CZ20021985A3 - Způsob konverze zásobních rezerv semen dvouděložných rostlin na směsi obsahující jeden nebo více genových produktů - Google Patents

Description

Způsob konverze zásobních rezerv semen dvouděložných rostlin na směsi obsahující jeden nebo více genových produktů

Oblast techniky

Předložený vynález se týká způsobu založeného na principu zdroje a spotřebiče pro konverzi rezerv uložených v semenech dvouděložných rostlin na směsi obsahující jeden nebo více genových produktů, o něž je zájem. Vynález také uvádí směs pocházející z klíčících semen, obsahující nejméně jeden genový produkt v děloze počítaje v to sazenici, nebo v prostředí obklopujícím klíčící semeno nebo sazenici.

Dosavadní stav techniky

Metody pro produkci terapeuticky aktivních savčích proteinů izolací a rafinací ze savčích zdrojů, byly v současné době, kvůli zvýšenému riziku kontaminace, v široké míře nahrazeny technologií rekombinantní DNA (genovým inženýrstvím) poskytující nové možnosti pro výrobu velikých množství průmyslově žádoucích savčích proteinů. Genové inženýrství poskytuje široký výběr hostitelských systémů a systémů pro expresi. Jsou-li žádanými cílovými proteiny proteiny savčí, jsou za účelem získání glykosylovaných forem žádaných proteinů preferovány eukaryotické hostitelské systémy.

Nejefektivnější hostitelský systém pro velkoobjemovou a nízkonákladovou výrobu glykosylovaných proteinů představují houby. I když houby byly úspěšné při produkci vysokých množství svých nativních proteinů, nebyly stejně tak úspěšné v exprimování heterologických proteinů, jako jsou terapeutické savčí proteiny.

Houby jsou v současné době užívány hlavně pro velkokapacitní produkci homologických průmyslových enzymů, zatímco pro produkci glykosylovaných heterologických proteinů se ohnisko výzkumného zájmu zaměřilo na vyhledání alternativních systémů exprese. Protože se glykosylační způsoby a postupy skladby v rostlinných hostitelských systémech podobají těm v savčích systémech, jsou z dostupných systémů rostlinné hostitelské expresivní systémy z hlediska nákladů zdaleka nejefektivnější. Hlavní zájem byl zaměřen na produkci farmaceuticky a průmyslově důležitých enzymů. Zmíněna může být produkce interferonu, enkefalinů, epidermálního růstového faktoru, albuminu lidského séra v tabáku a/nebo bramborách. Hladiny exprese u transgenních rostlin byly poměrně nízké.

Cizí geny jsou v rostlinách obvykle exprimovány ve vývojových orgánech rostlin pod silnými tkáňově specifickými promotory. Typickými příklady jsou promotor zásobních proteinů semen nebo pro hlízy specifický patatinový promotor v bramborových hlízách. Alternativně jsou používány buněčné nebo orgánové kultury anebo kultury z řas, stejně jako i sofistikovanější systémy, včetně systémů založených na rostlinných virech s požadovaným genem zapojeným uvnitř genomu viru a exprimovaným současně s proteiny viru. Nejpokročilejší systémy spoléhají na indukovatelnou expresi a sekreci rekombinantního proteinu do media.

Patenty US 5 693 506 a US 5 994 628 uvádějí produkční systém pro produkci cizích proteinů v klíčících semenech jednoděložných rostlin. Rekombinantní proteiny jsou exprimovány pod silným amylázovým promotorem v buněčné kultuře nebo v klíčícím semenu a protein je vylučován do živného media nebo extrahován ze sladu. V semeni jednoděložných rostlin sestávají zásobní rezervy převážně ze škrobovitého endospermu. Proteinové zásoby u jednoděložných rostlin se, ve srovnání s těmi v semenech dvouděložných rostlin, vyskytují v malém množství. Vedle toho, i když je exprese amylázy ve specifických buňkách vysoká, exprimuje amylázu v semeni pouze malý počet buněk. Tyto buňky jsou omezeny na skutelum zárodku a aleuronovou vrstvu endospermu. Existuje veliká poptávka po poskytnutí účinnějších systémů, které by využily zásobní rezervy proteinů a olejů v semenech dvouděložných rostlin. Patenty US 5 543 576 a US 5 714 474 popisují metodu, při níž jsou transgenní semena bez předklíčení a v mleté formě přidávána do živných směsí jako dodatečné zdroje enzymů.

Patent US 5 670 349 popisuje použití poraněním vyvolatelných HMGR/HMG2 promotorů pro expresi rekombinantních proteinů v čerstvých tabákových listech, sklizených z pole. Poranění čerstvého nebo skladovaného rostlinného materiálu naříznutím nebo drcením vyvolává rychlý vzrůst exprese. Avšak obsah proteinu v tabákovém listu je malý ve srovnání s tím, který lze získat ze semene dvouděložných rostlin. Navíc dále skladovatelnost čerstvých listů není se skladovatelností suchých semen srovnatelná co do doby, prostoru a/nebo nákladů na skladování. Používání čerstvého rostlinného materiálu, jako jsou listy sklizené z pole, je také hlavním zdrojem mikrobiální kontaminace, která je ve fermentační technologii vážným problémem.

• · « · · · ·· • 9 9 9 9 · · · ·· 9 9

9 9 9 9999 9

9 9 9 9 · 99 9 ·

Patentové přihlášky WO 94/11519 a WO 97/32986 zveřejňují metody a zařízení pro produkci degradačních a konversních produktů v rostlinách pomocí procesu sladování. Při těchto metodách se má za to, že enzymy jsou aktivní v glyoxysomech, které katalyzují rozštěpení mastných kyselin na acetylkoenzym A. Tento acetyl-CoA, který je normálně využíván na tvorbu organických kyselin, jež mohou být exportovány z glyoxysomú a použity v jiných metabolických pochodech jako je dýchání a syntéza sacharosy, by měl být nahrazen genem kódujícím enzymy na cestě vedoucí k polyhydroxyalkanoátům vhodným pro produkci biodegradabilních termoplastů.

I když postupy sladování jsou známy a byly použity zejména pro přípravu jednoděložných rostlin, je třeba poznamenat, že tyto pochody jsou omezeny na zpracovávání škrobu. Metody uvedené v patentech WO 94/11519 a WO 97/32986, i když navrhují využití zásobních rezerv u dvouděložných rostlin, jsou omezeny na aplikaci enzymů a cest, které řídí produkci sacharosy a energie, a jak využít tyto produkty z respiračních pochodů pro zpětnou syntézu.

I když je známo sladování a metody pro využití respiračních pochodů v rostlinách pro produkci polyhydroxyalkanoátů, využití zásobních rezerv u dvouděložných rostlin pro produkci proteinových produktů, jako strukturálních proteinů a enzymů, vyřešeno nebylo.

Je třeba konstatovat, že po proteinových produktech existuje veliká poptávka a vzhledem k tomu je hlavním úkolem předloženého vynálezu řešit problém konverze zásobních rezerv uložených v rostlinách na různé proteinové produkty, které mohou být dále použity pro produkci požadovaných produktů.

Hlavním úkolem předloženého vynálezu je poskytnout nový, proveditelnější, efektivnější, životnímu prostředí příznivý postup a produkční systém pro produkci genových produktů, speciálně proteinových genových produktů, v dělohách transgenních dvouděložných semen. Jinou výhodou předloženého vynálezu je, že poskytuje produkční systém pro uvážené využití, při němž genový produkt může být produkován v definovaných podmínkách a ne na poli. To umožňuje provádět předkládaný proces za podmínek téměř bez kontaminace.

Podstata vynálezu

Cíle předkládaného vynálezu jsou dosahovány využitím regulačních sekvencí přechodných proteinů, hromadících se během iniciace klíčení, pro produkci žádaných genových produktů.

Charakteristické znaky předkládaného vynálezu jsou vyloženy v patentových nárocích.

Podrobný popis vynálezu

Definice

Většina termínů použitých v předkládaném vynálezu má tentýž význam jako v oborech genového inženýrství, molekulární biologie a botaniky, zejména v oblastech vztahujících se na produkci transgenních rostlin a genových produktů. Některé termíny jsou však použity poněkud odlišným způsobem a jsou podrobněji vysvětlovány níže.

Termín semenné rostliny znamená Spermatophyta, rostliny nejvyššího vývojového stupně, charakterizované komplexními strukturami včetně zcela vyvinutých orgánů jako kořenů, lodyh, listů, květů a vaskulárního systému. Semenné rostliny se dělí na dvě třídy, krytosemenné (Angiospermae) a nahosemenné (Gymnospermae). Krytosemenné jsou dále děleny na podtřídy, tj. jednoděložné a dvouděložné. Embryo zralého semene jednoděložných rostlin obsahuje pouze jednu dělohu, která je redukována na absorptivní štítek (scutellum). U dvouděložných rostlin má embryo dvě dělohy, které slouží jako zásobní orgány. Asimiláty, potřebné pro uložení zásob v dělohách dvouděložných rostlin, jsou z mateřské rostliny vaskulárním systémem přemísťovány do slupky semene a nakonec do dělohy. Slupka semene je mateřskou tkání a nejsou tu symplastická spojení na embryo. Asimiláty procházejí apoplasmickým prostorem a potom jsou zachyceny embryem, symplasticky redistribuovány a využity pro syntézu reserv.

Termín dvouděložné semeno znamená semeno, které lze získat z dvouděložných rostlin, a které obsahuje v dělohách mnohostrannou zásobní reservu počítaje v to proteiny, lipidy a sacharidy, na rozdíl od zásobních reserv semen jednoděložných rostlin, které jsou tvořeny hlavně ze sacharidů a jen malých množství dalších sloučenin. V předkládaném vynálezu je dvouděložným semenem • · · · ♦ · · « • 4··· 4 4444 4 4

44 444 44 4·4 4 ·· · · míněno kompletní semeno nebo fragment anebo část semene, které lze získat předdrcením semene nejlépe v suchém stavu. Musí být poznamenáno, že předložený vynález se týká dvouděložných rostlin a pro dosažení cílů předloženého vynálezu nemohou být použity rostliny jednoděložné.

Nejvhodnější rody rostlin, které mohou být aplikovány pro produkci požadovaných genových produktů podle postupu předkládaného vynálezu, zahrnují, ale nejsou omezeny na dvouděložné rostliny s vysokým obsahem proteinu nebo oleje v semenech. Typické příklady jsou následující rody: Brassicaceae, Fabaceae a Polygonaceae. Rod Brassicaceae zahrnuje následující druhy: Brassica napus, Brassica campestris, Camelina sativa, Sinapis alba, rod Fabaceae zahrnuje Lupinus angustifolius, Phaseolus vulgaris, Glysine max, Vicia faba, Lens culinaris, Pisum sativum, Vigna mungo a Medicago sativa. Rod Polygonaceae zahrnuje druh Polygonům. Vzhledem k vysokému obsahu oleje v semenech je potenciálně užitečná také slunečnice, Helianthus annuus.

Termínem princip zdroje a spotřebiče je míněn produkční systém nebo produkční celek, který může být rozdělen na dvě odlišná stadia, akumulační stadium, v němž se v semeni ukládají reservy proteinu, sacharidu a lipidu, a mobilizační/produkční stadium, v němž jsou akumulované reservy, mobilizované normálně pro iniciaci růstu rostliny místo toho mobilizovány nebo využívány k produkci jednoho nebo více cizích genových produktů, o něž je zájem, spuštěním expresivního systému. Akumulační stadium zahrnuje kultivaci transgenních rostlin v podstatě bez exprese genových produktů do terénu, zatímco produkce genových produktů je omezena na klíčení v definovaných podmínkách. Toho se dá dosáhnout specificitou expresivního systému popsanou detailněji ve specifikaci jinde.

Termínem okolní prostředí je míněn vodný roztok pufru buď v kapalné, polotuhé nebo tuhé formě, který obsahuje substance schopné iniciovat, zvyšovat, zpožďovat nebo protahovat nejpříznivější stadium klíčení. Okolní prostředí může obsahovat zavádění klíčení, faktory regulující zvyšování určitých pochodů a/nebo faktory regulující omezování jiných určitých pochodů, právě tak jako externí živiny. Okolním prostředím může být také vlhký prostor nebo místnost.

Termín substrát znamená tuhou, polotuhou nebo kapalnou kompozici nebo medium, které obsahuje nejméně jednu sloučeninu nebo substanci, jež může být při použití směsi podle předloženého vynálezu, obsahující jako katalyzátor jeden nebo • · více genových produktů o něž je zájem, transformována na jinou sloučeninu nebo substanci s více žádoucími vlastnostmi.

Termín ze semen pocházející směs znamená surovou směs připravenou způsobem podle předkládaného vynálezu, kterou lze získat z klíčících dvouděložných semen obsahujících jeden nebo více de novo syntetizovaných genových produktů, exprimovaných v děloze naklíčeného semene dvouděložné rostliny včetně sazenice nebo vyloučených do prostředí obklopujícího klíčící semeno nebo sazenici. Ze semen pocházející směs může být použita jako taková, uvedením do styku se substrátem. Ze semen pocházející směs může být sušena a/nebo ošetřena použitelnými metodami proudového postupu, právě tak jako izolována a/nebo rafinována před použitím. Alternativně je substrát činidlem obsahujícím jednu nebo více sloučenin schopných modifikování jednoho nebo více genových produktů ve směsi. Aby se získal stabilní produkt, mohou být přidávány například substituenty nebo mohou být modifikovány skladebné části genového produktu anebo odstraněny či přidány fragmenty či části. Ze semen pocházející směs může být také formulována tj. opatřena vhodnými aditivy jako granulaci zlepšujícími činidly, plnivy, lubrikanty atd. Naklíčená, ze semen pocházející směs podle předkládaného vynálezu, může být také přidávána do krmivá pro zvířata ke zlepšení trávení podporujících vlastností krmivá.

Termínem v podstatě sterilní produkční systém zdroje a spotřebiče se rozumí, že semena dvouděložných rostlin mohou být povrchově sterilizována metodami jako je ozařování nebo chemická sterilizace. Klíčení může být prováděno v nebo na předem sterilizovaném okolním mediu za užití způsobů aplikovaných při aseptických pracovních metodách a/nebo při práci za sterilních nebo superčistých podmínek. Skutečnost, že celá produkce může být prováděna za sterilních podmínek znamená, že mohou být vyloučeny hlavní příčiny zmaření nebo nevyklíčení semen, tj. fungální nebo bakteriální kontaminace semen. Navíc dále je konečný produkt rovněž v podstatě kontaminace prostý a nenáchylný k degradaci kontaminanty s proteolytickými aktivitami. Produkční sytém je tedy také zvláště vhodný pro produkci farmaceutických produktů, který vyžadují vysoké hygienické standardy.

Termínem iniciace klíčení transgenních dvouděložných semen se rozumí zajištění podmínek příznivých pro klíčení. To případně zahrnuje skladování, sušení, sterilizaci, přidávání vody, doplňování semen regulačními faktory indukujícími stejně tak zesilování a/nebo zeslabování, jakož i vnější výživu. Doplňky zahrnují prostředky

jak fysikální tak chemické. Vnější výživa obsahuje na příklad N- a/nebo C-zdroje, vitaminy, minerály, stopové prvky atd. Růstové faktory, klíčení spouštějící faktory, zaváděcí činidla, faktory schopné během syntézy de novo regulovat některé procesy k zesílení a jiné potlačovat, zahrnují například rostlinné hormony jako auxin a cytokinin. Fysikální prostředky představují například světelné záblesky nebo osvětlování po delší dobu, právě tak jako sterilizaci a/nebo zahřívání.

Termín expresivní systém znamená konstrukt DNA, obsahující jednu nebo více sekvencí kódující jeden nebo více genových produktů o něž je zájem, operativně spojené se sekvencemi regulujícími expresi jako jsou zesilovače transkripce, promotory a/nebo terminátory. Expresivní systém je nejvhodněji takový, že je nebo může být navozen během klíčení semene, aleje v podstatě nečinný nebo může být umlčen, když se dvouděložná rostlina množí a kultivuje v polních podmínkách. Expresi regulující sekvence obsahují výhodně promotor, který může být nazván camera obscura” promotor, tj. promotor, který je spouštěn nebo aktivován během klíčení, když je semeno v podmínkách beze světla v temné místnosti. To nevylučuje použití iluminace nebo světla. Naproti tomu podrobení produkčního systému s úbytkem zdroje záblesku světla, může zvýšit produkci žádaného genového produktu vyvoláním a zvýšením aktivity specifického promotoru.

Expresivní systémy využívají výhody takových expresi regulujících sekvencí, které jsou aktivní zejména v de novo syntéze přechodných proteinů, které se hromadí v děloze během iniciací klíčení.

Takové indukovatelné expresivní systémy obsahují indukovatelné regulační sekvence volené z regulačních sekvencí genů kódujících přechodné proteiny, které jsou de novo syntetizovány během iniciace klíčení a akumulace v dělohách a endospermu rostliny.

Uvedené expresivní systémy mohou být připraveny vybráním vhodných regulačních sekvencí. Způsob selekce se skládá s těchto kroků

a) izolace celkové RNA z děloh a/nebo listů dvouděložných rostlin;

b) příprava cDNA z této izolované RNA amplifikací této RNA s jedním pro rostlinu specifickým primerem a primerem specifickým pro protein, který je de novo syntetizován během iniciace klíčení a akumulace v dělohách a endospermu rostliny;

c) shromáždění a nanesení cDNA obsahujících klonů na desky;

d) srovnání výsledků s klony získanými ze z listu pocházející RNA a • ·

e) znovuzískání klonů obsahujících cDNA vykazující zvýšenou aktivitu v klíčících dvouděložných semenech.

Termín genový produkt v předkládaném vynálezu značí proteiny, polypeptidy, včetně i strukturálních proteinů a/nebo enzymů. Genový produkt je obvykle peptid obsahující nejméně dvě aminokyseliny spojené spolu peptidovou vazbou. Peptidy obsahující 2 až 10 aminokyselin se nazývají oligopeptidy, zatímco peptidy obsahující více než 10 aminokyselin se nazývají polypeptidy. Polypeptidem může být řetězec polyaminokyselin jako polylysinový řetězec sestávající pouze z molekul lysinu, ale může to být i protein, proteinový komplex nebo část anebo fragment proteinu.

Jak bylo řečeno v předcházejícím odstavci, termín genový produkt může znamenat také produkty založené na nukleotidech, jako mRNA. V termínu jsou obsaženy také jiné žádané biochemikálie, sloučeniny nebo substance, které se dají získat například biotransformačními procesy, ve kterých jeden nebo více genových produktů přítomných ve směsích pocházejících ze semen podle překládaného vynálezu působí jako katalyzátory, jsou-li uvedeny do styku se substrátem obsahujícím sloučeninu nebo substanci, která může být transformována na požadovaný produkt nebo transformuje genový produkt požadovaným způsobem.

Deriváty genových produktů lze alternativně získat transformačními procesy, ve kterých je jeden nebo více originálních genových produktů podle předkládaného vynálezu modifikováno tak, že se činidlu přítomnému v substrátu umožňují jej modifikovat. Genové produkty lze učinit stabilnější nebo aktivnější změněním jejich sekundárních a/nebo terciárních struktur, např. znovusložením nebo přeskládáním řetězce aminokyselin, nebo odebíráním nebo přidáváním komplexujících fragmentů, nebo přidáním struktur nebo substituentů k těmto genovým produktům. Takové deriváty genových produktů jsou v termínu genový produkt podle předkládaného vynálezu obsaženy rovněž. Genové produkty produkované podle předkládaného vynálezu jsou obvykle heterologickými cizími proteiny. To znamená, že genový produkt není produkován divokým typem rostliny. Jinými slovy, není pro hostitelskou rostlinu nativní. Nativní semenné produkty mohou být ovšem produkovány s využitím postupu podle předkládaného vynálezu. Lze jej využívat zvláště ke zvýšení produkce určitých, farmaceuticky užitečných, nativních homologických produktů pocházejících z rostlin.

• · · · · · · · « * • · · ·· · · · · ♦ · · · • · · · · 1 · · · · · · ·

Termín získání genového produktu exprimovaného klíčícími semeny transgenních dvouděložných rostlin pomocí nebo bez následného zpracování znamená, že dělohy včetně semenáčků mohou být jako takové získávány jejich oddělením z okolního kapalného media pomocí nebo bez jakéhokoliv dalšího zpracování. Alternativně se okolní medium získává jako takové. Skladovatelnost směsi získané ze semen může být zlepšena sušením, extrakcí, filtrací, drcením atd. Mnohé z těchto způsobů jsou současně používány k zastavení klíčení. Zahřívání, sušení, drcení, separování, extrahování, lisování a filtrace se obvykle používají k zastavení klíčení před poklesem intenzity syntézy de novo a/nebo když požadované genové produkty opadají. Zastavování je důležité, protože když se klíčení nechá dlouho pokračovat, dochází k zneužití de novo syntetizovaných, žádaných proteinů pro produkci jiných substancí, které rodící se rostlina potřebuje.

Obecný popis vynálezu

Zásobní rezervy v klíčících semenech dvouděložných rostlin, které představují uvolněné aminokyseliny a jiné biochemické substance, obsahují obnovitelnou entitu zdroje suroviny, zatímco exprese požadovaného transgenu regulací transkripce, fungující v děloze během klíčení a následujícího růstu sazenice, tvoří entitu produkční (spotřebič). Předkládaný vynález se tedy především týká produkčního systému obsahujícího dva celky, zdroj a spotřebič, tj. dvě oddělená stadia, stadium akumulace suroviny a stadium produkce, ve kterém je zdroj surového materiálu využíván k de novo syntéze genových produktů a jejich derivátů nebo produktů modifikovaných genovým produktem ze zdroje suroviny získaného v prvním stadiu produkčního systému.

Cílem předkládaného vynálezu je vyvinout nový postup spočívající na produkčním systému zdroje a spotřebiče k produkování genových produktů v dvouděložných semenech. Produkce obsahuje dvě oddělená stadia. První stadium využívá nejrůznějších obnovitelných zdrojů suroviny, jako proteinu a oleje, které se hromadí jako zásobní rezervy u dvouděložných rostlin během kultivace, a které mohou být případně sklízeny ve formě semen. Druhé stadium obsahuje mobilizaci rezerv uložených v klíčící transgenní rostlině pro produkci jednoho nebo více genových produktů, de novo syntézou požadovaného genového produktu s pomocí anebo bez přidávání doplňků, jako nutričních faktorů a poskytnutí fysikáiních a/nebo ·· ·· » 9 9

I 9 9 99

99 chemických prostředků, stejně jako genetického inženýství, pro vyvolání klíčení a regulace zesílení a/nebo zeslabení de novo syntézy, počítaje v to transkripci, expresi a/nebo sekreci.

Předkládaný vynález ve své první fázi využívá mnohostranných zásobních rezerv obsahujících proteiny, oleje a/nebo sacharidy přítomné ve dvouděložných rostlinách, ale chybějících u jednoděložných rostlin, ve kterých zásobní rezervy z hlavní části zahrnují dvě příbuzné formy škrobu, amylosu a amylopektin. U jednoděložných rostlin je škrob během klíčení mobilizován amylázami a následujícím růstem rodícího se sazenice. Vznikající sacharosa je využívána jako zdroj energie a uhlíkatých sloučenin, avšak surovina pro de novo syntézu, zvláště proteinů, se vyskytuje mnohem vzácněji než u dvouděložných rostlin, činících naklíčená semena dvouděložných rostlin pro produkční systém zdroje a spotřebiče nesrovnatelně vynikající.

V předkládaném vynálezu jsou transgenní semena dvouděložných rostlin sklízena z pole, transportována a uskladněna, jak je obvyklé. Životnost uskladněných semen může být uchována po dlouhou dobu, obvykle až několik let. Hlavními faktory určujícími životnost semen během skladování je teplota a obsah vlhkosti v semeni. Semena jsou obvykle skladována při teplotách 0 až 5°C. Normální obsah vlhkostí skladovaných semen je 4 až 10 %. Je-li obsah vlhkosti menší než 20 %, semeno dýchá a vyvíjí se teplo. Jsou-li špatné podmínky ventilace, může vyvinuté teplo semeno zničit. Jestliže je obsah vlhkosti nad 20 %, může dojít ke zkažení semene mikrobiálním bujením.

Vysoušení při dozrávání je normálním jevem při vývoji semene, při němž semeno přechází do metabolicky klidového stavu. Avšak semena mnoha druhů mohou klíčit bez vysychání. Semena rajských jablíček mohou být klíčena, když jsou vyjmuta z dozrávajícího plodu a umístěna do vody. U některých jiných druhů, včetně Brassica campestris, klesá při vysychání semen prudce obsah škrobu a vzrůstá koncentrace některých sacharidů a oligosacharidú. U vysychajících semen jsou také silně exprimovány určité hydrofilní proteiny. Ty mají schopnost upoutávat vodu a má se za to, že hrají významnou roli v ochraně proti škodlivým účinkům při vysychání. Zralá suchá semena podržují schopnost klíčení a mohou být skladována po dobu dnů až mnoha let. Hrubý, neformulovaný surový materiál semen dvouděložných rostlin může být stabilně skladován až několik let.

• · • · ·· • · • ··· • * » ·

9 · • · · ··· 9 9 9 · 9 · · • 9 9 · · · · · · · · ·« · · 9· 99 9 9 99 9 9

U dvouděložných semen jsou hlavní zásobní formou lipidů triacylglyceroly, ukládané v subcelulárních organelách jako olejovitá tělíska. Obsah oleje v semenech může dosahovat výše až 64 % v ricinovém zrnu nebo 48 % v semeni řepky. Zásobní olej je syntetizován ze sacharosy pronikající do vyvíjejícího se semene. V cytosolu je je sacharosa konvertována na fosfát hexosy, který je přemísťován do plastidů nebo konvertován na glycerol-3-fosfát (nositel glycerolu). Vycházejíce z fosfátu hexosy jsou v plastidech syntetizovány mastné kyseliny, jablečnan a octan. V endoplazmatickém retíkulu (ER) jsou mastné kyseliny a nositel glycerolu esterifikovány za vzniku triacylglycerolů.

U dvouděložných rostlin jsou glutamin a asparagin hlavními aminokyselinami transportovanými floémem. V slupce semen je před přemístěním do děloh část glutaminu a asparaginu přeměněna na jiné aminokyseliny. V dělohách jsou pro syntézu ukládaných proteinů využívány aminokyseliny, z nichž jsou skládány proteinové celky. V ranném vývoji semene obsahuje děloha jednu nebo dvě vakuoly, které se později zaplňují ukládaným proteinem a postupně fragmentují, aby vytvořily odlišné a oddělené, menší proteinové celky. Semeno dvouděložné rostliny obsahuje obvykle dva nebo více různých uložených proteinů. Například Brassica campestris má celkový obsah proteinu 24 % obsahující například 2S albumin, napin, 11S globulin a kruciferin. Z celkového obsahu proteinu v semeni představuje napin 20 % a kruciferin 60 %. V předkládaném vynálezu je možné využívat genů kódujících uvedené proteiny.

Ukládané proteiny jsou obvykle kódovány multigenními rodinami. Obecným rysem pro luminální proteiny endoplazmatického retikula eukaryontů je zachovávaný karboxy-terminální tetrapeptid KDEL, který slouží jako ER-retenční signál a vždy se nalézá na nejzazším karboxy-konci. Neexistuje důkaz o tom, že by bylo nezbytné zachování více než čtyř koncových aminokyselin [Pelham H. R. B., TIBS 15, 483-486 (1990)], třebaže bylo prohlášeno, že kompozice kyselinových zbytků mezi 20 aminokyselinami může mít jistý význam pro účinnou retenci [Wandelt C. I. a spol., Plant J. 2, 181-192 (1992)]. Navrhovaný mechanismus retence je nejpravděpodobněji zprostředkováván receptory a zahrnuje vazbu KDEL signálu na membránový receptor a rychlý návrat komplexu signálního receptoru v ER, pokud je uvolňován jako váček [Pelham H. R. B., TIBS 15, 483-486 (1990)].

Geneticky modifikované proteiny nebývají nalézány v jejich přirozené celulární části vždy. Například vysoce-Met fazeolin, exprimovaný v transgenním tabáku, je ·«·· · · · *··· • · · · · ♦ ·· · * ·

nalézán pouze v ER (endoplastickém retikulu) Golgi cisternae a Golgi váčcích. Fazeolin se normálně akumuluje v matrici vakuol pro ukládání proteinu vyvíjejících se tabákových semen. Výsledky ukazují, že vysoce-Met fazeolin je degradován buď v Golgi váčcích nebo právě po vstoupení do vakuol pro ukládání proteinu [Hoffman L. M. a spol., Plant Mol. Biol. 11, 717-730 (1988)]. Vysoká hladina akumulace zásobního proteinu semen Vicia alba, vicilinu, s dodatečnou karboxy-terminální KDEL-sekvencí byla ohlašována u tabáku a vojtěšky [Wandelt C. I. a spol., Plant J. 2, 181-192 (1992)]. Modifikované genové útvary sloučené s 35S-promotorem mozaikového viru květáku a proteinem se akumulují v ER listů transgenních rostlin. Podle toho se zdá být pravděpodobné, že když jsou produkovány geneticky modifikované zásobní proteiny, retence v ER by mohla zamezovat degradaci, a že konstrukt DNA s 35S-promotorem mozaikového viru květáku by mohl být aplikován v předkládaném vynálezu.

Kruciferin je hexamerem ze šesti podjednotek, každé obsahující jeden řetězec kódovaný jednotlivým genem [Rodin J., Rask L., Physiol. Plant. 79, 421-426 (1990)]. Například u Brassica napus geny kruciferínu sdílejí 60 % homologie mezi členy. Druhým nejvíce prominentním proteinem v semenech Brassica napus je napin. Podobně jako subjednotky kruciferínu je napin jednotlivý genový produkt složený ze dvou polypeptidových řetězců, vázaných spolu disulfidovými můstky. Oba, kruciferin i napin, jsou syntetizovány na membráně ER jako prekurzory obsahující na ER zacílený signál [Ericson M. L. a spol. J. Biol. Chem. 261, 14576-14581 (1986)].

Jak bylo zmíněno dříve, jak kruciferin tak napin obsahují na svém Nterminálním konci na ER zacílenou signální sekvenci. Proteiny vstupují do ER v nerozvinutém stavu a signální sekvence se brzy po vstupu odštěpí. V nedávných letech se stalo zřejmé, že ne všechny proteiny vcházející do ER jsou dále zpracovávány a shlukovány do vakuol. ER obsahuje také veliký počet proteinů, které zůstávají v buněčné dutině a napomáhají počátečním krokům ve zrání vyměšovaných proteinů. Mnohé z těchto proteinů byly vyznačeny i v savčích systémech [Pelham H. R. B., TIBS 15, 483-486 (1990)] a naznačují, že glykosylace genových produktů, zvláště proteinů, je podobná jak u savců tak u rostlin. U rostlin bylo ukázáno, že například protein vázající auxin je zadržován v ER [Inohara N. a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 3564-3568 (1989)].

Obvykle první skupina proteináz objevující se během klíčení jsou SHdependentní proteinázy, které působí na nerozpustné nativní ukládané proteiny. U

4 *4	44	«4	4 4	44
4* 4	•	•	•	4	4	4	« 4
• ·	«	•	»	• 4 «	4	4	4
4 ·	•	•	4	♦ ·	4	4	4
4· · 44		• »		44	• 4		44*4

Vigna mungo je syntéza SH-dependentní proteinázy v děloze iniciována bezprostředně po imbibici a vzrůstá až do čtvrtého dne, po kterém klesá [Okamoto T. a Minamikawa T., J. Plant Physiol. 152(6), 675-682 (1998)]. Peptidy o krátkém řetězci vznikající z aktivity endopeptidázy jsou štěpeny z nativních proteinů a to zase zvyšuje jejich citlivost vůči dalším proteinázám.

Proteinázy druhé skupiny jsou proti nativním akumulovaným proteinům inaktivní, ale hydrolyzují peptidy s krátkým řetězcem na oligopeptidy. Ve stejnou dobu jsou aktivovány karboxypeptidázy a z peptidů jsou uvolňovány aminokyseliny. K této proteolýze dochází v hlavním řetězci proteinu, z něhož se do cytosolu uvolňují oligopeptidy a aminokyseliny, a kde oligopeptidy jsou dále degradovány na aminokyseliny pomocí amino- a di- nebo tripeptidáz. Aminokyseliny, uvolněné z uložených složek, jsou dále metabolizovány na hlavní transportní formu aminokyselin, asparagin a glutamin. Uložené proteiny představují zdroj aminokyseliny pro proteiny de novo syntetizované během klíčení.

Druhé stadium postupu podle předkládaného vynálezu zahrnuje klíčení, při němž surový materiál, nahromaděný během kultivace do uložených rezerv semena dvouděložných rostlin, je mobilizován pro produkci požadovaných genových produktů. Postup při klíčení je rychlý a náklady jsou nízké. Objem produkce není prakticky limitován, protože surovina se dá získávat z obnovitelných zdrojů a požadovaný příkon energie se získává ze slunce.

Klíčením se v předkládaném vynálezu míní vývojový fenomén, který začíná přijetím vody semenem dvouděložných rostlin a zvýšenou respirací a makromolekulárními syntézami, mobilizací uložených rezerv a subcelulárními strukturálními změnami. Fysiologicky je klíčení krátkým jevem končícím nástupem prodloužení osy embrya. V předkládaném vynálezu zahrnuje klíčení také růstovou fázi po nástupu prodlužování embryonální osy. Semeno nasakuje ne více než dvakrát nebo třikrát hmotnosti suchého semene, avšak později při vývoji sazenice je zapotřebí vody více. Klíčení obsahuje početné události jako zvýšenou respirací a makromolekulární syntézy a subcelulární strukturální změny. Klíčení je zpravidla dokončeno s rozpínáním kořínků, ke kterému dochází buněčnou expanzí bez buněčného dělení. Existují dva typy sazenic klasifikovaných podle osudu dělohy po klíčení. Při růstu hypogeálního typu sazenice děloha s vyvíjející se sazenicí z půdy nevystupuje. Hypokotyl (podděložní článek) zůstává krátký, ale epikotyl se prodlužuje a vyráží první pravé listy ven ze země. U epigeálního typu sazenice vystupují • · » · · · « · · · • · · ·· · · *·· * · 4 • · · ··· · t · « t · · «··· · · · » * · · ·· ·· ·* ·· ·^β ·**· narůstající dělohy expandováním hypokotylu. Dělohy se obvykle stávají fotochemicky aktivní před výskytem pravých listů.

Když semeno klíčí v přírodě nebo na poli, využívá rezervy dělohy na vyvolání fysiologické aktivity obvykle po klidovém stadiu jako suché semeno. Vitální funkce včetně exprese genů rychle narůstají. Během klíčení se z rezerv uložených v děloze uvolňuje výrazné množství aminokyselin a jiných biologických sloučenin a pak jsou vázány během růstu sazenice.

Klíčení může být u povrchově sterilizovaných semen také iniciováno inkubací semen ve vodě nebo vodě doplněné o sloučeniny, které jsou užitečné pro produkci požadovaného genového produktu. Během klíčení je aktivována exprese genu pro produkování požadovaného genového produktu. K iniciaci klíčení jsou semena nejprve hydratována na obsah vlhkosti 40 - 50 % máčením v tancích s vodou, kde se teplota adjustuje podle druhu semene a provzdušňování se uskutečňuje stlačeným vzduchem. Po nasáknutí jsou semena přemístěna obyčejně do komor se 100 %-ní vlhkostí, aby vyklíčila. Typická teplota je mezi 10 - 30°C a časové rozsahy od 2 do 10 dnů, lépe 3 až 6 dnů a nejvýhodněji 4 až 5 dnů.

V předkládaném vynálezu klíčící semeno dvouděložných rostlin zahrnuje transgenní dělohu, tj. dělohy dvouděložných rostlin, které jsou stabilně transformovány DNA sekvencí kódující žádaný genový produkt. Dělohy jsou částí embrya a slouží jako orgán pro ukládání. Fysiologická struktura a diverzita buněčných typů v děloze je relativně jednoduchá. Mobilizace hlavních rezerv uložených v děloze začíná po klíčení. V dělohách jsou během narůstání sazenice tři hlavní formy uložených materiálů, proteiny, olej a sacharidy, enzymaticky konvertovány na transpotovatelnou formu. Uložené proteiny jsou postupně štěpeny řadou proteináz exprimovaných v buňkách dělohy. Proteinázy jsou de novo syntetizovány strukturálními geny regulovanými v oblasti promotoru fungujícího v děloze.

Během klíčení a následujícího narůstání vznikajícího sazenice je mobilizace uloženého lipidu iniciována lipolýzou částeček oleje, která z triacylglycerolu poskytuje glycerol a volné mastné kyseliny. V úložných buňkách semene jsou glycerol a mastné kyseliny konvertovány na sacharosu složitými reakcemi včetně tuctů enzymů a alespoň glykosomů a mitochondriálních organel. Sacharosa je přemísťována do vakuoly nebo embrya.

» • *·« • 4 4 • · · · • * » ·

4 4

4«·· · » «

4· 44 »« «444

V mobilizačním / produkčním stadiu jsou akumulované rezervy proteinu, sacharidu a lipidu využívány jako výchozí materiál a jsou konvertovány na obchodně zajímavé produkty místo normálních proteinů, které jsou produkovány pro utvoření rostliny. Mobilizace začíná, pridajř-li se semena k okolnímu kapalnému, polotuhému nebo tuhému mediu obsahujícímu vodu, která je případně doplněna fysikálními nebo chemickými prostředky, počítaje v to výživu, klíčení zavádějící faktory, právě tak jako faktory schopnými regulovat zrychlení a/nebo zpomalení určitých kroků při produkci (transkripci, expresi a nebo sekreci). Tato mobilizace iniciuje klíčení a produkce postupuje až pokud se neobjeví zelené listy.

Bylo známo, že vážným problémem ve fermentační technologii je kontaminace. Při produkci v průmyslovém měřítku je kontaminována výrazná část (20 - 25 %) fermentačních vsádek. S mikrobiálním růstem během procesu mají také problémy postupy, které využívají čerstvého rostlinného materiálu, jako je výroba bramborového škrobu nebo mokré mletí obilí. Čerstvý rostlinný materiál jako listy sklizené z pole jsou hlavním zdrojem kontaminace, která může způsobit vážné ztráty konečného produktu.

Předkládaný vynález popisuje systém, který využívá jako surovinu suché semeno. Na poli je exprese cizího genu pouze omezená, zatímco, pokud se týká prostředí, se exprese bezpečně provádí hlavně za řízených podmínek v továrně, namísto podmínek polních. Suchá semena dvouděložných rostlin mohou být povrchově sterilizována snadněji než jednoděložných rostlin, protože semena mají tuhou, hladkou slupku na rozdíl od zrn jednoděložných rostlin. Sterilizace může být uskutečněna ošetřením chemikáliemi jako je chlornan, peroxid vodíku nebo jinými dezinfikujícími sloučeninami. Poněvadž dvouděložná semena mají na rozdíl od vrásčité struktury povrchu jednoděložných semen povrch hladký, je sterilizace semen dvouděložných rostlin mnohem více efektivní. Následkem toho může být produkce požadovaného cizího nebo nativního genového produktu(ů) prováděna za sterilních podmínek, což je velikou výhodou, zejména když je cílovým genovým produktem terapeuticky aktivní protein, ale také proto, že může být zabráněno mikrobiální degradaci konečného produktu.

Genový produkt může být získán v podstatě kontaminantu prostý, také jako kompozice pocházející ze sušeného semene rostliny, obsahující jeden nebo více genových produktů akumulovaných během klíčení semene transgenní dvouděložné rostliny, získaných nejlépe v bodě maximální akumulace přerušením procesu ·♦ ** ** ·· Φ» fr · · · · * · · · · » · ··* · « ·«· · · · • · · · · · · » » · · « A ···· 9 9· · r · · «« ·» ·· ·♦ *· ···· klíčení. Genový produkt může být získán jako postupně zpracovávatelná směs vyklíčených semen dvouděložných rostlin nebo ve stabilní formě pro skladování. Směs obsahuje na příklad proteiny, enzymy, peptidy, hormony, růstové faktory, vakcíny, aminokyseliny, vitaminy a/nebo antibiotika.

Předkládaný vynález užívá pro vedení syntézy k produkci žádaného genového produktu(ů) řízenou genovou expresi a jako surovinový zdroj pro de novo syntézu transgenního produktu používá aminokyseliny a jiné genové produkty uvolněné během iniciace klíčení. Přírodní či nativní genové produkty např. proteinázy, lipázy, amylázy atd., vytvářené v klíčících semenech, mohou být využity jako substráty pro transgenní enzym nebo na vytvoření žádaných biochemikálií.

V předkládaném vynálezu je cílem poskytnout transgenní rostlinu mající v sobě nejméně jeden expresivní systém, obsahující nejméně jednu DNA sekvenci, kódující nejméně jeden požadovaný genový produkt funkčně spojený s expresi regulujícími sekvencemi, které jsou indukovány nebo mohou být mohou být indukovány během klíčení a jsou v podstatě nečinné nebo mohou být umlčeny, když se dvouděložné rostlina pěstuje v polních podmínkách. Promotory, aktivní ve tmě (podmínkách bez osvětlování), v tomto případě tak zvané camera obscura promotory, včetně více nebo méně na světle nezávislých Rubisco-promotorů jsou v expresivním systému předkládaného vynálezu výhodné.

Předkládaný vynález poskytuje možnosti produkovat rozdílné žádané genové produkty, ale i jiné negenové biochemikálie. Transgen exprimovaný během klíčení produkuje první genový produkt, RNA, ze které lze získávat jiné RNA-produkty jako takové nebo po transformaci. RNA-stadium je obvykle přechodné a získaný genový produkt obsahuje proteiny. Principielně existují dva druhy proteinových produktů, enzymy a produkty neenzymové, kterými jsou často strukturální proteiny, vakcíny, hormony atd. Enzymy jsou schopny modifikovat z rostliny získatelný endocelulární substrát, který je transformován na žádanou biochemickou sloučeninu. Alternativně je přidáván substat extracelulární, který může být transformován, aby poskytl jinou biochemickou sloučeninu. Následně může být protein, ať už je to enzymaticky nebo neenzymaticky aktivní protein, uveden do styku s reagentem, v kterémžto případě se získává derivát proteinu.

V předkládaném vynálezu jsou heterologické cizí geny nebo DNA sekvence určeny pro optimální expresi v klíčících dělohách dvouděložné rostliny. Sekvenční charakteristiky mezi rostlinnými geny a heterologickými geny jsou ověřovány, aby • · ·· • · · · • ♦ ·

exprimovaly cizí transgenní geny z heterologických zdrojů. Je prospěšné srovnávat strukturu těchto genů u rostlin se známými rostlinnými geny. Průkopnická práce na tomto poli byla vykonána s endotoxinovým genem (cry) Bacillus thuringiensis. Aby se zvýšila exprese na AT bohatých cry genů v rostlinách, musí být v originální genové sekvenci učiněno několik modifikací.

Preferovanou transkripční startovací sekvencí v rostlinách je AACA ATG G (velmi konzervativní pozice nukleotidů jsou uvedeny tučně). Z ukončovacích kodonů TGA, TAG a TAA je první mírně preferován a TAA je u jednoděložných používán zřídka. Kodóny v genové sekvenci mohou být podle tabulek užívání kodonů konvertovány na vhodné pro rostliny. Konvertovaná DNA sekvence by měla být zkoumána na přítomnost předpokládaných poloh snižujících v rostlinách expresi. Předpokládané signální sekvence polyadenylace v rostlinách jsou AATAAA , AATAAT a jejich variace : AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT a AAAATA (nejkonzervativnější z A nukleotidů jsou označeny tučně). Předpokládané polohy spojování vyloučené z genové sekvence byly CAN7.9AGTNNA. Dodatečně by DNA sekvence měla být zbavena ATTTA sekvence, která je údajně mRNA degradačním elementem.

Transkripční terninátorové sekvence lze získat z různých genů exprimovaných v semeni nebo jiných rostlinných genů, na příklad z Rubisco genu. Terminátory z různých bakterií, na příklad z Agrobacterium mohou být použity právě tak jako nos gen nebo ocs gen. Nos gen kóduje nopalin syntetázu [Depicter A. a spol.,J. Mol. Appl. Genet. 1, 561-572 (1982); Shaw C. H. a spol., Nud. Acid. Res. 12, 7831-7846 (1984) a An G. a spol., Mol. Gen. Genet. 203, 245-250 (1986)]. Ocs gen kóduje octopin syntetázu [Koncz C. a spol., EMBO J. 3, 1597-1603 (1983); Dhaese P. a spol., EMBO J. 2, 419-426 (1983)].

RNA polymeráza II transkribuje protein kódující geny v rostlinách v podstatě stejnou cestou jako v jiných eukaryotických organismech. V obecné poloze lze v eukaryotických buňkách nalézt velmi podobné regulační elementy v oblastech iniciace transkripce (promotor). TATA oddíl je umístěn 20 - 40 nukleotidů ležících nahoru od místa iniciace transkripce a kódu iniciace translace, ATG je umístěn 40 80 nukleotidů ležících dolů od místa iniciace transkripce. Ve zralé mRNA rámec volného čtení sleduje ATG kód a končí jedním ze tří ukončovacích kodonů UGA, UAG nebo UAA.

Pro transgenní expresi v rostlinách mohou být použity promotory z rozdílných zdrojů. Mnohé z nich pocházejí z Agrobacterium ssp. a z rostlinných virů jako konstitutivně exprimovaný Agrobacterium nos promotor a 35S promotor mozaikového viru květáku. Specifické promotory tkáně jsou vhodné při aplikacích, kde je nutná exprese ve specifických tkáních. Specifické promotory tkáně jsou také vývojově kontrolovány tak, že jsou aktivní pouze v určitém vývojovém stadiu tkáně. V předkládaném vynálezu je vhodné, že promotor je pro klíčící semeno specifický.

Rubisco (ribulosa-1,5-bifosfát karboxyláza / oxygenáza) představuje až do 50 % celkového proteinu v klíčící děloze. Je nejhojnějším rostlinným proteinem, který katalyzuje reakce, při nichž kondenzuje CO2 molekula s 1,5-bifostátem ribulosy za vytvoření dvou molekul 3-fosfoglycerátu. Rubisco je umístěn na stromálním povrchu membrán tylakoidů. Enzym sestává z osmi velkých podjednotek kódovaných genomem chloroplastu a osmi malých podjednotek. Malá podjednotka je kódována druhem multigenů jádra (rbcS geny). Malá podjednotka je syntetizována na cytoplazmatických polyzomech jako prekurzorový protein. Je transportován do plastidů a zpracován před kompletováním holoenzymu. Exprese RcbS genu je specifická pro tkáň a vývojové stadium a je ovládána fytochromním systémem pomocí světla.

V předkládaném vynálezu nejpreferovanější genový produkt nebo systém produkce proteinu užívá promotor malé podjednotky genu Rubisco. Promotory malé podjednotky genu Rubisco mohou být izolovány z děloh Brassica campestris pěstované v temnu (camera obscura) nebo bez světelných podmínek. Tento druh promotoru může produkovat cizí proteiny na velmi vysoké úrovni. Naše práce ukázala, že kolem 50 % všech de novo syntetizovaných proteinů v temnu klíčícími dělohami B. campestris jsou malé a velké podjednotky proteinů Rubisco. mRNA úroveň transkriptu nativního RbcS genu je vysoká jako 500 pg na pg celkové RNA v klíčícím semeni. Maximální exprese se dosahuje kolem 60 hodin po začátku imbibice. Podobné výsledky byly uvedeny u mRNA úrovní transkriptu přírodního RbcS genu Brassica napus [Fiebig C. a spol., Bot. Acta 103 (3), 258-265 (1990)]. Aby se zvýšila exprese, může se klíčící semeno osvětlovat viditelným světlem kratší nebo delší čas. Pro potlačení aktivity přírodního rbcS promotoru mohou být přidávány monosacharidy, disacharidy nebo oligosacharidy, nejlépe sacharosa nebo glukosa. Jestliže je z transgenního promotoru odstraněn na sacharosu odpovídající element, nebude sacharosou potlačován. Je-li produkováno méně Rubisco enzymu,

zůstává pro transgenní expresi více volných aminokyselin. Pro regulaci snižování exprese endogenního rbcS genu mohou být užity i opačné technologie: exprimování opačného rbcS genu v klíčícím semeni.

Vzhledem k tomu, že Rubisco je nejhojnějším rostlinným proteinem, byl v předkládaném vynálezu užíván jako preferovaný promotor, avšak systém exprese podle předkládaného vynálezu není žádným způsobem omezen na používání řečeného promotoru. Výhodná transgenní děloha pro produkci proteinů obsahuje promotorový systém pro produkci proteinů a v dělohách zahrnuje nejraději vysoce aktivní, světelně indukovatelný Rubisco promotor. Screeningem Rubisco cDNA exprimovaných v dělohách, zejména za podmínek bez osvětlování, je možné produkovat jiné vysoce expresivní Rubisco promotory. cDNA mohou být produkovány pomocí RT-PCR za užití oligo-T-primerů a sekvencí z 5'-konce kódující sekvence vysoce zachované Rubisco. Vysoce expresivní cDNA mohou být v děloze sekvencovány a jako zkouška pro detekci úrovní exprimace v rostlinných tkáních může být použita variabilní 3' netranslatovaná oblast (UTR). Využitím databází cDNA sekvencí a za užití různých metod, mohou být izolovány promotory exprimující v podstatě pouze v dělohách. Podobným způsobem je možné využít cDNA informaci, aby poskytla jiné, pro semeno v podstatě specifické a pro klíčení aktivované a/nebo indukovatelné promotory, na tomto místě nazývané camera obscura - promotory.

Mnohé proteinázy a lipázy jsou exprimovány v dělohách klíčících semen specificky. Jedna z nejlépe charakterizovaných je Vigna mungo sulfhydrylendopeptidáza (SH-EP), která je syntetizována de novo v dělohách krátce po imbibici. Obecně vzrůstá množství SH-EP mRNA až do třetího nebo čtvrtého dne. Oblast SH-EP promotoru (číslo genové banky: EMBL X51900) je spojena s GUS genem, aby se usnadnilo měření úrovně exprese během klíčení dvouděložného semene.

Kromě promotorů regulovaných v tkáni specifickým způsobem, mohou být použity indukovatelné promotory, které mohou být aktivovány různými stimuly. Třída genů známá jako tepelně šokové nebo stresové geny se vyskytuje ve všech organismech, od bakterie až po člověka. Transkripce těchto genů je iniciována po účinku stresu (např. tepelném šoku) a translace transkriptu produkuje proteiny, které pravděpodobně dočasně chrání buňku. Produkce tepelně šokových mRNA a proteinů je pouze přechodným fenoménem a exprese tepelně šokových genů se ustálí po někoíka hodinách a potom klesá. Pokud teplota vzrůstá pomalu spíše než

0 ·· ·· 0 · • 0 0	4 4 0 0 0 0 * 000	0 · 0 · 0 0	00 « 0 0 0
00 « *0	0 0 0 0	0 ·	0 0*0

naráz, organizmus může vzdorovat teplotám, které by jinak mohly být smrtelné, tj. organizmus se na vyšší teploty může adaptovat. Aby se zvýšila aktivita tepelně šokových promotorů, mohou být klíčící semena zahřáta. Bylo ukázáno, že úrovně tepelně šokové (HS) mRNA u sóji vzrůstají od sotva zjistitelné úrovně až do 15 000 -20 000 kopií po dvou hodinách ošetřování při 40°C. Jako indukovatelný promotor může být v expresivním systému podle předloženého vynálezu využita také oblast HS promotoru popsaná v US patentu 5 447 858. HS promotor klonovaný PCR je spojován s GUS genem k měření úrovně exprese během klíčení semene.

Některé typy hydrolytických enzymů jsou syntetizovány de novo a působí v klíčících semenech, kde jsou mobilizovány uložené rezervy. Konverze uložených rezerv na transportovatelnou formu jako triacylglycerol na sacharosu zahrnuje některé vysoce exprimované geny jako isocitrátovou lyázu a jablečnanovou dehydrogenázu. Promotory z těchto genů mohou být využity pro expresi transgenů. Indukovatelný salicylátový promotor z tabákové rostliny, Nicotiana tabacum, může být klonován pomocí PCR. Může být využit na exprimaci heterologických genů v klíčících semenech.

Velikou výhodou předkládaného vynálezu z hlediska životního prostředí je, že cizí gen není exprimován při kultivaci v polních podmínkách. Gen je množen a sklízen spolu s uloženými rezervami, zatímco na klíčení omezená exprese cizího genového produktu může být prováděna za definovaných podmínek.

Podle předkládaného vynálezu může být v zásadě produkován jakýkoliv komerčně zajímavý genový produkt. Tyto genové produkty zahrnují enzymy, které jsou pro rostliny heterologické. Jinými slovy, nejsou nativní pro rostlinnou species, ve které jsou produkovány. Zahrnuty jsou také enzymy, které jsou homologické pro rostliny, ve které jsou produkovány. Řečené homologické proteiny jsou obvykle přeexprimovány užitím rekombinantních DNA technik. Zájem je o enzymy, které zahrnují, avšak nejsou omezeny na hydrolázy jako proteázy, β-glukanázy, celulázy, hemicelulázy, fosfatázy, lipázy, fosfolipázy, pektinázy, amylázy, amyloglykosidázy, lysozymy, pullulanázy a chitinázy, peroxidázy stejně jako lyázy jako pektinolyáza a izomerázy jako izomeráza glukosy.

Pomocí postupu a produkčního systému podle předkládaného vynálezu je také možné produkovat strukturální proteiny. Některá zajímavá provedení předkládaného vynálezu jsou například pro kolagen, spidroin, protein hedvábí, ale produkovány mohou být i mnohé jiné druhy proteinových genových produktů,

9 počítaje v to inhibitor trypsinu, terapeutické peptidy jako interferony, inzulín, neuropeptidy, enkefalin, somatostatin atd. Produkovány mohou být také další polyaminokyseliny jako polylysin a polyglutamát, stejně jako vlákna, membrány, povlaky, terapeutika nebo léčiva, prostředky proti zubnímu kameni, potravinová nebo krmivová aditiva a vakcíny jako LTB a růstové faktory jako GM-CSF. Mohou být syntetizovány i neproteinové genové produkty včetně poly-p-hydroxybutyrátu.

Protože de novo syntéza je během klíčení rychle probíhajícím přechodným stavem, musí být klíčení přerušeno nebo zakončeno před tím, než požadovaný genový produkt začne ubývat. Toho může být dosaženo získáním požadovaného genového produktu před tím, než jeho koncentrace klesne zastavením klíčení, buď zahřátím, kodinem-N2 (umělým vysušením) nebo alternativně rozdrcením či excizí dvouděložných semen včetně sazenic. Pokud je klíčení zastaveno zahřátím, může být žádaný genový produkt získán jako surový vysušený produkt, s dobrou skladovatelností, čímž se rozumí, že rovněž enzym může být opět získán v surové formě stabilní pro skladování. Syntéza požadovaného proteinu může být také zastavena při jejím vrcholu rozdrcením nebo excizí klíčícího semene. Jestliže je klíčení zastaveno excizí nebo rozdrcením, může být genový produkt získán jako surová směs a může být použita jako taková, anebo může být dalším postupem zpracována, tj. formulována, uskladněna a transportována a uskladněna. Vhodně se užívá jako taková, např. při biotransformačních procesech. Žádané genové produkty mohou být pochopiteně izolovány a rafinovány běžně známými konvenčními metodami.

Je-li genový produkt používán pro biotransformaci, uvede se do styku se substrátem, tj. určitou sloučeninou nebo směsí sloučenin, tj. genový(é) produkt(y), často enzym(y) se nechá reagovat se sloučeninami v substrátu. Buď genový produkt, např. enzym působí jako katalyzátor a modifikuje sloučeninu(y) v substrátu nebo alternativně substát nebo činidlo obsahuje nejméně jednu substanci nebo sloučeninu schopnou modifikovat genový produkt, na příklad může být modifikován způsob jeho skladby, může být provedena glykosylace nebo deglykosylace, nebo může být opatřen substituentem, aby se usnadnilo spojení genového produktu s jinými produkty.

V předkládaném vynálezu je po klíčení substrát genovým produktem obohacen za podmínek, kde může být produkován žádaný genový produkt. Ze semen pocházející směs obsahuje dělohy, hypokotyly, oddenek a u rostlin • · • to • ··· hypogeálního typu také epikotyl a někdy malé primární listy. Genový produkt může být extrahován nebo ponechán ve směsi.

Genový produkt může být proteinem, kódovaným genem poskytovaným expresivním systémem předkládaného vynálezu, nebo některou jinou biochemickou sloučeninou produkovanou transgenním enzymem, když jsou klíčením mobilizovány nativní genové produkty uložené v semeni a užity jako takové a nechány působit na exogenně přidaný substrát, aby se postaraly o žádanou (bio)transformaci substrátu.

Jestliže je genový produkt ze směsi extrahován, může být použit buď v čerstvé nebo vysušené formě. Sušení může být provedeno v sušárně vyhřívané na 40°C 80°C nebo v lyofilizátoru při -20°C až -80°C. Vysušený materiál může být rozdrcen nebo rozpráškován. Před extrakcí může být směs mechanicky rozrušena a/nebo enzymaticky ošetřena, což uvede celkový protein do kašovité směsi nebo roztoku. Buněčný odpad může být potom oddělen jakýmkoliv běžným způsobem jako centrifugací, sedimentací a/nebo filtrací.

Supernatant nebo filtrát bude obsahovat obvykle 1-40 hm.% požadovaného genového produktu z celkového proteinu v mediu, nejspíše nejméně kolem 30 hm.%. Když není žádaný produkt ve vodě rozpustný, může být například extrahován vhodným rozpouštědlem. Případný je i jiný postup, který dovolí renaturaci nebo solubilizaci a/nebo extrakci produktu bez ztráty aktivity požadovaného produktu.

Po izolaci z vodného prostředí proteinu, o který je zájem, může být genový produkt rafinován konvenčními postupy. Jelikož genový produkt bude zahrnovat podstatnou část celkového proteinu přítomnou ve směsi, často představující největší procentový obsah nějakého individuálního proteinu, je rafinace ohromně zjednodušena. Navíc dále kontaminanty v produktu po rafinaci nepředstavují pravděpodobně fysiologickou záležitost pro nějakou z aplikací genových produktů včetně terapeutických aplikací.

Pokud není genový produkt ze směsi extrahován, nýbrž v ní ponechán, může být rovněž získáván v čerstvé nebo vysušené formě. Sušení může být prováděno jak je shora popsáno. Vysušený materiál může být dále rozdrcen nebo rozpráškován. Čerstvý materiál může být rozmělněn mechanickým narušením nebo enzymatickým působením. Vysušený i čerstvý materiál může být používán jako zdroj genového produktu. Je-li genovým produktem enzym, mohou být vhodné substráty přidávány do vodné směsi nebo do vysušené směsi, anebo může být použit jako čerstvý materiál.

· »· · » • · * • 9 ··· · ·

Při jednom provedení předkládaného vynálezu mohou být jako doplněk krmivových směsí použita naklíčená dvouděložná semena, dělohy a/nebo sazenice, obsahující jeden nebo více proteinů, o které je zájem. Naklíčená semena dvouděložných rostlin mohou být míšena s normálními netransgenními semeny, aby se v krmivové směsi pro zvířata získala žádaná koncentrace genového produktu, o který je zájem.

Směsi nebo kompozice získané z naklíčených semen mohou být sušeny a skladovány. Genové produkty mohou být izolovány nebo ponechány v materiálu, na příklad, když je rekombinantní protein užitečný pro aplikace v krmivu. Genové produkty mohou být využity ke zvýšení proteinové hodnoty zvířecího krmivá nebo mohou být na příklad růstovým hormonem nebo vakcinou. Rovněž mohou být produkovány labilní nebo toxické substance přísně kontrolovaným způsobem, který kombinuje účinnou produkci proteinu s ekologickými aspekty a zemědělskými zájmy.

Vynález je podrobněji popsán níže. Příklady a experimentální podrobnosti jsou uváděny aby zkušeným odborníkům poskytly lepší pochopení a návod.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1A ukazuje naklíčené transgenní semeno exprimující GUS gen. GUS gen je spojen s promotorem tepelného šoku sóji. Na pravé straně je uvedena netransformovaná kontrolní sazenice.

Obrázek 1B ukazuje naklíčené transgenní semeno exprimující GUS gen. GUS gen je spojen s promotorem endopeptidázy.

Obrázek 1C ukazuje naklíčené transgenní semeno exprimující GUS gen. GUS gen je spojen s indukovatelným promotorem salicylátu.

Obrázek 1D ukazuje naklíčené transgenní semeno exprimující GUS gen. GUS gen je spojen s 35S promotorem.

Obrázek 2 ukazuje bezbarvý substrát β-glukuronidu (100 pg/ml), který je enzymaticky konvertován na modře zbarvenou glukopyranosiduronovou kyselinu a aglykon GUS enzymem, produkovaným naklíčeným transgenním semenem.

Obrázek 3 zobrazuje různá stadia klíčení semene Brassica campestrís označená jako dny po počátku klíčení.

Obrázek 4 ukazuje SDS-PAGE gel naklíčených semen. Vzorky byl odebírány denně počínaje ze suchého semene. Uložené proteiny a Rubisco podjednotky jsou • 444 označeny v Coomasie obarveném gelu. Po třech dnech klíčení za den produkované množství Rubisco proteinu výrazně vzrostlo, jak je viditelně na obrázku demonstrováno.

Obrázek 5 ukazuje Northern blot naklíčených semen za použití sond RNA. Vzorky byly sbírány denně počínaje od suchého semene.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese GUS genu v klíčících semenech Brassica campestris

Exprese GUS genu je demonstrována histochemickou analýzou. Pro regulaci exprese GUS se užívají čtyři různé promotory. Použitými promotory jsou promotor tepelného šoku sóji, promotor endopeptidázy Vigna mungo, Nicotiana tabacum prpromotor a CAMV 35S promotor. Sekvence promotoru jsou produkovány pomocí PCR za použití totální DNA rostliny jako templátu.

Promotory byly napojeny na GUS gen za použití Ncol enzymu. Útvary promotor-GUS byly klonovány ve vektoru transformace rostliny, pGPTV-hpt [Becker a spol., Plant Mol. Biol. 20, 1195-97 (1992)]. B. campestris byla transformována podle protokolu, který popsal Kuvshinov V. a spol. [Plant Cell Reports 18, 773-777 (1999)]. Transgenní rostliny byly pěstovány ve skleníku dokud nedaly semena. Transgenní semena byla naklíčena a použita k histochemické analýze GUS.

Výsledky jsou popsány na obrázcích.

Na levé straně v obrázku 1A je ukázáno naklíčené transgenní semeno B. campestris exprimující GUS gen. GUS gen je spojen s promotorem tepelného šoku sóji. Na pravé straně je uvedena netransformovaná kontrolní sazenice.

Na obrázku 1B je ukázáno naklíčené semeno transgenní Brassica campestris exprimující GUS gen. GUS gen je spojen s promotorem endopeptidázy.

Na obrázku 1C je ukázáno naklíčené semeno transgenní Brassica campestris exprimující GUS gen. GUS gen je spojen s indukovatelným promotorem salicylátu.

Na obrázku 1D je ukázáno naklíčené semeno transgenní Brassica campestris exprimující GUS gen. GUS gen je spojen s 35S promotorem.

Obrázek 2 ukazuje bezbarvý roztok pufru obsahující substrát β-glukuronidu (100 pg/ml), který je působením GUS enzymu produkovaného naklíčeným

Φ· Φ Φ Φ Φ « Φ * · Φ • φ Φ Φ Φ Φ·♦ Φ · ·

transgenním semenem enzymaticky konvertován na modře zbarvenou glukopyranosiduronovou kyselinu a aglykon.

Obrázek 3 zobrazuje různá stadia klíčení semene Brassica campestris označená jako dny po počátku klíčení. Povrchově sterilizovaná semena byla klíčena za podmínek in vitro, osvětlována 16 hodin při teplotě 22 °C a bez osvětlování (v temnu) byla 8 hodin při teplotě 18 °C.

Obrázek 4 ukazuje SDS-PAGE gel naklíčených semen. Vzorky byl odebírány denně počínaje od suchého semene. Materiál byl homogenizován v kapalném dusíku a resuspendován v 50 mM Tris, pH 8,0, v přítomnosti 850 mM NaCI. Po centrifugaci byl čirý supernatant smísen s plnícím pufrem. Zásobní proteiny a Rubisco podjednotky jsou označeny v Coomasie obarveném gelu. Po třech dnech klíčení je za den produkované množství Rubisco proteinu výrazné.

Obrázek 5 ukazuje Northern blot naklíčených semen za použití sond RNA. Vzorky byly sbírány denně, počínaje od suchého semene. Sonda pozitivní sekvence obsahuje 197 bp od exonu 3 a 153 bp od 3'4JTR oblasti malé Rubisco podjednotky cDNA. Sonda se generuje z pBluescript plasmidů T7 promotorem za použití DIGUTP v reakci. Každý pruh byl naplněn 3 pg celkové RNA. RNA byla extrahována a při tom byl použit Qiagen RNeasy Plant Mini Kit. Hybridizace byla provedena s DIG Easy Hyb pufrem, v podstatě podle návodu výrobce.

Příklad 2

Preparace nových rbcS promotorů pro expresivní systém

a. Izolace nového rbcS-promotoru

Rbc cDNA klony byly sekvencovány ze čtyři dny starých transgenních děloh Brassica campestris. Klony byly rozděleny na dvě skupiny s podobnými charakteristikami založenými na sekvenci 3'-UTR oblasti.

SDS-PAGE analýza sazenic Brassica campestris.

Semena Brassica campestris byla klíčena v sériích 1 až 7 dnů. Pět párů děloh bylo mleto v kapalném dusíku a resuspendováno v pufru [50 mM Tris HCI, pH 8,5, 2 % SDS, 0,1 % bromfenolové modři, 2 % merkaptoethanolu (2-ME)] zavádějícím lýzu. Vzorky byly deset minut vařeny na vodní lázni a analyzovány v 15 % SDS-PAGE gelu podle Laemmli (1970). Bylo usouzeno, že exprese Rbc genu počala 4 dny po imbibici.

·* ·· ·· • » · • ♦ * ·· • · · · • · · · • · · • » ··· ·

b. Rafinace RNA z děloh Brassíca campestris.

RNA byla rafinována ze čtyři dny starých děloh pomocí Qiagen RNeasy Kit.

c. Syntéza cDNA byla provedena z totální RNA děloh Brassíca campestris.

pg totální RNA a 10 ng noř/-d(T) primeru v 16 μΙ vody bylo inkubováno 5 minut při teplotě 70°C. Směs byla přenesena na led a bylo přidáno 5 μΙ 5 x reakčního pufru, 2,5 μΙ 5 mM dNTP, 20 U inhibitoru ribonukleázy a 200 U M-MLV reverzní transkriptázy. Reakční směs byla inkubována 1 hodinu při teplotě 42°C.

d. PCR-amplifikace cDNA klonů exprimovaných v buňkách dělohy.

PCR byla nejprve optimalizována použitím sérií dvanácti primerů tvořených thyminovými nukleotidy a měnícím se dinukleotidovým zakotvením jako 3'-primerem a 49-merním oligonukleotidem z počáteční oblasti rbc genu Brassíca napus (přístupové číslo genové banky g17849) exon číslo III jako 5'-primerem. Počáteční optimalizace ukázala, že v produktu PCR jako 3'-primer byl výsledkem pouze GCTn. Aby se klonoval tento produkt PCR, byl konstruován 49-merní oligonukleotid s Notlrestrikčním místem. Primery jsou uvedeny v Tabulce 1.

Tabulka 1

Primery použité k PCR-izolaci Rubisco cDNA klonů

3'-Primery pro počáteční screening:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12	5'TTTTTTTTTTTCA3' (SEQ.ID:1:) 5'TTTTTTTTTTTCT3' (SEQ.ID:2:) 5'TTTTTTTTTTTCC3' (SEQ.ID:3:) 5'TTTTTTTTTTTCG3' (SEQ.ID:4:) 5'TTTTTTTTTTTGA3' (SEQ.ID:5:) 5'TTTTTTTTTTTGT3' (SEQ.ID:6:) 5'TTTTTTTTTTTGC3' (SEQ.ID:7:) 5'TTTTTTTTTTTGG3' (SEQ.ID:8:) 5'TTTTTTTTTTTAA3' (SEQ.ID:9:) 5'TTTTTTTTTTTAT3' (SEQ.ID:10:) 5'TTTTTTTTTTTAC3' (SEQ.ID:11:) 5'TTTTTTTTTTTAG3' (SEQ.ID:12:)
5'-Primer (SEQ.ID:13:):
5-CGCGGATCCCACGGGTTTGTTTACCGTGAGCACGGAAGCACCCCCGGAT3'
3'-Primer pro klonování rbc cDNA-klonu (SEQ.ID: 14:):
5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGC3'

* • * • ·*# • ♦ ·

A · • 9

9» 99 • ♦ <

• AAAA • · * · < A A ·

A A *· • « ·

A · • »

A * «Α A

Pro klonování rbc cDNA fragmentu byla PCR-amplifikace provedena tak, že jako templát byl použit 1 μΙ reakční směsi ze syntézy cDNA, 100 nM 5'-primeru, 100 nM 3'-primeru, 100 μΜ dNTP a 1,25 U Pfu DNA-polymerázy/ 25 μΙ reakčního objemu. Získaný PCR-fragment byl klonován do Not\ a SamHl-míst pUK21-vektoru. Bylo sekvencováno sedm individuálních klonů. Podle sekvence byly klony rozděleny do dvou skupin obsahujících 3 podobné respektive 4 podobné reprezentanty. Jeden reprezentant z obou skupin byl zvolen pro další studie. Sekvence byly pojmenovány utr2 (SEQ.ID: 15;) a utr8 (SEQ.ID: 16:).

utr2-sekvence (SEQ,ID: 15:):

TTCGCGTTGT AAGACATTTC ATAAATAATA TCTACCTCAT TTCATTTCCA TTTGTCTGTTT TCTTTGGCTTT TTGTTTCTGA GGCATGTTAT ATCGGATTGT CAAGTGTCTG ATTTATGAAC AACATGTAAT CTCTATATGC ATATTTCT utr8-sekvence (SEQ.ID:16:):

TTCGCTTTCA TATAATAATA TCTTCCTCAT TTCATTTCCA ATAAGTCTGT TTCTTTTTTC TCTTTGGATT TCTGTTACGA GACTTTCTAT ATCGGATTGT AAAATGTCTG ATTTTATGAA CATGTAATTT CGG CAAATA

e. Klonování malé podjednotky Rubisco promotoru Typu I (65A) Brassica campestris.

2,8 kb fragment nesoucí promotor a gen odpovídající UTR 65A (SEQ.ID.24:) byl amplifikován za použití bnrbl (SEQ.ID: 17:) (5'-GAATTCTAACGACCCTTTTCCG3'), který je komplementární k malé podjednotce Rubisco genu B. napus jako 5'primer a UTR2 (SEQ.ID:18:) (5'-GGCCACACTTGACAATCCGATATAACATGCCTCA-3'), který je specifický pro UTR 65A (SEQ.ID:24:) jako 3'-primer. Amplifikace byla provedena s Pfx Platinum DNA polymerázou (Life Technologies) podle doporučení výrobce. Oblasti promotoru byly amplifikovány za použití získaného fragmentu jako templátu. Bnrb3 (SEQ. ID: 19:) (5'-AAAAAGCTTCTAGACCCTTTTCCGTCATAAGTTTTATA-3'), který je komplementární k malé podjednotce Rubisco genu B. napus byl použit jako 5'-primer a RbSiB (SEQ.ID:20:) a RBNCO (SEQ.ID:21:) jako 3'-primery v oddělených reakcích.

RbSiB (5'-CAGGTCTCCCATGCAGCTAACTCTTCCTCCGTTGCT-3') má 3'zakončení komplementární k zakončení předpokládaného chloroplastu mířícího na signální peptid malé podjednotky Rubisco genu B. napus a 5'-zakončení, které nese Eco311 místo, které po odříznutí zanechává ATG-obsahující Ncol místo, kompatibilní konec pro klonování na expresivní vektory rostliny.

RBNCO (SEQ.ID:21:) (5'-GAGGAAGCCATGGCTACTTCTT-3') je kompatibilní s počátkem kódující oblasti malé podjednotky Rubisco genu B. napus, až na změnu dvou nukleotidů, která vytváří Nco\ místo kolem ATG kodonu.

f. Vyhodnocení fondu mRNA kódující malou podjednotku ribulosa-1,5bifosfát-karboxylázy v listech a sazenicích Brassica campestris

Totální RNA byla za použití RNeasy Kit (Qiagen) izolována ze zralých listů a čtyři dny starých sazenic. Mediátorová RNA byla dále na koloně s Oligo (dT) Cellulose rektifikována podle doporučení výrobce (New England Biolabs). K syntéze fondu totální cDNA byly použity oligo T-primer (SEQ.ID:22:) (CUACUACUACUAGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN) a reversní transkriptáza Moloney-viru myší leukemie (Promega). Rubisco malé podjednotky cDNA byly amplifikovány při aplikaci dvou cyklů PCR (1 min 94°C, 1 min 55°C 1 min 72°C) PCR primerů; oligo T primerů a primerů, který rozeznává konec posledního exonu Rubisco malé podjednotky (SEQ.ID:23:) (CAUCAUCAUCAUTCGACGATCATCGGATTCGACA). PCR produkt byl digerován s uráčil DNA glykosylázou a klonován na pAMP1 vektor (CloneAMP pAMP System LIFE TECHNOLOGIES). Celkem 102 klonů bylo analyzováno DNA sekvencováním. 42 klonů pocházelo z klíčících sazenic a 60 ze zralých listů. Byly nalezeny tři různé typy mRNA (Typ I, II a III). Sekvence a procentický obsah distribuce různých typů sekvencí ve klíčících sazenicích a zralých listech jsou uvedeny v Tabulce 2.

Tabulka 2

Sekvence a procentický obsah distribuce různých typů sekvencí mRNA

Sekvence	Klíčící sazenice	Zralý list
Typl	29%	26%
Typu	15%	30%
Typ III	56 %	44%

Sekvence tří různých typů mRNA jsou následující:

Typ I (SEQ.ID:24:)

TTAATTCGCGTTGTAAGACATTTCATAAATAATATCTACTCATTTCATTTCCAT

TTGTCTGTTTTCTTTGGCTTTTTGTTTCTGAGGCATGTTATATCGGATTGTCAAGT

GTCTGATTTATGAACATGTAATCTCTATATTGCATATTTTCTTCTTGGAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAAA

Typ II (SEQ.ID:25:)

TTAATTTGCTATGACATTCACATAATAATCTCTGCTCATTTCATTTCCAATTGT

CTGTTTCTTTTCCCTTTGGTTTTCTGTTTCTCAGACATTCTATATCGGATTGTC

AAATGTGTGATTGTGAACATGTAATCTCTATATTGCTTCTTCGTCTTGGTAAA

AAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Typ III (SEQ.ID:26:)

TTAATTCGCTTTCATATAATAATATCTTCTCATTTCATTTCCAATAAGTCTGTTT

CTTTTTTTCTCTTTGGATTTCTGTTACGAGACTTTCTATATCGGATTGTAAAAT

GTCTGATTTTATGAACATGTAATTTCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAAAAAAAAA

g. Klonování nejhojnějšího genu Rubisco malé podjednotky Brassica campestris

Jeden z genů Rubisco malé podjednotky B. campestris představuje 56 % transkriptu podle kvantitativní sekvenční analýzy 102 klonovaných UTR-klonů Rubisco malé podjednotky. Tento klon byl pojmenován UTR56 (Typ III, SEQ.ID:26:). Za účelem klonování odpovídajícího genu a jeho nahoru směřující oblasti byly

...........

navrženy čtyři primery pro použití ve dvoustupňové PCR. V první PCR byl jako 5'primer použit primer bnrb4 (SEQ.ID:27:) (5'-GGCCATGAATTCTAACGACCCTTTTCC GTCATAAAAGT-3'), který je součástí genu Rubisco malé podjednotky B. napus (přístupové číslo x61097). Jako 3'primer byl použit primer 56r6 (SEQ.ID:28:) (5'-CGCGATATAGAAATTACATGTTCATAAAATCAGACATTTTAC-3'),specifický pro UTR56 (SEQ.ID:26:). Složení první PCR bylo: 75 mM Tris, pH 8,0 při 25°C, 20 mM (NH₄)SO₄, 0,01 % Tween 20, 2 mM MgCb, 200 μΜ dNTP, 0,2 μΜ primerů, 0,025 jednotek / μΙ Taq DNA polymerázy, 0,0016 jednotek / μΙ Pfu DNA polymerázy a 100 pg / μΙ DNA B. campestris. Program byl: 94 °C, 4 minuty, 30 X [(94°C, 30 s), (38°C, 30 s), 72°C, 3 min)]. Očekávaný 2,8 kb fragment byl rafinován z agarosového gelu. Protože tu nebyla jistá informace o sekvenci, byl fragment reamplifikován za použití bnrb5 (SEQ.ID:29:) (5'-GAGGTACCCGCGGCCGC GAATTCTAACGACCC TTTTCCGTCATAAAAG-3'), které má 3'-zakončení komplementární k bnrb4 (SEQ.ID:27:) a extensi 5'-zakončení, které nese Notl místo zkrácení 8-base a 56r7 (SEQ. ID.30:) (5'GAGAATTCGGCGCGCCATAGAAATTACATGTTCATAAAATC AGACA-3'), které má 3'-zakončení komplementární k 56r6 (SEQ.ID:28:) a extensi 5'-zakončení, které nese Ascl místo zkrácení 8-base. Složení PCR bylo podobné jako u prvního PCR s následujícími modifikacemi: 25 pg / μΙ na gelu rafinovaného fragmentu z prvního PCR bylo použito jako templát a bylo provedeno jen 7 cyklů.

Získaný produkt byl vysrážen, zkrácen s Acsl a Notl restrikčními enzymy a rafinován na gelu. Fragment byl klonován na modifikovaný pNEB193, pAN (Pmei místo bylo změněno na Notll místo), který byl otevřen s Acsl a Notl, zreagován se Shrimp alkalickou fosfatázou a po inaktivaci enzymů teplem byl rafinován na gelu. Čtyři z obdržených klonů byly sekvencovány, aby se ověřilo, že nesou UTR56 sekvenci.

Promotorova oblast byla amplifikována za použití brnb5 (SEQ.ID:29:) jako 5'primeru a jako 3’-primery byly použity RbSiB (SEQ.ID:20:) a RBNCO (SEQ.ID:21:) (viz shora). Podmínky PCR byly podobné těm, které byly použity pro amplifikaci celého genu a byly takto modifikovány: 5 ng / μΙ plasmidu DNA nesoucího klony (linearizováno s Ascl) bylo užito jako templáty, provedeno bylo pouze 10 cyklů.

• · • 4 • ·

Příklad 3

Srovnání různých konstitutivních a indukovatelných promotorů pro nadměrnou expresi transgenu (GUS) v tabáku a Brassica campestris

Klíčící sazenice byly zmrazený kapalným dusíkem a rozemlety. Proteiny byly extrahovány fofát-EDTA pufrem. Vzorky byly centrifugovány a supernatanty byly analyzovány za použití sady pro detekci aktivity β-glukuronidázy (Sigma). Koncentrace proteinu byla analyzována pomocí Protein assay reagent (Biorad) při aplikaci BSA jako standardu.

Tabulka 3

Specifické aktivity GUS s různými konstitutivními a indukovatelnými promotory v tabáku a Brassica campestris

Rostlina	Promotor	Specifická aktivita (nmol MU/min/mg rozpustného proteinu
Tabák	B. Rubisco typ I	7
B. campestris	Tepelný šok	44
B. campestris	Amyláza tepelného šoku	5
B. campestris	35S	28

Při sledování aktivity promotoru v klíčících sazenicích v sériích sedmi dnů byl zaznamenán exponenciální vzrůst specifické aktivity na příklad u Rubisco promotoru. Specifická aktivita Rubisco promotoru byla 0,25 čtvrtého dne, 0, 5 pátého dne, 1,6 šestého dne a 7 sedmého dne.

Analýza inhibitorů vývoje chloroplastu pro Rubisco protein a úrovní mRNA v klíčících semenech

Analýzy klíčících přirozených sazenic B. campestris ukázaly, že protein Rubisco malé subjednotky dosahuje nejvyšší koncentrace tři dny po iniciací klíčení a Rubisco malá podjednotka mRNA o den dříve. Zjistili jsme, že přidáním ♦ · ·· • 9 9 9 9

4 4 9 4 · ··· ·

317-3

streptomycinu, 100 mg / I do živného media 48 hodin po iniciaci klíčení, je možné potlačovat syntézu Rubisco proteinu, avšak úroveň mRNA zůstává konstantní. Protože Rubisco protein je hlavním proteinem určitých druhů klíčících děloh je prospěšné jeho syntézu potlačovat. Semena byla klíčena v provzdušňované vodě doplněné o streptomycin. Vzorky byly shromažďovány ve 12 hodinových intervalech. Hladiny proteinů byly analyzovány z SDS-PAGE gelu a úrovně mRNA při dot blot analýze.

Claims (23)

1. Patentové nároky

   1. Způsob založený na principu zdroje a spotřebiče pro konverzi zásobních rezerv v transgenních semenech na směs zahrnující jeden nebo více žádoucích genových produktů, produkovaných de novo syntézou během klíčení, kteréžto klíčení je zastaveno před poklesem uvedené de novo syntézy, a kterážto směs je získána s použitím nebo bez navazujícího zpracování, vyznačující se tím, že požadovaným genovým produktem je heterologický protein, přičemž se (a) kultivuje transgenní dvouděložná rostlina mající během klíčení vyvolatelný expresivní systém, aby byl zajištěn uložitelný vnitřní zdroj výchozího materiálu, který může být sklízen jako transgenní dvouděložná semena, kde uvedený vyvolatelný expresivní systém zahrnuje regulační sekvence, vybrané z regulačních sekvencí poskytujících vysoké úrovně exprese v dělohách klíčících semen;

   (b) uvedená transgenní dvouděložná semena zahrnující jeden nebo více expresivních systémů integrovaných do genomu rostliny se uvedou do styku s okolním mediem, aby vzklíčila, během kteréhožto klíčení je mobilizován vnitřní zdroj výchozího materiálu a expresivní systém je uveden do činnosti;

   (c) expresivní systém integrovaný v rostlinném genomu se použije pro de novo syntézu požadovaného jednoho nebo více heterologických proteinů z vnitřního zdroje výchozího materiálu mobilizovaného v kroku (b), aby poskytl směs zahrnující klíčící dvouděložná semena nebo sazenice.
2. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že vyvolatelný expresivní systém zahrnuje promotor poskytující vysoké úrovně exprese a de novo syntézy heterologických proteinů v dělohách klíčících dvouděložných semen.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že promotorem je promotor genu kódujícího Rubisco protein.
4. 4. Způsob založený na principu zdroje a spotřebiče pro konverzi zásobních rezerv v transgenních semenech na směs zahrnující jeden nebo více žádoucích genových produktů, produkovaných de novo syntézou během klíčení, kteréžto klíčení je zastaveno před poklesem uvedené de novo syntézy a kterážto směs je získána s

   99 0 » · · 0 »000

   0 0 0 0 9 900 9 · 0 • 0 090 09 090 · ·

   999 990« 900

   090 00 99 90 00 0999 použitím nebo bez navazujícího zpracování, vyznačující se tím, že požadovanými genovými produkty jsou heterologické proteiny, přičemž se (a) kultivuje transgenní dvouděložné rostlina mající během klíčení vyvolatelný expresivní systém, aby byl zajištěn uložitelný vnitřní zdroj výchozího materiálu, který může být sklízen jako transgenní dvouděložné semena, kde uvedený vyvolatelný expresivní systém zahrnuje regulační sekvence, vybrané z regulačních sekvencí poskytující vysoké úrovně exprese v dělohách klíčících semen;

   (b) uvedená transgenní dvouděložné semena, zahrnující jeden nebo více expresívních systémů integrovaných do genomu rostliny, se uvedou do styku s okolním mediem, aby klíčila, během kteréhožto klíčení je mobilizován vnitřní zdroj výchozího materiálu a expresivní systém je uveden do činnosti;

   (c) transgenní expresivní systém integrovaný v rostlinném genomu se použije pro de novo syntézu jednoho nebo více požadovaných heterologických proteinových produktů z vnitřního zdroje výchozího materiálu mobilizovaného v kroku (b), aby poskytl směs zahrnující klíčící dvouděložné semena nebo sazenice, kdy využití pro de novo syntézu je zajišťováno řízením snižování exprese endogenního genu ponecháním více volných aminokyselin pro transgenní expresi v klíčících semenech nebo sazenicích dvouděložných rostlin.
5. 5. Způsob podle nároku 4 vyznačující se tím, že řízené snižování genu je prováděno potlačením nebo antisense technologiemi.
6. 6. Způsob podle nároku 4 nebo 5 vyznačující se tím, že řízené snižovaný gen kóduje Rubisco protein.
7. 7. Způsob podle některého z nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že směs zahrnující nejméně jeden heterologický protein je uvedena do styku se substrátem zahrnujícím nejméně jednu sloučeninu, která může být transformována biochemickou reakcí katalyzovanou jedním nebo více řečenými heterologickými proteiny.

   35 ’♦·* *»· ·· ·«
8. 8. Způsob podle některého z nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že směs zahrnující nejméně jeden heterologický protein je uvedena do styku s reagentem zahrnujícím nejméně jednu sloučeninu schopnou modifikovat jeden nebo více heterologických proteinů.
9. 9. Způsob podle některého z nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že zdroj výchozího materiálu zahrnující transgenni dvouděložné semeno je případně sterilizován a klíčení se děje v podstatě za sterilních podmínek zajišťujících v podstatě sterilní produkční systém zdroj-spotřebič.
10. 10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9 vyznačující se tím, že promotor je v podstatě nečinný nebo může být utlumen, když je transgenni rostlina pěstována za polních podmínek.
11. 11. Způsob podle některého z nároků 1 až 10 vyznačující se tím, že okolní medium je případně pufrovaný vodný roztok.
12. 12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11 vyznačující se tím, že produkční systém zdroj-spotřebič je doplněn o nejméně jeden fysikální nebo chemický prostředek pro vyvolání klíčení.
13. 13. Způsob podle některého z nároků 1 až 12 vyznačující se tím, že produkční systém zdroj-spotřebič je doplněn o nejméně jeden vnější živný prostředek.
14. 14. Způsob podle některého z nároků 1 až 13 vyznačující se tím, že produkční systém zdroj-spotřebič je doplněn o nejméně jeden prostředek regulující zvýšení de novo syntézy žádaného/žádaných heterologického/ heterologických proteinu/proteinů.
15. 15. Způsob podle některého z nároků 1 až 14 vyznačující se tím, že produkční systém zdroj-spotřebič je doplněn o nejméně jeden prostředek regulující snížení de novo syntézy endogenního/endogenních genového/genových produktu/produktů produkovaného/produkovaných normálně během klíčení.

    4 ·* 4« »4 94 49 ·· · 4 • • 4 9 4 9 4 t 9 • • • 499 9 4 9 4 4 • • 4 9 9 9 9 4 999 94 *· 9 9 99 4494
16. 16. Způsob podle některého z nároků 1 až 15 vyznačující se tím, že klíčení je případně zastaveno nejméně jedním prostředkem, zahrnujícím zahřívání, sušení, drcení, separování, extrahování, lisování a filtrování a následným opětným získáním pomocí nebo bez následného zpracování nejméně jednoho z heterologických proteinů.
17. 17. Ze semen pocházející směs získatelná z dvouděložných semen vyznačující se tím, že směs je v podstatě kontaminantu prostou směsí obsahující jeden nebo více heterologických proteinů syntetizovaných v dělohách dvouděložného semene nebo sazenice.
18. 18. Ze semen pocházející směs podle nároku 17 vyznačující se tím, že směs obsahuje dále okolní medium.
19. 19. Ze semen pocházející směs podle některého z nároků 17 až 18 vyznačující se tím, že směs zahrnuje dále substrát nebo reagent obsahující alespoň jednu sloučeninu, která může být uvedenou směsí transformována, nebo která může modifikovat jeden z heterologických proteinů v uvedené směsi.
20. 20. Ze semen pocházející směs podle některého z nároků 17 až 19 vyznačující se tím, že směs je poskytována v sušené nebo navazujícím způsobem zpracované formě.
21. 21. Ze semen pocházející směs podle některého z nároků 17 až 20 vyznačující se tím, že směs obsahuje dále jednu nebo více vhodných ingrediencí pro formulaci.
22. 22. Expresivní systém použitelný v postupu podle některého z nároků 1 až 16 vyznačující se tím, že expresivní systém obsahuje jednu nebo více regulačních sekvencí získatelných z regulačních sekvencí zajišťujících v dělohách klíčících dvouděložných semen vysoké úrovně exprese.

    ····
23. 23. Způsob selekce regulačních sekvencí vhodných pro konstrukci S expresivního systému podle nároku 22 vyznačující se tím, že se

    a) izoluje celková RNA z děloh a listů dvouděložných rostlin;

    b) připraví se cDNA reversní transkripcí amplifikováním uvedené RNA s jedním mRNA specifickým primerem a primerem specifickým pro protein, který je v dělohách dvouděložných semen exprimován ve vysoké úrovni;

    c) shromáždí se klony zahrnující cDNA a nanesou na desky;

    d) srovnají se výsledky s klony získanými z RNA pocházející z listů a

    e) získají se klony zahrnující cDNA vykazujících zvýšenou aktivitu v klíčících dvouděložných semenech.