CZ20004790A3 - Způsob určování antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologické tekutině - Google Patents
Způsob určování antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologické tekutině Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20004790A3 CZ20004790A3 CZ20004790A CZ20004790A CZ20004790A3 CZ 20004790 A3 CZ20004790 A3 CZ 20004790A3 CZ 20004790 A CZ20004790 A CZ 20004790A CZ 20004790 A CZ20004790 A CZ 20004790A CZ 20004790 A3 CZ20004790 A3 CZ 20004790A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- beta
- antibiotic
- antibiotics
- ppb
- receptor
- Prior art date
Links
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 title claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 title claims description 30
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 67
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims abstract description 46
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 28
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims abstract description 24
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 claims abstract description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 72
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 26
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 19
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 15
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 13
- -1 peroxydase Proteins 0.000 claims description 9
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 7
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 7
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 5
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 5
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical compound [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052711 selenium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011669 selenium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 2
- 229910052714 tellurium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N tellurium atom Chemical compound [Te] PORWMNRCUJJQNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims 1
- 108020004256 Beta-lactamase Proteins 0.000 claims 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims 1
- 125000003460 beta-lactamyl group Chemical group 0.000 abstract 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 58
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 55
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 55
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 55
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 41
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 33
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 18
- 229960005229 ceftiofur Drugs 0.000 description 17
- ZBHXIWJRIFEVQY-IHMPYVIRSA-N ceftiofur Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C(O)=O)=O)NC(=O)\C(=N/OC)C=2N=C(N)SC=2)CC=1CSC(=O)C1=CC=CO1 ZBHXIWJRIFEVQY-IHMPYVIRSA-N 0.000 description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N cloxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1Cl LQOLIRLGBULYKD-JKIFEVAISA-N 0.000 description 16
- 229960003326 cloxacillin Drugs 0.000 description 16
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 16
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 16
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 15
- UQLLWWBDSUHNEB-CZUORRHYSA-N Cefaprin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CSC1=CC=NC=C1 UQLLWWBDSUHNEB-CZUORRHYSA-N 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 229960004350 cefapirin Drugs 0.000 description 13
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 12
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 12
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 12
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N cephalosporin C Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 9
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 6
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 6
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 6
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 6
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 5
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 4
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 4
- YFAGHNZHGGCZAX-JKIFEVAISA-N dicloxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=C(Cl)C=CC=C1Cl YFAGHNZHGGCZAX-JKIFEVAISA-N 0.000 description 4
- 229960001585 dicloxacillin Drugs 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 3
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 3
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 229960001139 cefazolin Drugs 0.000 description 3
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N diethanolamine Chemical compound OCCNCCO ZBCBWPMODOFKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- GPXLMGHLHQJAGZ-JTDSTZFVSA-N nafcillin Chemical compound C1=CC=CC2=C(C(=O)N[C@@H]3C(N4[C@H](C(C)(C)S[C@@H]43)C(O)=O)=O)C(OCC)=CC=C21 GPXLMGHLHQJAGZ-JTDSTZFVSA-N 0.000 description 3
- 229960000515 nafcillin Drugs 0.000 description 3
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 description 3
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000027294 Fusi Species 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 2
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012412 chemical coupling Methods 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical class O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000010030 laminating Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 2
- 239000002923 metal particle Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-ylideneazanium;chloride Chemical compound Cl.N=C1CCCS1 ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- NQIBQILAMKZKFE-UHFFFAOYSA-N 2-(5-bromo-2-fluorophenyl)-3-fluoropyridine Chemical compound FC1=CC=C(Br)C=C1C1=NC=CC=C1F NQIBQILAMKZKFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BUCXEFZXWKUCCY-UHFFFAOYSA-N 4-methyl-3-(2-phenylethyl)-1,2,4-oxadiazol-5-one Chemical compound O1C(=O)N(C)C(CCC=2C=CC=CC=2)=N1 BUCXEFZXWKUCCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CMUGHZFPFWNUQT-HUBLWGQQSA-N 6-[5-(2-oxo-hexahydro-thieno[3,4-d]imidazol-4-yl)-pentanoylamino]-hexanoic acid Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 CMUGHZFPFWNUQT-HUBLWGQQSA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 1
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 7beta-aminocephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 0.000 description 1
- 241000187362 Actinomadura Species 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- WZPBZJONDBGPKJ-UHFFFAOYSA-N Antibiotic SQ 26917 Natural products O=C1N(S(O)(=O)=O)C(C)C1NC(=O)C(=NOC(C)(C)C(O)=O)C1=CSC(N)=N1 WZPBZJONDBGPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101100064718 Borrelia bavariensis (strain ATCC BAA-2496 / DSM 23469 / PBi) fusA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101100209555 Caenorhabditis elegans vha-17 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 1
- XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N Cyanide Chemical compound N#[C-] XFXPMWWXUTWYJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DEFJQIDDEAULHB-QWWZWVQMSA-N D-alanyl-D-alanine Chemical group C[C@@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C)C([O-])=O DEFJQIDDEAULHB-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000030899 Serine-Type D-Ala-D-Ala Carboxypeptidase Human genes 0.000 description 1
- 108010004832 Serine-Type D-Ala-D-Ala Carboxypeptidase Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229940024554 amdinocillin Drugs 0.000 description 1
- 230000001745 anti-biotin effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- WZPBZJONDBGPKJ-VEHQQRBSSA-N aztreonam Chemical compound O=C1N(S([O-])(=O)=O)[C@@H](C)[C@@H]1NC(=O)C(=N/OC(C)(C)C(O)=O)\C1=CSC([NH3+])=N1 WZPBZJONDBGPKJ-VEHQQRBSSA-N 0.000 description 1
- 229960003644 aztreonam Drugs 0.000 description 1
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 108010059877 carboxy-terminal domain phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229960001668 cefuroxime Drugs 0.000 description 1
- JFPVXVDWJQMJEE-IZRZKJBUSA-N cefuroxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(N)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CC=CO1 JFPVXVDWJQMJEE-IZRZKJBUSA-N 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- BWWVAEOLVKTZFQ-ISVUSNJMSA-N chembl530 Chemical compound N(/[C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)=C\N1CCCCCC1 BWWVAEOLVKTZFQ-ISVUSNJMSA-N 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000003245 coal Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000989 food dye Substances 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229940116108 lactase Drugs 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002229 photoelectron microspectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 1
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/11—Automated chemical analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Způsob určováni antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologické tekutině.
Oblast techniky
Předložený vynález se týká nových způsobů rychlého a přesného určováni antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologické tekutině použitím receptoru citlivého na antibiotika s beta-laktamovým jádrem, získaného z Bacillus licheniformis. Předložený vynález se také týká souprav umožňujících provedení těchto způsobů.
Dosavadní stav techniky
Je známo, že antibiotika jsou velice široce používaná nejenom jako terapeutický prostředek, určený pro léčbu infekčních chorob vyvolaných bakteriemi, ale také jako činidla umožňující konzervaci potravy a jako přídavek do stravy zvířat, umožňující stimuaci jejich růstu. Nutnost detekce přítomnosti antibiotik i ve velmi malých koncentrací v komplexních biologických tekutinách jako jsou mléko, moč, krev, sérum, slina, extrakty z masa, kvasící tekutiny nebo pufrované vodné prostředí proto nabývá na významu.
U mléčných produktů se nej častěji popisované testy týkají detekce antibiotik. Je totiž dobře známo, že antibiotika pěstitelé používají pro léčbu jistých infekčních onemocnění dobytka.
Ze zřejmých lékařských důvodů mléko určené k lidské spotřebě musi v principu být prosté všech antibiotik. Mimo jiné koncentrace penicilinu 0,005 U/ml nebo méně může mít škodlivé důsledky v průběhu výroby produktů odvozených z mléka, jako je*sýr, jogurt a podobně.
Může být předvídána řada situací. Například v prvním případě pro detekci přítomnosti antibiotik na farmě před převedením do kamionu, bude mít prioritu extrémně rychlý (méně než 5 minut) a jednoduchý test. Použití rychlého testu může být také vhodné, jestliže například antibiotikum, které bylo použito pro ošetření, je známé a jestliže dále uvedený test dovoluje detekci uvažovaného antibiotika podle zákonné normy. V opačném případě, pokud na rychlost není dáván důraz, je důležité detekovat většinu nebo všechna antibiotika v zákonných normách.
Zákonné úpravy některých zemí stanoví přesné kvalitativní normy. Například americké úřady vyžadují, aby koncentrace šesti dále uvedených antibiotik v mléku nepřekračovaly přesně určené hodnoty: penicilín, 5 ppb; ampicilin, 10 ppb; amoxicilin, 10 ppb; cloxacilin, 10 ppb; cefapirin, 20 ppb; ceftiofur, 50 ppb. Evropské společenství také stanoví normy kvality: penicilín 4 ppb; amoxicilin 4 ppb; ampicilin 4 ppb; cloxacilin 30 ppb; dicloxacilin 30 ppb; oxacilin 30 ppb; cefapirin 10 ppb; ceftiofur 100 ppb: cefchinon 20 ppb; nafcilin 30 ppb; cefazolin 50 ppb.
Může proto být užitečné mít k disposici test, který dovoluje detekci většiny antibiotik. Kromě toho v mlékárenském průmyslu může být užitečné mit k disposici test, který má všechny vlastnosti rychlosti, citlivosti a jednoduchosti, test, který dovoluje vázat tyto tři parametry co nej lepším způsobem a to i pokud nejsou úplně pokryty...
Z literatury jsou známy různé druhy testů pro analýzu biologických tekutin. Tyto testy obecně používají způsoby detekce, které jsou založeny na rozpoznávacím činidlu (receptory nebo protilátky), které specificky rozpoznávají hledanou látku nebo její analog a na značkovacím činidlu (radioaktivní prvek, enzym, fluorescenční činidlo a podobně), které jsou dále označovány jako detekční činidla. V závislosti na zvoleném způsobu se mluví o radioimunologickém testu (RIA), radioreceptorovém testu (RRA), enzymovém imunologickém testu (EIA) a podobně. Ve svém obecném principu tyto testy využívají minimální kombinaci dvou výše uvedených prvků (detekčních činidel), která umožní získat výsledek, jehož hodnota indikuje množství zkoumané látky, které je přítomno.
Je vhodné poznamenat, že v závislosti na použitém způsobu detekce může být označující činidlo spojeno buď s rozpoznávacím činidlem nebo s testovanou látkou nebo s látkou, která je analogická testované látce z hlediska rozpoznávání použitým rozpoznávacím činidlem. Existují také testovací způsoby, ve kterých rozpoznávací činidlo nebo testovaná látka nebo látka analogická testované látce obsahují v sobě označovací činidlo (například radioaktivně označená testovaná látka).
Vynález US 4.239.852 popisuje mikrobiologický způsob detekce antibiotik s β-laktamovým jádrem v mléku. Podle tohoto způsobu se vzorek mléka inkubuje na jedné straně v přítomnosti části buněk mikroorganismu, který je velmi citlivý na antibiotika, obzvláště Bacillus stearothermophilus a na druhé straně v přítomnosti antibiotika označeného radioaktivním prvkem nebo enzymem. Inkubace se provádí . za podmínek dovolujících, aby antibiotika, popřípadě přítomná ve vzorku a označené antibiotikum se vázaly k částem buněk.
Po ukončení inkubace se části buněk oddělí ze směsi a potom promývají. Potom se množství označených antibiotik vázaných na části buněk určí označených antibiotik, úměrné koncentraci a porovnává vázaných ke antibiotik, se standardem. Množství zbytkům buněk je přítomných ve nepřímo vzorku analyzovaného mléka.
Tento způsob vyžaduje během separace částí nejcitlivější verzi, kdy je možná do koncentrace 0.01 U.I./ml či relativně jemné manipulace, buněk ze směsi.
Mimoto zejména ve své detekce dokonce penicilinu G až
0.001 U.I./ml v mléce, tento způsob používá radioaktivním prvkem (14C nebo 125I) množství antibiotika, vyžaduj e scintilační antibiotikum označené produkty, a není zcela použiti speciálního přístroje, počítač.
to i v prostá
V tomto případě určení které je popřípadě přítomno v mléku, jako je například
Kromě toho manipulace s radioaktivními případě použití velmi malých množství, nebezpečí pro osobu, která provádí analýzu.
• ·
4
Evropská přihláška vynálezu 593.112 popisuje jiný způsob, dovolující detekci antibiotik v mléku. Tento způsob používá protein izolovaný z mikroorganismu citlivého na antibiotika, jako je například Bacillus stearothermophilus. Tento protein se kromě jiného označí enzymem jako je peroxidáza.
Test postupuje následujícím způsobem: vzorek mléka se inkubuje ve zkumavce v přítomnosti označeného proteinu; po inkubaci se mléko přenese do druhé zkumavky, na jejíchž stěnách bylo imobilizováno referenční antibiotikum; provede se druhá inkubace, potom se odstraní obsah zkumavky; stěny druhé zkumavky se třikrát promývají promývacím roztokem, který se také odstraní, Potom se rezidua, přítomná na stěnách druhé zkumavky přenesou na savý papír; dále se do druhé zkumavky přidá barevný substrát, který se znovu inkubuje, potom se přidá roztok, který zastaví vývin barvy; zabarvení zkumavky se porovná se zabarvením, kterého bylo dosaženo v paralelně prováděném identickém testu na standardním vzorku antibiotika. Množství označeného proteinu, imobilizovaném na nosiči, tedy také intenzita zabarvení, je nepřímo úměrné množství antibiotika, přítomného v analyzovaném vzorku mléka.
Podle příkladu 1 předložené přihlášky vynálezu tento test dovoluje detekovat penicilín G až do koncentrací řádu 5 ppb a dovoluje detekci amoxicilinu (5 ppb), ampicilinu (10 ppb), cefapirinu (5 ppb) a ceftiofuru (5 ppb). Tento test nedovoluje stanovení množství penicilinu, amoxicilinu a ampicilinu daných evropskými předpisy a mimo to je tento test nesmírně složitý; neodpovídá úplně kritériím přesnosti • ♦ a jednoduchosti hledaných v kontextu předložené přihlášky.
Jsou také známy další typy enzymatických způsobů, které umožňují určení slabých koncentrací antibiotik v mléku (J.M. FRERE a kol., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 18(4), 506-510 (1980), a také vynálezy EP 85.667 a EP 468.946), které jsou založeny na použití specifického enzymu, totiž exobuněčné rozpustné D-alanyl-D-alaninkarboxypeptidázy, kterou produkuje Actinomadura R39 (dále označovaná jako „enzym R39). Enzym R39 má specifickou aktivitu hydrolýzy skupin D-alanyl-D-alanin u různých peptidů a je také schopný hydrolyzovat konkrétní thioestery.
Kromě jiného enzym R39 reaguje s antibiotiky s β-laktamovým jádrem za velmi rychlého vytvoření equimolárního komplexu enzym-antibiotikum, který je neaktivní a v zásadě ireverzibilní.
V nejnovější verzi tohoto testu (EP 468.946) se určený objem vzorku kapaliny určení k testování inkubuje s určeným množstvím enzymu R39 za podmínek, které dovolují, aby βlaktamové antibiotikum, které je popřípadě přítomno ve vzorku, reagovalo s enzymem pro vytvoření ekvimolárního komplexu enzym-antibiotikum, který je neaktivní a v. zásadě ireverzibilní.
Potom se určené množství substrátu typu thioesteru inkubuje s produktem získaným v první etapě za podmínek, dovolujících hydrolýzu substrátu reziduálním enzymem R39, který dosud nekomplexoval s antibiotikem během první • · inkubace. Množství takto vytvořené kyseliny merkaptoalkanové se potom určí kolorimetrickou metodou pomocí reaktantu, který je schopný vytvářet zabarvení s volnou skupinou -SH kyseliny merkaptoalkanové. Intenzita zabarvení se porovnává s etalonem, který byl předem vytvořen ze vzorků obsahujících známá množství antibiotik. Kvantitativní určení může být provedeno měřením pomocí spektrofotometrie; v případě mléka může být nutné provést nejprve zprůhlednění vzorku.
Podle příkladů provedení přihlášky EP 468946, tento způsob dovoluje určit, v mléce, 10 ppb penicilinu G následně po celkové inkubační době délky 5 minut a řádově 2,5 ppb penicilinu G po celkové inkubační době délky 5 minut 15 minut.
Vzhledem ke požadovaným kritériím rychlosti, jednoduchosti a citlivosti metod detekce antibiotika v potravinářských produktech, si přihlašovatelé dali za cíl nalezení ještě učinějších metod, které by umožňovaly detekci antibiotika v biologické tekutině. Přihlašovatelé si dali zvláště za cíl nalezení metody umožňující detekci většiny antibiotik, jejichž obsah je stanoven evropskými a americkými normami. Hledané metody musí dojít k výsledku po omezeném počtu etap, s výhodou i v rukou nekvalifikvaného personálu.
Přihlašovatelé hledali také metody, které by umožnily dosažení cíle následně po sníženém času inkubace vzhledem k již existujícím způsobům.
• ·
Podstata vynálezu
Předložený vynález se týká způsobu určování antibiotik s beta-laktamovým jádrem Přihlašovatelé nalezli nové beta-laktamovým jádrem v v biologické tekutině, způsoby detekce antibiotik s biologické tekutině, které umožňují pozoruhodným způsobem dosáhnout uvedených cílů.
Z uvedených důvodů se předložená přihláška vynálezu týká nového způsobu detekce antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologické tekutině, který sestává z následujících kroků:
a) uvedení určeného objemu biologické tekutiny do kontaktu s určitým množstvím rozpoznávacího činidla a inkubace takto získané směsi za podmínek dovolujících tvorbu komplexů antibiotik eventuelně přítomných v biologické tekutině s rozpoznávacím činidlem,
b) uvedení do kontaktu směsi získané v etapě a) s alespoň jedním referenčním antibiotikem, které je imobilizované na nosič, za podmínek dovolujících tvorbu komplexů referenčního antibiotika s množstvím rozpoznávacího činidla, které nereagovalo během etapy a), a
c) určení množství rozpoznávacího činidla přichyceného k nosiči, přitom rozpoznávací činidlo obsahuje receptor, citlivý, na přítomnost antibiotik s beta-laktamovým jádrem získaný z Bacillus licheniformis.
Obrázek 1 představuje použitelný typ nosiče podle předložené přihlášky vynálezu, který je představován ve formě testovacího zařízení, které sestává z pevného nosiče (1) na kterém jsou přichyceny membrány (2), (3) a (4). Obrázek představuje pohled zepředu a obrázek lb přdstavuje
9 ·· 9··· ··« •99 · 9 9 9 99
999 9 9 99 99
9 · ··· 9 99 ···· ·9 99 9999 «9999 pohled na podélný řez.
Ve výhodném provedeni předloženého vynálezu se používá identifikační činidlo, které zahrnuje receptor citlivý na antibiotika s β-laktamovým jádrem získaný z Bacillus licheniformis, jako je například receptor BlaR nebo receptor BlaR-CTD. Izolace a peptidová sekvenace proteinu BlaR jsou popsány v Y. ZHU a kol., J. Bacteriol., 1137-1141 (1990); receptor BlaR-CTD je karboxy-terminální oblast BlaR, jehož izolace a peptidová sekvenace jsou popsány v B. JORIS a kol., FEMS Microbiology Letters, 107-114 (1990).
Použití receptorů BlaR nebo BlaR-CTD podle předloženého vynálezu pro detekci antibiotik s β-laktamovým jádrem přináší významné výhody ve srovnání s rozpoznávacími činidly používanými do současné doby. Receptory BlaR a BlaR-CTD jsou totiž schopny komplexovat velmi rychle s velkým množstvím antibiotik a to při teplotách inkubace nižších než jsou teploty nutné pro známá rozpoznávací činidla, jako jsou například receptory získané z Bacillus stearothermophilus.
Jako příklad detekovatelných antibiotik díky způsobům podle předložené přihlášky vynálezu, je možné citovat následující antibiotika: benzylpenicilin (nebo penicilín G), ampicilin, amoxicilin, carbenicilin, metylcilin, cloxacilin, 6-APA, monolaktam, aztreonam, mecillinam, cefalexin, cefaloglycin, cefaloridin, nitrocephin, cefatoxim, cefuroxim, ceftiofur, cefapyrin, 7-ACA. Způsoby podle předložené přihlášky vynálezu dovolují detekovat všechny antibiotika, která jsou kontrolovaná v Evropě a Americe, a to až k mezím
I • · ·· 9 9« * · · ♦ · · « ♦ ♦ · · · • · · · · · · · · • · » · · · · Φ · ·· ··· 4 · · · 4· ···· ·· ·· 4·«· 44··· tolerovaných prahových množství.
Způsoby podle předložené přihlášky vynálezu dovoluji detekovat antibiotika s beta-laktamovým jádrem v biologických tekutinách, takových jako jsou mléko, moč, krev, sérum, slina, extrakty z masa, kvasící tekutiny nebo pufrované vodní prostředí.
Podle výhodného způsobu provedení vynálezu je rozpoznávací činidlo používáno ve spojení s označovacím činidlem. Toto označovací činidlo může být různého druhu. Označovací činidlo může být korpuskulárního typu, jako jsou koloidní kovové částice (platina, zlato, stříbro,...), koloidní částice selenu, uhlí, síry nebo teluru nebo ještě syntetické zbarvené latexové koloidní částice. Označovací činidlo může také být fluoreskující látka, jako aktivovaný fluorescein (dostupný od společnosti Boeringher-Mannheim Biochemica), izokyanid fluoresceinu, tetramétylizokianid rhodaminu nebo všechny ostatní fluoreskující látky známé odborníkům v oboru. Označovací činidlo může také být enzym, například beta-laktmáza, peroxydáza, fosfatáza,.... V tomto případě jsou receptory BlaR nebo BlaR-CTD spojeny chemickou nebo genetickou cestou na toto označovací enzymatické činidlo tak, aby vytvořily fúzovaný protein.
Vazba mezi označovacím činidlem a detekčním činidlem může být dosažena způsoby známými odborníkům v oboru. Rozpoznávací činidlo může být přichyceno na označovací činidlo buď přímo nebo po vytvoření meziproduktu. Spojení mezi rozpoznávacím činidlem a označovacím činidlem může proběhnout v různých momentech během provádění způsobů vynálezu. Podle prvního způsobu provedeni vznikne spojení mezi rozpoznávacím činidlem a označovacím činidlem před uvedením rozpoznávacího činidla do kontaktu se vzorkem biologické tekutiny, určeným k analýze. Podle jiných způsobů provedení vynálezu vznikne spojení mezi rozpoznávacím činidlem a označovacím činidlem během nebo po uvedení rozpoznávacího činidla do kontaktu se vzorkem biologické tekutiny, určeným k analýze. Označení rozpoznávacího činidla se provede výhodně před uvedením rozpoznávacího činidla do kontaktu se vzorkem biologické tekutiny určeným k analýze.
| První etapa a) daného objemu rozpoznávacího | způsobu podle vynálezu spočívá ve smíchání biologické tekutiny s určitým množstvím činidla a v inkubaci získané směsi za |
podmínek dovolujících tvorbu komplexů antibiotika případně přítomného v biologické tekutině s rozpoznávacím činidlem.
Inkubace biologické tekutiny s receptorem BlaR nebo BlaRCTD může být provedena v teplotním intervalu nacházejícím se mezi hodnotami 4 až 60°C. Tato teplota nabývá s výhodou hodnoty 47°C. Zvýšení teploty inkubace bude mít za následek snížení času potřebného k inkubaci a naopak. Vždy je proto možné snížit dobu trvání inkubace tím, že se zvýší teplota.
V druhé etapě b) způsobu podle předložené přihlášky vynálezu se směs získaná, po provedení etapy a) smíchá s alespoň jedním referenčním antibiotikem imobilizovaným na nosič.
Nosiče použitelné podle předložené přihlášky vynálezu mohou být velmi různých typů. Může se jednat o pevné nosiče jako jsou zkumavky, desky nebo tyčky pokryté preparátem referenčního antibiotika. Může se jednat o testovací zařízení, které je představováno ve formě pevného nosiče, na kterém jsou přichyceny membrány, jedna nebo více látek, které jsou schopné zachycení a které jsou umístěny ve stanovené určovací zóně. Může se jednat o nosič, který je představován ve formě magnetických nebo nemagnetických kuliček (agarózy, polystyrénu,...), schopných vytvořit gel, na kterých je imobilizováno referenční antibiotikum.
Imobilizace referenčního antibiotika na nosiči se může provést způsoby známými odborníkům v oboru, jako jsou například kovalentní nebo nekovalentní absorbce na nosič, případně prostřednictvím oddělovače.
Podle zvláštního způsobu provedení vynálezu mohou být etapy a) a b) provedeny současně.
Etapa c) způsobu podle předložené přihlášky vynálezu, spočívá v detekci receptorů, které se přichytily na nosič, na kterém je imobilizované referenční antibiotikum. Metoda používaná pro toto určení je vázaná přímo na typ použitého označovacího činidla. Pokud je označovacím činidlem enzym bude etapa určení sestávat ze specifické reakce tohoto asociovaného enzymu, například bude sestávat z produkce určitého zbarvení. Pokud je označovací činidlo fluorescenčním činidlem, bude se provádět určení pouze měřením fluorescence nosiče. V případě kovových částic nebo obarvených latexových částic se bude přítomnost receptorů přichyceného na nosič manifestovat zbarvením, jehož intenzita je přímo úměrná počtu na nosič přichycených receptorů. Pro jakýkoli typ označovacího činidla, které bylo použito, je intenzita detekovaného signálu, nepřímo úměrná množství antibiotika přítomného v analyzovaném vzorku.
Přihláška vynálezu se také týká zkušebních souprav pro detekci antibiotika v biologické tekutině, obsahujících alespoň jedno rozpoznávací činidlo, které obsahuje receptor citlivý na přítomnost antibiotik s beta-laktamovým jádrem, získaný z Bacillus licheniformis, a alespoň jedno referenční antibiotikum imobilizované na nosiči.
Přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 představuje použitelný typ nosiče podle předložené přihlášky vynálezu, který je představován ve formě testovacího zařízení, které sestává z pevného nosiče (1) na kterém jsou přichyceny membrány (2), (3) a (4). Obrázek představuje pohled zepředu a obrázek lb přdstavuje pohled na podélný řez.
Následující příklady ilustrují různé předměty a způsoby provedení předloženého vynálezu, aniž by jeho rozsah jakýmkoli způsobem omezovaly.
Příklad 1. Určení antibiotik s beta-laktamovým jádrem v mléce.
Tento příklad ilustruje detekci antibiotik s betalaktamovým jádrem, kontrolovaných hygienickou službou v mléce. Popsaný test v tomto příkladu používá receptory BlaR-CTD spojené s kuličkami zlata, které slouží jako označovací činidlo a používá nosič, který je představován ve formě testovacího zařízení, které sestává z pevného nosiče, na kterém jsou přichyceny membrány.
1. 1. Napojení BlaR-CTD na zlaté kuličky.
1.1.1. Biotinylace BlaR-CTD.
3,79 ml roztoku rozpoznávacího činidla BlaR-CTD o koncentraci 6,6 mg/ml de vloží do pufru fosforečnanu sodného o množství 20 mM, pH 7. K tomuto roztoku BlaR-CTD se přidá 41,71 ml hydrogenuhličitanového pufru (0,1 M hydrogenuhličitanu sodného, pH 9) a 2 ml roztoku esteru kyseliny 6-(biotinamido).kapronové a N-hydroxy-sukcinimidu o koncentraci 2,23 mg/ml, také v hydrogenuhličitanovém pufru. Tento roztok je šetrně míchán na zkumavkovém míchacím zařízení s rotační osou typu LABINCO (dodávaný společností VEL, Belgie) rychlostí 2 otáčky/minutu po dobu 2 hodin za teploty okolí, skryt před světlem. 2,5 ml roztoku pufru Tris 1 M pH 8 se inkubuje s reakční směsí za stejných podmínek po dobu 30 minut. Takto získaný roztok je dialyzován proti pufru HNM (Hepes lOOmM, pH 8, NaCl 100 mM, MgCl2 50 mM) během doby 24 hodin. Tímto způsobem se získá roztok BlaR-CTD s navázaným biotinem, který se zředí v pufru HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml) do výsledné koncentrace 250 mg BlaR-CTD s navázaným biotinem na jeden ml pufru. Tento roztok je skladován při teplotě -20°C.
• · • ·
1.1.2. Označovací činidlo.
Jako označovací činidlo se používají částice zlata, které mají průměr o velikosti 40 nm, na které byly naneseny kozí protilátky proti biotinu ve formě suspenze ve vodném roztoku tetraborátu sodného v množství 2 mM o pH 1,2, stabilizovaného nitridem sodným o koncentraci 0,1 % (dodávaný společností BRITISH BIOCELL (Ref. GAB40). Optická hustota těchto suspenzí je při vlnové délce 520 nm přibližně 10 a koncentrace proteinu je přibližně rovna 24 mg/ml.
1. 1. 3. Napojení. BlaR-CTD s navázaným biotinem na zlaté kuličky.
Roztok BlaR-CTD, na který je navázaný biotin, připravený v příkladu 1.1.1 je zředěn 114,7 krát pufrem HNM-BSA (Hepes 500 mM, pH 8, NaCl 500 mM, MgCl2 250 mM, BSA 10 mg/ml) . Za teploty okolí se smíchá 22,5 objemových dílů tohoto zředěného roztoku BlaR-CTD, na který je navázaný biotin, 7,5 objemových dílů pufru HNM-BSA, 9,27 objemových dílů suspenze částic zlata sloužících k označení BlaR-CTD, na který je navázaný biotin a 6 objemových dílů suspenze referenčních částic zlata (viz níže příklad 1.1.4).
1.1.4. Nezávislé referenční činidlo.
V tomto testu se také používá referenční látka, která vytváří pruh, jehož intenzita umožňuje .rychle kvantifikovat množství antibiotika přítomného ve vzorku.
Jako referenční činidlo se použijí částice zlata o průměru 40 nm, na které byly naneseny kozí protilátky proti
| ·· * · • | ·· • « • 9 | 9 · ♦ · • · | » 9 • 9 • | ||||
| • • | • • | • · • | |||||
| — | • • 99· | 9 · • 9 | • 9 9 · | • • 999 | • | • • 9 | • 9 9 9 |
králičímu imunoglobulinu. Tyto částice jsou dodávány společnosti BRITISH BIOCELL (Ref. GAR40) ve formě suspenzí ve vodném roztoku tetraboritanu sodného 2 mM při pH 7,2, stabilizované nitridem sodným 0,1 %. Optická hustota této suspenze při vlnové délce 520 nm je zhruba 3 a koncentrace proteinu je zhruba rovna 6 mg/ml.
1.2. Testovací zařízení.
Testovací zařízení, které je používané, sestává z pevného nosiče (1), který se skládá z prvního a druhého konce, na které jsou postupně navázány, počínaje prvním koncem,
- membrána (2) umožňující purifikaci analyzované tekutiny,
- membrána (3) , na které jsou imoblizovány dvě záchytné látky (referenční antibiotikum a látka, která je schopná zachytit nezávislé referenční činidlo), a absorbční membrána (4).
1.2. 1. Sestavení testovacího zařízení.
Sestavení membránových karet.
Karty o velikosti 300 x 76,2 mm se napřed sestaví použitím laminačního zařízení typu Chlamshell Laminator (dodávané společností Bio Dot, lne.) následujícím způsobem:
Vyřízne se obdélník z plastového nosiče typu ArCare 8565 (dodávaného společností Adhesive Research) o rozměrech 300 x 76,2 mm (pevný nosič (1)). Potom se vyřízne obdélník membrány Leukosorb LK4 (dodávané společností Pall Gelman Sciences) o rozměrech 300 x 20 mm. (membrána (2)), obdélník membrány Hi-Flow SX (dodávané společností Millipore) o rozměrech 300 x 25 mm (membrána (3)), obdélník membrány z ·♦-·.· ·« · · · · • · · · · ·· · · * · ··· · · · ··· ·#·· ·< Μ ·<·Φ ·φ ··· celulózy 3 mm (dodávané společností Whatmann) o rozměrech 300 x 40 mm (membrána (4)).
Membrány (2) a (4), potom (3) se postupně uloží na specifické místo spodní formy laminačního zařízení. Pevný nosič (1) pokrytý lepidlem je sám o sobě uchováván v příklopu tohoto zařízení. Lepivá strana nosiče je vystavena na vzduchu. Membrány uložené ve spodní formě se uvedou do kontaktu s lepivým nosičem uzavřením laminačního zařízení; membrány se udržují přesně na svých místech pomocí podtlaku vytvářeného vývěvou. Po přerušení tvorby podtlaku se vyjme karta, tvořená pevným nosičem (1), na kterém jsou připevněny membrány (2), (3) a (4).
Potom se na membránu (3) nanesou následující roztoky: z proximální části: první záchytná látka; proužek číslo 1; z distální části: druhá záchytná látka; proužek číslo 2. Tyto záchytné látky jsou naneseny za pomoci nanášecího zařízení typu X-Y Platform Biojet Quanti-3000 společnosti Bio Dot, lne.
Nanesené roztoky se okamžitě odpaří umístěním souboru karty po dobu jedné minuty do proudu vzduchu o teplotě 60 °C.
Karty získané výše popsaným sestavením se nastříhají na pásky pomocí zařízení typu guilotiny nebo pomocí rotačního zařízení (dodávaného společnostmi Bio Dot, Kinematic nebo Akzo) . Pásky vzniklé z konců karet jsou vyhozeny, ostatní pásky jsou připraveny k použití.
Obrázek 1 představuje takové testovacího zařízení.
Testovací zařízení jsou konzervovány umístěním do neprůhledné, hermeticky uzavřené nádoby za přítomnosti dezinfekčního činidla (Air Sec, France).
1.2.2. První záchytná látka - Referenční antibiotikum.
ml roztoku obsahujícího množství 213 mg lidského gamaglobulinu (G4386, Sigma) a 8,6 mg hydrochloridu 2iminothiolanu (Aldrich, 33056-6) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9) se inkubují po jednu hodinu při teplotě 25°C.
Odděleně se inkubuje po jednu hodinu při teplotě 25°C objem 20 ml roztoku obsahujícího množství 119,8 mg cefalosporinuC a 54 mg sulfosukcinimidyl 4-(Nmaleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylátu (sSMCC, 22322 Pierce) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9).
Dva roztoky, které byly předtím připraveny se potom smíchají. pH vzniklého roztoku se upraví na 7,1 přidáním 3 ml NaH2PO4 500 mM a inkubuje se po dvě hodiny při teplotě 25°C. Směs získaná po inkubaci se dialyzuje třikrát proti 1 litru pufru fosforečnanu sodného (10 mM, pH 7,5). Vzniklý roztok se filtruje na filtru o pórech velikosti 0,22 pm, potom se alikvotuje a zmrazí při teplotě -20°C až do použití.
Při použití se alikvoty rozmrazí a přidá se potravinářské barvivo před uskutečněním nanesení na membránu, aby byla v každém okamžiku zaručena přesná poloha nanesení a kvalita • * stopy.
První záchytná látka dovoluje fixaci BlaR-CTD navázaných na zlaté kuličky přítomných v přebytku, vzhledem k množství antibiotik přítomných ve vzorku.
1.2.3. Druhá záchytná látka - Látka schopná zachytit nezávislé referenční činidlo.
Jako druhé záchytné látky se používá roztok králičího imunoglobulinu (Sigma I 5006) o koncentraci 0,5 mg/ml immunoglobulinu v pufru fosforečnanu sodného v množství 10 mM, pH Ί,5, lidský gammaglobulin o koncentraci 5 mg/ml. Tato druhá záchytná látka zachytává referenční činidlo během migrace kapaliny na testovacím zařízení.
1.3. Určení antibiotik v mléce.
1.3.1. Test během 3 minut - Rychlý test
Připraví se sedm vzorků čerstvého mléka, které obsahuji postupně 0; 1; 2; 3; 4; 5 a 6 ppb penicilinu G. Každý z těchto roztoků je potom analyzován následujícím způsobem.
Odebere se alikvot 200 ml vzorku mléka a 45,27 ml roztoku připraveného v příkladu 1.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Tato směs se inkubuje po 1 minuty při teplotě 47°C. Potom se testovací zařízení umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a tak, aby druhý konec testovacího zařízení byl na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47°C.
Níže uvedená Tabulka 1 udává výsledky získané pro 7 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená, že pruh je nejintenzivnější a hodnota 0 znamená, že pruh je nejméně intenzivní. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství penicilinu G, který je přítomen ve vzorku.
| Tabulka 1 | ||
| Penicilín G | Intenzita | |
| (PPb) | první pruh | druhý pruh |
| 0 | 10 | 6 |
| 1 | 9 | 6 |
| 2 | 9 | 6 |
| 3 | 4 | 6 |
| 4 | 0 | 6 |
| 5 | 0 | 6 |
| 6 | 0 | 6 |
V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 1 ukazují, že test dovoluje detekovat do 3 minut až do 4 ppb penicilinu G ve vzorku mléka.
Pokusy byly za stejných podmínek také provedeny u jiných antibiotik s beta-laktamovým jádrem. Tento test, který je proveden během 3 minut, dovoluje detekci amoxicilinu do množství 5 ppb, ampicilinu do množství 5 ppb, cloxacilin v méně než 10 ppb, dicloxacilin v méně než 20 ppb, oxaciiin v méně než 20 ppb a cefapirin do množství 20 ppb ve vzorku • ·
mléka.
1.3.2. Test během 5 minut
Připraví se šest vzorků čerstvého mléka, které obsahují postupně 0; 2; 4; 6; 8 a 10 ppb cloxacilinu. Každý z těchto roztoků je potom analyzován následujícím způsobem.
Odebere se alikvot 200 ml vzorku mléka a 45,27 ml roztoku připraveného v příkladu 1.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Tato směs se inkubuje po 3 minut při teplotě 47 °C. Potom se testovací zařízení umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení' v kontaktu se směsí a tak, aby druhý konec testovacího zařízení byl na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47°C.
Níže uvedená Tabulka 1 udává výsledky získané pro 6 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená, že pruh je nejintenzivnější a hodnota 0 znamená, že pruh je nejméně intenzivní. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství Cloxacilinu, který je přítomen ve vzorku.
9
| Tabulka 2 | ||
| Cloxacilin | Intenzita | |
| (PPb) | první pruh | druhý pruh |
| 0 | 10 | 6 |
| 2 | 6 | 6 |
| 3 | 5 | 6 |
| 4 | 3 | 6 |
| 5 | 3 | 6 |
| 10 | 3 | 6 |
V tomto přikladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 2 ukazují, že test dovoluje detekovat do 5 minut až 4 ppb cloxacilinu ve vzorku mléka.
Pokusy byly za stejných podmínek také provedeny u jiných antibiotik s beta-laktamovým jádrem. Tento test, který je proveden během 5 minut dovoluje detekci penicilinu G do 3 ppb, amoxicilinu do 4 ppb, ampicilinu do množství 4 ppb, dicloxacilinu do množství 8 ppb, oxacilinu do množství 20 ppb, cefapirinu do množství 16 ppb, ceftiofuru do množství 100 ppb, cefchinonu v množství menším než než 20 ppb, nafcilinu do množství 20 ppb a cefazolinu do množství 60 ppb ve vzorku mléka.
Tento test se obzvláště hodí jako výběrový test před plněním nádrží kamionů, které transportují mléko.
1.3.3. Test během 9 minut
Připraví se šest vzorků čerstvého mléka, které obsahují
- 23 postupně 0; 4; 6; 8; 10 a 12 ppb cefapirinu. Každý z těchto roztoků je potom analyzován následujícím způsobem.
Odebere se alikvot 200 ml vzorku mléka a 45,27 ml roztoku připraveného v příkladu 1.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Tato směs se inkubuje po 7 minut při teplotě 4 7°C. Potom se testovací zařízení umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a tak, aby druhý konec testovacího zařízení byl na stěně skleněné baňky. Směs se ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47°C.
Níže uvedená Tabulka 3 udává výsledky získané pro 6 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená, že pruh je nejintenzivnější a hodnota 0 znamená, že pruh je nejméně intenzivní. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství Cefapirinu, který je přítomen ve vzorku.
| Tabulka 3 | ||
| Cefapirine | Intenzita | |
| (ppb) | první pruh | druhý pruh |
| 0 | 10 | 6 |
| 4 | 6 | 6 |
| 6 | 5 | 6 |
| 8 | 4 | 6 |
| 10 | 3 | 6 |
| 12 | 3 | 6 |
- 24 44 >
| ·· | ©4 | ·· | ·· |
| • < | • | • ♦ · | • 4 |
| • | 9© | © © | • |
| 9 | • | • © · 4 | e |
| • | • | '> « 4 | • |
| • ••4 | ·· | 4© | ··©* |
·· • · • · • · · • >
··
V tomto přikladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 3 ukazují, že test dovoluje detekovat do 9 minut až 6 ppb cefapirinu ve vzorku mléka.
Pokusy byly za stejných podmínek také provedeny u jiných antibiotik s beta-laktamovým jádrem. Tento test, který je proveden během 9 minut dovoluje detekci penicilinu G do množství 3 ppb, amoxicilinu do 4 ppb, ampicilinu do 4 ppb, cloxacilinu do množství 4 ppb, dicloxacilinu do množství 8 ppb, oxacilinu do množství 8 ppb, cefapirinu do 16 ppb, ceftiofuru do množství 100 ppb, cefchinonu v množství menšího než než 20 ppb, nafcilinu do množství 20 ppb a cefazolinu do množství 60 ppb ve vzorku mléka.
Tento test, který je proveden během 9 minut, umožňuje detekci všech antibiotik právě kontrolovaných v Evropském společenství a to až do legálních prahových množství daných v Evropském společenství.
1.3.4. Test během 20 minut
Připraví se šest vzorků čerstvého mléka, které obsahují postupně 0; 20; 30; 40; 50 a 60 ppb ceftiofuru. Každý z těchto roztoků je potom analyzován následujícím způsobem.
Odebere se alikvot 200 ml vzorku mléka a 45,27 ml roztoku připraveného v příkladu 1.1.3, které se umístí do skleněné baňky. Tato směs se inkubuje po dobu 20 minut při teplotě 47°C. Potom se testovací zařízení umístí vertikálně do skleněné baňky tak, aby byl první konec testovacího zařízení v kontaktu se směsí a tak, aby druhý konec testovacího zařízení byl na stěně skleněné baňky. Směs se « ·
ponechá migrovat testovacím zařízením a soubor se nechá inkubovat po 2 minuty při teplotě 47°C.
Níže uvedená Tabulka 4 udává výsledky získané pro 6 vzorků, které byly testovány. Detekovaným pruhům byla přiřazena intenzita v rozmezí od 0 do 10, přičemž hodnota 10 znamená, že pruh je nejintenzivnější a hodnota 0 znamená, že pruh je nejméně intenzivní. V této stupnici byla hodnota 6 přiřazena referenčnímu pruhu. Intenzita signálu pozorovaného v prvním detekčním pruhu je nepřímo úměrná množství Ceftiofuru, který je přítomen ve vzorku.
| Tabulka 4 | ||
| Ceftiofur | Intenzita | |
| (ppb) | první pruh | druhý pruh |
| 0 | 10 | 6 |
| 20 | 6 | 6 |
| 30 | 5 | 6 |
| 40 | 4 | 6 |
| 50 | 3 | 6 |
| 60 | 3 | 6 |
V tomto příkladu pokud byl první pruh méně intenzivní než referenční pruh, byl test považován za pozitivní. Výsledky uvedené v Tabulce 4 ukazují, že test dovoluje detekovat do doby 20 minut až 30 ppb ceftiofuru ve vzorku mléka.
Tento test, který je proveden během 20 minut umožňuje jedním testem detekci všech antibiotik právě kontrolovaných v Evropském společenství a Americe, a to až do legálních prahových množství daných v Evropském společenství a Americe.
Příklad 2. Určení 6 antibiotik v mléce.
Tento příklad ilustruje detekci 6 antibiotik s β-laktamovým jádrem, které jsou kontrolovány hygienickými úřady v Americe, v mléku. Test popsaný v tomto přikladu používá receptor BlaR-CTD vázaný ve formě fúzovaného proteinu spolu s beta-laktamázou, v testu se používá nosiče, který je představován magnetickými kuličkami.
2. 1. Fúzovaný protein BlaR-CTD-beta-laktamáza.
Fúzovaný protein BlaR-CTD-beta-laktamáza je získán genetickou kopulací mezi receptorem BlaR-CTD (B. JORIS a al·., PEMS Microbiology Letters, 107-114, 1990) a betalaktamázou na Zn z Bacillus cereus (M. Hussain a al., 1985,
J. Bact., 164:1, 223-229, 1985).
Spojení je realizováno následujícím způsobem:
2.1.1. Konstrukce plazmidu: byla provedena kopulace 1/1 mezi geny polypeptidu BlaR-CTD a beta-laktamázy: gen kódující beta-laktamázu byl vnesen ve fázi za gen BlaR-CTD. Plazmid, který nese genetickou fúzi dále obsahuje gen rezistence na kanamycin. Fúzovaný protein je dále nazýván Fus 1.
2.1.2. Výroba:
- Kmen: plazmid nesoucí fúzované geny byl vnesen do E. Coli. Klony nesoucí rekombinantní plazmid jsou selektovány
.. · · na základě LB + Km (50 mg/ml).
Selekce: označeni buněčného extraktu radioaktivním antibiotikem, následované elektroforézou na denaturujícím polyakrylamidovém gelu, ukazuje, že většina produkovaného proteinu je vytvořena ve formě fúzovaného produktu, jehož molekulová hmotnost je asi 50000. Přesto se ale zdá, že post-translační proteolytické štěpení disociuje pouze velmi malé procento (2 %) těchto molekul na dvě molekuly s různou aktivitou.
Kultura: 500 ml LB + Km (50 mg/ml) média s rekombinantními buňkami (konzervovaného při -70°C) je naočkováno. Prekultura je inkubovaná při teplotě 37 °C a protřepávaná přes noc rychlostí 225 otáček za minutu. 18 litrů média LB + Km (50 mg/ml) je naočkováno do 500 ml této prekultury, jejíž optická hustota při vlnové délce 600 nm nabývá hodnotu 4. Kultura 18 litrů je zastavena v okamžiku, kdy optická hustota bude mít hodnotu 6.
2.1.3. Extrakce: Ihned po zastavení kultury se buňky filtrují a potom centrifuguji. Supernatant, který obsahuje buněčnou sraženinu, je lyžován dezintegrátorem a uchován. Obsahuje fúzovaný protein FUSI.
2.1.4. Purifikace:
Použité pufry:
Pufr A: Tris 20 mM pH 8,0, etylenglykol 10 %, DTT 50 mM; Pufr B: pufr A + NaCl 1M.
Fúzovaný protein se částečně purifikuje iontovou chromatografií a na iontovém sítu. Po nanesení extraktu a promytí na koloně QSPP (Pharmacia, Upsala) pufrem A se FUSI vymývá lineárním gradientem pufru B. Aktivní frakce (± 0,25 M v NaCl) se potom seberou a nanesou na molekulární síto G100 (Pharmacia, Upsala); vymývají se pufrem A. Specifická střední aktivita získaného vzorku je odhadovaná na 30 %.
2.1.5. Inhibice beta-laktamázy: Fúzovaný protein (9/10 volume) se inkubuje v EDTA 50 mM (1/10 objemově) během 45 minut při teplotě 37°C. Inhibice se kontroluje pomocí nitrocefinu v kacodylátovém pufru 10 mM pH 6,0. V přítomnosti Zn musí být signál pozitivní, v jeho nepřítomnosti musí signál být negativní. Po inhibicí bude efektivní koncentrace měřená na základě aktivity betalaktamázy mít hodnotu 7,74 mmol/ml.
2.2. Pevný nosič: magnetické kuličky - cefalosporin C (referenční antibiotikum).
Používají se částice BioMag 4100 (dostupné u výrobce DRG Instrument GmbH, Marburg, Německo pod referenčním kódem AM 4100 B. ) , jejichž koncové NH2 skupiny jsou aktivované glutaraldehydem následujícím způsobem:
jeden objemový díl původního roztoku částic BioMag 4100 se čtyřikrát propláchne pomocí 5 objemových dílů pufru pyridinu v množství 0,01 M pH 6,0. Částice se dále přidají do 2,5 objemových dílů 5 % glutaraldehydu v pyridinovém pufru a protřepávaji se rotačně během tři hodin za teploty okolí. Potom se částice desetkrát propláchnou pomocí dvou objemových dílů pufru Kpi 0,01 M pH 7,0. Částice se potom uvedou znovu do suspenze do jednoho objemového dílu cefalosporinu CO, 1 M v pufru Kpi a protřepávaji se • ·
- 29 rotačně během po jednu noc při teplotě +4°C. Poslední propláchnutí se provádí až do úplného odstranění cefalosporinu C v pufru Kpi 0,1 M pH 7,0.
2.3. Určení 6 antibiotik penicilinu G, ampicilinu, amoxicilinu, cloxacilin, cefapirinu a ceftiofuru v mléce.
2.3. 1. Použité roztoky:
roztok 1: 700 pikomolů fúzovaného proteinu lyof ilizovaného v Tris v množství 100 mM, pH 8, BSA 1 mg/ml, EDTA 50 mM, DTT 50 mM se rehydratuje objemem 5 ml vody Milli-Q; objem 50 ml tohoto roztoku je nutný pro provedení měření.
roztok 2: objem 2 ml částic BioMag-cefalosporin C připravených v příkladu vynálezu 1.2 v isopropanolu 100 %;
objem 20 ml tohoto roztoku je nutný pro provedení měření.
- roztok 3: lyofilizovaný pufr kacodylátu v množství 10 mM, pH 6, NaCl 1M se rehydratuje pomocí objemu 500 ml vody Milli-Q.
roztok 4: objem 400 ml nitrocefinu 10 mM v DMP se rozpustí na objem 40 ml v roztoku 3; pro detekci je potřeba objemu 400 ml.
2.3.2. Způsob detekce:
μΐ roztoku 1 se umístí za přítomnosti objemu 500 ml vzorku dopovaného mléka a inkubuje se při teplotě 47°C během doby 2 minut. Objem 20 ml roztoku 2 se suspenduje v mléce, které se znovu inkubuje během 2 minut při teplotě 47 °C. Částice se přitáhnou na stěnu nádoby pomocí paramagnetického magnetu, zatímco supernatant se odstraní. Částice se dvakrát propláchnou roztokem 3 postupem podobným způsobu s magnetem. Konečně se objem 400 ml roztoku 4 inkubuje za přítomnosti částic během 3 minut při teplotě 47°C. Měří se zbytková absorbance roztoku roztoku při vlnové délce 482 nm vzhledem k roztoku nitrocefinu.
Tento způsob umožňuje detekci 6 antibiotik převzatých z amerických norem, a to jejich koncentraci, která je menší než koncentrace daná normou, to je penicilín při 5 ppb, ampicilin při 10 ppb, amoxicilin při 10 ppb, cloxacilin při 10 ppb, cefapirin při 20 ppb a ceftiofur při 50 ppb.
Příklad 3. Určení 3 antibiotik (penicilín G, cloxacilin, ceftiofur) v mléce.
Tento příklad ilustruje detekci 3 antibiotik s betalaktamovým jádrem kontrolovaných hygienickou službou v mléce. Popsaný test v tomto příkladu používá receptory BlaR-CTD ve formě dvou fúzovaných proteinů a to spolu s alkalickou fosfatázou a peroxydázou a používá nosič, který je představován ve formě mikrodesky.
3. 1. Fúzovaný protein BlaR-CTD-alkalická fosfatáza.
Fúzovaný protein BlaR-CTD-alkalická fosfatáza se získá chemickou kopulací receptoru BlaR-CTD (B. JORIS a al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990)) s aktivovanou alkalickou fosfatázou dostupnou od výrobce Boehringer Mannheim Biochemica pod referenčním kódem 1464752.
Kopulace se provádí následujícím způsobem:
3.1.1. Konjugace: BlaR-CTD a alkalická fosfatáza se dialyzují v pufru uhličitan/hydrogenuhličitan sodný v množství 100 mM při pH 9,8. 15 nanomolů BlaR-CTD se *
• · inkubuje za přítomnosti objemu 100 ml aktivované alkalické fosfatázy (20 mg/ml) během dvou hodin při teplotě 25°C.
3.1.2. Zastavení reakce: Přidá se objem 40 ml roztoku trietanolaminu 2 mM, pH 8, potom objem 50 ml roztoku hydroborátu sodného v množství 200 mM. Směs se inkubuje během 30 minut při teplotě +4°C. Pak se přidá objem 25 ml roztoku trietanolaminu 2 mM, pH 8, potom se směs znovu inkubuje během hodin při teplotě + 4°C.
3.1.3. Stabilizace spojení: Přidá se objem 10 ml roztoku glycinu v množství 1M, pH 7,0.
3.1.4. Přenos ve skladovacím pufru: Reakční směs (přibližně 300 ml) se třikrát dialyzuje po dobu 8 hodin objemem 0,5 litrů trietanolaminového pufru v množství 50 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, ZnCl2 0,5 mM, glycin 10 mM při teplotě +4°C.
3.1.5. Konečný titr: konečný titr spojení nabývá hodnot 50 mmol BlaR-CTD aktivního na ml roztoku.
3.2. Fúzovaný protein BlaR-CTD-peroxydáza
Fúzovaný protein BlaR-CTD-peroxydáza se získá chemickou kopulací mezi receptorem BlaR-CTD (B. JORIS a al., FEMS Microbiology Letters, 107-114, (1990)) a aktivovanou peroxydázou dostupnou od výrobce Boehringer Mannheim Biochemica pod referenčním kódem 1428861.
Spojení se realizuje následujícím způsobem:
• « · ♦ · ♦ ·· · · ♦ · ♦ ♦ · · · · ·· • · · «· · · · ···· ·· ·· ···· ·· ···
3.2.1. Konjugace: BlaR-CTD a peroxydáza se dialyzují v pufru uhličitan/hydrogenuhličitan sodný v množství 100 mM při pH 9,8. 40 nanomolů BlaR-CTD se inkubuje za přítomnosti objemu 100 ml aktivované peroxydázy hodin při teplotě 25°C.
(16 mg/ml) během dvou
3.2.2.
Zastavení reakce:
Přidá se objem 40 ml roztoku trietanolaminu v množství 2 mM, pH 8, potom objem 50 ml roztoku hydroborátu sodného v množství 200 mM. Směs se inkubuje během 30 minut při teplotě +4°C. Přidá se objem 25 ml roztoku trietanolaminu v množství 2 mM, pH 8, potom směs znovu inkubuje během hodin při teplotě + 4°C.
3.2.3. Stabilizace spojení:
Přidá se objem 10 ml roztoku glycinu v množství 1M, pH 7,0.
3.2.4. Přenos ve skladovacím pufru: Reakční směs (přibližně objem 400 ml) se třikrát dialyzuje po dobu 8 hodin objemem 0,5 litrů pufru fosforečnanu draselného v množství 10 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, glycin 10 mM při teplotě +4°C.
3.2.5. Konečný titr: konečný titr spojení nabývá hodnot 100 mmol BlaR-CTD aktivního na ml roztoku.
3.3. Pevný nosič: mikrodeska-cefalosporin C.
3.3.1. Příprava roztoku refernčního antibiotika.
Objem 8 ml roztoku obsahujícího 213 mg lidského gamaglobulinu (G4386, Sigma) a 8,6 mg hydrochloridu 2iminothiolanu (Aldrich, 33056-6) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9) se inkubují po jednu hodinu při teplotě 25°C.
• ·
- 33 Odděleně se inkubuje po dobu jedné hodiny při teplotě 25°C objem 20 ml roztoku obsahujícího 119,8 mg cefalosporinu-C a 54 mg sulfosukcinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-1karboxylátu (sSMCC, 22322 Pierce) v pufru uhličitanu sodného (100 mM, pH 9).
Oba dva roztoky, které byly připraveny, předtím, se potom smíchají. pH vzniklého roztoku se upraví na 7,1 přidáním objemu 3 ml NaH2PO4 v množství 500 mM a inkubuje se po dobu dvou hodin při teplotě 25°C. Směs získaná po inkubaci se dialyzuje třikrát proti objemu 1 litru pufru fosforečnanu sodného (10 mM, pH 7,5). Vzniklý roztok se filtruje na filtru o pórech velikosti 0,22 pm.
3.5.2. Pokrytí mikrodesek referenčním antibiotikem. Používají se polystyrénové mikrodesky s vysokou schopností adsorbce proteinu, dodávané společností NUNK (Immuno Plate: typ Maxisorp) nebo dodávané společností GREINER (microlon 600, reference 705071). Jamky mikrodesek jsou myté pufrem PBS v množství 150 mM, pH 7,2. Alikvot roztoku připravený v příkladu 3.3.1. se potom inkubuje během 24 hodin při teplotě 4°C v jamkách. Po inkubaci se jamky promývají třikrát pufrem PBS 150 mM, pH 7,2, Tween-20 0,1 %. Zkumavka se během dvou hodin při teplotě 20°C saturuje saturačním pufrem PBS 150 mM, pH 7,2, BSA 5 %. Po třech promytích mycím pufrem se zkumavky suší a skladují při teplotě 4°C, chráněné před vlhkem.
Pro jamky určené pro rozpoznávací činidlo BlaR-CTDalkalická fosfatáza je použitým mycím pufrem dietanolamin 1
Μ, ρΗ 9,8, MgCl2 0,5 mM; Pro jamky určené pro rozpoznávací činidlo BlaR-CTD-peroxydáza, je použitým mycím pufrem fosforečnan draselný v množství 50 mM, pH 5.
3.4. Určení tří antibiotik v mléce.
Množství 1,4 pikomolů značeného rozpoznávacího činidla se inkubuje za přítomnosti objemu 100 ml dopovaného mléka během 5 minut při teplotě 47°C. Mléko se za pomoci pipety přelije do jamky předem upravené podle příkladu 2.3.5. Mléko se inkubuje během 2 minut při teplotě 47°C. Po odstranění mléka následovaném dvěma mytími mycím pufrem (viz příklad 2.3.2.), se inkubuje během 2 minut v jamce 300 ml pufru obsahujícího vývojový substrát (vývojový substrát pro rozpoznávací činidlo BlaR-CTD-peroxydáza: fosforečnan draselný v množství 50 mM, pH 5, ABTS 9,1 mM, H2O2 0,002 %; vývojový substrát pro rozpoznávací činidlo BlaR-CTDalkalickou fosfatázou: dietanolamin 1 M, pH 9,8, MgCl2 0,5 mM, 4-NPP 10 mM) . Deska se potom umístí do automatického spektrofotometru pro desky používané při ELISA, vlnová délka se nastaví nadhodnotu 405 nm.
Tento test umožňuje detekci tří antibiotik penicilinu G, cloxacilinu a ceftiofuru až do prahových hodnot vymezených americkými předpisy (penicilín G 5 ppb, cloxacilin 10 ppb a ceftiofur 50 ppb).
Příklad 4. Určení 6 antibiotik penicilinu G, ampicilinu, amoxicilinu, cloxacilinu, cefapirinu a ceftiofuru v mléce. Tento příklad ilustruje detekci 6 antibiotik s betalaktamovým jádrem v mléce až do prahových hodnot vymezených americkými předpisy. Popsaný test v tomto příkladu používá
V 9
9 receptory BlaR-CTD ve formě fúzovaného proteinu s alkalickou fosfatázou nebo peroxydázou a používá nosič, který je představován ve formě potažené zkumavky.
4. 1. Fúzovaný protein BlaR-CTD-alkalická fosfatáza.
Viz přiklad 3. 1,.
4.2. Pevný nosič: zkumavka potažená referenčním antibiotikem.
V tomto příkladu se používá se polystyrénových zkumavek s vysokou schopností adsorbce proteinu, dodávané firmou NUNK (typ Maxisoo), na které se působí roztokem referenčního antibiotika, jak je uvedeno v příkladu 3.3.2.
4.3. Určení 6 antibiotik v mléce.
Množství 7 pikomolů rozpoznávacího činidla se inkubuje za přítomnosti objemu 500 ml mléka během 5 minut při teplotě 47°C v Eppendorfově zkumavce. Mléko se za pomoci pipety přelije do předem upravené zkumavky podle příkladu 3.2. Mléko se inkubuje během 2 minut při teplotě 47°C. Po odstranění mléka se zkumavka následovně promývá dvakrát objemem 1 ml pufru dietanolaminu v množství 1 M, pH 9,8, MgC12 0,5 mM. Potom se přidá objem 500 ml pufru obsahujícího vývojový substrát dietanolamin v množství 1 M, pH 9,8, MgCl2 0,5 mM, 4-NPP 10 mM a substrát se inkubuje během 2 minut při teplotě 47°C. Potom se měří absorbance supernatantu za pomoci spektrofotometru, jehož vlnová délka je nastavena na hodnotu 405 nm.
Tato metoda dovoluje určit 6 antibiotika až do prahových hodnot vymezených americkými předpisy: penicilín G . v množství menším než 5 ppb; ampicilin v množství menším než 10 ppb; amoxicilin v množství menším než 10 ppb; cloxacilin v množství menším než 10 ppb; cefapirin v množství menším než 20 ppb; ceftiofur v množství menším než 50 ppb.
Zastupuje:
dr. O. Švorčík
JUDr. Otakar Švorčík advokát Hálkova2, 120 00 Praha 2
Claims (13)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob detekce antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologické tekutině, který zahrnuje následující etapya) uvedení určeného objemu biologické tekutiny do kontaktu s určitým množstvím rozpoznávacího činidla a inkubace takto získané směsi za podmínek dovolujících tvorbu komplexů antibiotik, případně přítomných v biologické tekutině, s rozpoznávacím činidlem,b) uvedení směsi získané v etapě a) do kontaktu s alespoň jedním referenčním antibiotikem imobilizovaným na nosič, za podmínek dovolujících tvorbu komplexů referenčního antibiotika s množstvím rozpoznávacího činidla, které nereagovalo během etapy a), ac) určení množství rozpoznávacího činidla přichycného k nosiči, vyznačující se tím, že rozpoznávací činidlo obsahuje receptor citlivý na přítomnost antibiotik s beta-laktamovým jádrem, získaný z Bacillus lícheníformis. -
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že receptor citlivý na antibiotika s beta-laktamovým jádrem je receptor BlaR nebo receptor BlaR-CTD.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že receptor citlivý na antibiotika s beta-laktamovým jádrem je kopulován s označovacím činidlem vybraným ze souboru, zahrnujícího kovové koloidními částice, koloidní částice selenu, uhlíku, síry nebo teluru, koloidní částice syntetického barveného latexu.φ φ • φ
- 4. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že receptor citlivý na antibiotika s beta-laktamovým jádrem je kopulován s označovacím činidlem vybraným ze souboru, zahrnujícího fluorescenční látky.
- 5. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že receptor citlivý na antibiotika s beta-laktamovým jádrem je kopulován s označovacím činidlem vybraným ze souboru, zahrnujícího enzymy jako jsou alkalická fosfatáza, peroxydáza, beta-laktamázy.
- 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že receptor citlivý na antibiotika je kopulován s enzymatickým označovacím činidlem chemickou nebo genetickou cestou.
- 7. Způsob podle podle jednoho z nároků 3 až 6, vyznačující se tím, že kopulace receptoru citlivého na antibiotika s beta-laktamovým jádrem s označovacím činidlem se provede před etapou a).
- 8. Způsob podle podle jednoho z nároků 3 až 6, vyznačující se tím, že kopulace receptoru citlivého na antibiotika s beta-laktamovým jádrem s označovacím činidlem se provede během etapy a) nebo po etapě a).
- 9. Způsob podle podle jednoho z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že etapy a) nebo b) se provedou najednou.
- 10. Způsob podle podle jednoho z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že nosič používaný během etapě b) je vybrán ze souboru, zahrnujícího zkumavky, desky nebo tyčky pokryté9 9 • 9 • · • 99 referenčním antibiotikem.
- 11. Způsob podle podle jednoho z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že nosič používaný během etapy b) je testovací zařízení obsahující pevný nosič (1), který sestává z prvního a druhého konce, na který jsou postupně přichyceny, počínaje od prvního konce,- membrána (2) umožňující purifikaci analyzované tekutiny,- membrána (3), na kterou je imobilizována jedna nebo více záchytných látek- absorbční membrána (4).
- 12. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že nosič používaný během etapy b) je tvořen souborem kuliček, které jsou nebo nejsou magnetické.
- 13. Testovací souprava pro detekci antibiotika v biologické tekutině způsobem podle jednoho z nároků 1 až 12, obsahující alespoň jedno rozpoznávací činidlo citlivé na přítomnost antibiotik s beta-laktamovým jádrem, získané z Bacillus licheniformis, a alespoň jedno referenční antibiotikum imobilizované na nosiči.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE9800485A BE1012049A6 (fr) | 1998-06-25 | 1998-06-25 | Procede pour la determination d'antibiotique a noyau beta-lactame dans un liquide biologique. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20004790A3 true CZ20004790A3 (cs) | 2001-07-11 |
| CZ298192B6 CZ298192B6 (cs) | 2007-07-18 |
Family
ID=3891319
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20004790A CZ298192B6 (cs) | 1998-06-25 | 1999-03-30 | Zpusob urcování antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologické tekutine |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6524804B2 (cs) |
| EP (1) | EP1082451B1 (cs) |
| JP (1) | JP4426103B2 (cs) |
| KR (1) | KR100577700B1 (cs) |
| CN (1) | CN1145029C (cs) |
| AR (1) | AR018821A1 (cs) |
| AT (1) | ATE331808T1 (cs) |
| AU (1) | AU737906B2 (cs) |
| BE (1) | BE1012049A6 (cs) |
| BR (1) | BR9911500B1 (cs) |
| CA (1) | CA2335734C (cs) |
| CZ (1) | CZ298192B6 (cs) |
| DE (1) | DE69932161T2 (cs) |
| DK (1) | DK1082451T3 (cs) |
| ES (1) | ES2268860T3 (cs) |
| IL (1) | IL140258A (cs) |
| NO (1) | NO20006574L (cs) |
| NZ (1) | NZ508965A (cs) |
| PL (1) | PL195495B1 (cs) |
| PT (1) | PT1082451E (cs) |
| RU (1) | RU2213973C2 (cs) |
| TR (1) | TR200003833T2 (cs) |
| WO (1) | WO1999067416A2 (cs) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8481334B1 (en) | 2001-11-06 | 2013-07-09 | Charm Sciences, Inc. | Method of attaching a ligand to a solid support |
| EP1712914A1 (fr) * | 2005-04-14 | 2006-10-18 | Unisensor S.A. | Procédé in vitro pour la detection et l'identification simultanées d'antibiotiques de classes differentes et trousse de diagnostic correspondante |
| RU2379686C2 (ru) * | 2007-12-17 | 2010-01-20 | Федеральное агентство по высокотехнологичной медицинской помощи Федеральное государственное учреждение "Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии" (ФГУ УрНИИДВиИ Росмедтехнологий) | Способ определения концентрации препаратов бензилпенициллина в биологических жидкостях |
| PL385415A1 (pl) * | 2008-06-11 | 2009-12-21 | Marek Ciesielski | Sposób wykrywania bakteriooporności, zestaw diagnostyczny oraz zastosowanie oznaczania obecności leku i/lub produktów jego rozpadu |
| RU2406086C2 (ru) * | 2008-06-30 | 2010-12-10 | Михаил Тимофеевич Александров | Способ выбора предпочтительного антимикробного препарата |
| US20110177549A1 (en) * | 2008-07-10 | 2011-07-21 | Tacount Exact Ltd. | Method, kit and system for culturable cell count |
| GB0914001D0 (en) * | 2009-08-11 | 2009-09-16 | Benson Jennifer M | Biodegradable pregnancy test |
| WO2011091805A1 (en) * | 2010-01-29 | 2011-08-04 | Tartu Ülikool (University Of Tartu) | On-line system, method of its calibration and simultaneous detection of antibiotic residues and their concentration in milk |
| CN102192980B (zh) * | 2010-03-08 | 2014-04-09 | 苏州浩欧博生物医药有限公司 | 非金属胶体粒子免疫分析方法 |
| US9182397B2 (en) * | 2011-09-16 | 2015-11-10 | Dsm Ip Assets B.V. | Immunoassay for detecting antibiotics |
| WO2013037888A1 (en) * | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Immunoassay for detecting antibiotics |
| WO2013037886A1 (en) * | 2011-09-16 | 2013-03-21 | Dsm Ip Assets B.V. | Immunoassay for detecting antibiotics |
| US9689021B2 (en) * | 2011-10-14 | 2017-06-27 | Université de Liège | Method for measuring beta-lactam antibiotics |
| JP6486564B2 (ja) * | 2015-11-20 | 2019-03-20 | セントリエント ファーマシューティカルズ ネザーランズ ビー．ヴイ． | 廃棄物中の抗生物質の決定アッセイ |
| CA3006958C (en) | 2016-12-28 | 2022-10-04 | Frank Eric Klein | Implement analyzing device and method for utilizing the same |
| USD834721S1 (en) | 2017-03-03 | 2018-11-27 | Neogen Corporation | Assay cartridge |
| JP6987593B2 (ja) * | 2017-10-16 | 2022-01-05 | 株式会社ニップン | 変異体受容体タンパク質 |
| JP7206645B2 (ja) * | 2018-06-08 | 2023-01-18 | 株式会社島津製作所 | 流体デバイスの製造方法および流体デバイス |
| CN111830015B (zh) * | 2019-04-18 | 2022-12-09 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一种定量检测抗生素的方法 |
| CN110241056A (zh) * | 2019-07-19 | 2019-09-17 | 石河子大学 | 一种芽孢杆菌、利用该芽孢杆菌进行抗生素残留检测的方法及其应用 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4239852A (en) * | 1978-06-12 | 1980-12-16 | Penicillin Assays, Inc. | Antibiotic detection method |
| US4762782A (en) | 1985-05-16 | 1988-08-09 | Micromol Corporation | Assay for Beta-lactam antibiotics |
| US5028535A (en) * | 1989-01-10 | 1991-07-02 | Biosite Diagnostics, Inc. | Threshold ligand-receptor assay |
| US5434053A (en) * | 1992-10-06 | 1995-07-18 | Gist-Brocades N.V. | Detection of antibiotics |
| ES2284210T3 (es) * | 1997-07-16 | 2007-11-01 | Charm Sciences Inc. | Un dispositivo de ensayo y un metodo para detectar la presencia de un analito residual en una muestra. |
| US5985675A (en) * | 1997-12-31 | 1999-11-16 | Charm Sciences, Inc. | Test device for detection of an analyte |
| CN1126956C (zh) * | 1997-10-07 | 2003-11-05 | Ucb公司 | 检测液体奶制品中待分析物的试验装置及方法 |
-
1998
- 1998-06-25 BE BE9800485A patent/BE1012049A6/fr not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-26 US US09/276,923 patent/US6524804B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 CN CNB998094056A patent/CN1145029C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-30 ES ES99919158T patent/ES2268860T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 EP EP99919158A patent/EP1082451B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 WO PCT/EP1999/002166 patent/WO1999067416A2/fr active IP Right Grant
- 1999-03-30 NZ NZ508965A patent/NZ508965A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 KR KR1020007014639A patent/KR100577700B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-30 PT PT99919158T patent/PT1082451E/pt unknown
- 1999-03-30 CZ CZ20004790A patent/CZ298192B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 DK DK99919158T patent/DK1082451T3/da active
- 1999-03-30 AT AT99919158T patent/ATE331808T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 JP JP2000556056A patent/JP4426103B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-30 IL IL14025899A patent/IL140258A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 AU AU37032/99A patent/AU737906B2/en not_active Ceased
- 1999-03-30 TR TR2000/03833T patent/TR200003833T2/xx unknown
- 1999-03-30 CA CA002335734A patent/CA2335734C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-30 RU RU2001102261/13A patent/RU2213973C2/ru active
- 1999-03-30 PL PL99345396A patent/PL195495B1/pl unknown
- 1999-03-30 BR BRPI9911500-0A patent/BR9911500B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-03-30 DE DE69932161T patent/DE69932161T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-31 AR ARP990101468A patent/AR018821A1/es active IP Right Grant
-
2000
- 2000-12-21 NO NO20006574A patent/NO20006574L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-06-14 US US10/170,343 patent/US8106155B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20004790A3 (cs) | Způsob určování antibiotik s beta-laktamovým jádrem v biologické tekutině | |
| AU738143B2 (en) | Assay device for determining analytes in a liquid dairy product | |
| EP0047784A1 (en) | Detection of antibiotics in milk | |
| US20040235195A1 (en) | Methods for measuring and diagnosing endotoxin, sensor therefor, and method for producing and reusing the sensor | |
| EP0125368A1 (en) | A method of immunoassay detection by reaction-rate potentiometry using fluoride ion-selective electrode | |
| MXPA00012583A (en) | METHOD FOR DETERMINING ANTIBIOTICS WITH&bgr;-LACTAM CORE IN A BIOLOGICAL FLUID | |
| MXPA00003325A (en) | Testing device for determining analytes in a liquid dairy product | |
| US20040005627A1 (en) | Microvolume detecting method and device | |
| JP2000037199A (ja) | 病原微生物及び微量成分の高感度測定法 | |
| WO2004113921A9 (ja) | 抗梅毒トレポネーマ抗体測定試薬及び抗梅毒トレポネーマ抗体の測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20170330 |