CZ20004088A3

CZ20004088A3 - Transgenické rostliny s modifikovanou aktivitou plastidového přenašeče ADP/ATP

Info

Publication number: CZ20004088A3
Application number: CZ20004088A
Authority: CZ
Inventors: Ekkehard Neuhaus; Torsten Moehlmann; Karl-Heinz Graeve-Kampfenkel; Joachim Tjaden
Original assignee: Plantec Biotechnologie Gmbh Forschung & Entwicklung
Priority date: 1999-05-12
Filing date: 1999-05-12
Publication date: 2001-04-11

Abstract

Jsou popsány transgenické rostlinné buňky a rostliny, které ve srovnání s buňkami a rostlinami divokého typu vykazují zvýšený výtěžek, zvláště pak zvýšený obsah oleje a/nebo škrobu a s výhodou syntetizují modifikovaný škrob. Popsané rostliny vykazují zvýšenou nebo sníženou aktivitu plastidového přenašeče ADP/ATP.

Description

Transgenické rostliny s modifikovanou aktivitou plastidového přenašeče ADP/ATP

Oblast techniky

Vynález se týká transgenických rostlinných buněk a rostlin se zvýšenou aktivitou plastidového přenašeče ATP/ADP. Takovéto buňky a rostliny se vyznačují vyšším výtěžkem, s výhodou pak zvýšeným obsahem oleje a/nebo škrobu a syntetizují s výhodou škrob se zvýšeným obsahem amylosy.

Dále se tento vynález týká transgenických rostlinných buněk a rostlin se sníženou aktivitou přenašeče ADP/ATP. Takovéto buňky a rostliny syntetizují škrob s nižším obsahem amylosy.

Dosavadní stav techniky

V zemědělství a lesnictví neustále trvá snaha získání rostlin s vyšším výtěžkem, především proto, aby byly dostatečně zajištěny potravinové nároky stále rostoucí populace a k zajištění zásob regenerujících se surovin. V tradičním pojetí jsou takové rostliny s vysokým výtěžkem získávány šlechtěním. Tento způsob je však finančně a časově náročný. Navíc musí být odpovídající šlechtitelské programy prováděny pro každý rostlinný druh, o nějž máme zájem.

Pokroku bylo částečně dosaženo genetickými manipulacemi rostlin, tj. účelným zavedením a expresí molekul rekombinantních nukleových kyselin do rostlin. Výhoda takových postupů tkví obecně v tom, že nejsou omezeny pouze na jeden rostlinný druh, ale je možné je stejně tak aplikovat na jiné rostlinné druhy.

Mimo jiné například v EP-A 0 511 979 byla popsána zvýšená produkce biomasy způsobená expresí prokaryotické asparaginsyntetasy v rostlinných buňkách. Jak bylo popsáno například ve WO 96/21737, byl zvýšen výnos rostlin způsobený expresí deregulované nebo neregulované fruktosa-1,6-bisfosfatasy v důsledku zvýšené rychlosti fotosyntézy. Nicméně je stále zapotřebí obecně aplikovatelné metody vedoucí ke zvýšení výnosů rostlin zajímavých pro zemědělství či lesnictví.

Dále, vzhledem k faktu, že sloučeniny obsažené v rostlinách hrají stále důležitější roli obnovitelných zdrojů surovin, je jedním z problémů biotechnologického výzkumu přizpůsobení zmíněných rostlinných surovin požadavkům zpracovatelského průmyslu.

K umožnění použití regenerujících se surovin v co nejvíce oborech je navíc nutné do-

• « * ·» ···· • 9 · ·«·· · · · ·

9 · · · 9 9 9 9

299999» · ·' · · ·· · • 9 9 9 9 9 9 9

999 · ···«··» · » 9 1 · sáhnout široké škály sloučenin. Ke zvýšení účinnosti produkce obnovitelných zdrojů surovin z rostlinných zdrojů je dále nutné zvýšit výtěžek zmíněných látek s rostlinným obsahem.

Kromě tuků a proteinů patří k nezbytným obnovitelným rostlinným surovinám polysacharidy a oleje. Ústřední roli u polysacharidů zde vedle celulosy hraje škrob, který je jednou z nejdůležitějších zásobních látek ve vyšších rostlinách. Z těchto rostlin jsou zvláště zajímavými brambory a kukuřice, protože jsou důležitými pěstovanými rostlinami pro produkci škrobu.

Kromě použití polysacharidu škrobu, který je jednou z nejdůležitějších zásobních látek rostlinného světa, v potravinářském průmyslu, je široce používán coby obnovitelná surovina pro výrobu průmyslových produktů.

Průmysl zpracování škrobu má velký zájem o rostliny s vyšším obsahem škrobu, přičemž je pravidlem, že tyto rostliny mají vyšší suchou hmotnost. Zvýšená suchá hmotnost zvyšuje, díky vyššímu obsahu škrobu, hodnotu průmyslově zpracovaných rostlin (kukuřice, brambory, tapiok, pšenice, ječmen, rýže, atd.). Rostlinné buňky nebo orgány obsahující vyšší množství škrobu mají navíc výhodu při průmyslovém zpracování v tom, že absorbují méně tuku nebo oleje na smažení. To vede ke „zdravějším“ produktům s nižším kalorickým obsahem. Zmíněná vlastnost má velký význam např. při výrobě popcornu, kukuřičných nebo bramborových lupínků, křupek nebo bramborových smaženek z brambor.

Při průmyslovém zpracování brambor je suchá hmotnost (obsah škrobu) kritickou hodnotou, jelikož jsou tímto parametrem určeny náklady. Zvýšená suchá hmotnost (obsah škrobu) znamená, že je sníženo množství vody v hlíze při zachování výtěžku. Snížený obsah vody ve svém důsledku snižuje náklady na dopravu a snižuje dobu vaření.

Zdá se tedy potřebné poskytnout rostlinné buňky a rostliny se zvýšeným obsahem škrobu, podobně jako způsoby přípravy takových rostlinných buněk a rostlin. Dále se zdá žádoucí poskytnout škroby obsahující takové množství amylosy a amylopektinu, které splňuje požadavky zpracovatelského průmyslu. V této souvislosti je třeba uvést, že je žádoucí jak škrob se sníženým obsahem amylosy, tak škrob se zvýšeným obsahem amylosy, protože každý z nich je zvlášť vhodný pro určité speciální užití.

Problém svázaný s tímto vynálezem je tedy poskytnutí rostlinných buněk a rostlin, které ve srovnání s odpovídajícími nezměněnými buňkami divokých rostlin a divoφφ φ φφ ·· φφ φ · · · φ · φ φ · · * φφφ φ · φ · · φ φ Φ··· · φ a e · φ φ · ^u φφ φφ «φφφ φφφ φ φφφ φφφφ φφ φφ kými rostlinami, mají zvýšený obsah především oleje a/nebo škrobu a/nebo syntetizují škrob se změněným obsahem amylosy.

Tento problém je vyřešen poskytnutím provedení vyznačených v nárocích.

Podstata vynálezu

Tento vynález se tedy týká transgenických rostlinných buněk a rostlin, které jsou geneticky modifikované. Modifikace spočívá v zavedení cizí nukleové kyseliny, jejíž přítomnost nebo exprese vede ke vzrůstu aktivity plastidového přenašeče ADP/ATP transgenických buněk ve srovnání s odpovídajícími rostlinnými buňkami z rostlin divokého typu, které nejsou geneticky modifikované.

Genetická modifikace v této souvislosti může být jakákoli genetická modifikace vedoucí ke zvýšení aktivity plastidového přenašeče ADP/ATP. Jednou z možností je například tzv. „aktivace in šitu“, kde je genetickou modifikací změna regulačních oblastí endogenních genů plastidového přenašeče ADP/ATP, která vede ke zvýšené expresi těchto genů. Toho může být dosaženo například včleněním velmi silného promotoru před odpovídající geny, např. homolgní rekombinací.

Dále je možné využít metodu tzv. „aktivačního značení“ (srov. např. Walden a kol., Plant J. (1991), 281-288; Walden a kol., Plant Mol. Biol. 26 (1994), 1521-1528). Zmíněná metoda je založena na aktivaci endogenních promotorů zesilovači transkripce, jako např. zesilovačem transkripce 35S RNA promotoru mozaikového viru květáku nebo zesilovači transkripce oktopinsyntasy.

Ve výhodném provedení však genetická modifikace obsahuje zavedení cizí molekuly nukleové kyseliny kódující plastidový přenašeč ADP/ATP do genomu rostlinné buňky.

Výraz „transgenický“ tedy znamená, že rostlinná buňka podle vynálezu obsahuje alespoň jednu cizí molekulu nukleové kyseliny kódující plastidový přenašeč ADP/ATP, která je stabilně integrována do genomu, s výhodou do molekuly nukleové kyseliny.

Výraz „cizí molekula nukleové kyseliny“ značí molekulu nukleové kyseliny kódující protein s biologickou aktivitou plastidového přenašeče ADP/ATP a buď se přirozeně nevyskytuje v odpovídajících rostlinných buňkách nebo se přirozeně nevyskytuje v rostlinných buňkách ve správném prostorovém uspořádání nebo je umístěna v genomu rostlinné buňky na takovém místě, kde se přirozeně nevyskytuje. S výhodou je cizí molekula nukleové kyseliny rekombinantní molekulou, která je složena z různých * » ···· « prvků, jejichž kombinace nebo specifické prostorové uspořádání se v rostlinných buňkách nevyskytuje přirozeně. Transgenické rostlinné buňky podle vynálezu obsahují alespoň jednu cizí molekulu nukleové kyseliny kódující protein s biologickou aktivitou plastidového přenašeče ADP/ATP, kde zmíněná molekula nukleové kyseliny je spojena s regulačními prvky DNA zabezpečujícími transkripci v rostlinných buňkách, zejména s promotorem

V principu může být cizí molekulou nukleové kyseliny jakákoli molekula nukleové kyseliny kódující přenašeč ADP/ATP, který je po expresi lokalizován na vnitřní membráně plastidů. Plastidový přenašeč ADP/ATP je v této souvislosti protein katalyzující transport ATP do plastidů a ADP ven z plastidů. Takové molekuly nukleové kyseliny jsou známy například z Huseníčku rotního (Arabidopsis thaliana) (Kampfenkel a kol., FEBS Lett. 374 (1995), 351-355; přístupové číslo genové banky X94626 a Z49227) nebo z brambor (přístupové číslo genové banky Y10821). Na základě známé molekuly nukleové kyseliny je odborník schopen izolovat odpovídající sekvenci z jiného organismu, zejména z rostlin, pomocí standardních metod, jakou je například heterologní screening. Obzvlášť mohou být použity molekuly nukleové kyseliny jiného než rostlinného původu, které kódují přenašeč ADP/ATP a jsou spojeny s navádějící (targeting) sekvencí, která zajistí lokalizaci do vnitřní membrány plastidů. V této souvislosti je znám například přenašeč ADP/ATP u Rickettsia prowazekii (Williamson a kol., Gene 80 (1989), 269-278) a u Chlamydia trachomatis.

Ve výhodném provedení cizí molekula nukleové kyseliny kóduje plastidový přenašeč ADP/ATP z Arabidopsis thaliana, zejména protein AATP1 popsaný v Kampfenkel a kol. (1995, citováno výše).

Buňky podle vynálezu mohou být odlišeny od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk mimo jiné tím, že obsahují cizí molekulu nukleové kyseliny, která se přirozeně ve zmíněných buňkách nevyskytuje, nebo tím, že je zmíněná molekula integrována do genomu buňky v místě, ve kterém se přirozeně nevyskytuje, tj. v jiném genomovém prostředí. Navíc mohou být transgenické buňky tohoto vynálezu odlišeny od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk tak, že obsahují nejméně jednu kopii cizí molekuly nukleové kyseliny stabilně integrovanou do jejich genomu, případně navíc ke kopiím zmíněné molekuly vyskytující se přirozeně v buňkách. Jestliže molekula (molekuly) nukleové kyseliny začleněná (začleněné) do buněk je Osou) přídavná (přídavné) kopie molekul přirozeně se v buňkách vyskytujících, je možné rostlinné buňky tohoto vynálezu odlišit od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk zejména tak, že příi • · • · · · «· «· · ♦ • · · » · • 9 9 9 9 • · ······ • · 9 9 9 9 9

999 » ··· ···» «· ·· dávná (přídavné) kopie je (jsou) umístěna (umístěny) v genomu na místech, kde se přirozeně nevyskytuje (nevyskytují). Toto může být například určeno pomocí analýzy Southern blot.

Dále mohou být buňky tohoto vynálezu odlišeny od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk na základě alespoň jedné z následujících vlastností: jestliže je molekula nukleové kyseliny heterologní vzhledem k rostlinné buňce, potom se v transgenických rostlinných buňkách produkují transkripty vložené molekuly nukleové kyseliny, zjistitelný například pomocí analýzy Northern blot. S výhodou rostlinné buňky tohoto vynálezu obsahují protein kódovaný vloženou nukleovou kyselinou. To je možné detekovat například imunologickými metodami, zejména Western blotem.

Jestliže je molekula nukleové kyseliny homologní vzhledem k rostlinné buňce, mohou být buňky tohoto vynálezu rozlišeny od přirozeně se vyskytujících buněk na základě doplňkové exprese cizích vložených molekul nukleové kyseliny. S výhodou obsahují transgenické rostlinné buňky více transkriptů cizích molekul nukleové kyseliny. To lze analyzovat například pomocí analýzy Northern blot.

Výraz „geneticky modifikovaná“ značí, že rostlinná buňka má modifikovanou genetickou informaci vložením cizí molekuly nukleové kyseliny a že přítomnost nebo exprese této cizí molekuly nukleové kyseliny vede ke změně fenotypu. Fenotypovou změnou je v této souvislosti s výhodou myšlena měřitelná změna jedné nebo více funkcí buňek. Geneticky modifikované rostlinné buňky tohoto vynálezu tedy například vykazují vzrůst aktivity plastidového přenašeče ADP/ATP, způsobený přítomností nebo expresí vložené cizí molekuly nukleové kyseliny.

V této souvislosti tohoto vynálezu znamená výraz „vzrůst aktivity“ vzrůst exprese genu kódujícího plastidový přenašeč ADP/ATP, vzrůst množství proteinu plastidového přenašeče ADP/ATP a/nebo vzrůst aktivity přenašeče ADP/ATP v plastidech buněk.

Vzrůst exprese může být stanoven například měřením množství transkriptů kódujících přenašeč ADP/ATP pomocí analýzy Northern blot. Vzrůst v tomto případě znamená zvětšení množství transkriptů ve srovnání s geneticky nemodifikovanými buňami o alespoň 10 %, s výhodou o 20 %, zejména alespoň o více než 50 % a v lepším příobzvlášť výhodně o alespoň 75 %. Nárůst množství proteinu přenašeče ADP/ATP může být stanoven například pomocí analýzy Western blot. Vzrůst v tomto případě znamená zvětšení množství proteinu přenašeče ADP/ATP ve srovnání s geneticky nemodifikovanou buňkou o alespoň 10 %, s výhodou o alespoň 20 %, zejména o alespoň 50 % a obzvlášť výhodně o alespoň 75%.

Aktivita plastidového přenašeče ADP/ATP může být stanovena například izolací plastidů z odpovídajícího pletiva a určením hodnot Vmax pro import ATP pomocí metody filtrace silikonového oleje. Čištění různých druhů plastidů je popsáno například v Neuhaus a kol. (Biochem. J. 296 (1993), 395 až 401). Metoda filtrace silikonového oleje je popsána například v Quick a kol. (Plant Physiol. 109 (1995), 113 až 121).

Překvapivě bylo zjištěno, že u rostlin obsahujících zmíněné rostlinné buňky se zvýšenou aktivitou plastidového přenašeče ADPZATP je zvýšený výtěžek obshových látek a/nebo nárůst biomasy ve srovnání s odpovídajícími nemodifikovanými rostlinami divokého typu. Bylo například zjištěno, že byl zvýšen obsah oleje a/nebo škrobu u rostlin podle vynálezu, a/nebo že byl také zvýšený obsah amylosy ve škrobu ve srovnání s nemodifikovanými rostlinami divokého typu.

V této souvislosti výraz „rostliny divokého typu“ značí rostliny, které slouží jako výchozí materiál k výrobě popsaných rostlin, tj. rostlin, jejichž genetická informace je až na vloženou genetickou modifikaci totožná s genetickou informací rostlin tohoto vynálezu.

Výraz „zvýšený výtěžek“ vyjadřuje to, že podíl obsahových látek, s výhodou škrobu nebo oleje, v rostlinných buňkách tohoto vynálezu je zvýšen o alespoň 10 %, s výhodou alespoň o 20 %, výhodněji alespoň o 30 % a velmi výhodně alespoň o 40 % ve srovnání s nemodifikovanými rostlinami divokého typu.

Výraz „zvýšený obsah škrobu“ vyjadřuje, že obsah škrobu v rostlinných buňkách tohoto vynálezu je zvýšen o alespoň 10 %, s výhodou alespoň o 20 %, výhodněji alespoň o 30 % a velmi výhodně alespoň o 40 % ve srovnání s roztlinnými buňkami nemodifikovaných rostlin divokého typu. Stanovení podílu škrobu bylo provedeno metodikou, která je popsána v přiložených příkladech.

Výraz „zvýšený obsah amylosy“ vyjadřuje, že obsah amylosy ve škrobu syntetizovaném v buňkách rostlin tohoto vynálezu je zvýšen o alespoň 10 %, s výhodou alespoň o 20 %, výhodněji alespoň o 30 % a velmi výhodně alespoň o 40 % ve srovnání s rostlinnými buňkami u nemodifikovaných rostlin divokého typu. Stanovení obsahu amylosy bylo provedeno metodikou, která je popsána v přiložených příkladech.

Plastidový přenašeč ADP/ATP je, jak bylo zmíněno výše, transportní protein lokalizovaný na vnitřní membráně plastidů (Heldt a kol., FEBS Lett. 5 (1969) 11 až 14;

Pozueta-Romero a kol., Proč. Nat. Acad. Sci USA 88 (1991), 5769 až 5773; Neuhaus,

Plant Physiol. 101 (1993) 573 až 578; Schůnemann a kol., Plant Physiol. 103 (1993),

4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 • 9 4 4 4

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

444 9499 «> 44

131 až 137), který katalyzuje transport ATP dovnitř plastidů a ADP ven z piastidů. Plastidový přenašeč ADP/ATP tedy zásobuje stroma cytosolickým ATP.

Kampfenkel a kol. (FEBS Lett. 374 (1995), 351 až 355) jako první izolovali cDNA kódující přenašeč ADP/ATP (AATP1) z Huseníčku rolního (Neuhaus a kol. Plant J. 11 (1997), 73 až 82), u něhož byla prokázána vysoká podobnost (66,2% podobnost) s přenašečem ADP/ATP z Gram-negativní bakterie Rickettsia prowazekii. cDNA AATP1 z Arabidopsis thaliana kóduje silně hydrofobní protein čítající 589 aminokyselin, který vykazuje 12 potenciálních transmembránových spirál (Kamfenkel a kol., FEBS Lett. 374 (1995), 351 až 355). Zmíněná cDNA může být funkčně exprimována v pekařském droždí nebo v E.coli. Po extrakci proteinu a rekonstituci v proteoliposomech je možné zjistit zvýšení rychlosti přenosu ATP (Neuhaus a kol. Plant J. 11 (1997), 73 až 82). S použitím protilátek proti fragmentu peptidu AATP1 z Arabidopsis thaliana je možné prokázat umístění přenašeče ADP/ATP na vnitřní obalové membráně chloroplastu (Neuhaus a kol. Plant J. 11 (1997), 73 až 82).

Doposud nebylo možné zcela ozřejmit funkci plastidového přenašeče ADP/ATP v rostlinném metabolismu. Byly uvažovány různé funkce, např. že zásobování stromatu cytosolickým ATP by mohlo mít vliv na import proteinů do plastidů, na biosyntézu aminokyselin, na metabolismus mastných kyselin nebo škrobu (Flůgge a Hinz, Eur. J. Biochem. 160 (1986), 563 až 570; Tetlow a kol. Planta 194 (1994) 454 až 460; Hill a Smith, Planta 185 (1991), 91 až 96; Kleppinger-Sparace a kol., Plant Physiol. 98 (1992), 723 až 727.

Nicméně fakt, že vzrůst aktivity plastidového přenašeče ADP/ATP vede ke zvýšení obsahu škrobu v odpovídajících transgenických rostlinách, byl úplně překvapující. Stejně tak bylo překvapující i zjištění, že vzrůst aktivity plastidového přenašeče ADP/ATP má vliv na molekulární složení produkovaného škrobu. Tak například škrob z hlíz brambor podle vynálezu vykazuje vyšší zastoupení amylosy oproti škrobu z hlíz netransformovaných brambor.

Doposud převládal názor, že molekulární vlastnosti škrobu jsou výhradně určeny interakcí enzymů syntetizujících škrob, jako je amylo-(1,4-1,6)-transglykosylasa (E.C. 2.4.1.18), ADP-glukosa-škrobglukosyltransferasa (E.C. 2.4.1.21) a ADP-glukosasynthasa (E.C. 2.7.7.27). Fakt, že exprese transportního proteinu z plastidů ovlivňuje strukturu škrobu je však zcela překvapující.

Rostlinné buňky podle vynálezu mohou být odvozeny od jakéhokoli rostlinného druhu, tj. jak z jednoděložných, tak dvouděložných rostlin. S výhodou jsou tyto buňky

4

4 9

4944

9 • ** ·· ··

4 9 4 4 4 4 4 ♦ * 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

449 4494 4 4 4 4 odvozeny od zemědělských rostlin, tj. od rostlin pěstovaných lidmi pro nutriční nebo technické, zejména průmyslové, účely. S výhodou jsou rostlinné buňky ze zemědělských plodin, tj. z rostlin pěstovaných lidmi pro nutriční nebo technické, zejména průmyslové, účely. Obecně výhodné jsou rostlinné buňky z rostlin syntetizujících olej a/nebo škrob nebo z rostlin se zásobami oleje a/nebo škrobu. Vynález se tedy s výhodou týká rostlinných buněk z rostlin syntetizujících škrob nebo z rostlin se zásobami škrobu, jako jsou obiloviny (žito, ječmen, oves, pšenice, proso, ságo, atd.), rýže, hrách, kukuřice, fazole, kasava, brambory, řepka, sójové boby, konopí, len, slunečnice nebo zelenina (rajče, čekanka, okurka, salát, atd.). Výhodné jsou rostlinné buňky z brambor, slunečnice, sójových bobů, rýže. Zvláště výhodné jsou pak rostlinné buňky z kukuřice, pšenice, řepky a rýže.

Dále jsou podstatou vynálezu transgenické rostliny obsahující výše popsané transgenické rostlinné buňky. Zmíněné rostliny mohou být produkovány např. regenerací z rostlinných buněk tohoto vynálezu. Transgenické rostliny mohou být v principu jakýkoli druh rostlin, tj. jak z jednoděložných tak dvouděložných rostlin. S výhodou jsou to užitkové plodiny, tj. rostlin pěstované lidmi pro nutriční a technické účely, zvláště pak pro průmyslové účely. Tyto rostliny mohou patřit mezi olej a/nebo škrob syntetizující rostliny, nebo mezi rostliny, které mají zásoby oleje a/nebo škrobu. Vynález se s výhodou týká rostlin jako jsou obiloviny (žito, ječmen, oves, pšenice, proso, ságo, atd.), rýže, hrách, kukuřice, fazole, kasava, brambory, řepka, sójové boby, konopí, len, slunečnice nebo zelenina (rajče, čekanka, okurka, salát aj.). Výhodné jsou brambory, slunečnice, sója, rýže. Zvláště výhodné jsou kukuřice, pšenice, řepka a rýže.

Jak bylo uvedeno výše, bylo překvapivě zjištěno, že rostliny se zásobami škrobu obsahující rostlinné buňky tohoto vynálezu se zvýšenou aktivitou plastidového přenašeče ADP/ATP mají zvýšený obsah škrobu ve srovnání s rostlinami divokého typu a/nebo že je také zvýšen obsah amylosy v těchto škrobech ve srovnání s odpovídajícími nemodifikovanými rostlinami divokého typu.

Výhodné provedení tohoto vynálezu se tedy vztahuje také na rostliny se zásobami škrobu, obsahující rostlinné buňky tohoto vynálezu, a které mají ve srovnání s nemodifikovanými rostlinami divokého typu vyšší obsah škrobu a/nebo vyšší obsah amylosy ve zmíněných škrobech.

Označení „rostliny se zásobami škrobu“ zahrnuje všechny rostliny s pletivy, která zásobují škrob, jako je např, kukuřice, pšenice, rýže, brambory, žito, ječmen, oves. Výhodné jsou rýže, ječmen a brambory. Zvláště výhodné jsou kukuřice a pšenice.

• 9 • 9 •

9999 • 9 • 999 *

9 9

9 9 « 9 9

9 9 9

9 ·

V této souvislosti použité termíny „zvýšený výnos“, „zvýšený obsah škrobu“, „zvýšený obsah amylosy“ a „rostlina divokého typu“ jsou použity ve významu výše uvedených definicí a ve stejném smyslu jsou také použity v následujících provedeních vynálezu. Pojem „zvýšený výnos“ s výhodou znamená vzrůst produkce obsahových látek a/nebo biomasy, zvláště pak jedná-li se o měření čerstvé hmotnosti vztažené na rostlinu.

Zmíněný vzrůst výnosu se s výhodou týká těch částí rostlin, které mohou být průmyslově zpracovány, např. semena, plody, zásobní kořeny, kořeny, hlízy, květy, pupeny, výhonky, stonky nebo dřevo.

Podle vynálezu je zvýšení výnosu nejméně o 3 % pokud se týká biomasy a/nebo obsahových sloučenin ve srovnání s odpovídajícími netransformovanými rostlinami stejného genotypu, jsou-li zmíněné rostliny pěstovány za stejných kultivačních podmínek. Výhodné je zvýšení výnosu o alespoň 10 %, výhodněji o alespoň 20 % a velmi výhodně o alespoň 30 % nebo dokonce o 40 % v porovnání s rostlinami divokého typu.

Zmíněné rostliny tohoto vynálezu např. mají ve srovnání s jinými rostlinami syntetizujícími škrob s vyšším podílem amylosy jako jsou „amylosní nastavovač“ (amyloseextender) a „otupělé“ (duli) mutanty z kukuřice, výhodu v tom, že kromě zvýšeného obsahu amylosy vykazují ne snížený, ale dokonce zvýšený obsah škrobu.

Dále jsou podstatou tohoto vynálezu rostliny, které tvoří zásoby oleje a které obsahují rostlinné buňky tohoto vynálezu. Tyto rostliny mají zvýšený obsah oleje ve srovnání s nemodifikovanými rostlinnými buňkami divokého typu, s výhodou v buňkách pletiva, které si tvoří zásoby oleje.

Výraz „rostlina, která tvoří zásoby oleje“ zahrnuje veškeré rostliny schopné ukládat si olej, např. řepka, kanola, sója, slunečnice, kukuřice, podzemnice olejná, pšenice, bavlník, palmy olejně, olivovník a avokádo. Výhodné jsou kukuřice, pšenice a sója. Zvláště výhodné jsou řepka a kanola.

Výraz „zvýšený obsah oleje“ znamená, že obsah oleje v rostlinných buňkách tohoto vynálezu je zvýšen o alespoň 10 %, s výhodou o alespoň 20 %, výhodněji alespoň o 30 % a nejvýhodněji o alespoň 40 % ve srovnání s rostlinnými buňkami nemodifikovaných rostlin divokého typu.

Metody stanovení obsahu oleje jsou odborníkům obecně známy a jsou popsány například v Matthaeus a Bruehl, GIT Labor-Fachz. 43 (1999), 151 až 152, 154 až 155;

Mathaeus, Laborpraxis 22 (1998), 52 až 55. Stanovení obsahu oleje také může být prováděno neinvazivní spektroskopií v blízké infračervené oblasti, což je analytická metoda • *

0··· 0 • 0 0 ♦ 0 0 • 0 0 • · · 0 0 0 0 0·· 0 »00 0000 0Φ 00 (obecně užívaná ve šlechtitelství) a byla popsána například vSchulz a kol., J. Near Infrared Spectrosc. 6 (1998), A125 až A130; Starr a kol., J. Agric. Sci. 104 (1985), 317 až 323.

Rostliny se zvýšeným obsahem oleje mají veliký komerční význam. Tak například kukuřice, jejíž zrna jsou bohatá na škrob, ale také mají zvýšený obsah oleje jako vedlejšího produktu, má velký význam při průmyslovém mokrém mletí, protože vedlejší produkt má vysokou hodnotu. Krmivářský průmysl má také veliký zájem na krmných rostlinách se zvýšeným obsahem oleje, protože takové rostliny mají zvýšenu nutriční hodnotu. Při průmyslovém zpracování rostlin obsahujících olej znamená zvýšený obsah oleje zvýšení účinnosti procesu extrakce oleje.

Tento vynález se dále vztahuje na způsob výroby transgenických rostlin, které mají ve srovnání s rostlinami divokého typu zvýšený výtěžek, kde (a) rostlinná buňka je geneticky modifikována vložením cizí molekuly nukleové kyseliny a genetická modifikace vede k vyšší aktivitě plastidového přenašeče ADP/ATP a (b) rostlina je regenerována z buňky, a případně (c) z rostliny připravené podle bodu (b) jsou připravovány další rostliny..

Tento vynález se dále vztahuje na způsob výroby transgenických rostlin, které mají ve srovnání s rostlinami divokého typu zvýšený obsah škrobu a/nebo u kterých je zvýšen obsah amylosy ve srovnání s odpovídajícími rostlinami divokého typu, kde (a) rostlinná buňka je geneticky modifikována vložením cizí molekuly nukleové kyseliny a genetická modifikace vede k vyšší aktivitě plastidového přenašeče ADP/ATP a (b) rostlina je regenerována z buňky, a případně (c) z rostliny připravené podle bodu (b) jsou připravovány další rostliny.

Dále je podstatou tohoto vynálezu způsob výroby transgenických rostlin, které mají ve srovnání s rostlinami divokého typu zvýšený obsah oleje, kde (a) rostlinná buňka je geneticky modifikována vložením cizí molekuly nukleové kyseliny a genetická modifikace vede k vyšší aktivitě plastidového přenašeče ADP/ATP a (b) rostlina je regenerována z buňky, a případně (c) z rostliny připravené podle bodu (b) jsou připravovány další rostliny.

• · • fefefe fe • fe • fe fefe • fefefe fe fefefe fe fefe fefefe • fefe · fefefe fefefefe fefe

Na modifikaci zavedenou do buňky podle bodu (a) se vztahuje totéž, co bylo diskutováno výše v souvislosti s rostlinnými buňkami a rostlinami tohoto vynálezu.

Regenerace rostlin podle bodu (b) může být provedena podle způsobů známých odborníkům v oboru.

Generace dalších rostlin podle bodu (c) způsobů tohoto vynálezu může být dosaženo např. vegetativní propagací {např. řízkováním, hlízami nebo kalusovými kulturami a regenerací celých rostlin) nebo sexuální reprodukcí. Sexuální reprodukce je s výhodou prováděna kontrolované, tj. vzájemně jsou kříženy vybrané rostliny se specifickými vlastnostmi a jsou rozmnožovány.

Vynález se týká také rostlin získatelných způsoby podle tohoto vynálezu.

Tento vynález se také vztahuje na propagační materiál rostlin podle tohoto vynálezu, stejně tak jako transgenických rostlin, vyrobených podle způsobů tohoto vynálezu, přičemž tento materiál obsahuje geneticky modifikované buňky tohoto vynálezu. V této souvislosti propagační materiál obsahuje ty složky rostlin, které jsou vhodné k tvorbě potomků vegetativním nebo sexuálním množením. K vegetativnímu množení jsou vhodné například řízky, kalusové kultury, oddenky nebo hlízy. Dalším propagačním materiálem mohou být například plody, semena, sazenice, protoplasty, buněčné kultury, atd. Výhodným propagačním materiálem jsou hlízy, obzvlášť vhodná jsou semena.

Tento vynález se dále vztahuje na použití molekul nukleových kyselin kódujících plastidový přenašeč ADP/ATP při výrobě transgenických rostlin se zvýšeným výtěžkem v porovnání s rostlinami divokého typu.

Tento vynález se také vztahuje na nukleové kyseliny kódující plastidový přenašeč ADP/ATP užité k výrobě transgenických rostlin, které mají ve srovnání s rostlinami divokého typu zvýšený obsah škrobu v pletivech, kde se škrob syntetizuje a/nebo ukládá, nebo k produkci rostlin, v nichž škrob obsahuje vyšší obsah amylosy ve srovnání s rostlinami divokého typu. S výhodou jsou používány výše zmíněné nukleové kyseliny ve spojení s buňkami tohoto vynálezu.

Tento vynález se také vztahuje na nukleové kyseliny kódující plastidový přenašeč ADP/ATP užité k výrobě transgenických rostlin se zvýšeným obsahem oleje v porovnání s rostlinami divokého typu.

Tento vynález se také vztahuje na transgenické rostlinné buňky, které jsou geneticky modifikované a kde genetická modifikace vede ke snížení aktivity přenašeče

ADP/ATP v plastidech přítomného endogenně v rostlinné buňce ve srovnání • φ φ φφ φφ φφ φ φ φ φφφφ φφφφ φφφ φ φ φφφφ φ φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φ • φ φφ φφφφ φφφ φ φφφ φφφφ φφ φφ s odpovídajícími rostlinnými buňkami divokého typu, které nejsou geneticky modifikovány.

Výraz „transgenický“, jak je zde použit, znamená, že se rostlinné buňky tohoto vynálezu odlišují svou genetickou informací od odpovídajících nemodifikovaných rostlinných buňek. To je způsobeno genetickou manipulací, zejména vložením cizí molekuly nukleové kyseliny.

V této souvislosti termín „geneticky modifikovaný“ znamená, že rostlinná buňka je modifikována ve své genetické informaci v důsledku zavedení cizí molekuly nukleové kyseliny a že přítomnost nebo exprese cizí molekuly nukleové kyseliny vede k fenotypové změně. Fenotypová změna s výhodou představuje měřitelnou změnu jedné nebo více funkcí buňky. Geneticky modifikovaná rostlinná buňka podle vynálezu může mít např. sníženou aktivitu přenašeče ADP/ATP v plastidu.

Výroba zmíněné rostlinné buňky podle vynálezu se sníženou aktivitou přenašeče ADP/ATP může být provedena různými způsoby, které jsou odborníkům známé. Například se může jednat o způsoby vedoucí k inhibici exprese endogenních genů kódujících plastidový přenašeč ADP/ATP. Tyto způsoby zahrnují například expresi odpovídající antimediátorové RNA, expresi antikódující RNA k dosažení kosupresního efektu, exprese vhodně sestrojeného ribozymu, který specificky štěpí transkripty kódující přenašeč ADP/ATP, nebo tzv. „mutageneze in vivo“.

Ke snížení aktivity přenašeče ADP/ATP v buňkách tohoto vynálezu je s výhodou užívána exprese antimediátorové RNA.

K expresi může být použita buď molekula DNA, která obsahuje celou sekvenci kódující přenašeč ADP/ATP, včetně přesahujících sekvencí, které jsou případně přítomny, nebo molekuly DNA obsahující pouze části kódující sekvence, kde ovšem tyto části musí být dostatečně dlouhé, aby vedly k antimediátorovému účinku v buňkách. Mohou být obecně použity sekvence o minimální délce až 15 pb (párů baží), s výhodou 100 až 500 pb a zvláště pro účinnou antimediátorovou inhibici jsou vhodné sekvence delší než 500 pb. Obvykle jsou používány sekvence kratší než 5000 pb a s výhodou jsou pak užívány sekvence kratší než 2500 pb.

Je také možné použít sekvence DNA, které vykazují vysoký stupeň homologie k sekvencím, které se vyskytují endogenně v rostlinné buňce a které kódují plastidový přenašeč ADP/ATP. Minimální homologie by měla být vyšší než 65 %. Výhodné je pak užití sekvencí vykazujících homologii mezi 95 a 100 %.

• ·

4 Λ 4 4 4 4 · · · *

4 4 4 · 4 · 4 ·

7 4 4444 4 4 444444 ¹ J 4 4 44 4 * 4 4

444 4 444 4444 44 44

Snížení aktivity přenašeče ADP/ATP v rostlinných buňkách podle vynálezu může být také alternativně dosaženo kosupresním účinkem. Tento způsob je odborníkům znám a je popsán například v Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340 až 344); Niebel a kol. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91 až 103); Flavell a kol. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43 až 46); Palaqui a Vaucheret (Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149 až 159); Vaucheret a kol. (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311 až 317); de Borne a kol. (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613 až 621) a v jiných zdrojích.

Exprese ribozymů, která slouží ke snížení aktivity specifických proteinů v buňkách je také odborníkům známa a je popsána například v EP-B1 0 321 201. Exprese ribozymů v rostlinných buňkách byla popsána například v Feyer a kol. (Mol. Gen. Genet. 250 (1996), 329 až 338).

Snížení aktivity přenašeče ADP/ATP v rostlinných buňkách tohoto vynálezu lze dále dosáhnout tzv. „mutagenezí in vivo“, kde je do buněk transformací vnesen hybridní oligonukleotid složený z RNA a DNA („chimeroplast“) (Kipp, P.B. a kol., Plakátová konference na 5. Mezinárodním kongresu rostlinné molekulární biologie (5^th International Congress of Plant Molecular Biology), 21. až 27. září 1997, Singapur; R. A. Dixon a C. J. Arntzen, referát ze sjezdu „Metabolic Engineering in Transgenic Plants“, Keystone Symposia, Copper Mountain, CO, USA, TIBTECH 15 (1997), 441 až 447; mezinárodní patentová přihláška WO 95/15972; Křen a kol. Hepatology 25 (1997), 1462 až 1468; Cole-Strauss a kol., Science 273 (1996), 1386 až 1389).

Část DNA složky hybridního oligonukleotidu DNA a RNA je homologní k sekvenci nukleové kyseliny endogenního přenašeče ADP/ATP, avšak ve srovnání se sekvencí nukleové kyseliny endogenního přenašeče ADP/ATP má mutaci nebo obsahuje heterologní úsek ohraničený úseky homologními.

Párováním bází homologních úseků oligonukleotidu RNA a DNA a endogenní molekuly nukleové kyseliny a následnou homologní rekombinací může být mutace nebo heterologní úsek obsažený v DNA složce oligonukleotidu RNA a DNA přenesen do genomu rostlinné buňky. Toto vede ke snížení aktivity přenašeče ADP/ATP v plastidech.

Předmět vynálezu tedy tvoří především transgenické rostlinné buňky, (a) obsahující molekulu DNA, která může vést k syntéze antimediátorové RNA. Ta následně způsobí pokles exprese endogenních genů kódujících plastidový přenašeč ADP/ATP a/nebo • · tt tttt · · ·· • tttt ···· · « · · • tttt · · · · · ·

A · ···· · · · tttttttt ·

IH · · · · · · · · ··· · ··· ···· ·· ·· (b) obsahující molekulu DNA , která může vést k syntéze kosupresní RNA. Ta následně způsobí pokles exprese endogenních genů kódujících plastidový přenašeč ADP/ATP a/nebo (c) obsahující molekulu DNA , která může vést k syntéze ribozymu, který může specificky štěpit transkripty endogenních genů kódujících plastidový přenašeč ADP/ATP a/nebo (d) které díky „mutagenezi in vivo“ nesou mutaci nebo vložení heterologní sekvence DNA v alespoň jednom endogenním genu kódujícím plastidový přenašeč ADP/ATP. Mutace nebo vložení následně způsobuje pokles exprese genu nebo syntézu neaktivní molekuly transportního proteinu.

Pojem „pokles aktivity“ v tomto vynálezu značí pokles exprese endogeních genů kódujících přenašeč ADP/ATP, snížení množství proteinu přenašeče ADP/ATP v buňkách a/nebo pokles biologické aktivity proteinu přenašeče ADP/ATP v buňkách.

Pokles exprese může být měřen například stanovením množství transkriptů kódujících přenašeč ADP/ATP, tj. analýzou Northern blot. Pokles s výhodou znamená, že množství transkriptů se sníží ve srovnání s buňkami, které nejsou geneticky modifikované, o nejméně 30 %, s výhodou o nejméně 50 %, výhodněji o nejméně 70 %, obzvlášť výhodně o nejméně 85% a velice výhodně o 95 %.

Pokles množství proteinu přenašeče ADP/ATP může být měřen analýzou Western blot. Pokles s výhodou znamená, že množství proteinu přenašeče ADP/ATP se sníží ve srovnání s buňkami, které nejsou geneticky modifikované, o nejméně 30 %, s výhodou o nejméně 50 %, výhodněji o nejméně 70 %, obzvlášť výhodně o nejméně 85 % a nejvýhodněji o alespoň 95 %.

Překvapivý byl objev, že obsah škrobu u rostlinných buněk, které mají sníženou expresi a tedy sníženou aktivitu přenašeče ADP/ATP v plastidech v porovnání s geneticky nemodifikovanými rostlinnými buňkami divokého typu, poklesl. Stejně tak obsah amylosy v těchto škrobech byl v porovnání s odpovídajícími nemodifikovanými buňkami z rostlin divokého typu nižší. Doposud převládal názor, že molekulární vlastnosti škrobu jsou výhradně určeny interakcí enzymů zapojených do syntézy škrobu, jako je amylo-(1,4-1,6)-transglykosylasa (E.C. 2.4.1.18) a ADP-glukosa-škrobglucosyltransferasa (E.C. 2.4.1.21), a proto je fakt, že škroby z rostlin podle vynálezu mají modifikovanou strukturu, obzvlášť překvapující. Je úplně překvapující, že exprese transportního proteinu z plastidu ovlivňuje strukturu škrobu.

0

0000

0 0 · 0 0 0 0 • 0 · · 0 0

0 00000 0

0 0 0 0 0

0000000 ·0 ··

Výraz „snížený obsah škrobu“ v tomto vynálezu znamená, že obsah škrobu v rostlinných buňkách podle vynálezu je snížen o nejméně 15 %, s výhodou o nejméně %, výhodněji o nejméně 40 % a nejvýhodněji o 50 % ve srovnání s rostlinnými buňkami z rostlin divokého typu, které nebyly modifikovány. Obsah škrobu je určován způsoby popsanými v Příkladech.

Výraz „snížený obsah amylosy“ znamená, že obsah amylosy v rostlinných buňkách vynálezu je ve srovnání s buňkami, které nejsou geneticky modifikované, nižší o nejméně 10 %, s výhodou o nejméně 20 %, výhodou o nejméně 30 % a nejvýhodněji o 40 %. Obsah amylosy je stanovován způsoby popsanými v Příkladech.

Výraz „rostlina divokého typu“ má výše zmíněný význam.

Rostlinné buňky tohoto vynálezu mohou být odvozeny od jakéhokoli rostlinného druhu, tj. jak z jednodéložných, tak dvouděložných. S výhodou jsou tyto buňky odvozeny od zemědělských plodin, tj. od rostlin pěstovaných lidmi pro nutriční nebo technické, především průmyslové účely. Vynález se tedy s výhodou týká rostlinných buněk z rostlin syntetizujících nebo skladujících škrob, jako jsou obiloviny (žito, ječmen, oves, pšenice, proso, ságo, atd.), rýže, hrách, kukuřice, fazole, kasava, brambory, rajčata, řepka, sojové boby, konopí, len, slunečnice, vigna (fazolka) a maranta třtinová. Zvláště výhodné jsou rostlinné buňky z brambor.

Dále jsou předmětem vynálezu transgenické rostliny, které obsahují transgenické buňky popsané výše. Zmíněné rostliny mohou být vyrobeny regenerací z rostlinných buněk tohoto vynálezu. Transgenické rostliny mohou být v principu jakéhokoli rostlinného druhu, tj. jak z jednoděložné, tak dvouděložné. S výhodou jsou to rostlinné buňky ze zemědělských plodin, tj. z plodin pěstovaných lidmi z nutričních nebo technických, především průmyslových účelů. Vynález se tedy s výhodou týká rostlin, syntetizujících škrob, případně rostlin skladujících škrob jako jsou obiloviny (žito, ječmen, oves, pšenice, proso, ságo, atd.), rýže, hrách, kukuřice, fazole, kasava, brambory, rajčata, řepka, sojové boby, konopí, len, slunečnice, vigna (fazolka) a maranta třtinová. Zvláště výhodné jsou brambory.

Zmíněné rostliny tohoto vynálezu syntetizují škrob, který ve srovnání se škrobem z odpovídajících rostlin divokého typu obsahuje snížený obsah amylosy. Výraz „snížený obsah amylosy“ byl definován výše.

Navíc se tento vynález vztahuje také na způsob výroby transgenických rostlin, jejichž škrob obsahuje v porovnání se škrobem z odpovídajících rostlin divokého typu nižší obsah amylosy a kde » · · ·· ·· ·*»

9 lili 19 9 9

11 1 19 111

9111 9 1 119911

1 19 1111

111 1 111 9191 11 99 (a) rostlinná buňka je geneticky modifikována vložením cizí molekuly nukleové kyseliny a kde genetická modifikace vede ke snížené aktivitě přenašeče ADP/ATP v plastidech přítomného endogenně v rostlinných buňkách a (b) rostlina je regenerována z buňky vyrobené podle bodu (a), a případně (c) další rostliny jsou vyrobeny z rostliny vyrobené podle bodu (b).

Pro modifikaci vloženou do rostlinné buňky podle bodu (a) platí totéž, co bylo diskutováno výše v souvislosti s rostlinnými buňkami a rostlinami tohoto vynálezu.

Regenerace rostlin podle bodu (b) může být provedena podle způsobů, které jsou odborníkům známy.

Výroba dalších rostlin podle bodu (c) způsobů vynálezu může být například provedena vegetativním množením (například řízkováním, hlízami nebo kalusovými kulturami a regenerací celých rostlin) nebo pohlavním množením. S výhodou probíhá pohlavní množení kontrolované, tj. vybrané rostliny se specifickými vlastnostmi jsou navzájem kříženy a množeny.

Ve výhodném provedení je způsob podle vynálezu použit k výrobě transgenických brambor.

Tento vynález se také vztahuje na rostliny, které lze získat způsobem tohoto vynálezu.

Tento vynález se také vztahuje na rozmnožovací materiál rostlin podle vynálezu, stejně tak jako transgenických rostlin vyrobených podle způsobů vynálezu, který obsahuje geneticky modifikované buňky tohoto vynálezu. V této souvislosti je výrazem rozmnožovací materiál myšlena jakákoli část rostliny, která je vhodná k tvorbě potomků vegetativním, nebo sexuálním množením. K vegetativnímu množení jsou vhodné například řízky, kalusové kultury, oddenky nebo hlízy. Dalším propagačním materiálem mohou být například plody, semena, sazenice, protoplasty, buněčné kultury, atd. Výhodným propagačním materiálem jsou semena a zvláště výhodné jsou hlízy.

Dále se tento vynález vztahuje na použití molekul nukleových kyselin kódujících plastidový přenašeč ADP/ATP, jejich doplňků nebo částí zmíněných molekul k výrobě rostlin syntetizujících škrob, který má ve srovnání se škrobem z rostlin divokého typu snížený obsah amylosy. S výhodou jsou užívány molekuly nukleových kyselin zmíněné výše ve spojení s rostlinnými buňkami tohoto vynálezu, které mají zvýšenou aktivitu přenašeče ADP/ATP.

K dispozici je mnoho různých způsobů k zavedení DNA do rostlinné buňky. Mezi tyto způsoby patří transformace rostlinných buňek T-DNA s použitím Agrobacterium • · · · · · · » · · · · · · · • · 9 9 9 9 • · · · 9 9 9

9 9 9 9 ·

9999999 9 9 99 tumefaciens nebo Agrobacterium rhizogenes jako transformujícího činidla, fůze protoplastů, injekce, eiektroporace DNA, vložení DNA pomocí biolistické metody a jiné možnosti.

Použití transformace rostlinných buněk pomocí Agrobacteria bylo již podrobně analyzováno a dostatečně popsáno v EP 120516; Hoekama, v; The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), kapitola V.; Fraley a kol., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1 až 46 a An a kol., EMBO J. 4 (1985) 277 až 287. Transformace rajčat je popsána například v Rocha-Sosa a kol., EMBO J. 8 (1989), 29 až 33.

Transformace jednoděložných rostlin vektory na bázi Agrobakteria byla již také popsána (Chán a kol., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491 až 506; Hiei a kol., Plant J. 6 (1994) 271 až 282; Deng a kol., Science in China 33 (1990), 28 až 34; Wilmink a kol., Plant Cell Reports 11 (1992), 76 až 80; May a kol., Bio/Technology 13 (1995), 486 až 492; Connor a Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550 až 555; Ritchie a kol., Transgenic Res. 2 (1993), 252 až 265). Alternativní cestou transformace jednoděložných rostlin je transformace biolistickou metodou (Wan a Lemaux, Plant Physiol. 104 (1994), 37 až 48; Vasil a kol., Bio/Technology 11 (1993), 1553 až 1558; Ritala a kol., Plant Mol. Biol. 24 (1994), 317 až 325; Spencer a kol., Theor. Appl. Genet. 79 (1990), 625 až 631), transformace protoplastů, eiektroporace částečně permeabilizovaných buněk, vložení DNA pomocí skleněných vláken. Zvláště transformace kukuřice je v literatuře několikrát popsána (viz například WO 95/06128, EP 0513849, EO 0465875, EP 292435; Fromm a kol., Biotechnology 8 (1990), 833 až 844; Gordon-Kamm a kol., Plant Cell 2 (1990), 603 až 618; Koziel a kol., Biotechnology 11 (1993), 194 až 200; Moroc a kol., Theor. Appl. Genet. 80 (1990), 721 až 726).

Byly popsány i úspěšné transformace jiných obilovin, např. ječmene (Wan a Lemaux, citováno výše, Ritala a kol., citováno výše, Krens a kol., Nátuře 296 (1982), 72 až 74) a další pro pšenici (Nehra a kol., Plant J. 5 (1994), 285 až 297).

Pro expresi nukleových kyselin kódujících přenašeče ADP/ATP v antikódující nebo antimediátorové orientaci v rostlinných buňkách jsou zmíněné molekuly nukleových kyselin spojeny s regulačním prvky DNA, které zajišťují transkripci v rostlinných buňkách. Mezi zmíněné prvky patří zvláště promotory. Obecně je vhodný jakýkoli promotor aktivní v rostlinných buňkách.

Promotor může být zvolen tak, aby probíhala exprese konstitutivné nebo jen v konkrétním pletivu, v konkrétním okamžiku rostlinného vývoje nebo ve chvíli určené ······ · · · · · * · • · ·· ···· ··· ♦ ··· ···· ·· ·Φ vnějšími faktory. Promotor může být jak vzhledem k rostlině, tak vzhledem k molekule nukleové kyseliny homologní nebo heterologní.

Mezi vhodné promotory pro konstitutivní expresi patří například 35S RNA promotor z mozaikového viru květáku a ubichitinový promotor z kukuřice, pro specifickou expresi v hlízách v bramboru je to promotor B33 genu patatinu (Rocha-Sosa a kol., EMBO J. 8 (1989), 23 až 29) a promotor pro specifickou expresi pouze ve fotosynteticky aktivních pletivech, jako například ST-LS1-promotor (Stockhaus a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943 až 7947; Stockhaus a kol., EMBO J. 8 (1989), 2445 až 2451) nebo pro specifickou expresi v endospermu to může být promotor HMG z pšenice, promotor USP, promotor faseolinu, promotory zeinových genů z kukuřice (Pedersen a kol., Cell 29 (1982), 1015 až 1026; Quatroccio a kol., Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81 až 93), promotor glutelinu (Leisy a kol., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41 až 50; Zheng a kol., Plant J. 4 (1993), 357 až 366; Yoshihara a kol., FEBS Lett. 383 (1996), 213 až 218) nebo smrštěný-1 (shrunken-1) promotor (Werr a kol., EMBO J. 4 (1985), 1373 až 1380). Ale i romotory, které jsou aktivovány pouze v určitém okamžiku určeném vnějšími faktory, mohou být také použity (viz například WO 9307279). Zvláště pak mohou být z tohoto hlediska zajímavé promotory proteinů tepelného šoku, které jsou jednoduše indukovatelné. Dále mohou být použity promotory specifické pro semena, např. promotor USP z Vicia faba (vikev), který zajišťuj® expresi lokalizovanou do semen u Vicia faba a dalších rostlin (Fiedler a kol., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669 až 679; Báumlein a kol., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459 až 467).

Výše zmíněná provedení tohoto vynálezu s endospecifickými („specifickými pro endosperm“) promotory jsou vhodné zvláště ke zvýšení obsahu škrobu v endospermu. Naproti tomu promotory specifické pro embryo jsou zajímavé zvláště z hlediska zvýšení obsahu oleje, protože je pravidlem, že olej je skladován hlavně v embryích.

S výhodou jsou tedy používány podle vynálezu promotory, které zajišťují expresi v embryu nebo v semenech. Ve výhodném provedení vynálezu je tedy promotorem promotor globulinu-1 (glb 1) z kukuřice (Styer a Cantliffe, Plant Physiol. 76 (1984), 196 až 200). V dalším provedení vynálezu promotor specifický pro embryo je z rostlin, hlavně z Cuphea lanceolata, Brassica rapa nebo Brassica napus. Zvláště výhodné jsou promotory pCIFatB3 a pCIFatB4 (WO 95/07357). Jsou to promotory genů CIFatB3 a CIFatB4, které byly již úspěšně použity u transgenické řepky k biosyntéze mastných kyselin se středně dlouhým řetězcem. Mají tedy vhodné expresní vlastnosti k řešení předkládaného problému.

• · · · • · · « · * « · • · · · · · • · «>····· • · ·· · · · · ··· · ··· ···· «· ··

V dalším výhodném provedení vynálezu jsou použity promotor pCIGPDH (WO

95/06733, promotor napinu (popsaný např. v Kridl, Seed Sci. Res. 1 (1991), 209 až 219;

Ellerstrom a kol., Plant Mol. Biol. 32 (1996), 1019 až 1027; Stalberg a kol.., Planta 199 (1996), 515 až 519), nebo promotor oleosinu (popsaný např. v Keddie, Plant Mol. Biol (1994), 327 až 340; Plant a kol., Plant Mol. Biol. 25 (1994), 193 až 205).

Dále může být přítomna terminační sekvence, která slouží ke správnému ukončení transkripce a přidání poly-A konce k odpovídajícímu transkriptu, kde tento konec má funkci stabilizace transkriptů. Zmíněné prvky jsou popsány v literatuře (viz např. Gielen a kol., EMBO J. 8 (1989), 23 až 29) a jsou zaměnitelné podle potřeby.

Transgenické rostlinné buňky a rostliny tohoto vynálezu syntetizují, s výhodou v důsledku vzrůstu nebo poklesu aktivity přenašeče ADP/ATP v plastidech, škrob, jehož fyzikálně-chemické vlastnosti se liší od škrobu syntetizovaného rostlinami divokého typu. Zvláště se liší poměrem amylosy/amylopektin. Zmíněný škrob může být zejména modifikován oproti škrobu divokého typu ve smyslu viskozity a/nebo schopnosti tvořit gel u lepidel ze zmíněného škrobu.

Tento vynález se vztahuje tedy na způsoby výroby modifikovaného škrobu zahrnující krok extrakce škrobu z jedné z výše zmíněných rostlin a/nebo z částí zmíněné rostliny, které ukládají škrob. Zmíněná metoda s výhodou obsahuje také krok sklizení pěstovaných rostlin a/nebo částí zmíněných rostlin, které obsahují škrob, před vlastní extrakcí škrobu a dále zvláště výhodný krok kultivace rostliny z tohoto vynálezu před sklizením. Metody extrakce škrobu z rostlin nebo z částí rostlin obsahujících škrob jsou odborníkům známy. Navíc jsou popsány metody extrakce škrobu z různých dalších rostlin obsahujících škrob, např. v „Starch: Chemistry and Technology (vydavatelé: Whistler, BeMiller a Paschall (1994), 2. vydání, Academie Press lne. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; viz také např. kapitola XII, strana 412 až 468: maize and sorghum starch: production; napsal Watson; kapitola XIII, strana 469 až 479: starches from tapioca, arrowroot and ságo: production; napsali Corbishley a Miller; kapitola XIV, strana 491 až 506: starch from wheat: production, modification and uses; napsali Knight a Oson; a kapitola XVI, strana 507 až 528: starch from rice: production and uses; napsali Rohmer a Klem; starch from maize: Eckhoff a kol., Cereal Chem. 73 (1996) 54 až 57, extrakce škrobu z kukuřice podle průmyslových standardů je obvykle dosaženo tzv. „mokrým mletím“. Obvykle je v metodách extrakce škrobu z rostlinného materiálu použito zařízení jako jsou odstředivky, dekantéry, hydrocyklony, rozprašovací sušárny a sušárny s fluidním ložem.

• · • · · · · « 9 · · · φ • · · · · ····

7Π · ···· · » ······

Lv · · · · «··« ··· * ··· ···· ·· ··

Dále je podstatou tohoto vynálezu škrob, který lze získat z transgenických rostlinných buněk, rostlin a propagačního materiálu tohoto vynálezu, a škrob, který lze získat výše popsaným způsobem.

Škroby podle vynálezu mohou být modifikovány způsoby, které jsou odborníkům známy, a jsou vhodné pro různá použití v potravinářském nebo jiném průmyslu v modifikované nebo nemodifikované formě.

V principu lze možnosti užití rozdělit do dvou velkých oblastí. Jedna oblast zahrnuje produkty hydrolýzy škrobu, hlavně pak glukosu a glukanové stavební kameny, získané enzymatickými nebo chemickými způsoby. Slouží jako výchozí materiál k dalším chemickým modifikacím a procesům jako například kvašení. Pro snížení nákladů je důležitá jednoduchý a finančně nenáročný způsob hydrolýzy. V současnosti se jedná v podstatě o enzymatickou metodu s využitím amyloglukosidasy. Bylo by možné uspořit na výdajích snížením spotřeby enzymů. Toho by mohlo být dosaženo změnou struktury škrobu, například zvětšením povrchu zrn, snazší stravitelností v důsledku sníženého stupně větvení nebo szměnou prostorové struktury omezující přístupnost pro použité enzymy.

Druhá oblast aplikací, v níž je škrob užíván jako tzv. nativní škrob díky své polymerní struktuře, může být dále rozdělena na dvě podskupiny:

1. Použití v potravinách

Škrob je klasické aditivum různých potravin, v nichž v zásadě slouží k vázání vodných aditiv a/nebo zapříčiňuje zvýšenou viskozitu nebo zvýšenou tvorbu gelu. Důležitými charakteristickými vlastnostmi jsou vlastnosti tečení a sorpce, bobtnání a teplota pastifikace, viskozíta a zahušťovací funkce, rozpustnost škrobu, průhlednost a pastovitá struktura, odolnost vůči teplu, smyku a kyselému prostředí, tendence k retrogradaci, schopnost tvorby filmu, odolnost vůči mražení/rozmrazování, stravitelnost, stejně tak jako schopnost tvořit komplexy např. s anorganickými nebo organickými ionty.

2. Nepotravinářská použití

Druhou hlavní oblastí aplikací je použití škrobu jako pomocného prostředku v různých výrobních procesech nebo jako aditiva v technických výrobcích. Hlavní oblastí aplikací užití škrobu jako pomocného prostředku jsou hlavně papírenský a lepenkářský průmysl. V této oblasti je škrob využíván hlavně k zadržení pevných látek, klížící plnivo a malé částice, jako zpevňující látka a k dehydrataci. Navíc • · • · · · · jsou využívány výhodné vlastnosti škrobu vzhledem k tuhosti, tvrdosti, zvuku, omaku, lesku, hladkosti, síle v tahu a povrchu.

2.1. Průmysl papírenský a výroba kartónu

V rámci procesu výroby papíru mohou být rozlišeny čtyři hlavni aplikace. Jsou to povrch, nátěr, hmotnost a nástřik.

Požadavky na škrob pokud se týká zpracování povrchu jsou v zásadě vysoký stupeň jasu, odpovídající viskozita, vysoká stabilita viskozity, dobrá schopnost tvořit film a současně nízká schopnost tvořit prach. Při použití v nátěrech hrají důležitou roli obsah tuhé látky, odpovídající viskozita, vysoká schopnost vazby a vysoká afinita k pigmentům. Pro škrob jako aditívum do hmoty jsou důležité rychlá, jednotná, bezúbytková disperze, vysoká mechanická stabilita a úplná retence v papírovině. Při využití škrobu pro nástřik jsou významné odpovídající obsah pevných složek, vysoká viskozita a vysoká schopnost vazby.

2.2. Průmysl vyrábějící adheziva

Jednou z hlavních oblastí aplikací je například průmysl vyrábějící adheziva. Tato oblast se dělí na čtyři podoblasti: použití čistého škrobového lepidla, použití škrobových lepidel připravených se speciálními chemikáliemi, použití škrobu jako aditiva do syntetických pryskyřic a polymerních disperzí a použití škrobu jako plniva do syntetických adheziv. 90 % všech adheziv na bázi škrobu je použito při výrobě vlnité lepenky, papírových sáčků a tašek, kompozitních materiálů pro papír a hliník, krabic a smáčecích lepidel na obálky, známky atd.

2.3. Textilní produkty a produkty určené pro péči o textil

Další možností použití jako pomocných prostředků a aditiv je jejich použití při textilních produktech a produktech určených k péči o textil. V rámci textilního průmyslu je možné jednotlivé aplikace rozdělit do následujících čtyř skupin: použití škrobu jako klížidla, tj. jako pomocného prostředku k vyhlazení a zesílení tvorby otřepů k ochraně proti tažným silám aktivním při tkaní, pro zvýšení odolnosti při opotřebení během tkaní, jako látky sloužící ke zlepšení textilií hlavně po předběžných úpravách, které snižují kvalitu, jako např. bělení, barvení atd., jako zahušťovadla při výrobě barvicích past k zabránění difúze barev a jako aditívum do kroutících přípravků pro šicí příze.

• fefe fefefefe • · · fe • fe · · fe • · * fe • » fe ·

2.4. Stavebnictví

Škrob může být používán také jako přísada do stavebních materiálů. Jedním příkladem je výroba sádrokartonových desek. V tomto případě škrob vmíchaný do řídké sádry vytváří s vodou pastu, rozestře se na povrchu sádrokartonových desek a tím váže karton k desce. Dalšími možnostmi užití jsou přimíchávání do sádry a minerálních vláken. V už hotovém smíchaném betonu může být škrob použit ke zpomalení vytvrzovacího procesu.

2.5. Zpevnění půdy

Dále je škrob výhodný pro výrobu prostředků ke zpevnění půdy. Ty se používají k dočasné ochraně půdních částic proti vodě při umělých přesunech půdy. Podle současných znalostí mohou mít směsi škrobu a polymerních emulzí stejný ochranný účinek proti erozi a inkrustaci jako mají v současné době používané prostředky. Směsi škrobu a polymerních emulzí jsou však nezanedbatelně levnější.

2.6. Použití v ochranných látkách a hnojivech pro rostliny

Další oblastí využití škrobu je v ochranných látkách pro rostliny za účelem změny specifických vlastností těchto přípravků. Například je škrob užíván ke zlepšení smáčení rostlinných ochranných látek a hnojiv, za účelem dávkovaného uvolňování aktivních složek, ke konverzi kapalných, těkavých a/nebo páchnoucích aktivních složek na mikrokrystalické, stabilní, deformovatelné látky, ke smísení nekompatibilních směsí a k prodloužení trvání jejich účinku v důsledku snížení rozkladu.

2.7. Léky, medicína a kosmetický průmysl

Škrob může také užíván v průmyslu farmaceutickém, kosmetickém a medicíně. Ve farmaceutickém průmyslu může být škrob užíván jako pojidlo v tabletách, nebo k ředění pojidla v kapslích. Škrob je dále vhodný k rozbíjení tablet, protože po spolknutí absorbuje roztok, přičemž ho absorbuje za krátkou dobu tolik, že dojde u uvolnění aktivní složky. Z kvalitativních důvodů je další oblast užití v lékařských lubrikantech a v zásypech na zranění. Na poli kosmetiky si našel škrob například uplatnění jako nosič práškových přípravků, jako jsou voňavky a salicylová kyselina. Relativně vzdálenou aplikací využívající škrob jsou zubní pasty.

• · • · · · 9 • 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

999 99 99

2.8. Škrob jako přídavek v uhlí a briketách

Škrob může být také využit jako přídavek do uhlí a briket. Přídavek škrobu může způsobit velmi kvalitní a kvantitativní aglomeraci uhlí a/nebo briket, čímž je zabráněno předčasnému rozpadu briket. Grilovací uhlí obsahuje mezi 4 a 6 % přidaného škrobu, kalorované uhlí mezi 0,1 a 0,5 %. Navíc je možné využít škrobu jako pojidla, protože jeho přidání do uhlí a briket může výrazně snížit emisi toxických látek.

2.9. Zpracování rud a uhelného kalu

Dále může být škrob užit jako flokulační činidlo při zpracování rudy a uhelného kalu.

2.10. Přídavek do odlévacích materiálů

Další oblastí užití je použití jako přídavku při zpracování materiálů při odlévání. Při různých procesech odlévání je zapotřebí kanálů vytvořených z písků smíchaných s pojivou složkou. V současné době se všeobecně jako pojivé složky užívá bentonitu smíchaného s modifikovanými škroby, většinou bobtnajícími škroby. Důvodem přidávání škrobu je zvýšená odolnost proti toku a zvýšená pojivá schopnost. Navíc bobtnající škroby splňují i další podmínky výrobního procesu, jako dispergovatelnost ve studené vodě, schopnost opakované hydratace, dobrá mísitelnost s pískem a vysoká kapacita vazby vody.

2.11. Gumárenský průmysl

V průmyslu gumárenském může být škrob užíván pro zlepšení technické a optické kvality. Důvodem mohou být zlepšený povrchový lesk, omak a vzhled. Pro tento účel je škrob dispergován na lepkavý povrch pogumovaných povrchů gumových látek před studenou vulkanizací. To může být také využito ke zlepšení potisku gumy.

2.12. Výroba náhražek kůže

Další oblastí užití modifikovaného škrobu je výroba náhražek kůže.

2.13. Škrob v syntetických polymerech

V průmyslu plastů se objevují následující odvětví: integrace produktů odvozených od škrobu do výrobního procesu (škrob je pouze plnivo a netvoří se syntetickým polymerem žádnou vazbu) nebo integrace produktů odvozených ze škrobu do výroby polymerů (škrob a polymer tvoří stabilní vazbu).

• ·

ΦΦΦΦ » ♦ · · φ φ · • φ · φ φ φ « φ φ φ φ • φφφφ φφφφ φφ φφ

Použití škrobu jako pouhého plniva nemůže konkurovat jiným látkám jako je mastek. Odlišná je situace, kdy jsou specifické vlastnosti škrobu účinné a profil vlastností výsledných produktů je tím jasně změněn. Jedním z příkladů je použití škrobových produktů při zpracování termoplastů jako je polyethylen. V tomto případě je škrob smíchán se syntetickým polymerem v poměru 1:1 koexpresí za vzniku „základní dávky“, ze které jsou vyráběny běžnými způsoby s použitím granulovaného polyethylenu různé produkty. Integrace škrobu do polyethylenových filmů může zvýšit permeabilitu látek v dutých prostorech, zvýšit propustnost pro vodní páru, zlepšit antistatické chování a zlepšit potisk vodou ředitelnými barvivý.

Další možností je použití škrobu v polyuretanových pěnách. Díky přizpůsobení derivátů škrobu a díky optimalizaci zpracovatelských technik je možné specificky kontrolovat reakci mezi syntetickými polymery a hydroxyskupinami škrobu. Výsledkem jsou polyuretanové filmy, které mají v důsledku použití škrobu následující vlastnosti: snížený koeficient tepelné roztažnosti, sníženou schopnost smršťování, zlepšené tlakové/napěťové chování, zvýšenou permeabilitu pro vodní páru beze změny akceptance vody, sníženou hořlavost a hustotu popraskání, žádné snížení množství spalitelných částí, žádné . Nevýhodami, které doposud nebyly překonány, jsou snížená pevnost při tlaku a nárazu.

Vývoj produktů ve formě filmů není jedinou možností. Také výrobky z pevného plastu, jako hrnce, talíře a mísy, mohou být vyráběny s obsahem škrobu vyšším než 50 %. Navíc směsi škrobu a plastu nabízí tu ýhodu, že jsou mnohem snáze biodegradovatelné.

Vzhledem k extrémní schopnosti vázat vodu nabývají polymery roubované škrobem na významu. Tyto produkty mají hlavní řetězec tvořený škrobem a na něj jsou naroubovány boční řetězce ze syntetického monomeru na principu radikálového řetězového mechanismu. V současné době dostupné polymery roubované škrobem jsou charakteristické zlepšenou schopností vázat a zadržovat vodu až do 1000 g vody na g škrobu při vysoké viskozitě. Tyto vynikající absorbéry jsou používány hlavně v oboru hygieny, např. ve výrobcích jako jsou pleny a prostěradla, podobně v zemědělském sektoru, např. v obalování semen.

Rozhodující pro používání nových škrobů modifikovaných technikami rekombinantní DNA jsou na jedné straně struktura, obsah vody, obsah proteinů, obsah lipidů, obsah vlákniny, obsah popele/fosfátů, poměr amylosa/amylopektin, distribuce relativní molekulové hmotnosti, stupeň větvení, velikost zrn a jejich tvar, stejné jako krystalizace, tt tt··· • tttt · • tttt · • tt tttt · • tttt · tttt tttt a na druhé straně jsou to vlastnosti, které se promítají do následujících vlastností: takové a sorpční vlastnosti, teplota pastifikace, viskozita, schopnost houstnutí, rozpustnost, struktura pasty, průhlednost, odolnost vůči teplu, smyku a kyselinám, tendence k retrogradaci, schopnost tvořit gel, odolnost vůči zmrazování/ rozmrazování, schopnost tvorby komplexů, vázání jódu, tvorba filmu, adhezní síla, stabilita vůči enzymům, stravitelnost a reaktivita.

Výroba škrobu modifikovaného genetickou manipulací transgenických rostlin může změnit vlastnosti škrobu získaného z rostliny tak, že další modifikace chemickými a fyzikálními metodami mohou být nadbytečné. Na druhou stranu mohou být škroby modifikované pomocí technik rekombinantní DNA podrobeny dalším chemickým modifikacím, které budou mít za výsledek další zlepšení kvality pro určité z výše popsaných oblastí aplikace. Takové chemické modifikace jsou známy. Zvláště jsou to modifikace za pomoci

- tepelné zpracování

- zpracování kyselinami

- oxidace a

- esterifikace, které vedou k tvorbě fosorečnanů, dusičnanů, síranů, xantogenátů, octanů a citrátů škrobů. K esterifikaci mohou být použity také další organické kyseliny:

- výroba etherů škrob-alkylether, O-allylether, hydroxyalkylether, O-karboxymetylether, ethery škrobu obsahující dusík, ethery škrobu obsahující fosfor a ethery škrobu obsahující síru.

- výroba větvených škrobů

- výroba polymerů roubovaných škrobem.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 schematicky znázorňuje plazmid pJT31 (AATP1 (Arabidopsis thaliana) antikódující).

Obr. 2 schematicky znázorňuje plazmid pJT31 (AATP1 (Solanum tuberosum) antimediátorovou).

44 • · · 4 • · 4 4 • · · ·

4 4 4

Obr. 3 ukazuje porovnání aminokyselinové sekvence AATP2 zArabidopsis thaliana sAATPI (A. thaliana) s homologním proteinem zRickettsia prowazekii (Williamson a kol., Gene 80 (1989), 269 až 278).

Obr. 4 představuje analýzu hydroterapie AATP2 (A. thaliana), AATP1 (A. thaliana) a přenašeče ADP/ATP z Rickettsia provedené způsobem podle Heijne a kol. (Eur. J. Biochem. 180 (1989), 535 až 545).

Obr. 5 ukazuje analýzu exprese AATP1 (Solanum tuberosum) s použitím

Northern blotu v listech a hlízách rostlin s antimediátorovým přenašečem ADP/ATP .

Obr. 6 ukazuje analýzu exprese AATP1 (Arabidopsis thaliana) s použitím

Northern blotu v listech a hlízách rostlin s nadměrnou expresí přenašeče ADP/ATP.

Obr. 7 představuje schematický plán kazety pTE200 sloužící ke specifické expresi v embryu. EcoRI, Smál, BamHI, Xhol, Notl, Xbal, Sací, KpnI, Apal, Sall a Sfil značí poznávací místa pro restrikční endonukleázy. Z praktických důvodů se Sfil (A) a Sfil (B) liší variabilními sekvencemi nukleotidů v rámci rozpoznávací sekvence. Zkratky znamenají následující: PCIFatB4 = promotor CIFatB4, tCIFatB4 = terminátor CIFatB4, amp = bakteriální rezistence vůči ampicilinu, ColE1 ori = „počátek replikace“ z plazmidu ColE1, f1 (-) ori = „počátek replikace“ z fága f1.

Obr. 8 představuje schematický plán expresní kazety přenašeče ADP/ATP pTE208: Tento derivát vektoru pTE200 (Obrázek 7) nese cDNA kódující přenašeč ADP/ATP z Solanum tuberosum v antimediátorové orientaci;

Obr. 9Schématická mapa binárního vektoru pMH000-0. Sfil, Sall, Clal, Hindlll, EcoRI, Nsil, Smál, BamHI, Spěl, Notl, KpnI, BglII, Apal, Xhol, Xbal a BstEII označují rozpoznávací sekvence restrikčních endonukleáz. Sfil (A) a Sfil (B) se navzájem liší jak bylo popsáno. To je důvodem zabraňujícím zpětné cirkularizaci výchozího vektoru při štěpení Sfil a je možná přímá inzerce expresní kazety z derivátu pTE200. Zkratky označují následující: RB, LB = pravá a levá hraniční oblast, t35S - terminační oblast z 35S rna genu z CaMV, pat = gen kódující fosfinotricinacetyltransferasu, p35S = promotor 35S rna genu z CaMV, p35S (min) = minimální promotor z 35S rna genu z CaMV, tp-sul = gen s tranzitním peptidem kódující odolnost vůči sulfonamidům, tnos = terminační signál genu kódujícího nopalinsyntasu, Sm/Sp = bakteriální rezistence vůči streptomycinu a spektinomycinu, parA, parB a parR = multiplikační funkce plazmidu z plazmidu pVS1 se širokou oblastí hostitelských kmenů tj. Agrobacterium tumefaciens a Escherichia coli.

* · · · ···· • ·♦·· ···· * · » · · · · · ···· · · ······ • · · · · · · • ······· · · ··

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady ilustrují vynález.

Příklad 1

Konstrukce bakteriálního expresního vektoru pJT118 a transformace E.coli

K N-konci proteinu AATP2 (genová knihovna X94626) z Arabidopsis thaliana byl napojen „histidinový ocásek“ obsahující 10 aminokyselinových zbytků.

Proto byla cDNA kódující celý protein AATP2 z Arabidopsis thaliana izolována pomocí PCR. Jako antikódující primer sloužil následující oligonukleotid obsahující navíc rozpoznávací místo pro restrikční endonukleázu Xhol:

cgtgagagatagagagctcgagggtctgattcaaacc (identifikační číslo sekvence 1); obsahující páry baží 66 až 102.

Jako antimediátorový primer sloužil oligonukleotid obsahující navíc místo pro restrikční endonukleázu BamHi: gatacaacaggaatcctggatgaagc (identifikační číslo sekvence 2), obsahující páry baží 1863 až 1835. Získaný PCR produkt byl přečištěn na agarosovém gelu, štěpen restrikčními enzymy Xhol/BamHI a byl vložen „v rámci“ do plazmidu pET16b (Novagene, Heidelberg, Německo). To vedlo k exhibici histidinového ocásku z 10 aminokyselin na N-konci cDNA kódující celý AATP2 protein z Arabidopsis thaliana (His-AATP2). Vektor byl nazván pJT118. Sekvence PCR produktu byla určena sekvenční analýzou obou nukleotidových řetězců (Eurogentec). Transformace E. coli C43 (Miroux a Walker, J. Mol. Biol. 260 (1996), 289 až 298) byla provedena standardními metodami.

Kmen C43 E. coli umožňuje heterologní expresi živočišných (Miroux a Walker, citováno výše) a rostlinných (Tjaden a kol., J. Biol. Chem. (1998) (v tisku) membránových proteinů.

Po transformaci zmíněného kmenu vektorem pJT118 byly provedeny studie s radioaktivně značeným ADP a ATP. Těmito studiemi je možné demonstrovat, že HÍS-AATP2 může být funkčně exprimován v E. coli C43 v cytoplazmatické membráně E. coli. To ukázalo, že AATP2 kóduje ve skutečnosti přenašeč ADP/ATP. Přítomnost Nkoncového histidinového ocásku vede ke zvýšení (dva- až třikrát) transportní aktivity AATP2 z A. thaliana do E. coli v porovnání s AATP2 bez N-koncového histidinového ocásku.

·· ··

Příklad 2

Konstrukce plazmidu pJT31 a vložení tohoto plazmidu do genomu rostlin brambor

Konstrukce vektoru k transformaci rostlin spočívala v ligaci fragmentu EcoRV/BamHI z AATP1-cDNAz A thaliana, o délce 2230 pb (Kampfenkel a kol., FEBS Letters 374 (1995), 351 až 355) do vektoru pBinAR štěpeného restriktázami Smal/EcoRV a BamHI (Hófgen a Willmitzer, Plant Sci. 66 (1990), 221 až 230). Vložením fragmentu cDNA byla vytvořena expresní kazeta (pJT31), která je tvořena následujícími fragmenty A, B a C (viz obr. 1):

Fragment A (540 pb) obsahuje 35S promotor mozaikového viru květáku.

Fragment B obsahuje kromě bočních oblastí i protein kódující oblast přenašeče ADP/ATP z A. thaliana (AATP1). Izolace zmíněné oblasti byla popsána výše. Dále byla oblast spojena v antikódující orientaci s 35S promotorem ve vektoru pBinAR.

Fragment C (215 pb) obsahuje polyadenylační signál z genu kódujícího oktopinsyntasu z Agrobacterium tumefaciens.

Velikost plazmidu pJT31 činí přibližně 14,2 kb (kilopárů baží).

Plazmid byl přenesen do rostlin brambor s použitím Agrobacteria podle RochaSosa a kol. (EMBO J. 8 (1989), 23 až 29). Výsledek transformace rostlin brambor byla zvýšená hladina mRNA přenašeče ADP/ATP z plastidů. Toto bylo detekováno pomocí Northern blotu (viz obr. 6). RNA byla izolována z pletiva listů a hlíz rostlin bramboru standardními metodami. 50 pg RNA bylo separováno na agarosovém gelu (1,5% agarosa, 1x pufr MEN, 16,6% formaldehyd). Po elektroforéze byla RNA přenesena s 20x SSC kapilárním blotem na nylonovou membránu Hybond N (Amersham, UK). RNA byla fixována na membráně pomocí UV záření. Membrána byla 2 hodiny prehybridizována ve fosfátovém hybridizačním pufru (Sambrook a kol., citováno výše) a následně hybridizována 10 hodin přidáním radioaktivně značené sondy.

Příklad 3

Konstrukce plazmidu pJT32 a vložení tohoto plazmidu do genomu rostlin brambor

Konstrukce vektoru určeného k transformaci rostlin spočívala v ligaci fragmentu BamHl/Ndel z kódující oblasti AATP1-cDNA z S. tuberosum (Genová banka Y10821) o • · délce 1265 pb do vektoru pBinAR (Hófgen a Willmitzer, Plant Sci. 66 (1990), 221 až

230) štěpeného restriktázami Smal/Ndel a BamHI.

Vložením fragmentu cDNA byla vytvořena expresní kazeta, která je tvořena následujícími fragmenty A, B a C (viz obr. 2):

Fragment A (540 pb) obsahuje 35S promotor mozaikového viru květáku.

Fragment B obsahuje oblast kódující přenašeč ADP/ATP z S. tuberosum (AATP1 S.t.) o délce 1265 pb. Zmíněná oblast byla dále spojena v antimediátorové orientaci s 35S promotorem ve vektoru pBinAR.

Fragment C (215 pb) obsahuje polyadenylační signál z genu kódujícího oktopinsyntasu z Agrobacteríum tumefaciens.

Velikost plazmidů pJT31 činí přibližně 13,3 kb.

Plazmid byl přenesen do rostlin brambor s použitím Agrobacteria podle RochaSosa a kol. (EMBO J. 8 (1989), 23 až 29).

Výsledkem transformace rostlin brambor byla snížená hladina mRNA přenašeče ADP/ATP z plastidu. Toto bylo detekováno pomocí Northern blotu (viz obr. 5). RNA byla izolována z pletiva listů a hlíz rostlin bramboru standardními metodami. 50 μς RNA bylo separováno na agarosovém gelu (1,5% agarosa, 1x pufr MEN, 16,6% formaldehyd). Po elektroforéze byla RNA přenesena s 20x SSC kapilárním blotem na nylonovou membránu Hybond N (Amersham, UK). RNA byla fixována na membráně pomocí UV záření. Membrána byla 2 hodiny prehybridizována ve fosfátovém hybridizačním pufru (Sambrook a kol., citováno výše) a následně hybridizována 10 hodin přidáním radioaktivně značené sondy.

Příklad 4

Analýza obsahu škrobu, amylosy a cukru v transgenických rostlinách bramboru

Stanovení obsahu rozpustných cukrů bylo provedeno podle popisu Lowry a Passonneau v „A Flexible System of Enzymatic Analysis“, Academie press, New York, USA (1972). Stanovení obsahu škrobu bylo provedeno podle popisu Batz a kol. (Plant Physiol. 100 (1992), 184 až 190).

• * · · ·· • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · ·

Tabulka 1:

linie / genotyp	obsah škrobu v (pmol jednotek C6/ g čerstvé váhy)	obsah rozpustných cukrů v (pmol/g čerstvé váhy)
Desiree / Divoký typ	1094,0	26,49
654/antimediátorový-AATP1 (S. tuberosum)	574,2	42,52
594/antimediátorový-AATP 1 (S. tuberosum)	630,2	48,76
595/antimediátorový-AATP 1 (S. tuberosum)	531,4	45,92
676/antimediátorový-AATP 1 (S. tuberosum)	883,0	40,60
62/anti kóduj ící-AATP 1 (A. thaliana)	1485,0	30,65
98/antikódující-AATP1 (A. thaliana)	1269,0	18,28
78/antikódující-AATP1 (A. thaliana)	995,0	20,50

Stanovení obsahu amylosy bylo provedeno podle Hovenkamp-Hermelink a kol (Potato Res. 31 (1988), 241 až 246):

Tabulka 2:

linie/genotyp	% amylosy
Desiree / Divoký typ	18,8
654/antimediátorový-AATP 1 (S. tuberosum)	15,5
594/antimediátorový-AATP 1 (S. tuberosum)	14,3
595/antimediátorový-AATP1 (S. tuberosum)	18,0
676/antimediátorový-AATP1 (S. tuberosum)	11,5
62/antikódující-AATP 1 (A. thaliana)	27,0
98/antikódující-AATP1 (A. thaliana)	22,7
78/antikódující-AATP1 (A. thaliana)	24,5

Příklad 5

Výroba expresní kazety a transformace rostlin řepky

Expresní kazeta pTE200 v derivátu pBluescriptu (Short a kol., Nucl. Acid Res. 16, (1988), 7583 až 7600) nese sekvenci promotoru a terminátoru genu kódujícího thioesterázu CIFatB4 (přístupové číslo v genové bance AJ131741) z Cuphea lanceolata a vhodné sekvence polylinkeru sloužích k vložení různých užitečných genů. Krajní rozpoznávací sekvence Sfil s nekompatibilními nukleotidy ve variabilních rozpoznávacích úsecích umožňují řízený přenos celé expresní kazety, včetně užitečného genu, do odpovídajících resrikčních míst binárního plazmidového vektoru pMHOOO-O a další vývoj vektoru pLH9000 (Hausmann a Tópfer, (1999); 9. kapitola; Entwicklung von PlasmidVektoren v Bioengineering fůr Rapssorten nach MaB, D. Brauer, G. Róbbelen and R. Tópfer (vydavatelé), Vortráge fůr Planzenzůchtung, svazek 45, 155 až 172) a zabraňují zpětné cirkularizaci DNA v přijímajícím vektoru.

K výrobě expresní kazety pTE200 byl nejdříve fragment Sall-Bbvl nesoucí promotor o přibližné délce 3,3 kb izolován zgenomového klonu CITEg16 (WO95/07357), který nesl kompletní sekvenci genu CIFatB4 z C. lanceolata. Aby mohlo být tohoto dosaženo, bylo nejdříve otevřeno restrikční místo Bpvl na 3’-konci promotoru a bylo modifikováno tak, aby fragment mohl být vložen do pBluescriptu (stratagen) štěpeného pomocí Sall a Smál. Vnitřní rozpoznávací místo pro EcoR fragmentu umístěného na 1211 nukleotidech na 5’-konci bylo vymazáno tak, že bylo otevřeno a změněno T4- polymerasou a následně opět uzavřeno.

Sekvence terminátoru byla zvětšena polymerasovou řetězovou reakcí s použitím specifických oligonukleotidových primerů na matrici CITEg16 (WO95/07357) a byla opatřena různými polylinkerovými restrikčními místy (MCS) prostřednictvím příměrů. Sekvence použitých primerů jsou;

5'GAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTCTCGAGAAGTGGCTGGGGGCCTTT CC3' (identifikační číslo sekvence: 3)= 5'-primer: (MCS: EcoRI, Pstl, Smál, BamHI, Spěl Xhol; CIFatB4 terminátor: od pozice 35 po 56) a

5'TCTAGAGGCCAAGGCGGCCGCTTCAACGGACTGCAGTGC3' (identifikační číslo sekvence: 4) = 3'-primer: CIFatB4 terminátor: od pozice 22 po 39, MCS: Notl, Styl, Sfil,

Xbal. Zvětšený produkt byl štěpen enzymy EcoRV a Notl a vložen do odpovídajících restrikčních míst vektoru pBlueSfi BA (Hausmann and Tópfer, viz výše). Fragment nesoucí promotor byl otevřen BamHI, modifikován a následně štěpen Sall, aby jej bylo • · 00 · ·· ·0 0· • · 0 0 0 0 • 0 0 0 0 • 0 0 0 0 0 • 0 0 0 0 •000 00 00 možné vložit do vektoru pBlueSfi BA prostřednictvím restrikčního místa Sall a modifikovaného Hindlll před terminátorem. Výsledkem je expresní kazeta pTE200 (viz obr.7).

Konstrukce vektoru určeného k transformaci rostlin spočívala v ligaci fragmentu EcoRI z AATP1 cDNA z Solárium tuberosum (pTM1, Tjaden a kol., The Plant Journal 16 (1998) 531 až 540) o délce 2270 pb do vektoru pTE200, který byl otevřen EcoRI. Orientace byla kontrolována restrikčním trávením. Výsledkem byl plazmid pTE208 (obr. 8). V následujícím kroku byl Sfil fragment z pTE208 vložen do restrikčních míst polylinkeru binárního vektoru pMHOOO-O (obr. 9) řízeným způsobem. Výsledkem byl vektor pMH 0208.

Binární plazmidový vektor pMHOOO-O byl vyvinut dále z pLH9000 (Hausmann and Tópfer, viz výše) s různými selekčními značkovači pro transformace rostlin. Sulfonamidový gen (sul) byl izolován spolu se signální peptidovou sekvencí (tp) pro plastidiální import do malé podjednotky ribulosabisfosfátkarboxylasy z prekurzorového plazmidu pS001 (Reiss a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, (1996), 3094 až 3098) po modifikaci Asp718 na Xhol restrikční místo. Xhol - Sall fragment byl vložen do Xhol- a BamHI- restrikčních míst derivátu vektoru pBluescriptu před terminátorem genu kódujícího nopalinsyntasu (pAnos) po úpravě Sall a Bam Hl. Následnou třífragmentovou ligaci byly výsledný fragment tpsul-pAnos (Xhol - Xbal), spolu s Xhol - Hindlll fragment zpRT103pat (Tópfer a kol., Methods in Enzymol. 217, (1993), 66 až 78) spojeny s plazmidem pK18 (Pridmore, Gene 56, (1987), 309 až 312) otevřeným enzymy Hindlll a Xbal. Následkem toho byl gen kódující fosfinotricinacetyltransferasu s terminátorem genu CaMV35S RNA z pRT103pat umístěn v opačné orientaci k jednotce tpsul-Anos. Duální promotor ma genu CaMV35S jako Xhol fragment z potomka pROA93 (Ott a kol., Mol. Gen. Genet. 221, (1990), 121 až 124) byl vložen do Xhol restrikčního místa mezi sekvence genů zprostředkovávajících rezistenci, aby byla dokončena zmíněná dvojná selekční jednotka (s rezistencí proti herbicidu Basta a sulfonamidu sulfadiazinu). Po odpovídajících změnách v přiléhajícím polylinkeru byla výsledná duální selekční kazeta pomocí enzymů Xbal a Hindlll zaměněna za kanamycinovou kazetu v prekurzorovém l plazmidu pLH9000 (Hausmann and Tópfer, viz výše). Výsledkem byl binární plazmidový vektor pMHOOO-O.

Transformace hypokotylových explantátů řepky odrůdy Drakkar byla prováděna podle popisu De Blocka (Plant Physioi. 91 (1989), 694 až 701) s použitím Agrobacteria (kmen

GV 3101 C58C1 Rifr) nesoucí binární vektor pMH0208 (přenašeč ADP/ATP antikódující). Výhonky byly regenerovány na selektivním živném médiu (sulfonamid) a kultivoΦ φ φφφφ φ vány ve skleníku do vyzrání semen. Pomocí PCR a listového testu (tolerance vůči glufosinátamoniu (Basta®)) bylo stanoveno, které rostliny nesou transgen. Vyzrávající embrya byla v různých vývojových stádiích odebrána ze zmíněných rostlin a uskladněna v kapalném dusíku.

Stanovení obsahu oleje ve zralých semenech linií transgenické řepky a kontrolních linií bylo prováděno neinvazivní infračervenou spektroskopií v blízké oblasti (popsané například v Schulz a kol., J. Near Infrared Spectrosc. 6, (1998), A125 až A130; Starr a kol., J. Agric. Sci. 104(2), (1985), 317 až 323).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Transgenická rostlinná buňka, která je geneticky modifikovaná, vyznačující se t í m , že genetickou modifikací je zavedení cizí molekuly nukleové kyseliny, jejíž přítomnost nebo exprese vede ke zvýšení aktivity plastidového přenašeče ADP/ATP ve srovnání s odpovídajícími geneticky nemodifikovanými rostlinnými buňkami z rostlin divokého typu.
2. Transgenická rostlinná buňka podle nároku 1,vyznačuj ÍCÍ se tím, Že cizí molekula nukleové kyseliny kóduje plastidový přenašeč ADP/ATP.
3. Transgenická rostlinná buňka podle nároku 2, vyznačující se tím, že zmíněná cizí molekula nukleové kyseliny kóduje plastidový přenašeč ADP/ATP z Arabidopsis thaliana.
4. Transgenická rostlinná buňka podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, Že vykazuje zvýšený výtěžek ve srovnání s odpovídajícími geneticky nemodifikovanými rostlinnými buňkami.
5. Transgenická rostlinná buňka podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, vyznačující se t í m , že vykazuje zvýšený obsah oleje a/nebo škrobu ve srovnání s odpovídající geneticky nemodifikovanými rostlinnými buňkami.
6. Transgenická rostlinná buňka podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, Že syntetizuje škrob, který vykazuje zvýšený podíl amylosy ve srovnání se škrobem odpovídajících geneticky nemodifikovaných rostlinných buňek.
7. Transgenická rostlina obsahující transgenické rostlinné buňky podle kteréhokoli z nároků 1 až 6.
8. Transgenická rostlina podle nároku 7, vyznačující se tím, Že ukládá škrob a/nebo olej.
9. Transgenická rostlina podle nároku 8, kterou je kukuřice, řepka, pšenice nebo brambor.
10. Způsob výroby transgenické rostliny, která vykazuje zvýšený výtěžek ve srovnání s rostlinami divokého typu, kde (a) rostlinná buňka je geneticky modifikována vložením cizí molekuly nukleové kyseliny, jejíž přítomnost nebo exprese vede ke zvýšení aktivity plastidového přenašeče ADP/ATP v buňce;

• · • φ · · · t ·· ·· ·· φφφ φ · φ φ φ φ φ φ · φ · • ···*·· • · φφ φφφφ φφφ φ φφφ φφφφ ·« ·· (b) rostlina je regenerována z buňky vyrobené podle kroku (a); a (c) další rostliny jsou případně vyrobeny z rostliny vyrobené podle kroku (b).
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že transgenické rostlina má zvýšený obsah oleje a/nebo škrobu ve srovnání s rostlinami divokého typu a/nebo jejíž škrob obsahuje zvýšený obsah amylosy ve srovnání se škrobem z rostlin divokého typu.
12. Transgenické rostlina, kterou je možno získat způsobem podle nároků 10 nebo 11.
13. Propagační materiál rostlin podle kteréhokoli z nároků 7 až 9 nebo 12, vyznačující se tím, že zmíněný propagační materiál obsahuje transgenické buňky podle kteréhokoli z nároků 1 až 6.
14. Použití molekul nukleové kyseliny kódujících plastidový přenašeč ADP/ATP k produkci transgenických rostlin vykazujících zvýšený výtěžek ve srovnání s rostlinami divokého typu.
15. Použití podle nároku 14, vyznačující se tím, Že transgenické rostlina má zvýšený obsah oleje a/nebo škrobu a/nebo syntetizuje škrob se zvýšeným obsahem amylosy ve srovnání se škrobem z rostlin divokého typu.
16. Způsob výroby modifikovaného škrobu zahrnující extrakci škrobu z rostliny podle kteréhokoli z nároků 7 až 9 nebo podle nároku 12.