CZ20004155A3 - Molekuly nukleových kyselin kódující enzymy z pšenice, které se podílejí na syntéze škrobu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká molekul nukleových kyselin, kódujících enzymy, které se podílejí' na syntéze škrobu v rostlinách. Tyto enzymy zahrnují isoamylasy ze pšenice. Dále se řešení týká vektorů a hostitelských buněk, obsahujících uvedené molekuly nukleových kyselin, zejména transformovaných rostlinných buněk a rostlin, které je možno z těchto buněk regenerovat a které vykazují zvýšenou nebo sníženou aktivitu isoamylas.

Description

MOLEKULY NUKLEOVÝCH KYSELIN KÓDUJÍCÍ ENZYMY Z PŠENICE, KTERÉ SE PODÍLEJÍ NA SYNTÉZE ŠKROBU

Oblast techniky

Tento vynález se týká molekul nukleových kyselin, kó* dujících enzym z pšenice, který se podílí na syntéze škrobu v rostlinách. Tímto enzymem je isoamylasa.

Dále se tento vynález týká vektorů, hostitelských buněk a rovněž rostlinných buněk a rostlin, které obsahují molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu.

Dále je popsán postup pro získávání transgenních rostlin, které po zavedení molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu syntetizují škrob s některou pozměněnou vlastností.

Dosavadní stav techniky

V poslední době neustále stoupá význam rostlinných obsahových látek jako obnovitelných zdrojů surovin, a proto je jedním z úkolů biotechnologického výzkumu usilovat o přizpůsobení těchto rostlinných surovin požadavkům zpracovatelského průmyslu. Aby byla oblast použitelnosti těchto obnovili' telných surovin co nej širší, je nezbytné dosáhnout jejich maximální rozmanitosti.

Polysacharidy představují vedle olejů, tuků a proteinů důležitou obnovitelnou rostlinnou surovinu. Nejdůležitěj9 · • · · · « · « ší postavení mezi polysacharidy zaujímá vedle celulózy škrob, který je jednou z hlavních zásobních látek ve vyšších rostlinách. Jednou z nejdůležitějších kulturních rostlin je pšenice, z níž se získává v Evropském společenství 20 % z celkové výroby škrobu.

Polysacharid škrob je polymerem, skládajícím se z chemicky jednotných základních jednotek, a to z molekul glukosy. Přitom jde o velice složitou směs různých molekulárních forem, které se liší svým polymeračním stupněm, větvením glukosových řetězců a jejich délkou, a kterou je kromě toho možno derivátizovat, například fosforylovat. To znamená, že škrob není jednotnou surovinou. Amylosa, která je tvořena v podstatě nerozvětveným polymerem, skládajícím se z 1,4-glykosidicky vázaných molekul glukosy, se odlišuje od amylopektinu, který je tvořen komplexní směsí různě rozvětvených glukosových řetězců. Na tomto rozvětvení se podílejí i 1,6-glykosidické vazby. Škrob syntetizovaný v pšenici obsahuje cca 11 až 37 % amylosy.

Aby bylo možno zajistit použitelnost vhodných škrobů pro nej různější průmyslové účely, je zapotřebí mít k dispozici takové rostliny, které jsou schopny syntetizovat modifikované škroby, které by byly obzvláště vhodné pro různé účely použití. Jednou z možností pro získávání takovýchto rostlin jsou šlechtitelská opatření. Šlechtitelská opatření se však vzhledem k polyploidnímu charakteru pšenice (tetraa hexaploid) uplatňují velmi obtížně. Teprve nedávno se podařilo křížením přírodních mutantů pšenice získat voskovitou (neobsahující amylosu) pšenici (Nakamura a spol., Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 253 - 259).

Alternativou ke šlechtitelským opatřením je cílená ge• « • · · · ·«·· *·· • · · · · · · <> ♦ V · · * · · · • · · · · * · ········ · · ··· ·· · nově-technologická modifikace rostlin, produkujících škrob. Předpokladem k tomu však je identifikace a charakterizace enzymů, které se podílejí na syntéze nebo na modifikaci škrobu a rovněž izolace molekul nukleových kyselin, které tyto enzymy kóduj í.

Cesty biochemické syntézy, vedoucí k výstavbě škrobu, jsou v podstatě známy. Syntéza škrobu v rostlinných buňkách probíhá v plastidech. Ve fotosynteticky aktivních tkáních jsou to chloroplasty, ve fotosynteticky inaktivních škrobových zásobních tkáních to jsou amyloplasty.

Pro další cílenou genově-technickou přeměnu větvení škrobu syntetizovaného v rostlinách je stále nezbytné identifikovat DNA-sekvence kódující enzymy, které se na metabolismu škrobu podílejí, zejména na rozvětvování řetězce nebo jeho odbourávání.

Vedle takzvaných Q-enzymů, které rozvětvení do molekuly škrobu zavádějí, se v rostlinách vyskytují enzymy, které mohou rozvětvení odbourat. Tyto enzymy se označují jako Debranching-enzymy a podle jejich substrátové specificity se dělí do třech skupin:

(a) Pullulanasy, které kromě pullulanu potřebují jako substrát i amylopektin, se vyskytují v mikroorganismech, např. Klebsiella, a v rostlinách.

V rostlinách se tyto enzymy označují i jako R-enzymy.

(b) Isoamylasy, které nepotřebují jako substrát pullulan, nýbrž glykogen a amylopektin, se rovněž vyskytují v mikroorganismech a v rostlinách. Isoamylasy byly popsány např. v kukuřici (Manners & Carbohydr. Res. 9 (1969), 107) a bramborách (Ishizaki a spol., Agric.

Biol. Chem. 47 (1983), 771 - 779).

(c) Amylo-1,6-glukosidasy jsou popisovány u savců a kvasinek a potřebují jako substrát hraniční dextriny.

Li a spol. (Plant Physiol. 98 (1992), 1277 - 1284) prokázali v cukrové řepě vedle pěti endo- a dvou exoamylas pouze jeden Debranching-enzym pullulanasového typu. Tento enzym o velikosti cca 100 kD s optimálním pH 5,5, je lokalizován v chloroplastech. Rovněž u špenátu byl popsán jeden Debranching-enzym, který jako substrát využíval pullulan.

Jak Debranching-enzym ze špenátu, tak i z cukrové řepy mají při reakci s amylopektinem jako substrátem v porovnání s pullulanem jako substrátem pětkrát nižší aktivitu (Ludwig a spol., Plant Physiol. 74 (1984), 856 - 861; Li a spol. (Plant Physiol. 98 (1992), 1277 - 1284).

U hospodářsky významné kulturní rostliny ukládající škrob - u brambor - sledovali aktivitu Debranching-enzymu Hobson a spol. (J.Chem.Soc, (1951), 1451). Tito autoři prokázali, že příslušný enzym na rozdíl od Q-enzymu nevykazuje při prodlužování řetězce žádnou aktivitu, nýbrž že pouze hydrolyzuje alfa-1,6-glykosidické vazby. Tento enzym však doposud nebylo možno podrobněji charakterizovat.

U brambor byl již postup pro čištění Debranching-enzymu a rovněž parciálních peptidových sekvencí čištěného proteinu navržen (VO 95/04826). U špenátu bylo mezitím popsáno čištění Debranching-enzymu a rovněž izolace příslušné cDNA (Renz a spol., Plant Physiol. 108 (1995), 1342).

U kukuřice byla v literatuře dosud popsána pouze existence jednoho Debranching-enzymu. Tento enzym byl podle své substrátové specificity zařazen do skupiny isoamylas (viz např. Hannah a spol., Scientia Horticulturae 55 (1993), 177 - 197 nebo Garwood (1984) v publikaci Starch Chemistry and Technology, Vhistler, R.L., BeMiller, J.N., Puschall, E.F. (eds.), Academie Press San Diego, New York, Boston, 25-86). Příslušné mutanty byly označeny jako cukerné (sugary). Tento gen cukerného centra (sugary-Locus) byl krátce klonován (viz James a spol., Plant Cell 7 (1995), 417 - 429). Kromě centra sugary-Locus nebylo v kukuřici prokázáno žádné jiné genové centrum (Genlocus), které by kódovalo protein s Debranching-enzymovou aktivitou. Dosud neexistují ani žádné důkazy o tom, že by se v kukuřici vyskytovaly jiné formy Debranching-enzymů. Pro získání transgenní rostliny kukuřice, která by neměla žádnou Debranching-enzymovou aktivitu, například pro dosažení vyššího stupně rozvětvení amylopektinu, je nezbytné identifikovat všechny formy Debranching-enzymu které se v kukuřici vyskytují a izolovat příslušné geny nebo cDNA-sekvence.

Pro získání dalších možností pro provádění přeměn jakýchkoli škrobnatých rostlin, přednostně obilí, a zejména pšenice tak, aby tyto rostliny syntetizovaly modifikovaný škrob, je zapotřebí identifikovat příslušné DNA-sekvence, které kódují další isoformy enzymů, ovlivňující rozvětvení řetězce.

Podstata vynálezu

Cílem tohoto předkládaného vynálezu je příprava molekul nukleových kyselin, které kódují enzymy, podílející se na biosyntéze škrobu a jejich pomocí získávání genovětechnicky modifikované rostliny, které umožní výrobu rošt6 • · · · · • « · linných škrobů se změněnými chemickými a/nebo fyzikálními vlastnostmi.

Tento vynález se tedy týká molekul nukleových kyselin kódující protein s funkcí isoamylasy z pšenice, především proteinu, který je definován zejména aminokyselinovou sekvencí uvedenou pod Seq ID No.3 nebo 7. Tento vynález se zejména týká molekuly nukleových kyselin, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou pod Seq ID No.l, 2 nebo 6 nebo její část, přednostně molekulu obsahující kódující oblast uvedenou v Seq ID No.l, 2 nebo 6 a rovněž příslušné ribonukleotidové sekvence. Obzvláště výhodná je molekula nukleových kyselin obsahující další regulační prvky, které uskutečňují transkripci a rovněž případně translaci uvedených molekul nukleových kyselin.

Dále se tento vynález týká molekul nukleových kyselin které se s některými molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu hybridizují.

Předmětem tohoto vynálezu je i molekula nukleových kyselin, která kóduje isoamylasu z pšenice a jejíž sekvence se na základě degenerace genetického kódu liší od nukleotidové sekvence výše uvedených molekul.

Tento vynález se týká i molekuly nukleových kyselin, která obsahuje sekvenci komplementární s úplnými výše uvedenými sekvencemi nebo s jejich částmi.

Pojem hybridizace znamená v rámci tohoto vynálezu hybridizací za konvenčních hybridizačních podmínek, výhodně za přísně definovaných podmínek popsaných například v publikaci Sambrook a spol., Molecular Cloning, • * • »

Ί

A Laboratory Manual, 2. vyd. (1989) Cold Spring Harbor

Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Obzvláště výhodně se hybridizace” provádí za následujících podmínek:

Hybridizační pufr: 2 x SSC; 10 x roztok Denhardt (Fikoll

400 + PEG + BSA; poměr 1 : 1 : 1); 0,1 % SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na₂HP0₄; 250 pg/ml DNA sledího sperma (Heringssperma-DNA);

pg/ml tRNA; nebo 0,25 M natriumfosfátový pufr pH 7,2; 1 mM EDTA; 7 % SDS;

Hybridizační teplota: T = 65 až 70 °C

Promývací pufr: 0,2 x SSC; 0,1 % SDS;

Promývací teplota: T = 40 až 75 °C

Molekuly nukleových kyselin, hybridizované s molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, mohou principiálně kódovat isoamylasy z jakékoli rostliny pšenice, která tyto proteiny exprimuje.

Molekuly nukleových kyselin, hybridizované s molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, mohou být například izolovány z genomických pšenic nebo pšeničných tkání nebo z cDNA-knihoven pšenic nebo pšeničných tkání. Alternativně mohou být připraveny genově-technickými metodami nebo chemickou syntézou.

Identifikaci a izolaci těchto molekul nukleových kyselin je možno provádět s použitím molekul podle tohoto

Φ Φ φ · ·· · ·· φφφφ · φ · · · ♦ · • φ φ φ φ φ · φ •φφφφφφ φφ φφφ ·· φφφ vynálezu nebo částí těchto molekul respektive s použitím reverzních komplementů těchto molekul, například pomocí hybridizace podle standardního postupu (viz například Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Jako vzorek pro hybridizaci je možno použít například molekuly nukleových kyselin, obsahující přesně stejné nebo v podstatě stejné nukleotidové sekvence nebo jejich části, uvedené pod Seq ID No.l, 2 nebo 6. U těchto fragmentů použitých jako vzorek pro hybridizaci, může jít i o syntetické fragmenty, připravené pomocí běžných syntetických technik, jejichž sekvence v podstatě odpovídá molekulám nukleových kyselin pole tohoto vynálezu.

Molekuly, hybridizované s molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, zahrnují i fragmenty, deriváty a alelické varianty výše uvedených molekul nukleových kyselin, které kódují pšeničné isoamylasy podle tohoto vynálezu. Fragmenty se přitom rozumí části molekul nukleových kyselin, které jsou dostatečně dlouhé k tomu, aby byly schopny kódovat uvedené proteiny. Výraz derivát v této souvislosti znamená, že sekvence těchto molekul se od sekvencí výše uvedených molekul nukleových kyselin liší na jednom nebo několika místech a že vykazují vysoký stupeň homologie s těmito sekvencemi. Homologie znamená identitu sekvence minimálně ze 40 %, zejména identitu minimálně ze 60 %, obzvláště nad 80 % a obzvláště výhodně nad 90 %. Odchylky od dříve popsaných molekul nukleových kyselin mohou vznikat vyštěpením, substitucí, insercí nebo rekombinací.

Homologie dále znamená, že existuje funkční a/nebo

strukturní ekvivalence mezi příslušnými molekulami nukleových kyselin nebo jimi kódovanými proteiny. U molekul nukleových kyselin, které jsou homologické s výše uvedenými molekulami a představují deriváty těchto molekul, jde zpravidla o variace těchto molekul, které představují modifikace se stejnými biologickými funkcemi. Přitom může jít jak o přirozeně se vyskytující variace, například o sekvence z jiných organismů, tak o mutanty, přičemž tyto mutanty mohou mít přirozený výskyt nebo mohou být zaváděny cílenou mutagenezi. Dále se jedná o variace synteticky připravených sekvencí. U alelických variant může jít jak o varianty s přirozeným výskytem, tak i o varianty připravené synteticky nebo získané rekombinantní DNA-technikou.

Isoamylasy, kódované různými variantami molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, vykazují určité společné vlastnosti. K nim patří například enzymová aktivita, molekulová hmotnost, imunologická reaktivita, konformace a podobně a rovněž fyzikální vlastnosti, jako je například pohyblivost při gelové elektroforéze, chování při chromatografii, sedimentační koeficienty, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, elektrický náboj, stabilita; pH-optimum, teplotní optimum a podobně.

Proteinem, kódovaným molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, je isoamylasa z pšenice. Tyto proteiny vykazují určité homologické oblasti s dosud známými isoamylasami z jiných rostlinných druhů.

Molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu mohou být DNA-molekuly, zejména cDNA nebo genomické molekuly. Dále mohou být nukleovými kyselinami podle tohoto vynálezu RNA-molekuly, které mohou vzniknout například

transkripcí některé molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu. Nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu mohou být například získávány z přírodních zdrojů nebo technikou rekombinace či synteticky.

Předmětem tohoto vynálezu jsou i oligonukleotidy specificky hybridizované s některou molekulou nukleových kyselin podle tohoto vynálezu. Tyto oligonukleotidy mají výhodně délku minimálně 10, obzvláště minimálně 15 a obzvláště výhodně délku minimálně 50 nukleotidů. Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu se vyznačují tím, že se hybridizují specificky s molekulami nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, to znamená, že se sekvencemi nukleových kyselin, které kódují jiné proteiny, zejména jiné isoamylasy, nepodléhají hybridizaci nebo se hybridizují jenom v nepatrném rozsahu. Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu mohou být použity například jako primér pro PCR-reakci nebo jako hybridizačni vzorek pro izolaci příbuzných genů. Mohou tvořit i součást antisense-konstruktů nebo molekul DNA, kódujících vhodný ribozym.

Tento vynález dále zahrnuje vektory, zejména plasmidy, kosmidy, fagemidy, viry, bakteriofágy a další vektory, běžné v genové technice, které v sobě obsahují výše uvedené molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu. Tyto vektory jsou vhodné pro transformaci prokaryontických nebo eukaryontických, výhodně rostlinných buněk.

Obzvláště výhodné jsou vektory, umožňující integraci molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu do genomu rostlinné buňky, případně spolu se stínícími regulačními oblastmi. Jako příklady je možno uvést binární vektory, které je možno použít při transferu genů zprostředkovaném • ·

agrobakteriemi. Výhodná je syntéza přenositelných nebo případně nepřenositelných molekul nukleových kyselin v transformovaných pro- nebo eukaryontických buňkách integrací molekuly nukleových kyselin v sense- nebo anti-sense-orientaci podle tohoto vynálezu.

Pojem vektor označuje všeobecně vhodný, odborníkům známý, pomocný prostředek, umožňující cílený transfer jedné jedno- nebo dvouvláknové molekuly nukleové kyseliny do hostitelské buňky, jako jsou např. DNA-nebo RNA-virus, fragment viru, plasmidový konstrukt který za přítomnosti nebo nepřítomnosti regulačních prvků může být vhodný pro transfer nukleových kyselin do buněk, nosné materiály jako jsou skleněná vlákna nebo i částice kovů, používané například při postupu particle gun (vstřelování částic), může však jít i o molekulu nukleových kyselin, kterou je možno vložit přímo do buňky vhodným chemickým nebo fyzikálním postupem.

Při výhodném způsobu provedení jsou molekuly nukleových kyselin, obsažené ve vektorech, vázány s regulačními prvky, které umožňují transkripci a syntézu přenositelné RNA do pro- nebo eukaryontických buněk nebo - pokud je to žádoucí - které umožňují syntézu nepřenositelné RNA.

Exprese molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu v prokaryontických buňkách, například v Escherichia coli, má význam pro přesnější charakterizaci enzymatické aktivity enzymů, které kódují tyto molekuly. Obzvláště je možné charakterizovat produkt, syntetizovaný příslušnými enzymy za nepřítomnosti jiných enzymů, podílejících se na syntéze škrobu v rostlinných buňkách. To umožňuje vyvozovat závěry o funkci příslušného proteinu při syntéze škrobu v rostlinných buňkách.

Kromě toho je možné pomocí běžných postupů molekulární biologie (viz například Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) zavádět různé mutace do molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, přičemž se při této syntéze získají proteiny s případně přeměněnými biologickými vlastnostmi. To umožňuje přípravu delečních mutantů, u nichž postupným vyštěpováním z 5’- nebo 3’- konce je možno získat kódující DNA-sekvenci molekul nukleových kyselin, které vedou k syntéze příslušných zkrácených proteinů. Tato delece na 5’-konci nukleotidové sekvence umožňuje například identifikovat aminokyselinové sekvence, které způsobují translokaci enzymů v plastidech (transitpeptidy). To umožňuje provádět cílenou přípravu enzymů, které po odstranění příslušných sekvencí již nejsou lokalizovány v plastidech, nýbrž v cytosolu, nebo které jsou po adici jiných signálních sekvencí lokalizovány v jiných částech buňky.

Dále je možno provádět zavádění lokálních mutací do pozic, v nichž změna aminokyselinové sekvence ovlivňuje například enzymovou aktivitu nebo regulaci enzymu. Tímto způsobem je možno například získat mutanty se změněnou hodnotou K_m nebo mutanty, které již nepodléhají normálním regulačním mechanismům v buňce působením allosterické regulace nebo kovalentní modifikace.

Dále je možno získat mutanty proteinů podle tohoto vynálezu, které mají změněnou substrátovou nebo produktovou specificitu. Kromě toho je možno připravovat mutanty proteinů, které vykazují změněný profil aktivita - teplota.

• · · · · · * ······· ·· · · · ·· ·

Při provádění genově-technické modifikace prokaryontických buněk je možno vkládat molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nebo jejich části do plasmidů, které umožňuj i provádět mutagenezí nebo změnu sekvence rekombinací DNA-sekvencí. Pomocí standardních postupů (viz Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) je možno provádět záměny bází nebo připojovat přirozené nebo syntetické sekvence. Pro vzájemné spojování DNA-fragmentů je možno k těmto fragmentům připojit spojovací nebo vázací skupiny (Adaptoren o. Linker). Rovněž je možno používat manipulace, které uvolňují příslušná restrikční místa štěpení, nebo které nadbytečnou DNA nebo restrikční místa odstraňují. V případech, kde přicházejí v úvahu inserce, delece nebo substituce, je možno při mutagenezí in vitro používat primer repair”, restrikci nebo ligaci. Jako analytické metody byly obecně použity sekvenční analýza, restrikční analýza nebo jiné biochemické nebo molekulárněbiologické metody.

V dalších formách provedení se tento vynález týká hostitelských buněk, zejména pro- nebo eukaryontických buněk, které jsou transformovány s jednou z výšeuvedených molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nebo s jedním z vektorů podle tohoto vynálezu, a rovněž buněk, které z takto transformovaných buněk vznikají a obsahují molekulu nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nebo vektor. Přitom se přednostně jedná o pro- nebo eukaryontické buňky, zejména o rostlinné buňky.

Předmětem tohoto vynálezu jsou dále proteiny, které je možno připravit rekombinantním způsobem, a které mají aktivitu isoamylasy, kódované molekulami nukleových kyselin

podle tohoto vynálezu a rovněž postup jejich přípravy, přičemž hostitelská buňka podle tohoto vynálezu je kultivována za vhodných, odborníkům známých podmínek, umožňujících syntézu proteinu podle tohoto vynálezu a konečná izolace tohoto proteinu z hostitelských buněk a/nebo z kultivačního media.

Molekuly nukleových kyselin, získané podle tohoto vynálezu, nyní umožňují pomocí genově-technických metod provádět cílené zásahy do metabolismu škrobu v rostlinách a tento metabolismus měnit do té míry, že dojde k syntéze takových modifikovaných škrobů, které ve srovnání se známými škroby budou mít jiné fyzikálně-chemické vlastnosti, jako jsou například poměr amylosy a amylopektinu, stupeň rozvětvení řetězce, průměrná délka řetězce, obsah fosfátů, vlastnosti při mazovatění, vlastnosti při tvorbě gelu nebo filmu, velikost škrobových zrn a/nebo jejich tvar.

Je možno rovněž provádět expresi molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu v rostlinných buňkách pro zvýšení aktivity příslušné isoamylasy, nebo zavádět molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu do buněk, které tento enzym normálně neexprimují. Exprese molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu poskytuje i možnost snížit přirozenou aktivitu isoamylasy podle tohoto vynálezu v rostlinných buňkách. Dále je možno molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu modifikovat postupy, které jsou odborníkům známy, aby se získaly isoamylasy podle tohoto vynálezu, které již nepodléhají přirozeným regulačním mechanismům vlastní buňky, respektive které mají změněný profil teplota - aktivita nebo změněné specifické vlastnosti substrátu respektive produktu.

• · ·

Při expresi molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu v rostlinách existuje v zásadě možnost lokalizovat syntetizovaný protein do libovolné části rostlinné buňky.

Aby bylo možno provést lokalizaci do určité části rostlinné buňky, musí se vyštěpit sekvence zajišťující lokalizaci v plastidech a zbývající kódující oblast případně spojit s DNA-sekvencemi, které zajišťují lokalizaci do příslušného místa. Takovéto sekvence jsou známy (viz např. Braun a spol., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Volter a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnenwald a spol., Plant J. 1 (1991), 95-106).

Tento vynález se týká i postupu přípravy transgenních rostlinných buněk, které se transformují s molekulou nukleových kyselin nebo s vektorem podle tohoto vynálezu, přičemž molekula nukleových kyselin podle tohoto vynálezu nebo vektor podle tohoto vynálezu se integruje do genomu rostlinné buňky, a dále se týká i transgenních rostlinných buněk, transformovaných pomocí některé molekuly nukleových kyselin nebo vektoru podle tohoto vynálezu, a rovněž zahrnuje transgenní rostlinné buňky, které jsou z takto transformovaných buněk odvozeny. Buňky podle tohoto vynálezu obsahují jednu nebo více molekul nukleových kyselin nebo vektorů podle tohoto vynálezu, přičemž tyto molekuly nebo vektory jsou přednostně spojeny s regulačními DNA-prvky, které zajišťují transkripci v rostlinných buňkách, zejména s vhodným promotorem. Tyto buňky je možno odlišit od přirozených rostlinných buněk mimo jiné i podle toho, že obsahují molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, které se v těchto buňkách normálně nevyskytují, nebo podle toho, že takováto molekula je integrována na určitém místě genomu buňky, kde se jinak nevyskytuje, tedy v jiném genomickém okolí. Dále je možno tyto transgenní rostlinné buňky podle

tohoto vynálezu odlišit od přirozených rostlinných buněk tím, že tyto buňky obsahují ve svém genomu stabilně integrovanou minimálně jednu kopii molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, případně navíc ke kopiím této molekuly s přirozeným výskytem v buňkách. Jestliže jde u molekuly (molekul) nukleových kyselin zavedených do buněk o kopie navíc k molekulám s přirozeným výskytem v buňce, je možno rostlinné buňky podle tohoto vynálezu od přirozených buněk odlišit zejména tím, že tato (tyto) kopie navíc je/jsou lokalizovány v genomu na místě (místech), na nichž se v přírodě nevyskytuje (nevyskytují). To je možno snadno prokázat například pomocí Southern-Blot-analýzy podle postupů, které jsou odborníkům známy.

Jestliže je molekula nukleových kyselin podle tohoto vynálezu zavedená do rostlinného genomu ve vztahu k rostlinné buňce heterologní, obsahují transgenní rostlinné buňky transkripty molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, což je možno snadno prokázat např. Northern-Blotanalýzou podle postupů, které jsou odborníkům známy.

Jestliže je molekula nukleových kyselin podle tohoto vynálezu homologní ve vztahu k rostlinné buňce, je možno buňky podle tohoto vynálezu odlišit od přirozeně se vyskytujících buněk například podle další exprese molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu. Transgenní rostlinné buňky obsahují výhodně více transkriptů molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu. To je možno prokázat například pomocí Northern-Blot-analýzy. Více znamená přitom výhodně minimálně o 10 % víc, obzvláště o 20 % víc a především minimálně o 50 % více transkriptů než odpovídající netransformované buňky. Přednostně vykazují tyto buňky rovněž odpovídající (minimálně 10%, 20% nebo 50%) zvýšení ·· ·· • · · ·

aktivity nebo případně snížení aktivity proteinů podle tohoto vynálezu. Transgenní rostlinné buňky je možno regenerovat na celé rostliny pomocí postupů, které jsou odborníkům známy.

Předmětem tohoto vynálezu je i postup získávání transgenních rostlin, přičemž jednu nebo několik molekul nukleových kyselin nebo vektorů podle tohoto vynálezu se integruje do genomu rostlinné buňky a celá rostlina se z této buňky regeneruje. Dále jsou předmětem tohoto vynálezu rostliny, které výše uvedené transgenní rostlinné buňky obsahují. Tyto transgenní rostliny mohou být principiálně rostliny jakéhokoli rostlinného druhu, to znamená jak rostliny monokotylní, tak i dikotylní. Přednostně se jedná o užitkové rostliny, obzvláště o rostliny, které syntetizují nebo ukládají škrob, obzvláště výhodně žito, ječmen, oves, pšenice, proso, ságo, kukuřice, rýže, hrách, dřeňový hrách, maniok, brambory, rajčata, řepka, sojové boby, konopí, len, slunečnice, krmný hrách nebo maranta a především pšenice, kukuřice, rýže a brambory.

Tento vynález se rovněž týká množitelského materiálu rostlin podle tohoto vynálezu, jako jsou například plody, semena, hlízy, části kořenů, semenáčky, sazenice, pletiva, protoplasty, buněčné kultury a podobně.

Tento předkládaný vynález se dále týká způsobu výroby modifikovaného škrobu, zahrnující operaci extrakce škrobu z výše uvedených rostlin podle tohoto vynálezu a/nebo ze škrobnatých částí těchto rostlin.

Postupy pro extrakci škrobu z rostlin nebo z jejich škrobnatých částí, zejména z pšenice, jsou odborníkům známé, ·· ·« ·· · 9· « « · 9 * φ · · « · · • · «·· · · · ··«··!·· ·· »·· ·· ··· viz například Eckhoff a spol. (Cereal Chem. 73 (1996) 54 - 57 Starch - Chemistry and Technology (vydavatel: Vhistler, BeMiller a Paschall (1994), 2. vydání, Academie Press lne. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; viz například kapitola XII, str. 412 - 468: Škroby z kukuřice a sorghumu: Výroba; Vatson; kapitola XIII, str. 469 - 479: Tapiokový, marantový a ságový škrob: Výroba; Corbishlev a Miller; kapitola XIV, str. 479 - 490: Bramborový škrob: Výroba a použití; Mitch; kapitola XV, str. 491 - 506: Pšeničný škrob: Výroba, modifikace a použití; Knight a Oson; a kapitola XVI, str. 507 až 528: Rýžový škrob: Výroba a použití; Rohmer a Klem). K zařízení, která se zpravidla k extrakci škrobu z rostlinného materiálu používají, patří separátory, dekantéry, hydrocyklony, sprayové sušárny a sušárny pro sušení ve fluidní vrstvě.

Transgenní rostlinné buňky a rostliny podle tohoto vynálezu syntetizují na základě exprese molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu škroby, které se svými fyzikálně-chemickými vlastnostmi, jako je například poměr amylosy a amylopektinu, stupeň rozvětvení řetězce, průměrná délka řetězce, obsah fosfátů, vlastnosti při mazovatění, velikost škrobových zrn a/nebo jejich tvar, liší od škrobů syntetizovaných přírodními rostlinami. U těchto škrobů se může měnit zejména jejich viskozita a/nebo jejich vlastnosti při tvorbě filmu a vlastnosti vzniklých škrobových mazů v porovnání s vlastnostmi známých škrobů.

Předmětem tohoto předkládaného vynálezu je dále škrob, který je možno získat z rostlinných buněk, z rostlin a z jejich množitelského materiálu podle tohoto vynálezu a škrob, který je možno získat výše uvedenými postupy podle tohoto vynálezu.

Dále je možno pomocí molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu produkovat rostlinné buňky a rostliny, u nichž je aktivita proteinu podle tohoto vynálezu snížena. To vede rovněž k syntéze škrobu se změněnými chemickými a/nebo fyzikálními vlastnostmi v porovnání se škroby z původních rostlinných buněk.

Dalším předmětem tohoto vynálezu jsou transgenní rostlinné buňky, obsahující molekulu nukleových kyselin podle tohoto vynálezu, v nichž je aktivita isoamylasy v porovnání s netransformovanými buňkami snížena.

Přípravu rostlinných buněk se sníženou aktivitou isoamylasy je možno provádět například expresí příslušné anti-sense-RNA, sense-RNA pro dosažení ko-supresního efektu nebo expresí odpovídajícím způsobem konstruovaného ribozymu, který specificky štěpí transkript kódující isoamylasu s použitím molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu podle postupu, který je odborníkům znám, viz Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340 - 344), Niebel a spol., Immunol. 197 (1995), 91 - 103),

Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995),

- 46), Palaqui a Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149 - 159), Vaucheret a spol. (Mol.. Gen. Genet. 248 (1995), 311 - 317), de Borne a spol,. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613 - 621).

(Curr. Top. Microbiol Flavell a spol. (Curr

Přednostně se pro snížení aktivity isoamylasy podle tohoto vynálezu používá snížení počtu kódujících transkriptů v rostlinných buňkách, například expresí antisense-RNA.

Přitom je možno použít molekulu DNA, která obsahuje úplnou sekvenci kódující protein podle tohoto vynálezu včetně případně přítomných stínících sekvencí, a rovněž DNA-molekuly obsahující pouze části kódující sekvence, přičemž tyto části musí být dostatečně dlouhé k tomu, aby v buňkách vyvolaly antisense-efekt. Obecně se mohou používat sekvence o minimální délce 15 bp, výhodněně o délce 100 až 500 bp, pro účinnou antisense-inhibici zejména sekvence o délce nad 500 bp. Zpravidla se používají DNA-molekuly, které jsou kratší než 5000 bp, výhodně sekvence, které jsou kratší než 2500 bp.

Je možno používat i DNA-sekvence, které vykazují vysoký stupeň homologie se sekvencemi molekul DNA podle tohoto vynálezu, které však nejsou zcela identické. Minimální homologie by měla být vyšší než cca 65 %. Přednostně se používají sekvence se stupněm homologie mezi 95 a 100 %.

Předmětem tohoto vynálezu je i postup přípravy modifikovaného škrobu, zahrnující postup extrakce škrobu z buňky nebo z rostliny podle tohoto vynálezu a/nebo ze škrobnatých částí těchto rostlin.

Předmětem tohoto vynálezu je dále škrob, který je možno získat z buněk, rostlin a rovněž množitelského materiálu nebo jeho částí podle tohoto vynálezu a dále škrob, který je možno získat postupem podle tohoto vynálezu.

Škroby podle tohoto vynálezu je možno modifikovat postupy, které jsou odborníkům známy, přičemž tyto škroby v modifikované nebo nemodifikované formě jsou vhodné pro různá použití v potravinářské nebo nepotravinářské oblasti.

Možnosti použití škrobů podle tohoto vynálezu se v

podstatě dělí do dvou velkých oblastí. Jedna oblast zahrnuje produkty hydrolýzy škrobu, zejména glukosu a glukanové stavební jednotky, které je možno získat enzymatickými nebo chemickými postupy. Tyto látky slouží jako výchozí suroviny pro další chemické modifikace a procesy, jako je například fermentace. Pro snížení nákladů může mít v tomto případě značný význam jednoduchost a nepříliš nákladné provedení hydrolytického postupu. V současné době se tato hydrolýza provádí převážně enzymaticky s použitím amyloglukosidasy.

Lze předpokládat, že úspory nákladů by se mohlo dosáhnout snížením množství použitých enzymů. Určitý vliv by mohla mít i strukturní přeměna škrobu, jako je například snížení stupně rozvětvení nebo změna sférické struktury, která určuje přístupnost molekuly pro použité enzymy.

Druhá oblast, v níž by se škroby podle tohoto vynálezu mohly vzhledem k jejich polymemí struktuře používat jako takzvané nativní škroby, se dělí na dvě hlavní oblasti použití:

1. Potravinářský průmysl

Škrob je klasickou přísadou do řady potravin, v nichž zpravidla plní funkci pojivá pro vodné složky nebo se používá pro zvýšení viskozity nebo způsobuje zvýšenou tvorbu gelu. Důležitými vlastnostmi jsou přitom tekutost a sorpce, teplota botnání a mazovatění, viskozita a zahušfovací schopnost, rozpustnost škrobu, průhlednost a struktura škrobového mazu, stálost vůči působení tepla, střižných sil a kyselin, tendence k retrogradaci, schopnost tvorby filmů, stabilita při zmrazování/rozmrazování, viskozitní stálost v solných roztocích, stravitelnost a rovněž schopnost tvorby • · komplexů například s anorganickými nebo organickými ionty.

2. Nepotravinářský průmysl

V této široké oblasti je možno používat škrob jako pomocnou látku při různých výrobních procesech nebo jako přísadu do technických produktů. Škrob jako pomocná látka se používá zejména v papírenském průmyslu a v průmyslu výroby lepenky. Škrob se v této aplikaci používá především pro retardaci (vázání pevných látek) , vázání plnidel a jemných částic, jako ztužovací prostředek a jako prostředek pro odvodňování. Kromě toho se využívají výhodné vlastnosti škrobu pro dosažení tuhosti, tvrdosti, akustických vlastností, požadovaného omaku, lesku, hladkosti, odolnosti proti rozštěpení a rovněž pro dosažení požadovaných vlastností povrchu.

2.1 Průmysl výroby papíru a lepenky

Při výrobě papíru se rozlišují čtyři oblasti použití, a to úprava povrchu, natírání, úprava papírenské hmoty a postřik. Požadavky na škrob pro úpravu povrchu jsou zejména vysoký stupeň bělosti, odpovídající viskozita, vysoká viskozitní stálost, dobrá schopnost ke tvorbě filmů a minimální tvorba prachu. Při použití škrobu pro nátěry je důležitý obsah pevných látek, odpovídající viskozita, vysoká vaznost a rovněž vysoká afinita k pigmentům. Při použití škrobu jako přísady do papírenské hmoty se požaduje jeho rychlé, rovnoměrné a bezeztrátové rozptýlení, vysoká mechanická stabilita

• · a úplné zadržení škrobu v proudu papíroviny. Při použití škrobu pro postřikování jsou rovněž důležitými vlastnostmi odpovídající obsah pevných látek, vysoká viskozíta a vysoká vaznost.

2.2. Průmysl výroby lepidel

Průmysl výroby lepidel představuje širokou oblast použití škrobů, kterou je možno rozdělit na čtyři dílčí oblasti: použití jako čisté škrobové lepidlo, použití do škrobových lepidel s přísadou speciálních chemikálií, použití škrobu jako přísady k syntetickým pryskyřicím a k disperzím polymerů a konečně použití škrobů jako nastavovacího prostředku do syntetických lepidel. 90 % lepidel na bázi škrobu se používá při výrobě vlnité lepenky, papírových sáčků, pytlů a kornoutů, pro výrobu spojovacích materiálů pro papír a hliník, pro výrobu kartonáže a jako zvlhčovači lepidlo pro dopisní obálky, známky a podobně.

2.3 Textilní průmysl a průmysl pomocných textilních přípravků

Velkým odběratelem škrobů je textilní průmysl a průmysl textilních přípravků, kde se škroby používají jako pomocný prostředek a přísada. V rámci textilního průmyslu je možno rozlišit čtyři oblasti použití: použití škrobu jako šlichtovacího prostředku, tedy jako pomocného prostředku pro vyhlazení, zpevnění a zvýšení soudržnosti textilních surovin na ochranu proti působení tahových sil při spřádání a tkaní a rovněž pro zvýšení odolnosti proti oděru při tkaní, použití škrobu jako prostředku pro zušlechťování textilu, • · zejména po úpravách zhoršujících kvalitu jako je bělení, barvení a podobně, škrob se dále používá jako zahušfovací prostředek při výrobě barvicích past pro potlačení difúze barev a konečně se škrob používá jako přísada k prostředkům pro spojování nití.

2.4 Stavebnictví

Čtvrtou oblastí použití je používání škrobu jako přísady do stavebnin. Jako příklad je možno uvést sádrokartonové panely, kde škrob přidaný do sádrové kaše působením vody mazovatí, difunduje na povrch sádrové desky a váže karton na tuto desku. Další oblastí použití je přidávání škrobu do omítek a minerálních vláken. Při přepravě betonu se škrobové produkty používají pro zpomalení jeho tvrdnutí.

2.5 Stabilizace půdy

Další oblastí spotřeby škrobu je výroba prostředků pro stabilizaci půdy, které se používají při pohybech půdy pro dočasnou ochranu částic půdy proti vodě. Kombinované produkty skládající se ze škrobu a emulzí polymerů jsou podle současných znalostí ve svých účincích pro snižování eroze a tvorby krusty srovnatelné s dosud používanými výrobky, jsou však podstatně levněj ší.

2.6 Použití v prostředcích pro ochranu rostlin a v hnoj ivech

V této oblasti se škrob používá do prostředků pro ochranu rostlin pro změnu jejich specifických vlast25 ností. Škroby se používají pro zlepšené smáčení prostředků pro ochranu rostlin a hnojiv, pro postupné uvolňování účinných látek, pro přeměnu kapalných, těkavých a/nebo zapáchajících látek na mikrokrystalické, stabilní a tvarovatelné látky, pro míšení nekompatibilních sloučenin a pro prodloužení doby účinnosti zpomalením rozkladu.

2.7 Farmaceutický, zdravotnický a kosmetický průmysl

Další oblastí používání škrobu je farmaceutický, zdravotnický a kosmetický průmysl. Ve farmaceutickém průmyslu se škrob používá jako pojivo pro tablety nebo pro zřeďování pojiv v kapslích. Dále se škrob používá jako prostředek pro rychlý rozpad tablet, kde tablety po spolknutí absorbují tekutinu a po krátké době zbotnaji, přičemž uvolňují účinnou látku. Lékařské zásypy a pudry na zasypávání ran obsahují jako základní látku škrob. V oblasti kosmetiky se škroby používají například do pudrů jako nosiče přísad, jako jsou vonné látky a salicylová kyselina. Poměrně značná množství škrobů se používají do zubních past.

2.8 Přidávání škrobů do uhlí a briket

Škroby se přidávají i do uhlí a briket. Uhlí po přídavku škrobu lépe aglomeruje respektive briketuje, což brání předčasnénmu rozpadu briket. Do grilovacího uhlí se přidává 4 až 6 % škrobu, do palivového uhlí 0,1 až 0,5 % škrobu. Škroby jako pojivo do uhlí nabývají stále většího významu, poněvadž přídavek škrobu do uhlí a briket může značně snížit emise škodlivých látek.

2.9 Úprava rudných a uhelných kalů

Škroby je možno používat i pro úpravu rudných a uhelných kalů jako flokulační prostředek.

2.10 Pomocné prostředky ve slévárenství

Další oblastí je použití škrobu jako přísady do pomocných slévárenských prostředků. Při různých postupech odlévání jsou zapotřebí jádra, která se vyrábějí z písků s přísadou pojivá. Jako pojivo se v současné době používá převážně bentonit, ke kterému se přidávají modifikované škroby, zejména botnavé škroby. Přídavek škrobu se používá pro zvýšení pevnosti při toku a pro zlepšení vaznosti. Kromě toho mohou botnavé škroby splňovat další technické požadavky, jako je dispergovatelnost ve studené vodě, snadná rehydratace, dobrá mísitelnost s pískem a vysoká schopnost vázat vodu.

2.11 Použití v gumárenském průmyslu

V gumárenském průmyslu se může škrob používat pro zlepšení technické a optické kvality výrobků. Používá se pro zlepšení lesku povrchu, pro zlepšení omaku a vzhledu, přičemž se před vulkanizací za studená popráší škrobem lepivé pogumované plochy. Škrob se rovněž používá i pro zlepšení potiskovatelnosti pryžových výrobků.

2.12 Výroba náhražek kůže

Další oblastí uplatnění modifikovaných škrobů je ·*·· ···· · · · • · · · · · · • « · · · · · · · • · « · · · · výroba náhražek kůže.

2.13 Škroby v syntetických polymerech

V oblasti plastů se škroby používají k následujícím účelům: přídavek škrobových produktů při zpracování (škrob funguje pouze jako plnidlo, mezi syntetickým polymerem a škrobem nevzniká přímá vazba) nebo alternativně k vázání škrobových produktů při výrobě polymerů (škrob a polymer vytvářejí pevnou vazbu).

Používání škrobu jako pouhého plnidla není v porovnání s jinými látkami, jako je například mastek, perspektivní. Situace se však mění, jestliže se uplatní specifické vlastnosti škrobu a dojde k podstatné změně vlastností konečného produktu. Jako příklad je možno uvést použití škrobových produktů při zpracování termoplastů, jako je polyethylen. Přitom se škrob a syntetický polymer zpracují koexpresí v poměru 1 : 1 na takzvaný master batch (předsměs), z něhož se s granulovaným polyethylenem za použití běžných technologických postupů vyrábějí různé produkty. Navázání škrobu v polyethylenových fóliích může zvýšit látkovou propustnost fóliových dutých těles, zlepšit propustnost pro vodní páru, zlepšit antistatické vlastnosti a rovněž zlepšit potiskovatelnost barvami ředitelnými vodou.

Další možností je použití škrobu do polyurethanových pěn. Úpravou škrobových derivátů a rovněž optimalizací technologických parametrů je možno cíleně řídit reakci mezi syntetickými polymery a hydroxylovými skupinami škrobu. Výsledkem jsou polyurethanové fólie kterým použití škrobu dodává následující vlastnosti: snížení koeficientu tepelné ♦ · φ · · · · «φφφ · φ · · · • φφφφ · φ φ φ φ · · ······« φφ ··· · · roztažnosti, snížení srážlivosti, zlepšení vlastností při působení tlaku/tahu, vzrůst propustnosti pro vodní páru bez změny schopnosti přijímat vodu, snížení zápalnosti a možnosti roztržení, nedochází k odkapávání hořících dílů, absence halogenů a zpomalené stárnutí. Nevýhodami, které se v současné době projevují, jsou snížená pevnost v tlaku a snížená rázová odolnost.

Vývoj výrobků se však neomezil pouze na fólie.

V současné době se vyrábějí i masivní výrobky, jako jsou například hrnky, talíře a misky, obsahující i více než 50 % škrobu. Směsi škrobu a polymerů jsou hodnoceny velice příznivě i z ekologického hlediska, poněvadž mají podstatně vyšší biologickou odbouratelnost.

Mimořádný význam získaly roubované škrobové polymery vzhledem k jejich extrémní schopnosti vázat vodu. Jde o produkty jejichž hlavní řetězec tvoří škrob a na tento řetězec jsou podle principu radikálového mechanismu roubovány postranní vedlejší řetězce syntetického monomeru. Roubované škrobové polymery, které jsou v současné době k dispozici, se vyznačují zlepšenou schopností vázat a zadržovat vodu, a to až do množství 1000 g vody na 1 g škrobu při vysoké viskozitě. Oblasti použití těchto superabsorpčních látek se v posledních letech velmi rozšířily a tyto látky se uplatňují v oblasti hygieny jako pleny a podložky a rovněž v zemědělství, jako např. pro potahování osiva.

Pro použití nových genově-technicky přeměněných škrobů jsou rozhodující jednak jejich struktura, obsah vlhkosti, obsah proteinů, obsah lipidů, obsah vlákniny, obsah popela/ fosfátů, poměr amylosa/amylopektin, rozložení molekulárních hmotností, stupeň rozvětvení, velikost zrn a jejich tvar a krystalinita, a jednak vlastnosti, z nichž vyplývají následující charakteristiky: chování při toku a sorpční vlastnosti, teplota mazovatění, viskozita, stálost viskozity v solných roztocích, zahušťovací schopnost, rozpustnost, struktura a transparence škrobového mazu, odolnost vůči teplu, střižným silám a kyselinám, tendence k retrogradaci, tvorba gelů, stabilita při zmrazování/rozmrazování, schopnost tvořit komplexy, vázání jodu, tvorba filmů, pevnost lepeného spoje, stálost vůči enzymům, stravitelnost a reaktivita.

U modifikovaných škrobů, získaných z příslušných rostlin pomocí genově-technických postupů může dojít k takové změně jejich vlastností, že další modifikace pomocí chemických nebo fyzikálních postupů již není nutná. Jinak je možno škroby pozměněné genově-technickými postupy dále modifikovat chemickými postupy, takže se dosáhne dalšího zlepšení kvality pro výšeuvedené účely použití. Tyto chemické úpravy jsou v zásadě známy. Přitom se používají zejména úpravy působením tepla, působením organických nebo anorganických kyselin, oxidace a reesterifikace, přičemž vznikají například fosfáty, nitráty, sulfáty, xantháty, acetáty nebo citráty škrobu. Dále je možno pro přípravu etherů škrobu použít jednofunkční nebo vícefunkční alkoholy za přítomnosti silných kyselin, přičemž vznikají alkylethery, O-allylethery, hydroxyalkylethery, O-karboxymethyl-ethery škrobu, škrobové ethery obsahující dusík, škrobové ethery obsahující fosfor, škrobové ethery obsahující síru, zesíťované škroby nebo roubované škrobové polymery.

Výhodným použitím škrobů podle tohoto vynálezu je jednak výroba obalových materiálů a výrobků pro jedno použití a jednak použití těchto škrobů jako potravin a potráví30 • · ·· · * · ·· • · · · ··· · · · • 9 9 9 9 · · • · · · · 9 9 9 9

9 9 9 9 · · ·»····· · · · · · · · · nářských polotovarů.

Pro expresi molekul nukleových kyselin podle tohoto vynálezu v sense- nebo antisense-orientaci v rostlinných buňkách se tyto molekuly spojí s regulačními DNA-prvky, které potom uskutečňují transkripci v rostlinných buňkách.

K tomu se ještě přiřazují zejména promotory, enhancery a terminátory. Všeobecně se exprese může účastnit kterýkoli aktivní promotor v rostlinné buňce.

Tento promotor je přitom možno volit tak, aby exprese probíhala konstitutivně, nebo pouze v určité tkáni, v určitém časovém období vývoje rostliny nebo v určitém okamžiku, stanoveném vnějšími vlivy. Ve vztahu k rostlině může být tento promotor homologický nebo heterologický. Vhodnými promotory pro konstitutivní expresi jsou například promotor 35S RNA viru květákové mozaiky a ubiquitinový promotor z kukuřice, pro expresi specifickou pro hlízy je vhodný patatinový promotor B33 (Rocha-Sosa a spol., EMBO J. 8 (1989), 23 - 29), jako promotor zajišťující expresi pouze ve fotosynteticky aktivních tkáních je vhodný například promotor ST-LS1 (Stockhaus a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943 - 7947; Stockhaus a spol., EMBO J. 8 (1989), 2445 - 2451), pro endosperm-specifickou expresi je možno použít HMG-promotor z pšenice, USP-promotor, faseolinpromotor nebo promotory ze zeinových genů kukuřice.

Dále může být k dispozici terminační sekvence, která zajišťuje správné ukončení transkripce a zajišťuje rovněž adici poly-A-konce na transkript, kterému je připisována funkce při stabilizaci transkriptů. Tyto prvky jsou v literatuře popsány (viz např. Gielen a spol., EMBO J. 8 (1989) a jsou libovolně zaměnitelné.

• · ··· · · ·

Tento předkládaný vynález poskytuje molekuly nukleových kyselin, které kódují protein s funkcí isoamylasy z pšenice. Molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu umožňují přípravu tohoto enzymu, který se funkčně účastní biosyntézy škrobu a který umožňuje získávání genově-technicky změněných rostlin, v nichž je aktivita tohoto enzymu změněna a umožňuje tak v takto modifikovaných rostlinách provádět syntézu škrobu se změněnou strukturou a se změněnými fyzikálně-chemickými vlastnostmi.

Molekuly nukleových kyselin podle tohoto vynálezu mohou být principiálně používány i k získávání rostlin, v nichž je aktivita isoamylasy podle tohoto vynálezu zvýšena nebo snížena a současně v nichž je aktivita jiných enzymů, které se podílejí na syntéze škrobu, změněna. Tato změna aktivity isoamylasy v rostlinách vede k syntéze škrobu s pozměněnou strukturou. Dále mohou být vnášeny molekuly nukleových kyselin, které kódují isoamylasu, nebo odpovídající anti-sense konstrukty do rostlinných buněk, v nichž j iž byla syntéza endogenních škrobových synthas nebo enzymů ovlivňuijících rozvětvování řetězce inhibována (jako například ve VO 92/14827 nebo Shannon a Garwood, 1984, v publikaci Vhistler, BeMiller a Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academie Press, Londýn, 2. vyd.: 25 - 86).

Jestliže se má dosáhnout v transformovaných rostlinách inhibice více enzymů podílejících se na biosyntéze, je možno použít pro transformaci DNA-molekuly, které současně obsahují více oblastí kódujících odpovídající enzymy v antisense-orientaci za kontroly vhodného promotoru. Přitom může být alternativně buď každá sekvence kontrolována jedním vlastním promotorem, nebo mohou být sekvence transkribovány • · tf· tftf tf tftf ·>·« tftftftf tf·· tf · · · · tftf • · tftftf · » tftftf···· ·· »·· tftf tf jako fúze jedním společným promotorem nebo mohou být všechny sekvence kontrolovány jedním společným promotorem. Zpravidla se preferuje tato poslední alternativa, poněvadž v tomto případě je syntéza příslušných proteinů inhibována přibližně ve stejné míře. Pro délku jednotlivých kódujících oblastí využívanou v získaném konstruktu platí to, co bylo již dříve uvedeno při přípravě antisense-konstruktů. Horní hranice počtu antisense-transkribovaných fragmentů v promotoru jedné DNA molekuly principiálně neexistuje. Vznikající transkript by však neměl být delší než 10 kb, preferovaně by neměl překročit délku 5 kb.

Kódující oblasti, které jsou lokalizovány v těchto DNA-molekulách v kombinaci s ostatními kódujícími oblastmi v antisense-orientaci za příslušným promotorem, mohou pocházet z DNA-sekvencí, které kódují následující proteiny: synthasy vázané na škrobové zrno (GBSS I a II) a rozpustné synthasy (SSS I a II), enzymy ovlivňující rozvětvováni (isoamylasy, pullulanasy, R-enzymy, Branching-enzymy, Debranching-enzymy), škrobové fosforylasy a disproporcionační enzymy. Tento výčet je pouze orientační. V rámci těchto kombinací je možno použít i jiné DNA-sekvence.

Tyto konstrukty umožňují v rostlinných buňkách, které jsou jejich působením transformovány, současně inhibovat syntézu více enzymů.

Dále je možno tyto konstrukty vkládat do rostlinných mutantů, které jsou pro jeden nebo více genů biosyntézy škrobu defektní (Shannon a Garwood, 1984, v publikaci Vhistler, BeMiller a Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academie Press, Londýn, 2. vyd.: 25 - 86). Tyto defekty se mohu týkat následujících enzymů: synthasy vázané » · f ·

na škrobové zrno (GBSS I a II) a rozpustné synthasy (SSS I a II), enzymy ovlivňující rozvětvování (BE I a II), Debranching-enzymy (R-enzymy), disproporcionační enzymy a škrobové fosforylasy. Tento výčet je pouze orientační.

Pomocí tohoto postupu je dále možno v rostlinných buňkách transformovaných tímto způsobem současně inhibovat syntézu několika enzymů.

Pro zavedení cizích genů do vyšších rostlin je k dispozici velký počet klonovacích vektorů, které obsahují replikační signál pro E. coli a markerový gen pro selekci transformovaných bakteriálních buněk. Jako příklady těchto vektorů je možno uvést pBR322, pUC-serie, M13mp-serie, pACYC184 a další.

Požadovanou sekvenci je možno zavést do vektoru v příslušném restrikčním štěpném místě. Získaný plasmid se použije pro transformaci buněk E.coli. Transformované buňky E.coli se kultivují ve vhodném mediu, nakonec se provede jejich izolace a lýza. Plasmid se regeneruje. Jako analytické metody pro charakterizaci získané plasmid-DNA se obecně používá restrikční analýza, gelová elektroforéza a další biochemické a molekulárně-biologické metody. Po každé manipulaci je možno plasmid-DNA rozštěpit a získané DNAfragmenty vázat na jiné DNA-sekvence. Každou sekvenci plasmid-DNA je možno klonovat ve stejném plasmidu nebo v jiných plasmidech.

Pro zavedení DNA do rostlinné hostitelské buňky existuje řada postupů. K těmto postupům patří transformace rostlinných buněk s T-DNA s použitím Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes jako transformačním pro- 34 středkem, fúze protoplastů, injekce, elektroporace DNA, vkládání DNA pomocí biolistické metody a další možnosti.

Při injikaci a elektroporaci DNA do rostlinných buněk nejsou na použité plasmidy kladeny žádné speciální požadavky. Je možno použít jednoduché plasmidy jako například pUC-deriváty. Jestliže se však má z takto transformovaných buněk regenerovat celá rostlina, je zpravidla nutná přítomnost příslušného markerového genu.

V závislosti na způsobu zavádění požadovaných genů do rostlinné buňky může být zapotřebí použít další DNAsekvence. Jestliže se např. pro transformaci rostlinné buňky používá Ti- nebo Ri-plasmid, musí být alespoň pravé ohraničení, často však pravé i levé ohraničení Ti- a Riplasmidu T-DNA spojeno jako okrajová oblast se zaváděným genem.

Jestliže se pro transformaci používají agrobakterie, musí být zaváděná DNA klonována ve speciálním plasmidu, a to buď v intermediárním vektoru nebo v binárním vektoru. Intermediární vektory je možno na základě sekvencí homologických se sekvencemi v T-DNA integrovat do Ti- nebo Ri-plasmidu agrobakterií pomocí homologické rekombinace. Tento plasmid obsahuje nadto i virovou oblast (vir-Region) potřebnou pro transfer T-DNA. Intermediární vektory není možno replikovat v agrobakteriích. S použitím pomocného plasmidu je možno intermediární vektor přenášet na Agrobacterium tumefaciens (konjugace). Binární vektory je možno replikovat jak v E. coli, tak i v agrobakteriích. Tyto vektory obsahují selekční markerový gen a vazný člen (linker nebo polylinker), které rámují zprava a zleva hraniční oblast T-DNA. Tyto vektory je možno transformovat přímo v agrobakteriích (Holsters a spol.

·

• 9

Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181 - 187). Agrobakterium jako hostitelská buňka by měla obsahovat plasmid nesoucí vir-region. Tento vir-region je nutný pro transfer T-DNA do rostlinné buňky. Mohou být přítomny i další T-DNA. Takto transformované buňky Agrobakterium je možno použít pro transformaci rostlinných buněk.

Používání T-DNA pro transformaci rostlinných buněk je předmětem intenzivního studia a je zevrubně popsáno v EP 120 516; Hoekema, v publikacích The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V, Alblasserdam (1985), kapitola V; Fraley a spol., Crit Rev. Plant. Sci., 4,

- 46 a An a spol., EMBO J. 4 (1985), 277 - 287.

Pro transfer DNA do rostlinné buňky je možno účelně ko-kultivovat rostlinné explantáty s Agrobacterium tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes. Z infikovaného rostlinného materiálu (například kousky listů, části stonků, kořeny, ale i protoplasty nebo suspenzně kultivované rostlinné buňky) je potom možno ve vhodném mediu, obsahujícím mimo jiné určité cukry, aminokyseliny, antibiotika nebo biocidy pro selekci transformovaných buněk, regenerovat opět celé rostliny. V takto získaných rostlinách je potom možno sledovat přítomnost zavedené DNA. Jsou známy i jiné možnosti pro zavedení cizí DNA s použitím biolistického postupu nebo pomocí transformace protoplastů (viz např. Villmitzer, L., 1933 Transgenic plants, v publikaci Biotechnology, A MultiVolume Comprehensive Treatise (edit. H.J. Rehm, G.Reed, A.Puhler, P.Stadler), díl 2, 627 - 659, VCH Veinheim-New York-Basel-Cambridge).

Zatímco transformace dikotylních rostlin prostřednictvím Ti-plasmidových vektorových systémů pomocí Agrobac• * terium je známa dostatečně, ukazují novější práce, že transformaci pomocí vektorů, vycházejících z Agrobacterium je možno provádět i u monokotylních rostlin (Chán a spol., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491 - 506; Hiei a spol., Plant J. 6 (1994), 271 - 282).

Alternativními postupy k transformaci monokotylních rostlin jsou použití biolistických postupů, transformace protoplastů nebo fyzikálně nebo chemicky indukované vložení DNA do protoplastů, například pomocí elektroporace částečně permeabilizovaných buněk, transfer DNA pomocí skleněných vláken, makroinjekce DNA do květenství, mikroinjekce DNA do mikrospor nebo pro-embryonů, vkládání DNA pomocí klíčícího pylu a vkládání DNA do embryonů botnáním (Přehled: Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269 - 273).

Tři z výše uvedených transformačních systémů byly již dříve používány pro různé druhy obilí: elektroporace tkáně, transformace protoplastů a DNA-transfer vstřelováním částic do regenerovatelné tkáně a buněk (Přehled: Jáhne a spol., Euphytica 85 (1995), 25 - 44).

Transformace pšenice byla popsána v řadě prací (Přehled: Maheswari a spol., Critical Rewievs in Plant Science 14 (2) (1995), 149 až 178). Hess a spol. (Plant Sci. 72 (1990), 233) použili postup makroinjekce, aby dostali do bezprostřední vzájemné blízkosti pyl a agrobakterie. Mobilizace plasmidu obsahujícího nptll gen jako volitelný markér byla prokázána pomocí Southern-Blot-analýzy a NPTII testem. Tyto transformanty vykazovaly normální fenotyp a byly fertilní. Ve dvou po sobě jdoucích generacích bylo možno prokázat resistenci vůči kanamycinu.

První transgenní fertilní rostlinu pšenice, kterou bylo možno regenerovat po vstřelování DNA, vázané na mikroprojektily popsali Vasil a spol. (Bio/Technology 10 (1992), 667 - 674). Cílovou tkání pro vstřelování byla embryogenní kultura kaliu (kallus typ C). Jako selekční markér byl použit čistý gen (bar Gen) kódující fosfinothricin-acetyltransferasu, který zajišťoval resistenci proti herbicidu Phosphinothricin. Další systém popsali Veeks a spol. (Plant Physiol. 102 (1993), 1077 - 1084) a Becker a spol. (Plant J. 5(2) (1994), 299 - 307). V tomto případě byl cílovou tkání pro DNA-transformaci štítek (skutellum) nezralých embryonů, které byly v počáteční in vitro-fázi stimulovány k indukci somatických embryonů. Účinnost této transformace byla u systému, který vyvinuli Becker a spol. (citace viz dříve), s 1 transgenní rostlinou na 83 embryonů druhu Florida podstatně vyšší než u systému který vypracovali Veeks a spol. s 1 až 2 transgenními rostlinami na 1000 embryonů druhu Bohwhite.

Systém který vyvinuli Becker a spol. (citace viz dříve) tvoří základ transformačních pokusů popsaných v příkladech provedení.

Jakmile se vložená DNA integruje do genomu, zůstává v něm zpravidla stabilně a zůstává zachována i v potomstvu původních transformovaných buněk. Obsahuje zpravidla jeden z výšeuvedených selekčních markérů který zajišťuje transformovaným rostlinným buňkám například odolnost proti biocidním prostředkům jako je Phosphinothricin nebo proti antibiotikům jako je kanamycin, G418, Bleomycin nebo Hygromycin nebo umožňuje provádět selekci za přítomnosti nebo nepřítomnosti určitých cukrů nebo aminokyselin. Individuálně zvolený markér by měl proto umožňovat selekci transformovaných buněk • · za buňky, kterým vložená DNA chybí.

Transformované buňky rostou v rostlině normálním způsobem (viz např. McCormick a spol., Plant Cell Reports 5 (1986), 81 - 84). Výsledné rostliny je možno normálně pěstovat a je možno je křížit s rostlinami, které mají stejné nebo odlišné dědičné vlastnosti. Takto vzniklá hybridní individua mají odpovídající fenotypové vlastnosti. Z rostlinných buněk je možno získat semena. Aby bylo zajištěno, že fenotypová vlastnost zůstala zachována a že je dědičná, je třeba provést pěstování dvou nebo několika generací. Je třeba sklidit i semena, aby bylo zajištěno, že zůstal zachován příslušný fenotyp nebo ostatní charakteristické vlastnosti.

Následující příklady ilustrují tento vynález, v žádném případě jej však neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Postup klonování

Pro klonování v E.coli byl použít vektor pBluescript II SK (Stratagene).

Příklad 2

Kmeny bakterií

Pro vektor Bluescript a pro antisense-konstrukty byl • · · * · ·

použit E.coli kmen DH5a (Bethesda Laboratories, Gaithersburg, USA). Pro excisi prováděnou in vivo byl použit E.coli kmen XLl-Blue.

Příklad 3

Transformace nezralých pšeničných embryonů

Media:

MS:	100 ml/1 makrosůl	(D.Becker a H.	Lórz,
	1 ml/1 mikrosůl	Plant Tissue Culture
#30:	2 ml/1 Fe/NaEDTA 30 g/l sacharosa MS + 2,4-D (2 mg/1)	Manual (1996),	B 12 : 1 - 20)
#31:	MS + 2,4-D (2 mg/1)	+ Phosphinothricin	(PPI, aktivní

komponenta herbicidu BASTA

				(2 mg/1)
#32:	MS	+ 2,4-D	(0,1 mg/1)	+ PPT (2	mg/1)
#39:	MS	+ 2,4-D	(2 mg/1) +	po 0,5 N	mannit/sorbit

V uvedených mediích byla hodnota pH nastavena pomocí KOH na 5,6 a media byla ztužena 0,3 % přípravku Gelrite.

Metodu transformace nezralých embryonů z pšenice vyvinuli a optimalizovali Becker a Lórz (D.Becker a H.Lórz,

Plant Tissue Culture Manual (1996), B 12 : 1 až 20).

V dále popsaných pokusech byl dodržován protokol, který vypracovali Becker a Lórz (citace viz dříve).

« · φ ·

Pro transformaci byly klasy s karyopsy ve stupni vývoje 12 až 14 dnů po antezi sklizeny a povrchově sterilisovány. Izolovaná skutella byla nanesena s osou ebrya, přiřazenou k mediu na indukční medium #30.

Po dvou- až čtyřdenní předběžné kultivaci (26 °C, tma) byly explantáty převedeny na medium #39 pro osmotickou předběžnou kultivaci (osmotische Vorkultur) (2 až 4 hodiny, 26 °C, tma).

Pro biolistickou transformaci bylo pro jedno vstřelování použito cca 29 pg částic zlata, na které bylo předtím vysráženo několik pg cílové DNA. Vzhledem k tomu, že při prováděných pokusech šlo o ko-transformanty, byla cílová DNA ke srážení přidávána s cílovým genem a resistentním markerovým genem (bar-Gen) v poměru 1:1.

Příklad 4

DIG-značení DNA-fragmentů

Značení DNA-fragmentů použitých jako screeningové sondy bylo provedeno pomocí specifické PCR se vkládáním DIG-značeného dUTP (Boehringer Mannheim, Německo).

Media a roztoky použité v příkladech provedení:

x SSC 175,3 g NaCl

88,2 g natriumcitrát doplnit do 1000 ml redest. vodou úprava na pH 7,0 roztokem 10 N NaOH

V DSMZ v Braunschweigu, SRN, bylo provedeno uložení plasmidu pTaSU 8A podle Budapešťské smlouvy pod číslem DSM 12795 a rovněž plasmidu pTaSU 19 pod č. DSM 12796.

Příklad A

Identifikace, izolace a charakterizace cDNA, kódující isoamylasu (sacharidický homolog /sugary H./) z pšenice (Triticum aestivum L. , odrůda Florida)

Pro identifikaci cDNA kódující isoformu isoamylasy (sacharidická - sugary) z pšenice byla použita strategie heterologického screeningu. Přitom byla prozkoumána cDNAbanka z pšenice pomocí sacharidícké sondy z kukuřice.

Izolace této sacharidícké sondy z kukuřičné cDNA banky byla provedena pomocí specifického priméru PCR-amplifikací. Klonování kukuřičné cDNA banky bylo provedeno z póly (A) + RNA ze směsi stejných podílů 13, 17, 19, 20, 22, 25 a 28 dnů (DAP) starých karyopsů ve vektoru Lambda Zap II podle údajů výrobce (Sada /kit/ pro syntézu Lambda ZAP II-cDNA, Stratagene GmbH, Heidelberg, Německo). U všech použitých karyopsů, s výjimkou zrn starých 13 dnů, bylo před izolací RNA odstraněno embryo.

Amplifikace DNA-fragmentu použitého jako sonda pro zkoumávání pšeničné cDNA-banky bylo provedeno s následujícími priméry:

sulp-la: 5’AAAGGCCCAATATTATCCTTTAGG 3’ (Seq.ID No.4) sulp-2 : 5’GCCATTTCAACCGTTCTGAAGTCGGGAAGTC 3’ (Seq.ID No.5)

Jako templáty pro PCR-reakci byly použity 2 μΐ ·· *« ·· · *· ···· · · · · · * • · · · · · · « ···« »··· • · · · · · · ······»· ·· ··· *· amplifikované kukuřičné cDNA-banky. Tato PCR-reakční směs obsahovala dále 1,5 - 3 mM MgC^, 20 mM Tris-HCl (pH 8,4) , mM KC1, 0,8 mM dNTP Mix, 1 μΜ primér sulp-la, 1 μΜ primér sulp-2 a 2,5 jedn. Taq polymerasy (rekombinantní, Life Technologies). Amplifikace byla provedena v zařízení Trioblock od firmy Biometra podle schématu: 4’(min)/95 °C; l’/95 °C; 45” (sek.)/58 °C; l’15”/72 °C; 30 cyklů 5 ’/72 °C. Amplifikované DNA-pásy o velikosti cca 990 bp byly rozděleny v agarosovém gelu a vyříznuty. S tímto fragmentem byla podle výšeuvedeného schématu provedena druhá amplifikace. Fragment o velikosti 990 bp získaný z této druhé amplifikace byl rozštěpen pomocí restrikčního enzymu BAM HI na fragment o velikosti 220 bp a fragment o velikosti 770 bp.

Po opakovaném dělení sacharidického (sugary) fragmentu na agarosovém gelu, vyříznutí pásu a izolaci tohoto fragmentu bylo provedeno DIG-značkování sondy. Pro značkování random prime pomocí digoxygeninu bylo použito 500 ng sacharidického fragmentu. K tomuto značkovanému fragmentu bylo přidáno 10 μί přípravku Random Primér a reakční směs byla zahřívána po dobu 5’ na teplotu 95 - 100 °C. Po záhřevu byly přidány 0,1 mM dATP, 0,1 mM dGTP, 0,1 mM dCPT a 0,065 mM dTTP a 0,035 mM Digoxygenin-ll-dUTP (Boehringer Mannheim) a pufr Klenow (standard) a 1 jednotka polymerasy Klenow. Reakce byla prováděna při RT (laboratorní teplotě) přes noc. Pro kontrolu značkování byl použit Dot-test (tečkovací test) podle údajů výrobce (příručka Dig System User’s Guide for Filter Hybridization od firmy Boehringer, Mannheim,

Německo).

Syntéza pšeničné cDNA-banky byla provedena z poly(A)+RNA z 21 dnů starých karyopsů (starchy-endosperm) ve vektoru Lambda ZAP II Vektor podle údajů výrobce (Sada /kit/ pro syntézu Lambda ZAP II-cDNA, Stratagene GmbH, • · • »

Heidelberg, Německo). Po stanovení titru cDNA-banky byla stanovena hodnota primárního titru 1,26 x 10° pfu/ml.

Pro prozkoumání pšeničné cDNA-banky bylo naneseno na desku cca 350 000 fágů. Nanášení fágů a vyhodnocování (Abziehen) desek bylo provedeno podle standardního protokolu. Prehybridizace a hybridizace filtru byla provedena v 5X SSC, 3 % Blocking (Boehringer, Mannheim),

0,2 % SDS, 0,1 % natriumlaurylsarkosin a 50 pg/ml DNA sledího spermatu (Heringssperma) při 55 °C. K hybridizačnímu roztoku byl přidán 1 ng/ml značkované sacharidické sondy a hybridizace byla inkubována přes noc. Filtry byly promyty 2X5’ ve 2XSSC, 1 % SDS při laboratorní teplotě; 2X10’ v 1XSSC, 0,5 % SDS při 55 °C; 2X10’ v 0,5XSSC, 0,2 % SDS při 55 °C. Pozitivní klony byly spojeny při dalších screeningových postupech. Excisi in vivo byly získány spojené klony jako pBluescript SK Phagemide (provedeno podle údajů výrobce; Stratagene, Heidelberg, Německo).

Po analýze tohoto klonu pomocí miniprepacace a restrinkce získané plasmid-DNA byl klon pTaSU-19 uložen v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur DSMZ - Deutsche Sammlung fůr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH pod číslem DSM 12796 a byl dále analyzován.

Příklad B

Sekvenční analýza cDNA-inzercí plasmidu pTaSU-19

Z klonu pTaSU-19 byla izolována plasmid-DNA a sekvence cDNA-insertů byla stanovena didesoxynukleotidovou metodou (Sanger a spol., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463 - 5467).

Inserce klonu pTaSU-19 má délku 2997 bp a představuje částečnou cDNA. Nukleotidová sekvence je uvedena pod označením Seq ID No.l. Z porovnání s již publikovanými sekvencemi vyplynulo, že sekvence uvedená pod označením Seq ID No.l zahrnuje úplnou kódující oblast, která vykazuje homologií s isoamylasami z jiných organismů. Analýza této sekvence rovněž prokázala, že cDNA-sekvence obsahuje dva introny v pozici 297 - 396 (intron 1) a 1618 - 2144 (intron 2). Po odstranění těchto intronů je možno odvodit proteinovou sekvenci, která vykazuje homologií s proteinovými sekvencemi isoamylas z jiných organismů. Aminokyselinová sekvence odpovídající kódujícím oblastem Seq ID No.l je vedena pod označením Seq ID No.3.

Příklad C

Příprava rostlinného transformačního vektoru pTa-alfa-SU19

Pro expresi antisense-RNA odpovídající TaSU19-cDNA byl na základě základního plasmidu pUC19 konstruován rostlinný transformační vektor pTa-alfa-SU19, v němž byla spojena cDNA-inserce plasmidu pTa-alfa-SU19 v antisense-orientaci s 3’-koncem ubiquitinového promotoru. Tento promotor se skládá z prvního nepřenosového exonu (untranslatierter Exon) a prvního intronu ubiquitin 7-genu z kukuřice (Christensen A.H. a spol., Plant Molecular Biology 18 (1992), 675 - 689). Části polylinkeru a NOS-terminátor pocházejí z plasmidu pACTl.cas (CAMBIA, TG 0063; Cambia, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601, Austrálie). Vektorové konstrukty s tímto terminátorem a konstrukty založené na pACTl.cas jsou popsány v práci McElroy a spol. (Molecular Breeding 1 (1995),

- 37). Takto vzniklý vektor byl pojmenován PUbi.cas.

• ·

Klonování tohoto vektoru bylo prováděno restrikcí 2 kb fragmentu z klonu Ta-SU19 pomocí restrikčního enzym Xba 1. Tento fragment byl na koncích doplněn pomocí Klenowovy reakce a potom byl navázán na klonovací místo Sma I expresního vektoru pUbi.cas.

Vzniklý expresní vektor byl označen Ta-alfa-SU19 a byl výšeuvedeným postupem použit pro transformaci pšenice.

Příklad D

Izolace a charakterizace další cDNA kódující isoamylasu (Sugaryl-homolog) z pšenice (Triticum aestiviim L., odrůda Florida).

cDNA-banka z pšenice byla prozkoumávána sondou Sugary-Sondě, která představovala část klonu pTaSU19, a to pozici 489 - 1041 ze Seq.ID No.l.

Příprava digoxygeninem značkované Sugary-Sondě specifické pro pšenici, použité pro prozkoumávání cDNA-banky, byla provedena pomocí PCR-amplifikace.

Priméry použité při této reakci byly následující:

SUSO1: 5’-GCT TTA CGG GTA CAG GTT CG-3’ (Seq.ID No.8), a

SUSO2: 5’-AAT TCC CCG TTT GTG AGC-3’ (Seq.ID No.9).

Jako templát byl do reakce použit 1 ng plasmidu pTaSU19. Reakční směs pro PCR obsahovala kromě toho 300 nM priméru SUSO1 a SUSO2, po 100 μΜ nukleotidu dATP, dGTP, dCTP, 65 μΜ dTTP, 35 μΜ preparátu Digoxygenin-ll-dUTP (Boehringer Mannheim), 1,5 mM MgCl₂ a 2,5 U (jedn.)

• · preparátu Taq Polymerase a 10 μΐ desetinásobně koncentrovaného reakčního pufru Taq Polymerase (oba preparáty od Life Technologies). Konečný objem reakční směsi byl 100 μΐ. Amplifikace byla provedena v přístroji PCR-Gerát (TRIO^ Thermoblock, Biometra) při následujícím teplotním programu:

3’(min) při 95 °C (jednou); 45’’ (sec.) při 95 °C - 45’’ při 55 °C - 2’při 72 °C (30 cyklů); 5’ při 72 °C (jednou). Vzniklý DNA-fragment měl délku 553 bp. Vložení Digoxygenin-ll-dUTP do PCR-produktu bylo prokázáno podle nepatrné mobility v agarosovém gelu ve srovnání s produktem kontrolní reakce bez Digoxygenin-ll-dUTP.

Karoypticko-specifická cDNA-banka z pšenice z Příkladu 1 byla prozkoumána pomocí získané sondy značené digoxygeninem.

Postup hybridizace byl proveden přes noc v 5X SSC, 0,2 % SDS, 0,1 % natriumlaurylsarkosin a 50 pg/ml DNA sledího spermatu (Heringssperma) při teplotě 68 °C za přídavku 1 ng/ml digoxygeninem značené sondy. Po hybridizaci byly filtry promyty 2X5’ve 2XSSC, 1 % SDS při laboratorní teplotě; 2X10’ v 1XSSC, 0,5 % SDS při 68 °C; 2X10’v 0,5XSSC, 0,2 % SDS při 68 °C. Pozitivní klony byly získány minimálně dvěma dalšími screeningovými postupy. Excisí in vivo byly z fágových klonů získány pBluescript SK plasmidy (protokoly podle údajů výrobce; Stratagene, Heidelberg, Německo).

Po restrikční analýze byl získaný klon pTaSU8A uložen v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur DSMZ - Deutsche Sammlung fůr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH pod číslem DSM 12795 a byl dále analyzován.

Příklad Ε

Sekvenční analýza cDNA-insertu v plasmidů pTaSU8A

Nukleotidová sekvence cDNA-insertu v plasmidů pTaSU8A byla stanovena pomocí didesoxynukleotidové metody (Seq.ID No.6).

Tato inserce klonu pTaSU8A má délku 2437 bp a představuje parciální cDNA. Při porovnání s dosud publikovanými sekvencemi se ukázalo, že sekvence označená jako Seq. ID No.6 zahrnuje kódující oblast vykazující homologii s isoamylasami z jiných organismů. Rovněž tak proteinová sekvence, odvozená z kódující oblasti klonu pTaSU8A, znázorněná jako Seq. ID No.7, vykazovala homologii s proteinovými sekvencemi isoamylas z jiných organismů.

Z porovnáni sekvencí klonu pTaSU19 (Seq.ID No.l) a pTaSU8A (Seq.ID No.6) vyplývá 96,8%-ní podobnost. Většina rozdílů mezi oběma sekvencemi spočívá ve 3’-nepřenosové oblasti cDNA. Ostatní rozdíly v sekvencích v kódující oblasti způsobují různé aminokyseliny celkem ve dvanácti pozicích odvozených proteinových sekvencí (Seq.ID No.3 a 7). cDNA obsažené v pTaSU19 a pTaSU8A nejsou identické a kódují isoformy isoamylas z pšenice.

Příklad F

Příprava rostlinného transformačního vektoru pTa-alfa-SU8A

Pro expresi antisense-RNA odpovídající TaSU8A-cDNA byl na základě základního plasmidů pUC19 konstruován rostlinný transformační vektor pTa-alfa-SU8A, v němž byla spojena část TaSU8A-cDNA v antisense-orientaci s 3’-koncem ubiquitinového promotoru. Tento promotor se skládá z prvního nepřenosového exonu a prvního intronu ubÍqužtin I genu z kukuřice (Christensen A.H. a spol., Plant Molecular Biology 18 (1992), 675 - 689). Části polylinkeru a NOS-terminátor pocházejí z plasmidu pACTl.cas (CAMBIA, TG 0063; Cambia, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601, Austrálie). Vektorové konstrukty s tímto terminátorem a konstrukty založené na pACTl.cas jsou popsány v práci McElroy a spol. (Molecular Breeding 1 (1995), 27 - 37). Vektor s ubiquitinovým promotorem, polylinkerem a NOS-terminátorem na základě pUC19 byl pojmenován pUbi.cas.

Pro klonování pTa-alfa-SU8A byla pomocí PCR amplifikována část TaSU8A-cDNA o velikosti cca 2,2 kb, a to pozice 140 - 2304 ze Seq. ID No.6.

Primery použité při této reakci byly následující:

SUEX3:

5’-GCG GTA CCT CTA GAA GGA GAT ATA CAT ATG GCG GAG GAC AGG TAC GCG CTC-3’ (Seq.ID No.10), a

SUEX4:

5’-GCT CGA GTC GAC TCA AAC ATC AGG GCG CAA TAC-3’ (Seq.ID No.11).

Jako templát byl do reakce použit 1 ng plasmidu pTaSU8A. PCR-reakční směs kromě toho obsahovala: po 300 nM primerů SUEX3 a SUEX4, po 200 μΜ nukleotidu dATP, dGTP, dCTP a dTTP, 1,6 mM MgCl₂, 60 mM Tris-S04 (pH 9,1), 18 mM (NH^^SO^ a rovněž 1 μΐ preparátu Elongase^ Enzym Mix (směs • · · · · * · · · • · · · · · · · ···

- 49 • · · · · · · ···*···· ·· · · · ·· ·

Taq Polymerase a DNA Polymerase, Life Technologies). Konečný objem reakční směsi byl 50 μί. Amplifikace byla provedena v přístroji PCR-Gerát (TRIO^ Thermoblock, Biometra) při následujícím teplotním programu: 1’(min) při 94 °C (jednou); 30’’ (sec.) při 95 °C - 30” při 55 °C - 2’30’’ při 68 °C (30 cyklů); 10’ při 68 °C (jednou). Při této reakci vznikl DNA-fragment o délce 2205 bp.;

Tento 2,2 kb-produkt byl restringován pomocí Kp«I a SaZl a byl navázán do expresního vektoru pUbi.cas upraveného pomocí K/?«I a S«Z1. Takto vzniklý rostlinný transformační vektor byl označen jako pTa-alfa-SU8A a byl použit pro transformaci pšenice podle výše uvedeného postupu.

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Molekula nukleových kyselin kódující protein s funkci isoamylasy z pšenice, vybraná ze skupiny kterou tvoři (a) molekula nukleové kyseliny kódující protein, která zahrnuje sekvenci aminokyselin uvedenou pod Seq ID NO. 3 , (b) molekula nukleové kyseliny zahrnující nukleotidovou sekvenci uvedenou pod Seq ID No. 2 nebo její část nebo tomu odpovídající ribonukleotidovou sekvenci;

   (c) molekula nukleové kyseliny hybridizovaná s některou z molekul nukleové kyseliny uvedené pod (a) nebo (b) nebo je k ní komplementární, a (d) molekula nukleové kyseliny, jejíž nukleotidová sekvence je na základě degenerace genetického kódu odlišná od sekvence molekul nukleové kyseliny uvedené pod (a) , (b) nebo (c) , přičemž molekula nukleové kyseliny, uvedená pod (a), (c) a (d) , vykazuje homologii přes 90 % se Seq ID No. 2 .
2. 2. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 , vyznačující se tím, že jde o molekulu DNA.
3. 3. DNA-molekula podle nároku 2 , vyznačující se tím, že jde o molekulu cDNA.

   • · · · · ··· ······· · · ··· · · ···
4. 4. Molekula nukleové kyseliny podle jednoho nebo více z nároků 1 až 3, která obsahuje regulační prvky.
5. 5. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 , vyznačující se tím, že jde o molekulu RNA.
6. 6. Molekula nukleové kyseliny, která je specificky hybridizovaná s molekulou nukleové kyseliny podle některého z nároků 1 až 5 a která vykazuje homologii se Seq ID No. 2 přes 90 % .
7. 7. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 6, kterou je oligonukleotid o délce minimálně 15 nukleotidů.
8. 8. Vektor, obsahuj ící DNA-molekulu podle některého z nároků 1 až 5 .
9. 9. Vektor podle nároku 8, v němž je uvedená molekula nukleové kyseliny spojena s regulačními prvky v senseorientaci, která zajišťuje transkripci a syntézu přenosové RNA do pro- nebo eukaryontických buněk.
10. 10. Vektor podle nároku 8, v němž je uvedená molekula nukleové kyseliny spojena s regulačními prvky v sense-orientaci, která zajišťuje transkripci a syntézu nepřenosové RNA do pro- nebo eukaryontických buněk.
11. 11. Vektor podle nároku 8, v němž je uvedená molekula nukleové kyseliny spojena s regulačními prvky v antisenseorientaci, která zajišťuje transkripci a syntézu nepřenosové RNA do pro- nebo eukaryontických buněk.

    11 11 1111 1
12. 12. Hostitelská buňka, která je transformovaná molekulou nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 1 až

    5 nebo vektorem podle jednoho nebo několika nároků 8 až 11, nebo buňka z takovéto buňky pocházející.
13. 13. Protein, kódovaný molekulou nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 1 až 4.
14. 14. Způsob přípravy proteinu podle nároku 13, při kterém se hostitelská buňka podle nároku 12 kultivuje za podmínek, umožňuj ících syntézu uvedeného proteinu a tento uvedený protein se z kultivovaných buněk a/nebo z kultivačního media izoluj e.
15. 15. Způsob přípravy transgenní rostlinné buňky, při kterém se

    a) molekula nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 1 až 5 nebo

    b) vektor podle jednoho nebo několika nároků 8 až 11 integruje do genomu rostlinné buňky.
16. 16. Transgenní rostlinná buňka, transformovaná molekulou nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 1 až 4 nebo jedním nebo více vektory podle nároků 8 až 11, nebo buňka z takovéto buňky pocházej ící.
17. 17.

    Způsob výroby transgenní rostliny, při kterém se al) molekula nukleové kyseliny podle jednoho nebo několika nároků 1 až 5 nebo ·»·« ·» » ·· · • « · · · · · < » · · · • ···· ··· • ···· ···· · • · ··· ··· ·*·» ·»·· ·· ··· β« ··· a2) vektor podle jednoho nebo několika nároků 8 až 11 integruje do genomu rostlinné buňky a

    b) z uvedené rostlinné buňky se regeneruje celá rostlina.
18. 18. Rostlina, obsahující rostlinnou buňku podle nároku 16

    19. nou. Rostlina podle nároku 19, která je užitkovou rostli- 20. jící Rostlina škrob. podle nároku 19, která je rostlinou ukláda- 21. linou Rostlina podle nebo rostlinou nároku 20, kukuřice. která je monokotylní rošt- 22. Rostlina podle nároku 21, která je rostlinou žita,

    ječmene nebo pěnice.
19. 23. Množitelský materiál rostliny podle jednoho nebo několika nároků 18 až 22.
20. 24. Použití části rostliny podle nároku 16 , rostliny podle jednoho nebo více nároků 18 až 22 nebo množitelského materiálu podle nároku 23 pro výrobu škrobu.