CZ243196A3

CZ243196A3 - Pharmaceutical preparation containing plasminogen activators

Info

Publication number: CZ243196A3
Application number: CZ962431A
Authority: CZ
Inventors: Ulrich Kohnert; Stephan Fischer; Hans-Jorg Markl; Heinrich Woog
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1994-02-21
Filing date: 1995-02-18
Publication date: 1997-01-15
Also published as: DK0746334T3; DE59509580D1; CN1141592A; ATE205091T1; AU1758195A; FI117925B; FI963251L; PL181257B1; EP0746334A1; FI963251A0; SG50567A1; CA2183755C; JPH09511495A; EP0746334B1; US5747030A; MX9603515A; KR970701059A; HUT74843A; CA2183755A1; NO963460D0

Description

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutických přípravku, které jako účinné látky obsahují aktivátory plazminogenu nebo jejich deriváty ,jakož i pří slušné farmaceutické aplikační formy ve formě lyofilizátů nebo injekčních, případně infúzních roztoků.

Dosavadní stav techniky

Lidský tkáňový aktivátor plazminogenu /t-PA/ má velký terapeutický význam při rozpouštění krevních sraženin, například při srdečních infarktech. t-PA způsobuje rozpouštění krevních sraženin aktivací plazminogenu na plazmin. Plazmin zase rozpouští fibrin, hlavní složku proteinové matrice sražené krve.

Přírodní t-PA se skládá z více funkčních domén F, S, K1, K2 a P. Doména P zahrnuje proteolyticky aktivní centrum, které způsobuje štěpení plazminogenu na plazmin. Výroba aktivátorů plazminogenu /PA/ pomocí genové technologie, zejména t-PA nebo různých t-PA-muteinů v eukaryotních a prokaryotních buňkách.je už známá. Přitom se syntetizují deriváty t-PA z prokaryotů v protikladu k přírodnímu t-PA v neglykosylované formě.

Jako aktivátory plazminogenu přicházejí v úvahu ve smyslu vynálezu principiálně takové, zejména rekombinantně produkované deriváty.t-PA,které v podstatě zahrnují ty proteinové oblasti přírodního proteinu, které jsou kompetentní pro fibrinolýzu trombů. Přitom se mohou využívat i tahové deriváty t-PA, které vykazují delece nebo substituce jednotlivé nebo více aminokyselin v sekvenci t-PA.

Podle vynálezu se může použít například následujících aktivátorů plazminogenu: t-PA /například altepla^za/j LY 210825 /K2P k získání z buněčných linií syrian hamster, Circ. 1990,82, 930-940/; AFE3x a AFEIx /K1K2P, Blood 1988,

71, 216-219/; 4FEK1 /K2P z C127 buněk myší, J. Cardiovasc. Pharmacol. 1990, 16, 197209/; E-6010 /Jap. Circ. J. 1989, 53, s. 918/; t-PA-varianty /Thromb. Haemost., 1989, 62, s. 542/; K2P a L-K2P /Thromb. Haemost. 1989, 62, s. 393/; MB-1018 /FK2K2P, Thromb. Haemst, 1 989, 62, s. 543/; FK2P /FASEB J., 1989, 3, A1031 ,abstract 4791/; 2s>lx /Circulation, 1988, 4, 11-15/; F1F2P /Thromb. Pes., 1988, 50, 33-41/; FK1K2P/J. . Biol. Chem., 1988, 263, 1599-1602/; TNK-varianta t-PA /WO 93/ 246357; bat-PA /Witt et al., Blood 1992; 79: 1213-1217 a Mullot et al., Arterioscler. Thrombos. 1992; 12: 212-221/. V úva hu přicházejí zejména takové aktivátory plazminogenu, které obsahují prstencovou ,2-doménu /K2/t-PA a/nebo . serínproteázovoudoménu /P'7. Například by se mohl příslušně uvést t-PAmuteín r-PA typu K2P, který je popsán v EP 0 382 174 /WO 90/09437/. ·

Předložený vynález se týká zejména aktivátorů plazminoge nu typu K2P, K1K2P, FK1K2P a FK2K2P, jak 'jsou popsány v následujících spisech: Protein Engineering 5/1/, 93-100 /1992/; DE-OS-39 23 339.1; Circ. 1990, 82, 930-940 ; J. Cardiovasc. Pharmacol. 1990, 16, 197-203; Blood 1988, 71, 216-219; J. Biol. Chem. 1988, 263, 1599-1602; Thromb. Haemost. 1989, 62, s. 543. Zejména se používá rekombinantních aktivátorů plazminogenu typu K2P, jak je popsáno v EP-A-0 382 174 a v Protein Engineering sv. 5/1/, s. 93-100 /1992/. Další t-PA-muteiny tohoto druhu jsou popsány v následujících patentových přihláš kách:

US 4,970,159, EP-A-0,196.920. EP-A-0,207,589; AU 61804/86; EP-A-0,231,624;

EP-A-0,289,508; JP 63133988; EP-A-0,234,051; EP-A-0,263,172; EP-A-0,241,208; EP-A-0,292,009; EP-A-0,297,066; EP-A-0,302,456; EP-A-0,379,890.

- 3 Ze stavu techniky je známo, že podíl sacharidu má značný vliv na rozpustnost a agregaci proteinu /J. Biol. Chem.

263 /1988/, 8832-8837/. V EP-B-458 950 se zjistilo, že například neglykošylovaný rekombinanntní aktivátor plazminogenu s doménovou strukturou K2P má podstatně nižší rozpustnost než například glykosylované deriváty t-PA. Neglykosylované aktivátory plazminogenu, jako například r-PA, se zpravidla rozpouštějí jen v malé míre v obvykle k solubilizaci proteinů používaných pufrech, jako například v 50 mmol/1 Na-citrátu pH 6_f50 mmol/1 fosfátovém pufru nebo fyziologickém roztoku NaCl.

Pro použití jako terapeutické účinné látky je však žádoucí, aby byly aktivátory plazminogenu v dostatečně vysokých koncentracích, zejména v koncentraci až 10 mg/ml.

Z EP-A-0 217 379 je známo zvyšování rozpustnosti t-PA z prokaryotů pomocí neutrálních nebo slabě alkalických formulací argininu. Nevýhodou tohoto způsobu je ale to, že dobrých rozpustností t-PA z prokaryotů je možno dosáhnout jen s velmi vysokými koncentracemi argininu.

Další galenické formulace aktivátorů plazminogenu nebo jejich derivátu jsou známy z WO 90/01333, WO 89/050347, WO 90/08557, EP 0 297 294, EP 0 156 169 a EP 0 228 862.

VeWO 90/01333 /Invitron/ je popsána kombinace lysinu, histidinu, argininu s citrátem pro t-PA a deriváty z baktérií. Požívá se citrátu s 5 mmol/ljlysinu, histidinu, argininu se 150 mmol/1 při pH 6. Kromě toho se přidává albumin.

Ve WO 89/050347 /Invitron/ je popsána kombinace argininu /20 - 200 mmol/l7 a citrátu /20 - 80 mmol/1/ při pH 5 - 8.

WO 90/08557 /Genetics Institute/ zveřejňuje kombinaci kreatininu s různými přísadami, ja>o histidin, arginin, prolin, betain, kolin, imidazol, tryptofan, citrát, popřípadě za přídavku kyseliny glutamové, kyseliny asparagové a kyseliny jantarové.

V EP 0 297 294 /Behring/ se zveřejňuje kombinace alespoň dvou aminokyselin, jako lysin,ornithin,arginin, kyselina tr-ans-4(aminometyl)-cyklohexankarboxylová,a dalších přísad při pH 5 - 10.

EP 0 156 169 /Asahi/ popisuje ornithin a/nebo lysin, popřípadě za přídavku citrátu, glycinu nebo fosfátu a EP 0 228 862 /Génentech/ zveřejňuje formulaci obsahující arginin s nebo bez chloridu, jakoži s nebo bez detergentu.

Alternativní formulace r-PA v přítomnosti lysinu, případně lysinových analog¹! v roztocích pufrovaných kyselinou citrónovou jsou popsány ta>é v EP 0 458 950 /Boehringer Mannheim/. Novější výzkumy však ukazují, že rozpustnost r-PA není ani v těchto formulacích ještě plně postačující. Zjistilo se, že sice lze rozpustnost pomocí zvýšení koncentrace citrátu zlepšit, avšak takové formulace nejsou žilně kompatibilní nebo jenom podmíněně. Mimo to vedou vysoké koncentrace soli a ^s tlm spojená níz^l'á teolota skelného přechodu /T*/ k tomu, že lyofilizace těchto formulací musí být prováděna při teplotách pod -45 °C a -50 °C. Tyto teploty jsou technicky často realizovatelné jen s velmi vysokými náklady a vyžadují nákladné řídící a kontrolní prvky, aby bylo možno měřit a regulovat optimální podmínky pro lyofilizaci. Kromě toho je s tím spojena relativně vysoká spotřeba energie. K tomu se připojuje to, že se často pro velkovýrobu používá starších lyofilizačních zařízení, ^vterá nemají žádoucí komplikovanou měřící a regulační techniku, a u kterých proto může být garantována zpravidla pracovní teplota jen přibližně -45 °C.

- 5 Úlohou vynálezu je poskytnout formulace aktivátorů plazminogenu a jejich derivátů, které jsou dobře žilnš kompatibilní, obsahují účinnou látku v dostatečně vysokých koncentracích a zajišťují dobrou rozpustnost účinné látky, přičemž stabilita PA v lyofilizátu má zůstat po delší dobu zachována. Kromě toho je cílem vynálezu vyvinout formulace, které jsou také v technickém výrobním měřítku spolehlivě lyofilizovatel né, čímž se má zajistit dobře reprodu^ovatelná produktová kvalita lyofilizátů.

Podstata vynálezu

---- . — — — . - ------L2 --- ---Úloha podle vynálezu se řeší pomocí farmaceutického přípravku obsahujícího aktivátor plazminogenu, přičemž přípravek obsahuje jako farmaceutické přísady aspoň jeden sacharid a kyselinu trans-4-(aminomethyl)-cyklohexankarboxylovou / tranexaminokyselinu / přípravek je v lyofilizované formě po delší dobu stabilní při skladování. Také vodní injekční roztok vyrobený pomocí rekonstituce splňuje toto kritérium zvýšené stability při skladování. Tak je tomu obzvláště potom, když hodnota pH roztoku se nastaví na hodnotu mezi 5,5 - 6,5· Jako další přísady může farmaceutický přípravek obsahovat obvyklé pufrové látky nebo povrchově aktivní látky /anionové, kationové nebo neutrální tenzidy/.

Například pro aktivátory plazminogenu /PA/ přicházející v úvahu ve smyslu předloženého vynálezu byl použitý aktivátor plazminogenu K2P /BM 06.022/, blíže popsaný v evropské patentové přihlášce EP-A-0,382,174. Skládá se z prstence 2 /K2/ a proteázové domény /P/ humánního t-PA a je k dispozici kvůli, své expresi v buňkách Echerichia coli v neglykosylované formě.

- 6 Jako sacharidy obsahují formulace podle vynálezu přednostně mono- nebo disacharidy. Jako disacharidy přicházejí v úvahu zejména sacharóza, trehalóza, maltoza nebo la>tóza. Monosacharidy jsou zejména gala^toza nebo příslušné aminosacharidy, jako například galakfozamin. Přednostně se používá neredukující sacharid sacharóza nebo trehalóza. Koncentrace sacharidu ve vodním injekčním roztoku činí zejména 40 -Ί00 mg/ml, přednostně je mezi 50 - 70 mg/ml.

Jako pufrové látky mohou farmaceutické přípravky obsahovat látky přicházející v úvahu obvykle pro tyto účely, které představují soli silných kyselin se slabými zásadami nebo soli slabých kyselin se silnými zásadami. Například by bylo mož no jmenovat soli alkalických kovů.s .kyselinou fosforečnou, vinnou, jablečnou apod. Právě tak mohou přicházet v úvahu ami nokyseliny. Přednostně obsahují přípravky podle vynálezu fosfátový pufr. Koncentrace fosfátového pufru v hotovém injikovatelném vodním roztoku činí obzvláště 50 - 300 mmol/1, přednostně 80 - 220 mmol/1 a obzvláště přednostně 130 - 170 mmol/1. Jako fosfátový pufr se používá především h.ydrogenfosforečnan didraselný nebo disodný, který se nastavuje kyselinou fosforečnou na danou hodnotu pH.

Pro zlepšení rozpustnosti obsahují přípravky podle vynálezu kyselinu trans-4-(aminomethyl) cyklohexankarboxylovou /TES/. Koncentrace kyseliny trans-4-(.aminomethyl)cyklohexankarboxylové v hotovém injikovatelném vodním roztoku činí přednostně 1 - 50 mmol/1, především 8-12 mmol/1. Obzvláště výhodně se používá koncentrace 10 mmol/1. S překvapením se zjistilo, že kyselina trans-4-(aminomethyl) cyklohexankarboxylová zvyšuje rozpustnost aktivátorů plazminogenu, zvláště neglykosylovaných aktivátorů plazminogenu, ve vodním médiu. Například v případě derivátu aktivároru plazminogenu r-PA se zvýšila rozpustnost nejméně o faktor 1 ,5 vůči roztoku, který neobsahuje kyselinu trans-4- (aminomethyl) cyklohexánkarboxylovou. Faktor pro zvýšení rozpustnosti je obzvláště v rozsahu 2-3. Tento efekt je výhodný především v rámci výroby lyofilizovaných farmaceutických příprav aktivátorů plazminogenu, protože pomocí možnosti zvýšení koncentrace a^vtivá-

má být použito v procesu výroby, a celkově se docílí energeticky úsporné a levnější výroby. Zejména se tím zkracují doby lyofilizace při procesu výroby.

Jako tenzidy se mohou použít neionové, anionové nebo kationové tenzidy, především však neionové tenzidy, jako například Tv/een 80 nebo Tween 20. Koncentrace tenzidu činí 0,005 0,1 % /hm./obj./, zejména 0,01

Pro farmaceutický přípravek podle vynálezu ve vodní formě je vhodná hodnota' pH mezi 5,5 - 6,5, .přednostně je hodnota 'pH 5,8 - 6,2.

Přípravky podle vynálezu obsahují účinnou látku v koncentraci až 10 mg/ml, především 3-5 mg/ml.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu se používají jako in jekční nebo infúzní roztoky. Toto še může uskutečnit tak, že je k dispozici už hotový roztok ke vstřikování, který má složení podle vynálezu. Je však také možné dát k dispozici farmaceutické přípravky ve formě lyofilizátů. Tyto jsou potom rekonstituovány pomocí o sobě známých , pro injekční účely vhodných prostředků nebo roztoků /například ^s vodou/.

Jako injekční médium se používá pro přípravky podle vynálezu především voda, která může případně obsahovat obvyklé isoto8 nické přísady, jako například fyziologickou koncentraci NaCl.

Předmětem vynálezu je také způsob výroby farmaceutického přípravku obsahujícího aktivátory plazminogenu nebo jejich deriváty s hodnotou pH 5,5 až 6,5, jakož i jejich využití k výrobě farmaceutických přípravků podle vynálezu.

Předmětem vynálezu je mimoto použití určité směsi farmaceutických pomocných látek, sestávající ze skupiny sacharidu a kyseliny trans-4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylové, pro dlouhodobou stabilizaci aktivátorů plazminogenu. Obzvláště výhodná je zejména kombinace pomocných látek sacharidu, fosfátového pufru, kyseliny trans-4-('aminomethyl)cykiohexankarboxylové a tenzidu > dosažení dobré stability při skladování.

Výzkumy stability ukazují, že přípravky podle vynálezu jsou jako roztoky stabilní při 4 °G nejméně 30 dní. Stabilita účinné látky v lyofilizátech podle vynálezu činí při 4 °C dva až pět roků. Výhodně se projevuje zejména skutečnost, že léčivé příprsvk vykazují výbornou stabilitu také při vyšším tepelném zatížení, která je činí dalekosáhlé necitlivými vůči kolísáním teploty, která se mohou vyskytovat zejména v teplejších klimatických oblastech země, zejména při přerušení chladicího řetězu. Na základě často dlouhých cest odbytu v případě farmaceutických aplikačních forem od výrobce léčiv až ke konzumentovi nemůže být v různých zemích vyloučeno, že přípravky nebudou neúmyslně popřípadě vystaveny také po delší dobu kolísáním teploty, která vedou >e ztrátě aktivity proteinu, a tím uvádějí v pochybnost terapeutický úspěch při léčení v extrémním případě. Aplikační formy podle vynálezu jsou však vůči takovým kolísáním teploty dalekosáhle necitlivé.

V předběžných výzkumech stability se však mohlo ukázat, že při přípravcích ani při teplotě 35 °C, které byly vystaveny po dobu 30 dní, nemohlo být zjištěno žádné zvláštní poškození., ^{co se} týká stability proteinu. Proto je možno z toho vyvozovat, že přípravky při náležitém skladování při teplotě chladničky budou vykazovat stabilitu dva až pět roků.

Přípravky podle vynálezu mají kromě toho tu výhodu, že teplota skelného přechodu^T^) zmrazeného roztoku pro výrobu lyofilizátů je relativně vysoká a leží mezi -33 °C a -4-0 °C, takže reprodukovatelnost kvality produktu lyofilizátů je zajištěna také vtechnickém výrobním měřítku s dostatečnou jistotou.Poměrně vysoká tepl ta skelného přechodu je zejména proto výhodná, protože při technicky podmíněných a nepředvídaných zvýšeních teploty v průběhu často velmi dlouhých dob lyofilizace je méně pravděpodobné riziko nezamýšleného roztáni zmrazených roztoků. V případech,kdy teplota skelného.přechodu leží pod -40 °C a tato teplota se během procesu lyofilizace překračuje směrem nahoru, což nastává zejména u technologických lyofilizačních zařízení, která pracují při teplotách blízkých -45 °C,může nežádoucí překročení teploty s^ve ného přechodu vést k nevýhodným změnám zmrazeného roztoku. Dostatečně dobrá kvalita produktu už potom není zajištěna. Přitom může dojít zejména u lyofilizátů obsahujících proteiny ke ztrátě aktivity proteinu, popřípadě ke tvorbě agregátů. Další výhoda přípravků podle vynálezu s teplotou skelného přechodu -33 až -40 °C spočívá v tom, že žádoucí spotřeba energie pro proces lyofilizace se minimalizuje, protože proces lyofilizace se nemusí provádět nutně při teplotách pod -50 °C.

Ve smyslu předloženého vynálezu lze dosáhnout relativně vysokých teplot skelného, přechodu pro zmrazené roztoky zejména potom, když se jako fosfátového pufru pro lyofilizaci náležitých roztoků použije draselné soli, jako například hydrogenfosforečnanu didraselného nebo dihydrogenfosforečnanu draselného. V úvahu přichází v té věci zejména hydrogenfosforečnan didraselný v koncentraci 20 - 40 mg/ml, obzvláště 20-30 mg/ml.Zvýšení teploty skelného přechodu lze zvětšit pomocí přísady sacharózy. Sacharóza se přitom přidává zvláště v koncentraci 60 - 90 mg/ml, zejména 60 - 80 mg/ml. Obzvláště přednostně se používá roztoku, který obsahuje přibližné 26 mg/ml hydrogenfosfátu didraselného /R^HPO^. 12^0/ a přibližné 70 mg/ml sacharózy. Hodnota pH roztoku se především pomocí 85% kyseliny fosforečné /asi 1 2 mg/ml/ nastavuje na hodnotu 6. Dále obsahuje roztok asi 0,5 - 5 mg/ml, přednostně 1 - 2 mg/ml kyseliny trans-4-(aminomethyl) c.y>lohexankarboxylové, zejména asi 1,6 mg/ml. Mimoto mohou být dále obsaženy tenzidy, ja>o například Tween 80, který se používá přednostně v koncentraci 0,01 - 0,3 mg/ml, zejména asi 0,1 mg/ ml.

Další výhoda lyofilizátú podle vynálezu spočívá v tom, že vykazují relativně nízkou zbytkovou vlhkost po ukončení lyofilizace. Zbytková vlhkost má hodnoty zejména nižší než 5 %, především mezi 0,5 - 4 %, zejména 1 - 3 %. Obvykle leží hodnoty pro lyofilizáty nad 6 %. Nízká zbytková vlhkost přispívá k tomu, že přípravky mají lepší stabilitu při skladování. Přípravky s vyšší zbytkovou vlhkostí vedou často k nestabilitě proteinu, která se projevuje ztrátou biologické aktivity nebo tvorbou agregátů.

Další výhoda přípravku podle vynálezu spočívá v tom, že při výrobě lyofilizátú na základě zvýšení rozpustnosti neglykosylovaných aktivátorů plazminogenu, dosaženého pomocí přísady kyseliny trans-4-(aminomethylJcyklohexankarboxylové, zejména v případě muteinů typu V2P, ^T/1V2P nebo P, se může vycházet z menších objemů /například z asi 5 ml na jednotlivou aplikační formu/ roztoků, které se mají zmrazit, takže se doba lyofi lizace vůči dosud používaným roztokům pro výrobu l.yofilizátů /například asi 10 ml na aplikační formu/ výrazně zkrátí. Vychází se zejména od roztoků, které obsahují účinnou látku přibližně v dvakrát vyšší koncentraci ve srovnání s hotovými injekčními vodními aplikačními formami, takže místo dosud obvyklých roztoků s objemem 10 ml se mohou použít vodní roztoky s objemem 5 ml.

Výzkumy žilní kompatibility ukazují velmi dobrou kompatibilitu přípravků podle vynálezu.

Následující příklady provedení mají vynález blíže objasnit, aniž by ho omezovaly.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Zakalení po mechanickém zatíženi/

Měření rozptylu světla přípravků podle vynálezu r-PA /BM 06.022/ se nastavil na koncentraci proteinu /Cp_rot / & ^mS/^ml /ultrafiltrace přes membránu Amicon YM 10/ a dialyzoval proti uvedenému pufru. Následně se nestavily vzorky na Cp_ro^ = 4 mg/ml a a/ nechaly nezměněné, b/ zředily 0,01 % Tween 80 a o/ zředily 0,01 % Tween 20.

Zatížení vzorků nastalo nyní po dobu 10 s na Whirl

Mix /JankeA Kunkel, IKA-Laboratortechnik VF2, maximální počet otáček/. Následně se vzorky inkubovaly po dobu 2 minut při teplotě místnosti.

Rozptyl světla nezatíženého a zatíženého vzorku se měří fluo rimetricky při 25°C /Ex. 350 nm,Em.:350 nm,Sx.-bándpath:3 nm; Em. bandpath: 10 nm; interval měření: 10 s po 3 min/..Ve vyobr. 1 je uvedená hodnota pro rozptyl vzorku, korigovaná o fluorescenci pufru.

Výsledek:

Tyto údaje ukazují, že bez přídavku detergentú při mechanickém zatížení dochází ke značnému vzestupu rozptylu světla vzorku /vyobr. 1/. Vzestup může být pomocí přísady detergentú nejrozsáhleji potlačen. V rámci přesnosti měření nelze rozeznat žádný rozdíl mezi Tween 80 a Tween 20.

Ve vyobr. 1 /mechanické zatížení vzorku A, B, C, D/ jsou shrnuty získané výsledky. Zkratky použité ve vyobr. 1 jednotlivě znamenají:

A/ 150 mM Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 mM TES mg/ml sacharózy a/ bez detergentú b/ s 0,01 % Tween 80 c/ s 0,01 % Tween 20

B/ 150 mM Na₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0

0 mM TES mg/ml trehalózy a/ bez detergentú b/ s 0,01 % Tween 80 c/ s 0,01 % Tween 20

C/ 150 mM K₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0 mM TES mg/ml sacharózy a/ bez detergentu b/ s 0,01 % Tween 80 c/ s 0,01 % Tween 20

D/ 150 mM K₂HPO₄/H₃PO₄, pH 6,0

0 ml·,! TES mg/ml trehalozy a/ bez detergentu b/ s 0,01 % Tween 80 c/ s 0,01 % Tween 20

Příklad 2

Skladování r-PA /5M 06.022/ Va formulacích podle .vynál.eztt obsahujících TES/s°charózu// Vícenásobné zmrazení a roztáni r-PA se dialyzoval proti pufru uvedenému v tabulce 1 /bez Tween 80/, nastavil na θρ_Γ0·{. - mg/ml, zředil pomocí Tween 80 na C = 0,01 %, rozdělil do dávek a sterilně filtroval. Při -20, popřípadě -70 °C se zmrazilo 9 vzorků. Ve dnech uvedených v tabulce všechny vzorky až na kontrolu roztály /15 min při 25 °C ve vodní lázni/. Právě jeden vzore> se analyzoval /C_prot a amidolytická aktivita/. Zbývající vzorky se při -20, popřípadě -70 °C zmrazily. Po ukončení série se určila aktivita nezatížené kontroly.

Výsledek:

Jak vyplývá na základě údajů z tabulky 1, může být r-PA bez ztráty aktivity nejméně osmkrát zmrazen a rozmražen.

Tabulka 1

150 mM Νη₂ΗΡΟ4/Η3ΡΟ4, pH 6,0 lOmMTES mg/ml sacharózy 0,01 % Tween 80

	-20 °C	-70 °C
Den	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]	CProt. [mg/ml]	AA [MU/ml]
0	4,1	3,1	4,1	3,1
1	4,5	3,1	4,6	3,0
2	4,6	3,2	4,8	3,1
3	4,3	3,1	4,0	3,0
4	4,8	3,1	4,7	3,1
5	4,1	o ί	4,1	3,2
6	4,2	3,0	4,2	3,1
7	4,1	3,1	4,3	3,2
8	4,0	2,9	4,3	3,1
Kontrola	4,3	3,0	4,3	3,1

Kontrola: vzorek proměřen bez zpracování

AA: amidolytická aktivita 'Prot. ’ koncentrace proteinu

Příklad 3

Stabilita r-PA v roztoku

Porovnání různých formulací při Cp_rot4 mg/ml r-PA /BM 06.022/ se zkoncentroval na 5 mg/ml přes membránu Amicon YM 10 a dialyzoval proti pufru uvedenému v tabulce 2 /bez Tween 80/. Dialyzáty se nastavily na C_prot. = 4 mg/ml, zředily Tween 80 na C = 0,01 %, rozdělily do dávek a uložily při -20 a 4 °C. Po 7, 14, 20 a 30 dnech se určila amidolytická aktivita a koncetrace proteinu zatížených vzorku.

Výsledek:

Vzorky uložené při -20 a 4 °C zůstávají po 30 dní nezmě něny.

Tabulka 2

150 mM Νη₂ΗΡΟ4/Η₃ΡΟ4, pH 6.0 lOmMTES mg/ml trehalózy 0.01 % Tween 80

	-20 °C	-ř 4 °C
Den	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]	CProt. [mg/ml]	AA [MU/ml]
0	3.9	2.1
7	3.9	2.3	3,97	2,4
14	3,9	2.3	3,98	2,4
20	3,9	2.3	3,9	2,4
30	3,9	2.3	3,9	2,4

AA: amidolytická aktivita π : koncetrace proteinu

Prot.

Příklad 4

Stabilita r-PA v roztoku

Porovnání různých formulací při Cp_rc^·.⁼ 6 mg/ml r-PA /BM 06.022/ se dialyzoval přes noc proti níže němu pufru a nastavil na Cp_rQ^. = 6 mg/ml zkocentrováním membránu Amicon YM 10. Vzorky se plnily do 1 ml-dávek a žily po dobu 30 dní při -20 a 4 °C. Po 1 , 2, 5, 9, 15 a dnech se stanovila aktivita a obsah proteinu.

Tabulka 3

200mMNa₂HP04/H3P04.pH6.0 lOmMTES mg/ml. sacharózy 0.01 % Tween 80 uvede přes ulo29

	-20 °C	ť4°C
Den	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]
0	6.0	3.3	6,0	η Π
1	5,7	H Λ	5,7	3,6
2	5,8	3.3	5.9	3,4
5	5,9	3,2	6,0	3,6
9	6,0	3,3	5,9	3,7
15	5,8	3,5	5,9 3,5
29	5.9	3.6	5,9 3,8

AA: amidolytická aktivita

Cprot ^: koncentrace proteinů

Tabulka 4

150 mM NaoHPOyiTjPOd, pH 6.0 lOmMTES mg/ml sacharozy 0,01 % Tween 80

	-20 °C	-70 °C
Den	CProt. [mg/ml]	AA [MU/ml]	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]
0	5,9	3,5	5,9	3,5
1	5.5	3.5	5,6	3,4
2	5.6	3.4	5.5	3,5
5	6,0	3.5	6.2	3,6
9	6,0	-1 o	6,0	o -»
15	6,0	3.6	5,9	3,1
29	5.9	3,5	6,0	3,6

AA : amidolytická aktivita

Cr, . : koncentrace proteinu Prot.

Výsledek:

Z údajů v tabulkách vyplývá, že účinná látka BM 06.022 je stabilní v uvedených formulacích při -20 °C a 4 °C nejméně 29 dní.

Příklad 5

Rozpustnost r-PA ve formulacích podle vynálezu r-PA /BM 06.022/ se zkoncentroval pres YM 10 na 6 mg/ml a dialyzoval proti níže uvedenému pufru. Lialyzáty se znovu přes membránu Amicon YM 10 koncentrovaly tak dlouho, dokud se neprojevil zákal. Po centrifugací vzorků se supernatanty uložily po 5 dní při 4 °C. Na začátku a na konci skladování se stanovila amidolytická aktivita a C_n , .

Prot.

Tabulka 5

150 mM Na2HPO4/H3PO4, pH 6,0 lOmMTES mg/ml sacharozy 0,01 % Tween 80

Den	Cprot. [mg/ml]	AA [MU/ml]
0	10.2	4.8
5	10,2	4.9

AA: amidolytická aktivita

Cprot ^: koncentrace proteinu

Výsledek:

Rozpustnost r-PA činí přibližně 10 mg/ml. Při maximální koncentraci proteinu může být vzorek při 4 °C uskladněný beze změny amidolytické aktivity nejméně až 5 dní.

Příklad 6

Výroba kapalných aplikačních forem

Před lyofilizací byly vyrobeny jako roztoky následující aplikační formy;

Složení roztoků před lyofilizací Roztok A:

BM 06.022 ^{4 m}S^/nú

Na₂HPO₄. 12 H₂O ⁵³>^{72 mg/ml}

H3PO4 85 % 11,3 mg/ml

Kyselina trans-4-(acinomethyl)cyklohexankarboxylová 1/ mg/ml

Sacharóza 50 mg/ml

Tween 80, pH 6 0,1 mg/ml

Roztok B:

BM 06.022 ⁴ mg/ml

K9HPO4 ²⁶>² mg⁷™¹

H3PO4 85 % 11,6 mg/ml

Kyselina trans-4-faminomethyl)cyklohexankarboxylová 1,6 mg/ml

Sacharóza 70 mg/ml

Tween 80, pH 6 0,1 mg/ml

Výroba lyofilizátů:

Po sterilní filtraci se 5ml podíly plní do 2Gnl skleně ných lahviček. Lyofilizace se provádí následujícím způsobem: Naplněné lahvičky se vloží do lyofilizační sušičky a mrazí při teplotách -40 až -50 °C teploty plotny 10 hodin při atmosferickém tlaku. Následně se na komoru naloží vákuová hodnota p = 0,01 až 0,1 mbar. Teplota plotny se potom nastaví tak, aby teplota produktu ležela v každém okamžiku spolehlivě pod danou teplotou proměny skla. Když se celé množství ledu odsublimuje, zvýší se teplota plotny na hodnotu 20 - 40 °C a následně se provádí dodatečné sušení ve vakuu. Zbytková vlhkost se určila podle obvyklého způsobu /stanovení podle metody Karla Fischera/ a činí u roztoku A 6 % a u roztoku B 3 %. Uskladnění lyofilizátů pro výzkumy stability nastává při teplotách 4 °C /teplota chladničky/, °C /teplota místnosti/ a 35 °C. Stabilta lyofilizátů po době uskladnění od čtyř do dvanásti týdnů je při uvedených teplotách splněna tak, jak vyplývá z analytických výzkumů, pokud jde o amidolytickou aktivitu a koncentraci proteinu..

rekonstituce lyofilizátů pro aplikaci: Lyofilizáty se doplní vodou pro injekční účely na 10 ml. Toto odpovídá zředění o faktor dva v poměru k původnímu objemu roztoku před lyofilizaci.

Příklad 7

Zkouška žilní snášenlivosti formulací podle vynálezu

Připravily se dva testované roztoky a dva rozto^vy placeba se složením uvedeným v tabulce 6 a aplikovaly intravenózně králíkům. Jako aplikační množství se použilo 0,5 ml/zvíře, pro každý ze čtyř testovaných roztoků se použilo 5 zvířat.

Tabulka 6

Složení testovaných roztoků a roztoků placeba . Testovaný roztok

	Pokus č.93/1292	Pokus č.93/1294
BM06.022	10 MU	1 0 MU
Hydrogenfosforečnen didraselný	131,0 mg	131,0 mg
Kyselina fosforečná; 85%	58 mg	58 mg
Kyselina trans-4- (aminomethyl) -
cyklohexankarboxylová	8,0 mg	8,0 mg
Sacharóza	250,0 mg	350,0 mg
Polysorbát 80	0,5 mg	0,5 mg
Voda pro injekční účely	do 10,0 ml	do 10,0 ml
pH	6,0	6,0
Osmolarita	320 mOsmol	351 mOsmol
2. Roztoky placeba
	Pokus	Pokus
	č.93/1291	č.93/1293
Hydrogenfosforečnan didraselný	131,0 mg	131,0 mg
Kyselina fosforečná, 85%	58 mg	58 mg
Kyselina trans-4-(aminomethyl)-
cyklohexankarboxylová	8,0 mg	8,0 mg
Sacharóza	250,0 mg	350,0 mg
Polysorbát 80	0,5 mg	0,5 mg
Voda pro injekční účely	do 10,0 ml	do 10,0 ml
pH	6,0	6,0
Osmolarita	322 mOsmol	343 mOsmol
Výsledek:
Reakce zvířat při injekci a	histologické	nálezy ukazu-
jí, že použité testované roztoky	jsou celkově	dobře kompa-

tibilní.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1 . Farmaceutický přípravek aktivátoru plazminogenu, který obsahuje sacharid a kyselinu trans-4-( aminomethyl)cyklohexankarboxylovou jako jedinou aminokyselinu a nezahrnuje žádný citrát.
2. Přípravky podle nároku 1, vyznačující se tím, že sacharidem je disacharid.
3. Přípravek podle nároku 2,vyznačující se t í m , že sacharidem je sacharoza nebo trehaloza.
4. Přípravek podle jednoho z nároků 1 -3,vy značující se tím, že dodatečně je obsažena pufrová látka a touto pufrovou látkou je draselná sůl kyseliny fosforečné, zejména hydrogenfosforečnan óidraselný.
5. Přípravek podle jednoho z nároků 1 - 4, v y z n a čující se tím, že přípravek je k dispozici jako zmrazený roztok.
6. Přípravek podle jednoho z nároků 1 -5,vyznačující se tím, že obsahuje 40 - 100 mg/ml sacharidu, obzvláště 50 - 70 mg/ml.
7. Přípravek podle jednoho z nároků 1 -6, vyznačující se tím, že obsahuje 50 - 300 mmol/1 fosfátového pufru, obzvláště 80 - 220 mmol/1.
8. Přípravek podle jednoho z nároků 1 -7, vyznačující se tím, že obsahuje 1 - 50 mmol/1 kyseliny trans-4-(aminomethyl )cyklohexankarboxylové , obzvláště 8 ~ 12 mmol/1.

ZMĚNĚNÝ LIST
9. Přípravek podle jednoho z nárok} 1 - 8, v y z n a čující se tím, že obsahuje 0,005 - 0,1 % tenzidu, obzvláště 0,01 %.
10. Přípravek podle jednoho z nároků 1-9, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní aktivátor plazminogenu typu ^TZ2P, obzvláště 3M 06.022.
11. Přípravek podle jednoho z nároků 1-9, vyznačující se tím, že obsahuje t-PA nebo jeho deriváty v koncentraci až dó 10 mg/ml.
12. Přípravek podle jednoho z nároků 1 - 4 nebo 9-11, vyznačující se tím, že farmaceutickou aplikační formou je lyofilizát.
13· Příoravek podle jednoho z nároků 1 - 4 nebo 6 - 11, vyznačující se tím, že aplikační formou je vodní roztok a hodnota pH tohoto roztoku činí 5,5 - 6,5.
14. Způsob výroby farmaceutického přípravku podle jednoho z nároků 1-13, vyznačující se tím, že se aktivátor plazminogenu převádí spolu se sacharidem a kyselinou trans-4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylovou na vhodnou -farmaceutickou aplikační' formu.
15. Způsob výroby lyofilizovaného farmaceutického přípravku podle nároku 14, vyznačující se tím, že se vyrobí vodní roztok obsahující aktivátor plazminogenu, sacharid a kyselinu trans-4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylovou, roztok se zmrazí, teplota zmrazeného roztoku se nastaví na hodnotu pod teplotou skelného přechodu, obzvláště mezi -40 °C a -50 °C, a zmrazený roztok se lyofilizuje ve vakuu.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že při lyofilizaci se vychází z roztoků, které ob sáhují účinnou látku ve trojnásobně vyšší koncentraci v porovnání s hotovým vodním injekčním nebo infúzním roztokem.
17. Použití kombinace farmaceutických pomocných látek sacharidu, fosfátového pufru, kyseliny trans-4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylové a tenzidů pro výrobu žilně kompatibil nich farmaceutických aplikačních forem, které obsahují akti· vátor plazminogenu a tyto pomocné látky, avšak nezahrnují žádný citrát.
18. Použití podle nároku 17 k výrobě aplikačních forem se stabilitou při skladování nejméně dva roky.
19. Farmaceutická aplikační forma ve formě lyofilizátú se zbytkovou vlhkostí méně než 5 %, zejména 1 - 3 %, obsahující aktivátor plazminogenu, sacharid, fosfátový pufr, kyselinu trans-4-(aminomethyl)cyklohexankarboxylovou a tenzid, přičemž tato aplikační forma nezahrnuje žádný citrát.
20. Farmaceutická aplikační forma podle nároku 19 se stabilitou při skladování alespoň dva roky.
21. Farmaceutická aplikační forma podle nároku 19 nebo 20 k zabránění ztrátě biologické aktivity nebo k zabránění tvorbě agregátů.