CZ20012760A3

CZ20012760A3 - Způsob výroby ethanolu s častou dodávkou kvasnic

Info

Publication number: CZ20012760A3
Application number: CZ20012760A
Authority: CZ
Inventors: Georges Maurice Alard; Philippe Jean Roux; Alain Yves Gérard Mourin; Luc Robert Brasseur
Original assignee: Bio-Ethanol Nord Picardie
Priority date: 1999-02-04
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2002-01-16
Also published as: HU228697B1; EP1151127B1; SK286464B6; DE60020940D1; CA2360773C; DE60020940T2; FR2789400B1; CZ302593B6; CN1344327A; US6569653B1; WO2000046387A1; PL199934B1; ATE298372T1; ES2244405T3; EP1151127A1; AU759404B2; PL350301A1; ZA200106000B; AU2299200A; HUP0105130A2

Description

Způsob výroby ethanolu s častou dodávkou kvasnic

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu výroby ethanolu z moštu získaného ze škrobového rostlinného surového materiálu. Vynález je aplikovatelný zejména na výrobu ethanolu jako paliva, ale rovněž může být využit v chemickém farmaceutickém a kosmetickém průmyslu a po rektifikaci, která má odstranit aromatické látky, jej lze využít v potravinářském průmyslu. Jako výchozí materiál vynález využívá zejména pšeničný, kukuřičný, ječmenný nebo rýžový mošt nebo mošt z čiroku a žita.

Dosavadní stav techniky

Je znám způsob výroby ethanolu, při kterém se škrobový rostlinný materiál enzymaticky zkapalní, čimž se získá zkapalněný mošt. Tento zkapalněný mošt se následně podrobí alespoň částečnému enzymatickému zcukernatění, čímž se získá zcukernatělý mošt. Škrob se alespoň částečně převede na glukózu. Zcukernatělý mošt se následně rozdělí na první a druhou frakci. První frakce zcukernatělého moštu se naředí ředidlem a v prefermentoru uvede do kontaktu s kvasnicemi třídy Saccharomyces, čímž se získá kvasnicová suspenze. Množství ředidla, kterým je zpravidla voda a/nebo vinasa, je množství, které poskytuje kvasnicové suspenzi alkoholový stupeň menší než 6 % obj., přičemž zbytečně

01-2358-01-Ma vysoká koncentrace alkoholu nebrání růstu kvasnic. Tato kvasnicová suspenze se následně uvede ve fermentoru do kontaktu s druhou frakcí zcukernatělého moštu a v tomto kontaktu se nechá po dobu dostatečnou pro získání vína s obsahem ethanolu vyšším než je daná mezní hodnota. V praxi se tato doba prodlužuje v přímé závislosti na výši obsahu ethanolu, jinými slovy, čím vyšší obsah ethanolu se požaduje, tím delší tato kontaktní doba je. Například, pokud doba zcukernatění dosahuje 20 hodin, potom je v případě, že se požaduje obsah ethanolu vyšší než 9 % a současně obsah cukru nižší než 1 g/1, nutné, aby kontaktní doba ve fermentoru neboli fermentační doby dosahovala 40 hodin. Ve snaze zkrátit dobu cukernatění na 10 hodin byly doporučena úprava, která spočívá v tom, že k cukernatění dochází již v průběhu fermentace. Celkový čas zahrnující obě tyto operace tedy trvá 50 hodin. Aby se získal ethanol, tak se provádí destilace vína. Během této destilace se rovněž provádí extrakce „nepříjemných chutí, které odpovídají zejména esterům, a tak se získá ethanol obsahující méně než 500 mg/1 esterů, což je hodnota běžně vyžadovaná při použití ethanolu jako paliva. Do prefermentoru je rovněž nutné kontinuálně dodávat kyselinu a tím udržet určitou hladinu bakteriální asepse a dezinfikovat okruhy dezinfekčního činidla.

Podstata vynálezu

Vynález tyto nedostatky překonává pomocí způsobu výroby ethanolu, který je mnohem kratší než známé způsoby a

01-2358-01-Ma

který po destilaci přímo poskytuje alkohol s obsahem esterů tak malým, že nevyžaduje následnou extrakci, což zase umožňuje eliminovat přidávání kyseliny do prefermentoru a redukovat množství dezinfekčního činidla použitého ve výrobním okruhu, při zachování stejného času a všech ostatních výrobních podmínek, přičemž tento způsob poskytuje víno s vysokým obsahem alkoholu a stejně nízkým obsahem cukru, jako známé způsoby.

Cílem vynálezu je způsob výroby ethanolu, který zahrnuje umístění moštu škrobového rostlinného surového materiálu do kontaktu se zkapalňujícím enzymem za vzniku kapalného moštu, umístění zkapalněného moštu do kontaktu se sacharizačním enzymem za vzniku alespoň částečně zcukernatělého moštu, přípravu suspenze kvasnic třídy Saccharomyces v živném médiu, přičemž tato příprava se provádí v prefermentoru, uvedení zcukernatělého moštu do kontaktu s množstvím kvasnicové suspenze, které je dostatečné pro převedení cukrů obsažených ve zcukernatělém moštu na ethanol a udržení zcukernatělého moštu v kontaktu s kvasnicovou suspenzí po dobu dostatečnou pro toto převedení, získání vína s obsahem cukru menším než 3 g/1, výhodně menším než 2 g/1 a ještě výhodněji menším než 1 g/1 a stupněm alkoholu alespoň 9,5 % obj./obj., a destilaci vína vedoucí k získání ethanolu, přičemž tento způsob je charakteristický tím, že zahrnuje odstranění v podstatě všech kvasnic přítomných v prefermentoru a jejich nahrazení čerstvými kvasnicemi prováděné v určitém časovém intervalu, takže koncentrace mikroorganismů jiných než kvasnic třídy

01-2358-01-Ma

Saccharomyces zůstane v prefermentoru nižší než je daná mezní hodnota.

Konkrétně se zjistila neočekávaná skutečnost, že velmi dlouhá kontaktní doba kvasnicové suspenze se zcukernatělým moštem, která je nezbytná, je dána tím, že v relativně krátkém časovém úseku dojde k degeneraci kvasnic mutací a/nebo kontaminaci kvasnic Saccharomyces, jinými mikroorganismi zejména mnohem méně aktivními kvasnicemi třídy Brettanomyces. Nahrazením všech kvasnic čerstvými kvasnicemi třídy Saccharomyces ještě před tím, než k tomuto jevu dojde a zvláště výhodně před tím, než se jiné mikroorganismy než kvasnice třídu Saccharomyces nashromáždí v prefermentoru v koncentraci 10⁷ buněk/ml a v lepším případě 10⁶ buněk/ml, se aktivita fermentačních kvasnic zachová, což umožní zkrátit kontaktní dobu ve fermentoru, dosáhnout toho, že během destilace nebude přítomen již žádný ester, dosáhnout vyššího stupně alkoholu, eliminovat potřebu přidání kyseliny do prefermentoru a redukovat množství dezinfekčního činidla. Čerstvost kvasnicové suspenze’ je důležitá zejména pokud jde o dobu trvání kroku, při kterém se převádí cukry na ethanol. Dodání čerstvých kvasnic ke kvasnicím, které jsou již kontaminovány, poskytne pouze krátkodobé zlepšení, pokud jde o požadovanou kontaktní dobu. Pro zachování trvalé zkráceného kontaktního času je nezbytné před přidáním čerstvých kvasnic odstranit v podstatě všechny staré kvasnice.

Přítomnost kvasnic třídy Brettanomyces v prefermentoru lze detekovat odebráním vzorku kvasnicové suspenze a jejím

01-2358-01-Ma

	5	• · • ·	·..· -
zkoumáním pomocí	mikroskopu.	Zatímco	kvasnice	třídy
Saccharomyces, a	zejména Saccharomyces	cereisiae,	maj í

vejčitý tvar, kvasnice třídy Brettanomyces mají podlouhlý tvar. Ze zkušeností a prováděných experimentů je pravděpodobně známo, že interval pro přidání čerstvých kvasnic a pro systematické nahrazení vyčerpaných kvasnic kvasnicemi třídy Saccharomyces by měl být kratší než 4 dny.

Podle jednoho výhodného provedení vynálezu se první frakce 10 % až 30 % hmotn. a výhodně 15 % až 20 % hmotn zcukernatělého moštu naředí tak, aby se získal slabý mošt, přičemž zbytek zcukernatělého moštu tvoří silný mošt, přičemž slabý mošt se překvasí v prefermentoru a získá se tak předkvašený mošt, který se společně se silným moštem umístí do fermentoru, kde se ponechá po dobu dostatečnou pro získání vína.

Čerstvé kvasnice se do prefermentoru dodají výhodně v množství, které poskytne koncentraci alespoň 10⁶ buněk/ml a výhodně 10⁷ buněk/ml. Zjistilo se, zejména v případě mezní hodnoty obsahu ethanolu ve víně 9,5 %, že součet doby cukernatění a kontaktní doby ve fermentoru dosahuje pouze 35 hodin.

První stupeň způsobu podle vynálezu tvoří podrobení vystavení škrobového rostlinného materiálu enzymatickému zkapalnění, které poskytne kapalný mošt.

Rostlinný materiál a zejména pšenice se mele jednou nebo 2x například v kladivovém mlýnu (Promili PromillStolz, RN 12 Serville, 28410 BU, 3 min^-1; nebo JACKERING

01-2358-01-Ma

Vorsterhauser Weg 46 PO BOX 1733, 59007 HAMM) v případě, kdy se otruby neoddělí od mouky, a v jednom nebo více válcových mlýnech (které melou homogennějším způsobem (v případech, kdy se otruby oddělí od mouky, nebo v libovolném dalším typu mlýnu). Případně je možné, v případě rafinace škrobu oddělit mouku do dvou šarží: mouka A, která je určená pro rafinaci škrobů, a mouka B, která je určená pro výrobu ethanolu. Pšenici lze před mletím případně zvlhčit (18 % hmotn. až 25 % hmotn.) a tím zlepšit separaci mouky a otrub.

Získaná mouka se přeseje. Zbytky zachycené na sítu se recyklují do mlýnu tak, že nejhrubší zrna nepřesáhnou

2,5 mm. Procento částic větších než 1 mm zpravidla nesmí přesáhnout 10 %. Průměrná velikost částic mouky je 0,3 až 2 mm a běžnou hodnotou je 0,6 mm. Otruby, které se oddělí přesíváním se buď zavedou zpět do mouky nebo se oddělí. Tímto způsobem se získá buď celozrnná mouka nebo bílá mouka.

V případě celozrnné mouky se mouka následně mísí v mixéru s roztokem vody, vinasy, hydroxidu sodného a zkapalňujíčího enzymu. Tento roztok se například připraví za použití in-line statických mixerech nebo v přípravném zásobníku. Směs mouka/roztok lze připravit buď ve šnekovém směšovací (PROMILL Promill-Stolz, RN 12 Serville, 28410 BU, frekvence otáčení: 700 až 1200 min^-1) a/nebo následně v homogenizeru (APB GAULIN, tlak přibližně 10 MPa) nebo v míchaném tanku.

• ·

01-2358-01-Ma

V případě separace glutenu se vinasa pocházející z lihovaru nerecykluje do suspendační operace. Roztok se připraví za použití škrobového mléka pocházejícího z rafinace škrobů a mouky B.

Tímto způsobem se získá mošt z obsahem pevných látek 25 % hmotn. až 35 % hmotn. Procento pevných látek se stanoví na základě optimálního obsahu pevných látek pro funkčnost zkapalňujících a sacharizačních enzymů a s přihlédnutím k ekonomické stránce procesu, kdy pro úsporu nákladů spojených s odpařováním vinasy ve zbývajícím procesu je vhodný co možná nejvyšší obsah pevných látek. Množství mouky dodávané do mixeru je řízeno buď měřícím zařízením od společnosti SCHENCK, Chemin neuf BP 17, 78240 CHAMBOURCY nebo pomocí odvažovacího pásu. Pro dosažení co nejvyššího možného obsahu pevných látek (4,5 % hmotn. až 7 % hnotn.) ve vyčeřené vinase (separace nerozpustné frakce vinasy odstřeďovací dekantací se do suspenzní operace dodává spíše než externí voda co možná nejvíce vinasy. To určuje závislost frakce vinasy na vodě při suspendaci. vyčeřená vinasa představuje 40 % hmotn. až 80 % hmotn. roztoku použitého pro provádění suspendace. Vodou může být studniční voda, provozní tekutina (kondenzáty při odpařování nebo vodné destiláty) nebo říční voda, která se přefiltruje přes pískový filtr a/nebo sterilizuje UV zářením.

Teplota směsi vody/vinasy leží mezi 40 °C, což je teplota nutná pro usnadnění míchání a omezení energetické spotřeby při zkapalňování, a 70 °C, protože při vyšší

01-2358-01-Ma teplotě by mohlo během suspendačního procesu dojit k želatinaci škrobů. Teplota vinasy opouštějící odstřeďující dekantační nádoby (GUINARD CENTRIFUGATION, ZI du Buxerioux, BP 69, 36002 CHáteauroux; WESTFALIA SEPARATOR, 18, avenue de 1'Europe, BP 120, 02407 CHáteau-Thierry) se pohybuje mezi 70 °C a 100 °C podle použitého destilačního způsobu (v případě vakuové destilace je teplota nižší). Mouka má pokojovou teplotu. Pro ohřev vody na teplotu, která odpovídá výše zmíněné teplotě směsi, je možné použít deskový výměník nebo trubkový výměník nebo jakýkoliv další typ tepelného výměníku.

V závislosti na použitém zkapalňovacím enzymu je třeba přidáním 30% nebo 50% roztoku hydroxidu sodného nebo libovolného dalšího zásaditého činidla nastavit pH hodnotu. Pokud to enzym vyžaduje, je možné případně použít vápenatou sůl. Použitými enzymy jsou fungální nebo bakteriální α-amylasy, například Termanyl 120L typ S, typ L nebo typ LS od společnosti NOVO NORDISK Bioindustries S.A., 79, av. Franpois-Arago, 92017 Nanterre Cedex, Francie; SPEZIME ABSORPČNÍ STRUKTURA nebo SPEZIME AAL od společnosti GENENCOR P.O. BOX 642, Delft, Holandsko; NERVANASE nebo G-ZIME G995 od společnosti RHODIA, Poleacre Lané, Woodley, Stockport, Cheshire, SK6 1PQ, Spojené království. Průtok hydroxidu sodného se řídí pomocí pH sondy nainstalované na směsi voda/vinasa před suspendační jednotkou. Hodnota pH se může v závislosti na použitém enzymu pohybovat od 4,5 do 8.

Zkapalnění se provádí při teplotě 50 až 100 °C. Suspendovaný mošt se ohřeje na tuto teplotu buď pomocí

01-2358-01-Ma

přímého vstřikováni páry do zkapalňovacího tanku za použití trubek nebo pomocí tryskového hořáku, kdy se suspendovaný mošt udržuje po několik sekund na teplotě 100 až 150 °C vstřikováním páry do trysky, načež následuje rychlé ochlazení na teplotu 80 až 95 °C. Průtok enzymů lze regulovat průtokem mouky.

Zkapalňovací tanky mohou být míchány například pomocí míchadel typu PMS, BP Ί2 91560 Crosne, která jsou opatřena dvěma řadami lopatek v případě prvního tanku a jednou řadou lopatek v případě druhého tanku a rychlost otáčení lopatek v prvním tanku je 42 min”¹ a v druhém tanku 58 min-1 (rychlost otáčení se může pohybovat od 20 min”¹ do 60 min'¹) . Doba setrvání za těchto tepelných podmínek je 30 min až 2 hodiny.

Současné charakteristiky zkapalňovacího procesu v závislosti na použitém enzymu jsou:

teplota: 85 °C až 88 °C pH hodnota: 5,5 až 6 obsah pevných látek: 32 % až 35 % rezidenční doba: 1 h průtok zkapalňovacího enzymu: přibližně 3,5 1/h při průtoku mouky 8 t/h.

Takto zkapalněný mošt se ochladí v tepelných výměnících běžného typu (deskových výměnících nebo trubkových výměnících) na °C (teplota závisí na optimálních pracovních podmínkách sacharizačních enzymů a pokud je to možné, potom se pohybuje v rozmezí od 40 °C do • · * · • »

01-2358-01-Ma

°C). V určitých případech lze zkapalněný mošt již popsaným způsobem naředit ředidlem, jakým je například voda nebo recyklovaná vinasa pocházející z lihovaru.

Zkapalněný mošt se uvede do kontaktu s enzymem amyloglukosidasového typu (například Optimax 7525 HP, Optidex L300 od společnosti GENENCOR International, BOX 642, 2600 AP Delft, Holandsko; Amg 300 L od společnosti Novo Nordisk Bioindustries S.A., 79, av. Frangois-Arago, 92017 Nanterre Cedex, Francie; G-990 nebo Ambazyme LE300 od společnosti RHODIA, Poleacre Lané, Woodley, Stockport, Cheshire, SK6 1PQ, Spojené království) a enzymem redukujícím viskozitu (například Econase CE od společnosti Alko Biotechnology, SF-05200 Rajamaki, Finsko, Celluclast od společnosti Novo Nordisk Bioindustries S.A., 79, av. Frangois-Arago, 92017 Nanterre Cedex, Francie; β-Glucanase 750 L od společnosti RHODIA, Poleacre Lané, Woodley, Stockport, Cheshire, SK6 1PQ, Spojené království).

V závislosti na použití sacharizačnich enzymů je třeba pomocí 96% roztoku kyseliny sírové nebo libovolného dalšího okyselujícího činidla nastavit pH hodnotu. Průtok kyseliny se reguluje pomocí pH sondy nainstalované na vstupu do sacharizační zóny. Hodnota pH se může pohybovat od 3 do 7 v závislosti na optimálních charakteristikách použitých enzymů.

V závislosti na typu substrátu lze pro proteinů přítomných ve zkapalněném moštu, degradaci který je potencionálním zdrojem dusíku pro fermentační organismy,

01-2358-01-Ma

nebo pro ukončeni enzymatické hydrolýzy škrobů použit enzymy s proteasovou aktivitou (například Proteinase 200L od společnosti RHODIA, Poleacre Lané, Woodley, Stockport, Cheshire, SK6 1PQ, Spojené království) a/nebo Pullulanasu (například Ambazime P20 od společnosti RHODIA, Poleacre Lané, Woodley, Stockport, Cheshire, SK6 1PQ, Spojené království nebo Optimax L300 od společnosti GENENCOR, P.O. BOX 642, Delft, Holandsko) (Pullulanasy mají specifický účinek na vazbě a 1-6).

Průtok enzymů lze regulovat průtokem mouky a lze ho rovněž regulovat na základě laboratorních analýz týkajících se koncentrace vyprodukované glukosy a obsahu zbývajícího škrobu; přičemž cílem této operace je dospět na konec cukernatění nebo fermentace za absence zbytkového škrobu ve víně vstupujícím do lihovaru. Tyto průtoky se tedy řídí jako funkce enzymatické aktivity specifické pro každý typ enzymu.

Současnými charakteristikami závislými na enzymu použitými pro sacharizační proces jsou:

teplota: 55 °C až 65 °C hodnota pH: 4 až 4,5 obsah pevných látek: 28 % až 35 % rezidenční doba: 15 h až 20 h (příklad 1A) ; nebo 8 h až 13 h (příklad 1B) průtok sacharizačního enzymu: přibližně 4,5 1/h při průtoku mouky 8 t/h

01-2358-01-Ma • · průtok enzymu redukujícího viskozitu: přibližně

1,5 1/h při průtoku mouky 8 t/h

Při sacharizaci se používá pět 90m³ tanků (funkce příkladů 1A a 1B).

Všech pět sacharizačních tanků je opatřeno mechanickým mícháním (míchadla SEW-USOCONE nebo PMS, BP 72 91560

Crosne, frekvence otáčení 24 min^-1. Toto míchání umožňuje dobrou homogenizaci moštu během cukernatění a tedy snazší kontakt mezi enzymy a hydrolyzovaným škrobem.

Zcukernatělý mošt se ochladí na 32 °C (teplota mezi 30 a 34 °C je teplota, při které nedochází k inhibici růstu a fermentace použitých kvasnic) v běžných tepelných výměnících a potom se zavede do následujícího zpracovatelského zařízení.

Způsob podle vynálezu má dvě varianty. Odlišnost těchto variant spočívá v celkové nebo částečné biologické konverzi makromolekulárního škrobu na fermentovatelné molekuly glukózy. V druhém případě (pouze částečná hydrolýza) se cukernatění provádí v průběhu fermentačního kroku a rezidenční doba v sacharizační zóně je mnohem kratší než v prvním nejmenovaném případě (v podstatě celková hydrolýza).

Předkvašení

01-2358-01-Ma

Předkvašení neboli propagaci kvasnic (Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe atd.) lze výhodně provádět ve čtyřech paralelních prefermentorech ve snaze získat koncentraci těchto kvasnic alespoň 10⁷ buněk/ml (objem každého prefermentoru je 45 m³) .

Zcukernatělý mošt se naředí vodou nebo vinasou za vzniku slabého moštu (průtok vody 7 až 8 m³/h při průtoku zcukernatělého moštu 4 až 5 m³/h, takže se získá koncentrace glukózy ve slabém moštu 50 g/1 až 90 g/1) , který se rozdělí mezi 4 prefermentory a slouží jako růstový substrát pro mikroorganismy.

Použitou vodou může být studniční voda, provozní kapalina (kondenzáty po odpařování, vodné destiláty nebo voda pocházející rafinérek škrobu) nebo říční voda přefiltrovaná přes písečný filtr a/nebo říční voda sterilizovaná UV zářením. Teplota v prefermentorech se trvale monitoruje a reguluje pomocí systému chladících desek, ve kterých cirkuluje chladící kapalina a které jsou umístěny uvnitř prefermentačních tanků nebo vně těchto tanků.

Jakékoliv množení mikroorganismů vede ke zvýšení teploty. Veškeré změny teploty mohou inhibovat propagaci kvasnic.

Teplota v prefermentorech se udržuje v rozmezí od 30 do 35 °C.

Aby byl podpořen růst kvasnic je třeba použít živné médium pro množení těchto mikroorganismů, které obsahuje:

• · * ·

01-2358-01-Ma

- dusík dodávaný v různých formách, například ve formě močoviny, amoniaku nebo amonných solí, fosfor dodávaný v různých formách, například ve formě kyseliny fosforečné nebo fosfátu,

- síra dodávaná v různých formách, například ve formě kyseliny sírové nebo sulfátů,

- kyslík,

- fermentovatelné cukry,
esenciální nedostatek.	minerály,	pokud je	detekován jejich
Tyto	nutriční	prvky	brání jakémukoliv	zpomalení
propagace	kvasnic.
Tyto	nutriční	prvky a	kyslík ve	formě	stlačeného

vzduchu (nebo vodného roztoku peroxidu vodíku) jsou dodávány trvale ve snaze podpořit růst kvasnic a nikoliv alkoholové kvašení.

Takže například:

- průtok vzduchu v každém prefermentoru je přibližně 30 Nm³/h; a

- Do všech prefermentorů se každou hodinu přidává ve formě vodného roztoku 5 kg síranu amonného s minimálním obsahem dusíku 21 % a maximálním obsahem vody 0,2 % (HOLOVET Chemie Chaussée de Leuze 144, Leuzesesteenweg Belgie; INTERFERT, 28 rue d'Armenonville, 92200 Neuilly sur Seine, etc.) a 5 kg hydrogenfosforečnanu amonného s minimální čistotou 95 % a obsahu oxidu fosforečného 52 % až 55 % (RHODIA

01-2358-01-Ma

Chimie, 299, rue du Président Pomdidou, BP 202, 59561

La Medeleine Cedex; PRAYON France, 80-80 rue de Paris, 93804 Epinay sur Seine Cedex)

Aby se zabránilo jakémukoliv vzniku infekce cizími mikroorganismy, jsou prefermentory, do který je volně přístupný vzduch, čištěny a dezinfikovány nejprve přefiltrovanou říční vodou a následně minimálně 10 minutovým vstřikováním páry.

To rovněž umožňuje vyloučit infikaci kvasnicemi „divokého typu a postupnou degeneraci převládajícího kvasnicového kmene.

Provedla se identifikace na místě detekovaných kontaminačních mikroorganismů, a zjistilo se, že se jedná o mikroorganismus Brettanomyces bruxellensis.

Tyto kontaminační kvasnice mají charakteristický protáhlý tvar, který je velmi odlišný od morfologie použitých kvasnic Saccharomyces cerevisiae.

Denní mikroskopické pozorování (univerzální mikroskop ZEISS, 400x zvětšení) kvasících moštů prováděné ve výrobním závodě umožňuje okamžitou detekci výskytu těchto kvasnic typu Bretanomyces. Sečteni a morfologické rozlišeni na Petriho miskách poskytlo dodatečné potvrzení mikroskopických pozorování.

Médium použité pro odečet v Petriho miskách je známé jako médium MALT WICKERHAM a ve 2 1 přípravku je obsaženo:

01-2358-01-Ma

- 3 g sladového extraktu (reference: Laboratoire Měrek 105391)

- 5 g peptonu (reference: Laboratoire Měrek 7212)

- 3 g kvasnicového extraktu (reference: Laboratoire Měrek 103753)

- 10 g glukózy

- 10 g živného agaru (reference: Laboratoire Měrek

1614).

Vzorek z kvašeného moštu se podrobil sériovému lOnásobnému naředěni fyziologickým solným roztokem (10/1000 NaCl roztoku),

10~⁵; ΙΟ⁶; 10'⁷. 1 ml čímž se získala následující ředění:

Těchto ředění se pomocí běžných mikrobiologických metod hloubkově naočkoval médiem MALT

WICKERHAM.

Přerušení frekvence dodávání požadovaného kmene do fermentačního procesu následně vedlo k vážné kontaminaci nežádoucím mikroorganismem, která způsobila prodloužení fermentačních časů a zhoršení kvality vyprodukovaných lihových roztoků (například: zvýšení obsahu esterů). Tento jev byl pozorován bez ohledu k použité variantě způsobu podle vynálezu.

Prodlevu v nutné frekvenci dodávání požadovaného kmene kvasnic a v náhradě starých kvasnic dále způsobuje, že je nutné urychlit další dodávky kvasnic, které by zcela eliminovaly trvalou kontaminaci způsobenou recyklací čiré

01-2358-01-Ma • · ·· • · · ·· • · ·· • · ·O« vinasy obsahující kontaminované organismy do suspenzní operace.

Způsob náhrady starých kvasnic čerstvými kvasnicemi

Během propagace čerstvých kvasnic se například zvolí 1 za 4 prefermentorů k provádění tohoto procesu.

Po vyprázdnění prefermentoru se prefermentor vypláchne vodou a následně čistí parou (například absolutní tlak 0,3 MPa, teplota 130 °C) po minimální předem nastavený čas, kterým je 10 min.

K čištění lze rovněž použít vodný roztok formaldehydu (30,5% roztok formaldehydu: Caldic France B.P. 722 51056 REIMS) nebo libovolný běžný dezinfekční prostředek například:

skupinu halogenových sloučenin: chlor nebo jod a jejich deriváty;

oxidační činidla (peroxid vodíku, manganistan draselný);

aminové sloučeniny (Bactanios 95 použitý jako 0,2% až 0,5% roztok, Anios Pavé du Moulin 59260 Lilie Hellemmes);

silné kyseliny a báze (koncentrovaná 96% kyselina sírová použitá při 5% až 10% ředění, Tessenderlo Chemie, rue du Trone 130 B Brussels), (koncentrovaný 30,5% louh sodný použitý za současné aplikace tepla při 1% až 2% naředění CLEMENT RPC Ets LOMME, rue Pelouze, BP 117 89461 LOMME cedex), (Agrobac použitý při 2 až 7,5% ředění: MINOT

01-2358-01-Ma

APURA, 88 rue de Marquillies 59044 LILLE cedex), (Agromousse použitý při 5% až 7% ředění: MINOT APURA, 88 rue de Marquillies 59044 LILLE cedex), (Aniosteril dezinfekční kyselina použitá při dávkách 1 % až 1,5 % Anios Pavé du Moulin 59260 Lilie Hellemmes), GALOR C7 použitý v dávkách 1 % až 5 %, Anios Pavé du Moulin 59260 Lilie Hellemmes);

aldehydy a povrchově aktivní činidla (Anios W4 použitý při 0,5% naředění ve formě postřiku, kontaktní doba 5 až 10 min, nebo při cirkulaci jako 0,4% roztok, kontaktní doba 20 až 30 min, Anios Pavé du Moulin 59260 Lilie Hellemmes).

Výše uvedenými procenty se rozumí hmotnostní procenta.

Čištění/dezinfekci lze provádět v 5 stupních:

- předmytí nebo předčištění: mechanické odstranění hrubého znečištění proudem vody, čištění: odstranění zbytků zašpinění čistícím roztokem,

- oplach: odstranění čistícího roztoku s nečistotami dispergovanými v tomto roztoku, dezinfekce: chemická destrukce povrchové biokontaminace za použití dezinfekčního roztoku,

-konečný oplach: odstranění zbytkového dezinfekčního roztoku.

Ve snaze dostatečně dezinfikovat prefermentor určený pro příjem čerstvých kvasnic, který nebude v žádném případě kontaminován starými kvasnicemi, lze výše popsané operace kombinovat.

* ·

01-2358-01-Ma

Prefermentor se do jedné své třetiny naplní slabým moštem, který je o něco více naředěn než normální slabý mošt. Teplota v prefermentoru se nepřetržitě reguluje (udržuje na teplotě nižší než 34 °C).

Do prefermentoru se přidá 300 kg čerstvých kvasnic s obsahem pevných látek přibližně 32 %. Do fermentoru se dodává dávka výživných solí a vzduch a tato dodávka se reguluj e.

Zavádění slabého moštu pokračuje za současného monitorování hustoty a teploty v prefermentoru. Po naplnění se prefermentor postupně propojí s dalšími vyprázdněnými, vyčištěnými a párou nebo chemicky sterilizovanými prefermentory, takže nedojde ke kontaminaci čerstvých kvasnic starými kvasnicemi. Všechny 4 prefermentory se takto postupně naplní čerstvými kvasnicemi.

Kvašení

Alkoholové kvašení lze provádět za použití zcukernatělého moštu získaného cukernatěním, při průtoku 14 m³/h až 22 m³/h, dokud neklesne obsah cukrů v získaném vínu pod 3 g/1 výhodně pod 2 g/1 a ještě pod 1 g/1 a stupeň alkoholu ve víně dosáhne alespoň 9,5 % % obj. Kvašení lze provádět dvěma způsoby: „vsázkovou neboli diskontinuální fermentací, při které pracuje každý fermentor individuálně, tj . v každém fermentoru se provádí fermentaci a kontinuální fermentací, při které pracují jednotlivé fermentory kaskádovitým způsobem, tj. v každém fermentoru probíhá pouze částečná fermentace a k dokončení této fermentace dojde až v posledním fermentoru.

01-2358-01-Ma „Vsázková neboli diskontinuální fermentace

Každý fermentor je střídavě naočkován zkvašeným moštem získaným z prefermentorů.

Prefermentovaný mošt se dopravuje následujícím způsobem:

- jeden prefermentor (objem 45 m³) se zcela vyprázdní do fermentoru;

ostatní tři prefermentory se částečně paralelně přemístí tak, aby ve fermentorech vytvořily „zásobu kvasnic.

Celkový zkvašeného obj em moštu fermentoru.

rozmezí 30 odpovídáj ícím odpovídá přibližně Teplota ve fermentorech se až 35 °C.

způsobem přeneseného až 70 % obj.

udržuje v teplotním

Fermentace využívá dva 90m³ tanky a šest 180m³ tanky.

Zkvašený mošt se následně před zavedením do destilačního zařízení přemístí do vinných sudů.

Kontinuální fermentace

01-2358-01-Ma

Fermentory se již alternativně neplní zkvašeným moštem a zcukernatělým moštem, jak to bylo popsáno výše, ale spíše podle následujícího postupu:

Zkvašený mošt a zcukernatělý mošt se do fermentoru nebo prvních dvou nebo tří fermentoru označovaných jako přední fermentory dodávají kontinuálně, přičemž následující fermentory jsou označovány jako spádové fermentory.

Průtok moštů zaváděných do předních fermentoru může být následující:

zkvašený mošt: 9 až 16 m³/h zcukernatělý mošt: 15 až 25 m³/h teplota ve fermentorech se udržuje v teplotním rozmezí 30 až 35 °C.

Kaskádová fermentace v jednotlivých fermentorech pokračuje, dokud obsah cukru v získaném víně neklesne pod 3 g/1, výhodně pod 2 g/1 a ještě lépe pod 1 g/1 při stupni alkoholu v uvedeném vínu alespoň 9,5 % % obj., přičemž zkvašený mošt z posledního fermentoru se následně kontinuálně přepraví do vinných sudů, kde je skladován až do okamžiku přepravy do lihovaru.

U tohoto typu kontinuální fermentace se doba fermentace vypočte vydělením plnícího objemu moštů fermentujících ve všech fermentorech průtokem vína v kolonách lihovaru. Při kontinuální fermentaci je zapotřebí stejný čas jako při vsázkové fermentaci.

01-2358-01-Ma

Stupeň alkoholu ve víně se určí enzymaticky za použiti biochemického analyzéru YSI 2700 SELECT (ROUCAIRE, 2 av. du Pacifique BP 78 Les Ulis 91493 Courtaboeuf cedex). Vzorek vína se 50x naředi demineralizovanou vodou. Tento vzorek se filtruje a následně zavede do biochemického analyzéru YSI 2700 SELECT, který automaticky stanový obsah ethanolu v g/1. Pro získáni výsledků ve stupních alkoholu % obj./obj. postačí vydělit tuto hodnotu 7,88, potom co byl vzat v úvahu faktor na ředění.

Obsah zbývající glukózy se stanový enzymaticky za použití biochemického analyzéru YSI 2300 STÁT PLUS (ROUCAIRE, 2 av. du Pacifique BP 78 Les Ulis 91493 Courtaboeuf cedex). Po odhadu obsahu zbývající glukózy se provedou nezbytná naředění vzorku. Vzorek se přefiltruje a následně zavede do biochemického analyzéru YSI 2300 STÁT PLUS, který poskytne požadovanou hodnotu t j . obsah zbývající glukózy vyjádřenou v mg/dl. Pro získání této hodnoty v jednotce g/1 stačí získaný výsledek vynásobit stem, potom co byl vzat v úvahu možný faktor naředění.

Výroba lihového roztoku (surový alkohol)

Destilační kolona (kolony) (dodavatelé: KREBSSPEICHIM, 14 rue Hoche, 92800 PUTEAUX, JAAKKO-PÓYRY, Garden Part-Dieu, 65 Bd Vivier Merle 69482 LYIONS CEDEX 03), které mohou pracovat paralelně nebo v sérii (dvojnásobný účinek) za vakua nebo pod tlakem, se ohřívají pomocí páry vznikající například při zahušťování vinasy (lihovarnické

01-2358-01-Ma

koprodukty) ve snaze zlepšit tepelnou účinnost jednotky, přímým vstřikováním, pomocí destilačních zařízení nebo termální komprese. Tyto páry rovněž ohřívají Lutterovy kolony.

Zkvašený mošt nebo víno získané kvašením se po průchodu tepelným výměníkem zavádí paralelně do destilačních kolon. Alkoholové výpary z kolon kondenzují v tepelných výměnících. Vinasa, která zůstává na dně kolon, se dopravuje do separačního zařízení, kde se vyčeří (dojde k oddělení rozpustných látek od nerozpustných látek) a následně se zavede do zařízení pro zahušťování vinasy.

Alkohol neboli lihový roztok se zahustí v destilační koloně (kolonách) na 90 % obj . až 96 % obj . (v závislosti na investiční omezeních) a následně se před skladováním ochladí ve výměníku. Extrakce těkavých příměsí se rovněž provádí v destilačních kolonách, přičemž cílem této extrakce je zlepšit kvalitu lihových roztoků (podle požadovaného obsahu esterů). Tyto nepříjemné extrahované příměsi, jejichž kvalita se zvyšuje pouze obtížně se skladují v odděleném zásobníku.

Snahou následujících příkladů je podrobněji ilustrovat vynález.

01-2358-01-Ma

Příklady provedení vynálezu

Příklad IA: Sacharizační doba = 15 až 20 hodin (test s pšenicí)

Všechny sacharizační tanky se naplní, čímž se v podstatě všechny škrobové molekuly enzymaticky hydrolyzují na fermentovatelné cukry. Výkon zařízení je přibližně 24 m³/h zcukernatělého moštu.

Nej starší kvasnice se nahrazují při frekvenci kratší než 4 dny 300 kg čerstvých kvasnic (například Saccharomyces cerevisiae) slisovaných na obsah pevných látek 32 %; přičemž každý gram produktu obsahuje přibližně lOxlO⁹živých buněk, v případě slabého moštu s koncentrací glukózy 50 g/1 až 90 g/1, v závislosti na výkonu zařízení (průtok slabého moštu 12 až 13 m³/h). Stejné výsledky poskytuje i použití kvasnic sušených vymrazováním nebo komerčních zahuštěných kvasnicových krémů (Saccharomyces cerevisiae nebo pombe) (dodavatelé kvasnic: LALLEMAND S.A., Complexe scientifique Rangeuil, Halí Gelbert Durand 3, BP 4412, 31405 Toulouse Cedex 4; LESAFFRE, 41, rue Etienne Marcin, 75001 Paris, atd.).

Ukázalo se, že pro přípravu vína se stupněm alkoholu větším než minimálně 9,5 % obj. a koncentrací zbytkového cukru menší než 1 h/1 postačuje fermentační doba 18 až 24 h (průměrně 20 h) na rozdíl od fermentační doby dosahující 35 až 45 h, která je běžná za obecně používaných průmyslových

01-2358-01-Ma podmínek a při které může v řídkých případech docházet k tomu, že koncentrace zbývajícího cukru dosahuje 20 až 30 g/1 (běžné fermentační časy na škrobových substrátech doporučované výrobci nebo uváděné v literatuře dosahují až 40 až 60 h). Fermentační doba se vypočte následujícím způsobem. Čas pro naplnění fermentoru zcukernatělým moštem se přičte k době potřebné pro získání moštu s obsahem reziduální glukózy 0 g/1 v dané oblasti, což je doba strávená dopravou vína k destilaci, pokud nelze snížit obsah reziduální glukózy v dané oblasti na 0 g/1.

Obsah esteru v surovém alkoholu (lihové roztoky získané jednoduchou destilací) je nižší než 300 ml/1 i bez extrakce těkavých příměsí (tj. více než 50% snížení obsahu esterů v porovnání s běžně používanými způsoby.

Příklad IB: Sacharizační doba = přibližně 8 až 13 hodin (test s pšenicí)

Některé sacharizační tanky se vynechají, čímž se dosáhne pouze omezené enzymatické hydrolýzy škrobových molekul na fermentovatelné cukry. Výkon zařízení je přibližně 24 m³/h zcukernatělého moštu.

Staré kvasnice se nahradí ve stejné frekvenci jako v předcházejícím příkladu stejným množstvím kvasnic (například Saccharomyces cerevisiae) slisovaných na obsah pevných látek 32 %.

01-2358-01-Ma

Ukázalo se, že pro přípravu vína se stupněm alkoholu větším než minimálně 9,5 % obj . a koncentrací zbytkového cukru (menší než 1 h/1) postačuje fermentační doba 22 až 30 h (průměrně 25 h) na rozdíl od fermentační doby dosahující 35 až 45 h, která je běžná za obecně používaných průmyslových podmínek a při které může v řídkých případech docházet k tomu, že koncentrace zbývajícího cukru dosahuje 20 až 30 g/1 (běžné fermentační časy na škrobových substrátech doporučované výrobci nebo uváděné v literatuře dosahují až 40 až 60 h). Fermentační doba se vypočte následujícím způsobem. Čas pro naplnění fermentoru zcukernatělým moštem se přičte k době potřebné pro získání moštu s obsahem reziduální glukózy 0 g/1 v dané oblasti, což je doba strávená dopravou vína k destilaci, pokud nelze snížit obsah reziduální glukózy v dané oblasti na 0 g/1.

Obsah esteru v surovém alkoholu (lihové roztoky získané jednoduchou destilací) je nižší než 300 ml/1 i bez extrakce těkavých příměsí (tj. více než 50% snížení obsahu esterů v porovnání s běžně používanými způsoby).

Přiklad 2A: Test s kukuřicí

Kukuřice (škrob = 61 až 78 %, proteiny = 6 až 12 %), použitá jako škrobový substrát, se podrobila průmyslovému procesu popsanému v příkladu 1A. Výkon zařízení je přibližně 20 až 24 m³/h zcukernatělého moštu.

01-2358-01-Ma • · · ·

Kvasnice (například Saccharomyces cerevisiae) slisované na obsah pevných látek 32 % se nahrazovaly se stejnou frekvencí a ve stejném množství. Víno se stupněm alkoholu větším než minimálně 9,5 % obj. a koncentrací zbývajícího cukru nižší než 1 g/1 se získaly po době kvašení 18 až 24 hodin.

Příklad 2B: Test s ječmenem

Ječmen (škrob = 65 až 75 %, proteiny = 8 až 15 %), použity jako škrobový substrát, se podrobil průmyslovému procesu popsanému v příkladu 1A. Výkon zařízení je přibližně 20 až 24 m³/h zcukernatělého moštu.

Kvasnice (například Saccharomyces cerevisiae) slisované na obsah pevných látek 32 % se nahrazovaly se stejnou frekvencí a ve stejném množství. Víno se stupněm alkoholu větším než minimálně 9,5 % obj. a koncentrací zbývajícího cukru, nižší než 1 g/1 se získaly po době kvašení 18 až 24 hodin.

Obsah esteru v surovém alkoholu (lihové roztoky získané jednoduchou destilací) je nižší než 300 ml/1 i bez • ·

01-2358-01-Ma

extrakce těkavých příměsí (tj. více než 50% snížení obsahu esterů v porovnání s běžně používanými způsoby).

Kontrolní příklad: Test částečné reinokulace čerstvými kvasnicemi

Provedly se testy s částečnou reinokulací prefermentorů čerstvými kvasnicemi Saccharomyces cerevisiae.

Všechny sacharizační tanky se naplnily ve snaze dosáhnout co možná nejkompletnější enzymatické hydrolýzy škrobových molekul na fermentovatelné cukry (podobně jako v příkladu 1A) . Výkon zařízení je přibližně 24 m³/h zcukernatělého moštu.

200 kg Kvasnic (Saccharomyces cerevisiae) slisovaných na obsah pevných látek 32 % se dodává ve frekvenci kratší než 4 dny do slabého moštu s obsahem glukózy 50 až 90 g/1 v závislosti na výkonu zařízení (průtok slabého moštu = 12 až 13 m³/h). Do vymytého a vyčištěného prefermentorů se již další kvasnice nepřidávaly jako v příkladu 1, ale namísto toho se mezi čtyři prefermentory, ve kterých zůstaly staré kontaminované kvasnice (přibližně 25 m³ moštu v každém prefermentorů), rovnoměrně rozdělilo 200 kg (50 kg do každého prefermentorů).

V tomto případě nebylo dosaženo výsledků popsaných v souvislosti s příkladem IA a nedošlo ani ke zkrácení

01-2358-01-Ma

fermentační doby, ani zlepšeni kvality destilovaných lihových roztoků. Fermentační doba 35 až 45 hodin zůstala zachována s tím, že obsah zbytkového cukru může v některých řídkých případech dosahovat 20 až 30 g/1 a obsah esteru bez extrakce těkavých příměsí je vyšší než 300 mg/1.

Claims

1. Způsob výroby ethanolu, který zahrnuje umístěni moštu škrobového rostlinného surového materiálu do kontaktu se zkapalňujícím enzymem za vzniku kapalného moštu, umístění zkapalněného moštu do kontaktu se sacharizačním enzymem za vzniku alespoň částečně zcukernatělého moštu, přípravu suspenze kvasnic třídy Saccharomyces v živném médiu, přičemž tato příprava se provádí v prefermentoru, uvedením zcukernatělého moštu do kontaktu s množstvím kvasnicové suspenze, které je dostatečné pro převedení cukrů obsažených ve zcukernatělém moštu na ethanol a udržení zcukernatělého moštu v kontaktu s kvasnicovou suspenzí po dobu dostatečnou pro toto převedení, získání vína s obsahem cukru menším než 3 g/1, výhodně menším než

2 g/1 a ještě výhodněji menším než

1 g/1 a stupněm alkoholu alespoň

9,5

O. o destilaci vína za vzniku ethanolu, v nač m, že zahrnuje odstranění podstatě všech kvasnic přítomných v prefermentoru, čištění a dezinfekci prefermentoru a nahrazeni kvasnic v prefermentoru čerstvými kvasnicemi prováděné v určitém časovém intervalu, takže koncentrace mikroorganismů jiných než kvasnic třídy Saccharomyces zůstane v prefermentoru nižší než je daná mezní hodnota.

2. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že mezní hodnotou koncentrace mikroorganismů jiných než

01-2358-01-Ma kvasnice třídy Saccharomyces je hodnota nižší než 10⁷ buněk/ml.

3. Způsob podle nároku 1 vyznačený tím, že mezní hodnotou koncentrace mikroorganismů jiných než kvasnice třídy Saccharomyces je hodnota nižší než 10⁶ buněk/ml.

4. Způsob podle některého z nároků 1 až 3 vyznačený tím, že se nahrazení všech kvasnic v prefermentoru čerstvými kvasnicemi provede jakmile se v mikroskopu zpozoruje mikroorganismus podlouhlého typu.

5. Způsob podle některého z nároků 1 až 3 vyznačený tím, že se nahrazení všech kvasnic v prefermentoru čerstvými kvasnicemi provádí v časovém intervalu kratším než 4 dny.

6. Způsob podle z předcházejících nároků vy z n ač e n ý tím, že zahrnuje nahrazení všech kvasnic v prefermentoru čerstvými kvasnicemi v množství, které poskytne prefermentoru koncentraci alespoň 10⁶ buněk/ml a výhodně 10⁷ buněk/ml.

01-2358-01-Ma

7. Způsob podle některého z předcházejících nároků vyznačený tím, že zahrnuje naředění první části 10 % hmotn až 30 % hmotn. a výhodně 15 % hmotn. až 20 % hmotn. zcukernatělého moštu ve snaze získat slabý mošt, přičemž zbytek zcukernatělého moštu tvoří silný mošt, předkvašení slabého moštu v prefermentoru a získání předkvašeného moštu a umístění silného moštu do přítomnosti předkvašeného moštu ve fermentoru na dobu, která je dostatečná pro získání vína.

8. způsob podle některého z předcházejících nároků vyznačený tím, že zahrnuje umístění zcukernatělého moštu do kontaktu s kvasnicovou suspenzí při teplotě 30 až 35 °C.

9. Způsob podle některého z předcházejících nároků vyznačený tím, že rostlinným materiálem je pšenice.

10. Způsob podle některého z nároků 1 až 8 vyznačený tím, že rostlinným materiálem je kukuřice, ječmen, rýže, žito nebo čirok.