CZ20012966A3

CZ20012966A3 - Deriváty benzaldehydu vhodné jako protinádorové prostředky

Info

Publication number: CZ20012966A3
Application number: CZ20012966A
Authority: CZ
Inventors: Bernt Borretzen; Vidar Moen; Rolf Olaf Larsen; Erik Olai Pettersen; Camilla Bruno Dunsaed; Geir Sagvolden
Original assignee: Norsk Hydro Asa
Priority date: 1999-02-19
Filing date: 2000-02-18
Publication date: 2002-03-13
Also published as: WO2000048609A1; HUP0105281A2; CZ20012965A3; NO990814D0; JP2002537263A; EP1150689A1; NO990814L; CA2363670A1; PL350520A1; AU2834200A; MXPA01008347A; JP2002537264A; BR0008297A; SK11602001A3; IL144896A0; WO2000048610A1; IL144895A0; NO309305B1; BR0008302A; SK11612001A3

Description

Vynález se týká derivátů benzaldehydu vhodných jako protinádorové prostředky, antivirotika, imunopotenciátory a/nebo jako prostředky vhodné pro potlačeni chorob vznikajících následkem zvýšené proliferace buněk a/nebo jako prostředky pro potlačení autoimunitních chorob. Některé z uvedených sloučenin jsou sloučeniny nové.

Dosavadní stav techniky

Většina současně používaných protinádorových léčiv má cytotoxický účinek. Ačkoliv uvedené prostředky mají pozitivní výsledky při léčbě některých zhoubných nádorů jako je lymfom, leukemie a testikulární zhoubné nádory, často při jejich použití dochází k těžkým a k nepřijatelným vedlejším účinkům omezujícím možnosti jejich použití v účinné léčbě. Dále, u některých typů zhoubných nádorů, jako jsou solidní tumory (karcinomy) se dosud ukazuje, že chemoterapie má omezenou působnost protože současná cytostatika zřídka zlepší prognózu onemocnění pacienta. Schopnost nádorových buněk vyvinout si rezistenci proti cytotoxickým prostředkům patří mezi hlavní důvody pro jejich selhávání při léčbě solidních tumorů. V oboru tedy existuje značná potřeba nových protinádorových prostředků majících méně vedlejších účinků, a které by měly selektivnější účinky na maligní buňky.

Je známé, z mezi jiných zdrojů z EP-0215395, JP-63264411, JP-8800940, JP-55069510 a EP-0283139, že benzaldehydy a jeho deriváty mají selektivní protinádorový účinek.

• · · · ·· ·· · · 9 · • 9 9 · · 9 ·9 • · · · 9999>· ··· · ·99· ·· ···· ··· ··· ·· ···

Aldehydy reagují s různými nukleofilními skupinami obsahujícími 0, S nebo N, jako jsou hydroxyskupiny, thiolové skupiny a aminoskupiny za tvorby karbonylových kondenzačních produktů jako jsou acetaly, merkaptaly, aminaly atd. Nicméně s primárními aminy obvykle reagují za tvorby aduktů, Schiffových baží (iminů). Je notoricky známé, že tvorba Schiffových bázi in vivo je zahrnutá v klíčových biochemických procesech jako je transaminace, dekarboxylace a další aminokyselinami modifikované reakce zprostředkované pyridoxalfosfátem, při působení aldolasy nebo fruktosydifosfátu při glykolýze a při kondenzace retinalu s rhodopsinem v procesu vidění. Rovněž je známé, že karbonylové kondenzační reakce jsou zahrnuté v transmembránových signálních procesech, například v generaci imunitní odezvy.

Tvorba iminů probíhá dvoustupňovým mechanismem: přídavkem aminového nukleofilu ke karbonylové skupině vznikne karbinolaminový (aminohydrinový) meziprodukt ve kterém v následném dehydratačním stupni vznikne C=N dvojná vazba. Oba stupně jsou reverzibilní, přičemž reakce je podporovaná hodnotou pH. Reakce tedy probíhá způsobem, kde závislost pH/rychlost má charakteristický zvonovitý profil s nejvyššími rychlostmi reakce v mírně kyselém prostředí.

H₂N—R'

OH

R—C—N—R' I I

Η H aldehyde amine karbinolamin

R—C=N—R'

H imine + .h₂o

Nicméně také je známé, že Schiffovy baze také snadno vznikají ve fyziologických podmínkách, a že in vivo probíhá mnoho karbonylových kondenzačních reakcí (E.Schauenstein a sp., Aldehydes in biological systems, London, Pion Ltd., 1977).

Schiffovy baze jsou samy o sobě reaktivní, mají sklon zúčastnit se dalších reakcí vedoucích k adici nukleofilních prostředků na dvojnou vazbu. Z určitých aminů obsahujících síru, zejména z aminokyselin cysteinu, methioninu a rovněž glutathionu, prvotně vzniklé Schiffovy baze mohou podléhat reverzibilní vnitřní cyklizaci při které sulfhydrylová skupina se spojí s iminem za tvorby thiazolidinkarboxylátu (M.Friedman, The Chemistry and Biochemistry of Sulfhydryl

Group in Amino Acids, Peptides and Proteins,

Oxford, Pergamon

Press, 1973) .

S—CH, /

N—CH H

OH aldehyde cystein

H₂O thiazolidin-karboxylová kyselina

Výskyt reakcí probíhajících mezi karbonylovými sloučeninami a volným aminoskupinami proteinů tvořících reverzibilní vazby Schiffových baží popsali G.E.Means a R.E.Feeney (Chemical Modification of Proteins, str. 125-138, San Francisko, Holden-Day, 1971). Aromatické aldehydy jsou obecně reaktivnější než nasycené alifatické aldehydy, a mohou tvořit Schiffovy baze dokonce bez odstraňování vody vzniklé během reakce. (R.W.Layer, Chem:Rev.63 (1963), 489-510). Tato skutečnost je významná při posuzování možností tvorby Schiffových baží za fyziologických podmínek. Zaugg a sp. (J.Biol.Chem.252 (1977), 8542-8548) prokázali s použitím hemoglobinu jako zdroje aminoskupin že aromatické aldehydy mají pro tvorbu Schiffových baží dvojnásobně až trojnásobně zvýšenou reaktivitu ve srovnání s alifatickými aldehydy. Vysvětleni omezené reaktivity alkanalů spočívá ve skutečnosti, že ve vodném roztoku při neutrálním pH je pro posun rovnováhy ve prospěch tvorby Schiffových baží nutný velmi velký přebytek volného aldehydu (E.Schauenstein a sp., Aldehydes in biological systems, London, Pion Ltd., 1977).

Benzaldehyd a salicylaldehyd snadno tvoří iminové

Schiffovy baze s aminoskupinami membrán, a pro reakci benzaldehydu s aminy byly zjištěny vysoké hodnoty rovnovážných konstant (J.J.Pešek a J.H.Frost, Org.Magnet.Res., 8(1976), 173-176; J.N.Williams Jr. a R.M.Jacobs, Biochim.Biophys.Acta, 154, (1968), 323-331). Při reakci se salicyladehydem je vzniklý imin stabilizován navíc, a to díky vodíkové vazbě mezi volným elektronovým párem iminového dusíku a orto-hydroxylovou skupinou (G.E.Means a R.E.Feeney, Chemical Modification of Proteins, str. 125-138, San Francisko, Holden-Day, 1971; J.M.Dornish a E.0.Pettersen, Biochem.Pharmac.39, (1990), 309318) .

Autoři vynálezu již dříve prokázali pomocí radioaktivního značení, že benzaldehyd neproniká do buňky ale ulpívá na buněčné membráně (Dornish J.M. a Pettersen E.O.: Cancer Letters 29(1985) 235-243). Tento poznatek je ve shodě s dřívější studií prokazující, že benzaldehyd interaguje s membránovými proteiny E.coli (K.Sakaguchi a sp., Agric.Biol.Chem., (1979), 43, 1775-1777). Rovněž bylo zjištěno, že jak pyridoxal tak pyridoxal-5-fosfát chrání buňky proti cytotoxickému a protinádorovému prostředku cis-DDP. CisDPP je prostředek působící na jádro buňky. Zatímco pyridoxal v zásadě může pronikat lipofilní buněčnou membránou, u ···· 4 * · · ···· ·· · · · · · • · · · · · ♦ • · · 4 · · · · ·· ···· ··· ··· ·· ··· pyridoxal-5-fosfátu tuto možnost blokuje iontově připojená fostátová skupina. Pyridoxal-5-fosfát tedy musí vykazovat svůj chránící účinek působením na buněčnou membránu zevně. Tvorbě aduktu, Schiffově bázi vzniklé mezi aldehydem a aminoskupinami buněčné membrány rovněž odpovídá současně pozorovaný spektrální posun absorbance pyridoxal-5-fosfátu směrem k nižším vlnovým délkám (J.M.Dornish a E.0.Pettersen, Cancer Lett., 29, (1985), 235-243).

Z těchto zjištění vyplývá, že aldehydy se váží na aminy a další nukleofilní skupiny na buněčné membráně za tvorby Schiffových baží a dalších kondenzačních produktů. Také je známé, že stimulace růstu buněk je zprostředkovaná kaskádou procesů působících na buněčnou membránu z vnější strany. Stejným způsobem mohou deriváty podle předloženého vynálezu vyvolat tvorbou aduktů s ligandy na buněčné membráně spouštěcí impulsy uvnitř buňky, významné pro parametry růstu buněk jako je syntéza proteinů a mitosa, a na expresi genů suprese tumorů a imunitních reakcí. Protože kondenzační reakce jsou reverzibilní, účinky na buňku je možné modulovat posunem rovnováhy v návaznosti na vázající se složky. Přítomnost této existující rovnováhy na chemické úrovni je konzistentní s reverzibilním a netoxickým účinkem pozorovaným u derivátů benzaldehydu.

Inhibici syntézy proteinů vyvolanou deriváty benzaldehydu výzkumná skupina autorů vynálezu důkladně studuje in vitro. U solidních tumorů může redukce syntézy proteinů mít za následek nedostatek vitálních proteinů vedoucí k buněčné smrti. U normálních buněk je potenciální kapacita syntézy proteinů větší než u většiny nádorových buněk solidních tumorů. Tuto skutečnost je možné demonstrovat porovnáním doby trvání buněčného cyklu normálních kmenových buněk která je často pod • · · φ · ··· ·· ···· ··· ··· ·· ··· hodin a je tedy kratší než u většiny nádorových buněk solidních tumorů kde uvedená doba je obvykle 30-150 hodin (viz Gustavo a Pileri The Cell Cycle and Cancer. Ed. : Baserga, Marcel Dekker lne., N.Y., 1971, str.99). Protože buňky během svého buněčného cyklu v průměru zdvojnásobuji protein, znamená to že akumulace proteinu je u růstově stimulovaných normálních buněk vyšší než u většiny typů nádorových buněk.

Kromě znalosti výše uvedeného rozdílu mezi normálními a nádorovými buňkami existuje ještě další rozdíl podobného významu. Zatímco normální buňky mají odezvu na regulační růstové podněty, nádorové buňky mají uvedenou odezvu sníženou nebo žádnou. Jestliže inhibice syntézy proteinů se uplatní stejnou delší dobu jak na normální buňky tak na nádorové buňky, uvedené dva typy buněk mohou reagovat odlišně. Normální tkáň může využít svých růstových rezerv a tím si zachovat svoji normální tvorbu buněk. Nádorová tkáň však má malé nebo žádné rezervy. Ve stejném čase lze rychlost akumulace proteinu u většiny nádorových buněk hodnotit jako nízkou (tj. syntéza proteinu je pouze mírně vyšší než jeho degradace). Proto může inhibice syntézy proteinu být dostatečným faktorem pro vyvolání nerovnováhy v tumorové tkáni pokud jde o akumulaci proteinu, a vyvolat tak negativní posun ve vyváženosti určitých proteinů. Při kontinuální léčbě po dobu několika dní tak lze docílit inaktivaci buněk a nekrózu tumorové tkáně, zatímco normální tkáň zůstává nepoškozená.

Nej častěji hodnocenou sloučeninou indukující reverzibilní inhibici proteinové syntézy a vykazující protinádorovou účinnost je v současné době 5,6-benzyliden-di-askorbová kyselina, [zilaskorb(²H) ]. Tato již v oboru známá sloučenina inhibující proteinovou syntézu je podrobně popsaná v práci autorů Petterson a sp., (Anticancer Res., Vol.11, str.10777 ·· ·· ♦ · ·· • · · · tt tt · ♦ · • · · · · · · • · · · · ··· ·· '··· ··· ··· ·· ···

1082, 1991) a v EP-0283139. Zilaskorb (²H) indukuje nekrózu tumoru in vivo v lidských tumorových xenoimplantátech na holých myších (Petterson a sp., Br.J.Cancer, Vol.67, str.650656, 1993). Kromě zilaskorbu(²H) je nejbližší dosud známou sloučeninou v této oblasti pro léčbu nádorových onemocnění

4.6- O-benzyliden-D-glukopyranosa (sloučenina 1). O těchto dvou sloučeninách je známé že mají obecnou protinádorovou účinnost, a byly již hodnocené v klinických zkouškách vůči více nádorovým chorobám. Nicméně žádná navrhovaná léčba orgánů nebo tkání postižených nádorovým onemocněním navrhovaná jako vhodná s použitím uvedených sloučenin a obchodní vývoj těchto prostředků nebyly dosud schválené.

Autoři vynálezu nyní překvapivě zjistili, že benzaldehydové deriváty cukrů hexosového typu (zahrnující

4.6- 0-(benzyliden-di)-D-glukopyranosu, sloučeninu 2) mají neočekáváně silný účinek na nádory v určitých orgánech nebo v tkáních. Dosud není možné vysvětlit mechanismus výše uvedené selektivity, ale předpokládá se, že souvisí s cukernou skupinou uvedených derivátů působících na určité buňky nebo tkáně.

Autoři vynálezu rovněž zjistili, že určité nové produkty jako je například sloučenina 8, (2-acetamido-4,6-0(benzyliden-di)-2-deoxy-D-glukopyranosa), poskytují nečekaně dobré výsledky v modelu na holých myších (viz příklad 3, tabulka 1). V uvedeném pokusu byly 3 z 8 myší zbavené tumoru, což je v podobných pokusech na imunosupresivních druzích neobvyklý výsledek. Důvod tohoto jevu může spočívat v tom, že acetamidová skupina má vysokou afinitu k receptorům kyseliny hyaluronové. Je známé, že maligní tumory mají vysoký obsah kyseliny hyaluronové a proto rovněž jejích odpovídajících receptorů.

Autoři vynálezu rovněž ve svých studiích zjistili, že deuterované analogy uvedených sloučenin jsou účinnější než jejich odpovídající protonové analogy. Tento rozdíl je velmi zřejmý v pokusu hodnotícím adhezi na buňky (viz příklad 5 a rovněž příklad 8). Při náhradě atomu vodíku dvojnásobně těžkým atomem těžkého deuteriového isotopu, kinetické vlastnosti molekuly se změní v poměru ve kterém se sníží rychlost přerušení vazby C-D k rychlosti přerušení vazby C-H. Je známé, mimo jiné z práce autorů M.I.Blake a sp., J.Pharm.Sci., 64(1975), 367-391, že deuterace léčiv může změnit jejich farmakologickou funkci.

V oboru je rovněž známé (EP 0 283 139 a Anticancer Res. 15:1921-1928 (1995)) že při náhradě acetalového protonu v

4,6-0-benziliden-D-glukopyranose deuteriem (sloučenina 1 versus sloučenina 2), ovlivňuje jak syntézu proteinu tak frakci přežívajících buněk stanovenou in vitro. Autoři vynálezu předpokládají, že jedno z možných vysvětlení spočívá v tom, že účinek D-isotopu na chemické úrovni souvisí se zpomalením oxidace deuterovaného benzaldehydu na inaktivní kyselinu benzoovou což rovněž vede k delšímu poločasu deuterované účinné složky na buněčné úrovni. Nicméně pro prokázání významného rozdílu účinků na přežívající frakci NHIK 3025 buněk exponovaných sloučenině 1 respektive 2, musí být aplikovaná koncentrace léčiva více než 6 mM. Rozdíl v účincích inhibujících syntézu proteinu je velmi malý, pokud se buňky vystaví expozici koncentracím 1-10 mM.

Autoři vynálezu provedli zcela odlišný pokus. Pokus zahrnuje měření adhezní síly mezi buňkami NHIK 3025 a substrátem po preinkubaci buněk v roztocích sloučenin 1 a 2 (viz příklad 5). I při koncentracích 1 mM měl uvedený pokus ··«· · ··· · • · · · ·· ·· · · ·· ·· · · ♦··· • · · · 4 · · 4 ··

4 · · ····

4444 444 444 44444 s použitím D-isotopu překvapující výsledky. S použitím sloučeniny 2 došlo k významné redukci adhesní síly na 1/3 vzhledem ke kontrolnímu pokusu, zatímco u sloučeniny nedošlo k významné redukci adhezní síly. Autoři vynálezu předpokládají, sloučenina 2 může interferovat s biosyntézou integrinů snižujících schopnost buněk připojit se k substrátu. Integriny jsou strukturální trans-membránové proteiny rozhodující pro vazbu buněk na extracelulární matrici a pro vzájemné buněčné interakce. Inhibice funkce integrinů by tak mohla nepřímo působit na schopnost nádorových buněk metastázovat. Z uvedeného pokusu vyplývá, že integriny by mohly být zvláště senzitivní na inhibici syntézy proteinů. Podle výše uvedeného by tak sloučenina 2 mohla mít vhodné použití při prevenci šíření metastáz při vývoji nádorového onemocnění.

Chemicky indukovaná karcinogeneze má podobný mechanismus jako karcinogeneze indukovaná určitými typy virů jako jsou viry hepatitidy B a C, určité papilloma viry, určité herpes viry atd. Zejména se jedná o případ nádorového onemocnění' jater u pacientů infikovaných hepatitidou B a C. proto se dá předpokládat, že profylaktická léčba těchto pacientů sloučeninami podle vynálezu by mohla zabránit nebo oddálit vývoj nádorového onemocnění jater. Rovněž skutečnost, že uvedené prostředky mají nízkou toxicitu, je činí vhodnými pro použití v uvedené léčbě.

Z UK patentové přihlášky 9026080.3 je známé, že benzaldehydové sloučeniny, již dříve známé jako protinádorové prostředky, lze použít pro potlačení chorob projevujících se důsledkem abnormálně zvýšené proliferace buněk. Uvedené sloučeniny rovněž vykazují účinek na buňky vykazující zvýšenou rychlost buněčné proliferace, a je možné je tedy použít pro

léčbu chorob jako je psoriáza, zánětlivé choroby, revmatické choroby a další autoimunitni choroby jako ulcerózní kolitida, Crohnova chorobga a alergické dermatologické reakce.

Dermatologické abnormality jako je psoriáza jsou často charakterizované rychlou obnovou epidermis. Zatímco normální kůže produkuje asi 1250 nových buněk/den/cm² kůže obsahující asi 27 000 buněk, psoriatická kůže produkuje 35 000 nových buněk/den/cm² z 52 000 buněk. Buňky zahrnuté ve výše uvedených poruchách jsou však normální buňky, které se rychle a opakovaně reprodukují buněčným dělením. Zatímco obnova normálních kožních buněk trvá přibližně 211 hodin, u psoriatických kožních buněk se zrychlí na asi 10 až asi 36 hodin.

V současné době se psoriáza, zánětlivé choroby, revmatické choroby a další autoimunitni onemocnění léčí kortikosteroidy, NSAID a ve vážných případech imunosupresivními prostředky jako jsou cytostatika a cyklosporiny. Všechna tato léčiva mohou mít vážné nežádoucí účinky. Přetrvává tedy potřeba prostředků, které by měly méně vedlejších účinků.

Je známé, že aromatické aldehydy a jejich určité acetalové deriváty mají inhibiční účinek na růst buněk, jejichž obnova je přirozeně reverzibilní. Inhibice růstu vyvolaná uvedenými sloučeninami je v první řadě způsobená redukcí syntézy proteinů buňkami. (Pettersen a sp., Eur.J.Clin.Oncol., Vol.19, str.935-940, 1983, a Cancer Res., Vol.45, str. 2085-2091, 1981). Inhibice syntézy proteinů je účinná pouze tehdy, jestliže uvedené prostředky jsou přítomné v mikroprostředí buňky. Syntézu buněčného proteinu je proto například možné rychle vrátit na obvyklou hladinu odstraněním uvedeného prostředku z buněk (tj. ve většině případů během 1 hodiny).

Výše uvedený postup vede k tomu, že normální buňky zůstávají po ošetření výše uvedenými prostředky bez poškození.

Schopnost buněk přenášet signály mechanismem závislým na kontaktu buněk (adhezí) je již studována mnoho let. Tento mechanismus je zvláště důležitý pro reaktivitu cirkulujících buněk jako jsou lymfocyty, makrofágy atd., a rovněž například pro metastázující buňky a jejich zachycení v tkáních a tvorbě nových tumorů. Možnost změnit adhezní vlastnosti buněk které jsou řízeny imunitní nebo zánětlivou odezvou může mít velký terapeutický význam pro léčbu mnoha chorob jako je revmatoidní artritida, psoriáza, psoriatická artritida, lupus erythematodes, akné, Bechtěrovova artritida, progresivní systémová skleróza (PSS), seborrhoea a další autoimunitní choroby jako je ulcerózní kolitida a Crohnova choroba.

Imunitní systém je uspořádaný pro identifikaci a eliminaci veškerých složek které rozpozná jako cizí, ať již se jedná o bakteriální, virové nebo protozoální infekce nebo abnormální buňky jako jsou nádorové buňky. Aby imunitní systém poskytoval specifické odezvy v širokém rozsahu biotických variací představovaných různými původci poruch, musí být vysoce diverzifikovaný. Nicméně nadměrná stimulace tohoto jemně vyladěného systému může vést k různým alergickým a zánětlivým reakcím a může vyvolat autoimunitní choroby. Rovněž bývá obtížné překonat rejekci transplantátů. Významným úkolem současné terapie je modulace imunitního systému a to buď podpořením nebo omezením specifické odezvy.

·« ·· · · ♦ · • · · · ·» 99 9 99

9 · · » 99

9 9 9 9 9 99

9999 999 999 99999

V imunologickém rozpoznávacím procesu se fragment cizího proteinu zachytí v zářezu proetinu MHC třídy II na povrchu buňky prezentující antigen (APC). K tomuto komplexu MHCprotilátka je rovněž připojen receptor T-pomocného lymfocytu. K aktivaci T-pomocného lymfocytu jsou potřebné nejméně dva signály: primární signál poskytuje samotný antigen prostřednictvím komplexu MHC třídy II a zesiluje se koreceptory CD4. Druhý signál poskytuje specifická na plasmové membráně navázaná signální molekula na povrchu APC. Ligandový koreceptorový protein je lokalizován na povrchu T-pomocného lymfocytu. Oba signály jsou potřebné pro aktivaci T-lymfocytů. Jakmile dojde k jejich aktivaci, stimuluji vlastni proliferaci sekreci interleukinových růstových faktorů a syntézou ligandových povrchových buněčných receptorů. Vazba interleukinů na tyto receptory pak přímo stimuluje proliferaci T-lymfocytů.

V dekádě let 1980 bylo zjištěno, že inkluzní cyklodextrin-benzaldehydový inkluzní komplex může stimulovat imunitní systém zesílením lymfokiny aktivovaných zabíjecích buněk v modelu na myších (Y.Kuroki a sp., J.Cancer Res.Clin.Oncol. 117, (1991), 109-114). Ve studiích in vitro provedených později byla zjištěna podstata chemických reakcí na místech interakce APC-donor/receptor T-lymfocytu odpovědných za druhý ko-stimulační signál, a že uvedené reakce mají formu karbonyl-aminových kondenzací (tvorba Schiffových baží). Kromě toho bylo zjištěno, že uvedené reakce lze napodobit syntetickými chemickými složkami. Tato zjištění otvírají nové terapeutické možnosti prostřednictvím umělé potenciace imunitního systému. Ve WO 94/07479 je v patentových nárocích uvedeno použití určitých aldehydů a ketonů které tvoři Schiffovy baze a hydrazony s aminoskupinami na povrchu T-lymfocytů. V EP 0609606A je jako výhodná imunostimulačni

« ·	• 9	• 9	«9 9
•	•	9 9		• 9	«	9	99
•	•	9	9	9	*	9
•
•	•	9	9	9	«	9
♦ ·		999 9	999	999	• 9		99

sloučenina uvedená 4-(2-formyl-3-hydroxyfenoxymethyl)benzoová kyselina (tukaresol), sloučenina původně navržená k léčeni srpkovité anémie. Tato sloučenina se podává orálně a je systémově biologicky dostupná. Možné terapeutické možnosti tukaresolu které zahrnují více chorob se skupiny zahrnující bakteriální, virové a protozoální infekce, choroby související s autoimunitou a nádorová onemocnění, jsou v současné době ve stádiu zkoušek (H.Chen a J.Rhodes, J.Mol.Med. (1996) 74:497504) a současný vývoj léčiv zahrnuje i kombinační strategie podávání, kde tukaresol se podává společně s vakcínou k léčbě chronické hepatitidy B, HIV a maligního melanomu.

Rovněž bylo zjištěno stanovením imunologicky významných hodnot in vitro, že křivka závislosti dávka/odezva má zvonovitý průběh (H.Chen a J.Rhodes, J.Mol.Med.(1996), 74:497504). Tento jinak neobvyklý průběh závislosti dávka/odezva lze vysvětlit předpokladem, že vysoké koncentrace aldehydového léčiva nasytí ko-stimulační ligandy potřebné pro efektivní vazbu APC na T-lymfocyt a působí proto inhibičně. Zdá se, že optimální dávka je dávka dostatečná pro dosažení dynamické rovnováhy pro dosažení ko-stimulace bez blokovaní intercelulární ligace.

Obecně jsou aldehydy samy o sobě nestabilní díky oxidaci. 4- (2-formyl-3-hydroxyfenoxymethyl)benzoová kyselina (tukaresol), popsaná v EP-0609606 je významně stabilnější in vivo než in vitro. Důvod tohoto jevu může být v náchylnosti k oxidaci ve vodných roztocích in vitro (H.Chen a J.Rhodes, J.Mol.Med. (1996), 74:497-504). Mnoho aldehydů je příliš reaktivních k jejich podávání jako takových, a i když mají ověřený účinek in vitro jako protinádorová léčiva, při přímé aplikaci in vivo dráždí a jsou pro uvedené podání nevhodné. V biotickém systému karbonylové skupina aldehydu rychle • · · · * ·· ·· · · ·· • · · ·· »' e · · · · ·· ··· · · · ·· ·· ···· ·♦· ··· ····· reaguje s nukleoflíními skupinami které jsou především přítomné ve všech tělních tekutinách. ' Tyto nežádoucí vedlejší reakce mohou vést k rychlé metabolizaci léčiva a obtížnému řízení hladiny účinné složky v séru. Pro dosažení účinné imunopotenciace je rozhodující řízení koncentrace léčiva na buněčné úrovni v úzkém rozmezí. Tukaresol se podává orálně jako nechráněný aldehyd, a je podezření, že dochází k rozkladu léčiva a problémů pří řízení jeho farmakokinetiky.

U benzaldehydových derivátů 4,6-benzyliden-D-glukosy a jejich deuterovaných analog (sloučenina 1 a 2) bylo prokázáno, že mají vysokou biologickou dostupnost buď při i.v. podání nebo při p.O. podání. Bylo zjištěno, že biologická dostupnost stanovená koncentrací léčiva v séru po orálním podání sloučeniny 2 myším BALB je 93-99 %. (C.B.Dunsaed, J.M.Dornish a E.O.Pettersen, Cancer Chemother.Pharmacol.(1995), 35:464470. Kromě toho glukosová skupina může vykazovat afinitu k receptorům přítomným na povrchu buňky a tím zlepšit dostupnost léčiva na buněčné úrovni. Volný aldehyd lze snadno uvolnit hydrolýzou acetalu, čímž dojde k uvolnění karbonylové skupiny, která se stane dostupnou pro tvorbu Schiffových baží na cílených ligandech.

Podle předložené patentové přihlášky se aldehydy derivatizují biologicky přijatelnými glycidy jako je glukosa, galaktosa a další za tvorby acetalů. Cukerná složka přispívá ke zlepšené stabilitě a rovněž zvyšuje biologickou dostupnost aldehydové funkční skupiny pro cílové buňky. Ve srovnání s dosud známými sloučeniny, ve způsobech s použitím sloučenin podle vynálezu se překvapivě zvyšuje účinnost kondenzačních reakcí a jejich farmakokinetika se snadněji řídí.

··· · · · · · ·· ···· ··· ··· ·· ···

Pro srovnání sloučeniny 2 s tukaresolem z hlediska jejich účinků na inaktivaci buněk a proteinovou syntézu bylo provedeno stanovení těchto dvou účinků v přítomnosti stejných koncentrací obou těchto léčiv. Jak je zřejmé z obr.4 a obr.5, bylo prokázáno, že sloučenina 2 je v obou sledovaných parametrech účinnější než tukaresol.

Imunostimulační účinek sloučenin podle vynálezu je také možné využít k léčbě určitých virových chorob v kombinaci s další protivirovou terapií jako s použitím antivirotik nebo vakcín. Mnoho druhů virů se po první infikaci inkorporuje do buněčného jádra a zůstávají dlouhou dobu inaktivní. Onkogenní viry jako viry hepatitidy B a C, určité retroviry a určité papiloma viry mohou vyvolat vývoj nádorového onemocnění. V uvedených latentních obdobích je velmi obtížné virovou infekci léčit. Následkem imunitních odezev se uvedené viry často uvolňují za vzniku virémie, a v tomto stádiu je možné je odstranit z organismu. Schopnost benzaldehydových derivátů vyvolat imunitní odezvu je možné použít k vývoji léčby uvedených chorob v kombinaci s antivirotiky nebo vakcinami.

Hlavním cílem vynálezu je poskytnout nové sloučeniny pro prevenci a/nebo léčbu nádorových onemocnění a chorob souvisejících s poruchami imunitního systému.

Dalším cílem vynálezu je poskytnout nové sloučeniny umožňující potenciaci imunitních odezev a tím možnost potlačení infekčních chorob vyvolaných viry, bakteriemi, houbami a dalšími mikroorganismy.

Třetím cílem vynálezu je poskytnout sloučeniny pro prevenci nebo léčbu nádorových onemocnění a chorob • ·

souvisejících s poruchami imunitního systému které nemají toxické vedlejší účinky.

Čtvrtým cílem vynálezu je poskytnout sloučeniny pro profylaktickou léčbu nebo prevenci vývoje nádoru jater u pacientů infikovaných hepatitidou B nebo C.

Pátým cílem vynálezu je poskytnout sloučeniny pro účinnou a příznivou prevenci a/nebo léčbu nádorů tkání a buněk obsahujících receptory s afinitou k odpovídajícím cukerným složkám.

Šestým cílem vynálezu je poskytnout sloučeniny pro léčbu chorob souvisejících s imunitním systémem jako psoriáza, zánětlivé onemocnění střev, artritida, SLE, PSS atd.

Uvedené dosažené cíle a další dosažené cíle vynálezu jsou uvedené v připojených patentových nárocích.

Podstata vynálezu

Vynález zahrnuje sloučeniny obecného vzorce (I):

OR kde L znamená H nebo D;

(I) • ·

Ar znamená fenylovou skupinu nebo fenylovou skupinu substituovanou 1-3 substituenty které mohou mít stejný nebo různý význam, a znamenají skupinu zvolenou ze skupiny zahrnující alkyl 1-20 atomech uhlíku, cykloalkyl o 3-6 atomech uhlíku, fluoralkyl o 1-6 atomech uhlíku, alkenyl o 2-6 atomech uhlíku, alkynyl o 2-6 atomech uhlíku, fenyl, halogen, nitro, kyan, NH₂, NHR¹, N(R¹)2, NHC(O)R¹ nebo N[C(O)R¹]2 kde R¹ má stejný nebo různý význam a znamená alkylovou skupinu o 1-20 atomech uhlíku nebo fluoralkylovou skupinu o 1-6 atomech uhlíku, OR²nebo OC(O)R² kde R² znamená H, D, alkylovou skupinu o 1-20 atomech uhlíku nebo fluoralkylovou skupinu o 1-6 atomech uhlíku, SR², CA(OR¹)2 nebo CA[OC (O) R¹]2 kde A znamená H nebo D, C(O)R², COOR³ kde R³ znamená H nebo alkylovou skupinu o 1-20 atomech uhlíku, nebo fluoralkylovou skupinu o 1-6 atomech uhlíku nebo CON(R³)₂z kde R³ má stejný nebo různý význam;

Y znamená atom nebo skupinu zvolenou ze skupiny zahrnující H, D, alkyl o 1-20 atomech uhlíku, cykloalkyl o 3-6 atomech uhlíku, fluoralkyl o 1-6 atomech uhlíku, alkenyl o 2-6 atomech uhlíku, alkynyl o 2-6 atomech uhlíku, fluor, chlor, nitro, OR², OC(O)R², SR², NH2, NHR¹, NtR¹^ kde R¹ má stejný nebo různý význam, NHCfOjR¹ nebo N[C(O)R¹]2 kde R¹ má stejný nebo různý význam.

R znamená skupinu ze skupiny zahrnující H, D, alkyl o 120 atomech uhlíku, cykloalkyl o 3-6 atomech uhlíku, fluoralkyl o 1-6 atomech uhlíku, alkenyl o 2-6 atomech uhlíku, alkynyl o 2-6 atomech uhlíku, nebo jejich farmaceuticky přijatelné sole.

Uvedený popis je zapotřebí chápat tak, že vynález zahrnuje všechny stereoisomery sloučeniny obecného vzorce (I).

·· 9 9·♦ ♦ • · · · · · 99 9

0 0 · · 9 ·· • · · 9 · · · · ·· ··· · · 9 99

0909 999 999 99 999

Sloučeniny 5, β, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, a 24 (viz tabulka na str.23-29) jsou sloučeniny nové.

Podrobný popis vynálezu

Vynález je dále níže objasněn příklady provedeni vynálezu a připojenými obrázky a tabulkami.

Popis obrázků na připojených nákresech

Na obr.1 jsou znázorněné výsledky pokusu ve kterém buňky NHIK 3025 byly ošetřeny sloučeninou 8 (O) nebo sloučeninou 9 (·) po 20 hodin při 37 °C za jejich navázání na Petriho misky z plastické hmoty. Přežívající frakce znamená frakci buněk tvořících makroskopickou kolonii po ošetření. Každý bod znamená střední hodnotu počtu kolonií z 5 paralelně ošetřených misek. Standardní chyby jsou menší než je velikost použitých symbolů.

Na obr.2 jsou znázorněné výsledky pokusu ve kterém buňky NHIK 3025 byly ošetřeny sloučeninou 5 (O) nebo sloučeninou 7 (*) po 20 hodin při 37 °C za jejich navázání na Petriho misky z plastické hmoty. Přežívající frakce znamená frakci buněk tvořících makroskopickou kolonii po ošetření. Každý bod znamená střední hodnotu počtu kolonií z 5 paralelně ošetřených misek. Vyznačené vertikální označení znamená standardní chybu pokud její velikost převyšuje velikost symbolu.

Na obr.3 jsou znázorněné výsledky pokusu ve kterém buňky NHIK 3025 byly ošetřeny sloučeninou 12 () po 20 hodin při 37 • · ::.·*! : ·: z ;

·· ···· ··· ··· ·· ··· °C za jejich navázání na Petriho misky z plastické hmoty. Přežívající frakce znamená frakci buněk tvořících makroskopickou kolonii po ošetření. Každý bod znamená střední hodnotu počtu kolonií z 5 paralelně ošetřených misek. Vyznačené vertikální označení znamená standardní chybu pokud její velikost převyšuje velikost symbolu.

Na obr.4 jsou znázorněné výsledky pokusu ve kterém buňky NHIK 3025 byly ošetřeny sloučeninou 2 (Δ) nebo tukaresolem (·) po 20 hodin při 37 °C za jejich navázáni na Petriho misky z plastické hmoty. Přežívájici frakce znamená frakci buněk tvořících makroskopickou kolonii po ošetření. Každý bod znamená střední hodnotu počtu kolonií z 5 paralelně ošetřených misek. Standardní chyby jsou znázorněné pokud převyšují velikost použitých symbolů.

Na obr.5 jsou znázorněné výsledky pokusu stanovení rychlosti syntézy proteinu ve kterém buňky NHIK 3025 byly ošetřeny sloučeninou 2 () nebo tukaresolem (^-) po 1 hodinu při 37 °C vzhledem neošetřeným kontrolním buňkám. Rychlost syntézy proteinů byla stanovena zjištěním množství [³H]-valinu inkorporovaného během první hodiny ošetření léčivem. Výsledky představují čtyřnásobné provedení jednoho pokusu. Standardní chyby jsou zaznamenané pokud převyšují velikost použitých symbolů.

Obr.6 znázorňuje střední růstové křivky tumoru tumorové linie SK-OV-3 xenoimplantátu ovariálního karcinomu holým myším. Myši byly ošetřovány denně i.v. podáním 1 mg/kg sloučeniny 8 (▼) a 7,5 mg/kg sloučeniny 8 (-*). Kontrolní skupina () obdržela 0,9% NaCl. Každý uvedený výsledek představuje střední hodnotu objemu tumoru u 4 až 5 myší • · vzhledem ke dni 1. Vertikální omezení znamená standardní chybu.

Na °b^r-7-12 je znázorněn morfologický vzhled SK-OV-3 tumorů následujících tří skupin: skupiny zvířat ošetřených placebem (obr.7 a obr. 8), skupiny zvířat ošetřených dávkou 1 mg/kg/den sloučeniny 8 (obr.9 a obr.10) a skupiny zvířat ošetřených dávkou 7,5 mg/kg/den (obr.11 a obr.12). Tumory byly fixovány formalinem, uloženy do parafinu, nařezány na řezy o tlouštce 6 mm a vybarveny haematoxylinem a eosinem. Zvětšení je čtyřicetinásobné.

Na obr.13 jsou znázorněné růstové křivky plicního karcinomu buněčné linie T-47D na základě středního sferoidniho objemu. Sferoidy byly ošetřeny 0,1 mM sloučeniny 8 (*) a 1,0 mM sloučeniny 8 (▼) rozpuštěné v médiu. Kontrolní vzorek je znázorněný symbolem (). Každý bod představuje střední hodnotu sferoidniho objemu 6 až 11 sferoidů. Vertikální omezení znamená standardní chybu.

Obr.14 znázorňuje fotografie mikroskopických řezů 3 různě ošetřených NHIK 3025 buněčných sferoidů, z nichž jeden představuje neošetřený kontrolní vzorek (A), jeden představuje vzorek ošetřovaný 0,1 mM sloučeniny 8 po 4 dny (B) a jeden představuje vzorek ošetřovaný 1,0 mM sloučeniny 8 po 4 dny (C) .

Na obr.15-18 jsou uvedené výsledky stanovení frakcí jader v každé interfázi Gl, S a G2, kde je RB-protein navázaný na jádro po ošetření sloučeninou 8.

Na obr.19-20 je znázorněná rychlost syntézy proteinu u buněk NHIK 3025 (obr.19) a T-47D-buněk (obr.20) vzhledem ke

kontrolním buňkám. Každá hodnota znamená průměr ze čtyř paralelních stanovení. Standardní chyby jsou vyznačené vertikálním omezením pokud převyšují velikost symbolů.

Obr.21 znázorňuje medián adhezních sil buněk exponovaných různým benzaldehydovým derivátům. Buňky byly exponované 1 mM koncentracemi sloučeniny 1 a 2.

Obr.22. Periferní krevní mononukleární buňky a Superantigen v médiu ex vivo 10 byly vystavené expozici buď benzaldehydu, deuterovanému benzaldehydu, sloučenině 2 nebo zilaskorbu (²H) . Proliferace periferních mononukleárních krevních buněk byla stanovena inkorporací tritiovaného thymidinu při různých koncentracích léčiva.

Obr.23. NMRI myši byly infikované i.p. podáním virem Friend-erytroleukemie napadajícím slezinu. Infikované a neinfikované myši byly ošetřené i.p. denní dávkou 5 mg/kg buď sloučeniny 2 nebo sloučeniny 5. Po léčbě trvající 19 dní byly sleziny vyňaty a byly zváženy.

Obr.24 znázorňuje účinek sloučeniny 1, 2 a 5 na invazi lidského kolorektálního tumoru C170HM2 do jater.

Obr.25 znázorňuje přežití buněk lidského cervikálního karcinomu NHIK 3025 stanovené schopností tvořit kolonie, po ošetření po dobu 20 hodin buď sloučeninou 1 (O) nebo sloučeninou 13 (·) .

Obr.26 znázorňuje přežití buněk lidského cervikálního karcinomu NHIK 3025 stanovené schopností tvořit kolonie, po ošetření po dobu 20 hodin buď sloučeninou 1 (O) nebo sloučeninou 14 (·) .

Obr.27. Rychlost syntézy proteinu v buňkách lidského cervikálniho karcinomu NHIK 3025, ošetřených sloučeninou 1 nebo sloučeninou 21 byla zjištěna stanovením množství inkorporovaného [³H]valinu buď během období v průběhu do jedné hodiny od bezprostředního podání testované sloučeniny (tmavé symboly) nebo v průběhu jedné hodiny v čase od 2 hodin později (světlé symboly).

Obr.28. Rychlost syntézy proteinu v buňkách lidského cervikálniho karcinomu NHIK 3025, ošetřených sloučeninou 1 nebo sloučeninou 22 byla zjištěna stanovením množství inkorporovaného [³H]valinu buď během období v průběhu do jedné hodiny od bezprostředního podání testované sloučeniny (tmavé symboly) nebo v průběhu jedné hodiny v čase od 2 hodin později (světlé symboly).

Na obr.29 je znázorněné přežití buněk zjištěné schopností buněk lidského cervikálniho karcinomu NHIK 3025 tvořit kolonie po ošetření po dobu 20 hodin buď sloučeninou 1 (·) nebo sloučeninou 21 (O) .

Na obr.30 je znázorněné přežití buněk zjištěné schopností buněk lidského cervikálniho karcinomu NHIK 3025 tvořit kolonie po ošetření po dobu 20 hodin buď sloučeninou 2(0) nebo sloučeninou 22 (·*· ) .

Na .31 je znázorněné přežití buněk zjištěné schopnosti buněk lidského plicního karcinomu T47-D tvořit kolonie po ošetření po dobu 20 hodin buď L-glukosou (·) nebo sloučeninou 21 (O) .

ΦΦ • · Φ φ Φ

• · φφ * * • φ · · »··· • · · · · ο q φφφφφ ··

4-) · · φφ · φφ φφφφ φφφ φφ·

Na obr.32 je znázorněná reaktivita dýchacích cest hodin po expozici methacholinem ve formě aerosolu u senzibilizovaných ovalbuminem s reakcí vyvolanou solným roztokem (světlé sloupce a horizontálně šrafované sloupce) nebo ovalbuminem (tmavé sloupce a vertikálně šrafované sloupce) které byly ošetřené roztokem obsahujícím rozpouštědlo nebo sloučeninu 2. Výsledky jsou vyjádřené aritmetickým průměrem ± SEM (n=9/skupina).

Na obr.33 je znázorněn počet neutrofilních buněk v broncho-alveolární tekutině získaných 24 hodin po posledním podání solného roztoku (světlé sloupce) nebo ovalbuminu (tmavé sloupce) ovalbuminem senzibilizovaným myším k vyvolání reakce, kde myši byly ošetřeny roztokem obsahujícím rozpouštědlo nebo sloučeninu 2. Výsledky jsou vyjádřené aritmetickým průměrem ± SEM (n=9/skupina).

sloučenina č.	chemická struktura	název
1	H OH OH	4,6-0-benzyliden- -D-glukopyranosa
2	D OH OH	4,6-0-(benzyliden-dl)- -D-glukopyranosa

sloučenina č.	chemická struktura	název
3	Ph ^H O / hoM On OH	4,6-O-benzyliden- -D-galaktopyranosa
4	crt®i OMe	methyl-4,6-0-(benzyliden- -alfa-D-mannopyranosid
5	D OH	4,6-0-(benzyliden-dl)-2- -deoxy-D-glukopyranosa
6	H °<jy ^Ho_x'vS, 1 OH OH OMe	4,6-0-(4-karbomethoxybenzyliden)-D-glukopyranosa

sloučenina č.	chemická struktura	název
7	H 0¼¾. OH	4,6-O-benzyliden- -2-deoxy-D-glukopyranosa
8	D HN OH O==\ ch.	2-acetamido-4,6-0- (benzyliden-dl)-2-deoxy- -D-glukopyranosa
9	H crteA J HN QH ^N0* oA CH,	2-acetamido-2-deoxy-4,6-0- - (3-nitrobenzyliden)- -D-glukopyranosa
10	Ph _nA₀ ^D Ol hoM ch OH	4,6-0-(benzyliden-dl)- -D-galaktopyranosa

sloučenina č.	chemická struktura	název
11	crfek OH	4,6-0-(benzyliden-dl)- -D-mannopyranosa
12	Ph H o / HN\| JOH O=\ ch₃	2-acetamido-4, 6-Ό- -benzyliden-2-deoxy-alfa- -D-galaktopyranosa
13	H oďoH no₂	4,6-0-(3-nitrobenzyliden)- -D-glukopyranosa
14	OH H (Vs-k.	4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa

sloučenina č.	chemická struktura	název
15		2-deoxy-4,6-0- -(2-hydroxybenzyliden)- -D-glukopyranosa
OH H A/ QH
16	OH H ÓÚAk Av? Me	2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)D-glukopyranosid
17	„A hA?⁰ H 0 / A ^HO\h	4,6-0-(hydroxybenzyliden)- D-galaktopyranosa
18	..Ό ηΆ ^h o / OH	2-deoxy-4,6-0-(2- hydroxybenzyliden)-D- -galaktopyranosa

sloučenina č.	chemická struktura	název
19	../vo H o 1 HN >_OH O^\ ch₃	2-acetamido-2-deoxy-4,6-0— -(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa
20	OH H	4,6-0-(2- -hydroxybenzyliden)- D-mannopyranosa
21	H ^H0	4,6-0-benzyliden- -L-glukopyranosa
22	Ογο'ύ^Γ ó ^H0	4,6-0-(benzyliden-dl)- -L-glukopyranosa

·· • •	• •	• * •	♦» • * •	• •	··	* • ·
9 •	• «
	•		•	•	•	•
		41··	·*·	• ··	ti		99

sloučenina č.	chemická struktura	název
23	0 11 h₃c^o h OH OH	4,6-0- (2- -acetoxybenzyliden)- -D-glukopyranosa
24	OH H OH OH	4,6-0-(2,3- -dihydroxybenzyliden)- -D-glukopyranosa

Příprava

Je známé, že aldehydy reagují s alkoholy v kondenzačních reakcích podporovaných přítomností kyseliny za tvorby acetalů. Jako vedlejší produkt se tvoří voda. Tato reakce je reverzibilní a v roztoku se tvoří rovnovážná směs aldehyd/alkohol a acetal/voda. Stav rovnováhy určuje především reaktivita a koncentrace každé z reakčních složek. Aby se reakce posunula směrem k jejímu úplnému průběhu, obvykle se jeden z produktů reakce (acetal nebo voda) z reakční směsi odstraňuj e.

• · · • φ • · · ·

• ·· ·

Podle vynálezu se různé cukry, deoxycukry a aminocukry nechají kondenzovat s aldehydy nebo s ekvivalenty aldehydů za tvorby acetalových derivátů cukrů. Zvláště výhodná je strategie reacetalizace, kde místo samotného aldehydu se použije aldehyd chráněný ve formě dimethylacetalu. Jako koprodukt reakce přitom vzniká methanol. Jakmile dojde k vzniku methanolu, reakční směs se mírně zahřeje za sníženého tlaku aby se methanol odstranil. Ve většině případů dochází k posunu rovnováhy za uvedených reakčních podmínek plynule ve prospěch acetalu.

Acetalisace cukrů obvykle vede ke směsi regio- a steroisomerů. Také může dojít ke kontrakčním kruhovým transformacím vedoucím k tvorbě směsi pyranos a furanos a v některých případech k tvorbě diacetalových aduktů. Důsledkem toho je, pokud se nepoužije strategie chránění, tvorba velmi složité reakční směsi. Nicméně dále popsaným zpracováním, zejména s použitím kapalinové chromatografie byly získané překvapivě čisté podíly čistých produktů. Totožnost produktů se provádí GC-MC spektroskopií a různými způsoby NMR.

Specifické použité reakční podmínky, rozpouštědlo a katalyzátor v každém případě závisí na rozpustnosti a reaktivitě reaktantů a vlastnostech produktu. Jako katalyzátor je možné použít minerální kyselinu např. kyselinu sírovou, organickou kyselinu, například kyselinu para-toluensulfonovou, kyselou iontoměničovou pryskyřici, např. Amberlyst 15, Lewisovu kyselinu ve formě minerální hlinky např. Montmorillonit K-10 nebo superkyselinu na nosné pryskyřici, např. Nafion NR 50. Reakci lze výhodně provést v dipolárním aprotickém rozpouštědle jako je dimethylformamid, dimethylacetamid, dimethylsulfoxid, N-methylpyrrolidon, dimethoxyethan nebo podobně. Nejvýhodnější a nejčastěji aplikované reakční podmínky zahrnují provedení s kyselinou para-toluensulfonovou v dimethylformamidu.

Sloučeniny obecného vzorce (I) ve kterých L znamená deuterium, je možné připravit způsobem popsaným výše s tím, že se použije výchozí dimethylacetal aldehydu deuterovaný ve formylové části. Přípravu deutero-benzaldehydu lze provést modifikovanou redukcí podle Rosenmunda s použitím plynného D₂v deuterovaném rozpouštědle způsobem popsaným v EP 0 283 139 Bl. Deuterované benzaldehydové deriváty obsahující substituenty ve fenylovém kruhu lze připravit podle příkladů popsaných v EP 0 493 883 Al a v EP 0 552 880 Al.

Možné přípravy sloučenin podle vynálezu znázorňují níže uvedené příklady.

Příklady provedeni vynálezu

Sloučenina 1

4,6-0-benzyliden-D-glukopyranosa

Uvedená sloučenina v oboru známá se připraví způsobem popsaným pro sloučeninu 2 s použitím nedeuterovaného benzaldehyd-dimethylacetalu. Totožnost se potvrdí ^XH NMR spektroskopií v DMSO-dg:

δ vzhledem k TMS: 7,58-7,29 (5H, m, Ar-H), 6,83 (0,4H, d, OH-Ιβ), 6,60 (0,6H, d, OH-1-α), 5,61 (1H, s+s, acetal-H), 5,25 (0,4H, d, OH-3-β), 5,21 (0,4H, d, OH-2-β), 5,62 (0,6H, d, OH-3a) , 5,00 (0,6H, H-l-a), 4,82 (0,6H, d, 0H-2-a), 4,49 (0,4H, t, H-1-β), 4,18-4,02 (1H, m, Η-6'-α+β) , 3, 89-3,77 (0, 6H, m, H-532 ···· · · ·· 4··· · · · · · · · • · · · · · ·

α), 3,75-3,57 (1,6Η, m, Η-6-α+β a H-3-α), 3,45-3,27 (2,5Η, m, H-3-β, H-4-α+β, H-5-β a H-2-α) a 3,11-3,00 (0,4Η, m, H-2-β).

Sloučenina 2

4,6-0-(benzyliden-di) -D-glukopyranosa

Způsobem popsaným v EP 0 283 139 B1 se připraví benzaldehyd-di a převede se na benzaldehyd-dimethylacetal-di. Příprava 4,6-0-(benzyliden-di)-D-glukopyranosy je rovněž popsaná v EP 0 283 139 B1 ale z přednostních důvodů pro dosažení vysoké čistoty se v tomto případě připraví níže popsaným alternativním způsobem.

V suché aparatuře pro destilaci připojené přes chladič pro zpětný tok k vakuové vývěvě se smísí D(+)glukosa (706 g, 3,92 mol), benzaldehyd-dimethylacetal-di (571 g, 3,73 mol), suchý DMF (1,68 kg) a para-toluensulfonová kyselina (4,5 g, 24 mmol). Mechanicky míchaná směs se ohřeje na nejvýše 69 °C při tlaku 4 kPa (30 Torr) k oddestilování methanolu, a po 2 hodinách se oddělí 235 g. Pak se zpětný chladič vypne a teplota se zvýší na asi 73 °c aby se oddestilovat DMF. Za další 2 hodiny se oddělí dalších 1385 g a pak se destilace přeruší.

Zbytek se ochladí na asi 40 °c a během 5 minut se přidá směs led/voda (2,9 1). Pak se teplota pomalu sníží pod 0 °C přičemž se vysráží sraženina částečně ve velkých shlucích. Potom se směs převede do kádinky a přidá se dalších 8-9 1 směsi led/voda aby shluky rozpadly a vznikla suspenze. Pak se suspenze zfiltruje na dvou odsávacích filtrech a získané dva filtrační koláče se ponechají přes noc na filtrech za odsávání vodní vývěvou přičemž se promývají atmosférou N₂ kde dusík se přivede přes opačně připojenou nálevku. Pak se filtrační ···· · ·· · ···· · · ·· ·· · • · · · · ·· ···· · · ·· · • · · · · ·· ·· ···· ··· ··· ·· · koláče rozprostřou na dvě desky a suší se 20 hodin při 32 °C ve vakuové sušárně. Vakuum se nejprve nastaví na 1300 Pa (13 mbar) a pak se zvýší na 100 Pa (1 mbar).

Surový produkt se rekrystalizuje (aby se odstranily dibezyliden-acetaly) a promývá se vodou (k odstranění DMF a glukosy) až do odstranění uvedených kontaminantů. Surový produkt (500 g) se pak rozpustí v horkém dioxanu (800 ml) a získaný roztok se přidá přes skládaný filtr do vroucího chloroformu (9 1). Pak se roztok nechá vychladnout nejprve na teplotu místnosti a pak se chladí v ledové lázni přes noc. Sraženina se odfiltruje, suší se 2 hodiny na filtru (za promývání N₂ jak je popsané výše) a dále se suší při 31 °C ve vakuu na rotační odparce. Produkt (142 g) se pak suspenduje ve směsi led/voda (1 1) zfiltruje se na filtrech za pomocí odsávání ( s promytím 200 ml směsi led/voda) a suší se přes noc na filtru jak je popsané výše. Pak se produkt rozemele, proseje se (velikost ok 0,5 mm) a suší se 5 hodin při 31 °C na rotačním odpařovači. Pak se produkt ještě jednou suspenduje ve směsi led/voda (500 ml) zfiltruje se (za promytí směsí 150 ml led/voda) a vysuší se (7 hodin za promývání N₂) . Nakonec se rozemele v třecí misce, proseje se (0,5 mm) a vysuší se ve vakuové sušárně.

Produkt ve formě bílého jemně děleného prášku vysoké čistoty a analyzuje metodou HPLC. Výtěžek je 95 %, 10 % teoretického výtěžku. Poměr anomerů a k β zjištěný NMR v DMSOd6 je asi 7:3.

⁴Η- a ¹³C- NMR (DMSO-d₆) δ vzhledem k TMS: 7,55-7,28 (5,00H, m, Ar-H), 6,85 (0,27H, d, OH-1-β), 6,58 (0,71H, d, OH-1-α), 5,24 (0,27H, d, OH-3-β), 5,19 (0,28, d, OH-2-β), 5,61

(0,71H, d, OH-3-α), 4,99 (0,72H, H-1-α), 4,82 (0,71H, d, OH-2a), 4,48 (0,29H, t, H-1-β) , 4,20-4,04 (l,04H, m, Η-β'-α+β) , 3,88-3,73 (0,78H, m, H-5-a), 3,73-3,56 (1,72H, m, Η-6-α+β a H3-α) , 3,46-3,21 (2,61H, m, H-3-b, H-4-α+β, H-5-β a H-2-α) a 3,09-2,99 (0,28H, m, H-2-β); 137,881, 128,854, 128,042, 126,435 (Ar-C), 100,462 (acetal-C), 97,642 (C-1-α), 93,211 (C-1-α), 81,729 (C-4-α), 80,897 (C-4-β), 75,796 (C-2-β), 72,906 (C-2-α a C-3-β), 69, 701 (C-3-α), 68,431 (C-6-α), 68,055 (C-6-β) , 65,810 (C-5-β) a 62,032 (C-5-α).

Sloučenina 3

4,6-O-benzyliden-D-galaktopyranosa

V destilačni aparatuře se mícháním při 50 °C smísí D(+)galaktosa (15,0 g, 0,083 mol) se suchým DMF (80 ml). K vzniklé suspenzi se přidá benzaldehyd-dimethylacetal (12,2 g, 0,083 mol) a kyselina para-toluensulfonová (0,14 g) a pak se s použitím vodní vývěvy pomalu oddestiluje methanol/DMF. Za 3 hodiny po zreagováni většiny galaktosy, se odstraní zbylý DMF na rotační odparce připojené k vývěvě. Zbytek ve formě viskózního sirupu se přečistí na koloně Lobar C RP-8 s použitím směsi methanol/voda 1:1 jako elučního prostředku. Pak se produkt vysuší lyofilizací.

GC TMS-derivátů prokazuje, že produkt tvoří především dva isomery. Identifikace pomocí ¹H-, ¹³C~, COSY-, DEPT- a C-H korelačních NMR spekter prokazuje, že se jedná o a a β anomery titulní sloučeniny.

7- a ¹³C-NMR (D₂O) δ vzhledem k TMS: 7,49-7,27 (5H, m, ArH), 5,57 (1H, s, acetal-H), 5,22 (0,5H, d, H-1-α), 4,56 (0,5H, d, H-1-β), 4,23+4,18 (0,5H+0,5H, d+d , H-4-α+β), 4,14-3,98 (2H, m, H-6-α+β) , 3,94-3,79 (1,5H, m, H-2-α, H-3-α a H-5-α), 3,693,49 (1,5H, m, H-2-β, H-3-β a H-5-β); 137,422, 129,981, 128,902, 126,639, a 126,590 (Ar-C), 101,325 (acetal-C), 96,540 (Cl-β), 93,161 (C-1-α), 76, 581 (C-4-α), 76, 093 (C-4-β) , 71,889+71, 802 (Ο-2-β+Ο-3-β) , 69, 404 (C-6-α), 69, 182 (C-6-β), 68,566+68,057 (Ο-2-α+ϋ-3-β), 66,759 (C-5-β) a 62,886 (C-5-α).

Sloučenina 4

Methyl-4,6-0-benzyliden-a-D-mannopyranosid

V destilačni aparatuře se mícháním smísí při 50-55 °C methyl-a-D-mannopyranosid (18,1 g, 0,093 mol), benzaldehyddimethylcetal (21,0 g, 0,138 mol) a suchý DMF (90 ml). Pak se přidá para-toluensulfonová kyselina (asi 0,1 g) a za 10 minut potom se připojí vodní vývěva k oddestilování methanolu. Za čtyři hodiny se reakční směs odpaří na tuhý bílý zbytek. Tento zbytek se promyje dibutyletherem, zfiltruje se a filtrační koláč se rozpustí v acetonitrilu. Vzniká sraženina, a směs se ponechá v lednici 5 dnů. Potom se sraženina odfiltruje a filtrát se odpaří. Zbytek se přečistí na sloupci Lobar C RP-8 s použitím směsi 30 % acetonitrilu ve vodě. Frakce ze čtyř samostatných pokusů se podrobí lyofilizaci a spojí se.

GC analýza TMS derivátů prokazuje, že produkt tvoří z 95 % (plochy píku) monoacetaly. Uvedené monoacetaly tvoří 4 píky o integrované ploše plků 0,4, 3,2, 94,1 a 2,4 %. Způsoby zahrnující ^XH-, ¹³C-, COSY-, DEPT- a C-H korelační NMR spektrometrii a GC/MC spektroskopii potvrzují, že převažující identifikované druhy sloučenin odpovídají titulní sloučenině.

⁴Η- a ¹³C-NMR (aceton-cU) , δ vzhledem k TMS: 7, 54-7, 30 (5H, m, Ar-H), 5,60 (1H, s, acetal-H), 4,71 (1H, s, H-l), 4,34 (1H, široký s, OH), 4,22-4,02 (2H, m+široký s, H-6'+OH) , 3,94-3,82 (3H, m, H-2, H-3 a H-4), 3,80-3,60 (2H, m, H-5+H-6) a 3,39 (3H, s, CH₃); 139,264, 129, 396, 128,662 a 127,211 (Ar-C) , 102,825 (C-l), 102,468 (acetal-C), 79,888 (C-4), 72,090 (C-3), 69,308 (C-6), 69,127 (C-2), 64,363 (C-5) a 54,921 (CH₃) .

Sloučenina 5

4,6-0-(benzyliden-di) -2-deoxy-D-glukopyranosa

Způsobem popsaným v EP 0 283 139 B1 se připraví bezaldehyd-di a převede se na benzaldehyd-dimethylacetal-di.

2-deoxy-D-glukosa (10 g, 60,9 mmol), suchý DMF (35 ml), benzaldehyd-dimethylacetal-di (11,7 g, 76,4 mmol) a paratoluensulfonová kyselina (70 mg, 0,37 mmol) se smísí v atmosféře N₂ na bílou kaši. Zahřátím na 45-50 °C se během 1°/2 hodiny získá bezbarvý roztok. Pak se přes chladicí kolonu (k zabránění ztrát benzaldehyd-dimethylacetalu-dx) připojí vakuová vývěva k odstranění methanolu. Tlak se reguluje postupně od 7000 Pa (70 mbar) na 2000-3000 Pa (mbar) během 4,5 hodiny přičemž teplota se udržuje na 40-45 °C. Pak se destilace přeruší, aparatura se upraví pro destilaci s krátkou cestou par a DMF se odstraní při maximálním vakuu při 55-55 °C. Získá se zbytek ve formě světle žlutého sirupu.

1/4 získaného sirupu se rozpustí se rozpustí ve slabě alkalickém (NaHCO₃) roztoku methanol/voda 60/40 a přečistí se na koloně s reverzní fází Měrek LiChroprep RP-8 s použitím směsi methanol/voda 60/40 jako elučního prostředku. Frakce obsahující produkt se zahustí aby se odstranil methanol a vymrazením se získá bílá, vločkovitá tuhá hmota. Produkty ze

čtyř samostatných pokusů se spojí a získá se 3,5 g produktu což je 23 % teoretického výtěžku.

GC analýza TMS derivátů a NMR spektroskopie prokazuje, že produkt obsahuje směs a a β anomerů v poměru 1:1.

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-de), δ vzhledem k TMS: 7,52-7,28 (m, 5H,

Ar-H I+II), 6,9-6,65 (široký s, 1/2H, OH-1 II), 6,55-6,32 (široký s, 1/2H, OH-1 I), 5,25-5,12 (m, 1H, OH-3 II a H-l I),

5,12-5,0 (d,	1/2H, OH-3 II),	4,	84 -4,73	(dd, 1/2H,	H, H-l II),
4,20-4,02 (m,	1H, H-6 I+II),	3,	98-3,73	(m, 1H, H-3	I a H-5 I),
3,73-3,58 (m,	1,5H, H-6' I + II	a	H-3 II),	3,42-3,18	(2,5H, H-4
I+II a H-5 II	a H₂O) , 2,10-1,	86	(m, 1H,	H-2 I+II) a	1,62-1,34

(m, 1H, H-2' I+II); 137,979, 137,926, 128,841, 128,036 a 126,432 (Ar-CI+II), 101,5-100,0 (acetal-C I+II), 94,057a 91,424 (C-l I+II), 83,916 a 83,093 (C-4 I+II)), 68,374 a 68,119 (C-6 I+II), 66,889, 66,092, 64,174 a 62,604 (C-3 I+II a C-5 I+II) a 41,932 a 40,051 (C-2 I+II).

Sloučenina 6

4,6-0-(4-karboxymethoxybenzyliden)-D-glukopyranosa

V třihrdlé baňce objemu 500 ml se smísí methyl-4formylbenzoát (100 g, 0,609 mol), methanol (91,5 g, 2,86 mol), trimethylortoformiát (71 g, 0,68 mol) a koncentrovaná kyselina chlorovodíková (165 μΐ). Získaná kaše během několika minut přejde na mírně žlutý roztok a teplota se spontánně zvýší z 15 °C na 30 °C. Reakční směs se míchá 15 minut, pak se zahřívá za zpětného toku při 58 °C dalších 25 minut a potom se ochladí na 10 °C (led/voda). K reakční směsi se pak přidá 7 ml alkalického roztoku připraveného rozpuštěním KOH (8,3 g) v methanolu (53 ml). Po 25 minutách míchání při teplotě 10 °C se zařízení přestaví pro destilaci s krátkou cestou par a těkavé složky se odstraní ve vakuu (vodní vývěva). Pak destilace pokračuje s připojenou vakuovou vývěvou při 112-114 °C/50 Pa (0,5 mbar) a získá se bezbarvý olej. Olej přejde na bezbarvou tuhou hmotu o t.t.32-33 °C a kterou je stanovením totožnosti NMR spektroskopií 4-formylbenzoát-dimethylacetál. Získá se 108,75 g produktu, což je 85 % teoretického výtěžku.

Při 50 °C se v atmosféře N₂ smísí D(+)-glukosa (8,0 g,

44,4 mmol), suchý DMF (25 ml), methyl-4-formylbenzátdimethylacetal (10,4 g, 49,5 mmol) a para-toluensulfonová kyselina za vzniku bílé suspenze. Pak se aparatura spojí s vakuovou vývěvou přes svislý chladič a zahájí se opařování methanolu za počátečních podmínek 8000 a 10000 Pa (80-100 mbar), 55 °C. Pak se tlak postupně sníží na 4000 Pa (40 mbar) a teplota se udržuje na 55-60 °C. Reakční směs se postupně vyjasňuje a nakonec je průhledná. Za 8 hodin se destilace přeruší a zařízení se přestaví na destilaci s krátkou cestou par pro odstranění DMF. Zbytek je ve formě slabě nažloutlého sirupu.

Získaný sirup se rozpustí v horkém roztoku 100 mg NaHCO₃ v 20 ml methanolu a 8 ml vody a vyvolá se sráženi přídavkem 100 ml ethylacetátu. Sraženina se pak oddělí od matečného roztoku filtrací, promyje se chladnou vodou (4 x 15-20 ml) a převede se baňky rotačního odpařovače. Vlhkost se odstraní přídavkem ethylacetátu a dvojím odpařováním. Nakonec se produkt vysuší ve vysokém vakuu. Z matečného roztoku se odfiltruje další podíl sraženiny, promyje se a po vysušení se tak získá druhý podíl produktu. Oba podíly se spojí a získá se tak 1,94 g čistého produktu což odpovídá výtěžku 13 % teorie.

GC analýza TMS derivátů prokazuje obsah dvou isomerů v poměru 2:1.

9 ^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-d₆), δ (ppm) vzhledem k TMS: 7,99-7,61 (dd, 2+2H, furfuryl-H), 6,87 (d, 0,67H OH-1 II), 6,59 (d, 0,28H, OH-1 I), 5,68 (s+s, 1, acetal-H I+II), 5,29 (d, 0,68H, OH-3 II), 5,21 (d, 0,67H, OH-2 II), 5,16 (d, 0,31H, OH-3 I), 5,00 (t, 0,30H, H-l I), 4,85 (d, 0,28H, OH-2 I), 4,48 (t, 0,73H, H-l II), 4,25-4,08 (m, 1, 14H, H-6) , 3, 95-3, 77 (m, 3,43H, OCH3 a H-5 I), 3,78-3,59 (m, 1,40Η, H-3 I a H-6'), 3,493,23 (m, 3,59H, H-4 I a II, H-5 II, H-2 I a H-3 II), 3,10-2,98 (m, 0,72H, H-2 II); 165,978, 142,553, 142,553, 129,959, 129,067, 126,763, 99,982, 99,812, 97,661, 93,238, 81,794, 81,794, 80,963, 75,808, 72,902, 69,658, 68,487, 68,110, 65,714, 61,952 a 52,253.

Sloučenina 7

4,6-0-benzyliden-2-deoxy-D-glukopyranosa

V atmosféře N₂ se smísí 12-deoxy-D-glukosa (10,0 g, 60,9 mmol), suchý DMF (34 ml) benzaldehyd-dimethylacetal (11,6 g, 76,2 mmol) a para-toluensulfonová kyselina (70 mg, 0,37 mmol) na bílou kaši. Pak se reakční směs míchá 30 minut při teplotě místnosti a následným zahřátím na 45-50 °C se tuhé složky postupně rozpustí. Pak se přes chlazenou kolonu (k zabránění ztrát benzaldehyd-dimethylacetalu) připojí vakuová vývěva k odstranění methanolu a reakce se nechá probíhat 4,5 hodiny. Potom se destilace přeruší, kolona se odstraní a pokračuje se v destilaci s krátkou cestou par při 50-55 °C pro odstranění DMF. Zbytek je ve formě slabě nažloutlého sirupu.

Sirup se rozpustí se rozpustí ve slabě alkalickém (NaHCCh) roztoku methanol/voda 60/40 a přečistí se na koloně s reverzní fází Měrek LiChroprep RP-8 s použitím směsi methanol/voda 60/40 jako elučního prostředku. Frakce obsahující produkt se « · zahusti aby se odstranil methanol a vymrazenim se získá bílá, vločkovitá tuhá hmota. Produkty ze čtyř samostatných pokusů se spojí a získá se 3,18 g produktu což je 21 % teoretického výtěžku.

GC analýza TMS derivátů a NMR spektroskopie prokazuje že produkt obsahuje směs a a β anomeru v poměru 1:1.

¹H-NMR (DMSO-dg), δ (ppm) vzhledem k TMS: 7,52-7,30 (m, 5H, Ar-H I+II), 6,85-6,68 (široký s, 1/2H, OH-1 II), 6,50-6,35 (široký s, 1/2H, OH-1 I), 5,61 (s+s, 1H, acetal-H I + II), 5,235,12 (m, 1H, OH-3 II a H-l I), 5,12-5,02 (d, 1/2H, OH-3 II), 4,84-4,74 (dd, 1/2H, H-l II), 4,20-4,04 (m, 1H, H-6 I+II), 3,98-3,74 (m, 1H, H-3 I a H-5 I), 3,74-3,57 (m, 1,5H, H-6' I+II a H-3 II), 3,42-3,18 (2,5H, H4 I+II a H-5 II a H₂O), 2,08-1,88 (m, 1H, H-2 I+II) a 1,62-1,32 (m, 1H, H-2' I+II).

Sloučenina 8

2-acetamido-4,6-0-benzyliden-di-2-deoxy-D-glukopyranosa

Způsobem popsaným v EP 0 283 139 B1 se připraví bezaldehyd-dj. a převede se na benzaldehyd-dimethylacetal-di.

Benzaldehyd-dimethylacetal-di (8,7 g, 56,8 mmol), Nacetyl-D-glukosamin (10,0 g, 45,2 mmol), suchý DMF (30 ml) a para-toluensulfonová kyselina (88 mg, 0,46 mmol) se smísí v atmosféře N₂ za vzniku bílé suspenze. Směs se míchá 45 minut při 50 °C pak se spojí s vakuovou vývěvou přes svislý chladič a reakce se nechá probíhat 2 hodiny při 55 °C/6000-7000 Pa (60-70 bar). Pak se aparatura upraví na destilaci s krátkou cestou par pokračuje se v destilaci při maximálním vakuu při 55-55 °C po další jednu hodinu. Získá se zbytek ve formě žlutobílé tuhé hmoty.

Zbytek se zalkalizuje přídavkem roztoku připraveného smísením NaHCO₃ (150 mg) s 30 ml roztoku methanol/voda 60/40. Vzniklá krémová kaše se zfiltruje, promyje se 2-3krát 1% roztokem NaHCO₃ a několikrát etherem. Analýzou (GC) se potvrdí dostatečná čistota produktu a produkt se vysuší ve vakuu. Získá se 8,8 g produktu odpovídajících 63% teoretickému výtěžku.

GC analýza TMS derivátů indikuje, že produkt obsahuje směs isomerů 1:1. NMR spektroskopie v DMSO-dg prokazuje, že produkt tvoří směs anomerů v poměru 3:1.

^ΧΗ- a ¹³C-NMR (DMSO-de) , δ vzhledem k TMS: 7,83 (s+s, 1H, NH), 7,51-7,28 (m, 6H, Ar-H), 7,0-6,2 (široký s, 1H, OH-1), 5,65-5,05 (široký s, 1H, OH-3), 4,99 (d, 1H, H-l I), 4,61 (d, 0,3H, H-l II), 4,21-4,03, 3,92-3,67 a 3,51-3,22 (m, 6H, Η-2, H-4, H-5 a H-6) a 1,85 (s + s, 3Η, CH3) ; 169, 452 (C=O), 137,818, 128,869, 128,035 a 126,438 (Ar-C), 100,505 (acetal-C), 96,056, 91,500, 82,471, 81,505, 70,549, 68,300, 67,961, 67,218, 65,906, 62,123, 58,038, 54,790 (cukerná složka-C) a 23,123 a 22,674 (CH3).

Sloučenina 9

2- acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa

V tříhrdlé baňce objemu 500 ml se smísí

3- nitrobenzaldehyd (100 g, 0,66 mol), methanol (99 g, 3,1 mol) trimethylortoformiát (77,3 g, 0,73 mol) a koncentrovaná kyselina chlorovodíková (165 μΐ) za získání žluté kaše ze které během 5 minut vznikne roztok. Reakční směs se pak zahřívá pod zpětným chladičem při ~50 °C 15 minut a pak se ochladí směsí led/voda na 10 °C. Potom se reakční směs zalije β,6 ml roztoku připraveného rozpuštěním KOH (2,5 g) v methanolu (16 ml). V míchání se pokračuje dalších 15 minut a pak se zařízení upraví pro destilaci s krátkou cestou par. Těkavé látky (CH3OH+HCOOCH3) se odstraní vodní vývěvou, pak se destilace přeruší a připojí se vakuová vývěva. Potom se v destilaci pokračuje a oddestiluje se žlutý olej při 93-97,5 °C/2000 Pa (20 mbar). Identifikaci oleje pomocí NMR se prokáže, že jde o 3-nitrobenzaldehyd-dimethylacetal vysoké čistoty. Získá se 127 g produktu odpovídajících 97,6% teoretického výtěžku.

Mícháním při 50 °C se smísí 3-nitrobenzaldehyddimethylacetal (5,5 g, 0,028 mol), N-acetyl-D-glukosamin (5,0 g, 0,023 mol), para-toluensulfonová kyselina (50 mg, 0,263 mmol) a suchý DMF (15 ml) za vzniku lehce žlutě zbarvené suspenze. Za 1/2 hodiny s připojí vakuová vývěva a reakce se nechá probíhat 11 hodin při 56 °C/5000 Pa (50 mbar). Pak se rekční směs odpaří a zbytek se rozdělí mezi malý objem slabě alkalické (NaHCO₃) vody a chloroformu. Vodná fáze (tvořící sýrovitou suspenzi) se dvakrát reextrahuje chloroformem a zfiltruje se, promyje se několikrát vodou a etherem. Vysušením ve vakuu se získá ve formě slabě nahnědlého prášku požadovaný produkt. Získá se 570 mg produktu což odpovídá 7 % teoretického výtěžku.

GC analýza TMS derivátů prokazuje, že produkt obsahuje dva isomery v poměru 2:1. NMR spektroskopie v DMSO-dg prokazuje, že produkt tvoří směs a a β anomerů.

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-d₆), 6 vzhledem k TMS: 8,4-8,1 (m, 2H, Ar-H), 8,05-7,79 (m, 2H, Ar-H), 7,79-7,60 (t, 1H, NH), 6,80 (d, 1H, OH-1), 5,81 (s+s, 1H, acetal H), 5,30 a 5,18 (s+s, 1/2H + 1/2H, H-l), 4,30-4,10, 3,93-3,3 (m, 6H, H-2 - H-6) a

1,85 (d, 3H, CH3); 169,331 (C=0), 147,490, 139,544, 133,018, 129, 862, 123, 732, 120, 884 (ar-C), 99, 000, 98,806 (acetal-C), 95,924, 91,406, 82,433, 81,454, 70,320, 68,240, 67,907, 67,020, 65, 574, 61,833, 57, 875, 54,609 (cukerná složka-C) , 23,014 a 22,557 (CH3).

Sloučenina 10

4,6-0-(benzyliden-di) -D-galaktopyranosa

Benzaldehyd-di se připraví a převede na benzaldehyddimethylacetal-dx způsobem popsaným v EP 0 283 139 Bl.

V destilačním zařízení se při 45 °C mísí D(+)galaktosa (15,0 mg, 0,0833 mol) se suchým DMF (80 ml). Pak se přidá benzaldehyd-dimethylacetal-di (12,8 g, 0,0836 mol) a paratoluensulfonová kyselina (0,14 g) a methanol a DMF se pomalu oddestiluje ve vakuu (vodní vývěva). Za 3 hodiny se připojí vakuová vývěva a oddestiluje se zbylý DMF. Zbytek se rozpustí ve směsi methanol/voda (1:1) obsahující NaHCO₃ (11 mg/ml) a přečistí se na koloně Lobar C RP-8 s použitím směsi methanol voda (1:1) jako elučního prostředku. Frakce obsahující produkt ze 7 samostatných pokusů se vysuší vymrazením a jejich spojením se získá bílý vločkovitý produkt. Získá se 6,62 g produktu což odpovídá 30% teoretickému výtěžku.

Pomocí GC a NMR analýz lze prokázat, že produkt obsahuje směs anomerů v poměru 1:1. ^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-d₆) , δ vzhledem k TMS: 7,52-7,30 (m, 5H, Ar-H), 6,62 (0,5H, d, ΟΗ-1β), 6,32 (0,5H, d, OH-1-α), 5,05 (0,5H, t, H-1-α), 4,85+4,69+4,49 (1H+0,5H+0,5H, m+d+d, OH-2+OH-3), 4,35 (0,5H, t, H-1-β), 4,123,92+3,81-3,71+3,69-3,59+3,49-3,39+3,39-3,28 (3H+1H+0,5H+1H+2H m+m+m+m+m, H-2-H-6+H₂O) ; 138,753, 138,690, 128,607, 128,319, 127,913 a 126,3 (Ar-C), 99,345 (acetal-C), 97,307 a 93,178 (C

1), 76,738 a 76,158 (C-4), 72,101, 72,605, 68,947, 68,862, 68,486 a 67,730 (C-2, C-3 a C-6) a 65,829 a 62,068 (C-5).

Sloučenina 11

4,6-0-(benzyliden-di) -D-mannopyranosa

Benzaldehyd-dj se připraví a převede na benzaldehyddimethylacetal-di způsobem popsaným v EP 0 283 139 Bl.

V destilačním zařízení se při 40 °C smísí D(+)-mannosa (15,0 mg, 0,0833 mol) se suchým DMF (70 ml). Pak se přidá benzaldehyd-dimethylacetal-di a para-toluensulfonová kyselina (0,14 g) za vzniku čirého roztoku. Pak se připojí vakuová vývěva a pomalu se oddestiluje methanol a DMF při tlaku 70002000 Pa (70-20 mbar) a teplotě 45-50 °C. Za tři hodiny se oddestiluje zbylý DMF za nejvyššího vakuu a získá se tak mírně nažloutlý sirup.

Zbytek se opakovaně promyje etherem aby se odstranily lipofilni složky. Podíly tvořící surový produkt rozpustí v mírně alkalické (NaHCO₃) směsi methanolu/vody (3:2) a přečistí se na koloně Lobar C RP-8 s použitím směsi methanol/voda (3:2) jako elučního prostředku. Metodou GC TMS derivátů lze prokázat, že produkt obsahuje 4 isomery v poměru 10:3:1:4. Opětovnou elucí směsí methanol/voda (1:4) se získá bílý vločkovitý produkt obsahující na základě výsledků GC analýzy pouze dva isomery v poměru 70/30. Získá se 1,42 g produktu, což odpovídá 6,4 % teoretického výtěžku.

Na základě analýzy ¹H-, ¹³C~, COSY-, DEPT- a C-H korelační NMR analýzy lze potvrdit chemickou strukturu a rovnováhu a a β anomerů v poměru 1:8.

• 4	Φ 4	4 a	44 4
•	•	4 4	44	• 4	a a	4 4
•	•	4	4	4	4 4
•
«	4	4	4	4	4 4
•	4	4 4 4 4	4 4 4	···	4·	• ·

¹H- a ¹³C-NMR (DMSO-d₆) převládajícího isomeru, δ vzhledem k TMS: 7,5-7,28 (m, 5H, Ar-H), 6,56 (d, 1H, OH-1), 5,0-4,85 (m, 3H, H-l, OH-2 a OH-3), 4,10-4,02 (m, 1H, H-6), 3,63-3,40 (m, 5H, H-2, H-3, H-4, H-5 a H-6'); 138,045, 128,825, 128,029, 126,438 (Ar-C), 100,802 (acetal-C), 95,233 (C-l), 78,987 (C4), 72,032 (C-3), 68,317 (C-6), 67,252 (C-2) , 63,495 (C-5).

Sloučenina 12

2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-a-D-galaktopyranosa

K míchané suspenzi N-acetyl-D-galaktosaminu (1,50 g, 6,77 mmol) v acetonitrilu (37 ml) se přidá benzaldehyddimethylacetal (2,0 ml, 14 mmol) a potom para-toluensulfonová kyselina (15 mg). Pak se reakční směs ponoří do horké olejové lázně (60 °C) a míchá se 3 hodiny v atmosféře dusíku, za tvorby husté bílé sraženiny. Pak se reakční směs zfiltruje a, tuhé složky se promyjí chladným dichlormethanem (asi 2ml) s následným odsáváním v atmosféře dusíku. Získaný bílý prášek se pak vnese do předem zvážené skleněné lahvičky a ponechá se 72 hodin ve vakuu (6 Pa (0,06 mbar)) za získání požadovaného produktu obsahujícího pouze a-isomer (1,74 g, 83 %) .

^XH NMR δΗ (300 MHz, d6~DMSO) 1,83 (3H, s, CH3) , 3,80-4,17 (6H, m, H-2, H-3, H-4, H-5 a H-6), 4,65 (1H, d, OH-3), 5,06 (1H, t, H-l), 5,59 (1H, s, ArCH), 6,52 (1H, d, OH-1), 7,337,55 (5H, m, ArH) a 7,69 (1H, d, NH) ; ¹³C NMR δο{^χΗ} (75 MHz, D₆DMSO) 23 (CH₃), 50, 62, 65, 69 a 76 (C-2, C-3, C-4, C-5, C-6), 91 (C-l), 100 (ArCH), 126, 128, 128 a 129 (arom.C) a 170 (C=0).

Sloučenina 13

4,6-0-(3-nitrobenziliden)-D-glukopyranosa

3-nitrobenzaldehyd-dimethylacetal se připraví způsobem popsaným pro sloučeninu 9.

3-nitrobenzaldehyd-dimethylacetal (21,9 g, 0,11 mol), D(+)glukosa (16,0 g, 0,09 mol), para-toluensulfonová kyselina (100 mg, 0,5 mmol) a sichý DMF se smísí v atmosféře N₂ a míchá se 25 minut při 58 °C, Pak se připojí vakuová vývěva a přes připojenou chlazenou kolonu se za 4 hodiny 15 minut při 55-60 °C, 3000-4000 Pa (30-40 mbar)) pomalu oddestiluje methanol a DMF. Pak se aparatura přestaví na destilaci s krátkou cestou par k odstranění většiny DMF a v destilaci se pokračuje 1,5 hodiny. Zbytek je ve formě slabě žlutě zbarveného sirupu.

Sirup se pak rozpustí ve slabě alkalické (NaHCCh) směsi methanol/voda 60:40 a přečistí se na koloně Lobar C RP-8 s použitím methanolu/vody 60:40. Frakce obsahující podukt se odpaří (k odstranění methanolu), vymrazí se a spojením se získá 5 g vločkovitého bílého tuhého produktu. Získaný produkt se pak znovu přečistí s použitím methanolu/vody 60:40 a získá se tak produkt o dostatečné čistotě. Získá se 3,3 g, tj. 12 % teoretického výtěžku. GC analýzou je možné potvrdit, že produkt obsahuje dva isomery v poměru 70:30.

^XH NMR (DMSO-dg), δ vzhledem k TMS: 8,33-7,63 (5H, m, ArH) , 6,89+6,60 (1H, d+d, OH.l-I+II), 5,78 (1H, s+s, acetal-HI+II), 5, 34 (0, 65H, d, OH-3-II) , 5,75 + 5,71 (1,12H, d+d, OH-2II + OH-3-I), 4,99 (0,56H, m, H-l-I) , 4,88 (0,32H, OH-2-I) ,

4,49 (0, 74H, m, H-l-II) , 4,28-4,12 (1H, m, H-6'-I + II) , 3,853,53 (2,27H, m, H-3-I, H-5-I a H-6-I + II) , 3, 49-3,32 (2,58H, m, H-2-I, H-3-II, H-4-I+II a H-5-II) a 3,12-2,98 (0,85H, m, H-2II) .

··	4«	•	•	··
•	•	• ·	• ·	··	•	•	• ·
• ·		•	«	• ·
• ·	• ·	•	•	* ·	•
•	•	•	•		•	•
··	• •4 ·	• · ·	• · ·	99	9 9

Sloučenina 14

4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa

2-hydroxybenzaldehyd (16,0 g, 0,13 mol), D-glukosa (23,6 g, 0,13 mol) a para-toluensulfonová kyselina (katalytické množství) se smísí v DMF (100 ml). Směs se zahřívá při asi 60 °C 0,5 hodiny k získání roztoku. Průběh reakce se sleduje TLC analýzou (silikagel, ethylacetát). Po 20 hodinách při 20 °C se směs dvakrát zahřeje na 60 °C na 1 hodinu a pak se odpařením při 60 °C za sníženého tlaku odstraní většina DMF. Pak se přidá ethylacetát (asi 100 ml) přičemž vznikne sraženina. Pak se roztok oddělí dekantací, provede se analýza metodou TLC a odpařením za sníženého tlaku se získá olej. Olej se rozpustí v ethylacetátu, přidá se silikagel (120 g, 200-500 pm) a rozpouštědlo se odpaří. Asi polovina produktu se zpracuje chromatografii na silikagelu (550 ml, 30-60 pm) s použitím ethylacetátu jako elučního prostředku. Shromáždí se frakce po 100 ml a frakce 15 až 25 se odpaří za sníženého tlaku a získá se tak olej (3,4 g) znečištěný významným množstvím DMF. Produkt, pouze mírně rozpustný v chloroformu se vysráží přídavkem asi 20 ml uvedeného rozpouštědla. Promytím chloroformem a vysušením ze získá tuhá hmota (1,86 g). Zbytek produktu se zpracuje a vysráží výše uvedeným způsobem a získá se 2,43 g a a dalších 1,6 g se získá z matečných louhů po srážení. Celkem se získá 5,58 g produktu, tj. 16 % teoretického výtěžku.

Z výsledků NMR a TLC analýzy vyplývá, že produkt je znečištěn několika procenty 2-hydroxybenzaldehydu a glukosy. Chromatografii popsanou výše se získá produkt v podstatě prostý nečistot. Z výsledků NMR vyplývá, že produkt obsahuje směs a a B anomerů. Při stanovní v DMSO-dg je poměr anomerů α/β • · • · • · * 9 9 9 9 ·· ·· · 9999

9 9 9 9 9 9 ··«· 999 999 99 9 nejprve roven 2:1 ale mění se s časem. Rovněž GC spektroskopie silylovaných derivátů vykazuje dva píky v poměru 2:1.

^XH- a ¹³ NMR (DMSO-d₆) δ vzhledem k TMS: 9,50 (s, 1H, ArOH), 7,30 (m, 1H, Ar-H-6), 7,09 (m, 1H, Ar-H-4), 6,80-6,68 (m, 2,34H, Ar-H-3 + Ar-H-5 + OH-1-β), 6,48 (d, 0,67H, OH-1-α), 5,71 (s, acetal-H-α+β), 5,10 (t, 0,65H, OH-2-β + OH-3-β), 4,97 (d, 0,63H, OH-3-α), 4,90 (t, 0,66H, H-1-α), 4,71 (d, 0,65H, OH-2a), 4,39 (t, 0,39H, H-1-β) , 4,10-3,93 (m, 1,13H, Η-6'-α+β) , 3,80-3,67 (m, 0,71H, H-5-a), 3,60-3,45 (m, 1,73H, H-3-a) aH6-α+β), 3,35-3,14 (m, 3,31H, H-4-α+β, H-2-α, H-3-β, H-5-β a H₂O) , 3,00-2,95 (m, 0,42, H-2-β); 154,72, 154,69, 130, 11, 127,85, 127,77, 124,44, 124,38, 118,97 a 115,69 (Ar-C), 97,95 (C-1-β), 96,95 a 96,87 (acetal-C), 93,50 (C-1-α), 82,35 (C-4a), 81,52 (C-4-β), 76, 04 (C-2-β) , 73,32 (C-3-β), 73,19 (C-2-a), 70,04 (C-3-a), 68,98 (C-6-a), 68,61 (C-6-β), 66,24 (C-5-β) a 62,46 (C-5-α).

Sloučenina 15 2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa

K 2-hydroxybenzaldehydu (10,7 ml, 0,100 mol) a trimethylortoformiátu (11,0 ml, 0,100 mol) se přidá katalytického množství para-toluensulfonové kyseliny. Za 60 minut se přidá 2-deoxy-D-glukosa (16,4 g, 0,100 mol) a DMF (300 ml) a směs se rychle zahřeje na asi 60 °C. Za asi 10 minut z výsledků TLC analýzy vyplývá přítomnost produktu a za 25 hodin se přidá malé množství pyridinu. Odebere se vzorek a chromatografii (ethylacetát/methanol 9:1) se oddělí frakce obsahující nečistoty. Frakce obsahující poměrně čistý produkt se oddělí chromatografii s použitím malého množství směsi heptan/ethylacetát (1:4). Zbytek reakční směsi se odpaří ve ·· ♦· 4 444

4 4 4 ·· «· 4 ·4 • 4 4 4 · ·4 · 4 4 4 44 ·· ···· ··· ··· ·· ♦ vakuu a zbytek se rozpustí v ethylacetátu, přidá se silikagel (200-500 pm) a rozpouštědlo se odpaří ve vakuu. Chromatografii (heptan/ethylacetát 1:4) se získají asi 2 g produktu o střední čistotě.

Uvedený nízký výtěžek lze pravděpodobně přičíst zbytečně dlouhé reakční době a pokus byl opakován s přídavkem pyridinu po 2,5. Zpracováním a chromatografii výše uvedeným způsobem se tak získá 2,4 g znečištěného produktu. Izolované produkty se smísí a opakovaným chromatografickým zpracováním (heptan/ethylacetát 1:4) se získá bílý tuhý produkt. Získá se 4,1 g produktu, tj. 7 % teoretického výtěžku. NMR analýza poskytuje spektrum odpovídající čistému požadovanému produktu až na některé signály odpovídající několika procentům nečistot (signály okolo 1 ppm; nečistoty pravděpodobně pocházejí z rozpouštědel). Proto se provede opakované čištění chromatografii, které však vede k výrazným ztrátám produktu a konečné izolaci pouze 1,2 g produktu. Z výsledku NMR spektroskopie vyplývá poměr α:β asi 1:1.

^XH- a ¹³C NMR (DMSO-d₆) , δ vzhledem k TMS: 9,56 (s, 1H, ArOH), 7,41-7,29 (m, 1H, Ar-H), 7,18-7,06 (m, 1H, Ar-H), 6,866,70 (m, 2,54H, Ar-H + OH-1-β), 6,40 (d, 0,50H, OH-1-α), 5,83 a

5,80 (s+s, 1H, acetal-H), 5,17 (t, 0,51H, H-1-α), 5,11 (d,

0,46H, OH-3-β), 5,03 (d, 0,50H, OH-3-α), 4,79 (t, 0,46H, H-lβ), 4,14-3,95 (m, 1,25H, H-6-α+β + EtOAc), 3,91-3,72 (m, 1,11H,

H-3-α + H-5-α) , 3, 72-3,57 (m, 1,48H, H-3-β + Η-6'-α+β) , 3,363,16 (m, 1,39H, H-4-α+β, H-5-β + H₂O), 2,05-1,86 (m, 0,93H, H2-α+β + EtOAc), 1,63-1,47 (m, 0,51H, H-2'-a) a 1, 47-1, 32 (m,

0,48H, Η-2'-β) ; 154,71 a 154,66 (Ar-C-OH) , 130,09, 127,88, 127,78, 124,54, 124,48, 118,96, 118,93, 115,67 (Ar-C), 97,06a 97,00 (acetal-C), 94,36 (C-1-β), 91,71 (C-1-α), 84,52 a 83,70

(C-4)_z 68,92 a 68,68 (C-6), 67,24 (C-3-β), 66,52 (C-5-β), 64,50 (C-3-α), 63,03 (C-5-α) a 42,29 (C-2).

Sloučenina 16

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa

K 2-hydroxybenzaldehydu (10,7 ml, 0,100 mol) a trimethylortoformiátu (11,0 ml, 0,100 mol) se přidá katalytické množství para-toluensulfonové kyseliny. Teplota se spontánně zvýší na asi 60 °c a směs se ponechá asi 2 hodiny načež se přidá N-acetylglukosamin (20,3 g, 0,092 mol) a DMF (150 ml). Pak se reakční směs míchá 30 minut při 20 °C a krátce se zahřeje na 50 °C. Většina N-acetylglukosaminu se rozpustí a z výsledků analýzy TLC vyplývá v podstatě úplná konverze na očekávaný produkt. Pak se reakční směs opět krátce zahřeje na asi 50 °C a těkavé složky se odpaří při 20 °C/2000 Pa (15 mm Hg). Mírně zakalená reakční směs se pak ponechá 4 dny při 20 °C. Přidá se malé množství pyridinu a většina rozpouštědel se odpaří při 60 °C/2000 Pa (15 mm Hg) na olej. Olej se vnese do ethylacetátu (350 ml) a získá se malé množství sraženiny a dekantovaný roztok se odpaří společně s přídavkem silikagelu (200 g, 200-500 pm).

Menší podíl produktu se zpracuje chromatografii na silikagelu (550 ml, 30-60 pm) s použitím ethylacetátu a za shromažďování 100 ml frakcí. Po získání 58 frakce se eluční prostředek změní za směs ethylacetát/methanol 9:1 a produkt se získává pomocí následujících 20 frakcí. Odpařením frakcí obsahujících produkt se získá 3,3 g tuhého produktu. Zbytek produktu se zpracuje chromatografii na silikagelu s použitím směsi ethylacetát/methanol 9:1 a získá se tak dalších 21 g tuhého produktu. DMF se odstraní mícháním jemně děleného produktu s ethylacetátem (200 ml) po 2 hodiny. Filtrací, promytím ethylacetátem a vysušením se získá 16,7 g čistého produktu což odpovídá teoretickému výtěžku 56 %. Z výsledků GC analýzy vyplývá převládající obsah jednoho z isomerů v poměru 5:1. Z výsledků NMR analýzy v DMDO-dg vyplývá, že β isomer je obsažený ve čtyř- až pětinásobném přebytku vzhledem k a isomeru.

^XH- a ¹³C-NMR v (DMSO-dgú δ vzhledem k TMS: 9,59 (s, 1H, Ar-OH), 7,80 (d, 1H, NH), 7,38 (t, 1H, Ar-H), 7,17 (t, 1H, Ar-H), 6,86-6,72 (m, 3H, Ar-H a OH-1-α+β), 5,82 (s+s, 1H, acetal-H), 5,17 (d, 0,22H, OH-3-β), 5,10-4,98 (m, 1,54H, OH-3-α a HH-1a) , 4,61 (t, 0,21H, H-1-β) , 4,17-4,10 (m, 0,24H, Η-6'-β) , 4,104,03 (m, 0,78H, H-6'-a) , 3,90-3,80 (m, 0,80H, H-5-a) , 3,79-3,61 (m, 2,53H, Η-6-α+β, H-3-a a H-2-a), 3,61-3,53 (m, 0,26H, H-3β) a 3,46-3,28 (m, 3,58H, H-2-β, H-4-α, H-5-α a H₂O); 169,91, 169,77 (C=O), 154,70, 130,15, 127,86, 127,75, 124,41, 124,36, 112,98 a 115,70 (Ar-C), 97,00 a 96,86 (acetal-C), 96,34 (C-lβ), 91,81 (C-1-α), 83,08 a 82,12 (C-4), 70,92 a 67,58 (C-3), 68,86 a 68,52 (C-6) , 66,34 a 62,58 (C-5), 58,33 a 55,08 (C-2), 23, 46 a 23, 00 (CH₃) .

Sloučenina 17

4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa

K 2-hydroxybenzaldehydu (10,7 ml, 0,100 mol) a trimethylortoformiátu (11,0 ml, 0,100 mol) se přidá katalytické množství kyseliny para-toluensulfonové. Získaná reakční směs se míchá 60 minut a pak se přidá D-galaktosa (18,0 g, 0,100 mol) v DMF (300 ml) a směs se krátce zahřeje na asi 60 °C. Během několika minut se roztok stane homogenní a analýza TLC prokazuje přítomnost produktu. Za 20 hodin se ·· « 4 · 9 ·· · ·· < ·· ·· «·»· • 999

99 9 99 · 44 • 9 9 99 • 9 9·

».*« **· ♦· » přidá malé množství pyridinu, většina rozpouštědla se odstraní a zbytek se vnese do silikagelu jak je popsané výše.

Chromatografii na sloupci (ethylacetát/methanol 9:1) se získá požadovaný produkt ve vysokém výtěžku (asi 17 g) znečištěný pouze DMF. Opakovanou chromatografii se získá 4,9 g čistého produktu a současně asi 10 g produktu znečištěného několika procenty DMF. Z výsledků NMR spektroskopie vyplývá poměr a a β anomeru 77:23. Na záznamech GC analýzy silylovaných derivátů jsou dva píky v podobném poměru.

^XH- a ¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ vzhledem k TNS: 9,28 (s, 1H, ArOH), 7,43-7,34 (m, 1H, Ar-H), 7,19-7,13 (m, 1H, Ar-H) , 6,856,76 (m, 2H, Ar-H), 6,63 (d, 0,23H, OH-1-β), 6,30 (d, 0,76H, OH-1-α), 5,75 (s, 1H, acetal-H), 5,06 (t, 0,76H, H-1-α), 4,84 (d, 0,23H, OH-2-β), 4,79 (d, 0,22H, OH-3-β), 4,60 (d, 0,76, OH3-α), 4,54 (d, 0,78-OH-2-0C) , 4,34 (t, 0,23H, H-1-β), 4,13-3,87 (m, 3H, H-4-α+β a H-6-α+β), 3,79-3,70 (m, 1,55H, H-3-α a H-5α) , 3,66-3,59 (m, 0,78H, H-2-α), 3, 45-3,36 (m, 0,49H, H-3-β a H-5-β) a 3,36-3,27 (m, 0,95H, H-2-β a H₂O); 154,76, 154,70, 129,96, 128,08, 128,03, 125,18, 125,06, 118,95, 118,88 a 115,69 (Ar-C), 97,57 (C-1-β), 96,68 a 96,49 (acetal-C), 93,49 (C-1-α), 77,19 a 76,62 (C-4), 72,36 a 71,88 (C-2-β a C-3-β), 69,30 a 69,19 (C-6), 68,79 a 67,99 (C-2-α a C-3-α), 66,10 a 62,33 (C—5).

Sloučenina 18 2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa

K 2-hydroxybenzaldehydu (0,65 ml, 6,1 mmol) a trimethylortoformiátu (0,63 ml, 6,1 mmol) se přidá katalytické množství kyseliny para-toluensulfonové. Po 1 hodině se přidá 2-deoxy-D-galaktosa (1,0 g, 0,61 mmol) a DMF (25 ml) a směs se

• 9	• 4	*	•	··
•	•	• ·	• 4	··	•	•	44
•	•	4	9	•	• ·
4	4	• ·	9	•	• ·	•
• ·	•	4	•	•	4
44	• 44 A	• 4 ·	• 44	4·	• 4

krátce zahřeje na asi 60 °C za vzniku homogenního roztoku. TLC prokáže do 10 minut přítomnost produktu. Za 2,5 hodiny se přidá pyridin, a další zpracování se provede výše popsaným způsobem. Chromatografie s ethylacetátem poskytuje jen malou separační schopnost proto se eluce provede s použitím směsi ethylacetát/methanol 95:5 a získá se tak 98 mg (6 %) produktu přijatelné čistoty. Z výsledků NMR spektroskopie vyplývá přítomnost dvou isomerů v poměru 3:2. Na záznamech GC analýzy silylovaných derivátů jsou dva píky v podobném poměru.

¹H NMR (DMSO-d₆) δ vzhledem k TMS: 9,26 (s, 1H, Ar-OH), 7,48-7,37 (m, 1H, Ar-H), 7,23-7,10 (m, 1H, Ar-H), 6,86-6,73 (m, 2H, Ar-H), 6,62 (d, 0,31H, OH-1-β), 6,21 (d, 0,48H, OH-1α), 5,80 (s, 1H, acetal-H), 5,31 (s, 0,49H, H-1-α), 4,78 (d, 0,31H, OH-3-β) , 4,67 (d, 0,94H, OH-3-α + H-1-β), 4,07-3,79 (m, 3,49H, H-4-α+β, H-6-α+β + H-3-α), 3,70 (m, 0,95H, H-5-α, H-3β), 3,33 (m, H-5-β +H₂O) , 1,89-1,77 (m, 0,53H, H-2-α), 1,771,62 (m, 0,90H, H-2-β + Η-2'-β) a 1,72-1,51 (m, 0,53H, H-2'-a) ; 154,79 a 154,76 (Ar-C-OH), 129,96, 128,12, 125,24, 125,15, 118,94, 118,88 a 115,69 (Ar-C), 96,62 a 96,45 (acetal-C), 94,21 (C-1-β), 91,66 (C-1-α), 75,80 a 74,71 (C-4), 69,86 a 69,61 (C-6), 67,47 (C-3-β), 66,35 (C-5-β), 63,43 (C-3-α), 62,38 (C-5-α) a 37,09 a 34,23 (C-2).

Sloučenina 19

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa

K 2-hydroxybenzaldehydu (0,48 ml, 4,5 mmol) a trimethylortoformiátu (0,47 ml, 4,5 mmol) se přidá malé množství kyseliny para-toluensulfonové. Za 60 minut se přidá N-acetyl-galaktosamin (1,0 g, 4,5 mmol) v DMF (25 ml) a směs

• · • · · se krátce zahřeje na asi 50 °C za vzniku homogenního roztoku. Po 15 minutách analýza TLC prokazuje přítomnost produktu. Za 2,5 hodiny se přidá malé množství pyridinu, většina DMF se odstraní za sníženého tlaku. Produkt se vnese na silikagel jak je popsané výše chromatografii (ethylacetát/methanol 9:1) se získá 444 mg (30 %) titulní sloučeniny. Z výsledků NMR spektroskopie vyplývá, že sloučenina obsahuje převážně jeden isomer, pravděpodobně a isomer.

¹H- a ¹³C-NMR (DMSO-d₆) δ vzhledem k TMS (převládající isomer): 9,34 (s, 1H, Ar-OH), 7,63 (d, 1H, NH), 7,47-7,39 (m, 1H, Ar-H), 7,21-7,14 (m, 1H, Ar-H), 6,87-6,79 (m, 2H, Ar-H), 6,52 (d, 0,96H, OH-1), 5,80 (s, 1H, acetal-H), 5,08 (t, 0,97H, H-l), 4,58 (d, 1H, OH-3), 4,12 (d, 1H, H-4), 4,08-3,98 (m, 2H, H-2 +H-6), 3,98-3,89 (m, 1H, H-6') , 3,89-3,79 (m, 1H, H-3) , 3,78 (s, 1H, H-5) a 1,83 (s, 3H, CH₃) ; 169, 92 (C=O) , 154,69 (Ar-C-OH), 130,00, 128,05, 125,15, 118,98 a 115,68 (Ar-C), 96,40 (acetal-C), 91,72 (C-l), 76,45 (C-4), 69,37 (C-6), 65,75 (C-3), 62,27 (C-5), 50,57 (C-2) a 23,09 (CH₃) .

Sloučenina 20

4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-mannopyranosa

K -2-hydroxybenzaldehydu (10,7 ml, 0,100 mol) a trimethylortoformiátu (11,0 ml, 0,100 mol) se přidá katalytické množství kyseliny para-toluensulfonové. Za 60 minut se přidá D-mannosa (18,0 g, 0,100 mol) a DMF (300 ml) a směs se krátce zahřeje na asi 60 °C. Reakční směs je již za 20 minut homogenní a analýza TLC prokazuje přítomnost produktu.

Za 2,5 hodiny se přidá malé množství pyridinu a většina DMF se odpaří za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí v ethylacetátu (přidá se malé množství methanolu aby vznikl homogenní systém) a rozpouštědla se odpaří ve vakuu. Malý podíl surového • · produktu se zpracuje chromatografii (ethylacetát/methanol 9:1) a totožnost produktu se prokáže NMR analýzou. Zbytek produktu se zpracuje chromatografii s výtěžkem 7,7 g produktu znečištěného velkým množstvím DMF. Pokus odstranit DMF mícháním produktu s chloroformem s následnou filtrací vede k výtěžku 7,1 g tuhého produktu obsahujícího asi 20 % mol.

DMF. Produkt se pak míchá 20 hodin s asi 300 ml ethylacetátu a získá se tak 1,7 g mírně načervenalých krystalů, v podstatě prostých DMF. Chromatografii se získá produkt prostý DMF ale mírně zbarvený. Filtrát se odpaří a přečištěním zbytku chromatografii se získá dalších 3,5 g produktu. Celkový výtěžke izolovaného produktu je 4,7 g , což je 16 % teoretického výtěžku. Z výsledků NMR spektroskopie vyplývá přítomnost převážně a isomeru (α:β -85:15).

¹H- a ¹³C-NMR (DMSO-dg) δ vzhledem k TMS (převládající isomer): 9,51 (s, 1H, Ar-OH), 7,42-7,29 (m, 1H, Ar-H), 7,227,11 (m, 1H, Ar-H), 6,83-6,72 (m, 2H, Ar-H), 6,52 (d, 0,73H, OH-1), 5,79 (s, 0,72, acetal-H), 4,96-4,79 (m, 2,88H, H-l, OH2 + OH-2, + OH-3), 4,04-3,98 (m, 0,58H, H-6), 3,83-3,68 (m, 2,52H, H-3, H-4 + H-5) a 3, 68-3,54 (m, 2,84H, H-2 + H-6') ; 154,65 (Ar-C-OH), 130,07, 127,84, 124,56, 118,92 a 115,69 (ArC), 97,29 (acetal-C), 95,51 (C-l), 79,55 (C-4), 72,38 (C-2), 68,88 (C-6),.67,53 (C-3) a 63,87 (C-5).

Sloučenina 21

4,6-0-benzyliden-L-glukopyranosa

V destilační aparatuře se smísí L(-)-glukosa (5,0 g, 27,8 mmol), benzaldehyd-dimethylacetal (4,66 g, 30,6 mmol) a paratoluensulf onová kyselina (32 mg, 0,17 mmol) v suchém DMF (20 ml). Pak se připojí vodní vývěva pro destilaci s krátkou cestou par a destilacéí ve vakuu se odstraní methanol a DMF.

··· * * · _ ·· ···· ··· ··· ··

Během 1/2 hodiny při 55 °C se bezbarvá suspenze rozpustí a získaný roztok se míchá 1/2 hodiny při 12 000 Pa (120 mbar) za postupného zvýšení teploty na 65 °C. Pak se vakuum zvýší na maximum a reakční směs se odpařuje dalších 45 minut. Na konci destilace se reakční teplota zvýší na 75 °C. Zbytek je slabě nažloutlý sirup, který se zneutralisuje přídavkem NaHCO₃ (29 mg) a nechá se vychladnout.

Surový produkt se rozpustí v methanolu (10 ml) a přečistí se chromatografii na reverzní fázi RP-8 s použitím směsi methanol/voda 1:1. Frakce obsahující produkt se spojí a odpařením se odstraní methanol. Zbytek roztoku se dále zředí vodou a vysuší se vymrazením. Ze tří samostatných pokusů se získá bílá vločkovitá tuhá hmota v celkovém nmožství 2,42 g odpovídajících 32,5 % teoretického výtěžku.

Z výsledků GC chromatografie silylovaných vzorků vyplývá, že produkt obsahuje dva isomery (a a β anomer) v poměru 35/65. ^XH NMR posuny v DMSO-d₆ jsou podobné posunům 4,6-O-benzylidenglukopyranosy: 7,51-7,30 (5H, m, Ar-H), 6,86(0,6H, široký s, ΟΗ-1β), 6,58 (0,3H, široký s, OH-1-α), 5,58 (0,9H, s+s, acetalΗ-α+β), 5,23 (0,7H, d, OH-3-β), 5,20 (0,6H, d, OH-2-β), 5,11 (0,4H, d, OH-3-α), 5,00 (0,4H, H-1-α), 4,82 (0,3H, d, OH-2-α), 4,47 (0,7H, d, H-1-β), 4,21-4,08 (1H, m, Η-6'-α+β) , 3,87-3,73 (0,4H, m, H-5-α), 3,73-3,59 (1,3H, m, Η-6-α+β a H-3-α), 3,463,22 (3,7H, m, H-3-β, H-4-α+β, H-5-β a H-2-α) a 3,09-2,99 (0,6H, m, H-2-β).

Sloučenina 22

4,6-0-(benzyliden-di) -L-glukopyranosa • ♦

L-glukosa (5,14 g, 28,6 mmol) se zahřívá v DMF (20 ml) při 95 °C až do vzniku čirého roztoku. Pak se baňka s reakční směsí vloží do vodní lázně o teplotě 65 °c a přidá se paratoluensulfonová kyselina (33 mg, 0,17 mmol). Potom se k míchanému roztoku glukosy v prostředí o tlaku 8000 Pa (80 mbar) pomocí vodní vývěvy přidá po kapkách během 20 minut injekční stříkačkou benzyliden-dimethylacetal-di (4,7 ml, 31 mmol). Pak se DMF odstraní ve vakuu (200 Pa (2 mbar)) při 65 °C a získá se tak velmi bledě žlutý olej, ke kterému se pak přidá NaHCO₃ (345 mg) a směs se míchá 5 minut. K oleji o teplotě 65 °C se za míchání (magnetický míchací korálek) přidá horká voda (67 °C, 15 ml) a obsah baňky se protřepává ve vodní lázni dokud se olej zjevně nerozpustí. Pak se baňka s reakční směsí vloží na asi 5 minut do proudu chladné vody. Již za asi jednu nebo dvě minuty se vyloučí amorfní tuhá hmota. Vodná směs se pak umísti do lázně led-voda a ponechá se 40 minut. Vyloučená sraženina se pak izoluje filtrací za pomocí vakua (po dekantaci amorfního materiálu), promytím chladnou vodou (25 ml) a potom chladným isopropanolem (5 °C, 2x5 ml) a vysušením v proudu dusíku a získá se 1,85 g suchého bílého prášku. Silylovaný produkt se pak analyzuje plynovou chromatgrafií a z výsledků vyplývá 99% čistota požadovaného produktu.

^XH NMR δ (DMSO-d₅) δ vzhledem k TMS: 7,55-7,25 (5H, m, Ar-H), 6,85 (0,48H, ΟΗ-1β), 6,55 (s, 0,33H, OH-1-α), 5,25 (d, 0,48H, OH-3-β), 5,20 (d, 0,49H, d, OH-2-β) , 5,10 (d, 0,35, OH3-α), 4,98 (d, 0,35H, H-1-α), 4,82 (d, 0,34H, OH-2-α), 4,48 (d, 0,51H, H-1-β) , 4,20-4,05 (m+m, 0,53H + 0,42H, Η-6'-α+β) , 3,85-3,73 (m, 0,44H, H-5-α), 3,72-3,57 (m, 1,27H, m, Η-6”-α+β a H-3-α), 3,45-3,20 (m, 7,8H, H-3-β, H-4-α+β, H-5-β a H-2-α) a 3,10-2,98 (m, 0,56H, H-2-β).

Sloučenina 23

4.6- 0-(2-acetoxybenzyliden)-D-glukopyranosa

K ekvimolárni směsi 2-acetoxybenzaldehydu a trimethylortoformiátu se přidá katalytické množství paratoluenbenzoové kyseliny. Reakční směs se míchá 1 hodinu a pak se přidá ekvimolárni množství D-glukosy a DMF a směs se zahřeje asi na 60 °C. Konverze se sleduje TLC chromatografii a po dosažení rovnováhy se reakce přeruší přídavkem malého množství pyridinu. Většina DMF se odpaří za sníženého tlaku a zbytek se vnese do silikagelu způsobem popsaným výše. Po přečištění chromatografii, izolací požadovaných frakcí a odpaření se získaná sloučenina analyzuje NMR spektroskopií.

Sloučenina 24

4.6- 0-(2,3-dihydrobenzyliden)-D-glukopyranosa

Titulní sloučenina se připraví a přečistí výše uvedeným způsobem s použitím 2,3-dihydroxybenzaldehydu jako výchozí složky. Totožnost se prokáže NMR spektroskopií.

Biologické příklady

Příklad 1

Biologické materiály a způsoby použité pro průkaz účinků

Techniky kultivace buněk

Lidské buňky, NHIK 3025, původem z karcinomu in sítu čípku děložního (Nordbye, K., a Oftebro, R., Exp. Cell Res. 58: 458, 1969; Oftebro, R., a Nordbye, K. Exp. Cell Res. 58: 459-460, • ·

1969) byly kultivovány v Eaglově minimálním esenciálním mediu (MEM) doplněném 15% fetálnim telecím sérem (Gibco BRL, Ltd.). Lidské buňky karcinomu prsu, T-47D (Keydar, I. a sp., Eur. J. Cancer, svazek 15, str. 659-670, 1979) se kultivovaly v mediu RPMI-1640 doplněném 10% fetálnim telecím sérem, 0,2 j/ml insulinu, 292 mg/ml L-glutaminu, 50 j/ml penicilinu, 50 mg/ml streptomycinu. Buňky se kultivovaly běžným způsobem jako monovrstvy při 37 °C ve zkumavkách pro tkáňové kultury. Pro udržování buněk v kontinuálním exponenciálním růstu se buňky zpracovaly trypsinem a rekultivovaly se třikrát týdně.

Přežívání buněk

Přežívání buněk se měřilo podle schopnosti vytvářet kolonie. Před naočkováním se exponenciálně rostoucí buňky trypsinizovaly, suspendovaly se jako jednotlivé buňky a naočkovaly se přímo na 5 cm plastové disky. Počet naočkovaných buněk se vybral tak, aby počet životaschopných buněk byl přibližně 150 na disk. Po 2 hodinové inkubaci při 37 °C se buňky navázaly na dno disků. Potom se zahájila aplikace léků pomocí nahrazeni media mediem obsahujícím požadovanou koncentraci léku. Po aplikaci léku se buňky promyly jednou teplým (37 °C) Hankovým vyváženým roztokem solí a potom se přidalo čerstvé medium. Po 10 až 12 dnech při 37 °C v CO₂inkubátoru se buňky fixovaly ethanolem a barvily se methylenovou modří a potom se spočítaly kolonie.

Obr. 1-3 ukazují frakci přežívajících buněk pro NHIK 3025 buňky ošetřené na dobu 20 hodin sloučeninou 8 a 9 (obr. 1)), sloučeninou 5 a 7 (obr. 2) nebo sloučeninou 12 (obr. 3). Data ukazují, že všechny sloučeniny indukují inaktivaci buněk závislou na dávce podobnou nebo lepší než zilaskorb(²H) • «

(Pettersen a sp., Anticancer Res., svazek 11 ((1991), str.

1077-1082).

Z obr. 4 je patrné, že sloučenina 2 indukuje lepší inaktivaci buněk než tukaresol.

Příklad 2

Syntéza proteinu

Rychlost syntézy proteinů byla vypočtena způsobem popsaným dříve (Ronning, O.W. a sp., J. Cell. Physiol. 107: 47-57, 1981). Stručně, buněčný protein se nasytil značkovacím činidlem během minimálně dvou denní preinkubace s [¹⁴C]valinem o konstantní specifické radioaktivitě (0,5 Ci/mol). Pro udržení specifické radioaktivity na konstantní hodnotě se v mediu použilo vysokých koncentrací valinu (1,0 mM). Při této koncentraci valinu je naředění [¹⁴C]valinu intracelulárním valinem a proteolyticky produkovaným valinem zanedbatelné (Ronning, 0. et al., Exp. Cell Res. 123: 63-72, 1979). Rychlost syntézy proteinu se vypočte z inkorporace [³H]valinu vzhledem k celkové [¹⁴⁰C]radioaktivitě v proteinu na začátku příslušného měření a vyjádří se v procentech na hodinu (Ronning, O.W. a sp., J. Cell. Physiol. 107: 47-57, 1981).

Z obr. 5 je patrné, že sloučenina 2 indukuje lepší inhibici syntézy proteinu než tukaresol.

Příklad 3

Pokusy na lidských xenotransplantátech na holých myších

• ·

Léky byly testovány na léčbě tři lidských xenotransplantátů implantovaných samicím athymických myší. Použitými buněčnými liniemi byly SK-OV-3 ovariální karcinom, A-549 karcinom plic a Caco-2 kolorektální karcinom. Tyto buněčné linie se získaly od Američan Type Culture Collection a před implantací holým myším se krátce inkubovaly in vitro. Nádorové linie se pasážovaly jako s.c. implantáty u holých myší. Malé kousky nádorů se implantovaly s.c. do levého boku zvířat. Zvířata s rostoucími tumory (objem nádorů 25-110 mm³) se náhodně rozdělila do skupiny léčené lékem nebo kontrolní skupiny tak, aby průměrný objem nádorů v obou skupinách byl přibližně stejný. Protinádorová aktivita se hodnotila měřením křivek růstu objemu nádorů a histologickým vyšetřením některých nádorů. Během léčby se nádory měřily 2-krát týdně měřením ve dvou kolmých rozměrech pomocí kaliperu. Objem nádoru se vypočetl ze vzorce: objem = (délka x šířka²)/2. Křivky růstu objemu nádorů se vytvořily standardizací velikostí nádorů v různých skupinách pomocí relativního objemu nádoru (RV), který se vypočetl podle vzorce: RV = Vx/Vl, kde Vx je objem nádoru v den x a VI je objem nádoru na začátku léčby ((den 1), a grafickým znázorněním průměrného objemu se standardními odchylkami pro každou skupinu v závislosti na čase. Exponenciální křivka se upravila pro data růstu relativního objemu nádoru a interval, během kterého se objem nádoru v každé skupině zdvojnásobil (zdvojovači čas nádoru (TD)) , se určil z této křivky (log2/k, kde k je vypočtená rychlostní konstanta pro proces). Histologické vyšetření spočívalo v makroskopickém vyšetření nádoru a vyšetření parafinových řezů nádorem barvených hematoxylinem a eosinem (6-8 mm) ve světelném mikroskopu.

V tabulce 1 je uveden zdvojovači čas nádorů (TD) pro lidské nádorové xenotransplantáty kultivované na holých myších, které byly léčeny i.v. uvedenými léky a dávkami.

Tabulka 1

Typ nádoru	Léčivo	Dávka (mg/kg/den	TD+SE	Doba léčby (dny)
A549	kontrola		13±1	37
	sloučenina 2	90	16±1	52
	sloučenina 5	90	17±1	52
	sloučenina 8	1	21±1*	42
Caco-2	kontrola		2 7±1	81
	sloučenina 5	20	33±1*	81
SK-OV-3	kontrola		20+1	67
	sloučenina 8	1	28±1*	67
	sloučenina 8	7,5	31±1*	56
	sloučenina 10	1	36±1*	67
	sloučenina 10	7,5	17±1	56
SK-OV-3	kontrola		25±1	67
	sloučenina 5	5	28±1	67

* statisticky významný rozdíl mezi léčenou a kontrolní skupinou, p<0,05.

Na obr. 6 jsou uvedeny křivky růstu nádoru pro xenotransplantát nádorové linie SK-OV-3 ovariálního karcinomu implantovaný holé myši, která byla léčena denně 1 mg/kg a 7,5 mg/kg sloučeniny 8. Křivky ukazují významný inhibiční účinek na růst pro obě dávky.

• ·

Obr. 7-12 ukazuji mikroskopické fotografie nádorů pro každou skupinu. Tyto fotografie ukazují obecné nálezy pro tuto sloučeninu, konkrétně je viditelný rozdíl v nekrose nádorových buněk mezi kontrolními nádory a nádory léčenými sloučeninou 8. Potože jsou léčené nádory nekrotizované v důsledku léčby, jsou ve skutečnosti účinky léku ještě silnější, než je zřejmé z růstových křivek.

Příklad 4

Multicelulární sféroidy a aktivace retinoblastomového proteinu (pRB)

Sféroidy se inicializovaly přenesením suspendovaných jednotlivých buněk do tkáňové kultivační nádoby o objemu 25 cm²obsahující 12 ml media. Nádoba se potom umístila na naklápěcí desku (MIXER 440, Swelab Instrument) do průchozí inkubátorové komory při teplotě 37 °C. Rychlost náklonů byla nastavena na 10 náklonů za 18 sekund, během naklánění se bránilo navázání buněk na dno nádoby. Místo toho se buňky po přibližně 24 hodinách naklánění navazovaly jedna na druhou a vytvářely malé agregáty buněk skládající se obvykle z 50-100 buněk. Malé agregáty se potom přenesly do jiné tkáňové kultivační nádoby velikosti 25 cm². V tomto případě se dno nádoby předem pokrylo (potáhlo) tenkou vrstvou 1,3% sterilizovaného agaru (BactoAgar, Difco laboratories, USA). Buněčné agregáty sedimentovaly na agarové vrstvě a nemohly se navázat na tuto vrstvu. Buňky v agregátech, navázané na sebe navzájem, se začaly dělit. Po 1 týdnu zdvojily agregáty svůj objem a začaly se podobat okrouhlým sféroidům. Během tohoto období se medium vyměňovalo 3-krát týdně a sféroidy se přenášely do nových nádob potažených agarem jednou týdně.

• ♦ • 9

Když sféroidy dosáhly velikosti přibližně 400 μιη v průměru (po 2 až 3 týdnech kultivace), tak se přenesly do malých mikrojamek, s 1 sféroidem na jamku společně s 1 ml media, zajistilo se, aby měly všechny vybrané sféroidy přibližně stejnou velikost. Jamky byly také potažené agarem, aby se zabránilo navázání sféroidů na dno jamek. Různé jamky se doplnily novým mediem obsahujícím testovanou substanci ve vybrané koncentraci a potom se každý den měřil průměr každého jednotlivého sféroidů. Toto měřeni se provedlo pod mikroskopem, za použití fázového kontrastu a mřížky se známou vzdáleností linií v jednom z okulárů (vzdálenost mezi dvěma čarami). V každé skupině se použilo paralelně 8-12 sféroidů. Relativní objem sféroidů (objem v den n dělený objemem v den 1) se vypočítával každý den pro každý sféroid a vytvořily se růstové křivky jako závislost průměrného relativního objemu všech sféroidů ve skupině v závislosti na čase po zahájení léčby.

V tabulce 2 je uveden zdvojovači čas (TD) objemu T-47D sféroidů při 259 hodinové léčbě sloučeninou 8 v uvedených dávkách. Tabulka 2 ukazuje zdvojovači časy objemů sféroidů T47D buněk buď neléčených (dávka = 0 mM) nebo léčených kontinuálně 0,1 nebo 1,0 mM sloučeniny 8 v mediu. Je patrné, že sloučenina 8 prodlužuje zdvojovači čas sféroidů (t.j. inhibuje růst sféroidů) v závislosti na dávce, protože efekt je jasně silnější pro 1,0 mM než pro 0,1 mM sloučeniny.

Tabulka 2 • ·

Dávka	TD±SD
0	75±2
0, 1 mM	85±3
1,0 mM	98±7*

* statisticky významný rozdíl mezi léčenou a kontrolní skupinou, p<0,05.

Na obr. 13 jsou uvedeny růstové křivky pro průměrný objem sféroidů pro buněčnou linii T-47D karcinomu prsu, kde byly sféroidy ošetřeny 0,1 mM a 1,0 mM sloučeniny 8 rozpuštěné v mediu.

U sféroidů tvořených NHIK 3025 buňkami nebylo zvětšování objemu sféroidů v čase stejným způsobem redukováno jako u sféroidů tvořených T-47D buňkami. Místo toho se sféroidy ošetřené sloučeninou 8 rozpadaly po relativně krátké době léčby (7 až 10 dnů). Pro zjištění důvodu tohoto silného účinku se provedl pokus, při kterém se sféroidy tvořené NHIK 3025 buňkami ošetřovaly pouze 4 dny a potom se připravily histologické řezy sféroidy. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 14.

Obr. 14 ukazuje mikroskopické fotografie řezů 3 různě léčených sféroidů tvořených NHIK 3025 buňkami, z nichž jeden byl neléčenou kontrolou (A), jeden byl ošetřen 0,1 mM sloučeniny 8 po dobu 4 dnů (B) a jeden byl ošetřen 1,0 mM sloučeniny 8 po dobu 4 dnů (C). Sféroidy se fixovaly ve 4% formaldehydu a ponořily se do parafinu před tím, než se ··· · • · «· ·t·· · · W * • · · · · * * ♦ · *· «·· · « ··· ·♦ připravily 6 mm řezy, které se vybarvily hematoxylinem a eosinem.

Oba sféroidy ošetřené sloučeninou 8 měly významné centrální oblasti, kde byly patrné buňky v apoptose. Obraz apoptosy nebyl pozorován nikde v kontrolním sféroidu, ale byl patrný na mnoha místech sféroidů ošetřených sloučeninou 8.

V obou typech buněk léčených sloučeninou 8 je patrný jasný efekt léku, ačkoliv jsou srovnávány různé typy buněk. Ve sféroidech tvořených T-47D buňkami dochází k redukci růstu objemu sféroidů ošetřených lékem, který je závislý na dávce léku. Ve sféroidech tvořených NHIK 3025 buňkami nedochází k redukci růstu objemu sféroidu během léčby, naopak se objem sféroidů zvyšuje během prvních 9 dnů rychleji u léčených sféroidů. Nicméně, v těchto sféroidech existuje významná frakce buněk podléhajících apoptose, takže drť z mrtvých buněk v tomto případě zvětšuje objem sféroidu. Rychlé zvýšení objemu těchto sféroidů je patrně důsledkem změn osmotického tlaku po lýze fragmentů buněk. V důsledku bobtnání se tyto sféroidy stávají nestabilními a rozpadají se po přibližně 9 dnech.

Důvod rozdílné reakce těchto dvou typů buněk není jasný. Nicméně, existuje významný genetický rozdíl mezi těmito typy buněk s ohledem na regulaci buněčného růstu a proliferace, který mže ýt částečně důvodem tohoto rozdílu. T-47D buňky exprimují funkční pRB, retinoblastomový protein, který je normálním tumor-supresorovým genem, který je významný v regulaci progrese buněčného cyklu u normálních buněk. Tento gen je často defektní v nádorových buňkách a NHIK 3025 buňky patří mezi buňky se defektem funkce pRB. Bylo zjištěno, že pRB může být aktivovaný pro zastavení cyklu buněk za stresových podmínek i tehdy, když buňky vstoupily do S-fáze buněčného

I · • φ φ· · * «

Φ cyklu, což naznačuje, že tento gen může chránit buňky před inaktivačními účinky stresu v kombinaci se syntézou DNA (viz Amellem, Sandvik, Stokke a Pettersen, British Journal of Cancer 77(1998), 862-872). V uvedeném pokusu působí benzaldehydový derivát jako stresový vliv inhibující růst. Proto je možné, že T47D buňky jsou chráněny svým funkčním pRB a proto u nich nedochází k indukci apoptosy, zatímco NHIK 3025 buňky mající defektní pRB se nemohou vyhnout apoptose.

Pro testování aktivace pRB byly použity dva různé typy buněk, které mají oba normální expresi pRB, T-47D a MCF-7 buňky. Jaderný pRB protein se detekoval průtokovou cytometrií. Současně se také provedlo měření DNA a data se prezentovala jakou dvouparametrické histogramy DNA versus pRB. Fixace a barvení se provedlo způsobem podle Sandvik, Stokke a Pettersen, British Journal of Cancer 77(1998), 862-872. Stručně, buňky extrahované detergenčním činidlem se připravily resuspendováním buněk v 1,5 ml detergenčním pufru s nízkým obsahem solí. Extrahovaná jádra se fixovala ve 4% paraformaldehydu po dobu 1 hodiny a potom se pRB navázal na PMG3-245 monoklonální protilátku (Pharmingen), která rozpoznává jako hypo-, tak hyperfosforylované formy proteinu. pRB protilátka byla barvena streptavidinem-FITC a DNA byla barvena Hoechst 33258. Jádra se měřila na FACStart^plusprůtokovém cytometru (Becton-Dickinson) vybaveném dvěma argonovými lasery (Spectra Physics) nastavených na 488 nm a UV, v příslušném pořadí.

Data na obr. 15-18 ukazují frakci jader v každé interfázi, Gl, S a G2 fázi, která měla RB-protein navázaný na jádro po léčbě sloučeninou 8. Když je navázaný tímto způsobem, tak se předpokládá, že RB reguluje buňky mimo buněčný cyklus, t.j. kontroluje buněčný cyklus (viz Amellem, O., Stokke, T., ·· ♦ ·· * t·· • · i * * · · i * · ·· ♦·· ···♦·

Sandvik, J.A. a Pettersen, E.O.: The retinoblastoma gene product is reversibly dephosphorylated and bound in the nucleus in S and G2 phase during hypoxic stress. Exp. Cell Res. 227(1996): 106-115). Data jsou uvedena pro dva typu buněk lidského karcinomu prsu, MCF-7 (obr. 15 a 16) a T-47D (obr. 17 a 18) a pro dobu léčby 24 hodin (obr. 15 a 17) a 48 hodin (obr. 16 a 18). Pro oba typy buněk indukuje sloučenina 8 v koncentracích vyšších než 0,5 mm zvýšení frakcí jader s navázaným pRB ve všech interfázích. Efekt se zvyšuje s prodloužením doby léčby a je výraznější po 48 hodinách než po 24 hodinách léčby. Dohromady tato data ukazují, že substance aktivuje regulační účinek pRB na buněčný cyklus, což vede k redukci progrese buněčného cyklu. Závislost účinku léku na dávce je komplikovaná a vykazuje maximální efekt pro dávky okolo 1 mM sloučeniny 8 a snížení pro vyšší dávky. Byla tak zjištěna křivka dávka-odpověď ve tvaru zvonu, což je podobný výsledek, jako pro sloučeninu 10 v pokusu s SK-OV-3 xenotransplantáty na holých myších (viz tabulka 1). Ačkoliv není dosud známo, proč je aktivace pRB snížena při dávkách sloučeniny 8 nad 1 až 1,5 mM, je zajímavé, že při těchto dávkách byla zjištěna relativně silná inhibice syntézy proteinů. Po 24 hodinové léčbě NHIK 3025 buněk 1,5 mM sloučeniny 8 byla rychlost syntézy proteinů 70% ve srovnání s kontrolními buňkami (viz obr. 19).

Obr. 20 znázorňuje, že syntéza proteinů po 24 hodinách léčby 1,5 nebo 2,5 mM sloučeniny 8 je 75% nebo 50%, v příslušném pořadí, ale navrací se k normě přibližně 6 hodin po odstranění léku. Inhibice buněčného cyklu, která nevyhnutelně vede k inhibici syntézy proteinů (viz Ronning, O.W., Lindmo, T., Pettersen, E.O. a Seglen, P.O.: Effect of sérum step-down on protein metabolism and proliferation kinetics of NHIK 3025 cells. J. Cell Physiol. 107(1981): 47-57) je výsledkem

Φ φ φφ Φ·«· • 9· •· •·

Φ·

Φ· · regulačního účinku pRB- při koncentracích v rozmezí 1,5 až 2,5 mM.

Přiklad 5

Měření buněčné adhese

Buněčné adhesní síly se měřily pomocí mikroskopu pro měření manipulační síly (G. Sagvolden, Manipulation force microscope, Ph.D. thesis, University of Oslo, 1998, a G. Sagvolden, I. Giaver a J. Feder, Characteristic protein adhesion forces on glass and polystyrene substrates by atomic force microskopy, Langmuir 14(21): 5984-5987, 1998). Stručně, NHIK 3025 karcinomové buňky se kultivovaly v CO₂-independentním mediu obsahujícím 15% fetální telecí sérum. Tyto buňky se vystavily působení 1 mM koncentrace sloučeniny 1 nebo sloučeniny 2 na dobu 20 hodin před tím, než se uvolnily z buněčných kultivačních zkumavek pomocí trypsinu. Buňky se udržovaly v suspenzi a umístily se v mediu se sloučeninou 1 nebo sloučeninou 2 na polystyrénové tkáňové kultivační substráty 90 minut po ukončení trypsinové reakce. Adhesní sily mezi buňkami a substrátem se měřily pomocí odstranění buněk za použití šikmé konzoly mikroskopu pro měření síly působící jako snímač síly. V jednom momentě se odstranila jedna buňka a každá buňka se odstranila pouze jednou. Maximální síla zjištěná pro každou buňku se zaznamenala jako funkce času, protože buňky byly umístěny na substrátu. Medián síly pro skupinu 19 měření je na obr. 21 uveden jako funkce průměrného času pro buňky vystavené působení sloučeniny 1 nebo sloučeniny 2, společně s adhesními silami buněk nevystavených působení těchto sloučenin. Sloučenina 2 má značné účinky v redukci adhesní síly při této koncentraci, zatímco sloučenina 1 nemá významné účinky. Efekt

ΊΟ

• ·	·· ·
·· • • *	• 9 • • •	• 9 • 9 9 9 9 9 9	9 9 • 9 9
• 99	« ♦ ·	9·	• 9 9

sloučeniny spočívá hlavně v redukci adhesní síly buněk, nikoliv v průběhu adhese.

Snížená schopnost vazby na substrát může souviset s blokováním zakotvení buněk zprostředkovaného integriny. Bylo prokázáno, že takové blokování může indukovat programovanou buněčnou smrt u hepatomových a melanomových buněk (Paulsen,

P.E., Halí, K.S., Rugstad, H.E., Reichelt, K.L., and Elgjo, K., The synthetic hepatic peptides pyroglutamylgutamylglycylserylasparagin and pyroglutamylglutamylglycylserylaspartic acid inhibit growth of MH1C1 rat hepatoma cells transplanted into buffalo rats and athymic míče. Cancer Res. 52(1992), 1218-1221; a Mason, M.D., Allman, R. a Quibell, M. Adhesion molecules in melanoma - more then just superglue?, J. Royal Soc. Med. 89(1992), 393-395).

Adhesní síla mezi NHIK 3025 buňkami a substrátem byla měřena po pre-inkubaci buněk v roztoku sloučeniny 1 a 2. I při koncentraci 1 mM byl pozorován překvapivý efekt D-izotopu. Překvapivě, sloučenina 2 významně snižuje adhesní sílu na 1/3 ve srovnání s kontrolou, zatímco sloučenina 1 nevede k významnému snížení. Autoři vynálezu soudí, že sloučenina 2 může interferovat s biosyntézou integrinu, což snižuje schopnost buněk vazby na substrát. Integriny jsou strukturální transmembránové proteiny zásadní pro vazbu buněk na extracelulární matrici a pro mezibuněčné interakce. Inhibice funkce integrinu tak může přímo ovlivňovat schopnost metastazování nádorových buněk. Pokus ukázal, že integriny mohou být zejména citlivé na inhibici syntézy proteinů. Sloučenina 2 může být použita pro prevenci metastazování při vývoji nádoru.

Příklad 6 • » • · • · 4 ♦ *

Pokusy se sloučeninou 2 a sloučeninou 5 na NMRI myších infikovaných FRIEND virem erythroleukemie (FLV)

Virus: Eveline buňky byly získány od prof- Gerharh Hunsman, Mnichov. Bylo prokázáno, že tento virus, který byl původně používán jako zdroj Friend pomocného viru, obsahuje defektni virus stejné velikosti jako Spleen Focis Forming Virus (SFFV), který indukuje erythroleukemii u NMRI myší po 4-8 týdnech.

Myši: NMRI myši byly získány z Old Bomholt Farm, Dánsko, a byly zakoupeny prostřednictvím SIFF. Myši byly získány 6.5. a do pokusu byly zařazeny 11.5. Myši se infikovaly intraperitoneálně 50 μΐ supernatantu z Eveline kultury. Po 24 hodinách se zahájila léčba. Sloučenina 2 a sloučenina 5 se rozpustily ve sterilním izotonickém glycerolovém roztoku v koncentraci odpovídající 5 mg na kg při intraperitoneální aplikaci 50 μΐ.

Pokus byl proveden následovně:

myší - neinfikovaná kontrola myší - infikovaná kontrola myší - neinfikované, léčené sloučeninou 2 myší - infikované, léčené sloučeninou 2 myší - neinfikované, léčené sloučeninou 5 myší - infikované, léčené sloučeninou 5

Myším se podávaly intraperitoneální injekce jednou denně po dobu 19 dnů. Od 1.6. do 16.6., kdy se myši utratily, se nepodávala žádná léčba. 16.6. se myši utratily. Odebrala se krev (pro následnou analýzu). Odstranily se sleziny a zvážily se (viz tabulka 3). Část sleziny se zmrazila dusíkem pro přípravu tenkých řezů a část se fixovala formalinem.

Tabulka 3

Neinfikované kontroly	Infikované kontroly	Sloučenina 2 neinfikované	Sloučenina 2 infikované	Sloučenina 5 neinfikované	Sloučenina 5 infikované
125	154	266	151	185	308
160	240	143	153	161	162
94	214	106	168	188	150
146	212	153	145	155	153
118	165	117	149	120	195
120	171	157	127	161,8	129
115	190	63,824	131	27,472	157
103	204		170		176
130	203		127		153
147	148		148		197
125,8	190,1	157	146, 9	162	178 prům. hmotnost
20, 5	24,5	63	15,228	27	50,206 stand. odchylka

Výsledky jsou uvedeny také na obr. 23.

Jak je zřejmé, existuje významný rozdíl ve hmotnosti slezin u infikovaných zvířat ve srovnání s neinfikovanými kontrolami. Hmotnosti u neinfikovaných zvířat léčených sloučeninou 2 nebo sloučeninou 5 jsou vyšší než hmotnosti neinfikovaných kontrol, i když rozdíl není statisticky významný. Lze říci, že infikovaná zvířata, která byla léčena sloučeninou 2, měla skutečně nižší průměrnou hmotnost sleziny ve srovnání s neinfikovanými zvířaty, která byla léčena podobným způsobem (zde se předpokládá, že výsledek má původ v jednom zvířeti v kontrolní skupině, které mělo významně velkou slezinu).

Histologické vyšetření ukázalo, že neinfikované kontroly mají normální anatomii sleziny. Všechna zvířata v infikované neléčené skupině měla invazi patologických leukemických buněk do červené dřeně. Sleziny, od infikovaných zvířat léčených sloučeninou 2 i sloučeninou 5, měly hypertrofická zárodečná centra, která jsou interpretována jako důsledek imunostimulace. Nebylo možno nalézt leukemické změny ve slezinách od infikovaných zvířat léčených sloučeninou 2. Ve skupině léčené sloučeninou 5 mělo zvíře s největší slezinou (308 g) leukemické změny, zatímco všechna zvířata v infikované kontrolní skupině měla leukemické změny.

Tyto výsledky jsou slibné, vezme-li se v úvahu agresivní charakter FLV u myší a také když se srovnají s účinky azidothymidinové a jiné antivirové léčby.

Příklad 7

Proliferace mononukleárních buněk periferní krve

Byl proveden pokus, ve kterém byly mononukleární buňky periferní krve vystaveny působení superantigenu společně s benzaldehydem, deuerizovaným benzaldehydem, sloučeninou 2 nebo zilaskorbem(²H) . Superantigen se použil jako velmi aktivní standard pro proliferaci T-lymfocytů a je prezentován Tlymfocytům buňkami prezentujícími antigen.

♦ 9

Pokus prokázal (viz obr. 22)), že přidání benzaldehydu, deuterizovaného benzaldehydu nebo sloučeniny 2 statisticky významně zvyšuje proliferaci mononukleárních buněk periferní krve způsobem závislým na dávce s křivkou ve tvaru zvonu, zatímco velmi malý efekt byl pozorován pro zilaskorb(²H) . Skutečnost, že jsme byli schopni zesílit proliferační signál ze superantigenu naznačuje, že sloučeniny mají další kostimulační efekt na T-lymfocyty.

Příklad 8

Efekt na metastasy kolorektálního karcinomu do jater u holých myší

Materiál a postupy

Použitá buněčná linie, C170HM2, je známá linie lidského kolorektálního karcinomu S.A. Watson a sp., Eur. J. Cancer 29A (1993)), 1740-1745) a pochází původně z primárního nádoru pacienta. C170HM2 buňky se kultivovaly in vitro v RPMI 1640 kultivačním mediu (Gibco, Paisley, UK) obsahujícím 10% (obj./obj.) teplem inaktivovaného fetálního telecího séra (Sigma, Poole, UK) při 37 °C v 5% C0₂ a ve zvlhčené atmosféře. Buňky ze semi-konfluentních monovrstev se získaly pomocí 0,025% EDTA a promyly se dvakrát v kultivačním mediu popsaném výše.

C170HM2 buňky získané ze semi-konfluentních monovrstev se resuspendovaly v koncentraci lxl0⁶/ml ve sterilním fosfátem pufrovaném salinickém roztoku, pH 7,4 (PBS) a injikovaly se v objemu 1 ml do peritoneálni dutiny 20 MFI samců holých myší (chovaných v Cancer Studies Unit na University of Nottingham). Myši se identifikovaly elektronickým systémem (RS Biotech

DL2000 Datalogger). V den 10 po injekci buněk se myši náhodně rozdělily skupin:

Skupina 1:

Skupina 2:

Skupina 3:

do kontrolní skupiny (placebo) a do pokusných

Sloučenina

Sloučenina mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg mg/kg (i.v.) aplikovány intravenosně ode dne 10 do

Léky ukončení terapie. Pokus se ukončil v den 40 po implantaci buněk. Myši se vážily v pravidelných intervalech během pilotní studie.

Na konci testu se odebrala játra a spočítaly se viditelné nádory jater a změřily se jejich plochy na řezu. Nádory se také vyfotografovaly. Nebyly pozorováno zkapalněni nádorů a proto byly všechny nádory vyříznuty z normální jaterní tkáně, zvážily se a fixovaly se v formaldehydovém salinické roztoku. Peritoneální uzly se odebraly a změřila se jejich plocha na řezu a hmotnost. Provedlo se podrobné patologické hodnocení nádorů.

Efekt sloučenin 1, 2 a 5 a na jaterní invazi lidského kolorektálního nádoru C170HM2 je uveden na obr. 24.

Příklad 9 • *

Biologické účinky sloučeniny 13 ve srovnání se sloučeninou 1

Přežívání buněk

Obr. 25 znázorňuje přežívání buněk, měřené schopností buněk tvořit kolonie, pro lidské buňky karcinomu čípku děložního, NHIK 3025, po 20 hodinové léčbě sloučeninou 1 (o) nebo sloučeninou 13 (·). Buňky byly ošetřeny v otevřených plastových Petriho miskách inkubovaných v C0₂-inkubátorech při teplotě 37 °C. Graf hodnot přežívání představuje průměrné hodnoty z 5 simultánně a podobně ošetřených misek. Standardní odchylky jsou uvedeny vertikálními sloupci ve všech případech, kdy přesáhly velikost symbolů. Data ukazují, že sloučenina 13 indukuje zhruba 10-násobně silnější inaktivaci než sloučenina 1 při stejné dávce.

Příklad 10

Biologické účinky sloučeniny 14 ve srovnání se sloučeninou 1

Přežívání buněk

Obr. 26 ukazuje přežívání buněk, měřené schopností buněk tvořit kolonie, pro lidské buňky karcinomu čípku děložního, NHIK 3025, po 20 hodinové léčbě sloučeninou 1 (o) nebo sloučeninou 14 (·). Buňky byly ošetřeny v otevřených plastových

Petriho miskách inkubovaných v C0₂-inkubátorech při teplotě 37 °C. Graf hodnot přežívání představuje průměrné hodnoty z 5 simultánně a podobně ošetřených misek. Standardní odchylky jsou uvedeny vertikálními sloupci ve všech případech, kdy přesáhly velikost symbolů. Data ukazují, že tyto dvě sloučeniny mají podobný inaktivační účinek při všech koncentracích do 12 nM.

• · · * · • · • · *

• ··· • ·» • · ·· ♦· »· ···

Příklad 11

Biologické účinky sloučenin 21 a 22 ve srovnání se sloučeninami 1, 2a L-glukosou

Syntéza proteinů

Obr. 27 znázorňuje rychlost syntézy proteinů v buňkách lidského karcinomu čípku děložního, NHIK 3025, jak je měřenou množstvím inkorporovaného [³H]-valinu během pulsního období 1 hodina, které je zahájeno bezprostředně po přidání testované sloučeniny (plné symboly) nebo o 2 hodiny později (prázdné symboly). Testované sloučeniny, sloučenina 1 a sloučenina 21, byly přítomny od času 0 do konce pulsů. Buňky byly předem značeny {¹⁴C]-valinem po dobu alespoň 4 dnů proto, aby byly všechny buněčné proteiny saturovány značkovacím činidlem. Inkorporované množství [³H] bylo vztaženo k inkorporovanému množství [¹⁴C] tak, že syntéza proteinů byla vypočtena jako procento z celkového množství proteinu v buňkách. Rychlost syntézy proteinů je uvedena jako procento rychlosti vzhledem k neléčené kontrole. Graf pro syntézu proteinů představuje průměrné hodnoty ze 4 simultánně a podobně ošetřených jamek. Standardní odchylky jsou uvedeny vertikálními sloupci ve všech případech, kdy přesáhly velikost symbolů. Data ukazují, že sloučenina 1 indukuje inhibici syntézy proteinů, která se zvyšuje lineárně se zvyšující se koncentrací léku, zatímco pro sloučeninu 21 byl pozorován slabý nebo žádný efekt.

Obr. 28 znázorňuje rychlost syntézy proteinů v buňkách lidského karcinomu čípku děložního, NHIK 3025, měřené množstvím inkorporovaného [³H]-valinu během pulsního období 1 ·· ·· • · · » • · · • · ♦ *

• · • ·· • · • · • *
• · • · • · · • ·	··
··	·»·	··	«·

hodina, které je zahájeno bezprostředně po přidání testované sloučeniny (plné symboly) nebo o 2 hodiny později (prázdné symboly). Testované sloučeniny, sloučenina 2 a sloučenina 21, byly přítomny od času 0 do konce pulsů. Buňky byly předem značeny [¹⁴C]-valinem po dobu alespoň 4 dnů proto, aby byly všechny buněčné proteiny saturovány značkovacím činidlem. Inkorporované množství [³H] bylo vztaženo k inkorporovanému množství [¹⁴C] tak, že syntéza proteinů byla vypočtena jako procento z celkového množství proteinu v buňkách. Rychlost syntézy proteinů je uvedena jako procento rychlosti vzhledem k neléčené kontrole. Graf pro syntézu proteinů představuje průměrné hodnoty ze 4 simultánně a podobně ošetřených jamek. Standardní odchylky jsou uvedeny vertikálními sloupci ve všech případech, kdy přesáhly velikost symbolů. Data ukazují, že sloučenina 2 a sloučenina 22 indukují účinnou inhibici syntézy proteinů přibližně stejné úrovně pro obě sloučeniny. Obě tyto deuterizované sloučeniny jsou účinnější než příslušné nedeuterizované sloučeniny, jak je uvedeno na obr. 27.

Přežívání buněk

Obr. 29 ukazuje přežívání buněk, měřené schopností buněk tvořit kolonie, pro lidské buňky karcinomu čípku děložního, NHIK 3025, po 20 hodinové léčbě sloučeninou 1 (·) nebo sloučeninou 21 (o). Buňky byly ošetřeny v otevřených plastových Petriho miskách inkubovaných v C02~inkubátorech při teplotě 37 °C. Graf hodnot přežívání představuje průměrné hodnoty z 5 simultánně a podobně ošetřených misek. Standardní odchylky jsou uvedeny vertikálními sloupci ve všech případech, kdy přesáhly velikost symbolů. Z křivek dávka-odpověď, které mají pro tyto dvě sloučeniny různý tvar, je patrné, že sloučenina 21 je účinnější než sloučenina 1 v inaktivaci buněk při nízkých koncentracích sloučeniny. Rozdíl ve tvaru křivek • · · · · · · · • · · · · · · · · · • · · · · ♦ · ···· * ···· • · · · · · · ·· ···· ··· · · · ·· ukazuje na odlišný mechanismus těchto dvou sloučenin v inaktivaci buněk.

Obr. 30 ukazuje přežívání buněk, měřené schopností buněk tvořit kolonie, pro lidské buňky karcinomu čípku děložního, NHIK 3025, po 20 hodinové léčbě sloučeninou 2 (o) nebo sloučeninou 22 (-*-). Buňky byly ošetřeny v otevřených plastových Petriho miskách inkubovaných v C02~inkubátorech při teplotě 37 °C. Graf hodnot přežívání představuje průměrné hodnoty z 5 simultánně a podobně ošetřených misek. Standardní odchylky jsou uvedeny vertikálními sloupci ve všech případech, kdy přesáhly velikost symbolů. Sloučenina 22 je účinnější než sloučenina 2 v inaktivaci buněk, zejména při nízkých dávkách. Například, přežívání buněk je sníženo na 50% po ošetření 0,5 mM sloučeniny 22 a 4 mM sloučeniny 2, což ukazuje na 8-násobně vyšší inaktivační účinnost sloučeniny 22 ve srovnání se sloučeninou 2 na této úrovni efektu. Při 10% přežívání je tento rozdíl mnohem menší.

Obr. 31 ukazuje přežívání buněk, měřené schopností buněk tvořit kolonie, pro lidské buňky karcinomu prsu, T47-D, po 20 hodinové léčbě L-glukosou (·) nebo sloučeninou 21 (o). Buňky byly ošetřeny v otevřených plastových Petriho miskách inkubovaných v C0₂-inkubátorech při teplotě 37 °C. Graf hodnot přežívání představuje průměrné hodnoty z 5 simultánně a podobně ošetřených misek. Standardní odchylky jsou uvedeny vertikálními sloupci ve všech případech, kdy přesáhly velikost symbolů. Data ukazují, že L-glukosa má slabý nebo žádný vliv na přežívání při koncentracích až do 10 mM, což byla nejvyšší testovaná dávka. Sloučenina 21 má také slabý efekt na tyto buňky pro koncentrace do 2 mM, ale indukuje významný inaktivační efekt pro vyšší koncentrace a pouze 1 z 1000 buněk přežívá 20 hodin za přítomnosti 8 mM této sloučeniny.

Závěr

Oba dva testované deriváty L-glukopyranosy (sloučenina 21 a 22) inaktivuji buňky s vyšší účinností než příslušné deriváty D-glukopyranosy (sloučenina 1 a 2). L-glukosa samotná, nicméně, neindukuje žádnou statisticky významnou inaktivaci buněk při zde použitých koncentracích. Je tedy zjištěn pro benzylidenové deriváty lepší účinek L-glukosy ve srovnání s Dglukosou.

Příklad 12

Testování efektu sloučeniny 2 na ova-sensitizovaná a exponovaná zvířata

Samci Balb/c myší stáří 6 týdnů byly senzibilizováni 7 i.p. injekcemi 10 μg ovalbuminu v 0,5 ml salinického roztoku ob den. Za tři týdny po poslední injekci byly myši vystaveny působení 8 ovalbuminových (2 mg/ml) nebo 8 salinických aerosolů v následujících dnech, v dávce 1 aerosol za den na 5 minut. Dva dny před první injekcí ovalbuminu nebo salinického roztoku se zahájila léčba sloučeninou 2, v dávce 5 mg na kg a den i.p., po dobu 10 dnů, a devíti zvířatům byl aplikován ovalbumin a devíti zvířatům byl aplikován salinický roztok a kontrolní skupině byl aplikován salinický roztok. 24 hodin po poslední expozici byla in vivo měřena hyperreaktivita dýchacích cest v reakci na metacholin za použití BUXCO přístroje. Po měření v BUXCO se myši utratily, plíce se vypláchly a izolované buňky se promyly, spočítaly se a diferencovaly se. Odebrala se krev pro izolaci séra na stanovení koncentrace celkových a ova-specifických IgE. Hrudní lymfatické uzliny se izolovaly z paratracheální a • · · · ·

parabronchiální oblasti pro stanovení IFN-gamma, IL-4, IL-5 a IL-12. V pokusu se použilo 9 zvířat na skupinu.

Počet buněk (obr. 32) u myší léčených salinických roztokem nebo senzibilizovaných ovalbuminem nebyl ovlivněn léčbou sloučeninou 2 a nebyl pozorován rozdíl v počtu makrofágů, lymfocytů nebo eosinofilů mezi dvěma skupinami.

Překvapivě bylo zjištěno, že migrace neutrofilů byla inhibována léčbou sloučeninou 2 (obr. 33). Počet neutrofilů v laváži plic byl stejný pro kontrolní skupinu a pro ovalbuminem senzibilizovaná zvířata léčená sloučeninou 2, zatímco počet neutrofilů se zvýšil u zvířat senzibilizovaných ovalbuminem léčených salinickým roztokem.

Podle znalostí autorů vynálezu, nemá žádný lék tento účinek. Inhibice migrace neutrofilů může mít značný význam v medicíně, protože poškození tkáně způsobené lysozomálními enzymy uvolněnými z neutrofilů se pokládá za značně významné u plicního emfyzému (též indukovaného kouřením), profesionálního asthmatu, zánětlivých onemocnění střevních (jako je morbus Crohn a colitis ulcerosa), revmatoidní artritidy a podobných imunologických onemocnění. Jedná se o velmi překvapivé zjištění.

Závěry

Benzaldehydové deriváty podle předkládaného vynálezu reagují s jistými skupinami na povrchu buněk, například s volnými amino skupinami a vytvářejí Schiffovy báze. Protože mnoho buněčných pochodů, jako je syntéza proteinů, buněčný cyklus, imunitní reakce atd., jsou řízené z povrchu buněk, mění taková vazba chování buněk. Bylo prokázáno, že • · benzaldehydový komplex na povrchu buněk mění adhesní charakteristiky buněk. V pokusech bylo prokázáno, že sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou sloužit jako nová terapie nádorů, autoimunitních onemocnění, virových infekcí a možná také infekcí jinými mikroorganismy.

Bylo zjištěno, že hexosové deriváty benzaldehydů jsou překvapivě účinnější než deriváty jiných karbohydrátů v léčbě nádorů některých orgánů, jako jsou nádory ledvin, jater a plic. Předpokládáme, že tento fenomén souvisí s afinitou receptorů těchto orgánů k sacharidovým skupinám derivátů.

Podání

Farmaceutické kompozice podle vynálezu lze podávat při léčbě nádorů, virových onemocnění a při léčbě chorob vyvolaných abnormálně zvýšenou proliferaci buněk a/nebo pro potlačeni autoimunitních chorob. Uvedené farmaceutické kompozice lze rovněž podávat jako potenciátory imunity.

Pro výše uvedený účel lze sloučeniny obecného vzorce (I) podávat pacientovi v jakékoli vhodné formě, buď samotné nebo ve směsi s farmaceuticky přijatelnými nosiči nebo adjuvantními prostředky.

Zvláště vhodné jsou přípravky pro systémovou terapii buď ve formě přípravků pro orální podání nebo pro parenterální podání.

Vhodné přípravky pro enterální podání zahrnují tablety, tobolky například měkké nebo tvrdé želatinové tobolky, granule, zrněné prášky nebo prášky, sirupy, suspenze, roztoky nebo čípky. Uvedené lékové formy se připraví způsoby známými ···· · · ·· · 9 · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 v oboru smísením jedné nebo více sloučenin obecného vzorce (I) s jedním nebo více netoxických, inertních, tuhých nebo tekutých nosičů.

Vhodné přípravky pro parenterální podání obsahující sloučeniny obecného vzorce (I) zahrnují injekční nebo infúzní roztoky.

Pro topické podání lze sloučeniny obecného vzorce (I) podávat ve formě omývadla, masti, krému, gelu, tinktury, spreje nebo podobného přípravku, kde uvedené přípravky obsahují sloučeniny obecného vzorce (I) ve směsi s netoxickými, inertními, tuhými nebo tekutými nosiči, obvykle používanými pro topické přípravky. Zvláště vhodné je použití přípravku, ve kterém je účinná složka chráněná vůči vzduchu, vodě a podobně.

Uvedené přípravky mohou obsahovat inertní nebo farmakodynamicky aktivní přísady. Tablety nebo granule mohou například obsahovat různá pojivá, plniva, nosiče a/nebo ředidla. Tekuté přípravky mohou například ve formě sterilního roztoku. Tobolky mohou obsahovat kromě aktivní složky také plnivo nebo zahušťovací prostředek. Dále lze použít aditiva pro zlepšení chuti a vůně a rovněž přísady obvykle používané jako konzervační prostředky, stabilizační prostředky, prostředky pro zachycení vlhkosti a emulgátory, sole pro ovlivnění osmotického tlaku, pufry a další aditiva.

Dávky přípravku určené k podání mohou kolísat v závislosti na indikaci, způsobu použití a způsobu podání, a rovněž na požadavcích pacienta. Obvyklá denní dávka pro systémovou terapii průměrného dospělého pacienta je asi 0,01500 mg/kg tělesné hmotnosti, podávaná jednou nebo dvakrát denně, výhodně je asi 0,5-100 mg/kg tělesné hmotnosti, podávaná jednou nebo dvakrát denně, a nejvýhodněji je asi 1-20 mg/kg tělesné hmotnosti, podávaná jednou nebo dvakrát denně.

Je-li to žádoucí, může léčivý přípravek obsahující sloučeninu obecného vzorce (I) obsahovat antioxidační prostředek jako je tokoferol, N-methyl-tokoferamin, butylhydroxyanisol, kyselinu askorbovou nebo butylhydroxytoluen.

Claims

1. Použití derivátu benzaldehydu obecného vzorce (I):

kde L znamená H nebo D;

Ar znamená fenylovou skupinu nebo fenylovou skupinu substituovanou 1-3 substituenty které mohou mít stejný nebo různý význam, a znamenají skupinu zvolenou ze skupiny zahrnující alkyl 1-20 atomech uhlíku, cykloalkyl o 3-6 atomech uhlíku, fluoralkyl o 1-6 atomech uhlíku, alkenyl o 2-6 atomech uhlíku, alkynyl o 2-6 atomech uhlíku, fenyl, halogen, nitro, kyan, NH₂, NHR¹, NÍR¹)^ NHC(O)R¹ nebo N[C(O)R¹]2 kde R¹ má stejný nebo různý význam a znamená alkylovou skupinu o 1-20 atomech uhlíku nebo fluoralkylovou skupinu o 1-6 atomech uhlíku, OR²nebo OC(O)R² kde R² znamená H, D, alkylovou skupinu o 1-20 atomech uhlíku nebo fluoralkylovou skupinu o 1-6 atomech uhlíku, SR², CA(OR^x)2 nebo CA[OC(O)R¹]2 kde A znamená H nebo D, C(O)R², COOR³ kde R³ znamená H nebo alkylovou skupinu o 1-20 atomech uhlíku, nebo fluoralkylovou skupinu o 1-6 atomech uhlíku nebo CON(R³)2, kde R³ má stejný nebo různý význam;

« ♦

Y znamená atom nebo skupinu zvolenou ze skupiny zahrnující H, D, alkyl o 1-20 atomech uhlíku, cykloalkyl o 3-6 atomech uhlíku, fluoralkyl o 1-6 atomech uhlíku, alkenyl o 2-6 atomech uhlíku, alkynyl o 2-6 atomech uhlíku, fluor, chlor, nitro, OR², OC(O)R², SR², NH2, NHR¹, N(R^X)2 kde R¹ má stejný nebo různý význam, NHC(O)R^X nebo N[C(O)R^X]₂ kde R¹ má stejný nebo různý význam.

R znamená skupinu ze skupiny zahrnující H, D, alkyl o ΙΣΟ atomech uhlíku, cykloalkyl o 3-6 atomech uhlíku, fluoralkyl o 1-6 atomech uhlíku, alkenyl o 2-6 atomech uhlíku, alkynyl o 2-6 atomech uhlíku;

s výhradou že vyloučené jsou 4,6-O-benzyliden-Dglukopyranosa, 4,6-0-(benzyliden-di) -D-glukopyranosa,

4,6-benzyliden-D-allosa a deriváty 4,6-benzyliden-D-allosy, nebo jakékoliv jeho stereoisomeru nebo jeho farmaceuticky přijatelné sole pro přípravu léčivého prostředku pro prevenci a/nebo léčbu nádorového onemocnění.

2. Použití sloučeniny podle nároku 1, kde uvedenou sloučeninou je

4.6- O-benzyliden-D-galaktopyranosa, methyl-4,6-0-benzyliden-a-D-mannopyranosid,

4.6- 0-(benzyliden-di) -2-deoxy-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(4-karbomethoxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-benzyliden-2-deoxy-D-glukopyranosa,

2-acetamido-4,6-0-(benzyliden-di) -2-deoxy-D-glukopyranosa, 2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzyliden)-D87

-glukopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di)-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di) -D-mannopyranosa,

2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-a-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-mannopyranosa,

4.6- 0-(2-acetoxybenzyliden)-D-glukopyranosa, a/nebo

4.6- 0-(2, 3-dihydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa, nebo její isomery s L-cukernou složkou, nebo její farmaceuticky přijatelné sole, pro přípravu léčivého prostředku pro prevenci a/nebo léčbu nádorového onemocnění.

3. Použití sloučeniny podle nároku 1, kde uvedenou sloučeninou je 4,6-0-benzyliden-L-glukopyranosa a/nebo 4,6-0-(benzylidendi)-L-glukopyranosa nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, pro přípravu léčivého prostředku pro prevenci a/nebo léčbu nádorového onemocnění.

4. Použití derivátu benzaldehydu obecného vzorce (I) podle nároku 1 s výhradou, že uvedeným derivátem není

4,6-0-(benzyliden-di)-D-glukopyranosa a 4,6-0-benzyliden-L- ···· · ··· ·*·· · · · · ·♦ · • · · · » ··

RP · · * ♦ ····· ⁰⁰ · · « · · ·· ·· ♦··· ··· «·· ·· ·

-glukopyranosa a 4, 6-0-(benzyliden-di)-L-glukopyranosa, nebo jakéhokoliv jeho stereoisomeru nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, pro přípravu léčivého prostředku pro preventivní léčbu nádorových onemocnění vyvolaných viry jako jsou viry hepatitidy B a C, onkogenní papilloma viry a další onkogenní viry.

5. Použití sloučeniny podle nároku 4, kde uvedenou sloučeninou je

4.6- 0-benzyliden-D-galaktopyranosa, methyl-4,6-0-benzyliden-a-D-mannopyranosid,

4.6- 0-(benzyliden-di)-2-deoxy-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(4-karbomethoxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- O-benzyliden-2-deoxy-D-glukopyranosa,

2-acetamido-4,6-0- (benzyliden-di) -2-deoxy-D-glukopyranosa, 2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di)-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di)-D-mannopyranosa,

2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-a-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa, 2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

2-deoxy-4, 6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa, 2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-mannopyranosa,

4.6- 0-(2-acetoxybenzyliden)-D-glukopyranosa, a/nebo • · · ·

4, 6-0-(2,3-dihydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa, nebo její odpovídající isomery s L-cukernou složkou, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, pro přípravu léčivého prostředku pro preventivní léčbu nádorových onemocnění vyvolaných viry jako jsou viry hepatitidy B a C, onkogenní papilloma viry a další onkogenní viry.

6. Použití derivátu benzaldehydu obecného vzorce (I) nebo jakéhokoli jeho stereoisomeru nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, pro přípravu léčivého prostředku pro prevenci a/nebo léčbu infekcí vyvolaných mikroorganizmy jako jsou viry, prvoci, houby a další, cestou alterace imunitního systému.

7. Použití podle nároku 6, kde uvedenou sloučeninou je

4.6- 0-benzyliden-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-dx)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di) -2-deoxy-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(4-karbomethoxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-benzyliden-2-deoxy-D-glukopyranosa,

2-acetamido-4,6-0-(benzyliden-di)-2-deoxy-D-glukopyranosa, 2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di) -D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di) -D-mannopyranosa,

2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-oc-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa, 2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-mannopyranosa,

4.6- 0-(2-acetoxybenzyliden)-D-glukopyranosa, a/nebo

4.6- 0-(2,3-dihydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa, nebo její odpovídající isomery s L-cukernou složkou, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, pro přípravu léčivého prostředku pro prevenci a/nebo léčbu infekcí vyvolaných mikroorganizmy jako jsou viry, prvoci, houby a další, cestou alterace imunitního systému.

8. Použití podle nároku 6 nebo 7, 4,6-0-benzyliden-L-glukopyranosy a/nebo 4,6-0-(benzyliden-di)-L-glukopyranosy nebo její farmaceuticky přijatelné soli, pro přípravu léčivého prostředku pro prevenci a/nebo léčbu infekcí vyvolaných mikroorganizmy jako jsou viry, prvoci, houby a další, cestou alterace imunitního systému.

9. Použití derivátu benzaldehydu obecného vzorce (I) nebo jakéhokoliv jeho stereoisomeru nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli s výhradou, že uvedeným derivátem není

4,6-0-benzyliden-D-glukopyranosa a 4,6-0-(benzyliden-dx) -D-glukopyranosa, pro přípravu léčivého prostředku pro prevenci a/nebo léčbu chorob majících původ v nadměrně zvýšené proliferaci buněk.

10. Použití podle nároku 9, kde uvedená sloučenina je

4.6- 0-benzyliden-D-galaktopyranosa, methyl-4,6-O-benzyliden-a-D-mannopyranosid,

4.6- 0- (benzyliden-di)-2-deoxy-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(4-karbomethoxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-benzyliden-2-deoxy-D-glukopyranosa,

2-acetamido-4, 6-0- (benzyliden-di) -2-deoxy-D-glukopyranosa,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di) -D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di)-D-mannopyranosa,

2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-a-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D~mannopyranosa,

4.6- 0-(2-acetoxybenzyliden)-D-glukopyranosa, a/nebo

4.6- 0-(2,3-dihydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa, nebo její odpovídající isomery s L-cukernou složkou, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, • · • « ♦ · ·♦ ·

9 · * Φ ·ΦΦΦ·

Φ · Φ · ·· *

Φ· · · ·· ··· ♦···· · pro přípravu léčivého prostředku pro prevenci a/nebo léčbu chorob majících původ v nadměrně zvýšené proliferaci buněk.

11. Použití podle nároku 9, 4,6-0-benzyliden-L-glukopyranosy a/nebo 4,6-0-(benzyliden-di)-L-glukopyranosy nebo její farmaceuticky přijatelné soli, pro přípravu léčivého prostředku pro prevenci a/nebo léčbu chorob majících původ v nadměrně zvýšené proliferaci buněk.

12. Použití derivátu benzaldehydů obecného vzorce (I) nebo jakéhokoli jeho stereoisomeru nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, pro přípravu léčivého prostředku pro prevenci a/nebo léčbu autoimunitních chorob jako je revmatoidní artritida, psoriáza, psoriatická artritida, lupus erythematodes, akné, Bechtěrovova artritida, progresivní systémová skleróza (PSS), seborrhoea a další autoimunitní choroby jako je ulcerózní kolitida a Crohnova choroba.

13. Použití podle nároku 12, kde uvedená sloučenina je

4.6- 0- (benzyliden-dj.) -2-deoxy-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(4-karbomethoxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-benzyliden-2-deoxy-D-glukopyranosa,

2-acetamido-4,6-0-(benzyliden-dj) -2-deoxy-D-glukopyranosa, 2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-dx) -D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di) -D-mannopyranosa,

2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-oc-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa, «· ·· φ ···

Φ Φ Φ Φ ΦΦ ♦· Φ ΦΦ • · Φ · · Φ· η ο φ φ φ φ φ · ♦ ·· yj · φ φ φ φ φ· ·· «·φ· ··· Φ···· ·

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa, 2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa, 2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-

-galaktopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-mannopyranosa,

4.6- 0-(2-acetoxybenzyliden)-D-glukopyranosa, a/nebo

4.6- 0-(2,3-dihydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa, nebo její odpovídající isomery s L-cukernou složkou, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, pro přípravu léčivého prostředku pro prevenci a/nebo léčbu autoimunitních chorob jako je revmatoidní artritida, psoriáza, psoriatická artritida, lupus erythematodes, akné, Bechtěrovova artritida, progresivní systémová skleróza (PSS), seborrhoea a další autoimunitní choroby jako je ulcerózní kolitida a Crohnova choroba.

14. Použití podle nároku 12 nebo 13, 4,6-0-benzyliden-L-glukopyranosy a/nebo 4,6-0-(benzyliden-di)-L-glukopyranosy nebo její farmaceuticky přijatelné soli, pro přípravu léčivého prostředku pro prevenci a/nebo léčbu autoimunitních chorob jako je revmatoidní artritida, psoriáza, psoriatická artritida, lupus erythematodes, akné, Bechtěrovova artritida, progresivní systémová skleróza (PSS), seborrhoea a další autoimunitní choroby jako je ulcerózní kolitida a Crohnova choroba.

9 9 • ** ·

99 9© 9© ·

9 9 9 9 • 9*99

9 9 · ·

9*9 ··· ·< 9

15. Derivát benzaldehydu který je vhodný jako léčivý přípravek a kterým je sloučenina ze skupiny zahrnující:

4.6- O-benzyliden-D-galaktopyranosa, methyl-4, 6-0-benzyliden-a-D-mannopyranosid,

4.6- 0-(benzyliden-di)-2-deoxy-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(4-karbomethoxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-benzyliden-2-deoxy-D-glukopyranosa,

2-acetamido-4,6-0- (benzyliden-dj -2-deoxy-D-glukopyranosa,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di) -D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di) -D-mannopyranosa,

2-acetamido-4,6-0-benzyliden-2-deoxy-a-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-mannopyranosa,

4.6- 0-(2-acetoxybenzyliden)-D-glukopyranosa, a/nebo

4.6- 0-(2,3-dihydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa, nebo její odpovídající isomery s L-cukernou složkou, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl,

16. Farmaceutická kompozice vyznačující se tím, že obsahuje benzaldehydový derivát podle kteréhokoli • 9 ·9 · 999

9 9 9 9 99 99 9 99

ΠΕΣ 9 9 9 9 9 99 • 99 ·♦99

99 9999 999 999 999 z předcházejících nároků a farmaceuticky přijatelný nosič, ředidlo a/nebo přísadu.

17. Způsob přípravy farmaceutické kompozice vyznačující se tím, že zahrnuje stupeň ve kterém se spojí derivát benzaldehydu podle kteréhokoli z předcházejících nároků s farmaceuticky přijatelným nosičem, ředidlem a/nebo přísadou.

18. Derivát benzaldehydu kterým je sloučenina ze skupiny zahrnuj ící

4, 6-0-(benzyliden-di) -2-deoxy-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(4-karbomethoxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-benzyliden-2-deoxy-D-glukopyranosa,

2-acetamido-4,6-0-(benzyliden-dx) -2-deoxy-D-glukopyranosa,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(benzyliden-di) -D-galaktopyranosa,

4, 6-0-(benzyliden-di) -D-mannopyranosa,

4.6- 0-(3-nitrobenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa,

2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-D-galaktopyranosa, 2-acetamido-2-deoxy-4,6-0-(2-hydroxybenzyliden)-Dgalaktopyranosa,

4.6- 0-(2-hydroxybenzyliden)-D-mannopyranosa,

4.6- 0-(2-acetoxybenzyliden)-D-glukopyranosa,

4.6- 0-(2,3-dihydroxybenzyliden)-D-glukopyranosa, • · · • · • · • · ·· •· •9 nebo její odpovídající isomery s L-cukernou složkou, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.