CZ2002888A3 - Bioreaktor pro fermentaci pevných látek - Google Patents

Description

Bioreaktor pro fermentaci pevných látek

Vynález se týká bioreaktoru pro fermentaci pevných látek a příslušného fermentačmho postupu.

Přeměna pevných, ve vodě nerozpustných substrátů nebo substrátů ve formě pevných částic ve fermentorech přináší řadu problémů, které se týkají v první řadě vzdušnění, míchání a přidávání živných medií. Jestliže má být přeměňovaná látka synergisticky napadána různými mikroorganismy, je kromě toho nutné cílené zásobování reaktorového prostoru živinami a kyslíkem. Ve velkoobjemových reaktorech nelze tyto fermentace v současné době realizovat vzhledem k obtížnému míchání a s ním spojenému nedostatečnému vzdušnění a nedokonalému zásobení substráty.

Míchání u komerčně dostupných reaktorů nastává pomocí mechanických míchacích systémů. Kromě toho popisuje US patent 4,846,964 bioreaktorový systém s fluidním ložem pro přeměnu uhlí na mikrobiologicky zkapalněné uhelné produkty u nějž udržuje vzestupný vodní proud částice uhlí v roztoku. Výše jmenované metody míchání mají tu nevýhodu, že u fermentaci vyšších koncentrací substrátu nebo substrátů, které mají tendenci ke tvorbě shluků nezajišťují dostatečné míchání a tím ani vysokou přeměnu substrátu.

Předmětem tohoto vynálezu byla konstrukce bioreaktoru a fermentačního postupu, které nevykazují nedostatky současného stavu techniky, zvláště pak zajišťují dostatečné míchání fermentovaných materiálů.

Překvapivě bylo zjištěno, že prostřednictvím cíleného zavádění tlakového plynu buď kontinuálního nebo v tlakových pulsech dochází k dostatečnému míchání reakčního média obsahujícího pevné nebo ve vodě nerozpustné fermentační látky v znaky vlastnostmi podle nároku 1 a způsob aerobní fermentace se znaky podle nároku 19.

Bioreaktor slouží k fermentaci ve vodě rozpustných substrátů nebo substrátů obsahujících částice jako např. dřeva (které je degradováno pouze některými mikroorganismy vzhledem ke svému obsahu ligninu), uhlí (s cílem využít tekuté fermentační produkty jako výchozí látky pro chemický průmysl nebo k termickému použití), sanaci zemin zatížených xenobiotiky, k rychlé fermentaci organických odpadních produktů, k biologickému čištění odpadních vod a k předběžnému zpracování surovin pro chemický průmysl.

Navrhovaný bioreaktor umožňuje pomocí alespoň jedné speciální soustavy trysek, která je zavedena do fermentovaného substrátu a je pneumaticky zásobována tlakovým plynem, optimální vzdušnění a míchání pevných, ve vodě nerozpustných nebo substrátů ve formě částic. Jak zásobení mikroorganismů vzdušným kyslíkem, tak dodávka živných půd, kosubstrátů, vitaminů, minerálních látek, pufrů nebo antibiotik probíhá jediným pneumatickým tlakovým systémem. Bioreaktor může být použit v lehce modifikované formě v každé libovolné velikosti od pětilitrového laboratorního měřítka, až k velkoprůmy šlovému měřítku v řádu násobků hektolitrů. Navrhovaný bioreaktor může být s jednoduchými úpravami použit rovněž jako konvenční reaktor typu kapalina/pevná fáze, pevná fáze, zkrápěný biofilm, fed-batch nebo airlift reaktor.

Podle vynálezu je možno první vertikálně uspořádanou soustavu trysek vysunout a zasunout do reakčního prostoru fermentační nádoby. Tuto soustavu trysek je tak možno posunovat ve vertikálním směru, což umožňuje tuto soustavu, která je zásobována tlakovým plynem, • ·

-2posunout k zajištění lepšího míchání a vzdušnění. Pokud má ovšem fermentační proces probíhat za sterilních podmínek, je nezbytné, aby reakční prostor zůstal uzavřen. Tato soustava trysek pozůstává z trubek zasahujících vertikálně do fermentační nádoby, které jsou na spodním konci opatřeny tryskami. Tímto způsobem je možno zavádět tlakový plyn, případně kapalnou bioreaktivní látku do blízkosti dna fermentační nádoby. Soustava trysek je také vhodná pro průnik do zrnitých pevných látek nacházejících se ve fermentačním roztoku. Vertikální trubky mohou mít různou délku a jsou vyměnitelné. Dále může být soustava trysek po vyjmutí z fermentační nádoby jednoduše čištěna.

Kromě toho je možno použít druhou, vodorovnou soustavu trysek pozůstávající ze vzájemně propojených trubek, procházejících horizontálně a současně vzájemně rovnoběžně reakčním prostorem. Tyto trubky mají na povrchu svého pláště rozmístěny trysky.

Horizontální soustavy trysek může být použito dodatečně k vertikální soustavě trysek pro míchání.

Pokud má horizontální soustava trysek rotovat kvůli lepšímu míchám fermentované látky, musí být vertikální soustava trysek vysunuta směrem nahoru, nebo musí být vertikální trubky zvoleny tak, aby nebránily rotaci horizontální soustavy trysek, tzn. „normální“ trubky musejí být nahrazeny kratšími trubkami.

Výhodné další uspořádání bioreaktoru podle vynálezu se vyznačuje měřícím zařízením, ve kterém se v jediné měřící komoře nalézá například několik měřících elektrod k měření media odebraného z fermentační nádoby. Měřící komora je s fermentační nádobou spojena přívodním potrubím k přívodu měřeného media z fermentační nádoby do měřící komory.

K odvodu media po měření zpět do fermentační nádoby je měřící komora spojena s fermentační nádobou odvodním potrubím. Zvláštností tohoto uspořádání je to, že měřící komoře je předřazena tlaková komora, ve které je možno nabudovat definovaný tlak, který odpovídá vytlačenému objemu v měřící komoře. Zpětný odvod měřeného media nastává podle vynálezu tím, že do měřící komory se vhání tlak, takže medium je vytlačeno zpět do fermentační nádoby.

U známých bioreaktorů se měření provádějí obvykle přímo ve fermentační nádobě. Protože fermentační nádoba obsahuje pevné substráty, dochází často k poškození měřících elektrod. Při externím měření je u známých bioreaktorů měřené medium dopravováno do měřící komory peristaltickými pumpami. Tyto pumpy podléhají vysokému opotřebení a jsou nevhodné k přepravě větších objemů.

Při tlakové přepravě mediapodle vynálezu mohou odpadnout takové pumpy, které podléhají opotřebení a jsou tedy náročné na údržbu. Dále je možno přepravovat velké objemy. Další výhodou tlakové přepravy je, že neovlivňuje sterilitu. To znamená, že při pumpování se do fermentační nádoby nedostanou žádné cizí látky.

Přívod media do měřící komory přívodním potrubím může být zprostředkován podtlakem. Měřící komora podle vynálezu může být dále použita jako cirkulační systém. S takovým cirkulačním systémem může probíhat přídatné vzdušnění substrátů, nacházejících se ve fermentační nádobě.

Další výhodná uspořádání bioreaktoru jsou uvedena v níže uvedených nárocích.

V postupu podle vynálezu se při fermentaci pevných látek míchá medium obsahující tyto pevné látky tlakovým plynem přiváděným shora do reakčního media. V důsledku tohoto míchám se drasticky zvýší fermentační rychlost. Ve smyslu tohoto vynálezu značí „přivádět shora do reakčního media“, že tlakový plyn je přiváděn do reakčního media prostřednictvím vhodného zařízení (trubky opatřené tryskami), které zasahuje shora do reakčního media.

• ·

Délka trubek může být přitom zvolena tak, že za uvedeného pracovního režimu (tj. s nebo bez přiváděného tlakového plynu) dosahují do libovolné výšky pod povrch reakčního media. Vynález bude níže blíže popsán pomocí vyobrazení a příkladů provedení. Přitom ukazuje obr. 1 bioreaktor s tlakovou nádobou pro bioreaktivní látky a pro tlakový vzduch, obr. 2 čelní pohled na bioreaktor, obr. 3 boční pohled na bioreaktor, obr. 4 průřez fermentační nádobou bioreaktoru, obr. 5 řez podél linie V-V na obr. 4, obr. 6 uspořádání míchání media a přívodu tlakového vzduchu pro bioreaktor, obr. 7 schematický pohled na měřící zařízení spojené s fermentační nádobou a obr. 8 průběh reakce fermentačního postupu popsaného v příkladu 1.

Bioreaktor pro fermentaci pevných látek a k provádění fermentačního postupu blíže popsaného v dalším textu, uvedený na obr. 1, se vyznačuje fermentační nádobou 2, která je hermeticky uzavíratelná tlakovým víkem 8.

Fermentační nádoba 2 je opatřena alespoň jednou soustavou trysek K), 20 zasahující do reaktorového prostoru 49, která je zásobována tlakovým vzduchem 48 přes tlakovou nádobu 44, přes tlakové potrubí pro vedení plynu 3 pro vertikální soustavu trysek 10, příp. přes tlakové potrubí pro vedení plynu 4 pro horizontální soustavu trysek 20.

Tlaková nádoba 44 obsahuje kromě toho bioreaktivní kapalnou látku 50, která může být přiváděna přes škrticí ventil 7 a tlakové vedení 5 do horizontální soustavy trysek 20 a/nebo přes tlakové vedení 9 do vertikální soustavy trysek 10.

Vertikální soustava trysek 10 a/nebo horizontální soustava trysek 20 může být tímto způsobem použita také jako zařízení pro přidávání bioreaktivní látky alternativně k zásobování tlakovým plynem.

Na dně tlakové nádoby 44 se nachází odváděči vedení 11 se škrticím ventilem 12. Na horním konci tlakové nádoby 44 je umístěno přívodní vedení 13 pro přívod bioreaktivní ch látek 50 a škrticí ventil 15.

Tlakový plyn 48, např. tlakový vzduch, je přiváděn přes přívodní potrubí 17 a škrticí ventil 18.

Po straně pod tlakovou nádobou 44 je umístěn vodoznak 19.

Fermentační nádoba 2 se vyznačuje dále zařízením na vyrovnávání tlaku 21 se škrticím ventilem. Na dně fermentační nádoby 2 se nachází pod konickou částí dna 32 odtokový žlab 36 (obr. 2), který je zakryt pletivem 38, takže kapalina nacházející se ve fermentační nádobě 2 je před odtokem odtokovým žlabem 36 nahrubo filtrována. Dno odtokového žlabu 36 probíhá šikmo k vodorovné rovině, přičemž na čelní straně 51 fermentační nádoby se v nej nižším bodě odtokového žlabu 36 nachází výpustní ventil 40.

Na čelní straně 51 fermentační nádoby 2 se nachází odnímatelný poklop 53, umožňující čistit vnitřní prostor a pletivo 38 bez nutnosti otevírat víko 8 uzavírající reaktorový prostor 49. Na odtokovém žlabu 36 jsou proti sobě umístěna dvě okénka 41, která umožňují stanovení optické hustoty fermentované látky optickým senzorem (obr. 3). Další okénka 62,64 umístěná na bočních stěnách, která však nejsou obligatorní, umožňují visuální kontrolu fermentačních podmínek.

-4Namísto nebo kromě externí měřící komory 72 popsané dále může být na boku fermentační nádoby 2 umístěno uzavíratelné zařízení 66 pro řídící technické elektrody (např. pH, parciální tlak O2, vodivost, iontová specifita, atd.) jakož i zařízení na vyrovnávání tlaku 21 pro kontrolované odpouštění vzduchu nebo plynů vznikajících během fermentace z fermentační nádoby 2.

Všechny součásti přicházející do styku s mediem nebo plyny je možno nezávisle na sobě autoklávovat.

Bioreaktor podle vynálezu může být dále opatřen zařízeními na výměnu tepla, tj. zahřívání a chlazení. K tomu účelu může mít fermentační nádoba 2 dvojité stěny, přičemž vzniká prázdný prostor 51a. Ten je vytvořen mezi vnitřní a vnější stěnou nádoby 2. Prázdný prostor 51a je spojen přes přípojné potrubí 51b a odvodní potrubí 51c např. s příslušně temperovaným zásobníkem na teplosměnnou kapalinu (např. zásobníkem na vodu nebo olej). Voda nebo olej, který se vyznačuje definovanou teplotou zajištěnou externím termostatem, obtéká nádobu 2. Pomocí tohoto zařízení může být bioreaktor provozován ve stupňovitě nastaveném teplotním rozmezí od 10 do 90 °C, čímž je možno zaprvé v bioreaktoru nastavit teplotu optimální pro různé mikroorganismy a zadruhé celý bioreaktor včetně obsahu šetrným, způsobem sterilizovat resp. tyndalizovat. Taková sterilizace/tyndalizace celého bioreaktoru v integrovaném systému, který jako takový nebyl dosud popsán, nabízí proto podstatné výhody při použití systému.

Jak je zřejmé z obr. 2 a 3, fermentační nádoba 2 je podepírána podstavcem 6. Podstavec 6 zahrnuje také dvě vřetena 22, jejichž pomocí je možno z fermentační nádoby 2 odejmout nebo na ni nasadit tlakové víko 8. Tlakové víko 8 tvoří současně vertikální soustavu trysek přičemž dochází k přísunu tlakového plynu nebo bioreaktivních látek přes tlakové víko 8 do vertikálních trubek 14 vyčnívajících z tlakového víka 8. Vertikální trubky 14 mohou být různě dlouhé, přičemž se při zavřeném tlakovém víku 8 špičky trubek 14 s tryskami 16 nacházejí v oblasti dna fermentační nádoby. Při spouštění tlakového víka mohou trysky 16 pronikat také pevnými látkami v reaktorovém prostoru. Při uzavřeném tlakovém víku může být fermentační nádoba 2 hermetiky uzavřena.

Vřetena 22 jsou uváděna v činnost ručními klikami umístěnými na horní straně postavce 6.

Dutá tlaková deska 8 slouží jako tlakové víko bioreaktoru f a je jednou ze dvou možností, jak provzdušňovat prostor bioreaktoru ve fermentační nádobě 2 a nebo jej zásobovat mediem. Může být vertikálně vedena kolejnicemi a za provozu hermeticky uzavírá fermentační nádobu

2. Jestliže má být bioreaktor ý zásoben přeměňovaným substrátem, je možno tlakové víko 8 vysunout nahoru vedle shora popsaného mechanického způsobu také hydraulicky nebo pneumaticky.

Tlakové víko 8 má na horní straně ručně nebo elektronicky ovladatelnou přípojku pro dodávku tlakového vzduchu (nebo definovaných plynů). Přípojku je možno podle potřeby použít také pro dodávku kapalných definovaných medií, např. nutných kosubstrátů, vitaminů, minerálních látek, pufrů nebo antibiotik. Ve tlakovém víku 8 naráží vzduch nejprve na přepážku 45. Na spodní straně tlakového víka 8 jsou do závitů přišroubována vyměnitelné trubky 14 s tryskami 16. Jestliže se v tlakovém víku 8 nabuduje tlak, vzduch proudí kontinuálně tryskami 16 nacházejícími se na vrcholech trubek 14 do reaktorového prostoru 49 fermentační nádoby 2 a tím jej rovnoměrně provzdušňuje. Kromě mírného míchání reaktorového prostoru kontinuálním proudem vzduchuje možno v případě potřeby dosáhnout podstatného promíchání reaktorového prostoru za použití silných tlakových pulsů v definovaných intervalech.

-5Různá délka vyměnitelných trubek 14 zašroubovaných do tlakového víka 8 umožňuje cíleně provzdušňovat reaktorový prostor 49. Tryskami 16, sahajícími až ke dnu fermentační nádoby 2 je možno zajistit homogenní, aerobní reakční prostor. Pokud je použito kratších trysek, vytvoří se definovaný prostor s nízkým parciálním tlakem kyslíku. Bioreaktor ý je možno provozovat buď bez vzdušnění (v tomto případě jsou závity na tlakovém víku zakryty záslepkami), nebo obligátně anaerobně dodáním definovaných plynů neobsahujících kyslík.

V tomto případě by měla být případně přidávaná media před dodáním odplyněna.

Podle potřeby lze také těmito tryskami 16 dodávat do bioreaktoru J. kapalná media z tlakové nebo směšovací nádoby 44,46. Pokud je to žádoucí, je možno provádět vzdušnění v tomto případě prostřednictvím soustavy trysek 20 procházejících reaktorovým prostorem 49.

Obr. 4 a 5 ukazují horizontální soustavu trysek 20 nacházející se ve fermentační nádobě 2, jimiž může být rovněž vpouštěn tlakový vzduch 48 nebo kapalná bioreaktivní látka 50. Jak je zřejmé z obr. 5, horizontální soustava trysek 20 může být vložena jednostranně do čelní stěny nebo oboustranně do čelních stěn fermentační nádoby 2. Dále je možno předpokládat, že horizontální soustava trysek může být upevněna na čelní stěnu v různých výškách.

Jak ukazuje obr. 5, skládá se horizontální soustava trysek 20 ze tří trubek 24, které horizontálně a vzájemně rovnoběžně probíhají fermentační nádobou 2 a každá z nich obsahuje množství otvorů trysek 28. Tyto tři trubky 24 jsou vzájemně spojeny přes vstupní rozvětvení 20a a výstupní rozvětvení 20b.

Jak ukazuje obr. 5, horizontální soustava trysek 20 může být otáčena kolem horizontální osy otáčení tak, aby bylo navíc dosaženo dobrého míchání obsahu nádoby. Při rotaci horizontální soustavy trysek 20 je nutno zvolit délku trubky 14 vertikální soustavy trysek 10 tak, aby nedošlo ke kolizi mezi trubkami 14 a trubkami 24. Alternativně - jestliže není nutná sterilita fermentačního postupu, je možno vysunout vertikální soustavu trysek tak dalece nahoru, že nemůže dojít ke kolizi mezi trubkami 14 a 24. Pro zachování sterilních podmínek je nutno umístit otočnou horizontální soustavu trysek 20 přednostně na nejnižší místo ve fermentační nádobě 2. Trubky 14 jsou pak s výhodou zkráceny tak, aby právě nečněly do prostoru otáčení. Vnější trubky 14 sousedící s bočními okraji fermentační nádoby 2 jsou tak delší než trubky nacházející se dále uvnitř.

Výstupní rozvětvení 20b je opatřeno ventilem k uzavření výstupu nebo k použití jako vstupního rozvětvení, přičemž materiál přiváděný do trubky 24 musí zcela prostupovat otvory trysek 28. Výstupní rozvětvení 20b může také zcela odpadnout. Toto ovšem vyžaduje stabilnější konstrukci soustavy trysek 20.

Soustava trysek 20 může být použita také k vyhřívání/chlazení tak, že trysky 28 jsou uzavřeny, nebo soustava trysek 20 je nahrazena odpovídající soustavou trubek bez trysek. Přitom slouží vstupní rozvětvení 20a jako přívod vyhřívací/chladicí kapaliny a výstupní rozvětvení 20b jako její odvod. Taková soustava trysek 20 konstruovaná jako chladicí soustava může být rovněž otočná. Dále je možno použít několik soustav trysek/chladicích trubek, takže v nádobě 2 může být umístěna současně např. otočná horizontální soustava trysek a otočná horizontální chladicí soustava.

Je samozřejmě možné, zásobit vertikální soustavu trysek 10 tlakovým plynem 48 a horizontální soustavu trysek 20 bioreaktivní látkou 50 a naopak.

Druhá soustava trysek 20 probíhá horizontálně reaktorovým prostorem 49. Může být nasazena v různých výškách a je uložena otočně podle své osy. Tato soustava trysek se používá k zásobení bioreaktoru kapalnými definovanými medii, např. vodou, potřebnými kosubstráty, vitaminy, minerálními látkami, pufiy nebo antibiotiky, může být ale dle potřeby použita pro vzdušnění a míchání bioreaktoru χ. Při fermentaci kapalných nebo ve vodě rozpustných látek

-6se může horizontální soustava trysek otáčet pomocí motoru nacházejícího se na vnější straně bioreaktoru 1 a může tak přispívat k důkladnému míchání obsahu bioreaktoru. V tomto případě jsou použity krátké vertikální trubky 14 a horizontální soustava trysek 20 je nasazena ve svém nej spodnějším nastavení.

Promíchávání obsahu bioreaktoru při fermentaci pevných látek a zásobení bioreaktoru 1. vzdušným kyslíkem nebo definovanými plyny jakož i mediem se provádí pneumaticky tlakovým vzduchem. Přes tlakovou nádobu 44, která je v tomto případě použita také jako zásobník na medium, se vzduch dostává do tlakového víka 8 a odtud do vertikálních resp. v případě potřeby do horizontálních trysek 16,28. Mezi tlakovou nádobou 44 a tlakovým víkem 8 se nachází škrticí ventil 26. Pokud je škrticí ventil 26 uzavřen a škrticí ventil 7 na dně tlakové nádoby 44 otevřen, vytlačuje se medium tlakovým vzduchem přes horizontální a v případě potřeby také přes vertikální soustavu trysek 10,20 do bioreaktoru T

Obr. 6 ukazuje příklad provedení, při němž je na místě tlakové nádoby 44 na bioreaktor j. připevněna směšovací nádoba 46. Se směšovací nádobou 46 je spojeno několik tlakových nádob 52,54,56,58,60, které obsahují různé kapalné bioreaktivní látky a tlakový plyn, např. tlakový vzduch. Tyto různé látky mohou být přiváděny do směšovací nádoby 46 a zde míšeny v žádaném poměru. Přes vedení tlakového vzduchu 17 a škrticí ventil 18 se tlakový vzduch dostává do rozdělovacího zařízení 23, které rozděluje tlakový vzduch 48 do všech připojených tlakových nádob 52,54,56,58 a 60 a do směšovací nádoby 46. Vedení tlakového vzduchu 25 pro jednotlivé tlakové nádoby jsou také opatřena škrticími ventily 26.

Z rozdělovacího zařízení 23 se odvětvuje také vedení tlakového vzduchu 3 do fermentační nádoby 2.

Aby bylo možno přivádět cíleně různá media do popisovaného bioreaktoru 1, bude využito pneumatického systému z tlakových nádob 52,54,56,58,60 o různých objemech. Obr. 6 ukazuje použití spětí výměnnými a odděleně autoklávovatelnými tlakovýmih nádobami (např. pro medium, dva pufry, roztok stopových prvků a roztok antibiotika), u nichž kalibrované vodoznaky 19 ukazují stupně naplnění tlakových nádob 52,54,56,58,60. Tlakový vzduch prochází přes rozdělovači zařízení 23 do pneumatického systému. Jeden díl může být v případě potřeby vzdušnění bioreaktoru J. veden přímo do vertikální a/nebo horizontální soustavy trysek 10,20. Tlakové nádoby, které jsou regulovatelné nezávisle jedna na druhé, jsou spojeny s rozdělovacím zařízením 23. Media z jednotlivých tlakových nádob jsou vedena do směšovací nádoby 46. Pokud je směšovací nádoba naplněna různými medii, tlakové vyrovnávací zařízení 47 umožní vyrovnání tlaku a vpustí např. tlakový vzduch na dno tlakové nádoby přes další vedení tlakového plynu 34 rozdělovacího zařízení 23. To způsobí promíchání různých roztoků. Jestliže je proces míchání ukončen, směšovací nádoba 46 je natlakována tlakovým vzduchem a žádané medium je vedeno do horizontální a/nebo vertikální soustavy trysek 10,20.

Každá tlaková nádoba může být opatřena vodoznakem 19. Přívodní vedení 29 pro bioreaktivní látky z tlakových nádob jsou opatřena škrticími ventily 30.

Před rozdělovacím zařízením 23 se dále odvětvuje vedení pro tlakový plyn 34, které je vybaveno škrticím ventilem 35, přičemž vedení tlakového plynu 34 vede k výpustnímu vedení 37 na dne směšovací nádoby tak, aby přivádělo např. tlakový vzduch pro proces promíchávání. Výpustní vedení je opatřeno škrticím ventilem 39. Z výpustního vedení 37 se odvětvuje přívodní vedení 42 se škrticím ventilem 43, přes které je možno přivádět smíchané bioreaktivní látky 50 do bioreaktoru L

Směšovací nádoba 46 je dále opatřena zařízením pro vyrovnávání tlaku 47 pro vyrovnávání tlaku během promíchávání.

-7Tlakový plyn může být přiveden do vertikální a/nebo horizontální soustavy trysek 10,20 také ve formě pulsů.

S fermentační nádobou 2 je spojeno měřící zařízení 70. Měřící zařízení 70 je vybaveno měřící komorou 72, která je spojena s fermentační nádobou 2 přes přívodní vedení 74. Přívodním vedením 74 protéká z fermentační nádoby 2 měřené medium do měřící komory 72. K zajištění směru toku z fermentační nádoby 2 do měřící komory 72 nezávisle na podmínkách v měřící komoře 72 je přívodní vedení 74 opatřeno zpětným ventilem 76.

V měřící komoře 72 je několik měřících elektrod, které jsou spojeny přes vedení 80 s měřícím zařízením 82, které je s výhodou počítačově řízeno. Měřicí elektrody 78 mohou provádět měření např. pH, kyslíku, teploty a iontů.

V nejnižším bodě v zásadě kosočtverečné měřící komory 72 je ke komoře 72 připojeno zpětné vedení 84. Přes zpětné vedení 84 je měřené medium vedeno zpět do fermentační nádoby 2.

Ke zpětnému vedení media do fermentační nádoby 2 se do měřící komory 72 vpouští tlak.

K tomu je měřící komora 72 opatřena tlakovou komorou 86. Tlaková komora 86 je spojena se zdrojem tlakového vzduchu přes vedení 88, 90. Pro vytvoření přetlaku v tlakové komoře 86 se otevře ventil 92 a zavře se ventil 94, takže tlakový vzduch proudí ve směru šipky 96 do tlakové komory 86.

Aby se medium z měřící komory 72 vedlo zpět do fermentační nádoby 2 přes zpětné vedení 84, ventil 92 se uzavře a ventil 94 se otevře. Tím proudí tlakový vzduch z tlakové komory 86 ve směru šipky 98 vedením 100 spojeným s měřící komorou 72 do měřící komory 72 a vytváří zde přetlak. Definovaný přetlak v tlakové komoře 86 je přímo úměrný objemu vypuzované kapaliny v měřící komoře 72. Z důvodu přetlaku vznikajícího v měřící komoře 72 se uzavře zpětný ventil 76 ve zpětném vedení 74 a medium nacházející se v měřící komoře 72 je vytlačeno zpětným vedením 84 do fermentační nádoby 2. Aby se docílilo rovnoměrného rozdělení tlaku vzduchu v měřící komoře a zabránilo se víření, jev měřící komoře 72 v oblasti vstupu tlakového vzduchu zabudována nárazová přepážka 102.

Jakmile je medium dopraveno zpět z měřící komory 72 do fermentační nádoby 2, uzavře se opět ventil 94 a otevře se ventil 92. Tím se znovu nabuduje přetlak v tlakové komoře 86. Jakmile se uzavře ventil 94, dojde v měřící komoře 72 k vyrovnání tlaku, takže zpětný ventil 76 je znovu otevřen mediem proudícím z fermentační nádoby 2. U ventilu 76 se dále může jednat o stavitelný ventil, aby bylo možno např. řídit množství media k měření, které vstupuje do měřící komory 72.

Vynález se týká také postupu pro aerobní fermentaci pevných látek, přičemž medium obsahující pevné látky se promíchává tlakovým plynem 48 přiváděným shora do reakčního media. Toto nastává podle vynálezu tím, že tlakový plyn se vede přímo do reakčního media prostřednictvím vhodných zařízení (jako např. vertikální soustava trysek 10 popsaná výše), takže šířící se plynové bubliny zajišťují promíchávání. Protože se při aerobních fermentacích používá přednostně tlakový plyn bohatý na kyslík (např. vzduch, vzduch obohacený O₂ nebo O₂), dochází při tomto postupu také ke zvýšení obsahu kyslíku v reakčním mediu, což obvykle podstatně urychluje fermentaci. Přivádění tlakového plynu může nastávat kontinuálně (v dalším je označováno jako „vzdušném“) nebo prostřednictvím pulsů (v dalším je označováno jako „promíchávání|.

„Pevné látky“ ve smyslu postupu podle vynálezu jsou přitom přednostně uhlí, dřevo a znečištěné zeminy. Postup podle vynálezu je zvláště vhodný pro fermentaci uhlí, zvláště hnědého uhlí. To pozůstává ze tří faktorů definovaných na základě své rozdílné rozpustnosti v závislosti na hodnotě pH:

1. Huminové kyseliny, které lze extrahovat 0,1 N roztokem NaOH;

-82. Fulvokyseliny, které se rozpouštějí také v kyselém prostředí;

3. Nerozpustný zbytek, který se označuje jako matrix.

Ke zkapalnění hnědého uhlí se výchozí produkt, který může být případně předběžně upraven nebo pre-oxidován, v rozemletém stavu (velikost částic s výhodou 0,1 mm až 2 cm, ještě výhodněji 1 až 10 mm) smíchá s množstvím rozpouštědla (tj. vody nebo rozpouštědlových systémů na bázi vody) dostatečným pro zkapalňování, živinami, pufrem (včetně pufrovacích látek, kyselin, zásad) a kulturou mikroorganismů a po promíchání tlakovým plynem obsahujícím kyslík se kultivuje.

Vhodnými mikroorganismy pro zkapalňování hnědého uhlí jsou přitom plísně, houby působící bílou hnilobu dřeva a kvasinky. Preferovaným mikroorganismem k tomuto účelu je Trichoderma atroviride. Živiny používané pro tento způsob fermentace se silně řídí druhem používaného mikroorganismu. Přitom je přednostně využíváno zvláště přidávání zdrojů uhlíku na počátku reakce k mikroorganismu zkapalňujícímu hnědé uhlí tak, aby se zaručila růstová výhoda.

Používají se pufrační látky, které zaručují udržení žádané hodnoty pH v každém daném bodě reakční doby. Na počátku reakce, kdy je preferovaná hodnota pH 5,5 až 6,0, jakož i v zkapalňovací fázi, kdy je přednostní pH 6,5 až 7,2, se tak používá s výhodou citrát fosfátový pufr o pH 3, protože houba při růstu sama alkalizuje medium a je nutno použít pouze proti-titraci. Zvláště výhodné je nastavit pH 5,5 na začátku pokusu. Fermentace probíhá přednostně při teplotě 15 až 35 °C.

Při preferovaném provedení se hnědé uhlí, směs hnědého uhlí/rozpouštědlo nebo směs hnědé uhlí/rozpouštědlo/živná směs sterilizuje příp. tyndalizuje před přidáním fermentujících mikroorganismů. To se děje s výhodou v několika cyklech nejméně 45-minutového zahřívání na teploty nad 75 °C, s výhodou nad 80 °C, a následného několikahodinového ochlazování na teplotu místnosti.

Při krocích na 80 °C jsou usmrceny fyziologicky aktivní mikroorganismy v substrátu, mediu a reaktorovém prostoru, ne však klidové spory. Během časů při mírných teplotách spory vyklíčí a jsou usmrceny při následujícím kroku při vysoké teplotě.

Konvenční tyndalizací rozumíme trojí zahřívání kapaliny nebo živného media. V intervalech mezi zahřívacími kroky je materiál uchováván při teplotě místnosti (Eckhard Bašt, 1999, Mikrobiologische Methoden: eine Einfuhrung in grundliegende Arbeitsetchniken Heidelberg, Berlin; Spektrum, Akad. Verl. ISBN 3-8274-0786-9).

Mikrobiálně zkapalněné uhlí získané podle uvedeného postupu může být použito jako zdroj uhlíku a energie pro bakterie, které jsou schopny produkovat z chemicky heterogenní látky jako je např. uhlí chemicky charakterizovanou látku jako např. polyhydroxymastné kyseliny pro syntézu biologicky odbouratelných umělých hmot (A. Steinbuchel a B. Fúchtenbusch, Proceedings ICCS 97,1673 - 1676 (1997)). Alifatický, mikrobiálně nezkapalnitelný zbytek, který se vyznačuje nízkým obsahem vody a popelovin a tím i vysokou specifickou hodnotou spalování, může být využit jednak pro přímé termické užití (R. Kópsel et al., Freiberger Forschungshefte, 159- 166 (1998)), jednak pro další následné fermentační postupy využívající kvasinek odbourávajících alifatické látky (U. Hólker et al., Proceedings of the 16th SMYTÉ, Slovensko, str. 16 (1998; Folia Microbiol. 44, 226-227 (1999)).

Zvláště výhodný je postup podle vynálezu, prováděný v bioreaktoru popsaném výše.

Vynález bude blíže popsán pomocí následujících příkladů.

-9« · ·· ·· • · · · • · ♦ • « · • · · • · · · · ·

Příklady

Celkový postup

Produkt „zkapalněné uhlí“ byl definován jako supernatant ve vzorku získaný po 20 min. centrifugaci při 10 000 g. Stupeň zkapalnění byl stanoven pomocí optické hustoty při 450 nm nebo pomocí suché váhy supematantu. Aby se sloučeniny typu huminových kyselin oddělily od fulvokyselinových sloučenin, byl supernatant okyselen na pH 1,5 a znovu centrifugován. Zkapalněné produkty byly charakterizovány pokud jde o jejich optickou hustotu, obsah huminových kyselin a fulvokyselin a bakteriální kontaminaci na základě inkubace vzorků v komplexních mediích a následné mikroskopické analýzy.

Příklad 1: Fermentace hnědého uhlí

Bioreaktor podle vynálezu, jak je uveden na obr. 1 až 6, s vertikální soustavou trysek (10), tlakovým víkem (8) s trubkami (14) sahajícími až ke dnu reaktorového prostoru (49) s tryskami (16) a tuhou horizontální soustavou trysek (20); objem 25 1| byl naplněn 2500 g hnědého uhlí (Bergheim Lithotyp A, velikost částic 2-10 mm, obsah vody v uhlí přibližně 50 %) jako přeměňovanou pevnou látkou v 10 1 vody. Trichoderma atroviride byla použita jako uhlí zkapalňující aerobní houba (U. Hólker et al., Fuel Processing Technol., (1997)). Bylo přidáno 50 g glutamátu k indukci uhlí zkapalňujících enzymů (U. Hólker et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, (1995)). Počáteční hodnota pH byla 5,8, aby byla houbě poskytnuta růstová výhoda proti bakteriím vyskytujícím se v uhlí. Kontinuální tlak vzduchu postačující ke vzdušnění byl 0,4 bar. Tlak vzduchu byl denně pomocí vertikální soustavy trysek zvyšován po 10 s na 3 bar, aby se promíchal obsah reaktoru.

V semikontinuálním provedení bylo v intervalech 24 hodin pomocí horizontální soustavy trysek (20) přidáno 800 ml vody a stejné množství obsahu reaktoru bylo odebráno z odtokového systému. V této suspenzi byla stanovena optická hustota, hodnota pH, obsah huminových kyselin a fulvokyselin a byla testována bakteriální kontaminace. Když hodnota pH dosáhla 7,3, byla zpětně titrována na 7,0 pomocí systému přítoku media (Obr. 8, šipky j. £>·

Výtěžek zkapalněného uhlí dosažený v tomto fermentačním pochodu byl 3 mg suché váhy na ml suspenze při pH 7 za den a měl být udržován konstantní po dobu 30 dnů. To odpovídalo plánovanému výtěžku kolem 2 g zkapalněných produktů za den. Při zvýšení nad 3,3 mg suché váhy na ml byl obsah reaktoru zředěn přidáním vody přes systém přítoku media a znova nastaven na žádanou koncentraci (Obr. 8, šipky 6 - 10).

Po 12-denní době fermentace byla dosažena žádaná koncentrace zkapalněného uhlí a v období dalších 28 dnů bylo v navrhovaném bioreaktoru vyprodukováno 71 g zkapalněných produktů. Příklad 2: Postup pro šetrnou sterilizaci bioreaktoru včetně obsahu; modifikovaná tyndalizace

Bioreaktor podle vynálezu (jak uvedeno na obr. 1 až 6, se zasunutelnou vertikální soustavou trysek (10) s krátkými trubkami (14), zařízeními na výměnu tepla (51a, 51b, 51c) ve vnější stěně otočnou horizontální soustavou trysek (20) a měřícím zařízením (70); objem 12,5 1) byl naplněn přesně tak, jak je uvedeno v příkladu 1. Tlakové víko (8) bylo uzavřeno a trysky (16) tím byly pneumaticky vtlačeny do substrátu. Pneumatický cirkulační a měřicí systém byl aktivován a v minutových intervalech mylo medium zpětně pumpováno kolem teplotního sensoru měřící komory a přes horizontální soustavu trysek (20) zpět do bioreaktoru. Voda byla v termostatech zahřáta na 95 °C a pumpována pláštěm bioreaktoru (51a, 51b, 51c), až teplota ve vnitřním prostoru dosáhla 80 °C. Tato teplota byla udržována 45 min (za stálého vzdušnění/míchání pomocí vertikální soustavy trysek (10) a cirkulace media pomocí

-10·· ··*· · · • · · • · · • ♦ « · • · · · • · · • · « · β · horizontální soustavy trysek (20)). Následně byl bioreaktor ochlazen na 25 °C temperovanou vodou v opláštění, přitom byl 12 hodin provzdušňován, míchán a promícháván. Následně byla teplota v prostoru bioreaktoru jako předtím nastavena po dobu 45 minut na 80 °C.

Následovalo nové ochlazení na 20 hodin na 25 °C, následované třetím zahřátím reaktorového prostoru na 80 °C na dobu 45 min.

Aby byl přezkoušen úspěch sterilizace, byl bioreaktor následně opět míchán, vzdušněn a promíchán. Denně (7 dní) byly odebírány 1-ml vzorky a byly jimi zaočkovány Petriho misky (1,2 % agar) a 50-ml tekuté kultury, které obsahovaly živné medium použité v bioreaktoru. Petriho misky byly inkubovány 72 hodin při 25 °C, tekuté kultury na třepačce při 25 °C a 120 ky vech/min. Ukázalo se, že zy těchto podmínek v reaktorovém prostoru nebyly detegovány žádné kontaminace.

Poté, co byla provedena kontrola sterility, byl bioreaktor zaočkován houbou T. atroviride zkapalňující uhlí a uhlí bylo fermentováno analogicky k příkladu 1 avšak při teplotě nastavené na 25 °C. Bylo získáno 60 g zkapalněného produktu.

*.·**··* *·· ···· Pť&&/'///

Claims (25)

1. Patentové nároky

   1. Bioreaktor pro fermentaci pevných látek vyznačující se tím, že obsahuje fermentační nádobu (2), přidávací zařízení pro bioreaktivní látky a soustavu trysek ve fermentační nádobě (2) ke vzdušnění a promíchávání substrátu, přičemž alespoň jedna soustava trysek (10,20) je opatřena větším počtem trubek (14,24) zasahujících rovnoběžně do reakčního prostoru (49) fermentační nádoby (2) a opatřených tryskami (16,28) přičemž první soustava trysek (10), zasahující vertikálně je zasunovatelná a vysunovatelná do reakčního prostoru (49) fermentační nádoby (2), vyznačující se druhou horizontální soustavou trysek (20) z alespoň dvou navzájem spojených trubek (24) procházejících horizontálně a vzájemně rovnoběžně reakčním prostorem (49) a opatřených u obou větším počtem tryskových otvorů (28).
2. 2. Bioreaktor podle nároku 1 vyznačující se tím, že horizontální soustava trysek (20) je otočná kolem horizontální osy otáčení.
3. 3. Bioreaktor podle z nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že fermentační nádoba (2) obsahuje úsek dna (32), který se v příčném řezu zužuje.
4. 4. Bioreaktor podle nároku 3 vyznačující se tím, že konicky vytvořený úsek dna (32) ústí do odtokového žlabu (36) probíhajícího šikmo k vodorovné ose a opatřeného na nejnižším místě odtokovým ventilem (40).
5. 5. Bioreaktor podle jednoho nebo více nároků 1 až 4 vyznačující se tím, že alespoň jedna soustava trysek (10,20) obsahuje tlakový plyn (48) z tlakové nádoby (44,46).
6. 6. Bioreaktor podle nároku 5 vyznačující se tím, že v tlakové nádobě (44,46) je kromě tlakového plynu (48) obsažena kapalná bioreaktivní látka (50).
7. 7. Bioreaktor podle nároku 6 vyznačující se tím, že alespoň jedna soustava trysek (10,20) obsahuje alternativně tlakový vzduch (48) nebo kapalnou bioreaktivní látku (50) z tlakové nádoby (44,46).
8. 8. Bioreaktor podle jednoho nebo více nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že alespoň jednu soustavu trysek (10,20) je možno zásobovat pulsujícím tlakovým vzduchem (48).
9. 9. Bioreaktor podle jednoho nebo více nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že druhá soustava trysek (20) je umístěna výškově stavitelně ve fermentační nádobě (2).
10. 10. Bioreaktor podle nároku 6 vyznačující se tím, že obsahuje větší počet tlakových nádob (52,54,56,58,60) zásobených tlakovým vzduchem (48) a spojených se směšovací nádobou (46), které obsahují různé kapalné bioreaktivní látky.
11. 11. Bioreaktor podle nároku 10 vyznačující se tím, že směšovací nádoba (46) je opatřena zařízením na vyrovnávání tlaku (47).
12. 12. Bioreaktor podle nároku 10 nebo 11 vyznačující se tím, že tlakové nádoby (52,54,56,58,60) jsou vyměnitelné a nezávisle jedna na druhé autoklávovatelné.
13. 13. Bioreaktor podle jednoho nebo více nároků 4 až 12 vyznačující se tím, že odtokový žlab (36) je zakryt pletivem (38).
14. 14. Bioreaktor podle jednoho nebo více nároků 1 až 13 vyznačující se tím, že tlakové víko (8) fermentační nádoby (2) obsahuje první soustavu trysek (10), jejíž trubky (24) probíhají reakčním prostorem (49) vertikálně od tlakového víka (8).
15. 15. Bioreaktor podle nároku 14 vyznačující se tím, že vertikální trubky (14) první soustavy trysek (10) jsou v tlakovém víku (8) umístěny vyměnitelně.
16. 16. Bioreaktor podle jednoho nebo více nároků 1 až 15 vyznačující se tím, že fermentační nádoba (2) je přes přívodní potrubí (74) spojena s měřící komorou (72) a ta přes zpětné potrubí (84) s fermentační nádobou (2) a že do měřící komory (72) je možno vpustit tlak k zpětnému vedení měřeného media.
17. 17. Bioreaktor podle jednoho nebo více nároků 1 až 16 vyznačující se tím, že obsahuje zařízení k výměně tepla, zvláště pak se zařízením, (i) ve kterém je fermentační nádoba (2) dvoustěnná a takto vzniklý prázdný prostor (51a) je průtočný pro temperované teplosměnné kapaliny přes přítokovou trubku (51b) a odtokovou trubku (51c), a/nebo (ii) kteyé jé horizontálním trubkovým systémem (20) ve fermentační nádobě (2) a je průtočné pro temperované teplosměnné kapaliny.
18. 18. Postup pro aerobní fermentaci pevných látek, při němž reakční medium obsahující tyto pevné látky je promícháváno shora tlakovým plynem (48) zaváděným do media.
19. 19. Postup podle nároku 18, při němž promíchávání nastává kontinuálním proudem tlakového plynu nebo pulsy tlakového plynu.
20. 20. Postup podle nároků 18 nebo 19, při němž zvolené pevné látky jsou uhlí, dřevo a znečištěné zeminy.
21. 21. Postup podle nároku 20, při němž je pevnou látkou uhlí, zvláště hnědé uhlí.
22. 22. Postup podle nároku 21, při němž se do reakční směsi dále přidává mikroorganismus vhodný k fermentaci, živiny a/nebo pufry.
23. 23. Postup podle nároku 21, při němž hnědé uhlí nebo reakční medium obsahující hnědé uhlí je spolu s bioreaktorem před fermentaci nebo přidáním mikroorganismu tyndalizováno.
24. 24. Postup podle jednoho nebo více nároků 21 až 23, při němž (i) hnědé uhlí má velikost částic 1 až 10 mm;

    (ii) mikroorganismus je vybrán z plísní, kvasinek a hub bílé hniloby a zvláště Trichoderma atroviride·, (iii) pH reakčního media na počátku reakce je 5.5 až 6.0;

    (iv) pH během zkapalňovací fáze je udržováno na 6.5 až 7.2;

    (v) fermentace probíhá při teplotě 25 °C až 30 °C a/nebo (vi) do reakčního media se zavádí 1 až 25 1 tlakového vzduchu na 1 fermentační kapaliny na den.
25. 25. Postup podle jednoho nebo více nároků 18 až 24, při němž reakce probíhá v bioreaktoru (1) definovaném v nárocích 1 až 17.