CZ2001916A3 - Použití antagonisty interakce mezi integrinem nesoucím alfa 4 podjednotku a jeho ligandem pro výrobu léku pro léčení mnohočetného myelomu a myelomem indukované resorpce kostí - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití antagonisty interakce mezi alfa 4 podjednotku nesoucím integrinem a jeho + * ligandem pro výrobu léku pro léčení mnohočetného myelomu a myelomem indukované resorpce kostí, tedy uvolňování faktorů resorbujících kost z myelomových buněk. Vynález se zejména týká antagonistů integrinu, např. antagonistů integrinu obsahujících alfa 4, kteří inhibují biologické účinky adheze, asociované s osídlením kostní dřeně myelomovými buňkami, jejich další přežívání závislé na integrinu a také na integrinu závislé uvolňování faktorů resorbujících kost, které vede k destrukci kosti pacienta s mnohočetným myelomem.

Dosavadní stav techniky

Mnohočetný myelom je druhá nej četnější hematologická maligní nemoc s 15 000 nově diagnostikovanými případy každý -r . rok a 30 000 až 40 0000 pacienty ročně v USA (Mundy a Bertolini, 1986). 80 % pacientů trpí devastující osteolytickou destrukcí kostí způsobenou zvýšenou tvorbou a aktivitou osteoklastů (OCL) (Mundy a Bertolini, 1986). Tato destrukce kostí způsobuje nesnesitelnou bolest kostí, patologické fraktury, kompresi páteře a život ohrožující hyperkalcémii. Jelikož mnohočetný myelom nemůže být léčen standardní chemoterapií nebo transplantací kmenových buněk (Attal et al.,

1996) a je spojen s vysokou nemocností a potenciální mortalitou, jsou životně důležité takové léčebné strategie, které brání růstu samotných myelomů a zejména osteólytické destrukci kostí, ke které u ^těchto pacientů dochází.

Avšak patologické mechanismy, které jsou zodpovědné za zvýšenou aktivitu osteoklastů u pacientů s mnohočetným myelomem, jsou dosud neznámé (Mundy, 1998). Objevují se různé profily kostních lézí. Někdy se u pacientů vyvinou diskrétní osteolytické léze, které jsou spojeny se ’ solitérními plasmacytomy. Někteří pacienti mají difúzní osteopenii, která maskuje výskyt osteoporózy, a je způsobena tím, že myelomové buňky se difúzně rozšířily páteří. U většiny pacientů se objevují jsou četné diskrétní lytické léze v sousedství hnízd myelomových buněk.

Hyperkalcémie· se objevuje jako důsledek destrukce kostí asi u jedné třetiny pacientů s pokročilou nemocí. Zřídka pacienti s myelomem nemívají lytické léze nebo ztráty kostí, a spíše u nich dochází ke zvýšení tvorby nové kosti v okolí hnízd myelomových buněk. Tato vzácná.· situace se nazývá osteosklerotický myelom.

Osteolytické kostní léze jsou zdaleka nejrozšířenějším kosterním projevem u pacientů s myelomem (Mundy 1998). Ačkoliv přesný molekulární mechanismus zůstává nejasný, pozorování za posledních 15 let vedly k závěrům, že:

1) Mechanismus, kterým u myelomu dochází k destrukci kosti, je zprostředkován osteoklasty, což jsou normální buňky resorbující kost.

2) Osteoklasty se akumulují na. kost resorbujících površích přilehlých k shluku myelomových buněk a zdá se, že mechanismus, kterým jsou stimulovány osteoklasty v myelomu, je lokální mechanismus.

• · · · · · · · · · · « · · • · · · · · « · · · • · , · · e · · ♦ • ««· · ·«· ♦ · • · · · · e - · · · · •·« ·· · · ·· ·· ···

3) Již mnoho let je známo, že kultury lidských myelomových buněk in vitro produkuji několik faktorů stimulujících osteoklasty, jako jsou např. lymfotoxin-alfa (LT-a), interleukin-1 (IL-1), protein příbuzný parathormonu (PTHrP) a interleukin-6 (IL-6).

4) Hyperkalcémie se objevuje asi u jedné třetiny pacientů někdy v průběhu nemoci, a je vždy spojena s výrazným zvýšením resorpce kosti a velmi často také s výrazným poškození glomerulárni filtrace.

5) Zvýšení resorpce kosti osteoklasty v myelomu je často spojeno se zvýšeným poškozením funkce osteoblastů. Aktivita alkalické fosfatázy v séru je snížena nebo je normální, na rozdíl od pacientů s jinými typy osteolytického onemocnění kostí, a radionuklidové vyšetření nevykazuje známky zvýšeného příjmu, což ukazuje na narušenou reakci osteoblastů na zvýšení.resorpce kosti.

Ačkoliv různé mediátory, zmíněné výše, se účastní stimulace aktivity osteoklastů u pacientů s mnohočetným myelomem, dosavadní publikace o faktorech produkovaných myelomovými buňkami nebyly konzistentní, a některé studie nebyly průkazné vzhledem k přítomnosti jiných kontaminujících typů buněk, · včetně stromatálních buněk a makrofágů, v populaci myelomových buněk. Hlavním myelomovým růstovým faktorem je IL-6, který podporuje růst několik myelomových buněčných linií a myelomových buněk čerstvě izolovaných z pacienta (Bataille et al., 1989). Produkce IL-6 může být detekována u asi 40 % čerstvě izolovaných myelomových buněk užitím metody PCR, ale pouze Γ ze 150 vyšetřovaných pacientů měl produkci IL-6 detekovatelnou imunocytochemickým testem nebo testem ELISA (Epstein 1992). IL-6 receptory byly detekovány pouze u 6 ze 13 vzorků z pacientů s mnohočetným myelomem Bataille et al,, 1992). Navíc zralé myelomové buňky mají podle publikací minimální proliferační reakci na IL-6.

Interleukin-1.1 (IL—11) má na plastocytomy

IL-6, avšak dosud nikdo neprokázal, že produkují interleukin-11. Bataille a ukázali, že 5 perfúze pacientů s účinky podobné myelomové buňky spolupracovníci (1995) refraktorním myelomem protilátkou proti IL-β snížily počet těchto pacientů. IL-1 je . extrémně způsobuj.e 'hyperka.lcémii na zvířecích resorpce modelech kosti, které bez selhání tomu hyperkalcémie se bez selhání ledvin.

purifikováných produkce IL-1 k domněnce, že myelomových buněk pouze účinné činidlo

1989) . Naproti ledvin (Boyce et al., vyskytuje zřídka u pacientů s myelomem Důležitěj ší myelomových buněk a jen j iné však' nebyl vzácná produkce kontaminuj ící zdrojem IL-1 a makrofágy, by mohly být

Podobně. LT-a je produkován, většinou je, že u detekována

TNF-a, což buňky, jako

TNF-a (Epstein buněčných linii (Bataille et al., 1995) buňkami in vivo (Alsina et myelomovými

IL-1, TNF-a, formu M-CSF, nezpůsobuj e v kulturách

Takže vysoce žádná vedlo např'.

lidských myelomových ale není produkován al., 1996) . Kromě

LT-a a IL-6 myelomové buňky který je biologicky aktivní, hyperklacémii lidské kostní role žádného nemoci kostí u pacientů produkují zkrácenou avšak samotný.M-CSF ani neindukuje dřeně (MacDonald et tvorbu al.

osteoklastů z těchto faktorů s myelomem nebyla in vivo, takže známé cytokiny zjevně za celkovou resorpcí kostí pozorovanou

Role interakcí adhezivních molekul při

Anderson a spolupracovníci byly osteolytické dosud prokázána zodpovědné samy nej sou u těchto pacientů.

myelomové .nemoci kosti první skupinou, která prokázal důležitost adhezivních interakcí mezi myelomovými buňkami a buňkami v mikroprostředi dřeně, jak pro růst myelomových buněk tak pro rozvoj osteolytické nemoci kosti.

Buňky mnohočetného myelomu exprimují na svém povrchu adhezní molekuly, CD29 (VLA-4), LFA-1 a CD44 (Chauhan et al., 1995). Tito pracovníci předpokládali, že myelomové buňky jsou lokalizovány v dřeni prostřednictvím specifických adhezních interakcí mezi proteiny extracelulární matrix a stromatálními buňkami dřeně. Dále ukázali, že adheze buněk mnohočetného myelomu k stromálním buňkám spouštěla sekreci·. IL-6 jak u normálních buněk stromatu tak buněk myelomových a zvyšovala růst nádorových buněk, zprostředkovaný IL-6. Avšak protilátky proti CD29, LFA-1 nebo CD44 nesnížily produkci IL-6 stromatálními buňkami dřeně v reakci na myelomové buňky, což předpokládalo, že jiná interakce ligand-receptor spouští sekreci IL-6 stromatálnich buněk dřeně navázaných na myelomové buňky. Pouhá identifikace možné adhezní metabolické dráhy neznamená, že tato dráha je důležitá. V tomto případě se ukázalo, že žádná z domnělých drah nehrála roli v produkci IL-6.

Vanderkerken et al. (1997) vyšetřil také fenotypový adhezní profil myších buněk 5T2 a 5T33 myelomových buněk na modelu myšího myelomu. tyto výzkumy ukázaly, že tyto buněčné linie exprimovaly VLA-4, VLA-5, LFA-1 a CD44, a vedly k předpokladu, že tyto faktory jsou důležité.k tomu, aby se myelomové buňky navázaly na stromatální buňky dřeně.

Nicméně i přes značné pokroky v laboratorním zkoumáni, základní mechanismy zvýšené osteoklastické destrukce kostí při myelomu zůstaly nevyjasněny. To odráží také nesnadnou' situaci při interpretaci údajů- o adhezivních interakcích získaných in vitro pro situaci in vivo. tak např. mnohé studie in vitro ukazovaly na účast jak integrinu VLA-4 tak· integrinu LFA-1 při adhezi hematopoetických kmenových buněk

Φ φ · φ φ · ΦΦΦΦ φ φ φφφ φφφ • ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ φ φφφ ·* · φ φφ' φφ «φφ

ΦΦΦΦ ·· ·· na stromatální buňky dřeně (přehled viz Papaynnapoulou a Nakamoto, 1993). Tyto in vitro údaje by vedly k predikci toho, že obě metabolické dráhy, pokud by byly blokovány in vivo, by vedly k periferalizaci hematopoetických kmenových buněk z dřeně do periferní krve. Nyní na studii s primáty se ukázalo, že zatímco monoklonální protilátka (mAb) proti VLA-4 skutečně účinně periferalizovala kmenové buňky, monoklonální protilátka· proti beta2-integrinovému řetězci LFA-1 byla bez účinku, i přes zvýšený počet neutrofilů, ukazující aktivitu protilátky (Papaynnapoulou a Nakamoto, 1993) . Tyto údaje mj. také ukázaly, že na. základě výsledků získaných in vitro se nedala předvídat situace in vivo.

Je třeba poznamenat, že role integrinu VLA-4 byla studována v metastázách mnohých nádorů, včetně leukémií jako je lymfom., . s rozdílnými, výsledky. Transfekce lidského alfa-4 řetězce do buněk ovarií čínského křečka (CHO) vedla k expresi VLA-4, a poskytla těmto buňkám schopnost migrovat do kostní dřeně in vivo, přičemž tento jev byl inhibován protilátkami proti VLA-4 (Matsuura et al., 1996). Naproti tomu transfekce lymfomových buněk VLA-4 vedla k silné inhibici metastáz v játrech, plicích a ledvinách, a byla bez účinku na osidlování a proliferaci kostní dřeně (Gosslar et al., 1996). Navíc exprese VLA-4 na silně metastazujících buňkách myšího melanomu inhibovala vytváření plicních metastáz in vivo (Qian et al., 1994) a nepredisponovala melanom ,k metastázám v kostní dřeni.

Lze tedy shrnout, že na základě studií adhezivnich drah in vitro není jasné, jaká je relevance predikce pro situaci in vivo. Dokonce ani ze studií in vitro nejsou konzistentní údaje. Hlavním důvodem překvapivé nekonzistence, údajů je zřejmě to, že současné dostupné zvířecí modely myelomu nejsou • · · · · · · φφφφ' · · · φφ · φ φ · · ♦ φφ φφφφ φφφ φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ βφ φ dostatečně dobré pro predikci nemoci u lidí. V případě mnohočetného myelomu, lidské a myší meyelomové buněčné linie, které mohou být kultivovány in vitro, jsou jen velmi zřídka spojeny s destrukcí kostí in vivo (Mundy 1998).

Je tedy velmi potřebné identifikovat sloučeniny nebo antagonisty, kteří inhibují produkci těchto faktorů resorpce kosti, a tím mohou zastavit destrukci kosti a zlepšit kvalitu života pacientů trpících myelomem.

Podstata vynálezu

Byl použit nově vyvinutý model mnohočetného myelomu, ve kterém se u myši vyvíjejí závažné osteolýze, se. všemi základními příznaky téže nemoci u lidí (Garret 1997). Pomocí této buněčné linie a zvířecího modelu původci zjistili, že inhibice dráhy alfa 4 integrin/ligand alfa 4 integrinu in vivo vede ke snížení schopnosti buněk mnohočetného myelomu proliferovat a/nebo přežívat. Původci dále ukázali, . že kontakty buňka-buňka mezi myelomovými buňkami a stromatickými buňkami kostní dřeně prostřednictvím interakce VLA-4/VCAM-1 je nutná pro zvýšení produkce aktivity, která stimuluje resorpci kosti osteoklasty v mikroprostředí kosti in vivo.

Původci předpokládali, že tato interakce je kritická pro osídlení kompartmentu kostní dřeně myelomovými buňkami, a také pro další přežívání a růst myelomových buněk, áž po progresi myelomem indukované osteolýzy.- Tento předpoklad byl testován na zvířecím modelu a bylo zjištěno, že. v podmínkách in vivo antagonista integrinu VLA-4 obsahujícího podjednotkualfa 4 silně inhibuje produkci protilátek typu IgG2b. Tento isotyp je shodný s isotypem produkovaným buněčnou linií 5TGM1 a je ve kterémkoliv okamžiku přesnou náhradou řady · · · · 4 · ···4 ·· • · · · · · ·

4 4 44 44 · · 4 myelomových buněk v kompartmentu kostní dřeně. takže blokování dráhy VLA-4 významně inhibuje produkci IgG2b a tudíž hladinu zátěže myelomovými buňkami.

Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká léčení mnohočetnéhó myelomu, který spočívá v tom, že se pacientovi podává terapeuticky účinné množství přípravku obsahujícího antagonistu interakce mezi integrinem s podjednotkou alfa 4 (např. VLA-4) a ligandem tohoto integrinu (např. VCAM-1). Tímto antagonistou je např. činidlo vázající alfa 4 integrin nebo činidlo vázající ligand alfa 4 integrinu. K výhodným činidlům patří homology protilátek antí-VLA-4 nebo anti-alfa

4-beta 7 (humánní protilátky, chimérické a humanizované protilátky a jejich fragmenty), homology protilátek antiVCAM-1 (humánní protilátky, chimérické a humanizované protilátky a jejich fragmenty) a malé molekuly působící jako inhibitory interakce integrinů obsahujících alfa 4 podjednotku s jejich ligandy. Přípravek může být podáván v takových dávkách, aby poskytly dávku 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti. Zvláště výhodná činidla jsou antagonisté interakce a) společně jak VLA-4 tak alfa 4-beta 7 s příslušnými ligandy alfa 4, b) pouze VLA-4 s ligandy alfa 4, nebo c) pouze s ligandy alfa 4.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká inhibice resorpce kosti spojené s nádorovým onemocněním kostní dřeně, která spočívá v podávání savci s daným nádorem antagonisty interakce mezi integrinem s podjednotkou alfa 4, jako je např. VLA-4, a ligandem tohoto integrinu, j ako je např.

VCAM-1) v množství, které je účinné k tomu, aby došlo k inhibici resorpce kosti.

Tímto antagonistou je např.

činidlo vázající alfa 4 integrin, jako je např. činidlo vázající VLA-4, nebo činidlo vázající ligand alfa 4 integrinu, jako je např. činidlo vázající VCAM-1. K výhodným..

• · · ·	. · · · ♦ · ·	• ·	•
• ♦	• · ·	* ·	• 9
• ·	• · ·	• ·	•
♦ ♦ ·	* · ♦	9 9 ·	•
• · Φ ·	*· ··	« ·	• ·

činidlům patři homology protilátek anti-VLA-4 nebo anti-alfa 4-beta 7 (humánní protilátky,. chimérické a humanizované protilátky a jejich fragmenty), homology protilátek antiVCAM-1 (humánní protilátky, chimérické a humanizované protilátky a jejich fragmenty) a malé molekuly působící jako inhibitory interakce integrinů obsahujících alfa 4 podjednotku s jejich ligandy. Přípravek může být podáván v takových dávkách, aby poskytly dávku 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti.

Ještě další provedení vynálezu se týká léčení subjektu, který trpí nemocí . charakteristickou přítomností osteoklástogeneze, které spočívá v tom, že se subjektu podává antagonista interakce mezi integrinem s podjednotkou alfa 4 a ligandem tohoto integrinů v množství, které je účinné k tomu, aby došlo k potlačení osteoklástogeneze. Podobně jako v předchozím antagonistou' je např. činidlo vázající alfa 4 integrin nebo činidlo vázající ligánd alfa 4 integrinů. K výhodným činidlům patří homology protilátek anti-VLA-4 nebo anti-alfa 4-beta 7 (humánní protilátky, chimérické a humanizované protilátky a jejich fragmenty), homology protilátek anti-VCAM-1 (humánní protilátky, chimérické a humanizované protilátky a jejich fragmenty) a malé molekuly působící jako inhibitory interakce integrinů obsahujících alfa 4 podjednotku s jejich ligandy (např. . interakce VLA-4/VCAM-1). Přípravek může být podáván v takových dávkách, aby poskytly dávku 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti. Pokud není uvedeno jinak, citované publikace jsou formou odkazu součástí předkládané přihlášky.

Φ ·Φ·· ΦΦ φ Φ φ · Φ· • Φ Φ ΦΦ Φ Φ · Φ

ΦΦΦ Φ · Φ · Φ

ΦΦΦ ΦΦ ΦΦ β· Φ· ΦΦΦ

Popis obrázků

Obr. 1

Účinek neutralizačních protilátek na vytváření TRAP-pozitivních multinukleárních buněk podobných OC ve společných kulturách (ko-kulturách) buněk 5TGM1 a buněk kostní dřeně

Směs buněk 5TGM1 (le3) a buněk kostní dřeně (le6) v suspenzi byla vyseta na 48jamkové kultivační destičky a kultivována buďto bez a nebo s přídavkem 10 μς/πιΐ protilátky anti-VCAM-1 (VCAM-1 Ab) , protilátky anti-alfa 4 beta 1 protilátky anti-ICAM-1 (ICAM-1 Ab) nebo IgG potkana j akožto byly kultury kontrolní protilátky.

fixovány a bylo

Po 6denní stanovené kultivaci .

množství multinukleárních buněk podobných OC protilátky VCAM-1 Ab pozitivních tak anti-alfa na TRAP

4-beta 1 inhibovaly vytváření buněk TRAP(+)MNC, zatímco protilátka ICAM-1 Ab byla bez účinku. Údaje jsou uvedeny jako průměrné hodnoty ± směrodatná odchylka (S.E.) pro n=3. * označuje statisticky významný rozdíl ve .srovnání s IgG kontrolou.

Obr. 2

Účinek 5TGM1 a ST2 kondiciovaného média na resorpci kosti v orgánové kultuře dlouhých kostí z fétu potkana.

Kondiciovaná média (48 hodin) získaná ze samotné kultury ST2, samotně kultury 5TGM1 a společné kultury ST2 a 5TGM1 byla restována na kost resorbující aktivitu v orgánových kulturách dlouhých kostí z fétu potkana značených ^4SCa. Dlouhé kosti z fétu potkana značené ⁴⁵Ca byly kultivovány v přítomnosti kondiciovaného (40 % objem.) nebo, kontrolního média po dobu 12 0 hodin. Hodnoty jsou uvedeny jako procenta zvýšení uvolňování kalcia ve srovnání s kontrolním médiem.

Uvolňování z kondiciovaného média stromatických buněk ST2 je ukázáno jako. prázdný (bílý) sloupec, uvolňováni z kondiciovaného média ' 5TGM1 je znázorněno šrafovaným sloupečkem. Uvolňováni z kondiciovaného média ze společné kultury 5TGM1 a ST2 je znázorněno jako plné (černé) sloupce. Data jsou uvedena jako průměr ± S.E. (střední chyba) pro n=4. * znamená statisticky významně odlišnou hodnotu od samotné ST2, ** znamená statisticky významně odlišnou hodnotu od samotné 5TGM1.

Účinek rekombinantního rozpustného VCAM-1 (sVCAM-1) . na produkci osteoklastogenní aktivity u buněk 5TGM1

Kondiciované médium bylo sklizeno z

5TGM1 v přítomnosti či absenci sVCAM-1 (1 buněčných x 10‘³ až 1 kultur x 10'⁷ mol/1) po 24 hodin. Osteoklastogenní aktivita těchto kondiciováných médií byla testována na kulturách buněk z kostní dřeně myši.

Buňky kostní dřeně (le6/jamka) byly naneseny na 48jamkové kondiciovaného média destičky a kultivovány v přítomnosti (šrafované sloupce) nebo kontrolního média (IMDM) obsahujícího stejnou koncentraci sVCAM-1 (prázdné sloupce). Po 6 dnech byly kultury fixovány a byl stanoven počet . TRAP-pozitivních mnohojaderných buněk podobných OC (TRAP+MNC). Kondiciované médium z buněk 5TGM1 ošetřené 1 x 10-7 M sVCAM-1 zvýšilo tvorbu TRAP(+)MNC. Data jsou uvedena jako průměr + S.E. (střední chyba) pro n=3. * znamená statisticky významně odlišnou hodnotu od kontroly.

I • ···· ·· ···· ·Φ · ····'♦ · · · ·· • ♦ · · · ♦ · · · · ··♦ ·· ·· «'· ·· ···

Obr. 4

Účinek monoklonálni protilátky (mAb) PS2 proti VLA-4 na zvýšení IgG2b v séru myši nesoucí 5TGM1

Myším bylo injikováno le5 buněk 5TGM1, aby osídlily kostní dřeň. Pak byly myši rozděleny do dvou skupin po třech, kdy první skupina sloužila jako kontrola a druhá skupina byla 8., 11., 14., 17. a 20 den ošetřena 80 gg mAb PS/2 (přibližně 4 mg/kg). Týdně, od 1. do 6. týdne byly měřeny hladiny IgG2b, isotypové protilátky produkované myelomovými buňkami 5TGM1. Ošetření protilátkami významně inhibovalo tvorbu IgG2b, což ukazuje na to, že došlo k inhibici přežívání a růstu myelomových buněk in vivo. .

Obr .5

Účinek monoklonálni protilátky (mAb) M/K-27 proti. VCAM-1 na hladinu IgG2 v séru myši nesoucí 5TGM1

Myším byly injikovány buňky 5TGM1 stejně jak bylo popsáno u obr. 4, aby osídlily kostní dřeň. Pak byly myši rozděleny sloužila do skupin po čtyřech nebo pěti, kdy první skupina kontrola, (prázdné čtverečky) ošetřena 80 j ako byla skupina kosočtverečky.) byla ošetřena Byly měřeny myelomovými inhibovalo profylakticky a 160 gg mAB (4 terapeuticky a 8 mg/kg) a

160 hladiny buňkami

IgG2b,

5TGM1.

tvorbu k inhibici přežívání

IgG2b, .

a růstu a druhá/třetí gg (prázdné čtvrtá skupina gg mAb (trojúhelníčky) . isotypové protilátky produkované Ošetření protilátkami významně což 'ukazuje na to, že' došlo myelomových buněk in vivo.

Obr. 6 .

Účinek protilátky proti alfa 4-integrinu přežívání myší nesoucích mnohočetný myelom

Předkládaný vynález se týká také léčeni a prevence mnohočetného myelomu. Zvláště se týká použiti antagonistů interakce mezi integrinem obsahujícím podjednotku alfa 4 a ligandem tohoto integrinu pro léčení mnohočetného myelomu. termín mnohočetný myelom v tomto popisu označuje nemoc, kterou trpí neoplazický kmen a sice v různém jedinec s neoplázií je tvořen buňkami stadiu vývoje u plazmatických buněk, kdy plazmatické buněčné řady, různých pacientů (Mundy

Alfa beta buněčném .

molekuly, povrchu, které se integrin je receptor, pro VCAM-1, fibronektin na něj váží nebo s ním lokalizovaný na

a. možná i jiné jinak inteřagují.

V tomto ohledu molekuly, které se váží na integrin obsahující podjednotku alfa 4 nebo s ním jinak inteřagují, jsou obecně označovány alfa 4 ligandy., termín a4bl integrin (a. také zaměnitelně žívaná, označení \VLA-4 nebo . a4bl). označuje polypeptid, který je schopen vázat VCAM-1 a některé proteiny extracelulární matrix, zejména fibronektin, nebo jeho homology a fragmenty, ačkoliv odborníkovi je známo, že mohou existovat i jiné ligandy VLA-4a lze je analyzovat konvenčními metodami.

Nicméně je známo, že podjednotka alfa 4 asociuje kromě podjednotky betal ještě s jinými podjednotkami beta, takže termín alfa 4 integrin může být definován tak, že zahrnuje takové integriny, jejich podjednotka alfa 4 asociuje s podjednotkou beta jednoho či druhého typu. Dalším příkladem alfa 4 integrinu je alfa 4 beta 7 (R. Lobb a M. Hemler, 1994). Termín alfa 4 integrin(y) užívaný v předkládaném popisu označuje tedy VLA-4 a také integriny, které obsahují podjednotku beta 1, beta 7 nebo jakoukoliv ' jinou beta podj ednotku.

• ···· • ·

Antagonisté požití ve , vynálezu nejsou nijak omezeni na určitý typ nebo strukturu molekuly, takže podle vynálezu lze užit jakékoliv činidlo, které je schopné vázat se na integrin obsahující podjednotku alfa 4 jako je např. VLA-4 na povrchu buněk nesoucích VLA-4 a/nebo integrin alfa 4 beta 7 na povrchu buněk nesoucích integrin alfa 4 beta 7 (viz Lobb a Hemler, J. Clin. Invest. 94: 1722-1728, 1994) a/nebo případně na jejich ligandy jako je např. VCAM-1 nebo MadCAM na povrchu buněk nesoucích VCAM-1 a MadCAM, a které účinně blokuje nebo pokrývá VLA-4 (nebo alfa 4 beta 7) nebo VCAM-1 (nebo MadCam) (tj . činidlo vázající alfa 4 integrin nebo činidlo vázající ligand alfa 4 integrinu) a které je považováno za ekvivalent antagonistů použitých v příkladech.

Antagonisťa . integrinu . zahrnuje tedy jakoukoliv sloučeninu, která zabraňuje tomu, aby se alfa 4 integriny navázaly s ligandy . a/nebo. . receptory alfa 4 integrinu. V tomto smyslu jsou užitečné protilátky proti integrinu nebo proteiny obsahující homology protilátek (diskutovány dále) a další molekuly jako např. rozpustné proteinové, ligandy integrinu. K rozpustným formám proteinových ligandu alfa 4 integrinu patří VCAM-1, kolagenové peptidy, fúzní proteiny s VCAM-1 nebo bifunkční fúzní protein nebo bifunkční fúzní proteiny VCAM-1/Ig. TAk např. může být podávána rozpustná forma ligandu pro alfa 4 integrin nebo její fragment, aby vázala integrin a zejména kompetovala o vazebná místa pro integrin na povrchu buněk, což vede k podobnému účinku jako podání ' antagonisty jako je např. anti-alfa 4- integrin (tj. protilátky alfa 4 beta 7 nebo VLA-4). Zejména rozpustné mutanty alfa 4 integrinu, která váží ligandy alfa 4 integrinu, ale přitom nevyvolávají na integrinu závislou signalizaci, jsou předmětem předkládaného vynálezu. Takové mutanty působí jako kompetitivní inhibitory integrinových proteinů' divokého typu a jsou tedy považovány za antagonisty. Další antagonisté použití ve vynálezu jsou malé molekuly jak budou definovány dále.

Předkládaný vynález zahrnuje také činidla, která antagonizují působení více než jednoho alfa 4 integrinu, jako je např. malá molekula nebo homolog protilátky, které jsou antagonisty několika alfa 4 integrinu jako je např. VLA-4 a alfa 4 beta 7 nebo jiné kombinace alfa 4 integrinů.· Vynález zahrnuje také použití kombinací různých molekul jako je např. kombinace antagonizující působeni více než jednoho alfa 4 integrinu, kdy se užívá několik malých molekul nebo homologů protilátek, které v kombinaci antagonizují alfa 4 integriny VLA-4 a alfa 4 beta 7 nebo jinou kombinaci integrinů.

Někteří antagonisté integrinů mohou být fúzováni nebo jiným způsobem konjugováni např. s homology protilátek jako je např. imunoglobuli.n nebo jeho fragment, a nejsou nijak omezeny určitou strukturou integrinu nebo jeho ligandu nebo jiné molekuly. Tudíž podle vynálezu je za ekvivalent antagonistů použitých v příkladech . považováno jakékoliv činidlo schopné vytvářet fúzní protein (definován dále) a schopné vázat se na ligandy alfa 4 integrinu a účinně blokovat nebo potáhnout alfa 4 beta 7 integrin nebo VLA-4.

Termín antagonista interakce ligandu alfa.4 integrinu/alfa 4 integrinu podle vynálezu označuje činidlo, tj. polypeptid nebo jinou molekulu, které může inhibovat nebo blokovat alfa 4 ligand (např. VCAM-1) a/nebo alfa 4 integrin (např. alfa 4 beta 7 nebo VLA-4) zprostředkovanou vazbu nebo jiným způsobem modulovat funkci alfa 4 integrinu a/nebo· alfa 4 ligandu, např. inhibovat nebo blokovat signální transdukci alfa 4 integrinu zprostředkovanou alfa 4 ligandem nebo signální transdukci alfa 4 ligandu zprostředkovanou alfa 4 ligandem, a které je schopno účinně léčit mnohočetný • ·· · ·· ···· 99 • · · · · · * • · · · · ····«

9 9 9 9 9 9· 9 ·· ··· 99 99 99 99999 myelom, výhodně stejným způsobem jako protilátky anti-alfa 4 integrin.

Specificky antagonistou interakce VCAM-l/VLA-4 je činidlo, které má jednu nebo více z následujících vlastností

1) potahuje nebo se váže na VLA-4 na .povrchu buněk nesoucích VLA-4 (např. myelomových buněk) š dostatečnou specificitou k tomu, aby došlo k inhibici interakce VLA-4 ligand/VLA-4, např. interakce VCAM-l/VLA-4 mezi buňkami stromatu kosti a myelomovými buňkami,

2) potahuje nebo se váže na VLA-4 na povrchu buněk nesoucích VLA-4 (např. myelomových buněk) s dostatečnou specificitou k tomu, aby došlo k modifikaci, .výhodně inhibici, signální transdukce zprostředkované VLA-4, např. signální transdukce zprostředkované VLA-4/VCAM-1,

3) potahuje nebo se váže na VLA-4-ligand (např. VCAM-1) na buňkách stromatu kosti s dostatečnou specificitou k tomu, aby došlo k inhibici interakce VCAM-l/VLA-4 a

4) potahuje nebo se váže na VLA-4-ligand (např. VCAM-1) na buňkách stromatu kosti s dostatečnou specificitou k tomu, aby došlo došlo k modifikaci, výhodně inhibici, signální transdukce zprostředkované VLA-4, např. signální transdukce,zprostředkované VLA-4/VCAM-1.

Ve výhodném provedeni má antagonista jednu nebo obě vlastnosti z výše uvedených bodů 1 a 2. V jiném výhodném provedení má antagonista jednu nebo obě vlastnosti z bodu 3 a 4. Kromě toho může být pacientovi podáván více než jeden antagonista, např. činidlo' vázající VLA-4 může být kombinováno s činidlem vázajícím VCAM-1.

TAk např. protilátky nebo homology protilátek (budou ještě popsány dále) jsou užitečné podle vynálezu, a také rozpustné formy přírodních vazebných proteinů pro VLA-4 a VCAM-1.· Rozpustné formy přírodních vazebných proteinů pro • ·»·· 00 00 0 0 0 0 ' · 0 0 · · 0 0 • · · ·· 0 0 0 0 0 ··· ·· ·· ·· ·· 000

VLA-4 zahrnují peptidy VCAM-1, fúzní proteiny s VCAM-1., bifunkční fúzní proteiny VCAM-l/Ig, fibronektin, fibronektin s alternativně sestřižený spojovací fragment jiného typu než typu III, a fibronektinové peptidy obsahující aminokyselin sekvenci EILDV nebo podobnou konzervativně substituovanou aminokyselinovou sekvenci. Rozpustné formy přírodních vazebných proteinů pro VCAM-1 zahrnují peptidy VLA-4, fúzní proteiny s VLA-4, bifunkční fúzní proteiny VLA-4/Ig a další. Termíny rozpustné peptidy VLA-4 a rozpustné peptidy VCAM-1 označují polypeptidy, které nejsou schopny samy ukotvení v membráně. K takovým rozpustným polypeptidům patří např. polypeptidy VCAM-1 nebo VLA-4 postrádající dostatečnou část transmembránové domény k ukotvení polypeptidu nebo jsou modifikovány tak,' že transmembránová doména je nefunkční. Tato vazebná činidla působí tak, že kompetují s vazebnými proteiny na povrchu buněk pro VLA-4 nebo jiným způsobem mění funkci VLA-4. NApř. rozpustná forma VCAM-1 (viz Osborn et al., 1989, Cell 59: 1203-1211) nebo její fragment se mohou podávat, aby vázaly VLA-4 a výhodně kompetovaly o VLA-4 vazebné místo na myelomových buňkách, což vede k účinku podobnému podávání antagonistů jako jsou malé molekuly nebo protilátky VLA-4.

V jiném příkladu je VCAM-1 nebo jeho fragment, schopná vázat s.e na VLA-4 na povrchu myelomových -buněk nesoucích VLA-4, např. tedy fragment dvěN-koncové domény VCAM-1 může být fúzován s druhým peptidem, např. s peptidem, který zvyšuje rozpustnost nebo in vivo poločas části VCAM-1 fúzního peptidů.· Druhý peptid může být fragment rozpustného peptidů, výhodně lidského peptidů, nejvýhodněji plazmatického proteinu, nebo člen superrodiny imunoglobulinů. Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je druhý peptid IgG nebo jeho část nebo fragment, např. konstantní úsek, těžkého řetězce lidského IgG, a obsahuje alespoň kloubový úsek, a CH2 a CH3 domény.

Dalšími antagonisty užitečnými pode vynálezu (bez omezení) sou činidla, která napodobují působení peptidů (tj. jsou to organické molekuly nazývané malé molekuly) a jsou sphopná narušit interakci alfa 4 integrin/alfa 4 ligand např. blokováním VLA-4 vazbou na VLA-4 receptory na povrchu buněk nebo blokováním VCAM-1 vazbou na VCAM-1 receptory na povrchu buněk. Tyto malé molekuly jsou samotné malé peptidy nebo jsou to větší organické sloučeniny obsahující peptid nebo jsou organické sloučeniny jiné než peptidy. Termín malá molekula v předkládaném popisu nezahrnuje protilátku nebo homolog protilátky. Ačkoliv molekulová hmotnost malých molekul je obvykle menší než 2000, tato hodnota ve vynálezu nepředstavuje žádný horní limit molekulové hmotnosti malých molekul.

Tak např. mohou být užity malé molekuly· jako jsou oligosacharidy, které napodobují vazebnou doménu ligandu VLA4 a pasují k receptorové doméně VLA-4 (viz J.J. Devlin et al., Science 249: 400-406,- 1990, J.K. Scott, G.P. Smith, Science 249: 386-390, 1990 a Patent USA 4,833,092 (Geysen) , které jsou vloženy formou odkazu). TAké mohou být užity malé molekuly, které napodobují vazebnou doménu ligandu VCAM-1 a pasují k receptorové doméně VCAM-1.

. Příklady dalších molekul užitečných podle vynálezu lze najít v publikaci Komoriya et al. (The Minimal Essential Sequence for MAjor Cell type-Specific Adhesion Site (CS1) ithin the Alternatively Spliced type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine - Aspartic Acid - Valine, J. Biol. Chem. 266/23): 15075-79, 1991). Byla identifikována minimální aktivní aminokyselinové sekvence nezbytná k vazbě VLA-4 a na základě aminokyselinové sekvence úseku CS-1

4444 • 4.

• 4 ···· • 4 · ·· · 4 444 • 4 4 4 · 4 44 • 4 4 4 · 4 4 4 4« • 44 «·«« 444 • 44 44 44 44 44444 (vazebná doména VLA-4) byla syntetizována řada překrývajících se peptidů z určitého druhu fibronektinu. Byl identifikován peptid obsahující 8 aminokyselin, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-ProSer-Thr a také dva menší překrývající se pentapeptidy GluIle-Leu-Asp-Val a Leu-Asp-Val-Pro-Ser, které mají inhibiční vlastnosti vzhledem k buněčné adhezi závislé na fibronektinu. Později bylo ukázáno, že určité větší peptidy obsahující sekvenci LDV byly aktivní in vivo (T.A. Ferguson, Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-Cell Mediated Imune responce in vivo, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 8072-76, 1991, S.M.Wahl et al., Synthetic Fibronectin Peptides Supress Arthritis in RAts by Interupting. Leukocyte Adhesion and Recruitment, J. Clin. Invest. 94: 655-62, 1994),. Byl také popsán cyklický pentapeptid Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (kde TPro je thioprolin), který inhibujé adhezi jak VLA-4 tak VLA5 k fibronektinu (viz např. D.M.Nowlin et al., A Novel cyclic Pentapeptide Inhibits .Alpha4 Betal Integrin Mediated Cell Adhesion, J. Biol. Chem. 268 (27): 20352-59,. 1993 pentapeptid z FN, který pro několik přihláška PCT/US91/04862). Tento na sekvenci tripeptidu Arg-Gly-Asp obecný motiv v rozpoznávacím místu matrix.

inhibujících VLA-4 byly

Adhesion

Inhibitors, lineární a mezinárodní patentová byl založen je znám jako proteinů z extracelulární

Příklady dalších malých molekul popsány např. v Adams et al.,Cell PCT/US97/13013, kde jsou popsány sloučeniny obsahující beta ' aminokyseliny aktivitou pro - buněčnou adhezi. přihlášky WO 94/15958 a WO 92/00995 a peptidomimetické sloučeniny, které

Mezinárodní peptidylové s inhibiční patentové popsali cyklický peptid- . mají inhibiční aktivitou pro buněčnou adhezi. Mezinárodní patentové přihlášky

WO .93/08823 a WO 92/08464 popsali sloučeniny inhibujíci buněčnou adhezi, které obsahují guanidinyl, močovinu nebo

• ····	··		• ·*
• ·	• ·	•	Φ ·	• ·
• · ·	• ·	• ·	• ·
• · ·	• ·	• ·	• ·
·· *·	··	··	··	··

thiomočovinu. Patent USA č. 5,260,277 popsal guanidylovou sloučeninu modulující buněčnou adhezi.

Malé molekuly působící jako mimetická činidla mohou být připraveny tak, že se syntetizuje mnoho peptidů, semipeptidových sloučenin nebo organických sloučenin jiné než peptidové povahy, a pak se provede screening těchto sloučenin na jejich schopnost inhibovat interakci alfa 4 integrin/ligand alfa 4 integrinu. Obecně viz Patent USA 4,833,092, Scottand Smith, Searching for peptide Ligands with an Epitope Library, Science 249, 386-90, 1990,. aDevlin et al., Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules, Science 249: 4040-7, 1990).

V jiném výhodném provedení je činidlo použité podle vynálezu, aby vázalo, blokovalo nebo potáhlo, alfa 4 integrin a/n.ebo ligand alfa 4 integrinu je monoklonální protilátka anti-VLA-4 a/nebo anti-alfa 4 beta 7 nebo její homolog. Výhodné protilátky a jejich homology, vhodné k léčení,_: zejména k léčení lidí, jsou analogy lidských protilátek, _v homology humanizovaných protilátek,., homology chimérických protilátek, Fab, Fab', F(ab')2 a F(v) fragmenty protilátek a monomery nebo dimery lehkých a těžkých řetězců protilátek nebo jejich směsi. Monoklonální protilátky proti VLA-4 jsou výhodná vazebná činidla podle vynálezu.

Termín „homolog protilátky” podle vynálezu zahrnuje intaktní protilátky složené z těžkého řetězce a lehkého řetězce imunoglobulinu, které jsou spojeny disulfidickými vazbami. Termín „homolog protilátky” zahrnuje také proteiny obsahující jeden nebo, více polypeptidů vybraných ze skupiny obsahující lehké řetězce ' imunoglobulinu, těžké řetězce imunoglobulinu a jejich fragmenty vázající antigen, které jsou schopné vázat jeden nebo více antigenů. Složené polypeptidy homologů protilátky obsahující více než jeden

ΦΦΦΦ φ · ···· φ φ φ φ φ φ « φ φ φφφ φ φφφ φ

polypeptid jsou případně vázány disulfidickými vazbami nebo kovalentně zesítěny.

Tudíž k „homologům protilátky patří intaktní imunoglobulin typů IgA, IgG, IgE_z IgD, IgM (včetně jejich subtypů), kde jsou lehké imunoglobulinové řetězce typu kappa nebo lambda.

K „homologům protilátky patří i části intaktních protilátek, které si uchovávají vazebnou specifitu pro antigen, např. fragmenty fab, Fab',. F(ab')2 a F(v), dále monomery nebo dimery těžkého řetězce, monomery nebo dimery lehkého řetězce, dimery složené z jednoho těžkého řetězce a jednoho lehkého řetězce a pod. Takže podle vynálezu jsou užitečné fragmenty vázající antigen stejně tak jako dimerní nebo trimerní polypeptidy plné délky odvozené z výše popsaných protilátek.

Termín „homolog humanizované protilátky označuje homolog protilátky připravené technologií rekombinantni DNA, kde buďto jen některé nebo všechny aminokyseliny, které nejsou nezbytné pro vazbu antigenu, z těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu svace jiného než člověk byly nahrazeny odpovídajícími aminokyselinami těžkého nebo lehkého řetězce lidského imunoglobulinu.

Termín „homolog humanizované protilátky označuje homolog protilátky připravené technologií rekombinantni DNA, kde 'buďto celá nebo část kloubové oblasti a konstantních úseků těžkého nebo lehkého řetězce imunoglobulinu nebo obou řetězců byly nahrazeny odpovídajícími úseky těžkého nebo lehkého řetězce jiného imunoglobulinu.

Jiným aspektem předkládaného vynálezu je varianta chimérické molekuly, která obsahuje: 1) VLA-4 zaměřovači část, např. část VCAM-1 schopnou vázat se na antigen (tj.

VLA-4) na povrchu myelomové buňky nesoucí VLA-4 a 2) případně • ···· ·· ···· ·· • · · ·· · · · · ··· · · ? · · ··· ·· ·· *· ·· ·'· · druhý peptid, např. takový, který zvyšuje rozpustnost nebo biologický poločas in vivo, např. člen superrodiny imunoglobulinu nebo jeho fragment, např. část nebo fragment imunoglobulinu G, např. konstantní úsek těžkého řetězce lidského IgGl, např. kloubové úseky CH2 a CH3, a dále toxinovou část. VLA-4 zaměřovači část je přirozeně se vyskytující VLA-4 ligand nebo jeho fragment, např. peptid VCAM-1 nebo podobná konzervativně substituovaná sekvence aminokyselin.. Výhodná zaměřovači část je rozpustný fragment VCAM-1 , např. ’ N-koncové domény 1 a 2 molekuly VCAM-1 Chimérická molekula může 'být užita k léčení subjektu, např. člověka, u něhož je riziko nemoci, např. mnohoče.tného myelomu, charakterizované přítomností myelomových buněk nesoucích VLA-4 a výhodně VLA-4.

Termín „homolog lidské protilátky je homolog protilátky připravený technologií rekombinantní DNA,. kde všechny aminokyseliny těžkého řetězce i . lehkého řetězce imunoglobulinu pocházejí z lidského zdroje.

Způsoby přípravy homologů protilátky anti-VLA-4

Techniky přípravy homologů monoklonálních protilátek jsou odborníkům dobře známy.. Stručně shrnuto, nesmrtelná buněčná linie (typicky myelomové buňky) jsou fúzovány s lymfocyty (typicky splenocyty) ze savce imunizovaného celými buňkami exprimujícími · daný antigen, např. VLA-4, a supernatant z kultury výsledných hybridomových buněk se pak testuje na přítomnost protilátek proti antigenu. Viz Kohleret al., 1975, Nátuře 265: 295-297.

Imunizace se provádí standardním postupem. Jednotkové dávky a imunizační režim jsou závislé na druhu imunizovaného savce, jeho imunitním stavu,. tělesné hmotnost a pod. Typicky se imunizovanému. savci odebere, krev a sérum z každého krevního vzorku se testuje pomocí příslušného testu na přítomnost určitých protilátek. Tak např. protilátky anti-VLA-4 mohou být identifikovány pomocí imunoprecipitace ^12SI-značených buněčnýph lyzátů buněk exprimujících VLA-4 (viz např. Sanchez-Madrid et al., 1996, Eur. J. Immmunol. 16: 1343-1349, Hemler et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: .1147811485). Protilátky anti-VLA-4 mohou být identifikovány také pomocí průtokové cytometrie, např. měřením fluorescenčního barvení Ramosových buněk inkubovaných s protilátkou, která rozpoznává VLA-4 (Elices et al., 1990, Cell 60: 577-584). Lymfocyty použité pro přípravu hybridomových buněk se typicky izolují z imunizovaných savců, jejichž sérum bylo v testu na přítomnost protilátek anti-VLA-4 pozitivní.

Typicky nesmrtelná buněčná linie (např. myelomové buňky) pocházejí ze stejného druhu savce jako lymfocyty. Výhodné nesmrtelné buněčné linie jsou myší myelomové buněčné linie, které jsou citlivé na kulturní médium obsahující hypoxatin, aminopterin a thymidin (médium „HAT)· Typicky HAT-senzitivní myší myelomové buňky jsou fúzovány s myšími splenocyty pomocí polyethylenglykolu s molekulovou hmotností 1500 (PEG 1500). Vzniklé hybridomové buňky jsou pak selektovány pomocí média HAT, které usmrtí nefúzované a nebo neproduktivně fúzované buňky (nefúzované splenocyty odumřou po několika dnech, protože nejsou transformované). Hybridomy produkující požadovanou protilátku se detekují pomocí testu supernatantu z kultury buněk. Tak např. hybridomy připravené, aby produkovaly protilátky anti-VLA-4 se podrobí screeningu, kdy se testuje supematant z hybridomové kultury na přítomnost secernovaných protilátek, které mají schopnost vázat se na rekombinantni . buněčnou linii exprimující alfa 4 podjednotku (viz např. Elices, výše).

Pro přípravu homologů protilátek anti-VLA-4, které jsou intaktní imunoglobuliny, se hybridomové^; buňky, které byly ve výše popsaných testech pozitivní, kultivují v živném médiu v takových podmínkách a po takovou dobu, které jsou dostatečné k tomu, aby hybridomové buňky secernovaly monoklonální protilátky do média. Techniky tkáňových kultur a živná média vhodná pro hybridomové buňky jsou známy. Kondicionovaný supernatant z hybridomové kultury se odebere a požadované protilátky anti-VLA-4 se mohou dále purifikovat známými metodami, pokud je to potřeba.

Alternativně se požadované protilátky produkují injekcí hybridomových buněk do. peritoneální dutiny myši premedikované přistáném. Hybridomové buňky pak proliferují v peritoneální dutině a secernuj! protilátky, které, se akumulují v ascitu. Protilátky se pak izolují odebráním tekutiny z ascitu- pomocí injekční stříkačky.

Několik myších monoklonálních protilátek anti-VLA-4 bylo již dříve popsáno (viz např. Sanchez-Madrid et al., 1986, Hemler . et al. 1987, Pulido et al., 1991, J. Biol. Chem. 266(16):10241-10245). Tyto monoklonální protilátky anti-VLA-4 jako je např. HP1/2 a další (např. HP2/1, HP2/4, L25, P4C2, P4G9) schopné rozpoznávat P řetězec VLA-4 jsou užitečné podle vynálezu. Výhodné jsou takové protilátky anti-VLA-4, které rozpoznávají alfa 4 epitop VLA-4, který se účastní vazby, k ligandům VCAM-1 a -fibronektinu (tj.. protilátky, které se mohou vázat na VLA-4 v místě podílejícím se na rozpoznání ligandu a tudíž blokovat vazbu VCAM-1 a fibronektinu). Takové protilátky byly definovány jako protilátky specifické pro epitop Β (B1 nebo B2) (Pulido et al., 1991, viz výše) a jsou také anti-VLA-4 protilátkami ve smyslu předkládaného vynálezu.

ΦΦΦΦ Φ Φ · φ .ΦΦ

Φ · Φ Φ ΦΦΦ

ΦΦΦ · Φφφ Φ

ΦΦΦ φ Φ ♦ · . · ·. φ plně lidských protilátek proti činidlem podle vynálezu, které antigeny. Takové protilátky v být připraveny z lidských vitro, jako popsali Boerner eta

86-95. Alternativně klonováním jak popsali

Acad. Sci. USA 88:

1991, J.

5,798,230

Immunol. Methods (25. srpen of human monoclonal

Homology dalším výhodným potahuje VLA-4 formě mohou stimulovaných in

Immunol. 147: repertoárovým

Proč. Nati.' a Stollar,

USA č.

preparation pro přípravu

B buněk. Tímto postupem -se protilátku imortalizují tak, Barrové nebo jeho derivátem, antigen 2 (EBNA2) . Funkce imortalizaci, je poté vyřazena zvýšení tvorby protilátek.

V další metodě produkce plně lidských monoklonálních

VLA-4 jsou blokuje nebo jejich intaktní splenocytů 1., 1991, J.

mohou být připraveny Persson et al., 1991, 2432-2436 nebo Huang 141, 227-236 a Patent

1998, Process for the antibodies and their use) protilátek z lidských lidské B buňky produkující že se infikují virem Epsteinkterý exprimuje EBV jaderný EBNA2, která- je. nutná pro z činnosti, což vede ke lidských protilátek (Patent

USA č. 5,789,650 ze 4. srpna 1998 Transgenic non-human animals for producing heterologous. antibodies) je popsáno použití transgenních zvířat s výjimkou člověka schopných produkovat heterologní protilátky a transgenních zvířat, která mají inaktivované endogenní imunoglobulinové geny. Endogenní imunoglobulinové geny jsou potlačeny užitím antisense oligonukleotidů a/nebo antisérem namířeným proti endogenním imUnoglobulinům. Heterologní protilátky jsou kódovány imunoglobulinovými geny, které se normálně v genomu daného biologického druhu nevyskytují. Jeden nebo více transgenů obsahujících sekvence těžkého řetězce heterologního lidského imunoglobulinu, které jsou v původním uspořádání, se vnesou do zvířete jiného než člověka, čímž se vytvoří ·· ···· transgenní zvíře schopné funkčně přeorganizovat transgenní imunoglobulinové sekvence a produkovat tak repertoár protilátek různých isotypů, které jsou kódovány lidskými imunoglobulinovými geny. Takové heterologní lidské protilátky jsou produkovány B buňkami, které jsou potom imortalizovány, např. fúzí s imortalizovanou buněčnou linií jako, je např. myelom, nebo úpravou těchto B-buněk jiným postupem, aby poskytly permanentní buněčnou linii produkující homology monoklonální heterologní plně lidské protilátky.

Velké neimunizované knihovny užívající fágové expozice mohou být užity pro izolaci protilátek s vysokou afinitou, které mohou pak dále být zpracovány jako léky .konvenční technikou s využitím fágů (Vaughan et al, 1996) .

Další výhodné vazebné činidlo, které může blokovat nebo potahovat VLA-4 antigeny podle vynálezu je homolog humanizované rekombinantní protilátky mající specifitu antiVLA-4. Po původních metodách přípravy chimérických protilátek .byl popsán nový způsob v dokumentu EP 0239400 (Winter et al.), kde byly protilátky změněny substitucí jejich původních komplementaritu určujících úseků (CDR) úseky z jiného biologického druhu. Tento způsob je možné použít např. k nahrazení CDR z domén variabilních úseků těžkého a lehkého řetězce lidského Ig alternativními CDR .z domén variabilních úseků Ig myši. Tyto alterované variabilní úseky Ig pak mohou být 'kombinovány s konstantními úseky lidského Ig, čímž se vytvoří protilátky, které jsou svým složením plně lidské, až na substituované myší CDR. Lze předpokládat, že·' takové substituované protilátky budou s mnohem menší pravděpodobností vyvolávat imunitní reakci u lidí ve srovnání např. s chimérickými protilátkami, neboť CDR-substituované protilátky obsahují významně méně složek, které nejsou lidského původu. Proces humanizace protilátek metodou tzv..

φ »··« • · · φ φ · · φ ♦ ♦ φ · ··· • · · · · * φ · φ · φ .· · · · φ φ·♦ · ♦ ΦΦ ·· · · ··· roubováni CDR byl nazván přetvařování protilátek (Riechmann et al., 1988, Nátuře 332, 323-327; Verhoéyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536).

Typicky se komplementaritu určující úseky (CDR) z myší protilátky, transplantují do odpovídajících úseků lidské' protilátky, neboť jsou to právě CDR (tři v těžkých řetězcích a tři v lehkých řetězcích protilátky) úseky, které se v myší protilátce váží na specifický antigen. Transplantace CDR se provede metodami genového inženýrství, kdy se sekvence cDNA pro CDR určí klonováním genových segmentů pro variabilní úseky (V) lehkého a těžkého řetězce a pak se přenesou do odpovídajících úseků místně cílenou mutagenezí. V poslední fázi tohoto postupu se segmenty genu lidského konstantního úseku požadovaného isotypu (obvykle gama I pro CH a kappa, pro CL) přidají a geny pro humanizované lehké a těžké řetězce se společně exprimují (ko-exprimuji) v savčích buňkách a produkují rozpustné humanizované protilátky.

Přesun těchto CDR do lidských protilátek dává lidským, protilátkám antigenně-vazebné vlastnosti původní· myší protilátky. Šest úseků CDR z myší protilátky je vneseno do rámcového úseku V. Důvod, úspěšného roubování CDR je ten, že rámcové úseky myších a lidských protilátek mají velmi podobnou 3-D strukturu s podobnými body navázání CDR, takže CDR se mohou zaměňovat. Takové homology humanizovaných protilátek se mohou připravovat postupy, které např. popsali Jones et al., 1986, Nátuře 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nátuře 332, 323-327; Queen et al:, 1989, Proč. Nat. Acad. Sci. UŠA 86, '10029; a Orlandi et al., 1989, Proč. Nat. Acad. Sci, USA 86, 3833.

Avšak má se za to, že některé aminokyseliny v rámcové oblasti protilátky interaguji s CDR a ovlivňují celkovou vazebnou schopnost protilátky. Přímý přenos CDR z myší • 4 4·· ··*«»· 4 4 • · · Φ · ' · · · « • 4 4 4 4*4 4

Φ 44 44 44 φ 4 «· Φ protilátky na rekombinantní lidskou protilátku bez jakékoliv modifikace lidského rámcového V úseku často vede ke k částečné nebo úplné ztrátě vazebné afinity. V mnoha případech je zřejmě kritická záměna zbytků v rámcovém úseku akceptorové protilátky, aby bylo dosaženo vazebné aktivity.

V dokumentech Queen et al. (1989, viz výše) a WO 90/07861 (Protein Design Labs) byla popsána příprava humanizovaných protilátek, které obsahují modifikovaná rezidua v rámcové oblasti akceptorové protilátky tím, že byly kombinovány CDR z myší monoklonální protilátky (MAb) anti-Tac s rámcovým a konstantním úsekem lidského imunoglobulinu. Takto bylo tedy ukázáno jedno řešení problému ztráty vazebné afinity, která je často důsledkem přímého přenosu CDR, aniž by byly modifikovány zbytky lidské V rámcové oblasti. Toto řešení obsahuje dva rozhodující kroky: první je výběr lidské V rámcové oblasti pomocí počítačové analýzy pro optimální homologii proteinových sekvencí s V. rámcovou oblastí původní myší protilátky, v daném případě anti-Tac MAb. V druhém kroku je modelována terciární struktury myšího V úseku pomocí počítačového programu, aby bylo možné vizualizovat aminokyselinové zbytky v rámcové oblasti, které pravděpodobně interagují s myšími CDR a tyto aminokyselinové zbytky jsou pak přeneseny na homologní lidský rámcový úsek (viz také Patent USA č. 5,693,762, Protein Design Labs).

Je možné užit také jiný přístup (Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266271) a využít jako standard úseky V rámce odvozené z NEWM a REI těžkého a lehkého řetězce pro roubování CDR bez radikálního vnášení aminokyselinových zbytků myši. Výhodou výše zmíněného postupu podle Tempest et al. při konstrukci humanizovaných protilátek založených na NEWM a REI je to, že 3D struktury variabilních úseků NEWM a REI jsou známy ze zkoumání rentgenovou krystalografií a tudíž lze ♦ 9 9 · ♦ 99 • 9 9 · 9 9 9 99 • 9 9 9 99 999 9

9 modelovat specifické interakce mezi CDR a aminokyselinovými zbytky V rámcového úseku.

Bez ohledu na způsob přípravy, příklady počátečních homologů humanizovaných protilátek ukazují, že to není jednoduchý proces. I když je uznáváno, že změny v rámcovém úseku jsou nutné, ,není možné na základě dosavadního stavu techniky předpovědět, které aminokyselinové zbytky bude třeba změnit, aby se získala funkční humanizovaná rekombinantni ♦ protilátka s požadovanou specifitou. Dosavadní výsledky ukazují, že změny nutné k uchování specifity a/nebo afinity jsou ’z větší části jedinečné pro danou protilátku a nelze je předpovědět na základě humanizace jiné protilátky.

K výhodným antagonistům.užitečným podle vynálezu patří homology chimérické rekombinantni a humanizované protilátky (tj. intaktní imunoglobuliny a jejich části) se specifitou k B epitopů, které byly připraveny způsobem popsaným v současně projednávané přihlášce vynálezu USA 08/004,798, podané 7. ledna 1993,. publikované jako PCT/US94/00266). Výchozím materiálem pro přípravu homologů chimérické (myši V - lidský C) protilátky a humanizované protilátky anti-VLA-4' je myší monoklonální protilátka anti-VLA-4, která je komerčně dostupná (např. protilátka HP2/1, Amae International, lne., Westbrook, Maine) nebo monoklonální protilátka anti-VLA-4 připravená -postupem podle předkládaného vynálezu. Tak např. variabilní úseků těžkého a lehkého řetězce anti-VLA-4 protilátky HP¹/? byly klonovány, sekvencovány a exprimovány v kombinaci s konstantními' úseky těžkého a lehkého řetězce lidského imunoglobulinu. Takové protilátky HP¹/? jsou specifitou a účinkem podobné myší protilátce HP 1/2 a lze je využít jako léčiva podle vynálezu.

Další výhodné homology humanizované protilátky byly, popsány v přihlášce PCT/US595/01219 (podané 27. července ♦ ···

9« ·««·

1995, Athéna' Neurosciences, lne.). Tyto humanizované protilátky anti-VLA-4 obsahují humanizovaný těžký řetězec, obsahuje tři komplementaritu určující úseky CDR3) mající aminokyselinovou sekvenci komplementaritu imunoglobulinového variabilního úseku humanizovaný lehký řetězec a

Humanizovaný lehký řetězec (CDR1, CDR2 a odpovídáj ícich úseků určuj ícich lehkého řetězce a z rámce variabilního

21-6 myšího sekvenci . rámce úseku lidského lehkého řetězce kappa s výjimkou, že alespoň v jedné pozici aminokyselinou variabilního je aminokyselinová pozice obsazena stejnou jaká je přítomna v ekvivalentní pozici rámce úseku lehkého řetězce myšího imunoglobulinu 21.6.

Humanizovaný těžký řetězec obsahuje tři komplementaritu určující úseky (CDR1, CDR2 a CDR3) mající aminokyselinovou sekvenci z odpovídajících komplementaritu určujících úseků myšího 21-6 imunoglobulinového těžkého řetězce a sekvenci rámce variabilního úseku z rámce variabilního úseku lidského těžkého řetězce s výjimkou, že alespoň v jedné pozici je aminokyselinová pozice obsazena stejnou aminokyselinou jaká je přítomna v ekvivalentní pozici rámce variabilního úseku lehkého řetězce myšího imunoglobulinu 21.6.

Terapeutické přípravky 'Přípravky podle vynálezu, tj . VLA-4 vazebná činidla, zejména homology fúze VCAM-1 a anti-VLA-4 protilátky, jsou výhodně podávány parenterálně.

Termín parenterálně podle vynálezu znamená podávání subkutánní, intravenózní, intramuskulární, intra-artikulárni, intrasynoviální, iňtrasternální, intrathekální, intrahepatickou, intrakraniální injekcí nebo infúzí nebo podáváni přímo do léze.

• ·· · *· ·Μ· benzensulfonat, kamforsulfonát, dodecylsulfát, glycerolfosfát,

VLA-4 vazebná činidla podle vynálezu jsou výhodně podávány jako sterilní farmaceutické přípravky obsahující farmaceuticky přijatelný nosič, což může být jakýkoliv z mnoha v oboru známých nosičů jako je např. voda, solný roztok, pufrovaný.solný roztok, dextróza, glycerol, ethanol a pod. nebo směsi těchto látek. Sloučeniny podle vynálezu-mohou být ve formě farmaceuticky přijatelných solí organických nebo anorganických kyselin a baží. K takovým solím patří např. acetát, adipát, alginát, aspartát, benzoát, bisulfát, butyrát, citrát, kamforát, cyklopentanpropionát, diglukonát, ethansulfonát, fumarát, glukoheptanoát, hemisulfát, heptanoát, hexanoát, hydrochlorid, hydrobromid, hydrojodid, 2-hydroxyethansulfonát, laktát, maleát, methansulfonát, 2-naf talensulfonát, nikotinát, oxalát, pamoát, pektinát, persulfát, 3-fenylpropionát, pikrát, pivalát, propionát, sukc.inát, tartrát, thiokyanát, tosylát a undekanoát. K bazickým solím patří soli amonia, soli alkalických kovů jako jsou sodné a draselné soli, soli kovů alkalických zemin jako jsou soli vápníku a hořčíku, soli s organickými bázemi, jako jsou např. dicyklohexylaminové, N-methyl-D-glukaiminové a tris(hydroxymethyl)methylaminové soli a soli a aminokyselinami jako jsou arginin, lysin atd. Také bazické skupiny obsahující dusík mohou být kvarterizovány činidly, např. halidy nižších alkylů jako jsou methyl-, ethyl-, propyl- butylchloridy, -bromidy a jodidy; dialkylsulfáty jako jsou dimethyl-, diethyl-, dibutyla diamylsulfáty, halidy s dlouhými řetězcem jako jsou decyl-, lauryl-, myristvl- a stearylchloridy, , -bromidy a -jodidy, aralkvlhalidy jako jsou benzyl- a fenethylbromidy a další. Takto se získají produkty, které jsou rozpustné nebo dispergovatelné ve vodě nebo v oleji.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují sloučeninu podle vynálezu nebo její farmaceuticky derivát, spolu s farmaceuticky přijatelným Termín . nosič podle vynálezu zahrnuje také adjuvans a vehikula. K farmaceuticky přijatelným j akoukoliv při j ate.lný nosičem.

přijatelná které lze využít v předkládaném vynálezu patří (aniž byl omezující): iontoměniče, oxid lecitin, nosičům, by však hlinitý, tento výčet aluminiumstearát, sérové proteiny jako je lidský fosfáty, sérový albumin, pufrované sorbová, sloučeniny jako jsou glycin, kyselina parciálních glyceridů . rostlinných kyselin, voda, sorbát draselný, směsi saturovaných mastných protaminsulfát, soli nebo elektrolyty jako hydrogenfosforečnan sodný, je např..

hydrogensoli zinku, polyvinylpyrrolidon, polyethylenglykol, sodná sůl fosforečnan draselný, chlorid sodný, koloidní oxid křemičitý, křemičitan hořečnatý, látky odvozené z celulózy,, karboxymethylcelulózy, polyakryláty, vosky, blokové polymery polyethylen-polyoxypropylenu, polyethylenglykol a tuky z ovčí vlny.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu mohou být ve formě, sterilního injikovatelného přípravku, např. sterilní injikovatelné suspenze ve vodě nebo v oleji. Taková suspenze je formulována obvyklými technikami, které jsou odborníkovi známé, pomoci vhodných dispergujicich, suspendujících a zvlhčovačích činidel. Sterilní injikovatelné přípravky mohou být. také sterilní injikovatelné roztoky nebo suspenze v netoxických parenterálně přijatelných rozpouštědlech .nebo ředidlech, např. jako roztok v 1,- 3-butandiolu. Jako přijatelná vehikula a rozpouštědla se mohou užít také voda, Ringerův roztok a isotonický roztok chloridu sodného. Kromě toho sterilní upravené oleje se užívají obvykle jako rozpouštědla nebo suspendační médium. Pro tento účel může být φ

φ φφφ • φφφφ φφφφφφ ·· • φ φ. φ φ φ φφ φ φ φφφ · φ • φ φ φ , φ φφφ φ φφφ φ φφφ φφ φφφ φφ φφ φφ φφ užit jakýkoliv nedráždivý upravený olej včetně syntetických mono- nebo diglyceridů. Mastné kyseliny, jako je kyselina olejová, a její glyceridové deriváty jsou užitečné pro přípravu injikovatelných přípravků, stejně tak jako přírodní farmaceuticky přijatelné oleje, jako je olivový olej, ricínový J olej, obzvláště jejich polyoxyethylované verze. Tyto olejové roztoky nebo suspenze mohou také obsahovat alkoholové ředidlo nebo dispergující činidlo s dlouhým řetězcem, například podle Ph. Helv. (Švýcarského lékopisu) nebo podobný alkohol.

Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu, zejména antagonistické malé molekuly interakce VLA-4/VCAM-1, mohou být podávány parenterálně nebo perorálně. Jestliže jsou podávány perorálně, mohou být podávány v každé perorálně přijatelné dávkové formě včetně, a bez omezení, tobolek, tablet, vodných suspenzí nebo roztoků. V případě tablet pro perorální použití obvykle používané nosiče zahrnují laktózu á kukuřičný škrob. Jsou také typicky přidávány lubrikanty, jako například stearát hořečnatý. Pro perorální podávání ve formě tobolek zahrnují použitelná ředidla laktózu a usušený kukuřičný škrob.

vodná suspenze, a suspendujícími

Když je pro perorální použití vyžadována aktivní složka je spojena s.emulgátory

Je-li žádoucí, mohou být také přidány určitá sladidla, příchutě nebo barviva. Mohou být také použity topické transdermální náplasti. Farmaceutické přípravky podle tohoto vynálezu mohou být také podávány nazálnim aerosolem nebo inhalací s použitím nebulizéru, inhalátoru suchého prášku nebo inhalátoru s měřenými dávkami.

Tyto přípravky jsou připraveny podle technik dobře známých v oboru farmaceutických formulací a mohou být připraveny jako roztoky ve fyziologickém roztoku, používat benzylalkohol nebo absorpci pro zvýšení biologické dostupnosti, fluorované další vhodné konzervační prostředky, činidla podporující • 999 .99 9999 • · • 9 9 · ' -9 99

999 9 9999

999 9 9 9 999

99999 99 9999 uhlovodíky a/nebo další obvyklá solubilizační nebo dispergující činidla.

Podle dalšího provedení přípravky obsahující sloučeninu podle tohoto vynálezu mohou také obsahovat další činidlo vybrané ze skupiny zahrnující kortikosteroidy, protizánětlivá činidla, imunosupresiva, antimetabolity a imunomodulátory. Specifické sloučeniny v každé z těchto skupin mohu být vybrány z jakýchkoliv sloučenin uvedených v příslušném záhlaví v Comprehensive Medicinal. Chemistry (Pergamon Press, Oxford, England, ss. 970-986, 1990), jejichž popis je zahrnut formou odkazu. V této skupině jsou také zahrnuty sloučeniny, jako například theofylin, sulfasalazin a aminosalicy.láty (protizánětlivá látky); cyklosporin,' FK506, a rapamycin (imunosupresiva); cyklofosfamid a metotrexát (antimetabolity); steroidy . (inhalační, perorální . nebo topícké) a interferony (imunomodulátory).

Množství aktivní složky, které může být spojeno s materiálem nosiče, aby vznikla jednotková léková forma, závisí na léčeném hostiteli a konkrétním způsobu podávání. Ale je nutné rozumět, že specifické dávkování a léčebný režim pro každého konkrétního pacienta závisí na celé řadě faktorů, včetně aktivity specifické použité sloučeniny, věku, tělesné hmotnosti, obecném zdrávi, pohlaví, dietě, času podávání, rychlosti vylučování, kombinaci léků a úsudku ošetřujícího lékaře a vážnosti konkrétní léčené nemoci. Množství aktivní složky může také záviset na eventuálním terapeutickém nebo profylaktickém přípravku, se kterým je složka podávána společně.

Dávkování a dávkovači režim sloučenin podle tohoto vynálezu účinný pro prevenci, supresi nebo inhibicí buněčné adheze závisí na celé řadě faktorů, jako je povaha inhibitoru, velikost pacienta, cíl léčby, povaha léčené • φφφφ ·· φφφφ φφ φ φφ φ φ φ φ φφφφ φ φφφφ φφφφ φ φφφ ΦΦΦ··· · φφφ φφ φφ φφ φφ φφφ patologie, specifickém použitém· farmaceutickém přípravku a úsudku ošetřujícího lékaře. Hladina dávek mezi přibližně 0,001 a přibližně 100 mg/kg tělesné hmotnosti denně, výhodně mezi přibližně 0,1 a přibližně 50 mg/kg tělesné hmotnosti denně. aktivní složky sloučeniny jsou použitelné. Nejvýhodněji, VLA-4 vázající činidlo, když jde o protilátku nebo její derivát, je podáváno v dávce 0,1 mg/kg tělesné hmotnosti/den až 20 mg/kg tělesné hmotnosti/den, výhodně 0,1 mg/kg až 10 mg/kg tělesné hmotnosti/den v intervalech 1 až 14 dnů. V případě činidel, která jsou malé molekuly nebo jsou jiné povahy než protilátky, dávky jsou molárními ekvivalenty dávek protilátek. Výhodně je protilátkový přípravek podáván v množství, které poskytuje účinnou hladinu protilátky v plazmě alespoň 1 mg/ml. Optimalizaci dávek lze určit na základě podávání vazebného činidla a následného vyhodnocení potažení buněk pozitivních na VLA-4 činidlem v průběhu času v

po podání dané dávky in vivo.

Myelomové buňky obsažené ve vzorku periferní krve odebrané pacientovi (nebo vzorku kostní dřeně) je třeba testovat na přítomnost činidla in vitro (nebo ex vivo) pomocí druhého činidla, kterým se detekuje podávané činidlo. To může být např. fluorochromem značená protilátka specifická pro podávané činidlo, která se pak stanovuje standardním postupem užitím průtokové cytometrie FACS („fluorescence activated cell·, sorter). Alternativně přítomnost podávaného činidla může být detekována in vitro (nebo ex vivo) pomocí neschopností nebo sníženou schopností jenotlivých buněk vázat stejné činidlo, které bylo samo označeno (např. fluorochromem). Výhodné dávkování by mělo vést k detekovatelnému potažení převážné většiny buněk pozitivních na VLA-4. výhodně by toto potažení mělo přetrvávat v případě homologu protilátky 1 až 14 dnů.

• 0 · 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ·· , 0 0 0 0 · · · • · 0 · · 0 0 0 ·

000 00 00 00 00 000

Zvířecí modely

Zvířecí modely byly podrobně popsány v práci Garretta 1997. Stručně shrnuto, Radí et al. (1988) popsali myší model myelomu, který vzniká spontánně u stárnoucích myší CS7BL/KaLwRij. Tato nemoc vzniká při stárnutí přibližně u jednoho z 200 zvířat a vede k monoklonální gamapatii s některými rysy nemoci u lidí (Radí 1988) . Pro vývoj lepšího modelu s vyšší reprodukovatelností původci připravili a subklonovali buněčnou linii z myšího myelomu nazvanou STGM1 a zjistili, .že způsobuje léze u myší charakteristické pro lidský myelom, jako jé např. silná osteolýza, a postihuje i jiné orgány než kosti, např. ledviny a játra (Garrett 1997) . U myší inokulovaných kultivovanými buňkami se vyvíjí nemoc, a sice vysoce predikovatelným a reprodukovatelným způsobem, která' zahrnuje, vznik monoklonální gamapatie a radiologické kostní léze. Kromě toho se některé myši stávají hyperkalcemické, a kostní léze jsou charakteristické zvýšenou aktivitou osteoklastů. Tudíž na základě histologického vyšetření postižených orgánů myší nesoucích STGM1 a zvýšené sérové hladiny IgG2b, byl STGM1 definován jako myší myelom, který přesně reprodukuje významné znaky onemocnění u lidí.

Následující příklady podrobně ilustrují výhodná provedení, vynálezu a nijak neomezují předmět vynálezu.

Restrikční enzymy, plazmidy a další reagencie a materiály lze získat z komerčních zdrojů a postupy klonování a dalších metod genového inženýrství ' (technologie rekombinantní DNA.) jsou odborníkům známy.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1

Materiál a metody

Myelomové buňky 5TGM1

Myelomové buňky 5TGM1 původně pocházejí z myelomu, který vznikl spontánně u starých myší C57BL/KaLwRij (Garrett 1997, Vanderkerken 1997),. Buňky byly pěstovány v Dulbeccově médiu modifikovaném podle Isocova (IMDM, Life Technologies Tne., Gaithersburg, MD) doplněném 10% fetálním bovinním sérem (FBS, Summit, Fořt Collins, CO) a 1 % roztokem penicilihstreptomycinu (GIBCO, Grand Island, NY) ve 37 °C v 5% CO₂ atmosféře. Pro in vitro pokusy, popsané níže byly použity buňky 5TGM1 mezi 25. a 30. pasáží.

Protilátky, rozpustná VCAM-1

Neutralizační protilátky proti myší VCAM-1 (M/K-2.7), integrinu VLA-4 (PS/2) a intercelulární adhezivní molekule-l (ICAM-1,

YN1/1.7) byly laskavý dar od Dr.

Kensuke Miyake (Saga Medical University, Saga, rozpustná VCAM-1 (Lobb et al,

Japan). Rekombinantní

1991) obsahující .7 extracelulárních domén lidské VCAM-1 byl dar od Dr.

Roy Lobb,

Biogen lne., Cambridge, MA.

Reverzní transkripce spřažena s polymerázovou řetězovou reakcí (RT-PCR)

S použitím RT-PCR potvrdili původci expresi VCAM-1 a integrinu alfa 4 v buňkách stromatu. kostní dřeně a 5TGM1, v daném pořadí. Celková RNA byla izolována z 5TGM1, ·>·· • · · · w « z primární' kultury buněk stromatu kostní dřeně a buněčné line ST2 stromatu kostní dřeně (RIKEN Cell Bank, Tsukuba, Japan) pomocí jednokrokové metody izolace RNA s použitím reagencie TRIzol (GIBCO) . Tři pg RNA byly inkubovány s 50 ng náhcdného hexameru v 70 °C po 10 min a ochlazeny na ledu, pak konvertovány na první vlákno cDNA s použitím reverzní transkriptázy (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ) podle instrukcí výrobce. Primery použité pro PCR byly následující: myší VCAM-1 5'-primer, .5'-OH-GCTGCGCGTCACCATTGTTCTC-3'-OH (sekvence id. č. 1), myší VCAM-1 3'-primer, 5'-OHACCACCCTCTTGAAGCCTTGTG-3'-OH (sekvence id. č. 2), myší integrin alfa 4 5'-primer, 5 '-OHCCCCTCAACACGAACAGATAGG-3 '-OH (sekvence id. č. 3), myší integrin alfa 4 3'-primer, 5’-OHGCCTTGTCCTTAGCAACACTGC-3'-OH (sekvence id. č. 4).

PCR byla prováděna 30 cyklů skládajících se z 1 min v 94° C, 1 min v 55° C a 2 min v 72° C. PCR reakční směs /

(celkem 50 μΐ) obsahovala 10 μΐ. První Vlákno cDNA, 50mM KC1, lOmM Tris-HCl (pH 8,3), 2mM MgClz, deoxy-NTP mix (0,2 mM každý), pár primerů (0,15 pM každý) a 2 U Taq DNA polymerázy (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ). Produkty PCR byly separovány na 2,5% agarózových gelech obsahujících ethidiumbromid a vizualizovány pod ultrafialovým světlem. Velikost fragmentů byla potvrzena vztahem ke standardům molekulové hmotnosti.

Připojení buněk 5TGM1 k buňkám stromatu kostní dřeně

Pro provádění heterotypových testů adheze buněk byly buňky ST2 (5 e 4/jamka) nasazeny na 48-jamkOvé kultivační destičky (Costar, Cambridge, MA) a pěstovány 48 hodin v médiu alfaMEM doplněném 10% FBS do konfluence. Buňky 5TGM1 (5 e 6) byly značeny inkubací s 10 pCi [methyl-3H] thymidinu (New England Nuclear) po 24 hodin v 37° C v kultivačním médiu. Poté, co_ se vytvořila monovrstva ST2, byly inkubovány • ··*· «··« ·· · ·· · ♦ · · · · ·· • · · · · · · β · · ··· ···· · · · ··· ·· ·· 99 09 999 s 1% bovinním sérovým albuminem (BSA, Sigma, St Louis, MO) v médiu alfaMEM bez séra po 1 hodinu a na monovrstvu byly naneseny buňky 5TGM1 značené tritiem. Systém. byl inkubován v přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek proti VCAM-1 nebo integrinu alfa 4betal v 37 °C po 1 hodinu. Neadherované buňky byly, odstraněny promytím s 5% kyselinou trichloroctovou,

dvakrát, a s	PBS,	dvakrát, a . adherované	buňky	byly
solubilizovány	ve	300 μΐ 0,25mM NaOH,	0,25mM	HC1
neutralizovány	se	stejným objemem a- radioaktivita	byla

určována počítačem scintilace v kapalinách.

Test tvorby osteoklastů ve společné kultuře buněk 5TGM1 a buněk kostní dřeně myší

Buňky kostní dřeně myší byly získány od samců myší C57BL starých 5 týdnů, jak popsáno dříve (Yoneda 1993). Femury a tibie byly asepticky vyňaty a. oba konce odseknuty.. Buňky kostní dřeně byly vypláchnuty, sesbírány a inkubovány v médiu alfaMEM doplněném 10% FBS (Hyclone, Logan, U-T) a 1% penicilin-streptomycihem na kultivačních miskách o průměru 100 mm (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) v 37 °C po 2 hodiny. Neadherované buňky obsahující hemopoetické prekurzory osteoklastů a buněk stromatu byly sklizeny. Buňky kostní, dřeně (1 e 6) buňky 5TGM1 (1 e 3) ve 300 μΐ kultivačního média byly nasazeny na 48-jamkové kultivační destičky (den 0). V den 2 bylo do každé jamky jemně přidáno 300 μΐ čerstvého kultivačního média a v den. 4 bylo 300 μΐ vyčerpaného média bylo nahrazeno stejným objemem čerstvého média. V den 6 byly kultury fixovány, a obarveny kyselou, fosfatázou rezistentní na tartrát (TRAP) s použitím komerčního kitu (Sigma). TRAP-pozitivní mnohojaderné buňky s více než 3 jádry byly definovány jako buňky podobné osteoklastům (podobné .OC) a ručně počítány pod mikroskopem.

Aby se potvrdilo, že tyto buňky podobné OC mají schopnost resorbovat kost, byly buňky 5TGM1 a buňky dřeně společně pěstovány na řezech velrybího dentinu o velikosti 5x5 mm za stejných podmínek a resorpční otvory vytvořené na těchto dentinových řezech byly vyšetřovány rastrovacím elektronovým mikroskopem, jak popsáno (Yoneda 1992)..

V některých pokusech byly prováděny společné kultivace myelomových buněk 5TGM1 a buněk kostní dřeně s. použitím jamkových přepážek (Becton Dickinson Labware), aby se zabránilo přímému kontaktu mezi těmito dvěma typy buněk (2e6, 24-jamkové destičky, Costar). Buňky dřeně byly nasazeny do spodních komůrek a myelomové buňky 5TGM1 (2e3) pak býly nasazeny buď do spodních (přímý kontakt) nebo do horních (bez kontaktu) komůrek.

Orgánové kultury dlouhých kostí, fétu laboratorního potkana značené ⁴⁵Ca

Kondiciovaná média sklízená z kultur 5TGM1 byla testována na aktivitu resorpce kosti prostřednictvím orgánové kultury dlouhých kostí fétu laboratorního potkana značené ⁴⁵Ca, jak popsáno dříve (Mbalaviele 1995). Březím samicím laboratorního potkana byly podávány injekce 250 pCi 45Ca (New England Nuclear) 18. den březosti. Diafýzy radia a ulny byly získány od fétů starých 19 dnů pomocí mikrodisekce a předběžně pěstovány 24 hodin v médiu BGJ (Sigma) doplněném 0,1% BSA na rozhraní vzdušné a tekuté fáze na mřížkách z nerezové oceli. Kosti byly pěstovány v kondiciovaných médiích (50 % objem/objem) nebo v kontrolním médiu po 120 hodin. Média byla měněna jednou za 48 hodin. Na .konci kultivace byly kosti inkubovány v ledově chladné 5% kyselině trichloroctové po 2 hodiny a radioaktivita ⁴⁵Ca v kostech a médiích byla určována počítačem scintilace v kapalinách.

Resorpce kosti byla kvantifikována jako procento 45Ca uvolněné do média z kosti, jak vypočítáno: (počet impulsů 45Ca v médiu)/(počet impulsů 45Ca v médiu a kosti) x 100.

Společná kultivace myelomových buněk 5TGM1 s buňkami stromatů z myší buněčné linie ST2

Buňky ST2 (0,5 é 6) a buňky 5TGM1 (4 e 6) byly nasazeny společně na kultivační misky o průměru 60 mm (Beckton Dickinson) v IMDM doplněném 10% FBS a pěstovány přes noc, dvakrát promyty s IMDM bez séra a inkubovány v 5 ml IMDM bez séra. Po 48 hodinách byla kondiciovaná média sklizena a uskladněna v -70 °C až do použiti.

Účinek mAb PS2 na elevaci IgG2b v séru u myší nesoucích 5TGM1

Myším byla podána injekce 1 e 5 buněk 5TGM1, kterým bylo umožněno kolonizovat kostní dřeň. Myši byly rozděleny na dvě skupiny po třech, jedna sloužila jako kontrolní skupina, a druhá byla ošetřována dvakrát týdně počínaje 8. dnem 80 pg mAb PS12 (4 mg/kg). Hladiny .IgG2b, protilátkového isotypu produkovaného myelomovými buňkami 5TGM1, byly měřeny v týdenních intervalech od 1. do 6. týdne.

Výsledky

Exprese VCAM-1, VLA-4 a účinek protilátek proti VCAM-1 a VLA4 na připojení 5TGM1 na monovrstvy ST2

S použitím RT-PCR potvrdili původci expresi VCAM-1 a integrinu VLA-4- buňkách stromatů kostní dřeně a myelomových buňkách, v daném pořadí. Jak lze očekávat, jak buněčná linie stromatů ST2, tak primární buňky stromatů kostní dřeně exprimovaly VCAM-1, zatímco 5TGM1 neexprimovaly. Na rozdíl od toho myelomové buňky 5TGM1 exprimovaly integrin VLA-4, • · · ·· ·· · « · · φ φ · ·· · 4 · · · · ··

4 4 Φ 4 4 4 Φ • ·ΦΦ4 φφ φφ φ

Φ · · · ·\ 4 Φ Φ Φ φ * ΦΦΦ zatímco buňky stromatu neexprimovaly (data neukázána). Kromě toho jak protilátka anti-VCAM-1 (10 pg/ml) tak protilátka VLA-4 (10 pg/ml) částečně (50-80 %) inhibovaly připojení buněk 5TGM1 k monovrstvě ST2, . což ukazovalo, že VCAM-1 a integrin VLA-4 exprimovaný na těchto buňkách jsou biologicky funkční a že tyto protilátky mají neutralizační aktivitu (data neukázána).

Vznik buněk podobných OC ve společné kultuře myelomových buněk 5TGM1 s buňkami kostní dřeně myší

6. den společné kultury buněk 5TGM1 a buněk kostní dřeně myší vznikaly četné TRAP-pozitivní mnohojaderné buňky podobné osteoklastúm (podobné OC). Tyto buňky podobné OC vytvářely na dentinových řezech resorpční otvory, což prokazovalo, že tyto buňky byly schopné resorbovat kost a mají os.teoklastický fenotyp. V pokusech použivajících přepážky v jamkách, byl pozorován vznik buněk podobných OC, když byly buňky 5TGM1 pěstovány v přímém kontaktu s buňkami kostní dřeně. Na rozdíl od toho se buňky podobné OC, které vznikly při oddělení buněk 5TGM1 od buněk dřeně membránou- v jamce, vyskytovaly pouze v malém počtu. Buňky 5TGM1 tedy indukují vznik osteoklastů ve smíšených kulturách kostní dřeně a tato indukce vyžaduje přímý kontakt buněk.

Účinek protilátek proti VCAM-1 a integrinu VLA4 vznik buněk podobných OC ve společné kultuře buněk 5TGM1 a buněk dřeně

Jak protilátka anti-VCAM-1 (VCAM-1 Ab, 10 pg/ml) -tak protilátka VLA-4-integrin (alfa 4betal Ab, 10 - pg/ml) pozoruhodně inhibovaly vznik buněk podobných OC. Na rozdíl od toho mAb proti ICAM-1, jiné adhezivní molekule buněk stromatu kostní dřeně zapojené do interakcí stroma/myelom, neměla na vznik buněk podobných OC žádný účinek (obrázek 1).

φ · · · · ·· ···· ·· φ • · · · · · · · φ φ • · · 9 · Φ ' Φ · Φ ·

ΦΦΦ · · · · Φ Φ ·

ΦΦΦ ·· ·· ΦΦ ·· ΦΦΦ

Aby se určilo, zda tato inhibice prostřednictvím.VCAM-1 a VLA-4 mAbs byla specifická pro vznik buněk podobných OC indukovaný 5TGM1 a nebyla způsobená cytotoxicitou, byl účinek těchto protilátek vyšetřován na vzniku buněk podobných OC indukovaným 1,25 (OH) ₂D₃, široce používaným stimulátorem osteoklastogeneze v myších buněčných kulturách kostní dřeně (Takahashi 1988) . Ani VCAM-1 Ab nebo VLA-4 mAb neinhibovaly vznik buněk · podobných OC indukovaný vitaminem D3, který

samotný nemá žádný účinek stromatu (data neuvedena).	na expresi	VCAM-1 na	buňkách
Účinek kondiciovaných médií	sklizených	ze společné	kultury
5TGM1 a ST2 na resorpci kostí
Kondiciované médium pro	společnou kulturu buněk	5TGM1 a

ST2 vykazovalo výrazné zvýšení resorpce kostí, v testu na. dlouhých, kostech fétu laboratorního potkana (obrázek 2), zatímco kondiciované médium z 5TGM1 způsobilo pouze malé zvýšení ve srovnání s kontrolním médiem. Kondiciované médium z buněk ST2 nevykázalo žádné zvýšení resorpce kostí.

Tudíž· přímý kontakt buněk prostřednictvím obou VCAM-1 a VLA-4 indukuje buňky podobné osteoklastům a in vitro produkci faktorů resorbujících kost.

Účinek rekombinantní rozpustné VCAM-1 (sVCAM-1) na aktivitu resorbůjící kost a osteoklastogenní aktivitu buněk 5TGM1

Kondiciované médium z 5TGM1 ošetřených rozpustnou rekombinantní formou VCAM-1 (sVCAM-1) zvyšovalo resorpci kostí na dlouhých kostech fétu laboratorního potkana způsobem závislým na dávce, zatímco kondiciované médium získané z neošetřených 5TGM1 zvyšovalo resorpci kostí pouze omezeně. Rozpustná VCAM-1 samotná neměla žádný účinek na resorpci kostí (data neukázána). V systému tkáňové kultury myší kostní dřeně kondiciované médium sklizené z buněk 5TGM1 ošetřených VCAM-1 vykázalo zvýšenou aktivitu, co se týče vzniku buněk podobných OC, zatímco kondiciované médium . získané z neošetřených 5TGM1 projevovalo pouze omezenou aktivitu na vznik buněk podobných OC (obrázek 3).

Exprese mRNA ligandu Rank v buňkách stromatu kostní dřeně (ST2) pěstovaných v přítomnosti a nepřítomnosti myších myelomových buněk

Protože se zdá, že ligand Rank je důležitý mediátor tvorby OCL a může být konečnou společnou.metabolickou drahou pro působení osteoklastogenních cytokinů na tvorbu OCL, zkoumali původci expresi ligandu Rank v buňkách 5TGM1 a ST2 individuálně a při společné kultivaci. Původci zjistili, že společná kultivace buněk 5TGM1 a ST2 indukuje mRNA ligandu Rank, v buňkách ST2. Navíc,, i když buňky 5TGM1 neexprimuj-í ligand Rank, učiní tak při ošetření s VCAM-1 (neukázáno). Konečně kondiciované médium z buněk 5TGM1 ošetřených VCAM-1 indukovalo mRNA ligandu Rank v buňkách ST2, což svědčilo pro to, že metabolická dráha VCAM-l/VLA-4 produkuje v myelomových buňkách cytokin, který zvyšuje expresi ligandu Rank buňkami stromatu kostní dřeně (data neukázána).

Souhrnem, původci prokázali, že. buňky 5TGM1 samotné produkují omezené množství' aktivity, která stimuluje vznik buněk podobných OC a resorpci kostí. Ale když byly myelomové buňky 5TGM1 společně pěstovány s buňkami kostní dřeně obsahujícími ' hemopoetické prekurzory osteoklastů a buňky, stromatu, adherovaly silně k buňkám stromatu a zvyšovaly vznik buněk podobných OC. Ve společných kulturách,, kdy bylo buňkám 5TGM1 zabráněno v kontaktu s buňkami stromatu, nevznikaly žádné buňky podobné OC. Navíc v orgánových kulturách dlouhých kostí fétu laboratorního potkana zvyšovalo

9 99 9 9 kondiciované médium sklizené ze společných kultur myelomových buněk 5TGM1 a buněk stromatu kostní dřeně ST2 aktivitu resorbující kost ve srovnání s kondiciovaným médiem ze samotných ST2 nebo 5TGM1. Tato data jsou konzistentní s teorií, že přímý mezibuněčný kontakt buněk 5TGM1 s buňkami stromatu kostní dřeně je vyžadován pro produkci aktivity stimulující osteoklasty a resorpci kostí. Původci tedy zjistili, které buněčné adhezivní molekuly byly zapojeny do přímých buněčných interakcí mezi buňkami 5TGM1 a buňkami stromatu kostní dřeně, které jsou nutné pro vytvoření osťeoklastogenní aktivity.

Data původců ukazují, že VCAM-1 a integrin VLA-4 mají úlohu v těchto buněčných interakcích, protože neutralizační protilátky k těmto dvěma adhezivním molekulám vážně snížili vznik buněk podobných OC ve společných kulturách. Interakce VCAM-1/integrin VLA-4 je zodpovědná za buněčnou komunikaci mezi buňkami stromatu kostní dřeně a myelomovými buňkami 5TGM1, která vede ke zvýšenému vytvoření osteoklastogenní aktivity a aktivity resorbující kost. Konečně, tato aktivita resorbující kost je částečně způsobena indukcí ligandu Rank.

Příklad 2 . ý Pokusy in vivo

In vivo studie původců svědčí pro to, že interakce mezi VLA-4 na myelomových buňkách s VCAM-1 na buňkách stromatu kostní dřeně může mít klíčovou úlohu v indukci aktivity myelomu· resorbující kost. Původci podnikli klíčové kroky testování této hypotézy in vivo na zvířecím modelu, který přesně odráží lidské onemocnění.

• · · · · · · 9 9 9 9 · · 9 ·· · · e · · » o·· • * ♦ · · · ·· t · · .· e · · · 99 • 9 9 9 99 9 9 99

999 «« 9* 99 99999

A. V tomto pokuse byla myším podávána injekce s le5 myelomových buněk 5TGM1, které byly ponechány kolonizovat kostní dřeň. Myši, byly rozděleny do dvou skupin po třech, jedna sloužila jako kontrolní skupina a druhá byla ošetřována dvakrát týdně počínaje 8. den s mAb PS/2. Hladiny IgG2b, protilátkového isotypu produkovaného .myelomovými buňkami 5TGM1, byly měřeny každý týden od 1. do 6. týdnu. Ošetření s mAb v dávce 80 pg na injekci (~4 mg/kg) dvakrát, týdně silně inhibovalo tvorbu IgG2b, udávající významnou inhibici přežívání myelomových buněk a růstu in vivo (obrázek 4). Dále ošetřené myši vykazovaly snížený výskyt paraplegie (všechna 3 neošetřená zvířata vykazovala paraplegii 42. den, zatímco pouze jedno z ošetřených zvířat vykazovalo, paraplegii. Dvě ošetřená zvířata bez paraplegie také vykazovala redukci' hmotnosti sleziny a jater, což také korelovalo s výskytem .nádorů. Konečně, ošetřená zvířata vykazovala redukci rozsahu nádoru při histologickém vyšetření (ód .6,71 ± 1,74 do 0,05 ± 0,08 mm³) tibií a femurů. Na sérové hladiny, kalcia ošetření nemělo žádný vliv (data neukázána).

B. V paralelně probíhajícím pokuse nemělo ošetření se 40 pg PS/2 dvakrát týdně žádný účinek na hladiny IgG2b (neukázáno). Tato data ukazují, že mAb PS/2 proti VLA-4 silně inhibuje růst usazených myelomových buněk způsobem závislým na dávce.

C. V dalším in vivo pokuse byla myším 18 SCID podána injekce s myelomovými buňkami 5TGM1 v den 0. Čtyři myši byly ošetřeny s PBS, 4 myši byly ošetřeny podle'profylaktického protokolu s mAb M/K-2.7 reaktivní proti, myší VCAM-1 v dávce 80- pg (4 mg/kg) každé 3 dny počínaje v den -1 (tj. dny -1, 2, 5, 8, a 11) . V paralelním pokuse používajícím stejný protokol bylo pět myší ošetřeno se 160 pg mAb M/K-2.7. Kromě toho bylo pět • · e>

myši ošetřeno se 160 pg mAb M/K-2.7 počínaje 8. den (tj. dny 8, 11, 14, 17 a 20) terapeutického protokolu. Všem myším bylo odebráno sérum ve dnech 21, 28 a'35 a zvířatům bylo provedeno • rentgenové vyšetření, a pak byla utracena, aby se provedlo histologické vyšetření v 35. den. Všechny tři ošetřené skupiny vykazovaly snížení sérových hladin IgG2b, udávající snížený výskyt myelomových buněk (obrázek 5) . Relativně ke kontrolám byl také pozorován významný účinek na hmotnost sleziny při použití profylaktického protokolu s nízkými dávkami (0,23 ± 0,14 g u kontrol versus 0,08 ± 0,04 u ošetřených). V profylaktické skulině' s vysokými dávkami 4 z 5 zvířat vykázala jasnou redukci hmotnosti sleziny, ale celková hodnota nebyla významná díky jednomu zvířeti s velkou hmotností sleziny (data neukázána).

D. Je také možné zkoumat, zda počáteční vysoká dávka jako bolus antagonisty alfa 4 integrinu, následovaná udržovací dávkou, zlepší účinnost. Myelomové buňky jsou již usazené v kompartmentu kostní dřeně a jejich těsná interakce s VCAM-1 závislá na VLA-4 musí být inhibována. Navíc lze předpokládat, že čím je počet usazených myelomových buněk větší, tím. je vyžadována vyšší počáteční dávka pro vyplavení buněk do periferní cirkulace.

Byla tedy provedena větší ' studie s anti-VLA-4 protilátkou PS/2. Dvaceti osmi myším SCID byla podána injekce s myelomovými buňkami 5TGM1 v den 0. Devět myší nedostalo žádné ošetření, 9 dostalo izotypově souhlasnou kontrolní' IgG mAb, 10 myší bylo ošetřeno s mAb PS/2 proti alfa 4 integrinu. Byl podáván odlišný terapeutický režim, ve kterém byla myším podána vysoká dávka mAb (200 pg) ve dnech 4, 5. a 6, a poté udržovací dávka 80 pg (4 mg/kg) každé 3 dny počínaje 8. dnem.

• ···· ·· ····9 9 • · 9 9 9 9 · ·9 •99 9 9 99 99 9·999

Byla nalezena statisticky významná redukce sérového IgG2b, když byla ošetřená skupina srovnána buď s neošetřenou skupinou nebo skupinou ošetřenou kontrolním IgG ve 3. a 4. týdnu (data neuvedena). Je důležité, že když byla ošetřená skupina srovnána buď s neošetřenou nebo skupinou nebo skupinou ošetřenou kontrolním IgG,' byl zřetelný vliv na přežití (obrázek 6).

Příklad 3

Další pokusy in vivo

Na základě informací zde uvedených poprvé, mohou odborníci snadno potvrdit a . rozšířit důležitost alfa 4 integrinů a jejich ligandů u mnohočetného myelomu při použití popsaného zvířecího modelu myší.

Následující série pokusů je v kompetenci odborníka . na základě předkládaného popisu, slouží tedy pouze ..jako příklad a vynález nijak neomezuje.

1) Odpověď na dávku mAb PS/2 pro stanovení optimální udržovací dávky podávané dvakrát týdně. 80 pg ukazovalo dobrou účinnost, ale 40 pg bylo bez účinku. Lze vyšetřit vyšší dávky až do 20 mg/kg dvakrát nebo třikrát týdně pro určení optimálního dávkování.

2) Pacienti s nemocí v různých stupních závažnosti, spojeni se zvýšeným výskytem nádorů. Lze' vyšetřit účinnost mAb PS/2 podávané v různých časech po stanovení nemoci, tj . lze srovnávat zahájení ošetření v 8 dnech (viz například obrázek 4) se zahájením po dvou, třech, čtyřech a pěti týdnech po inokulaci, aby bylo' možné vidět, jak pozdě může být mAb příznaků.

podávána, aby poskytala určitou úlevu od

Lze vyšetřit následování (dávkování, účinek mAb MK-2 proti stejných parametrů časování dávkování) pro účinnosti budou nezbytné myší VCAM-1 při navržených ' výše mAb proti VLA-4.

že pro pozorování podobné hladiny dávek.

Jsou vyšetřovány další markéry výskytu nádorů v kostní dřeni kvantifikace kostních lézí

Očekává se, progrese myelomu, včetně a na místech mimo dřeň, pomocí rentgenografické histomorfometrie, měření analýzy skeletu prostřednictvím rychlosti resorpce kostí vyhodnocením zesítění kolagenu v plazmě, měření tvorby monoklonálního proteinu v plazmě, výskyt hyperkalcémie a úmrtnost.

5) Mnohočetný myelom je v současnosti neúčinně léčen podle standardních chemoterápeutických režimů. Lze . zkoumat aditivní nebo synergický účinek mAbs v optimálním dávkování ve spojení s dávkováním podle příslušného chemoterapeUtického režimu, ať už před tímto režimem nebo po něm.

6) Lze zkoumat schopnost malé molekuly inhibitoru alfa 4 integrinu, který je selektivní pro jeden konkrétní alfa 4 integrin nebo je selektivní pro několik alfa 4 integrinu najednou nebo schopnost kombinace těchto inhibitorů, napodobovat účinek mAbs a blokovat progresi myelomu s použitím protokolů a výsledků popsaných výše. Inhibitory s malou molekulou jsou podávány parenterálně nebo perorálně, v rozmezí dávek od 0,1 do 30 mg/kg, jednou nebo .dvakrát denně nebo dvakrát nebo třikrát týdně.

♦ · ····

Přehled citované literatury

Alsina M, Boyce B, Devlin R, Anderson JL, Craig F, Mundy GR, Roodman GD.

Development of an in vivo model of human multiple myeloma bone disease. Blood 87:

1495-1501,1996.

Attal M, Harousseau JL, Stoppa AM, Sotto JJ, Fuzibet JG, Rossi JF, Casassus P, Maisonneuve H, Facon T, Ifrah N, Payen C, Bataille R. A prospective, randomized trial of autologous bone marrow transplantation and chemotherapy in multiple myeloma. lntergroupe Francais du Myelome. N Engl J Med 335: 91-97, 1996.

Bataille R, Jourdan M, Zhang XG, Klein B. Sérum levels of interleukin-6, a potent myeloma cell growth factor, as a reflection of disease severity in plasma cell dyscrasias. J Clin Invest 84: 2008, 1989.

Bataille R, Chappard D, Klein B. Mechanisms of bone lesions in multiple myeloma. Hem Onc Clin NA 6: 285-295,1992.

Bataille R, Barlogie B, Lu ZY, Rossi JF, Lavabre-Bertrand T, Beck T, Wijdenes J, Brochier J, Klein B. Biologie effects of anti-interleukin-6 murine monoclonal antibody in advanced multiple myeloma. Blood 86: 685-691, 1995.

Boyce BF, Yates AJP, Mundy GR. Bolus injections of recombinant human interleukin1 cause transient hypocalcemia in normál mice. Endocrinology 125: 2780-2783,1989.

Chauhan D, Uchiyama H, Urashima M, Yamamoto K, Anderson KC. Regulation of interleukin-6 in multiple myeloma and bone marrow stromal cells. Stem Celíš 13: 3539, 1995.

Epstein J. Myeloma phenotype: Clues to disease origin and manifestation. Hem Onc Clin NA 6: 249-256,1992.

Garrett IR, Dallas S, Radí J, Mundy GR: A murine model of human myeloma bone disease. Bone 20: 515-520, 1997.

• φ φ»· φφφ φ φφφφ ΦΦΦ· φ φ φ φ φ φφ φ · · · φφφ φφ φφ φφ ·· ♦·♦

Gosslar U, Jonas Ρ, Luz A. Lifka A, Naor D, Hamann A, Holzmann B. Predominant role of alpha 4 integrins for distinct steps of lymphoma metastasis. Proč. Nati. Acad.

Sci. USA. 93:4821-4826, 1996.

Lacey DL, Timms E, Tan HL, Kelley MJ, Dunstan CR, Burgess T, Elliott R,

Colombero A, Elliott G, Scully S, Hsu H, Sullivan J, Hawkíns N, Davy E, Capparelli C,

Eli A, Qian YX, Kaufman S, Sarosi 1, Shalhoub Y, Senaldi G, Guo J, Delaney J, Boyle

WJ. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell 93: 165-176, 1998.

Lobb R, Chi-Rosso G, Leóne D, Rosa M, Newman B, Luhowskyj S, Osbom L, Schiffer

S, Benjamin C, Dougas I, Hession C, Chow P. Expression and functional characterisation of a soluble form of vascular cell adhesion molecule 1. Biochem.

Biophys. Res. Commun. 178: 1498-1504, 1991.

Lobb, R. and Hemler, M. The Pathophysiologic Role of alpha4 Integrins In Vivo. J.

Clin. Invcst., 94: 1722-1728 (1994).

MacDonald BR, Mundy GR, Clark S, Wang EA, Kuehl TJ, Stanley ER, Roodman GD.

Effects of human recombinant CSF-GM and highly purified CSF-1 on the formation of multinucleated cells with osteoclast characteristics in Iong-term bone marrow cultures.

J Bone Min Res 1: 227-233,1986.

Mbalaviele G, Chen H, Boyce BF, Mundy GR, Yoneda T: The role of cadherin in the generation of multinucleated osteoclasts from mononuclear precursors in murine marrow. J Clin Invest 95: 2757-2765, 1995.

Matsuura N, Puzori-McLaughlin W, Irie A, Morikawa Y, Kakudo K, Takada Y.

Induction of experimental bone metastasis in mice by transfection of integrin alpha 4 beta 1 into tumorcells. AmJPathol 148: 55-61, 1996.

• ···· ·· ···· ·· · ·· φ · φ · « φ Φ· • φ φ φ φ φφφ φ φφφ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ · · φφ φφφ

Matsuzaki Κ, Udagawa Ν, Takahashi Ν, Yamaguchi Κ, Yasuda Η, Shima Ν, Morinaga

Τ, Toyama Υ, Yabe Υ, Higashio Κ, Suda Τ. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochem Biophys Res Commun 246: 199-204,1998.

Mundy GR, Bertolini DR. Bone destruction and hypercalcemia in plasma cell myeloma. Seminář Oncol 3: 291,1986.

. Mundy GR. Myeloma bone disease. Eur. J. Cancer 34: 246-251,1998.

Papayahnopoulou T, Nakamoto B. Peripheralization of hemopoietic progenitors in primates treated with anti-VLA4 integrin. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 9374-9378, 1993.

Qian F, Vaux DL, Weissman DL Expression of the integrin a4bl on melanoma cells can inhibit the invasive stage of metastasis formation. Cell, 77: 335-347, 1994. —

Radí J, Croese JW, Zurcher C, van den Enden-Vieveen MM, de Leuuw AM. Animal model of human disease. Am. J. Pathol. 132: 593-597, 1988.

Simonet WS, Lacey DL, Dunstan CR, Kelley M, Chang MS, Luthy R, Nguyen HQ,

Wooden S, Bennett L, Boone T, Shimamoto G, DeRose M, Elliott R, Colombero A,

Tan HL, Trail G, Sullivan J, Davy E, Bucay N, Renshaw-Gegg L, Hughes TM, Hill D,

Pattison W, Campbell P, Boyle WJ, et al. Osteoprotegerin: a novel secreted protein involved in the regulationof bone density. Cell 309-319, 1997.

Takahashi N, Yamana H, Yoshiki S, Roodman GD, Mundy GR, Jones SH, Boyde A,

Suda T: Osteoclast-like cell formation and its regulation by osteotropic hormones in mouše bone marrow cultures. Endocrinology 122: 1373-1382, 1988.

Vanderkerken K, De Raeve H, Goes E, Van Meirvenne S, Radí J, Van Riet 1,

Thielemans K, Van Camp B. Organ involvement and phenotypic adhesion profile of 5T2 and 5T33 myeloma cells in the C57BL/KaLwRij mouše. Brit J Cancer 76: 451460,1997.

Takahashi N, Suda.T. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RankL. Proč Nati Acad Sci USA 95: 3597-3602, 1998.

Yoneda T, Alsina MM, Garcia JL, Mundy GR: Differentiation of HL-60 Celíš into cells with the osteoclast phenotype. Endocrinology 129: 683-689, 1992. Yoneda T, Lowe C, Lee CH, Gutierrez G, Niewolna M, Williams P, Izbicka E, Uehara Y, Mundy GR: Herbimycin A, a pp6O^c'^src tyrosine kinase inhibitor, inhibits osteoclastic bone resorption in vitro and hypercalcemia in vivo. J Clin Invest 91: 2791-2795, 1993.

Vaughan T, Williams AJ, Pritchard K, Osboum JK, Pope AR, Eamshaw JC, et al.

Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nátuře Biotechnology. 14: 309-314, 1996.

Yasuda H, Shima N, Nakagawa N, Yamaguchi K, Kinosaki M, Mochizuki S, Tomoyasu A, Yano K, Goto M, Murakami A, Tsuda E, Morinaga T, Higashio K, Udagawa N,

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použiti antagonisty interakce mezi integrinem nesoucím podjednotku alfa 4 a ligandem integrinu nesoucího' podjednotku alfa 4 pro výrobu farmaceutického přípravku k léčení mnohočetného myelomu.

   2. Použití vázaj ící podle alfa 4 nároku 1, integrin. kdy antagonista je činidlo 3. Použití podle nároku 1, kdy antagonista je činidlo vázaj ící ligand alfa 4 integrinu. 4. Použití podle nároku 2, kdy činidlo vázající alfa 4 integrin je vybráno ze skupiny obsahující a) homolog

   protilátky antagonizující interakci jak VLA-4 tak alfa 4 beta 7 s jejich odpovídajícími alfa 4 ligandy, b) homolog protilátky antagonizujicí interakci VLA-4 s alfa 4 ligandem, c) homolog protilátky antagonizujíci interakci alfa 4 beta 7 s alfa 4 ligandem.
2. 5. Použití podle nároku 4, kdy homolog protilátky je vybrán ze skupiny obsahující lidskou protilátku, chimérickou protilátku, humanizovanou protilátku a jejich fragmenty.
3. 6. Použití podle nároku 3, kdy činidlo vázající ligand alfa 4 integrinu je homolog protilátky anti-VCAM-1.
4. 7. Použití podle nároku 6, kdy homolog protilátky je vybrán ze skupiny obsahující lidskou protilátku, chimérickou protilátku, humanizovanou protilátku a jejich fragmenty.

   • ···· 00 0 0 ·♦ 00

   00 0 0 0 0 0 0 0

   0 »000 0 0 0 0

   000 00 00 00 0 0 000
5. 8. Použiti podle nároku 1, kdy antagonista je malá molekula.
6. 9. Použití podle nároku 1, kdy farmaceutický přípravek je podáván v dávce '0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti.
7. 10. Použití antagonisty interakce mezi integrinem nesoucím podjednotku alfa 4 a ligandem integrinu nesoucího podjednotku alfa 4 pro výrobu farmaceutického přípravku k inhibici resorpce kosti spojené s nádory kostní dřeně.

   11. Použútí podle nároku 10, kdy antagonista je činidlo vázaj ící alfa 4 integrin. 12. Použití podle nároku 10, kdy·., antagonista je činidlo vázaj ící ligand alfa 4 integrinu. 13. Použití podle nároku 11, kdy činidlo vázající alfa 4 integrin je homolog protilátky anti- VLA-4 nebo homolog

   protilátky anti-alfa 4'beta 7.
8. 14. Použití podle nároku 13, kdy homolog protilátky je vybrán ze skupiny obsahující lidskou protilátku, chimérickou protilátku, humanizovanou protilátku a jejich fragmenty.
9. 15. Použití podle nároku 12, kdy činidlo vázající ligand alfa 4 integrinu je homolog protilátky anti-VCAM-1.
10. 16. Použití podle nároku 15, kdy homolog protilátky je'vybrán ze skupiny obsahující lidskou protilátku, chimérickou protilátku, humanizovanou protilátku a jejich fragmenty.
11. 17. Použití podle nároku 10, kdy antagonista je malá molekula.

    B.

    19.

    20.

    Použiti v dávce

    Použiti v dávce podle

    0, 1 až podle nároku
12. 20 mg/kg nároku

    10, kdy antagonista je tělesné hmotnosti.

    17, kdy antagonista je schopné poskytnout dávku malých molekul mg/kg tělesné hmotnosti.

    Použití antagonisty interakce mezi integrinem alfa 4 a ligandem integrinu výrobu farmaceutického podj ednotku podj ednotku alfa 4 pro podáván podáván

    0,1 až 30 . nesoucím nesoucího k léčení nemoci charakterizované přípravku výskytem osteoklastogeneze.

    21. Použití vázaj ící podle alfa 4 nároku integr: 20, Ln. kdy antagonista je činidlo 22. Použití podle nároku 20, kdy antagonista je činidlo vázaj ící ligand alfa 4 integrinu 23. Použití podle nároku. 21, kdy činidlo vázající alfa 4

    integrin je homolog protilátky anti-VLA-4 nebo homolog protilátky anti-alfa 4 beta 7.
13. 24. Použití .podle nároku 23, kdy homolog protilátky je vybrán ze skupiny obsahující lidskou protilátku, chimérickou protilátku, humanizovanou protilátku a jejich fragmenty.
14. 25. Použití podle nároku 22, kdy činidlo vázající ligand alfa 4 integrinu je homolog protilátky anti-VCAM-1.

    ···· •Φ ··«· ♦ · · ·· · · · · · • · · · · · Φ · • · · · · ···· · ·«· · · · · · · · *♦· ·· ·· ·· ·· ···
15. 26. Použiti podle nároku 25, kdy homolog protilátky je vybrán, ze skupiny obsahující lidskou protilátku, chimérickou protilátku, humanizovanou protilátku a jejich fragmenty.

    27 . Použití molekula podle nároku 20, kdy antagonista je malá Λ 28 . Použití podle nároku 20, kdy antagonista- je podáván V v dávce 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti. 29. Použití podle nároku 27, kdy antagonista je podáván

    v dávce schopné poskytnout dávku malých molekul 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti.