CZ2001646A3 - Způsob chromatografického čištění insulinů - Google Patents
Způsob chromatografického čištění insulinů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2001646A3 CZ2001646A3 CZ2001646A CZ2001646A CZ2001646A3 CZ 2001646 A3 CZ2001646 A3 CZ 2001646A3 CZ 2001646 A CZ2001646 A CZ 2001646A CZ 2001646 A CZ2001646 A CZ 2001646A CZ 2001646 A3 CZ2001646 A3 CZ 2001646A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- insulin
- pressure
- water
- brand
- insulins
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 title abstract description 47
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 title abstract description 47
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 title abstract description 22
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 title description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 29
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 7
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical group CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 3
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N benzene Substances C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 abstract description 3
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 abstract 1
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 25
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 15
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 15
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 14
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 11
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 11
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 3
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 3
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 3
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N Propane Chemical compound CCC ATUOYWHBWRKTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 2
- 229960004592 isopropanol Drugs 0.000 description 2
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000004237 preparative chromatography Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 102100031272 Calcineurin B homologous protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 241001510512 Chlamydia phage 2 Species 0.000 description 1
- 206010011469 Crying Diseases 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101000777239 Homo sapiens Calcineurin B homologous protein 2 Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N acetic acid trimethyl ester Natural products COC(C)=O KXKVLQRXCPHEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 150000001335 aliphatic alkanes Chemical class 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- -1 insulin amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 238000001935 peptisation Methods 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000001294 propane Substances 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012798 spherical particle Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Hematology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká zlepšeného způsobu chromatografického čištění insulinů.
Dosavadní stav techniky
Aby byly splněny extrémně vysoké požadavky na čistotu, vyznačují se postupy výroby insulinů v podstatě vedle enzymatických nebo/a gentechnických způsobů chromatografickými způsoby ,
Pod pojmem insuliny se. zde rozumí insuliny pocházející z přírodních zdrojů nebo rekombinantní insuliny (to znamená exprimované geneticky modifikovanými mikroorganismy) zvířecího nebo lidského původu (například prasečí insulin, hovězí insulin nebo humánní insulin), proinsuliny (například prekursory insulinu, preinsuliny) neJbo deriváty insulinu.
Jako deriváty riváty přírodně se insulinu nebo zvířecích alespoň jednoho přírodně nv nebo/a adicí alespoň organického zbytku odpovídajícího, se vyskytujícího insulinu.
označovány insulinů, které se následující detotiž humánního liší substitucí insulinu jsou vyskytujících insulinů, se vyskytujícího esteru aminokyselijednoho zbytku aminokyseliny nebo/a jinak stejného, přírodně
Humánní insulin je aminokyselin. Tak zvaný B (basický) řetězec z 30 aminokyselin se vyskytuje vždy dva cysteinové můstek (oba řetězce můstky). V a B-řetězce který je řetězec vybudován z 51 sestává z 21, obou řetězců přičemž jsou d i sulfidový cvsteinovými polypeptid,
A (kyselý) zbytků aminokyselin.
cysteinových zbytků, zbytky spolu spojeny přes jsou spolu spojeny dvěma biologicky aktivním humánním insulinu jsou Aspolu spojeny přes dva cysteinové můstky a další • · · · · ♦ • · · · · · · · ·«· ··· · · · · · můstek je v A-řetězci. Následující cvsteinové zbytky jsou spolu spojeny v (biologicky účinném) humánním insulinu:
A7 - All
A7 - B7
A20 - B19
Písmena A nebo B označují příslušné řetězce insulinové aminokyseliny,. číslice označují polohu zbytku aminokyseliny, která se počítá od aminového konce ke karboxylovému konci příslušného řetězce aminokyseliny.
Výroba rekombinantního insulinu probíháí obvykle ve stupních fermentace a otevření buněk, následovaných proteinchemickými a technologickými výrobními postupy, obvykle chromatografickými procesy čištění produktu.
Gentechnické způsoby umožňují vyrábět lidský proinsulin nebo proinsulin (proinsulin od derivátů insulinu), který má jednu aminosekvenci nebo/a délku řetězce aminokyseliny odlišnou od humánního insulinu, v mikroorganismech. Proinsulinv vyrobené geneticky pozměněnými buňkami Escherichia coli nemají žádné korektně spojené cvsteinové můstky. Způsob získávání, humánního insulinu s korektně spojenými cysteinovými můstky je známý například z EP 0 055 945. Zlepšené způsoby výroby humánního insulinu a derivátů insulinu s korektně spojenými cysteinovými můstky jsou popsány v EP 0 600 372 Al (US 5,473.049) a v EP 0 668 292 A2 (US 5,663.291).
Proinsulin vyrobený geneticky modifikovanými mikroorganismy, prekurzor insulinu, se nejdříve izoluje z buněk, korektně se složí a pak se enzymaticky přemění na humánní insulin. Štěpná směs, vzniklá při enzymatických peptizačních procesech, obsahuje vedie nežádoucích vedlejších produktů také cennou látku jakož i nežádoucí doprovodné látky podobné insulinu, které se od cenného produktu neliší zřetelně ani molekulovou hmotností ani jinými fyzikálními vlastnostmi, což značně ztěžuje dělení a čištění právě ve velkoprovozním měřítku.
·· ·· ·· ·♦ *· · • ·· · · · · · · · · · *·· · · * ·· · ··· · · · · · · ··*· ·· ·· ···· ·· ···
Provozně technické postupy pro vyčištění jsou různé, za setou zařazené chromatografické způsoby (například adsorpční chromatografie, ionexová chromatografie, vysokotlaká chromatografie s obrácenými fázemi nebo jejich kombinace), částečně ve více stupních s různými nosnými materiály, zčásti s navazující krystalizací, přičemž se vlastní vyčištění dosahuje chromatografií. K oddělení doprovodných látek podobných insulinu dochází přitom na iontoměničích nebo na nosičích na bázi silikagelu s obrácenými fázemi.
Konečné oddělení nejmenších nečistot jako poslední stupeň čištění se obvykle provádí v oblasti vysokého tlaku pomocí chromatografie na silikagelu s obrácenými fázemi (RP-HPLC = Reversed Phase High Pressure Liguid Chromatography = vysokotlaká kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi).
Pod pojmem silikagel s obrácenými fázemi (to znamená li— pofilně modifikovaný, tedy hvdrofóbní silikagel) se rozumí křemičitanový materiál, na který byla nanesena hvdrofóbní vrstva. Pro hvdrofóbní vrstvu se použijí například alkany s délkou řetězce o 3 až 20 atomech uhlíku, zejména o 4 až 18 atomech uhlíku. Velikosti zrn leží v rozmezí 10 až 50 pm, velikosti pórů v rozmezí 50 až 300 . 10'10 m.
Jako příklady chromatografických způsobů, které používají podle stavu techniky silikagelv s obrácenými fázemi (lipofilně modifikované silikagelv), je možno jmenovat postupy podle EP 0 547 544 Ά2 (US 5,621.073) nebo EP 0 474 213 AI (US 5,245,008). Podle stavu techniky mohou být splněny vysoké požadavky na čistotu insulinů, které mají být vyrobeny, pouze použitím silikagelů s obrácenými fázemi. Použití silikagelu s obrácenými fázemi však má značné nevýhody.
Silikagely s obrácenými fázemi jsou v rozmezí od pH 2 do pH 10 stabilní. Při chromatografi i fermentačních produktů se získají vždy vvsokomolekulární vedlejší produkty, které ·* ·· ·· • « · · * « · · · · ··· · » · ·t • 4 · · · 4 4 «·« ···· 44 44 ···· *·· jsou nevýhodně absorbovány a obvyklou elucí nemohou být desorbovánv. Vedlejší produkty se časem obohacují na silikagelu s obrácenými fázemi (hovoří se o stárnutí adsorbčního. prostředku). Regenerace, popřípadě čištění na místě (ClP-cleaning in plače) se většinou daří jen promýváním zředěným louhem sodným. Tím se při každém postupu CIP rozruší část silikagelu s obrácenými fázemi, jehož stálé nahrazování je velmi nákladné. Dále existuje pro insuliny na silikagelech denaturační nebezpečí.
Je známa řada pokusů, jak nahradít silikagely s obrácenými fázemi na bázi silikátů. Pokusy s materiálem s obrácenými fázemi na bázi oxidu hlinitého nebo oxidu titaničitého (oba materiály nejsou zcela pH-stabi lni ,. ale alespoň stabilnější nežli silikagel) ukázaly, že dělení je pouze nedostatečné a že požadované specifikace, popřípadě čistoty nelze dosáhnout.
Další nutnou vlastností chromatografických materiálů je jejich stabilita vůči tlaku. Pod pojmem polymerní chromatog·rafické materiály stabilní vůči tlaku se rozumí částice (které se mohou vyskytovat v nejrůznějších formách, jako ve formě tyčinek, ve formě zlomků nebo s výhodou v kulové formě a s výhodou mají průměr mezi 10 a 35 pm) organických polymerů, jejichž deformace pod tlakem (až 7 MPa) je jen malá. Materiál vyskytující se v chromatografické koloně musí byt tak dobře naplněn, aby nebyly přítomné žádné dutiny (kvalita plnění rozhoduje o výsledku dělení). K plnění kolon jsou v zásadě známé dvě rozdílné techniky, které mohou být použity i v kombinaci. Existuje metoda, pomocí níž se pomocí pístu (většinou hydraulicky ovládaného) náplň stlačí (DAC = Direct Axial Compression - přímé axiální stlačení), popřípadě se kolona hydrodynamicky naplní pomoc í vysokotlakého čerpadla, to znamená suspenze kapaliny a částic se do kolony vtačí. V obou případech ukazuje praxe, že na průřez kolony musí působit tlaky až 7 MPa, aby částice mohly být naplněny pokud možno hustě a bez vznikajících dutin.
·· ·· ·· ·· ·· • · > · · 9 · · 9 · • · · «· « ·· • · · · · · · ·· « • · · · · t «· ···· *· ·· ···· «·
Mnohé částice organických polymerů nejsou stabilní na tlak a deformují se působením tlaku natolik, že se z kuliček stanou ploché destičky, které se překrývají a zamezují průtoku náplní. Naproti tomu jsou siikagely s obrácenými fázemi samy o sobě podstatně tvrdší a téměř se působením tlaku nedeformuj í .
Podstata vynálezu
Vynález si klade za úkol poskytnout způsob chromatografického čištění insulinů na vhodných chromatografických materiálech. které by byly stabilní vůči tlaku a byly by použitelné v celém rozsahu pH od 1 do 14, čímž by se dosahoval tak vysoký dělící výkon, že k docílení potřebné čistoty insulinu při současném zvýšení výtěžku by byl místo obvyklých dvou nebo více po sobě zařazených chromatografických stupňů podle dosavadního stavu techniky zapotřebí pouze jediný dělící stupeň .
Tento úkol je vyřešen způsobem chromatografického čiš-? tění insulinů, který spočívá v tom, že se použije jako stacionární fáze organický polymerní chromatografický materiál stabilní vůči tlaku, mobilní fáze obsahuje nejméně jedno s vodou mísitelné organické rozpouštědlo a nejméně jeden pufr a hodnota pH činí 7 až 11.
Neočekávaně bylo zjištěno, že se chromatografií v rozmezí pH od 7 do 11, tedy v bazickém rozmezí, dosáhne velmi dobrého rozdělení na organických polymerních chromatografických materiálech. Hodnota pH činí s výhodou 9 až 10.
Zvláštní výhoda způsobu podle vyná.lezu spočívá v tom, že v tomto bazickém rozmezí pH je potlačena tvorba amidoinsu1 i nu, vedlejšího produktu, který obvykle vzniká v kyselém prostředí a který se podle specifikací insulinových přípravků musí oddělit na velmi malá zbytková množství.
·· · ··· ·· ···
Mobilní fáze, které se použijí pro eluci, obsahují organická rozpouštědla mísitelná s vodou, jako například alkoholy, které obsahují 1 až 4 atomy uhlíku, ketony, methvlacetát nebo acetonitril. Výhodné jsou alkoholy jako například 1-propanol nebo 2-propanol (n- nebo iso-propanol), methanol nebo ethanol. Koncentrace organických rozpouštědel mísitelných s vodou činí 1 až 90 % objemových, s výhodou 10 až 50 % obj emových.
Mobilní fáze obsahují dále pufr, aby se hodnota pH elučního prostředku udržela na konstantní hodnotě. Vhodné puf ry jsou například fosfáty, alkalické soli nebo soli alkalických zemin, jako citrát sodný nebo acetát draselný, citrát amonný, acetát amonný, síran amonný nebo chlorid amonný.
Nastavení hodnoty pH se dosahuje přídavkem kyseliny solné nebo louhu sodného.
Eluce může být provedena isokraticky, to znamená s. konstantní koncentrací pufrů nebo s konstantním podílem organického rozpouštědla nebo s výhodou s lineárním gradientem,, tedy se zvýšováním podílu rozpouštědla.
Průměrná velikost částic organického polymerního chro— matografického materiálu by měla činit s výhodou 5 až 300 pm, s výhodou 10 až 50 pm. Čím menší je velikost částic, tím ostřejší a lepší bude dělení. Ovšem stabilita vůči tlaku je u menších částic menší.
Insulin Je relativně malý polypeptid (molekulová hmotnost přibližně 6000) a může bez problémů difundovat do pórů o průměru 10 nm (žádná stérická zábrana). Materiály s malými průměry pórů jsou vhodnější, protože specifický povrch a tím adsorpční kapacita je větší. Průměrná velikost pórů organického polymerního chromatografického materiálu stabilního vůči tlaku činí účelně 5 až 500 nm, s výhodou 10 až 50 nm.
Pro způsob podle vynálezu jsou zvláště vhodné organ i cké polvmerní chromatografické materiály stabilní vůči působení tlaku, které jsou s výhodou tvořeny polystyrendivinvlbenzenem nebo polymethakrvlátem. Příklady obchodně běžných organických polymerních chromatografickych materiálů, stabilních vůči tlaku, které mohou být použity při způsobu podle vynálezu, jsou shrnuty v tabulce 1.
Tabulka 1
Obchodně běžné chromatografické materiály
| Výrobce | Obchodní název | Materiál | Nej menší velikost částic (pm) | Průměr pórů (nm) |
| TosoHaas | AmberchromeR | PMA | 35 | 100 |
| Pharmacia | SourceR | StDVB | 15 | 100 |
| Perseptive | PorosR | StDVB | 10 | 200 |
| Mi tsubi shi | CHP2 0 | StDVB | 35 | 100 |
| PR | ||||
| Biosepra | RPCPolvBioR | StDVB | 10 | 30 |
| Macherey | NucleogelR | StDVB | 20 | 10 |
| + Nagel | ||||
| Polymer La | - PLRPR | StDVB | 10-15 | 10 |
| boratori es |
PMA = polymethakrylát StDVB = styrendivinylbenzen
Způsob podle vynálezu se hodí pro analytickou, pro semipreparativní a zejména pro preparativní chromatografi i. Pod pojmem preparativní chromatografie se rozumí výroba čistých produktů v technickém měřítku.
Aby byla docílena čistota potřebná pro insulinové přípravky, je třeba předřadit chromatografi i s obrácenými fázemi, například podle EP 0 547 544 A2 (US 5,621.073) něho EP
474 213 Al (US 5,245.008), nejméně jednu další chromatografii s obráceným fázemi nebo latexovou chromatografií a popřípadě krystal izační operaci. Při způsobu podle vynálezu se dosahuje stejného účinku s jednostupňovou chromatografií na polymerním nosiči. Způsobem podle vynálezu se tedy celkový výtěžek při výrobě insulinu podstatně zlepšuje, protože spojením více stupňů procesu do jednoho stupně odpadají ztráty na výtěžku.
Způsob podle vynálezu se hodí k chromatografickéhmu čištění všech insulinů podle shora uvedené definice, totiž insulinů pocházejících z přírodních zdrojů nebo rekombinantních insulinů (tj. exprimovaných geneticky modifikovanými mikroorganismy), insulinů zvířecího nebo lidského původu (například prasečího insulinu., hovězího insulinu nebo humánního insulinu), proinsulinů (například prekurzorů insulinu, preinsuinů) nebo insulinových derivátů, přičemž se pod pojmem insulinové deriváty rozumí deriváty přírodně se vyskytujících insulinů, totiž humánních insulinů nebo zvířecích insulinů, které se liší substitucí alespoň jednoho zbytku přírodně se vyskytující aminokyseliny nebo/a adicí nejméně jednoho zbytku aminokyseliny nebo/a organického zbytku odpovídajícího, jinak stejného přírodně se vyskytujícího insulinu.
Jako příklady pro takové insuliny je možno jmenovat humánní insulin, hovězí insulin, prasečí insulin, insuliny podle EP 0 368 187 (US 5,656.722), například Gly(A21), Arg(B31), Arg(B32)-humánní insulin, insuliny podle EP 0 821 006 (ZA 97/6645) nebo insuliny popsané v EP 0 547 544 Al (US 5, 621.073), EP 0 474 213 Al (US 5,245.008), EP 0 600 372 Al (US 5,473.049) nebo v EP 0 668 292 (US 5,663.291) (písmena A a B představují příslušný řetězec aminokyseliny insulinu, číslo znamená polohu zbytku přírodně se vyskytující aminokyseliny, který je nahrazen zbytkem aminokyseliny uvedené před závorkou.)
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Obměny hodnoty pH
V příkladu 1 byly provedeny pokusy na semipreparativní koloně o rozměrech 10 mm v průměru a 120 mm délky, která byla naplněna PLRP 10-15 pm 100A (Polymer Laboratoř i es ) . Účelem bylo vyčistit předčištěný insulin, který měl čistotu 95 % (podle plochy odpovídajícího píku chromatogramu) tak, aby jeho čistota byla větší 98,5 %.
Požadované množství bylo tak nastaveno, aby zatížení polymerního chromatografického materiálu činilo 6 g/litr (objem kolony). Pufr a mobilní fáze jsou směsi vody a propanolu s 0,05 m amoniumacetátu a 0,1 m glycinu, které byly upraveny pomocí NaOH na příslušnou hodnotu pH. Rychlost prázdné kolony činila 150 cm/hodina. Byly nastaveny tři hodnoty pH 3,5 - pH 6,8 - pH 9. Fluát byl jímán po frakcích.
V tabulce 2 jsou znázorněny výsledky. Pouze při pH 9 se. dosahují čistoty přes 98 % a tím se splňují specifikace. Jednoznačně je zřejmé, že čištění insulinu na polymerních chromatografických materiálech vykazuje účinnost pouze v bazickém prostředí.
« « ···· «··· · · · • · · · · · · ·
Tabulka 2
Čistota a koncentrace insulinu při různých hodnotách pH s polymerním chromatografickým materiálem PLRP-S 10-15 100
| pH 3,5 | PH | 6,8 | pH | 9 | ||
| Frakce | č i stota | konc . | č i stota | konc . | č i stota | konc . |
| (%)x | (mg/ml) | (%)x | (mg/ml) | (%)x | (mg/ml) | |
| 1 | 95,22 | 0,236 | 92,74 | 0,565 | ||
| 2 | 96,74 | 0,449 | 94,68 | 0,196 | 96,70 | 1,310 |
| 3 | 96,69 | 0,690 | 94,84 | 0,274 | 98,59 | 1,362 |
| 4 | 97,43 | 1,020 | 95,38 | 0,454 | 99,54 | 2,020 |
| 5 | 97,39 | 1,240 | 96,84 | 1,120 | 98,99 | 2,230 |
| 6 | 97,14 | 1,330 | 97,95 | 2,236 | 99,24 | 1,730 |
| 7 | 96,07 . | 1,250 | 97,82 | 3,140 | 98,80 | 1,340 |
| 8 | 94,94 | 1,120 | 97,64 | 3,120 | 98,46 | 1,200 |
| 9 | 93,30 | 0,974 | 97,12 | 2,080 | 97,28 | 0,960 |
xpodle plochy odpovídajícího píku chromatogramu
Příklad 2
Stabilita vůči tlaku a naplnění kolony
Chromatografická kolona (ProchromR LC50 , o průměru 50 mm) byla naplněna DáC (Direct Axial Compression) - Technik. Chromatografický materiál (stacionární fáze) byl dodán v 100¾ methanolu a naplněn do kolony, při různých rychlostech průtoku byla změřena ztráta tlaku 11%-ní směsí n-propanolu. Tlak pístu chromatografické kolony se pohyboval mezi 5 a 8 MPa.
Zkoušeny byly následující i c ké materiály:
PLRP-S 10-15 100R (Polymer Laboratoř i es)
SourceR 15 RPC (Amersham Pharmacia Biotech)
KromasilR 13-120 (Akzo Nobel)
Materiály mají přibližně stejný průměr částic (sférické částice). PLRPR a SourceR jsou polymery, KromasilR je vysokoy hodnotný RP-silikagel.
Tabulka 3
Ztráta tlaku v MPa/cm směsi propan/voda
| Tlak pístu 0,5 MPa | Tlak pístu 2 MPa | Tlak pístu 4 MPa | Tlak pístu 8 MPa | ||||
| cm/h | PLRPR | SourceR | PLRPR | SourceR | PLRPr | SourceR | Kromas i1R |
| 50 | 0,31 | 0,40 | 0,32 | 0,85 | 0,50 | 3,33 | 0,5 |
| 100 | 0,62 | 0,80 | 0,72 | 1,85 | 1,08 | 6,33 | 1,0 |
| 150 | 1,00 | 1,50 | 1,04 | 3,14 | 1,67 | 9,33 | 1,6 |
Specifická ztráta tlaku 0,1 MPa/cm znamená pokles tlaku 3 MPa v 30 cm vysoké náplni, což je v technické chromatografii obvyklé.
Příklad 3
Čištění humánního insulinu v preparátivním měřítku
Dále isou popsány celkem 3 příklady, ve kterých je humánní insulin čištěn v technické koloně, která je podle principu DAC plněna posuvným pístem. Je použita kolona ProchromR, typ LC50. Pro všechny pokusy má náplň stejný průměr 50 mm, délku kolony 110 až 120 mm.
• · ♦ · · ·· · · ··· ··· · · · · · · ······ ···· · ··· · · · · · · ···· · · · · ···· · · · · ·
Humánní insulin o čistotě 95 % (podle plochy odpovídajícího píku chromatogramu) hy měl být přiveden na čistotu větší 98,5 %.
Byly použity tři chromatografické nosiče:
PLRP-S 10-15 100R (Polymer Laboratoř i es)
SourceR 15 RPC (Amersham Pharmacia Biotech)
KromasilR 13-120 (Akzo Nobel)
Jak je již popsáno v příkladu 2, jsou PLRP a SourceT polymerní materiály, kdežto Kromasil” je vysoce hodnotný nosič na bázi RP-si 1 ikagelu.
Pufr a mobilní fáze odpovídají údajům v příkladu 1. Náplň je uvedena v gramech humánního insulinu na litr objemu kolony. Jako výtěžek se rozumí podíl eluátu, kteý má čistotu větší 98,5 %.
Tabulka 4
Výtěžek při preparátivním čištění humánního insulinu
| Nosič | Náplň | PH | Tlak pístu | Výtěžek |
| PLRP-S 10-15 100R | 6 g/1 BV | 9 | 4 mPa | 60 % |
| SourceR 15 RPC | 6 g/1 BV | 9 | 2,5 MPa | 73 % |
| KromasilR C4 13-120 | 6 g/1 BV | 3,5 | 8 MPa | 68 % |
V tabulce 4 jsou proti sobě postaveny docílené výtěžky. Hodnoty od 60 do 70 % jsou pro délku kolony asi 12 cm překvapivě dobré. Rozhodující rozdíl mezi stavem techniky (čištění si1ikagelovým nosičem, zde KromasilemR) a chromatografií s polymerním nosičem je rozdíl pH. Pouze při hodnotě pH 9 ♦ ·
jsou dosažitelné tak vysoké výtěžky.
Příklad 4
Čištění jednorázového insulinu v preparativním měřítku
V tomto příkladu měl být vyčištěn jednorázový insulin (Fast-Acting-Insulin). Příklad má kromě toho demonstrovat, že jako výchozí materiály pro tuto chromatografickou operaci jsou přípustné i horší kvality. Podle stavu techniky se konečné čištění insulinu obvykle provádí ve dvou chromatografických stupních. Pokud se konečný stupeň naplní přímo špatným, to znamená silně znečištěným materiálem, není již možno dosáhnout požadovaných čistot a současně vysokých výtěžků.
S překvapením bylo nyní zjištěno, že zkoušený polymerní materiál tuto čistotu dosahuje v jediném chromatografickém stupni, což je umožněno malým průměrem částic od 10 do 15 pm a vynikajícími adsorpčními vlastnostmi.
Byly provedeny čtyři pokusy s následujícími výchozímistavy:
| 75 | %x | č i stoty |
| 85 | čistoty | |
| 89 | čistoty | |
| 93 | č i stoty |
xpodle plochy odpovídajícího píku chromatogramu
V tabulce 5 isou uvedeny jednotlivé výtěžky (ti. příslušný podíl použitého insulinu, který byl eluován s čistotou větší 98,5 %). Pokud výchozí stav byl pouze 75 %, nedocílí se nikdy čistota přes 98,5 %. Čistota je v oblasti pouze 93,0 %.
Pokud však výchozí stav je přes 85 %, dosáhnou se spo lehlivě požadované hodnoty vyšší 98,5 %, při výtěžcích mezi
3 80 %·
Preparativní podmínky byly popsány v příkladu 1. Všechny pokusy byly provedeny v koloně ProchromeR typ LC50 o průměru 50 mm a o výšce náplně 12 cm. Náplň byla vždy 6 g/1 BV, hody nota pH byla upravena na 9 a tlak pístu byl 3,5 MPa.
Tabulka 5
Čištění jednorázových insulinů různé jakosti
| Nosič | Čistota výchozího stavu v %x | Výtěžek (čistota vyš | |||
| ší 98,5 | %x ) | ||||
| PLRP-S | 10-15 | 100R | 75 % | 0 | % |
| PLRP-S | 10-15 | 100R | 8 5 % | 64 | % |
| PLRP-S | 10-15 | 100R | 89 % | 73 | % |
| PLRP-S | 10-15 | 100R | 93 % | 73 | % |
xpodle plochy odpovídajícího píku chromatogramu
Z tabulky 5 je dobře vidět, jak v závislosti na jakosti výchozího stavu přibývá výtěžek chromatografie. Pokusy ukazují jednoznačně, že čištění v jediném stupni je bezpečně možné .
?|/ UM~£lf6
PATENTOVÉ
Způsob chromatografického čištění insulinů, vyznačující se tím že se jako stacionární fáze použije organický polymemí chromatografický materiál stabilní na tlak,mobilní fáze obsahuje nejméně jedno s vodou mísitelné rozpouštědlo nejméně jeden pufr a pH má hodnotu 7 až
Claims (1)
- Znůsob podle nároku že pH má hodnotu 9 až1 v y z Ώ. 3 Č UCl s a 1 koho 1,Σ p u s o b podle nároků 1 že organické rozpouštědlo mísitelné který obsahuje 1 až 4 atomy uhlíku.i í cVOdOU je
4 . Způsob podle nároku 3, v V u znač u i í c í s e t í m že alkohol je 1-propanol nebe i 2-propanol. c Způsob podle nároku 3, v V J. znač u i í c í ' S 8 t í m že alkohol je ethanol. 6 . Způsob podle nároku 3, v v Λ znač u í í c í S 8 t. í m že alkohol je methanol. 7 . Způsob podls nároku 2, v y znač U l í c i S 8 t í m že organické rozpouštěj 1 o W í s i t. e 1 n é s vodou j e ton . Způsob podle nároku 2, v y znač u i í c í S 8 t í ω že organické rozpouštědl o mísitelné s vodou je met- hylacetát 9 . Způsob podle nároku 2, v v u znač u j í c í S 8 • · tím , že organické rozpouštědlo mísitelné s vodou je acetoni tri 1.10. Způsob podle nároků 1 až 9, vyznačující se tím , že koncentrace organického rozpouštědla mísitelného s vodou v mobilní fázi činí 1 až 90 obj. %.11. Způsob podle nároku 10, v y z n a č u j ící se tím , že koncentrace organického rozpouštědla misi- telného s vodou v mobilní fázi činí 10 až 50 obj. %. 12. Způsob podle nároků 1 až 11, vyznačující se tím , že eluce probíhá isokraticky.13. Způsob podle nároků 1 až 11, vyznačující se tím , že eluce probíhá s lineárně stoupajícím gradientem podílu organického rozpouštědla mísitelného s vodou.14. Způsob podle nároků 1 až 13, vyznač u jící se tím , že organický polymerní chromatograficky materiál stabilní na tlak má průměrnou velikost částic 5 až 300 pm..15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím , že průměrná velikost částic činí 10 až 50 pm.16. Způsob podle nároků 1 až 15, vyznačující se tím , že průměrná velikost pórů organického polymerního chromatografického materiálu stabilního na tlak činí 5 až 500 nm.17. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se tím , že průměrná velikost pórů činí 10 až 50 nm.18. Způsob podle nároků 1 až 17, vyznačuj ící se tím , že organicky polymerní chromatografický materiál stabilní na tlak je tvořen polymethakrylátem.• ·19. Způsob podle nároků 1 až 17, vyznačuj ící se tím , že organický polymerní chromatografický materiál stabilní na tlak je tvořen polvstyrendivinvlbenzenem.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19838097A DE19838097A1 (de) | 1998-08-24 | 1998-08-24 | Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2001646A3 true CZ2001646A3 (cs) | 2001-09-12 |
| CZ300604B6 CZ300604B6 (cs) | 2009-06-24 |
Family
ID=7878335
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20010646A CZ300604B6 (cs) | 1998-08-24 | 1999-08-11 | Zpusob chromatografického cištení inzulinu |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6710167B1 (cs) |
| EP (1) | EP1107988B1 (cs) |
| JP (1) | JP2002523732A (cs) |
| KR (1) | KR100703578B1 (cs) |
| CN (1) | CN1198843C (cs) |
| AT (1) | ATE380827T1 (cs) |
| AU (1) | AU756105B2 (cs) |
| BR (1) | BR9913092A (cs) |
| CA (1) | CA2341355C (cs) |
| CY (1) | CY1107877T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ300604B6 (cs) |
| DE (2) | DE19838097A1 (cs) |
| DK (1) | DK1107988T3 (cs) |
| ES (1) | ES2296407T3 (cs) |
| HK (1) | HK1039130B (cs) |
| HU (1) | HU227753B1 (cs) |
| ID (1) | ID29517A (cs) |
| PL (1) | PL201880B1 (cs) |
| PT (1) | PT1107988E (cs) |
| RU (1) | RU2222546C2 (cs) |
| TR (1) | TR200100634T2 (cs) |
| WO (1) | WO2000011030A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200101096B (cs) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19838097A1 (de) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen |
| DE60326271D1 (de) * | 2002-12-05 | 2009-04-02 | Wockhardt Ltd | Verfahren zur extraktion und isolierung von insulin aus recombinanten quellen |
| US6921703B2 (en) * | 2003-05-13 | 2005-07-26 | Texas Instruments Incorporated | System and method for mitigating oxide growth in a gate dielectric |
| ATE356837T1 (de) * | 2004-04-20 | 2007-04-15 | Rohm & Haas | Polymerabsorbens, und herstellungsverfahren und verwendung |
| US20080108787A1 (en) * | 2004-05-24 | 2008-05-08 | Maharaj K Sahib | Purification of Insulin-Like Material by Reverse Phase Chromatography |
| DE102004051807B4 (de) * | 2004-10-25 | 2008-10-09 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Verwendung von hydrophobiertem Kieselgel als selektives Sorbens zur Entfernung von organischen Siliziumverbindungen |
| CN100368804C (zh) * | 2006-01-24 | 2008-02-13 | 李振国 | 测定注射剂中高分子量物质含量的方法 |
| EP2451824A4 (en) * | 2009-07-09 | 2013-04-24 | Biocon Ltd | PREPARATIVE NONLINEAR CHROMATOGRAPHIC PROCESSING ON GRADIENT BASIS AND CLEANED PRODUCTS THEREOF |
| EP3091562B1 (en) * | 2010-12-28 | 2019-01-30 | Quest Diagnostics Investments LLC | Quantitation of insulin by mass spectrometry |
| RU2453331C1 (ru) * | 2011-06-29 | 2012-06-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Завод Медсинтез" | Способ получения высокоочищенного кристаллического инсулина любого происхождения |
| JP6093364B2 (ja) * | 2011-09-30 | 2017-03-08 | ジーイー・ヘルスケア・バイオプロセス・アールアンドディ・アクチボラグ | 生体分子の精製方法 |
| US10421795B2 (en) * | 2012-12-17 | 2019-09-24 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Process for purifying insulin and analogues thereof |
| CN103275210B (zh) * | 2013-06-25 | 2015-02-25 | 珠海联邦制药股份有限公司 | 脂肪酸单酰化胰岛素的色谱纯化方法 |
| EP3116531B1 (en) | 2014-03-14 | 2021-10-20 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Purifying insulin using cation exchange and reverse phase chromatography in the presence of an organic modifier and elevated temperature |
| WO2016014325A1 (en) | 2014-07-21 | 2016-01-28 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Chromatography process for purification of inlsulin and insulin analogs |
| CN105111305B (zh) * | 2015-10-10 | 2018-12-14 | 山东阿华生物药业有限公司 | 酰化胰岛素的色谱纯化方法 |
| RU2736358C2 (ru) * | 2015-12-09 | 2020-11-16 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Синбио" | Способ очистки полисиалированного инсулина человека |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1285024A (en) * | 1968-08-09 | 1972-08-09 | Novo Terapeutisk Labor As | Process of purifying insulin |
| NZ199391A (en) | 1981-01-02 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin |
| US4616078A (en) * | 1985-04-08 | 1986-10-07 | Eli Lilly And Company | Process for purifying proinsulin-like materials |
| DE3837825A1 (de) | 1988-11-08 | 1990-05-10 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| DE4028120C2 (de) * | 1990-09-05 | 1996-09-19 | Hoechst Ag | Verfahren zur Reinigung von Insulin und/oder Insulinderivaten |
| ATE150032T1 (de) * | 1991-12-18 | 1997-03-15 | Hoechst Ag | Verfahren zur gewinnung von insulinhaltigen lösungen |
| ATE148710T1 (de) | 1992-12-02 | 1997-02-15 | Hoechst Ag | Verfahren zur gewinnung von proinsulin mit korrekt verbundenen cystinbrücken |
| DE4405179A1 (de) | 1994-02-18 | 1995-08-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Insulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| DK0821006T3 (da) | 1996-07-26 | 2004-08-16 | Aventis Pharma Gmbh | Insulinderivater med öget zinkbinding |
| DE19652713C2 (de) * | 1996-12-18 | 2001-11-22 | Aventis Pharma Gmbh | Verfahren zur Reinigung von Insulin und Insulinderivaten durch Chromatographie an stark saurem Kationenaustauscher |
| DE19838097A1 (de) * | 1998-08-24 | 2000-03-02 | Hoechst Marion Roussel De Gmbh | Verfahren zur chromatographischen Reinigung von Insulinen |
-
1998
- 1998-08-24 DE DE19838097A patent/DE19838097A1/de not_active Withdrawn
-
1999
- 1999-08-11 ES ES99944373T patent/ES2296407T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 WO PCT/EP1999/005887 patent/WO2000011030A2/de active IP Right Grant
- 1999-08-11 DE DE59914580T patent/DE59914580D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 PL PL346865A patent/PL201880B1/pl unknown
- 1999-08-11 DK DK99944373T patent/DK1107988T3/da active
- 1999-08-11 CN CNB998100161A patent/CN1198843C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 PT PT99944373T patent/PT1107988E/pt unknown
- 1999-08-11 KR KR1020017002331A patent/KR100703578B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-08-11 RU RU2001107841/04A patent/RU2222546C2/ru active
- 1999-08-11 ID IDW20010441A patent/ID29517A/id unknown
- 1999-08-11 BR BR9913092-0A patent/BR9913092A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-08-11 CA CA002341355A patent/CA2341355C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 EP EP99944373A patent/EP1107988B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-11 JP JP2000566302A patent/JP2002523732A/ja active Pending
- 1999-08-11 AU AU57331/99A patent/AU756105B2/en not_active Expired
- 1999-08-11 AT AT99944373T patent/ATE380827T1/de active
- 1999-08-11 HU HU0103325A patent/HU227753B1/hu unknown
- 1999-08-11 TR TR2001/00634T patent/TR200100634T2/xx unknown
- 1999-08-11 CZ CZ20010646A patent/CZ300604B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-08-24 US US09/379,796 patent/US6710167B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-02-08 ZA ZA2001/01096A patent/ZA200101096B/en unknown
-
2002
- 2002-01-16 HK HK02100330.7A patent/HK1039130B/zh unknown
-
2008
- 2008-02-04 CY CY20081100142T patent/CY1107877T1/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HK1039130B (zh) | 2006-05-12 |
| HU227753B1 (en) | 2012-02-28 |
| KR100703578B1 (ko) | 2007-04-05 |
| CA2341355C (en) | 2009-04-07 |
| US6710167B1 (en) | 2004-03-23 |
| CA2341355A1 (en) | 2000-03-02 |
| AU5733199A (en) | 2000-03-14 |
| ZA200101096B (en) | 2002-06-26 |
| PL346865A1 (en) | 2002-03-11 |
| TR200100634T2 (tr) | 2001-07-23 |
| DE19838097A1 (de) | 2000-03-02 |
| CY1107877T1 (el) | 2013-06-19 |
| PL201880B1 (pl) | 2009-05-29 |
| AU756105B2 (en) | 2003-01-02 |
| EP1107988A2 (de) | 2001-06-20 |
| HUP0103325A3 (en) | 2003-09-29 |
| BR9913092A (pt) | 2001-10-30 |
| DK1107988T3 (da) | 2008-04-21 |
| CN1313866A (zh) | 2001-09-19 |
| HK1039130A1 (en) | 2002-04-12 |
| HUP0103325A2 (hu) | 2001-12-28 |
| JP2002523732A (ja) | 2002-07-30 |
| EP1107988B1 (de) | 2007-12-12 |
| RU2222546C2 (ru) | 2004-01-27 |
| ES2296407T3 (es) | 2008-04-16 |
| PT1107988E (pt) | 2008-01-16 |
| ATE380827T1 (de) | 2007-12-15 |
| KR20010072914A (ko) | 2001-07-31 |
| WO2000011030A3 (de) | 2000-06-02 |
| CZ300604B6 (cs) | 2009-06-24 |
| WO2000011030A2 (de) | 2000-03-02 |
| ID29517A (id) | 2001-09-06 |
| DE59914580D1 (de) | 2008-01-24 |
| CN1198843C (zh) | 2005-04-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ2001646A3 (cs) | Způsob chromatografického čištění insulinů | |
| JP4975895B2 (ja) | 高圧液体クロマトグラフィーによるインシュリンの単離方法 | |
| Kroef et al. | Production scale purification of biosynthetic human insulin by reversed-phase high-performance liquid chromatography | |
| EP1709065B1 (en) | A counterion exchange process for peptides | |
| CN103080128B (zh) | Glp-1类似物的反相hplc纯化 | |
| AU637255B2 (en) | A process for the purification of insulins by chromatography | |
| EP1613409B1 (en) | Regeneration of chromatographic stationary phases | |
| Olson et al. | Preparative isolation of recombinant human insulin-like growth factor 1 by reversed-phase high-performance liquid chromatography | |
| EP1373302B1 (en) | Method for purification of molecules using unbranched terminal alkyldiols | |
| MXPA01001007A (en) | Method for chromatographically purifying insulins | |
| US11198718B2 (en) | Purifying insulin using cation exchange and reverse phase chromatography in the presence of an organic modifier and elevated temperature | |
| Hancock et al. | Biochemical applications of preparative liquid chromatography | |
| KR20020044601A (ko) | 재조합 인간 성장호르몬 유사체의 분리방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20190811 |