje, ale.není i na/ ně/ omezena, ₄ N-hydroxysukcinimid . (NHS), hýdřoxysulfósukeiniitiid; hydrát hydroxybenzotriazólu á podobné molekuly. ' - ₅ . · >

¹ ' ·· ·»

Způsob B podle předloženého Vynálezu je založen na překvapujícím objevu, že molekuly, jako je NHS, jsou schopny přispívat ke kondenzační reakci podporované EDC také v tom případě, kdy jsou skupiny navázány na povrch v nepřítomnosti molekulárních struktur známých zručným odborníkům z oblasti techniky jako raménka (spacer arins).... i * *

I i , 4 V '

Pokud se zvláště týká kyseliny hyáluronové, je známo, že

W ♦ ·· v roztoku a v nepřítomnosti NHS se tvoří meziproduktové reakční produkty, genericky definované jako N-acylmočovina, které zabraňují tomu, aby reakce byla dokončena [X. Xu a spol., Trans

IV World Biom. Gong., 170, 1992.]. Když se aminové skupiny navážou na povrch, musí se použít raménka”, aby byly dostatečně , aktivní. Raménko je sekvence atomů uhlíku, která odděluje re- , aktivní skupinu od povrchu atak způsobuje, že je volnější a ý zvyšuje tedy její reaktivitu. Například výrobek Covalink (Nunc) se vyrábí z polystyrenu obsahujícího sekundární aminové skupiny oddělené od povrchu raménkem s 9 atomy uhlíku [K. Gregorius a .·.

spol.: J. Immunol. Méth. 181, 65 (1995) .] a NHS zvýšuje výtěžek reakce podporované EDC [J.V. Saros a spol.: Aňal. Biochem. 156. %

220 (1986) . ] . Cena vytvoření komplexních molekulárních struktur na povrčhu, jako jsou funkční skupiny nesené raménky, je zřejmě velmi vysoká a omezuje tento způsob výroby. Ve způsobu B podle 'ýí předloženého vynálezu jsou aminové skupiny navázány na povrch .¼ á vnitřek PEI struktury bez požadavku používání řamének nebo jakýchkoliv jiných strukturních aspektů· Zjištění, že NHŠ je schopen ulehčit kondenzační reakci povrchových aminoskupin vnesených EDC, i v nepřítomnosti raménka a bez jakékoliv další pozornosti týkající se jiných molekulárních aspektů povrchu, je # překvapující a je rozhodujícím faktorem způsobu B podle vynálezu.

Dokonce ještě překvapivější a nepředvídatelnější na základě dosud známých znalostí je zjištění, žé přítomnost NHS v reakční směsi má rozhodující vliv na antiadhezní vlastnosti povrchů potažených kyselinou hyaluronovou nebo jejími deriváty vůči buňkám. Jestliže se pracuje v nepřítomnosti NHS, jak je to popsáno v USA patentu č. 5 409 696, je nemožné získat povrchy potažené kyselinou hyaluronovou s takovými antiadhezivními vlastnostmi, aby zabránily adhezi buněk. Naopak, jestliže se pracuje způsobem podle předloženého vynálezu, získají Se povrchy které“ jsou“dokonale odolné-vůči kolonizaci-buňkami r i — -- —— když autoři vynálezu nemusí vysvětlovat důvody takto získaných výsledků, a bez ohledu na jakoukoliv teorii, předpokládá Se, že rozdíl v chování lze přičíst jednomu ž následujících důvodů:

···· ·· ···· buď je v nepřítomností NHS výtěžek reakce tak nízký, že i když se kyselina hyaluronová naváže na povrch, nenaváže se v dostatečném množství, aby úplně potáhla nosný materiál, nebo vazba, která se vytvoří v nepřítomnosti NHS, změní vlastnosti kyseliny hyaluronové navázané na povrch. Výsledná struktura si nezachovává vlastnosti, které by byly normálně očekávány u tohoto druhu polymeru na základě dosud známých znalostí Z oblasti techniky.

V jedné zvláště výhodně formě předloženého vynálezu se polymerní, kovový nebo keramický materiál ošetřuje plazmou vzduchu nebo kyslíku s výkonem 1 až 400 W, s výhodou 10 až 150 W, tlakem mezi 1,33 Pa a 1,33 kPa a dobou ošetření 1 vteřina až l h, s výhodou 10 vteřin až 30 minut. Podmínky ošetření však nejsou omezující a závisí ha tvaru produktu. Ošetření probíhá déle, jestliže zahrnuje modifikování vnitřku trubic nebo jiných nepřístupných částí, zatímco ploché a přístupné povrchy vyžadují kratší časy.

Ošetřený materiál se umístí do vodného rozotku PEI o koncentraci 0,01 až 10, s výhodou 0,5 až 2 % hmotn. Doba reakce není omezující a je 10 minut až 10 h. Na konci tohoto stupně se materiál promyje a umístí se do roztoku kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu nebo semisyntétického polymeru obsahujícího karboxyskupiny. Koncentrace polyšacharidu je mezi 0,005 a 5, s výhodou mezi 0,05 a 1 % hmotn. Tento roztok se doplní NHS a EDC na koncentraci mezi 0,001 a 1 % hmotn. Reakce probíhá za teploty místnosti nebo při mírném zahřátí a může trvat ód 10 minut do 48.h. Jestliže je typ polyšacharidu a substrátu vhodný, reakce může probíhat v organickém rozpouštědle, použitím DCC a NHS v dříve uvedených koncentracích.

Důležitost tohoto vynálezu (způsob A a B) bude zřejmá kterémukoliv odborníkovi z oblasti techniky. Způsobem podle předloženého vynálezu je možné získat předměty s výhodnými povrchovými vlastnostmi díky přítomnosti potahu kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu, které jsou stabilní díky přío ·· ·»·

tomnosti chemických vazeb mezi potahem a substrátem. Povrchy těchto předmětů mají vlastnosti spočívající v resištehci k adhezi buněk a bakterií přítomných v biologických kapalinách.

Dále jsou uvedeny některé cistě ilustrativní příklady. Jakékoliv variace-, které jsou zřejmé odborníkům z oblasti techniky, spadají do rozsahu předloženého vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 <

Z Petriho desek pro bakteriologii (Corning) Se odebere vzorek polystyrenu a ošetří se plazmou v reaktoru s rovnoběžnými deskami (Cambetti Kenologia). Ošetření se provede za tlaku 13,3 Pa kyslíku, výkonu 50 W, průtoku 20 cm³ (Std) Za minutu a “ý doba ošetření byla 30 vteřin. Ošetřené vzorky Se ponoří na dvě hodiny do 0,5% (hmotn.) roztoku PEI (Aldrich) vě vodě. Potom se extrahují, promyjí vodou a ponoří do zkumavek obsahujících 5 ml následujících roztoků:

1) 1% (hmotn.) kyseliny hyaluřonové (Fidia Advanced Biopolymers, Brindisi)

2) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluřonové, 0,02 g l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (Sigma) a 0,02 g N-hydroxy- >

sukcinimidu (Sigma)

3) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluřonové esterifikované z 25 % benzylakoholem (Fidia Advanced Biopolymers)

4) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluřonové esterifikované z 25 % benzylakoholem (Fidia Advanced Biopolymers), 0,02 g l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (Sigma) á &

0,3 g N-hydroxysukcinimidu (Sigma)

5) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluřonové esterifikované z 50 % benzylakoholem (Fidia Advanced Biopolymers)

6) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluřonové esterifikované z 50 % benzylakoholem, 0,02 g l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (Sigma) a 0,02 g N-hydroxysukcinimidu (Sigma) .

φ φ φφφφ • φ φ * φ φ · · • Φ φ · · φ · φ « «Μ · · · * · · • Φ Φ Φ φΦΦΦΦΦΦ • · Φ Φ * · Φ «» ΦΦΦ φΦφ Φ· Φ

Vzorky se nechají stát ve zkumavkách 12h za teploty místnosti, potom še promývájí přes noc vodou. Účinnost ošetření se vyhodnocuje ESCA analýzou (elektronová spektroskopie pro chemickou analýzu). Jak je již známo (Garbassi F. a spol.: Polymer Surfaces, from Physics to Technology, Wiley, Chichester,

3, 1994.), touto technikou je možné vyhodnotit Chemické složení povrchů materiálů. Analýza se provádí systémem Perkin Elmer PHI 5500 ESCA. Kromě shora popsaných vzorků se jako referenční vzorek použije jiný vzorek ošetřený plazmou, který se uvede do kontaktu se samotným PEI.

atomové složení povrchu (%)
vzorek č.	0	C	N
1	11,8	79,3	7,1
2	26,4	65,5	7,1
3	11,5	78,9	7,6
4	23,2	67,4	6,0
5	11,8	79,0	7,3
6	21,6	69,0	6,9
PEI samotný	11,2	78,8	7,5

Tato data ukazují významné zvýšení množství kyslíku příto·^ mného na povrchu po procesu modifikace, jak bylo po zavedení kyseliny hyaluronové nebo jejích esterů očekáváno. Naopak v nepřítomnosti EDC a ŇHS zůstává složení povrchu podobně jako v referenčním příkladu. Navíc - podrobná analýza CIS maxima ukazuje hojnost C-0 vazeb, v souladu s Očekávanou molekulární strukturou. ESCA spektra vzorků l a 2 jsou uvedena na obr. 1 a A ib.

Příklad 2

Jiné vzorky, které se vyrobí podle způsobu popsaného v «· · • · ·· • · · • · * · · · · ··· • · · · « • · · « · • * » «»· · • » · ♦ * ··« ·· ·· t příkladu 1, se ponoří do vody na dva měsíce. Opakuje se ESCA analýza. Nebyla pozorována Žádná změna v koncentraci kyslíku na povrchu, což potvrzuje stabilitu vazby mezi polysacharidem a povrchem.

' Příklad 3

Film polyethylenu, který se používá pro balení, se ošetří plazmou a ponoří se do PEI, jak je popsáno v příkladu 1. Připraví se dva vzorky a ponoří se do následujících roztoků diiiiethylsulfoxidu (Fluka):

1) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluronové esterifikováné ze 75 % benzylakoholem (Fidia Advanced Biopolymers)

2) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluronové esterifikované ze 75 % benzylakoholem, 0,02 gÍ-ethyl-3-(3-dimethylaminopropýl)karbodiimidu (Sigma) a 0,02 g N-hydroxysukčiňimidu (Sigma) .

Po 24h promývání v dimethylsulfoxidu se vzorky analyzují

ESCA. Získají se následující výsledky:
	atomové složení povrchu	(%)
vzorek č.	0	C	N
1	11,8	.79,3	7,1
2	21,4	69,5	6,4
samotný PEI	11,2	78,8	7,5

Příklad 4

Vzorek oceli 316, typu obvykle pouzí váného pro biolékařské aplikace, se ošetřuje 15 minut Vzduchovou plazmou a pak se úve* · ¹ Λ de od kontaktu s 0,5% (hmotn.) roztokem PEI na dobu 2 h. Hyaluronová kyselina se naváže na povrch materiálu použitím roztoku 2, který jě popsán v přikladu 1. Materiál se pak analyzuje • ♦·*· * ·· • φ · «· « • · · · · φ · · · · • · · Φ Φ · · »Φ Φ «

Φ Φ Φ · · Φ φ·· ·♦· ··· «· ·« ·

ESCA. Získané Cis maximum je popsáno na obrázku 2: Obr. 2a ukazuje vzorek po vystavení působení roztoku PEI, obr. 2b ilustruje Cis maximum vzorku, který byl podroben kompletní modifikaci.

V tomto posledním případě lže pozorovat typický, široký, vícesložkový tvar, který jé charakteristický pro Clš maximum polysacharidů (viz například dříve citovaný článek E. Ostenberga a spol.: Journal of Biomedical Materials Research 29, 741 (1995).], který potvrzuje přítomnost kyseliny hyaluronové na povrchu.

Příklad 5

Petriho misky pro buněčnou kulturu (Corning) se upraví tak, jak je to popsáno v příkladu l (pro každé ošetření 3 misky). Takto připravené misky se náplní 5 ml suspenze buněk (fibťóblastové buňky myší pojivové tkáně, L-929, v minimálním esenciálním Eaglově mediu, doplněném 10 % (hmotn.) plodového telecího sera, penicillnovými antibiotiky, streptomycinem a amfoterieinem B, a L-glutaminem - SPA, Milán) a umístí se do inkubátoru (Forma) při 37 °C v atmosféře 5 % hmótn. CO₂ a při 98% (hmotn.) vlhkosti. Interakce buňka-buňka a polysteronová báze, ošetřená jak shora popsáno v příkladu 1, se vyhodnocují v pravidelných intervalech optickým mikroskopem s fázovým kontrastem (Leica). Zvláště se vyhodnocuje, jestli byly buňky schopny ulpívat na různě ošetřených površích a do jakého rozsahu. Jako kontrola se použijí Petriho misky, které byly ošetřeny samotnou plazmou, a které tedy mají maximální adhezní vlastnosti. V tomto příkladu (odvozením od středu pozorování provedených během 24h období) hodnocení 5 znamená maximální ulpívání, zatímco hodnocení o znamená, že nedošlo k žádnému ulpívání.

• · MM ·

·99· •9 9999 vzorek Číslo hodnocení kontrola 5

4

0

4

0

4

0

X*.:*

'·

7X

Tento pokus potvrzuje přítomnost hydrofilní vrstvy, která je pevně navázána a je schopna zabránit ulpívání buněk.

Příklad 6

Čtyři Petriho misky byly ošetřeny podle způsobu popsaného v příkladu 1 použitím roztoku 2 kyseliny hyaluronové (tyto vzorky budou označeny jako A). Stejný počet misek je ošetřen způsobem potahování kyselinou hyaluronovou, popsaným v. příkladu 11 USA patentu 5 409 696 (tyto příklady budou označovány jako B). Modifikované misky se uvedou do kontaktu se suspenzí L929 buněk, jak popsáno v předcházejícím příkladu· Ulpívání buněk se vyhodnocuje jako v předcházejícím vzorku. Výsledky jsou následující:

vzorek číslo	hodnocení
kontrola	5
A	0
B	4

Obrázky 3a a 3b jsou obrazy získané optickým mikroskopem a ukazují stav povrchů ňa konči testu. Obr. 3a se týká vzor-ku

A, obr. 3b vzorku B. Zřetelně je vidět různý stupeň resistencě • · · · • · · · • β ♦ • · · · ·*»· ·« · • Β na adhezi buněk, který byl dosažen uvedenými dvěma způsoby.

Příklad 7

Čtyři polystyrénové Petrihó misky byly ošetřeny podle způsobu popsaného v příkladu i použitím roztoků 4 a 6 esterů kyseliny hyalurdnové (tyto vzorky budou označeny jako C a D) . Stejný počet misek je ošetřen podle způsobu potahování kyselinou hyaluronovou, popsaného v USA patentu 5 409 696 (tyto příklady budou dále označovány jako E a F) . Modifikované misky se uvedou do kontaktu se suspenzí I>929 buněk, jak popsáno v předcházejícím příkladu. Ulpívání buněk se vyhodnocuje jako v předcházejícím příkladu. Výsledky jsou následující:

vzorek číslo	hodnocení
kontrola	5
C	0
D	0
E	5
F	5

Obrázky 4a a 4b jsou obrazy získané optickým mikroskopem a ukazují stav povrchů na konci testu. Obrázek 4a se týká vzorku D, obrázek 4b vzorku F. Zřetelně je vidět různý stupeň resistertce k adhezi buněk, který byl dosažen uvedenými dvěma způsoby.

«

Příklad 8

Malá deska titanu (Aldrich) se upraví plazmou a ošetří se PEI, jak je popsáno v příkladu 4. Takto ošetřený povrch se nechá zreagovat s roztokem 6 jako příkladu 1. čtyři vzorky neupraveného titanu a čtyři vzorky titanu, které byly upraveny, se uvedou do kontaktu se suspenzi buněk L-929, jako v předcházejícím příkladu. Adheze buněk se vyhodnotí po 24 h zabarvením

9 9 • 9999 • 9 9 • « • 9 • 9

999 9«

9*9 buněk ťoluidinovou modří a pozorováním kultivovaných vzorků metalografickým mikroskopem. Výsledky těchto pzorování jsou uvedeny na obrázcích 5a a 5b. Obr. 5a Se týká neupraveného titanu, obr. 5b titánů upraveného esterem kyseliny hyaluronové podle předloženého způsobu. Je zřejmé, že buňky se na těchto dvou površích chovají různě. V případě upraveného materiálu si buňky zachovávají kruhovou formu a nemají plochý, rozprostřený vzhled í' typický pro buňky, které pevně ulpívají na substrátu, jak bylo pozorováno u neupraveného materiálu (obr. 5a) .

Příklad 9 $

Způsob úpravy popsaný v příkladu 8 se aplikuje na skleněnou desku. Upravené sklo, vzorek neupraveného skla a polýsty- .

reňóvá deska upravená plazmou (použitá jako kontrola pro maxi- j mální ulpívání) se uvedou do kontaktu s L-929 buňkami. Adhezě buněk se vyhodnocuje po 24 h. Získají se následující výsledky:

vzorek	hodnocení
kontrola	5
normální sklo	5
upravené sklo	0

Příklad 10

Způsob úpravy popsaný v příkladu 1 se provede na dvou nitroočních čočkách (Sanitaria Sealigeraj roztokem 0,5¾ (hmotn.) kyseliny hyaluronové pro oční použiti (Fidia Advanced Biopolymers), 0,4 % (hmotn.) EDC a 0,4 % (hmotn.) NHS. Upravené čočky a stejný počet neupravených Čoček sé umístí na Petriho misky a uvedou se do kontaktu se supenzí L-929 buněk, jako v předcházej icich příkladech. Resistence vzorků k ulpíváni buněk je ilustrována na obrázcích 6 a 7. Tyto obrázky, jsou fotograf ie povrchů čoček upravených podle předloženého způsobu (6a a 7a) a neupravených (6b a 7b) . Tyto obrázky jasně ukazují rozdílnou ··*· • 4 4 *444 4 · * 4 · • · · 4·«···** • · 4 · · · ·

4*4 444 44 44 * schopnost inhibice ulpívání buněk na těchto dvou površích.

Příklad 11

Z Petriho misek pro bakteriologii (Corning) se odebere vzorek polystyrénu a ošetří se plazmou v reaktoru s rovnoběžnými deskami (Gambětt i Kenologia). Toto ošetření se provádí za tlaku 13,3 Pa kyslíku, výkonu 100 W, průtoku 20 cm³ (Std)/min. a době ošetření 1 minuta. Ošetřený vzorek se ponoří, extrahuje pětkrát následujícími vodnými roztoky, které byly připraveny o 6 h dříve, a nechá se reagovat za teploty místnosti:

1) 1% (hmotn. ) kyseliny hyaluronové (Fidia Advanced Biopolymers)

2) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluronové, 0,4 g l-eťhyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (Sigma), 0,3 g N-hydroxysukcinimidu (Sigma) a 1 % (obj.) 3-aminopropyltrimethoxysilartu (Sigma)

3) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluronové esterifikované z 25 % benzylakoholem (Fidia Advanced Biopolymers), 0,35 g 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (Sigma), 0,3 g N-hydroxysukcinimidu (Sigma) a 1 % (obj.) 3-áminopropyltr imethoxys ilanu (S igma)

4) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluronové esterifikované z 50 % benzylakoholem (Fidia Advanced Biopolymers), Ó,35 g 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (Sigma), 0,3 g N-hydroxysukcinimidu (Sigma) a 1 % (obj.) 3-aminopropyltrimethoxysilanu (Sigma).

Vzorky se vysuší při 60 °C přes noc v sušárně, potom se promyjí vodou a vysuší se proudem stlačeného vzduchu. Aby se zkontrolovala integrita potahu, ponoří se vzorky do 1% (hmotn.) roztoku toluidinové modře ve vodě (Aldfich) . Ta okamžitě zbarví kyselinu hyaluronovou a další polysacharidy jasně fialově modře. ' Účinnosttohoto“žpůšóbúšěvyhodnocujepodléstupnice’ ód ” ' do 5, kde 5 znamená dokonale stejnoměrné zabarvení (ukazující integritu potahu kyselinou hyaluronovou nebo jejím derivátem) a 0 nepřítomnost zabarvení. Vzorkům vyrobeným podle popsaného φφφ

Φ·Φ· ··« • ·· příkladu (identifikovány číslem roztoku, do kterého byly ponořeny) , bylo připsáno následující hodnocení:

vzorek	hodnocení	poznámky
1	1	na počátku Se objeví stejnoměrné obarvení, ale obarvení potahu po > několika vteřinách ve vodě mizí -
2	5	*·> ^r i
3	5	í'· +
4	5

Vzorek 12

Způsobem popsaným v příkladu 11 bylo vyrobeno několik vzorků? Tyto vzorky byly ponořeny dó vody na 20 dnů za teploty místnosti. Potom byl proveden test vybarvování. Byly získány následující výsledky:

vzorek číslo	hodnocení
1	0
2	5
3	5
4	4

Příklad 13

Následující příklad umožňuje vyhodnocení účinnosti popsaného způsobu: reakce mezi polysačharidém a funkčními skupinami v roztoku, na rozdíl od konvenčního přístupu zahrnujícího reakci’ mezi‘skupinamifixovanými na povrch~a~skupinami'přítomnými' -” v polysacharidu. Silikonový katetr se rozřeže tak, aby se získaly vzorky dlouhé 3 cm. Řada vzorků se ošetří roztoky 2, 3 a 4 podle způsobu popsaného v příkladu 11. Druhá řada vzorků se • 9 9 ♦ · · · ··· *

9 9 9- · · ·

99* 999 99» ·* ·· * podrobí ošetření plazmou a aplikaci 3raminopropyltrimethoxysilanu (Sigma) v 1% (óbj.) vodném roztoku. Jakmile jsou suché, uvedou se vzorky do kontaktu s následujícími roztoky:

a) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluronové, 0,4 g l-ethyl-3-(3-dÍmethylaminopropyl)kařbodiimidu (Sigma) a 0,3 g N-hydroxysukcinimidu (Sigma)

3a) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluronové esterifikované z 25 % benzylakoholem (Fidia Advanced Biopolymers), 0,351 g 1-ěthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (Sigma) a0,3 g N-hydróxýsukcinimidu (Sigma)

4a) 1 % (hmotn.) kyseliny hyaluronové esterifikované z 50 % benzylakoholem (Fidia Advanced Biopolymers), 0,35 g 1-éthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (Sigma) a 0,3 g N-hydroxýsukcinimidu (Sigma).

Vzorky se vysuší při 60 °C přes noc v sušárně, potom se promyjí vodou a vysuší se proudem stlačeného vzduchu. Test obarvování poskytl následující výsledky:

vzorek číslo	hodnocení
2	5
3	5
4	5
2a	1
3a	0
4a	0

Příklad 14

Vzorek polystyrenu z Petriho misek pro bakteriologii (Corning) šeošetří~roztoky 1,'2 a3,~jak popsáno v příkladu 11 (3 misky pro každé ošetření). Takto připravené misky se náplní 5 ml buněčně suspenze (fibroblastové buňky myší pojivové tkáně, L-929 v minimálním Ěaglově mediu, ke kterému bylo přidáno 10

ΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦ

ΦΦΦΦ Φ φ·ΦΦΦ

Φ Φ Φ ΦΦΦ Φ

Φ Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦΦ φ · • «φφ •

♦ Φ·

Φ ΦΦΦ *

Φ Φ Φ · • Φφ

ΦΦ Φ«Φ ΦΦΦ φ» % (hmotn.) plodového téléeího sera, peniciliňová antibiotika, streptomycin a amfotericin B, a L-glutamin-SPA) a umístí se do inkubátoru (Forma) při 37 °C v atmosféře 5 % hmotn. C0₂ a při 98% (hmotn.) vlhkosti. Interakce búňka-buňká a polystyrénová báze, ošetřená jak shora popsáno v příkladu 11, se vyhodnocují v pravidelných intervalech optickým mikroskopem s fázovým kontrastem (Leiča). Zvláště se vyhodnocuje, jestli buňky byly schopny ulpívat na různě ošetřených površích a do jakého rozsahu. Jako kontrola se použijí Petriho misky, které byly ošetřený samotnou plazmou a které tedy mají maximální adhezní vlastnosti. V tomto přikladu (odvozením od středu pozorování provedených během 24h období) hodnocení 5 znamená maximální ulpívání, zatímco hodnocení 0 znamená, že nedošlo k žádnému ulpívání.

vzorek číslo	hodnocení
kontrola	5
1	3
2	0
3	0

Tento pokus potvrzuje přítomnost hydrofilní vrstvy, která &

je pevně navázána a je schopna zabránit ulpívání buněk. Tato hydrofilní vrstva se odstraní ze vzorku ošetřeného roztokem 1, který neumožňuje tvorbu chemické vazby.

Přiklaď 15 U

Silikonový katétr (Silkomed) se rozdělí na Sekce o délce 7 cm. Čtyři vzorky se ošetří roztoky l, 2, 3 a 4 za podmínek popsaných v příkladu ll. Kluzkost katetrů ve vodném prostředí se vyhodnocuje následuj ícím způsobem.; zkumavka se naplní agarem (Sigma) o koncentraci 0,7 % (hmotn.). Zkumavka se upevni v horizontální poloze a do zkumavky še vloží 7cm kousek kátetru s • φ φ • ΦΦΦ φ φ ·

Φφφφ φ φφ φφ φφφφ φφ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ φ · φ φφφ φ φ φ φ φ φ φφφ φφ φφ « jedním koncem mírně vysunutým z agaru. Na tento konec se nití naváže závaží, které se pak vede přes kolečko tak, aby účinek závaží táhl katetr z agaru, do kterého je ponořen. Vzhledem k vlastnostem agaru je tedy možné vyhodnotit kluzkost katetru ve Vodném prostředí. Doba, která je potřeba k vytažení katetru z agaru, je nepřímo úměrná kluzkosti katetru. Tento test poskytl následující výsledky:

vzorek č.	doba vytažení (sek)
1	90 ± 13
2	35 + 6
3	38 + 8
4 ošetření pouze	36 ± 9
plazmou	125 ±15
neošetřeno	120 + 10

Příklad 16

Následující příklad ověřuje způsob použití účinku plazmy ha složení povrchu, což prokazuje účinnost také na materiály s různými chemickými složeními. Navíc tento příklad ukazuje, že způsob je účinný také tehdy, jestliže předmět, který má být potažen, je složen z různých materiálů.

Jako vzorky se připraví třícentimetrové kousky katetru. Jsou složený ze a) silikonu, b) polyurethanu, G) polyvinylchloridu a d) kaučukového latexu. Použije se také krycí sklíčko pro mikroskop. Tyto vzorky se ošetří plazmou, jak je popsáno v příkladu 1, a pak se Ošetří roztokem 3 ze stejného příkladu, jak popsáno. Test Zabarvení poskytuje následující výsledky:

• 9 9 9 9 » 9 9 9 « · 9 999 9

9 9 9 • 9 99 9 materiál

9999 · 99

9 9 9. 9 »99 · · •99999 ·*·

9999 hodnocení silikon 5 polyurethan 5 polyvinylchlorid 5 latex 5 sklo 5

Přiklad 17

Připraví se 1% (hmotn.) roztok kyseliny hyaluronové, esterifikované ze 75 % bénzylalkoholem (Fidia Advanced Biopólymers), v dimethylsulfoxidu (Aldrich). část tohoto roztoku se odebere a přidá se k němu 1/1 % (obj.) aminoethylaminopropyltrimethoxysiianu a 0,5 g dieyklohexylkarbodiimidu (Aldrich). Po 6h reakci se dva shora popsané vzorky katetru ošetří plazmou, jak popsáno v příkladu 14. Jeden ze vzorků se ponoří do esterového roztoku, druhý do esterového roztoku s aminosilanem a pomalu se extrahují. Vzorky se umístí do vakuové sušárny nastavené na 60 °C a 13,3 kPa a nechají se zde 48 h. Test zabarvení poskytuje následující výsledky:

vzorek hodnocení esterový roztok l esterový roztok a aminosilan 4 pouze plazma 0 neošetřeho o

Přiklad 18

Připraví se i% (hmotn. ) roztok kyseliny hyaluronové, esterifikované z 50 % ethylalkoholem (Fidia Advanced Biopolymers), v dimethylsulfoxidu (Aldrich), část tohoto roztoku se odebere ·· *··· •v··* · ·* • Β ♦ · * 4 · · · • ·« · · * · · · · a přidá se k němu 1 % (obj.) aminoethylaminopropylmethoxysilanu a 0,5 g dičyklohexylkarbodiimidu (Aldrich). Po 6h reakci se dva vzorky shora uvedeného katetru ošetří plazmou za takových podmínek, jak bylo popsáno v příkladu 14. Jeden ze vzorků se pohoří do esterového roztoku, druhý do esterového roztoku s aminosilanem a pomalu se extrahují. Vzorky se umístí do vakuové sušárny nastavené na 60 °C a 13,3 kPa á nechají se zde 48 h. Test zabarvení poskytuje následující výsledky:

vzorek	hodnoceni
esterový roztok	1
esterový roztok	a aminosilan 5
pouze plazma	0
neošetřeno	0

Přiklad 19

Připraví se 1% (hmotn.) roztok kyseliny hyaluronově, ester ifikované ze 100 % benzylalkoholem (Fidia Advanced Biopolymeřs), v dimethylsulfoxidu (Aldrich). část tohoto roztoku se Odebere a přidá se k němu 1 % (obj.) amihoethylaminopropyltrimethoxysilanu a 0,5 g karbonyldiimidazolu (Aldrich) . Po 6h reakci se dva shora popsané vzorky katetru ošetří plazmou za takových podmínek, které jsou popsány v příkladu 14. Jeden ze vzorků se pohoří do esterového roztoku, druhý do esterového roztoku s aminosilanem a pomalu se extrahují. Vzorky se umístí do vakuové sušárny nastavené na 60 °C a 13,3 kPa a nechají se Zde 48 h. Test zabarvení poskytuje následující výsledky:

9999 • Β· B

9 9

999

9 9

9

9 ·

· * * • B

B • bb B • * Μ » vzorek hodnocení esterový roztok 1 esterový roztók a aminosilan 4 pouze plazma . 0 neošetřeno 0

Příklad 20

Připraví se 1% (hmotn.) roztok kyseliny hyaluronové, ester ifikované ze 100 % ethylalkoholem (Fidia Advanced Biopolymers) , v dimethylsulfoxidu (Aldrich). Část tohoto roztoku se odebere a přidá se k němu 1 % (obj.) aminoethylaminopropyltrimethoxysilanu a 0,5 g karbonyldiimidazolu (Aldrich) . Po 6h reakci se dva vzorky shora uvedeného katetru ošetří plazmou za takových podmínek, jak bylo popsáno V příkladu 14. Jeden ze vzorků se ponoří dů esterového roztoku, druhý do esterového roztoku s aminosilanem a pomalu se extrahují. Vzorky se umístí do vakuové sušárny nastavené na 60 °C a 13,3 kPa a nechají se zde 48 h. Test zabarvení poskytuje následující výsledky:

vzorek	hodnocení
esterový roztok	1
esterový roztok a	amihosilan 4
pouze plazma	0
neošetřeno	0

Příklad 21

Připraví se 1% (hmotn.) roztok zesítované kysěliný hyaluronové (10 % karboxyskupin je vnitřně esterifikováno, 90 % kářboxyskupin je ve formě sodné solí) v dimethylsulfoxidu (Aldrich) . Část tohoto roztoku se odebere a přidá se k němu 1 % φφ φ

φφφφ φ

φφ* φ

φ φ φφ φφ φφφφ «φ φ φ φ * φ • φ φ · φ · φ · φφ «φφ φ φ φ φ φ φ

ΦΦ· * φφ φ (obj.) aminoethylaminopropýltrimethoxysilanu a 0,5 g dicyklohexylkarbodiimidu (Aldrich). Po 6h reakci se dva vzorky shora uvedeného katetru ošetři plazmou ža takových podmínek, jak bylo popsáno v příkladu 4. Jeden ze vzorků še ponoří do esterového roztoku, druhý do esterového roztoku s aminosilaném a pomalu sě extrahují. Vzorky se umístí do vakuově sušárny nastavené na 60 °C a 13,3 kPa a nechají se zde 48 h. Test zabarvení poskytuje následující výsledky:

vzorek	hodnocení
esterový roztok	1
esterový roztok a	aminošilan 5
pouze plazma	0
neošetřeno	0

Přikládá 22

Připraví se 1% (hmotn.) roztok kyseliny alginové (50 % karboxyskupin je esterifikováno bénzylalkOholem, 50 % karboxyskupin je ve formě soli) v dimethylsulfoxidu (Aldrich). Část tohoto roztoku se odebere a přidá se k němu l % (obj.) áminoethylamiňoprůpyltrimethoxysilanu a 0,5 g dieyklohéxylkárbodiimidu (Aldrich). Po 6h reakci se dva vzorky shora uvedeného katetru ošetří plazmou za takových podmínek, jak bylo popsáno v příkladu 14. Jeden ze vzorků se ponoří do esterového roztoku, druhý do esterového roztoku s aminosilaném a pomalu, se extrahují. Vzorky še umístí do vakuové sušárny nastavené na 60 °C a 13,3kPaa nechají se zde 48 h. Test zabarvení poskytuje následující výsledky:

* »«»« · ·· »· · 99 9 9 9 9 9

9999 999 · · · * · · ··«···*· • ♦ · · 9 9 ·

vzorek	hodhocéní
esterový roztok	1
esterový roztok a	aíriinosilan 4
pouze plazma	0
neošetřeno	0

Cílem předloženého vynálezu je tedy poskytnout nový a inovační způsob výroby předmětů potažených tenkou vrstvou kyseliny hyaluronové nebo jejích derivátů nebo jiných semisyntetických polymerů navázaných na substrát. Tento způsob lze aplikovat na výrobu materiálů a zařízení se zlepšenými povrchovými vlastnostmi a zvláště takových materiálů a zařízení , která se vyznačují hydřofilními povrchy. Podrobněji - tento způsob lze použít pro výrobu materiálů pro biolékařské a chirurgické aplikace, v urologii, ortopedii, otorinologii, gáštroenterologii, oftalmologii, v kardiovaskulární oblasti a při stanovování diagnos. Přo biolékařské aplikace, zařízení pro para- nebo mimotělní použití, jako jsou kátetry, krevní sáčky, vodící trubičky, sondy, injekční stříkačky, chirurgické nástroje, nádoby, filtrační Systémy, pro protetické nebo chirurgické účely nebo implanty je možné potáhnout umělé šlachy, klouby, hřeby, srdeční chlopně, kostní a kardiovaskulární náhrady, štěpy, žilní katetry, nitrooční čočky, substituce měkkých tkání atd. Příklady Sémipermaneňtníeh zařízení, která se mohou potahovat, jsou kontaktní čočky. Komplexní zařízeni simulující fysiologické procesy, jako,jsou umělé ledviny, okysličovadla krve, umělá srdce, slinivky břišní a játra. A nakonec - v diagnostice se mohou potahovat laboratorní zařízení, misky pro buněčné nebo tkáňové kultury a/nebo regeneraci a nosné materiály pro aktivní složky, jako jsou peptidy, proteiny a protilátky.

Všechny publikace a patentově dokumenty, které jsou Zde citovány a/nebo na které jě v předloženém spisu odkazováno, jsou zde celé zahrnuty jako odkaz.

·· ···· ·· · ··

Je zřejmé, že způsoby vynálezu, který jsou Zde popsány, mohou být různými způsoby modifikovány. Tyto modifikace nejsou považovány za odklony od ducha a účelu vynálezu a jakákoliv modifikace, která by byla zřejmá odborníkovi Z oblasti techniky, spadá do rozsahu následujících patentových nároků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob potahování povrchu předmětu kyselinou hyaluronovou nebo jejím derivátem, vyznačující se t í m, že zahrnuje následující stupně:

zreagování kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu s alkoxysilanovým kondenzačním Činidlem ve vodném roztoku nebo organickém rozpouštědle v přítomnosti kondenzačního bifunkčního Činidla za vzniku roztoku obšahujícího reakční produkt kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu a alkoxysilanového kondenzačního činidla, ošetření povrchu předmětu plazmou, potažení ošetřeného povrchu předmětu roztokem, který obsahuje reakční produkt kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu a alkoxysilánového kondenzačního činidla, a odstranění tohoto roztoku z povrchu uvedeného předmětu, při čemž se nechá reakční produkt kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu a alkoxys i lanového kondenzačního činidla zreagovat s povrchem předmětů.
2. Způsob potahování povrchu předmětu podle nároku 1, vyznačující se tím, že alkoxysilanové kondenzační činidlo obsahuje merkaptanové skupiny nebo aminové skupiny.
3. Způsob potahování povrchu předmětu podle nároku 1, v y z nač ující setím, že alkoxys i lanové kondenzační činidlo znamená gama-aminopropyltriethoxysilan nebo N-beta-(aminoethyl)-gama-amiňopropyltřimethoxyšilan.
4. Způsob potahování povrchu předmětu podle nároku 1, v y značující se tím, ze k reakci alkoxysilanového kondenzačního činidla a kyseliny hyaluronové nebo jejího derivátu dochází:

i) ve vodném roztoku v přítomnosti l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu jako kondenzačního, činidla nebo r* t: t t

č

ΙΪ, ti , ii) v organickém rozpouštědle v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu-jako kondenzačního činidla.

.. ff
5. Způsob potahování, povrchu předmětu podle nároku 1, v .y z n á č u.jrí,c,í s e t í ra, že k reakci mezi álkoxysilánovým kondenzačním činidlem a kyselinou hyalurohóvou nebo jejím derivátem dále dochází v přítomnosti Ň-hydroxysukcihimiduhydroxysulfosukcinimidu, hydrátu hýdroxybenzotriazolu nebo jim podobné sloučeniny mající stejnou 'funkci. jV* .·. Ά+ ^ř*. .jí Γ.-r—JU. ·. . , «ít v, * > ’

1» Λ-ί i. V | t.· * -tf ! I £·>* - i Λ K 1 -i- .,·., -i- i . Λ “*
6. Žpůšób potahování povrchu'předmětu semisýntetickým polymerěm7 v y *z h átStůt ji i č‘ í*+ š ěi* tt) í m; Ažeížáhrriůjer há^ sleduj íoí i stupně i * . - r »..*> · >, - ^: »·*' ' i <. x zřeagováhí semisyntetickéhó polymeru s alkoxysilanovýmkondenzačním činidlem ve vodném roztoku nebo organickém. rozpouštědle i v přítomnosti kondenzačního nebo bifunkčníhó činidla’zá vzniku roztoku, který obsahuje reakční produkt'semisyntetickéhó polymeru a'alkoxysilanového kondenzačního činidla,i 'i _¥ ' I· ošetření povrchu předmětu plazmou‘, «s ’ ” ^J *

ΓΡ potažení Ošetřeného povrchu předmětu roztokem, který obsahuje:reakční produkt semisyntetickéhó polymeru a alkoxysilanového kondenzačního činidla, á'^ ' odstraněni tohoto roztoků z povrchu uveděriého předmětu; při čemž' se- nechá'reakční'produkt' semisyntetického polymeru a ialkojtysiláriového kondenzačního činidla zreagovat s povrchem předmětu.
7. Způsob potahování povrchu předmětu podlé nároku 1 nebo 6, v ý z n a č u j í c í s e t í m, že plazma znamená ky. silkovou plazmu, vzduchovou plazmu, vodní plazmu, alkoholovou plazmu, acetonovou plazmu, plazmu kyslíkaté sloučeniny, . dusíkovou plazmu, argonovou plazmu nebo směs dvou nebo více těchto plazem.
8. Způsob potahování povrchu předmětu podle nároku 6, vy· · « « značující se t í m, že k reakci semisyntetického polymeru a alkoxys i lanového kondenzačního činidla dochází:

i) vevodnémroztokuvpřítomnostil-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu jako kondenzačního činidla nebo ii) v organickém rozpouštědle v přítomnosti dicyklohexylkarbodiimidu jako kondenzačního činidla.
9. Způsob potahování povrchu předmětu podle nároku 9, vyznačující se tím, že k reakci mezi semisyntetickým polymerem a alkoxysilanovým kondenzačním činidlem dochází v přítomnosti N-hydroxysukcinimidu, hydroxyšulfosukcinimidu, hydrátu hydroxybenzotriazolu nebo jim podobné sloučeniny mající stejnou funkci.
10. Způsob potahování povrchu předmětu kyselinou hyaluronovou nebo jejím derivátem, vyznačující se t í m> že zahrnuje následující stupně:

ošetřeni povrchu předmětu plazmou, ponoření ošetřeného povrchu předmětu do roztoku obsahujícího polyethylenimin, a zreagování ošetřeného povrchu předmětu s kyselinou hyaluronovou nebo jejím derivátem v přítomnosti karbódiimidu a sloučeniny, která je vybrána ze skupiny sestávající z N-hydřoxysukcinimidU, hydroxysulfosukčinimidu, hydrátu hydroxybenzotriazolu apod.
11. Způsob potahování povrchu předmětů podle nároku 1 nebo 10, v y z ή a č u j í c í s e ti m, že derivátem kyseliny hyaluronové je:

i) úplný nebo částečný benzylester kyseliny hyaluronové nebo —„„—| j. j - úplný nebo částečný ethylester.kyseliny..hyalur o-._ nové.
12. Způsob potahování povrchu předmětu podle nároku 10, «

« a

9 9

9 99 φ 9 • 9« «99 9

99 « «

9 9
13.
14.

\ .
15 i vyznačující se tím, že reakce mezi ošetřeným povrchem a kyselinou hyaluronovou nebo jejím derivátem se provádí:

i) ve Vodném roztoku v přítomnosti hydroxysukcinimidu a l-ethy1-3-(3-dimethylaminOpropy1)karbodiimidu nebo ii) v organickém rozpouštědle v přítomnosti hydroxysukcinimidu a dicyklohexylkarbodiimidu.

Způsob potahování povrchu předmětu šemisyntetickým polymerem, vyznačující se t í m, že zahrnuje následující stupně:

ošetření povrchu předmětu plazmou, ponoření ošetřeného povrchu předmětu dó roztoku obsahujícího polyethylenimin, a zreagování ponořeného ošetřeného povrchu předriíětu se šemisyntetickým polymerem v přítomnosti karbodiimidu a sloučeniny, která je vybrána Ze skupiny sestávající z N-hydroxysukcinimidu, hydroxyšulfošukcinimidu, hydrátu hydroxybenžotriazólu ápod.

Způsob potahováni povrchu předmětu podle nároku 6 nebo 13, vyznačující se tím, že semisyntetický polymer je vybrán ze skupiny sestávající z:

esteru vícemocného alkoholu a kyseliny hyaluronové, vnitřního esteru kyselinového polysacharidu, esteru karbůxymethylcelulosy, esteru karboxymethylchitinu, esteru karboxymethylamidu, aktivního esteru kářboxylového polysacharidu, sulfatovaného esteru kyseliny hyaluronové, esteru kyseliny alginové, esteru chitinu, esteru chitosanu, ešteru kyseliny pektové a esteru kyseliny pektinové.

Způsob potahování povrchu předmětu podle nároku 13, vy z na č u j ící s e t í m, že reakce mezi ošetřeným povrchem a šemisyntetickým polymerem se provádí:

i) ve vodném roztoku v přítomnosti hydroxysukcinimidu a l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu nebo ii) ve vodném roztoku v přítomnosti hydroxysukcinimiφ* φφφφ φ φφφφ φ φφ φφφ φφφφ φφ φ φφφφ φφφ φ φ φ φ Φ» Φφ Φφ φφφφ

Φ · φφφ Φ φ

ΦΦΦΦΦΦ ·*Φ ·· ·· · du a dičyklohexylkarbodiimidu.
16. Způsob potahování povrchu předmětu podle nároku 1, 6, 10 hébó 13, vyznačují c í se tím, žé předmět, který má být potažen, obsahuje materiál, který je slučitelný s fysiologickými kapalinami.
17. Způsob potahování povrchu předmětu podle nároku 10 nebo 13, vyznačující se tím, že předmět, který má být potažen, obsahuje polymerní materiál, keramický materiál nebo kovový materiál.
18. Způsob potahování povrchu předmětu podle nároku 10 nebo 13, v y z n á č u j í c í se t í m, že předmět, který má být potažen, obsahuje kovový materiál, kteřý je vybrán ze Skupiny sestávající z titanu, slitiny titanu, oceli a slitiny chrómu s kobaltem.
19. Způsob potahování povrchu předmětu podle nároku 1., 6, 10 nebo 13, v y z n a č u j í c í se tím, že předmět, který má být potažen, je vybrán ze skupiny setsávající z;

katetrů, krevních sáčků, vodících trubiček, sond, injekčních stříkaček, chirurgických nástrojů, nádob, filtračních systémů, umělých šlach, kloubů, hřebů, srdečních chlopní, náhrad kostí a kardiovaskulárních náhrad, štěpů, žilních katetrů, vnitřoočních čoček, kontaktních čoček, náhrad měkkých tkání, umělých ledvin, ókysličovadel krve, umělých srdcí. Slinivek břišních a ledvin.
20. Způsob potahování povrchu předmětu podle nároku 1, 6, 10 nebo 13, vyznačující se t í m, že předmět, který má být potažen, je vybrán ze skupiny sestávající z:

částí laboratorního zařízení, misek pro buněčné a tkáňové kultury, misek pro regeneraci buněk a tkání a nosičů aktivních složek, kterými jsou péptidy, proteiny a protilátky.