CZ2000413A3

CZ2000413A3 - Léčba akutního poškození plic a fibrózy antagonisty alfavß6

Info

Publication number: CZ2000413A3
Application number: CZ2000413A
Authority: CZ
Inventors: Xiaozhu Huang; Dean Sheppard; Robert Pytela
Original assignee: The Regents Of The University Of California
Priority date: 1997-08-08
Filing date: 1998-08-07
Publication date: 2000-11-15
Also published as: DK1930022T3; US7544358B2; DK1504764T3; HU228900B1; PT996460E; EP1504764B1; KR20010022740A; BR9814040A; EE04752B1; DE69828614D1; PL201716B1; CY1111792T1; KR100586202B1; AU739283B2; US6316601B1; US20010056076A1; TR200000374T2; EP0996460A1; NZ515955A; HUP0003547A2

Description

Léčba akutního poškození plic a fibrózy antagonísty ανββ

Oblast techniky

Vynález se týká nových terapeutických přístupů při léčbě poškození plic a pulmonární fibrózy.

Dosavadní stav techniky

Integriny jsou heterodimérní buněčné adhezní receptory, které tvoří dvě pod jednotky a a β. Integrin ανββ je receptor fibronektinu a tenascinu, který převážně exprimují epiteliální buňky. Ve zdravých tkáních dospělých primátů se mRNA a protein β6 detekuje jen vzácně, ačkoli ββ se exprimuje během fetálního vývoje, hojení ran a v některých epiteliálních nádorech.

V případě, že se βδ exprimuje v linii buněk karcinomu tlustého střeva, kde se v normálním případě nevyskytuje, exprese podjednotky propůjčuje schopnost proliferace. Oblast C-konce zahrnující 11 aminokyselin, která se vyskytuje pouze v pod jednotce βδ, je nutná při zvýšené proliferační aktivitě integrínu ανββ (popisuje se v publikaci Agrez et al., J. Cell. Biol. 127: 547-556 (1994)). Expresi β6 je možné vyvolat v aveolárních epiteliálních buňkách typu II, když dojde k poškození zavedením živých bakterií injekcí. Expresí β6 je možné pozorovat ve fokálních místech sub-klinického zánětu, stejně jako u různých klinických preparátů získaných z pacientů s chronickým nebo akutním zánětem plic nebo ledvin (Bruess et al., J. Cell Sci. 108: 2241-2251 (1995)).

V publikaci Huang et al., J. Cell Biol. 133: 921-928 (1996) se popisují myši homozygotní v případě nulové mutace v genu kódujícího pod^jednotku β6, které jsou v mládí holé, což je spojeno s infiltrací makrofágů do kůže a s hromaděním aktivních lymfocytů v okolí dýchacích cest v plicích.

Pulmonární fibróza je běžným onemocněním, které je pravděpodobně způsobeno destruktivními účinky produktů uvolněných z leukocytů (popisuje se například v publikaci • · · ·· · • · · ·· »9

Marshall et al., Int. J. (1997)). Poranění plic bleomycínem jsou spojené

Biochem. Cell Bio. 29: 107-120 a pulmonární fibróza vyvolaná a mohou záviset na zesílení a aktivaci lymfocytů (popisuje se v publikaci Schrier, D. J. et al., Am. J. Pathol. 116: 270-278 (1984)). Při léčbě parenchymatického poranění plic a pulmonární fibrózy je možné použít „anticytokin (popisuje se v publikaci Coker et al., Thorax 52 (2): 294-296 (1997)).

Současné terapie akutního plicního poškození a pulmonární fibrózy jsou do velké míry neadekvátní (popisuje se v publikaci King et al., „Idiopathyc Pulmonary Fibrosis and other Interstitial Lung Diseases of Unknow Etiology, in Textbook of Respirátory Medicine, Murray and Naděl, eds., W. B. Saunders, Philadelphia, PA, pp. 1827-1839 (1994)). Proto je nutné vytvořit léčbu akutního poškození plic a pulmonární fibrózy.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje farmaceutickou kompozici pro léčení akutního poškození plic, která obsahuje jako účinnou látku antagonistu ανβδ, přičemž antagonista je s výhodou protilátka, která specificky váže β6. Protilátkou je s výhodou monoklonální protilátka. Antagonista s výhodou obsahuje aminokyselinovou sekvenci RGD.

Popisná část se zabývá rovněž léčbou pacientů trpících akutním poškozením plic, která zahrnuje aplikaci léčebné dávky antagonisty ανβδ. Dále se popisují způsoby inhibující metastázy do plic, které zahrnují aplikaci terapeutické dávky antagonisty ανβ6. Rovněž se popisuje způsob léčby pacienta

♦ · Α·

2a trpícího fibrózou, který zahrnuje aplikaci terapeutické dávky antagonisty ανββ.

Dále vynález popisuje monoklonální protilátky produkované hybridomem ATCC HB12382.

Dále vynález zahrnuje hybridom ATCC HB12382.

φ φ φ φ · φ φ φ φ φ φ • · φ φ φ φ φ φ φ φ ·

Ό Φ Φ ΦΦΦ · Φ Φ Φ Φ φ φ φ φ ΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦΦ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ

Vynález popisuje způsoby a kompozice vhodné pro léčbu akutního poškození plic, jako je například poškození plic spojené s bakteriální sepsí, hemoragickým šokem, inhalací toxických látek, aplikací bleomycinu a jiných léků, které vyvolávají poškození plic. Kompozice podle vynálezu je možné použít při léčbě fibrózy u epiteliálních orgánů, jako jsou plíce, játra, ledviny, močový měchýř a jícen.

Takové kompozice je možné aplikovat pacientům, kteří trpí symptomy akutního plicního poškození nebo fibrózy, nebo u těchto pacientů existuje nebezpečí tohoto onemocnění. Kompozice je možné těmto pacientům aplikovat jako profylaxi nebo terapii. Například pacienti, kteří byli vystaveni inhalaci toxické látky, budou pravděpodobně po takové inhalaci léčeni, zatímco pacient, kterému se aplikuje bleomycin se může ošetřit profylakticky a/nebo terapeuticky. V typickém případě se kompozice podle vynálezu aplikují denně po dobu nejméně jednoho až pěti dní, ačkoli pacienti trpící progresivní pulmonární fibrózou mohou dostávat terapeutické dávky po několik měsíců až let. Termín „terapeutická dávka znamená dávku, která u pacienta předchází, zmírňuje, zeslabuje nebo jinak omezuje vážnost symptomů.

V jiných provedeních vynálezu se popisují antagonisty ανββ. Takové antagonisty zahrnují, ale nejsou omezeny na protilátky, které specificky váží ββ, protilátky, které specificky váží ligandy vhodné pro ανββ, antimediátorové nukleové kyseliny a peptidové, peptidominotické analogy takových ligandu a analogy takových ligandu které nejsou peptidy.

Protilátky mohou být syntetické, monoklonální nebo polyklonální a mohou se připravovat způsobem dobře známým v oboru. V preferovaném provedení vynálezu je antagonísta protilátka, která specificky rozeznává cytoplazmatickou oblast pod jednotky ββ (popisuje se například v publikaci Weinacker et al., J. Cell Biol. 269: 1-9 (1994)). V případě terapeutických

99 •· ·»··

9 *

9 9 9

9 9 9 «

aplikací se preferují „lidské monoklonální protilátky obsahující lidské konstantní a variabilní oblasti. Preferují se proto, protože se minimalizuje imunitní odezva pacienta proti protilátkám. Takové protilátky se mohou vytvořit imunizací transgenních zvířat, která nesou geny lidských imunoglobinů (popisuje se v publikaci Jakobovits et al., Ann.

Ve spojení se syntetickými takové termíny zahrnují s „přepínacím” izotypem,

NY Acad. Sci. 764: 525-535 (1995)). a semi-syntetickými protilátkami fragmenty protilátek, protilátky humanizované protilátky (např. myší-lidské, lidské-myší a podobně), hybridy, protilátky vykazující plurální specifitu, plně syntetické molekuly podobné protilátkám a podobně.

Jak se popisuje dále v textu u protilátek je možné testovat schopnost blokovat navázání ligandqna ανββ a/nebo jiné vlastnosti, jako je schopnost ochrany in vivo proti pulmonární fíbróze vyvolané bleomycinem. Příklad anti-βδ monoklonálních protilátek je 10D5 (ATCC číslo uložení HB12382, uloženo 6. Srpna 1997) .

V jiném provedení vynálezu se používají antagonisty, kterými jsou peptidy, polypeptidy, proteiny nebo analogy napodobující peptidy, které tvoří ligandy pro ανβ6 na základě přítomnosti buněčné adhezní domény arginin-glycin-kyselina asparágová (RGD). Tvorba takových molekul, jako 1igand^vhodný^ například popisuje v publikacích . Cell. Biochem. 56: 150-154 (1994),

Ruoslahti, Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 12: 697-715 (1996),

Chorev et al., Biopolymers 37: 367-375 (1995), Pasqualini et al., J. Cell. Biol. 130: 1189-1196 (1995) a Smith et al., J.

Biol. Chem. 269: 32788-32795 (1994)).

V některých provedeních vynálezu se molekuly antimediátorové nukleové kyseliny používají jako antagonisty ανβ6. Molekuly „antisense nukleové kyseliny jsou komplementární oligonukleotidové řetězce nukleových kyselin vytvořených tak, že se váží na specifickou sekvenci pro integriny, se Pierschbacher et al.,

A A AAAA • AA

A • A

AA AA » A · · » · · ·

I A A · ft A A ·

A· ·· nukleotidů, přičemž inhibuji produkci cílového proteinu. Nukleotidová sekvence podjednotky integrinu β6 se popisuje v dokumentu U.S.S.N. 07/728,215, podaném 11. července 1991, začleněný zde jako odkaz. Tato činidla je možné použít samotná nebo v kombinaci s jinými antagonisty. „Antisense antagonista může poskytovat „antisense oligonukleotid, jako je RNA (popisuje se například v publikaci Murayama et al. , Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7: 109-114 (1997)) . „Antisense geny se mohou nacházet také ve virových vektorech, jako je například virus hepatitidy B (popisuje se v publikaci Ji et al., J. Viral Hepat. 4: 167-173 (1997)), v adeno-asociovaném viru (popisuje se například v publikaci Xiao et al. , Brain Res. 756: 76-83 (1997)) nebo v jiných systémech zahrnujících například HVJ(Sandai virus)-liposomový systém pro zavádění genů (popisuje se v publikaci Kaneda et al. , Ann. N. Y. Acad. Sci. 811:299-308 (1997)), „peptidový vektor (popisuje se například v publikaci Vídal et al., CR Acad. Sci III 32) : 297287 (1997)), jako gen v epizomálním nebo v plazmidovém vektoru (popisuje se v publikaci Cooper et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 94: 6450-6455 (1997), Yew et al. , Hum. Gene Ther. 8:

575-584 (1997)), jako gen v agregátu peptid-DNA (popisuje se například v publikaci Niidome et al. , J. Biol. Chem. 272: 15307-15312 (1997)), jako „holá DNA (popisuje se např. v dokumentu U.S. 5,580,859 a U.S. 5,589,466) a v lipidových vektorových systémech (popisuje se například v publikaci Lee et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14: 173-206 (1997)) .

U kandidátů antagonistů ανβ6 se může testovat jejich funkce za použití řady metod známých v oboru a/nebo popsaných v uvedené přihlášce. Takovými funkcemi může být ochrana proti fibróze indukované bleomycinem u myšího modelu, inhibice proliferace nádorových buněk (popisuje se v publikaci Agrez et al. , J. Cell Bio., 127: 547-556 (1994)) a inhibice migrace buněk a/nebo inhibice buněčné adheze (popisuje se v Příkladech provedení vynálezu).

9999

999 · 9

99

9 9

9 9 9

9 9

99

Velké množství vhodných formulací antagonistů podle vynálezu se mohou nacházet ve formulacích, které jsou dobře známy v oboru farmakologie (popisuje se například v publikaci Remingston' s Pharmaceutical Sciences, (15^th Edition, Mack Publíshing Company, Easton, Pennsylvania (1975)), zvláště v kapitole 87, Blaug, Seymour. Tyto formulace například zahrnují prášek, pasty, masti, gel, vosky, oleje, lipidy, nevodné absorpční báze, emulze olej ve vodě nebo voda v oleji, emulze karbowax (polyethylenglykol s různými molekulárními hmotnostmi), semi-pevné gely a semi-pevné směsi obsahující karbowax.

Množství aktivní složky nezbytné pro účinnou terapii závisí na mnoha různých faktorech, které zahrnují způsoby aplikace, cílové místo, fyziologický stav pacienta a aplikace jiných medikamentů. Léčebná dávka by se měla určit titrací, aby se optimalizovala bezpečnost a účinnost. V typickém případě dávky používané in vitro mohou být dobrým základem pro množství aktivních látek použitelných při aplikaci in šitu. Pro stanovení správné dávky je také možné použít hodnoty stanovené testováním na zvířatech. Další úvahy se popisují například v publikaci Goodman and Gilman's the Pharmacological Basis of Terapeutics, 7 th

Publíshing Company, New York,

Edition (1985), MacMillan a Remington' sPharmaceutical

Science 18 th Edition, (1990) Mack Publíshing Co, Easton Penn. Způsob aplikace zahrnují orální, intravenózní, intraperitoneální, intramuskulární, transdermální, nasální, intoforetickou aplikaci a podobně.

Kompozice podle vynálezu se mohou aplikovat v různých formách jednotkové dávky v závislosti na způsobu aplikace. Jednotkové dávkové formy vhodné pro orální aplikaci existují například v pevné formě, jako je prášek, tablety, pilulky, kapsle a draže, a v kapalné jednotkové formě, jako je elixír, sirup a suspenze. Aktivní složky se mohou aplikovat parenterálně, jako sterilní kapalná dávková forma. Želatinové ·· *4 > · 9 * » · · · » 4 ··« 9 >9 · ·· ·· ·· ···· r · « » · « » · « » · 4 4 ♦ 4 99 kapsle obsahují aktivní složku a dále jako neaktivní složku obsahují práškové nosiče, jako je glukosa, laktosa, sacharosa, manitol, škrob, celulosa nebo deriváty celulosy, stearat horečnatý, kyselinu stearovou, sacharin sodíku, talek, uhličitan horečnatý a podobně. Příklady dalších aktivních složek, které se mohou přidat, aby vznikla požadovaná barva, chuú, stabilita, tlumící kapacita, disperze nebo jiné požadované rysy, zahrnují červený oxid železitý, silikagel, laurylsulfat sodíku, oxid titaničitý, poživatelná bílá barva a podobně. Podobná ředidla se mohou použít při přípravě lisovaných tablet. Tablety i kapsle se mohou vyrábět jako kapsle s prodlouženým účinkem, které uvolňují aktivní látku bez přerušení po dobu několika hodin. Lisované tablety mohou být potažené cukrem, aby se překryla nepříjemná chuú a aby se tableta ochránila před působením okolních podmínek. Tablety mohou být ve formě enterosolventních tablet, aby došlo k selektivnímu uvolnění v gastrointestinálním traktu. Kapalné dávkové formy vhodné pro orální aplikaci mohou obsahovat barvivo a příchutě, aby byly pro pacienta přijatelnější.

Koncentrace kompozic podle vynálezu ve farmaceutických formulacích značně kolísá. Koncentrace se pohybuje v rozsahu méně než asi 0,1 %, obvykle alespoň asi 2 %, stejně jako 20 až 50 % nebo více hmotnostních procent. Vhodná koncentrace se vybírá primárně na základě objemu a viskozity kapaliny v souladu s určitým modem vybrané aplikace.

Kompozice podle vynálezu se může aplikovat pomocí liposomů. Liposomy zahrnují emulze, pěny, micela, nerozpustné monovrstvy, kapalné krystaly, fosfolipidové disperze, lamelární vrstvy a podobně. V těchto přípravcích kompozice podle vynálezu, která má být zavedena, je součástí liposomů, jenž je sám nebo je spojen s molekulou, která se váže na požadovaný cíl, jako je protilátka, nebo s terapeutickou nebo imunogenní kompozicí. Liposomy buď naplněné nebo obalené požadovanou kompozicí podle vynálezu se mohou aplikovat ·· *9 · 9 9 · · 9 • · ··· 9 • · · ·· ·· ·· 99··

9 · · · • 9 » • · 9 · • 9 *· • 9 99

9 9 9 • · · 9 • · t 9 • · · 9 »· er systémově nebo se mohou zavést přímo do tkáně. Liposomy tak zavádějí vybrané terapeutické/imunogenní peptidové kompozice.

Liposomy vhodné pro použití podle vynálezu jsou vytvořeny ze standardních lipidů tvořících vesíkula, které v obecném případě zahrnují neutrální a negativně nabité fosfolipidy a sterol, jako je cholesterol. Výběr lipidů probíhá na základě velikosti liposomů, odolnosti liposomů vůči kyselinám v krevním řečišti. V publikaci Szoka et al., Ann. Rev. Bíophys. Bioeng. 9: 467 (1980), U.S. patent č. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028 a 5,019,369 se popisují metody přípravy liposomů.

Suspenze liposomů obsahující kompozici podle vynálezu se může aplikovat intravenózně, lokálně, povrchově atd. v dávkách, které kolísají podle způsobu aplikace, podle způsobu cílení kompozice a stádia léčeného onemocnění.

V případě pevných kompozic se mohou použít běžné netoxické pevné nosiče, které zahrnují například manitol, laktózu, škrob, stearát hořečnatý, sacharin sodíku, talek, celulosu, glukosu, sacharosu, uhličitan hořečnatý a podobně ve stupni čistoty, který je nutný pro farmaceutické použití. V případě orální aplikace se farmaceutický přijatelná netoxická kompozice připravuje spojením normálně používaného ekcipientu, jako jsou popisované nosiče, a 10 až 95 % aktivní složky, kterou je jedna nebo více kompozic podle vynálezu. Upřednostňuje se koncentrace aktivní složky 25 až 75 %.

Při aplikaci aerosolem kompozice podle vynálezu zahrnuje povrchově aktivní činidlo a hnací látku. V typickém případě procentuální zastoupení kompozic podle vynálezu je 0,01 až 20 % hmotn. , upřednostňuje se 1 až 10 %. Povrchově aktivní činidlo nesmí samozřejmě být toxické a je výhodné, když je rozpustné v hnací látce. Představitelé takových činidel jsou estery nebo parciální estery mastných kyselin obsahující 6 až 22 atomů uhlíku, jako je kyselina kapronová, kyselina kaprylová, laurová, palmitová, stearová, linolová, linolenová, • · · · • ·

9 9 9 9 9 9 9 9 ·· · • 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 99 ·· 99 olestarová nebo olejová s alifatickým vícemocným alkoholem nebo s jeho cyklickým anhydridem. Mohou se také použít smíšené estery, jako jsou smíšené a přirozené glyceridy. Povrchově aktivní činidlo může tvořit 0,1 až 20 % (hmotn.) kompozice, upřednostňuje se 0,25 až 5 %. Zbytek kompozice tvoří obyčejná hnací látka. Je-li to nutné může se do kompozice zahrnout nosič, jako je například lecitin v případě nasální aplikace.

Konstrukty podle vynálezu se mohou navíc zavádět depotním způsobem, ve formě kapslí nebo ve formě implantátů, přičemž metody jsou dobře známy v oboru. Podobně lze konstrukty zavést do tkání pumpou.

Libovolné formulace jsou vhodné pro ošetření a léčbu podle vynálezu v případě, že aktivní látka obsažená ve formulaci jí není deaktivována a formulace je fyziologicky kompatibilní.

Popis obrázků na výkrese

Obrázek č. 1A zobrazuje graf porovnávající obsah plicního hydroxyprolinu u myší, které exprimují nulovou mutaci v genu jednotky integrinu β6, au kontrolních myší v přítomnosti bleomycinu (blm) nebo fyziologického roztoku (sal).

Na obrázku č. 1B je fotografie sekcí plic obarvených trichromem, která demonstruje masivní akumulaci kolagenní extracelulární matrice v plicích myší divokého typu (β6+/+), ale nikoli (β6-/-), léčených bleomycinem, 30 dní po léčbě.

Na obrázku č. 2 je graf porovnávající zvýšené množství vody na plicích u myší divokého typu (β6 + / + ) a u myší (ββ-/-) v přítomnosti bleomycinu (blm) nebo fyziologického roztoku (sal).

Na obrázku č. 3 je graf porovnávající recruitment lymfocytů u myší divokého typu (ββ+/+) a (ββ-/-) po aplikaci bleomycinu (blm) nebo fyziologického roztoku (sal).

Následující příklady ilustrují určité aspekty předkládaného vynálezu a pro podstatu vynálezu nejsou zamýšleny jako limitující.

• ·

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Úvod

Pulmonární fibróza je běžné onemocnění způsobené destruktivními účinky produktů uvolňujících se z leukocuytů. Ačkoli dochází během vývoje fibrózy k porušení respiračního epitelu, samotné epiteliální buňky se tohoto procesu neúčastní. Na myších exprimujících nulovou mutaci v genu pod jednotky integrinu (ββ), která je v epiteliálních buňkách zcela redukována, se testovaly účinky bleomycinu, což je aktivní látka způsobující pulmonární fibrózu. Myši β6—/— se dramaticky bránily fibróze vyvolané bleomycinem. Terapie používající tento integrin proto mohou přinést nové přístupy léčby velmi vážného onemocnění.

Integrin ανβ6 se exprimuje pouze na epiteliálních buňkách během organogeneze a jako odezva na poškození. Myši β6—/ — vykazují nadměrné zánětlivé odezvy na podkožní poranění a poranění dýchacích cest, ale vyvíjejí se a rozmnožují se normálním způsobem (popisuje se v publikaci Huang, X. Z. et al., J. Cell Biol. 133: 921-928 (1996)).

Příklad 2: Deaktivace genu pod^jednotky integrinu ββ chrání myši před pulmonární fibrózou vyvolanou bleomycinem

Pulmonární toxicita bleomycinu (0,03 jednotek (U) v 60 μΐ fyziologického roztoku) nebo fyziologického roztoku (60 μΐ) aplikovaného intratracheální injekcí se testovala na myších divokého typu (ββ+/+) a ββ-/- kmen 129SVEMS/ter s porovnatelnými charakteristikami věku a pohlaví. Pulmonární fibróza se hodnotila 15, 30 a 60 dní po ošetření, testem sledování morfologie plic a měřením obsahu hydroxyprolinu a indexem ukládání kolagenu. Fibróza byla podstatná u myší divokého typu ošetřených bleomycinem po 30 dnech a zhoršovala se až do 60-tého dne (obrázky č. 1A až 1B) . Naopak morfologie plic u myší ββ-/- zůstávala skoro normální v průběhu celého • ·

ΒΒΒΒ Β Β Β Β · Β · ΒΒΒΒ · Β Β ΒΒΒΒ

Β Β ΒΒΒ ΒΒ Β ΒΒΒ ΒΒ Β

ΒΒ Β ΒΒΒΒ ΒΒΒΒ

Β Β «· ΒΒ · Β ΒΒ · Β experimentu. Vznikly jen malé oblasti fibrózy. Obsah hydroxiprolinu v plicích se podstatně nelišil od hodnot dosažených u myší, kterým se aplikoval fyziologický roztok v libovolném uvedeném čase. Toto zjištění neplatí pouze pro myši jednoho druhu 129, protože podobných výsledků se dosáhlo u mláďat po křížení myší 129 a C57B1/6. Tyto neočekávané výsledky ukazují, že exprese integrinu ανβ6 je nutná pro vyvolání pulmonární fibrózy.

Aby se stanovila úloha ανβ6 v časných stádiích fibrózy vyvolané bleomycinem, měřil se 1, 5 a 15 dní po aplikaci bleomycinu nebo fyziologického roztoku obsah vody na plicích, jako znak pulmonárního edému, ke kterému dochází zvýšenou vaskulární permeabilitou. U myši divokého typu byl obsah vody nejvyšší pátý den po aplikaci bleomycinu a zůstal zvýšený až do 15-ého dne (obrázek č. 2) . Stejně jako je tomu v případě pulmonární fibrózy, myši β6-/- jsou chráněny před časnými účinky bleomycinu, což ukazuje úloha epiteliálního ανβ6 před vývojem vaskulárního úniku vyvolaného bleomycinem.

Dříve se publikovalo, že myši β6-/- vykazují silné jednojaderné buněčné zánětlivé odezvy na kůži a v dýchacích cestách (popisuje se v publikaci Huang, X. Z. et al. , J. Cell Biol. 133: 921-928 (1996)). Poškození plic vyvolané bleomycinem a pulmonární fibróza jsou spojeny a mohou záviset na zesílení intenzity a aktivaci lymfocytů (popisuje se v publikaci Schrier, D. J. et al., Am. J. pathol. 116: 270-278 (1984)). Za účelem zjištění, zda rezistence myší vůči poškození vyvolanému bleomycinem a fibróze je způsobena změnou zesílení intenzity lymfocytů nebo změnou aktivace, se stanovil počet CD4+ a CD8+ lymfocytů a hodnotila se aktivace lymfocytů měřením exprese receptoru interleukinu 2 (CD25) v buňkách získaných z rozsekaných plic myší, kterým se aplikoval fyziologický roztok nebo bleomycin, 5 a 15 dní po ošetření.

Výsledky odpovídají dříve stanoveným hodnotám. V plicích myší β6-/-existuje ve srovnání se zvířaty divokého typu více buněk • · · · • 9

CD4+, CD8+ a CD25+. Bleomycin vyvolal velké zvýšení počtu lymfocytů exprimujících CD4 a CD8 a značné zvýšení procenta lymfocytů exprimuj ících CD25 (obr. č. 3) u obou typů myší. U obou typů myší se maximálního zesílení intenzity a aktivace plicních lymfocytů dosáhlo 5 dní po aplikaci bleomycinu a začala klesat po 15-ti dnech po ošetření. Tato data naznačují, že není pravděpodobné, aby nedostatečnost zesílení intenzity a aktivace leukocytů u myší β6-/- byla příčinou ochrany před poškozením účinky bleomycinu.

Interakce infcegrinů s jejich matricovými ligandy moduluje několik důležitých buněčných funkcí, které zahrnují proliferaci (Agrez, M. et al. , J. Cell Biol. 127: 547-556 (1994)), možnost přežití (Lusacs, N. W. et al., Eur. J. Immunol. 25: 245-251 (1995)) a expresi cytokinů (Miyake, S. et al., J. Exp. Med. 177: 863-868 (1993)) a metaloproteinas (Werb, Z. et al. , J. Cell Biol. 109: 877-889 (1989)). Uvádí se, že pouze pod jednotka β6 tvoří jediný integrinový heterodimer ανβ6, který se vyskytuje v epiteliálních buňkách pouze omezeně. Spolu s rychlou indukcí exprese ανβ6, která následuje po poškození epitelu, se zvyšuje místní koncentrace alespoň dvou ligandů vhodných pro uvedené integriny (fibronektin a tenascin). Dříve se uvádí, že exprese ανβ6 má důležitou úlohu při ukončení zánětlivých odezev jednojaderných buněk kůže a dýchacích cest plic (Huang, X. Z. et al. , J. Cell Biol. 133: 921-928 (1996)). Zde uvedené výsledky ukazují, že tento integrin také hraje kritickou úlohu při indukci plicního poškození a pulmonární fibrózy jako odezvy na aplikaci bleomycinu.

Respirační epiteliální buňky se považují za komponenty pasivní bariéry oddělující jiné plicní buňky od potenciálně toxických komponentů inhalovaného vzduchu. Na tomto rozhraní však mají tyto buňky dobrou polohu k iniciaci a modulaci místní odezvy na poškození. Jisté důkazy naznačují, že respirační epiteliální buňky mají kapacitu syntetizovat a • · • · ♦ 9 * * 9 9 9 9 •99 9 9 9

9 9 9 9 vylučovat řadu proteinů, které mohou iniciovat a upravit odezvu na poškození. Jsou to chemokiny (např. interleukin-8, GROa,/RANTES, GMCSF, ΜΙΡ-Ια a MCP-1), jiné cytokiny (např. IL6, IL-lj. a IL15) a růstové faktory (např. TGFP) . Jedním možným mechanizmem, který se podílí ανββ na vývoji poškození plic a pulmonární fibróze, je modulace exprese jednoho nebo více proteinů.

Současné terapie pulmonární fibrózy jsou velmi neadekvátní. Výsledky uvedené studie ukazují, že respirační epiteliální buňky a epiteliální integrin ανββ má důležitou roli v patogenezi parenchymatického poškození plic a pulmonární fibrózy a že terapie, které jsou specificky navrženy tak, aby interferovaly s funkcí integrinu, jsou použitelné pro léčbu těchto většinou těžko léčitelných onemocnění plic.

Příklad 3: Tvorba blokačních protilátek

A. Tvorba monoklonálních protilátek

Aby došlo k vytvoření protilátek proti ανββ, myši ββ-/- se imunizovaly buď keratinocyty získanými z myší divokého typu nebo rekombinantními vylučovanými lidskými ανββ (Weinacker et al., J. Bíol. Chem. 269: 6940-6948 (1994)) ve Freundově adjuvans. Izolovaly se myší splenocyty a fúzovaly se s myšími buňkami myenomu SP2/0 podle standardních postupů. Buňky SW 480 transfekované β6 nebo falešně transfekované buňky SW480 sloužící jako kontroly se použily k testování výsledného supernatantu průtokovou cytometrií. Protilátky, které rozeznávají buňky SW480 transfekované β6 nikoli buňky falešně transfekované se použily v pozdějších experimentech.

B. Charakterizace monoklonálních protilátek

Aby vznikly protilátky proti myšímu ανβ6, použily se u myší ββ-/- 129/C57 jako imunogeny vylučované lidské ανββ a myší • · · · • · · · · · • · Λ

keratinocyty. U supernatantů vytvořených hybridomů se sledovalo odlišné obarvení falešně transfekovaných buněk SW480 a buněk transfekovaných β6. Výsledné protilátky Οδβ6 a 10D5 obarvily jak lidský β6 exprimovaný v buňkách SW480 a myší β6 na keratinocytech divokého typu. Οββ6 se dále charakterizovaly imunoprecipitací lyzátu lidských keratinocytů značených (³⁵S). Tyto protilátky srážely jako heterodiméry o vhodné molekulové hmotnosti, přičemž z keratinocytů β6+/+, ale nikoli z keratinocytů β6-/-, vzniká ανβ6, což indikuje, že tyto protilátky jsou specifické pro integrin ανβ6.

U protilátek Οδβ6 a 10D5 se testovala blokační aktivita, pomocí testu buněčné adheze s β6 transfekovanými buňkami SW480 a myšími keratinocyty, fibronektinu. Protilátky 10D5 inhibovaly migraci keratinocytů divokého typu na fibronektin stejně, jako je možné spatřit u keratinocytů β6-/-.

C. Test buněčné adheze

Polystyrénové mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi, které nejsou určeny pro tkáňové kultury, se potáhly vitronektinem, fibronektinem nebo kolagenem. (popisuje se v publikaci Linbro/Titertek, Flow Laboratories, McLean, VA) . Do každé prohlubně se přidalo 100 μΒ roztoku, který obsahuje různé množství matrice, a vše se inkubovalo při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny. Po inkubaci se prohlubně promyly PBS, pak se blokovaly 1 % BSA v DMEM bez séra při teplotě 37 °C po dobu 30 minut. Kontrolní prohlubně se naplnily 1 %BSA v DMEM. Buňky se odebíraly stejným způsobem, jako při migračním testu a resuspendovaly se v KGM bez séra a pak se přidaly do každé prohlubně potažené proteinem v přítomnosti nebo za nepřítomnosti PMA. V případě blokačního experimentu se buňky před nanesením na plotnu inkubovaly s protilátkami po dobu 5 minut při teplotě 4 °C. Destičky se před inkubací po dobu 1 hodiny při teplotě 34 °C v atmosféře 7 % CO₂ centrifugovaly • · · · • · ♦ · · · • · · · · · • · ♦ · · · · • · · ···· ··«· (horní stranou nahoru) při 10 x g po dobu 5 minut. Nepřichycené buňky se odstranily centrifugací při 48 x g po dobu 5 minut, přičemž destičky jsou uloženy horní stranou dolů. Přichycené buňky se fixovaly 1 % formaldehydem a obarvily se 0,5 % krystalickou violetí, pak se buňky promyly PBS. Relativní počet buněk v každé prohlubni se hodnotil stanovením absorbance při vlnové délce 595 nm na zařízení Microplate Reader (Bio-Rad).

D. Migrační test

Testy migrace buněk se uskutečnily na destičkách potažených matrici s prostupnými prohlubněmi (póry o velikosti 8 μπι, Costar, Cambridge, MA) . Spodní povrch membrány se potáhl kolagenem (10 gg/ml), fibronektinem (10 μg/ml) nebo vitronektinem (10 μg/ml) v PBS po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C a blokoval se 1 % BSA. Primární kultivované keratinocyty se odebraly za použití trypsinu/EDTA a trypsin se deaktivoval sojovým inhibitorem trypsinu. Buňky se suspendovaly v KGM bez séra a nanesly se na destičky do horní komory při hustotě 3,6 x 10⁴ buněk do jedné prohlubně ve 100 μΐ kultivačního média v přítomnosti nebo v nepřítomnosti forbolmeristatacetatu (PMA, 10 ng/ml). Při inhibičních experimentech se do horní a spodní komory přidaly protilátky v přítomnosti PMA. Po 6 hodinách inkubace se buňky fixovaly 2 % paraformaldehydem a obarvily se 0,5 % krystalickou violetí v 1 % formaldehydu. Buňky v horní komoře se odstranily a určil se počet buněk na spodním povrchu při velkém zvětšení (40x). Počítalo se velké množství polí v mřížce a pro každé studované podmínky se určila průměrná hodnota.

Příklad 4: Myši s deaktivovaným β6 vykazují omezený výskyt metastáz v plicích.

Transgenní myší linie, u které se spontánně vyvinuly metastázy karcinomu prsu (myši MMTV-mTAg) se křížily s myšmi • · · · • · • · s deaktivovaným ββ. (J mláďat křížených myší, kterým chybí ββ, se vyvinuly rychle rostoucí primární nádory prsní žlázy, ale došlo k značnému omezení výskytu a rozsahu metastáz plic ve srovnání s mláďaty, které exprimují ββ. Imunohistochemie ukázala, že ββ se silně exprimuje na okrajích lézí metastáz. To naznačuje, že ββ je v tomto modelu nutný pro maximální tvorbu metastáz.

Protože myši s deaktivovaným ββ mají chronický zánět plic, je možné, že omezení metastáz je způsobené přítomností zánětu v plicích, což interferuje s růstem metastáz. Aby se prozkoumala tato otázka provedly se dva experimenty:

1. Buněčné linie exprimující ββ získané z primárního nádoru se zavedly injekcí do syngenních myší, které jsou buď divokého typu nebo mají deaktivovaný ββ. Metastázy plic se objevily rychle u obou typů myší, což naznačuje, že přítomnost zánětu u myší s deaktivovaným ββ neinterferuje s růstem nádorových buněk v plících.

2. Buněčné linie získané z myší buď s deaktivovaným ββ nebo myší divokého typu se zavedly injekcí do sy^enních myší divokého typu. U myší, kde se zavedly buněčné linie divokého typu bez rozdílu vznikly plicní nádory, zatímco u myší, kam se zavedla buněčná linie s deaktivovaným ββ, se uvedené nádory neobjevily. Tento experiment naznačuje, že ββ nádorových buněk je v tomto systému nutný pro maximální tvorbu metastáz.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutická kompozice pro léčení akutního poškození plic, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou látku antagonistu ανββ.
2. Farmaceutická kompozice nároku 1, yznačující se tím, že antagonista je protilátka, která specificky váže β6.
3. Farmaceutická kompozice podle nároku 2, vyznačující se tím, že protilátka je monoklonální protilátka.
4. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že antagonista obsahuje aminokyselinovou sekvenci RGD.
5. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že antagonista obsahuje molekulu „antisense nukleové kyseliny.
6. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že je určena pro terapeutické podání.
7. Farmaceutická kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že je určena pro profylaktické podání.
8. Farmaceutická kompozice pro léčbu fibrózy, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou látku antagonistu ανββ.
9. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že fibróza je pulmonární fibróza.
10. Farmaceutická kompozice podle nároku 9, vyznačující se tím, že pulmonární fibróza je výsledkem akutního poškození plic.

• · • · · • · • · 9 9 9 9
11. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že antagonista je protilátka, která specificky váže ββ.
12. Farmaceutická kompozice podle nároku 11, vyznačující se tím, že protilátka je monoklonální protilátka.
13. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že antagonista obsahuje aminokyselinovou sekvenci RGD.
14. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že antagonista obsahuje molekulu „antisense nukleové kyseliny.
15. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, že je určena pro terapeutické podání.
16. Farmaceutická kompozice podle nároku 8, vyznačující se tím, zeje určena pro profylaktické podání.
17. Monoklonální protilátka, kterou produkuje hybridom ATCC

HB12382.
18. Hybridom ATCC HB12382.