CZ20002562A3

CZ20002562A3 - Příprava lipidové směsi a fosfolipidové suspenze obsahující lipidovou směs

Info

Publication number: CZ20002562A3
Application number: CZ20002562A
Authority: CZ
Inventors: Poh K. Hui; John E. Bishop; Eleodoro S. Madrigal Jr.
Original assignee: Du Pont Pharmaceuticals Company
Priority date: 1999-01-14
Filing date: 1999-01-14
Publication date: 2000-10-11

Abstract

Předložené řešení popisuje způsoby přípravy lipidové směsi a stejnoměrné filtrovatelné fosfolipidové suspenze obsahující lipidovou směs, přičemž tato suspenze je vhodná jako kontrastní činidlo pro ultrazvuk.

Description

Způsob přípravy lipidové směsi a fosfolipidové suspenze obsahující lipidovou směs

Oblast techniky;

Předložený vynález se týká obecně způsobů přípravy lipidové směsi a stejnoměrné filtrovatelné fosfolipidové suspenze obsahující lipidovou směs, přičemž tato suspenze je vhodná jako kontrastní činidlo pro ultrazvuk.

Dosavadní stav techniky:

Výrobu fosfolipidového kontrastního činidla lze rozdělit do následujících kroků: (1) příprava lipidové směsi ; (2) vytvoření objemového roztoku, které zahrnuje hydrataci a rozptýlení (disperzi) lipidové směsi v podstatě vodném prostředí za vzniku lipidové suspenze; (3) fitrace objemového roztoku přes sterilizační filtr/filtry k získání suspenze bez mikrobiologických nečistot; (4) vypuštění sterilní suspenze do jednotlivých lahviček v kontrolovaném aseptickém prostředí; (5) plnění nadávkovaných lahviček do lyofilizační komory, aby se nahradil plyn v horním prostoru lahvičky perfluoropropanovým plynem (PFP); (6) přenesení těsně uzavřených lahviček po výměně plynu do autoklávu pro konečnou sterilizaci.

V tomto postupu jsou tři velké překážky: (1) rovnoměrnost lipidové směsi; (2) hydratace lipidové směsi;

(3) rovnoměrnost a velikost částic suspenze; a, (4), sterilní filtrace suspenze přes sterilizační filtr (filtry).

minimalizace výsledných

Fosfolipidové směsi jsou typicky vyráběny rozpuštěním nebo suspendováním požadovaných lipidů v příslušném vodném nebo nevodném rozpouštědlovém systému, a potom redukováním objemu buď lyofilizací nebo destilací. Ideálně tento postup produkuje smísené pevné látky s vysokým obsahem jednotnosti a čistoty. Nicméně zatímco v malém, laboratorním měřítku pracuje dobře, je tento jednoduchý přístup často problematický při přenesení do výroby ve velkých rozměrech.

Obtíže zahrnují: (1) udržení jednotnosti (rovnoměrnosti) obsahu během kroku odstraňování rozpouštědla (vzhledem k rozdílným rozpustnostem); (2) udržení čistoty ( častý problém, když se použije voda, vzhledem k vedlejším hydrolytickým reakcím); (3) zvyšování čistoty; (4) objemu rozpouštědla; a (5) pevných látek ( např. není odškrabávat pevné látky z velkého reaktoru).

Po vyrobení lipidové směsi zahrnuje typicky finální sestavování směsi zavádění směsi do vodného média. Jelikož jsou fosfolipidy hydrofobní a snadno ve vodě, způsobuje přidávání lipidové směsi přímo do vodného roztoku, že se lipidový prášek shlukuje a vytváří shluky, které jsou velice obtížně dispergovatelné. Proces hydratace tak nemůže být regulován v potřebné době zpracování. Přímá hydratace fosfolipidů nebo lipidové směsi ve vodném prostředí produkuje zakalenou suspenzi s částicemi o rozměrech od 0,6 pm do 100 pm. Díky distribuci částic o relativně velké velikosti nemůže být suspenze filtrována při teplotě okolí, kdy je teplota roztoku suspenze pod teplotou fázového přechodu lipidů z odstranění praktické nerozpouštějí se fosfolipidů nebo • ·

gelu-na-tekutý krystal. Lipidy by se mohly shlukovat ve filtrech a způsobit tak omezení rychlosti průtoku, a ve většině případů by byly filtry krátce poté zcela zablokovány. Dalšího snížení velikosti částic suspenze nelze dosáhnout prostřednictvím běžných vsádkových postupů, dokonce i když se prodlouží míchání (např. na 6 hodin) při zvýšených teplotách (např. 40 °C až 80 °C) s běžně používanými lodními vrtulemi.

Ačkoliv je možná filtrace při zvýšených teplotách, tedy nad teplotou fázového přechodu lipidů, výrazné množství větších lipidových částic může ještě být vyloučeno, když se použije normální filtrační tlak. Naopak koncentrace sterilního filtrátu může mít proměnlivý obsah lipidů od vsádky k vsádce v závislosti na tom, jak jsou lipidy původně hydratovány, což je naopak určeno fyzikálními charakteristikami, tedy morfologií, výchozích materiálů.

Postup přímé hydratace lipidů nebo lipidové směsi pro výrobu jednotné suspenze a filtrace suspenze přes sterilní filtr/filtry může být obtížný a drahý na to, aby se využíval v rozumném komerčním měřítku, jako je > 20 1.

Proto předložený a nárokovaný postup výroby lipidové směsi a následně fosfolipidové suspenze usiluje o řešení výše uvedených problémů tím, že poskytuje praktický postup, který může být snadno přenesen a upraven na různé provozní podmínky bez širokých úprav nebo doplňování existujícího zařízení.

Podstata vynálezu:

Jedním předmětem předloženého vynálezu je poskytnout • · • 4 4 4 • ·44 4 4 nový způsob přípravy lipidové směsi.

Dalším předmětem předloženého vynálezu je poskytnout nový způsob přípravy fosfolipidové suspenze z lipidové i

směsi.

Těchto a dalších předmětů, které budou zřejmé z dalšího podrobného popisu, bylo vynálezci dosaženo na základě zjištění, že rozpuštění lipidové směsi ve vhodném nevodném rozpouštědle před tím, než se přivede do vodného roztoku, umožní produkci fosfolipidové suspenze.

Podrobný popis vynálezu:

/1/ V prvním provedení tedy poskytuje vynález nový způsob přípravy fosfolipidové suspenze, který obsahuje:

(1) uvedení do kontaktu lipidové směsi s nevodným rozpouštědlem, čímž se lipidová směs v podstatě rozpustí v nevodném rozpouštědle; a (2) uvedení do kontaktu roztoku z kroku (1) s vodným roztokem za vzniku lipidové suspenze.

/2/ Ve výhodném provedení je nevodné rozpouštědlo vybráno z propylenglykolu, ethylenglykolu a polyethylenglykolu 300.

/3/ V ještě výhodnějším provedení je nevodným rozpouštědlem propylenglykol.

/4/ V dalším výhodném provedení obsahuje lipidová směs:

(a) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholin;

(b) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfotidovou, monosodnou sůl; a • · • ·

(c ) N- (methoxypolyethylenglykol 5000 karbamoyl)-l,2-dipalmitoyl~sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin, monosodnou sůl.

/5/ V dalším výhodném provedení se v kroku	(1)	nevodné
rozpouštědlo zahřívá na teplotu asi 30 až	asi	70 °C
předtím, než se uvede do kontaktu s lipidovou směsí.
/6/ V dalším ještě výhodnějším provedení	se	nevodné

rozpuštědlo zahřívá na teplotu asi 50 až asi 55 °C před tím, než se uvede do kontaktu s lipidovou směsí.

/7/ V jiném výhodném provedení je poměr lipidové směsi k nevodnému rozpouštědlu od asi 5 mg lipidové směsi na mililitr nevodného rozpouštědla do asi 15 mg/ml.

/8/ V dalším ještě výhodnějším provedení je poměr lipidové směsi k nevodnému rozpouštědlu asi 10 mg/ml.

/9/ V jiném výhodném provedení je v kroku (2) vybrán vodný roztok z vody, solného roztoku, směsi solného roztoku/glycerinu, a směsi solného roztoku/ glycerinu/nevodného rozpouštědla.

/10/ V dalším ještě výhodnějším provedení je vodným roztokem směs solného roztoku a glycerinu.

/11/ V dalším ještě výhodnějším provedení je vodným roztokem směs solného roztoku, glycerinu a propylenglykolu.

• · · · /12/ V dalším ještě výhodnějším provedení je přítomno 6,8 mg/ml chloridu sodného; 0,1 ml/ml glycerinu; 0,1 ml/ml propylenglykolu; a asi 0,75 až 1,0 mg/ml lipidové směsi.

/13/ V dokonce mg/ml lipidové ještě výhodnějším provedení je přítomno 0,75 směsi.

/14/ V dalším ještě výhodnějším provedení je přítomno 1,0 mg/ml lipidové směsi.

/15/ V dalším výhodném provedení je v kroku (2) vodný roztok zahříván na teplotu asi 45 až 60 °C před uvedením do kontaktu s roztokem z kroku (1).

/16/ V dalším ještě výhodnějším provedení je vodný roztok zahříván na teplotu asi 50 až 55 °C před uvedením do kontaktu s roztokem z kroku (1).

/17/ V jiném výhodném provedení způsob dále zahrnuje:

(3) zahřívání lipidové suspenze z kroku (2) na teplotu asi shodnou s nebo vyšší než je nejvyšší teplota přechodu krystalické fáze gelu na kapalinu u lipidů, přítomných v suspenzi.

/18/ V jiném ještě výhodnějším provedení je v kroku (3) lipidová suspenze zahřívána na teplotu alespoň asi 67 °C.

/19/ V jiném ještě výhodnějším provedení postup obsahuje:

dále • · • · · · (4) filtrování lipidové suspenze přes sterilizační filtr.

/20/ V jiném dokonce ještě výhodnějším provedení se v kroku (4) provádí filtrace s použitím dvou sterilizačních filtračních náplní.

/21/ V dalším výhodném provedení jsou sterilizační filtrační náplně při teplotě od asi 70 do asi 80 °C.

/22/ V jiném dalším provedení jsou v kroku (4) použity 0,2 pm hydrofilní filtry.

/23/ V jiném dokonce ještě výhodnějším provedení postup dále zahrnuje:

(5) dávkování filtrovaného roztoku z kroku (4) do lahvičky.

/24/ V jiném dále výhodném provedení postup dále zahrnuje:

(6) výměnu plynu v horním prostoru lahvičky z kroku (5) plynným perfluoruhlovodíkem.

/25/ V jiném dokonce ještě výhodnějším provedení je plynným perfluoruhlovodíkem perfluorpropan.

/26/ V jiném dokonce ještě výhodnějším provedení se provádí výměna plynu v horním prostoru použitím lyofilizační komory.

/27/ V jiném dokonce ještě výhodnějším provedení postup dále ·· ·ΦΦΦ • φ φ φ φ · • · · » · · >·· φφ zahrnuje:

(7) sterilizaci lahvičky z kroku (6).

/28/ V dokonce ještě výhodnějším provedení se v kroku (7) lahvička sterilizuje při asi 126-130 °C po 1 až 10 minut.

/29/ Ve druhém provedení poskytuje předložený vynález nový způsob přípravy lipidové směsi zahrnující:

(a) uvedení do kontaktu alespoň dvou lipidů s prvním nevodným rozpouštědlem (b) koncentrování roztoku na hustý gel;

(c) uvedení do kontaktu hustého gelu s druhým nevodným roztokem; a (d) spojení získaných pevných látek.

/30/ Ve výhodném provedení jsou lipidy v kroku (a) :

(i) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfátidylcholin;

(ii) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfotidová, monosodná sůl; a (iii ) N- (methoxypolyethylenglykol 5000 karbamoyl)-1,2dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin, monosodná sůl.

/31/ V jiném výhodném provedení je v kroku (a) prvním nevodným rozpouštědlem směs methanolu a toluenu.

/32/ V jiném výhodném provedeni! je v kroku © druhým nevodným rozpouštědlem methyl-terc.butylether.

fcfc fcfcfcfc • fc • fc fc fcfc · • I» • · • · fcfcfcfc fcfc fc fc • · • · /33/ V jiném výhodném provedení je v kroku (a) roztok zahříván na teplotu postačující k úplnému rozpuštění lipidů v rozpouštědle.

/34/ V jiném ještě výhodnějším provedení je v kroku (a) roztok ohříván na asi 25 až asi 75 °C.

/35/ V jiném výhodném provedení jsou v kroku (d) shromážděné pevné látky promyty methyl-terc.butyletherem a sušeny ve vakuu.

/36/ Ve třetím provedení poskytuje předložený vynález novou fosfolipidovou suspenzi obsahující:

(a) lipidovou směs v množství asi 0,75-1,0 mg/ml suspenze;

(b) chlorid sodný v množství asi 6,8 mg/ml suspenze;

(c ) glycerin v množství asi 0,1 ml/ml suspenze;

(d) propylenglykol v množství asi 0,1 ml/ml suspenze; a (e) vodu;

přičemž suspenze se připraví postupem zahrnujícím:

(1) uvedení do kontaktu lipidové směsi s nevodným rozpouštědlem, přičemž lipidová směs se v podstatě rozpustí v nevodném rozpouštědle;

(2) uvedení do kontaktu roztoku z kroku (1) s vodným roztokem za vzniku lipidové suspenze;

(3) zahřívání lipidové suspenze z kroku (2) na teplotu asi stejnou nebo vyšší, než je teplota přechodu krystalické fáze z gelu na kapalinu u lipidů přítomných v suspenzi; a «· ··♦· ♦ 4 «· • « · · « • ··· · · • 4 · 4 · « • · · · ·

4··· «· _β· (4) filtrování lipidové suspenze přes sterilizační filtr.

/37/ V jiném výhodném provedení obsahuje lipidová směs:

(a) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholin;

(b) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfotidovou, monosodnou sůl; a (c ) N- (methoxypolyethylenglykol 5000 karbamoyl)-1,2dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin, monosodnou sůl.

/38/ V jiném ještě výhodnějším provedení se nevodné rozpouštědlo zahřívá na teplotu asi 50 až asi 55 °C před uvedením do kontaktu s lipidovou směsí.

/39/ V jiném ještě výhodnějším provedení je poměr lipidové směsi k nevodnému rozpouštědlu asi 10 mg/ml.

/40/ V jiném ještě výhodnějším provedení je vodným roztokem směs solného roztoku, glycerinu a propylenglykolu.

/41/ V dokonce ještě výhodnějším provedení je přítomno 0,75 mg/ml lipidové směsi.

/42/ V dalším výhodném provedení se zahřívá vodný roztok na teplotu asi 50 až 55 °C před uvedením do kontaktu s roztokem z kroku (1) .

/43/ V jiném ještě výhodnějším provedení se v kroku (3) lipidová suspenze zahřívá na teplotu alepoň asi 67 °C.

«· ·*«· /44/ V ještě dalším výhodném provedení se použijí v kroku(4 ) dva 0,2 pm hydrofilní filtry.

Příklady provedeni vynálezu:

Složení:

Předpokládá se, že předložený vynález bude prakticky uskutečňován v alespoň vícegramovém měřítku, kilogramovém měřítku, vícekilogramovém měřítku, nebo v průmyslovém měřítku. Vícegramové měřítko, jak se zde používá, je výhodně měřítko, kde je alespoň jeden výchozí materiál přítomen v 10 gramech nebo více, ještě výhodněji alespoň 50 gramech nebo více, dokonce ještě výhodněji alespoň 100 gramech nebo více. Vícekilogramové měřítko, jak se zde používá, je uvažováno jako měřítko, kde se používá více než jeden kilogram alespoň jednoho výchozího materiálu. Průmyslové měřítko označuje měřítko, které je jiné než laboratorní měřítko a které je postačující pro přísun produktu dostatečného pro klinické testy nebo distribuci k zákazníkům.

Lipidová směs nebo fosfolipidová směs, jak se zde používá, je uvažována, že znamená dva nebo více lipidů, které byly smíseny. Lipidová směs je obecně v práškové formě. Přednostně je alespoň jedním z lipidů fosfolipid. Přednostně lipidová směs obsahuje

1.2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholin (DPPC);

1.2- dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfotidovou, monosodnou sůl (DPPA); a N- (methoxypolyethylenglykol 5000 karbamoyl)- 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidyl-ethanolamin,

9

9 9

9

9 •999 99 monosodnou sůl (MPEG5000-DPPE). Množství každého lipidu, přítomné ve směsi, závisí na požadovaném konečném produktu. Výhodné poměry každého z lipidů jsou uvedeny v příkladové části. Široká řada dalších lipidů, jako jsou posány v patentu US 5 469 854, Unger a kol., jehož obsah je zde uveden jako odkaz, může být použita v předloženém postupu.

Fosfolipid, jak se zde používá, je mastná látka obsahující olejový (hydrofobní) uhlovodíkový řetězec (e) s hlavní polární (hydrofilní) forforečnou skupinou. Fosfolipidy jsou amfifilní. Spontánně tvoří hranice a uzavřené váčky ve vodném prostředí. Fosfolipidy tvoří asi 50 % hmotnosti buněčné plasmové membrány živočichů.

Příprava lipidové směsi

Lipidová směs může být připravena vodným suspenzně -lyofilizačním postupem nebo postupem disoluce v organickém rozpouštědle -vysrážením s použitím organických rozpouštědel. V postupu vodného suspenzně-lyofylizačního jsou požadované lipidy suspendovány ve vodě při zvýšené teplotě a potom koncentrovány lyofilizací. Výhodně se používá postupu disoluce (rozpouštění).

Krok (a):

Postup rozpouštění - vysrážení v organickém rozpouštědle zahrnuje uvedení do kontaktu požadovaných lipidů (jako DPPA, DPPC, a MPEG5000 DPPE) s prvním nevodným rozpouštědlovým systémem. Tento systém je typicky kombinací rozpouštědel, např. CHC1₃/ MeOH, CH₂Cl₂/MeOH a toluenu/ MeOH.

999·

99 « · 9 · 9 • 9 99 9 9 • 9 9 9 9 9 • · 9 9 9

9999 99 99 • 9 9 • 9 9

9 9 9

9 9

13
Přednostně	je první nevodné rozpouštědlo	směs	toluenu a
methanolu.	Může být vhodné ohřát lipidový	roztok na

teplotu postačující k dosažení úplného rozpuštění. Tato teplota je přednostně asi 25 až 75 °C, ještě výhodněji asi 35 až 65 °C.

Po rozpuštění může být vhodné odstranit nerozpuštěné cizí látky filtrací za horka nebo ochlazením na teplotu místnosti a potom filtrací. Mohou být použity známé postupy filtrace (jako gravitační filtrace, filtrace za vakua nebo tlaková filtrace).

Krok (b):

Potom je roztok koncentrován na hustý gel/polopevnou látku. Koncentrování se přednostně provádí vakuovou destilací. Další metody koncentrování roztoku, jako je rotační odpařování, mohou být rovněž použity. Teplota v tomto kroku je výhodně kolem 20 až 60 °C, výhodněji 30 až 50 °C.

Krok (c):

Hustý gel/polopevná látka je potom dispergován ve druhém nevodném rozpouštědle. Směs je suspendována, přednostně blízko okolní teploty (jako 15-30 °C) . Vhodná druhá nevodná rozpouštědla jsou ta, která způsobují, že se lipidy vysrážejí z filtrovaného roztoku. Druhým nevodným rozpouštědlem je přednostně methyl terč.butylether (MTBE). Mohou být použity i jiné ethery a alkoholy.

Krok (d):

Potom jsou tuhé látky produkováné po přidání druhého

44 « 4 4 ·

4 4 « • 4 · ·

44 nevodného rozpouštědla spojeny. Výhodně jsou spojené tuhé látky promyty dalším dílem druhého nevodného rozpouštědla (jako MTBE). Sloučení se může uskutečnit přes vakuovou filtraci nebo odstředěním, přednostně při teplotě okolí. Po sloučení je výhodné, pokud jsou pevné látky sušeny ve vakuu při teplotě asi 20 - 60 °C.

Z následujících důvodů je postup s rozpouštěním organickým rozpouštědlem - srážecím postupem výhodnější, než je postup vodné suspenze-lyofilizace:

(1) Protože lipidy jsou zcela rozpustné v toluenu/methanolu, jsou objemy rozpouštědla výrazně sníženy ( vzhledem k vodnému postupu) .

(2) Vzhledem k tomuto zvýšení rozpustnosti je teplota zpracování také nižší vzhledem k vodnému postupu, čímž je zabráněno hydrolytické nestabilitě esterů mastných kyselin.

(3) Když se ochladí zpět na teplotu místnosti zůstává toluen/methanolový roztok lipidů homogenní, což umožňuje fitraci při teplotě místnosti, aby se odstranily cizí pevné látky.

(4) MTBE vysrážení umožňuje rychlé a snadné izolování pevných látek lipidové směsi. U vodného postupu se spotřebuje čas na lyofilizaci použitou k izolaci materiálu.

(5) MTBE vysrážení rovněž umožňuje odstranění v MTBE rozpustných nečistot, které přicházejí do odpadního filtračního proudu. Tato možnost odstraňování nečistot není realizována, pokud je roztok přímo koncentrován nebo lyofilizován na pevnou látku.

·· **··

00

9 « « « 0 · ·

0 0 0 0

0 0 0

90 • 0 ·· • 9 9 9 0 •999 · 9 * · 0 0 9 0 • 9 0 9 9

0090 00 0« (6) Předložený postup umožňuje jednotnou pevnou látku.

Příprava lipidové suspenze Krok (1):

V kroku jedna se uvádí lipidová směs do kontaktu s nevodným rozpouštědlem, přičemž je lipidová směs v podstatě rozpuštěna v nevodném rozpouštědle. Obdobně mohou být jednotlivé lipidy uvedeny do kontaktu s nevodným rozpouštědlem postupně v pořadí: DPPC, DPPA, a

MPEG5000-DPPE; DPPC, MPEG5000-DPPE, a DPPA; MPEG5000-DPPE, DPPA a DPPC; nebo MPEG5000-DPPE, DPPC, a DPPA. DPPA, který je nejméně rozpustný a nejméně bohatý z lipidů, se nepřidává první. Přidání jednoho z ostatních lipidů před nebo spolu s přidáním DPPA usnadňuje disoluci DPPA. V jiné alternativě mohou být jednotlivé lipidy kombinovány ve svých pevných formách a kombinace pevných látek je pak uváděna do kontaktu s nevodným rozpouštědlem.

Podstatné rozpuštění je obvykle indikováno tím, že se se směs lipidové směsi a nevodného rozpouštědla vyčeří. Jak bylo uvedeno výše, fosfolipidy nejsou obecně ve vodě rozpustné. Proto přímé vnesení směsi fosfolipidové směsi do vodného prostředí způsobí, že se lipidová směs shlukuje a vytváří tak shluky, které jsou velmi obtížně dispergovatelné. Předložený vynález překonává tato omezení rozpouštěním lipidové směsi v nevodném rozpouštědle před vnesením do vodného roztoku. Tím se umožní dispergovat lipidovou směs v kapalině. Kapalná disperze může být vnesena do potřebného vodného prostředí.

„Nevodné znamená rozpouštědlo nebo směs •4 4444 *4 Μ*

4 4

444 • »

4 4 4 4

4444 44 44

4444 44 44 • · 4 4 4 4 4 . * · * »444 * · · ♦ 44 4 4 · “ “ * 4 4 4 4 • 4 44 rozpouštědel, kde množství přítomné vody je tak dostatečně nízké, že nebrání rozpouštění lipidové směsi. Požadované množství nevodného rozpouštědla závisí na rozpustnosti lipidové směsi a také na požadované výsledné koncentraci každé složky. Jak bude odborník v dané oblasti předpokládat, množství vody přítomné v nevodném rozpouštědle, které může být tolerováno, se bude měnit s ohledem na rozpustnosti jednotlivých lipidů v lipidové směsi ve vodě. Čím rozpustnější ve vodě jsou jednotlivé fosfolipidy, tím více je vody, která může být přítomna v kroku (1) . Výhodně se používá jako nevodné rozpouštědlo propylenglykol. Nicméně i další z rodiny polyolů, jako je ethylenglykol a polyethylenglykol, mohou být použity.

Mechanické míchání lipidové směsi a nevodného rozpouštědla může být pro dosažení úplného rozpuštění nezbytné. Odborník znalý dané oblasti techniky rozpozná, které z řady způsobů míšení jsou vhodné. Přednost se dává použití homogenizeru s vysokým střihem.

Odborník z dané oblasti techniky ví, že zvýšení teploty rozpouštědla může napomoci rozpuštění lipidové směsi. Teplota, při níž se může krok (1) uskutečňovat, se může měnit v rozmezí od teploty okolí až k bodu varu vybraného rozpouštědla. Přednostně je teplota od asi 30 do asi 70 °C, výhodněji asi 45 až asi 60 °C, a dokonce ještě výhodněji asi 50, 51, 52, 53, 54 a 55 °C. Pokud se použije ethylenglykol nebo polyethylenglykol 300, je výhodné, pokud je teplota od asi 50 do asi 60 °C a ještě výhodněji kolem 55 °C. Udržování roztoku na zvýšené teplotě má snižovat • · • · ·· • · « • · · · · · viskozitu roztoku a usnadnit přípravu prostředku.

Výhodný postup rozpouštění lipidové směsi je následující:

(a) Přidá se propylenglykol do vhodného zváženého zásobníku, (b) Ohřeje se propylenglykol na asi 40-80 °C v ohřívací lázni. ( c) Naváží se lipidová směs do samostatného zásobníku. (d) Když dosáhne propylenglykol požadovaného teplotního rozmezí, přenese se roztok do zásobníku obsahujícího lipidovou směs. (e) Zásobník se vloží zpět do ohřívací lázně, až je roztok čirý. (f) Roztok lipidové směsi/propylengylkolu se mechanicky míchá, aby se dále zajistilo úplné rozpuštění a jednotná disperze lipidové směsi.

Poměr lipidové směsi k nevodnému rozpouštědlu bude samozřejmě limitován rozpustností lipidové směsi. Tento poměr také bude ovlivněn požadovaným množstvím lipidové směsi ve finálním složení. Přednostně je poměr od asi 1 mg lipidové směsi na ml rozpouštědla (mg/ml) do asi 100 mg/ml. Ještě výhodněji je lipidová směs přítomna v množství asi 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15 mg/ml. Dokonce ještě výhodněji je lipidová směs přítomna v množství kolem 10 mg/ml.

Krok (2) :

Druhý krok zahrnuje uvedení do kontaktu roztoku z kroku (1) s vodným roztokem za vzniku lipidové suspenze. Vodným roztokem může být voda, solanka, směs solanky/glycerinu nebo směs solanky /glycerinu/ nevodného rozpouštědla. Nevodným rozpouštědlem je, jak bylo uvedeno ► · · • · • 0 · · dříve, výhodně propylenglykol. Suspenze, jak se zde používá, je ve smyslu označení disperze, v níž jsou nerozpustné částice dispergovány v kapalném prostředí.

Když se dosáhne úplného rozpuštění lipidové směsi (krok(l)), potom může být získaný roztok vnesen do vodného roztoku. Vodný roztok může obsahovat jednu nebo více složek vybraných z chloridu sodného, glycerinu a nevodného rozpouštědla. Přednostně obsahuje vodný roztok glycerin a chlorid sodný. Přednostně je přítomno ve vodném roztoku, před přidáním roztoku z kroku 1, postačující množství propylenglykolu, aby se zajistila požadovaná finální koncentrace propylenglykolu.

Pořadí přidávání potřebných složek se nepovažuje za zvláště významně dopadající na rezultující lipidovou suspenzi. Nicméně je výhodné, pokud se přidává roztok lipidové směsi do vody, která již může obsahovat výše zmíněné přídavné složky. Potřebné přídavné složky mohou být přidány i potom. Výhodnější je, pokud se roztok lipidové směsi přidá do roztoku vody a chloridu sodného (tedy solanky). Dále je také výhodné, pokud se roztok lipidové směsi přidává do roztoku vody, chloridu sodného a glycerinu. Rovněž je také výhodné, pokud se do roztoku lipidové směsi přidává roztok vody, chloridu sodného, glycerinu, a propylenglykolu.

Je výhodné, pokud je ve složení přítomno 6,8 mg NaCl na ml prostředku. Přednostně je přítomno 0,lml glycerinu na mililitr. Přednost se dává finální koncentraci 0,1 ml propylenglykolu na mililitr formulace. Finální pH formulace • · · · · · » · · • · • · · · je přednostně asi 5,5 - 7,0. Lipidová směs je přednostně přítomna v množství 0,75 - 1,0 mg/ml složení.

Teplota vodného roztoku může být v rozmezí od teploty okolí do 70 °C. Přednostně je teplota asi 45 až 60 °C, s tím, že výhodnější je 50, 51, 52, 53, 54 nebo 55 °C. Aby se dosáhlo úplného rozpuštění, je potřeba směsí pohybovat, přednostně ji míchat. Rovněž je třeba upravit pH roztoku v závislosti na požadovaném výsledném složení. Pro tuto úpravu se může přidat buď kyselina (jako HCI) nebo zásada (jako NaOH).

Lipidová suspenze obsahuje kapalné částice různých velikostí. Jednou z výhod předloženého vynálezu je schopnost získávat konzistentně malé částice téměř jednotné velikosti. Proto je výhodné, že největší získané částice jsou menší než 100 nm v průměru, ještě výhodněji méně než 50 nm.

Výhodný postup rozpouštění lipidové směsi je následuj ící:

(a) Přidat vodu pro injekce (WFI-water for injection) do reakční nádoby.

(b) Zahájit míchání a zajistit teplotu od 50 do 55 °C.

(c ) Přidat chlorid sodný do reakční nádoby. Čekat, až je pevná látka zcela rozpuštěna, než se zahájí další krok.

(d) Přidat glycerin do reakční nádoby. Ponechat dostatečnou dobu pro úplné promísení.

(e) Přidat zbývající propylenglykol, který není v roztoku lipidové směsi/propylenglykolu. Ponechat dobu pro důkladné promísení.

(f) Snížit rychlost míchání aby se omezila turbulence v • · • fcfcfc fc · fc · fcfcfc fcfc • fcfc · · · • fcfcfc fcfc fcfc · reakční nádobě.

(g) Přidat roztok lipidové směsi/propylenglykolu do reakční nádoby.

(g) Opět upravit rychlost míchání na původní rychlost, (i) Pokračovat v míchání po přibližně 25 minut a zajistit úplné promísení.

(k) Ověřit a upravit roztok na cílové pH.

Krok (3):

Třetí krok zahrnuje ohřívání lipidové suspenze získané z kroku (2) na teplotu asi odpovídající nebo vyšší, než je nejvyšší teplota přechodu krystalické fáze z gelu na kapalinu u lipidů, přítomných v roztoku.

Jedním z úkolů tohoto kroku je poskytnout filtrovatelnou suspenzi. Roztok/suspenze je považována za schopnou filtrace, pokud nedochází k výraznému poklesu rychlosti toku v normálním procesu, a pokud nedochází k výraznému zvýšení tlaku ve filtračním systému.

Experimentální data dokládají, že lipidy v prostředku by měly být za svým fázovým přechodem z gelu na kapalinu, aby se zjednodušila sterilní filtrace. Pokud jsou lipidy pod teplotou fázového přechodu, jsou částice suspenze pevné. Avšak pokud jsou nad jejich, resp. nad teplotami fázového přechodu gel-kapalný krystal, jsou v mnohem uvolněněji organizovaném uspořádání a jsou tedy mnohem snadněji filtrovatelné.

DPPC a DPPA vykazují fázové přechody 41 °C, resp. 67 °C.

MPEG5000-DPPE je rozpustný ve vodě, tedy nevykazuje fázový přechod gel-kapalina, který je charakteristický pro většinu • · ft · · • · · · hydratovaných lipidových suspenzí. Jelikož lipidy ve výhodném složení vykazují všechny rozdílné přechody z gelu na kapalnou fázi, je nejvyšší teplota fázového přechodu, 67 °C, přednostně používána k filtrování roztoku. Udržováním teploty na nebo za 67 °C jsou všechny lipidy za svým respektive fázovým přechodem, a tím je zajištěno volnější uspořádání při průchodu přes filtry.

Zahřívání může být zajištěno oplášťováním reakční nádoby tepelným spirálovým výměníkem. Teplá voda/ pára z regulovaného zdroje, jako je horkovodní lázeň nebo vodní ohřívač, by měly dodávat dostatečné teplo k udržení slučovacího roztoku na stanovené teplotě. Rovněž lze použít i další tepelné zdroje známé odborníkovi ze stavu techniky.

Krok (4) :

Čtvrtý krok se uskutečňuje filtrováním lipidové suspenze přes sterilizační filtr. Smyslem tohoto kroku je poskytnout suspenzi v podstatě prostou bakterií. Filtrát je považován za v podstatě prostý bakterií, pokud pravděpodobnost, že filtrát obsahuje alespoň jeden mikroorganismus tvořící kolonie, je menší než 10 ~⁶.

Filtrace se přednostně provádí použitím sterilizačníních filtračních náplní. Rovněž tedy může být vyžadován prostředek pro protlačení roztoku přes filtr (např. pro čerpání nebo tlakový prostředek). Jelikož roztok, který má být filtrován, vyžaduje udržování při teplotě, nebo nad nejvyšší teplotou přechodu gelu na kapalnou krystalickou fázi lipidů, přítomných v roztoku, měla by být filtrace uskutečňována při asi té samé teplotě. K dosažení tohoto * · a·»· · « účinnosti při dvou filtrů.

požadavku je filtr (tedy sterilizační filtrové výplně) přednostně uzavřen v oplášťovaných filtračních pouzdrech, která jsou kontinuálně ohřívána, např. proudem horké vody z vodní lázně z regulovanou teplotou, aby se zajistilo, že suspenze je nad teplotou fázového přechodu lipidů. Teplota sterilizačního filtru je přednostně od 50 do 100 °C, výhodněji od 60 do 90 °C, a dokonce ještě výhodněji 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 nebo 80 °C.

Pro filtraci suspenze může být použit jeden nebo více sterilizačních filtrů. Potřebný počet závisí na jejich odstraňování bakterií. Výhodné je použití Velikost pórů ve filtru je omezena potřebou získat suspenzi prostou bakterií. Přednostně jsou použity 0,2 pm hydrofilní filtry.

Objemný roztok s výhodným složením byl kontinuálně filtrován přes dva 0,2 pm hydrofilní filtry po dobu do 3 hodin rychlostí přibližně jeden litr za minutu (1 1/min), tedy průchod filtry celkově 180 litrů roztoku suspenze. Experimentální výsledky ukazují, že není zjevné zablokování filtrů. Testy na lipidy indikují, že ztráty v průběhu filtrace nejsou měřitelné (s ohledem na akumulaci filtračního media).

Objemný roztok výhodného složení byl sloučen při 40 °C až 80 °C, a suspenze byla ochlazena na teplotu okolí před sterilní filtrací. Nebylo pozorováno žádné zjevné zahlcování filtrů, což indikuje, že distribuce velikosti částic suspenze je pod velikostí pórů filtru 0,2pm. Je výhodné použít ohřevu v průběhu filtrace, aby se zajistilo

4 4 4 » · «

4 44 maximální uchování lipidové směsi v sterilním filtrátu (tedy aby se minimalizovalo možné zadržování lipidových částic ve filtračním mediu).

Výhodný postup filtrace lipidové suspenze je následující:

(a) Zajistit, aby všechny oplášťované filtry byly při

70-80°C.

(b) Zajistit, aby byly všechny ventily ve filtrační jednotce uzavřeny.

(c ) Napojit vstup filtrace hadicí na na výstup z reakční nádoby.

(d) Otevřít ventily, aby se umožnil průchod roztoku přes filtry.

(e) Nalít tři litry roztoku přes filtry před sloučením filtrátu.

(f) Pokračovat ve filtraci až do konce.

Krok (5):

Uložení filtrovaného roztoku do lahviček zakončuje pátý krok. Přednostně se tento krok uskutečňuje v regulovaném aseptickém prostředí. Odborník z dané oblasti techniky ví, že výběr lahviček a množství suspenze, které se naplní do lahviček, závisí na konečném užití, které se pro lipidovou suspenzi předpokládá. Dávkování se může provádět řadou metod, včetně plnění pipetou, ruční dávkovači stříkačkou (např. Filamatic® vstřikovací dávkovači zařízení) , nebo průmyslové auto-dávkovací zařízení (jako Cozzoli nebo TL auto-plnící zařízení).

• · ·

• · · · •··· »· ·*

Krok (6):

Krok šest se provádí výměnou plynu v horní části lahviček z pátého kroku perfluoruhlovodíkovým plynem. Výhodným postupem výměny je vložení nadávkované lahvičky do lyofilizační komory a nahrazení horního prostoru plynu perfluoruhlovodíkovým plynem. Výhodným plynem je perfluorpropan (PFP). Mohou být použity i jiné metody výměny plynu v horním prostoru lahviček, známé odborníkovi ze stavu techniky.

Lahvičky jsou utěsněny po ukončení cyklu výměny plynu v horním prostoru lahvičky. Když je tlak lyofilizační komory navrácen zpět na atmosferický tlak, naplní se komora PFP. Uzávěry lahviček jsou uzavřeny a lahvičky utěsněny.

Krok (7):

Sedmý krok zahrnuje konečnou sterilizaci lahviček po šestém kroku. Jeden postup závěrečné sterilizace je použitím autoklávu. Utěsněné lahvičky ale také mohou být na závěr sterilizovány v parním sterilizátoru a tím se dále zvýší zajištění sterility produktu. Je třeba dbát opatrnosti při postupu sterilizace, neboť lze očekávat určitou degradaci lipidů jako výsledek působení autoklávu. Výhodně jsou lahvičky sterilizovány při asi 126-130 °C po 1 až 10 minut.

Další znaky vynálezu budou zřejmé z následujícího popisu příkladných provedení, která jsou uvedena pro ilustraci vynálezu a nemají být považována za omezující vynález.

f • · • · » ♦ » 9 · ♦ 9 · · · · · · ·· · « * · · · 9 * · · • · 9 9 9 9 » 9 · 9 • •••99 9 9 · ·· 99

Příklady provedení vynálezu:

Tabulka 1: Cílové složení lipidové směsi

Název Běžný název % hmotn. % mol.

lipidu

DPPA	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidová kyselina, monosodná sůl	6, 0	10
DPPC	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholin	53,5	82
MPEG5000 DPPE	N-(methoxypolyethylenglykol 5000 karbamoyl)-1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylethanolamin, monosodná sůl	40,5	8

Postup výroby lipidové směsi

Baňka je naplněna toluenem (3,3 1), methanolem (1,2 1),

DPPA (59,6 g), DPPC (535 g), a MPEG5000 DPPE (405 g).

fc · fcfcfc fcfc fc fcfcfcfc ♦ fcfcfc fc* ♦ fcfcfcfc fcfc fcfcfc fcfc fcfc fcfc · fcfcfc fcfcfc fcfcfcfc fcfcfcfcfc· fc* · fc* fcfc

Po opláchnutí pevných styčných ploch 0,9 1 methanolu byla suspenze zahřáta na 45-55 °C, až byla disoluce ukončena.

Roztok byl filtrován a koncentrován ve vakuu při 35-45 °C na hustý gel. Přidá se methyl-terc.butylether (MTBE, 5,4 1) a směs je suspendována při 15-30 °C. Bílé pevné látky jsou spojeny odstředěním nebo vakuovou filtrací a promyty MTBE (0,9 1). Potom jsou pevné látky vloženy do vakuové pece a sušeny do konstantní hmotnosti při 40-50 °C. Usušená lipidová směs je přenesena do nádoby a uskladněna při 15-25 °C.

V jiném provedení postupu výroby lipidové směsi podle vynálezu může být použit následující postup:

Velikost vsádky (spojená hmotnost fosfolipidů) v tomto experimentu byla 2 kg.

• ·· • 1

Rotační odpařovací baňka je naplněna postupně toluenem (3 300 ml), methanolem (1 200 ml), DPPA (122,9g; přepočítáno na čistotu „use as 97,0%), DPPC (1 098,5 g celkově; 500,8 g z celku s' 96,7% „use as čistotou a 597,7 g z celku s 96,7% „use as čistotou), a MPEG5000 (815,7 g; přepočteno na čistotu „use as 99,3%). Po opláchnutí zbytků pevných látek do baňky methanolem (900 ml) se baňka vloží do rotační odparky (bez vakua) a suspenze se ohřeje na 45 a 55 °C (vnější). Po dokončení rozpouštění se vnější teplota sníží na teplotu mezi 35 a 45 °C, použije se vakuum a roztok se koncentruje na bílou polopevnou látku. Baňka je odebrána z odparky a pevné látky se rozdrobí pomocí špachtle. Baňka se znovu vrátí do odparky a koncentrování pokračuje. Po dosažení koncového bodu (výsledný tlak vakua ² 20 mbar;

bílá, granulová, hutná pevná látka), MTBE (5400 ml) se přidá přes přívodní trubičku rotační odparky, vakuum se přeruší a směs se suspenduje po 15 až 40 min při 15 až 30 °C. Pevné látky jsou izolovány buď odstředěním nebo vakuovou filtrací, promyty MTBE (3800 ml) a suší se do konstantní hmotnosti ve vakuové peci (40 až 50 °C). Před přenesením do polyethylenových lahví s polypropylenovými zátkami jsou pevné látky rozmělněny přes síto (0,079 palců mesh) za získání 1966, 7 g (98% ) lipidové směsi (SG896) jako bílé pevné látky.

Výhodná lipidová směs obsahuje:

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfotidovou, monosodnou sůl (DPPA);

• ftft ftft ftftftft · · ft · • · ft · • ft ♦ ftft • ftft ftft ft · · ftft ftftftft »1 ftft

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholin (DPPC);

N-(methoxypolyethylenglykol 5000 karbamoyl)-l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin, monosodnou sůl (MPEG5000-DPPE);

propylenglykol, USP;

glycerin, USP;

chlorid sodný, USP; a

Injekční vodu, USP.

Tabulka 2: Výhodné složení, kontrastního činidla

Složka	A*	B*
NaCl, USP	6, 8 mg/ml	6,8 mg/ml
glycerin, USP	0,1 ml/ml	0,1 ml/ml
Propylenglykol, USP	0,1 ml/ml	0,1 ml/ml
Lipidová směs **	1 mg/ml	0,75 mg/ml
perfluorpropan	> 65 %	> 65%
pH	6,0 - 7,0	6,0 - 7,0

Složení A má lmg/ml lipidové směsi. Složení B má koncentraci lipidové směsi 0,75 mg/ml.

Lipidová směs sestává z 53,5 % hmotn. DPPC, 6,0 % hmotn. DPPA a 40,5 % hmotn. MPEG5000-DPPE.

i ftft ftft ♦ ♦ 1 r ftft 1 • ft • · • · ·· • · · ·· ·

Tabulka 3: Výhodný kontejner(zásobník) a uzávěr

Část	Typ
Lahvička	Wheaton 2802, B33BA, 2cc, 13 mm, Typ I, křeměnná trubkovitá lahvička
Zátka	West V50 4416/50, 13 mm, šedé butyl lyo, silikonové zátky
Uzávěr	West 3766, bílé 13mm, hliníkové odklápěcí uzávěry

Objem plněného finálního produktu může být od 1,0 do 2,0 ml/lahvičku.

Při přípravě výhodných složení, kdy je lipidová směs přímo hydratována s vodným roztokem matrice obsahujícím injekční vodu, chlorid sodný, glycerin a propylenglykol, mají filtráty méně lipidů ve srovnání s objemným roztokem před filtrací. Ztáta lipidů se pohybuje v rozmezí od 12 % do 48 %. Tyto výsledky dokládají, že postup sterilní filtrace není efektivně regulován, a tedy je obsah lipidů ve finálním produktu velice proměnlivý.

Naproti tomu při použití zde popsaného postupu ukazují výsledky testů lipidů úplný výtěžek lipidů v průběhu filtračního postupu. Proměnlivost výsledků testů kolem teoretických hodnot je v rámci normálních testovacích metod proměnlivosti. Distribuce velikosti částic číselně, objemově a reflektivní intenzitou suspenze připravené první solubilizovanou lipidovou směsí v propylenglykolu indikuje, že většina částic je menší než 50 nm v objemovém roztoku před • · ··φ* > φφ * φ φ φφφ φφ φφ • * ⁹ I φ φ φ 9 φ·φ· φφ filtrací při 55 °C stejně jako 70 °C. Profil distribuce částic se po filtraci nemění.

Průmyslová využitelnost

Zde nárokovaný postup je vhodný pro přípravu ultrazvukových kontrastních látek. Tyto látky jsou vhodné pro řadu zobrazujících aplikací, včetně zvyšování kontrastů v echokardiografických a zobrazeních.

Samozřejmě je v rámci radiologických ultrazvukových předloženého vynálezu možná modifikací a variací. Je zřejmé, že v rozsahu připojených patentových nároků může být vynález uskutečňován i jinak, než je zde konkrétně popsáno.

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

9 9 *0

9 0 9 9 • · 0 ·

1. Způsob přípravy fosfolipidové suspenze vyznačující se tím, že zahrnuje:

(1) uvedení do kontaktu lipidové směsi s nevodným rozpouštědlem, přičemž se lipidová směs v podstatě rozpustí v nevodném rozpouštědle; a
2) uvedení do kontaktu roztoku z kroku (1) s vodným roztokem za vzniku lipidové suspenze.

2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že se nevodné rozpouštědlo vybere z propylenglykolu, ethylenglykolu a polyethylenglykolu 300.

3. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že nevodným rozpouštědlem je propylenglykol.

4. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že lipidová směs obsahuje:

(a) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholin;

(b) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfotidovou, monosodnou sůl; a (c ) N-(methoxypolyethylenglykol 5000 karbamoyl)-1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin, monosodnou sůl.

5. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že se nevodné rozpouštědlo zahřívá na teplotu asi 30 až 70 °C předtím, než se uvede do kontaktu s lipidovou směsí.

00 00

0 0 0 0 *00 ·

00 00

0 0 0

0 0 00

6. Způsob podle nároku 5 vyznačující se tím, že se nevodné rozpuštědlo zahřívá na teplotu asi 50 až asi 55 °C před tím, než se uvede do kontaktu s lipidovou směsí.

00 0000

0 0 0 •000 00

0 0 0 0 00 00

7. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že poměr lipidové směsi k nevodnému rozpouštědlu od asi 5 mg lipidové směsi na mililitr nevodného rozpouštědla do asi 15 mg/ml.

8. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že poměr lipidové směsi k nevodnému rozpouštědlu asi 10 mg/ml.

9. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že v kroku (2) se vodný roztok vybere z vody, solného roztoku, směsi solného roztoku/glycerinu, a směsi solného roztoku/ glycerinu/nevodného rozpouštědla.

10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že vodným roztokem je směs solného roztoku a glycerinu.

11. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že vodným roztokem je směs solného roztoku, glycerinu a propylenglykolu.

12. Způsob podle nároku 11 vyznačující se tím, že je přítomno 6,8 mg/ml chloridu sodného; 0,1 ml/ml glycerinu; 0,1 ml/ml propylenglykolu; a asi 0,75 až 1,0 mg/ml lipidové směsi.

13. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že je

44 44

4 4 4 4 4

4 4 4 4 4

4 9 4 4 4 4

4 4 4 4 4

9 44 94

44 44 • · · · ·

4444 4 4

4 4 4 4 4

4444 44 44

4» 4944 přítomno 0,75 mg/ml lipidové směsi.

14. Způsob podle nároku 12 vyznačující se tím, že je přítomno 1,0 mg/ml lipidové směsi.

15. Způsob podle nároku 2 vyznačující se tím, že v kroku (2) se vodný roztok zahřívá na teplotu asi 45 až 60 °C před uvedením do kontaktu s roztokem z kroku (1).

16. Způsob podle nároku 15 vyznačující se tím, že se vodný roztok zahřívá na teplotu asi 50 až 55 °C před uvedením do kontaktu s roztokem z kroku (1).

17. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že způsob dále zahrnuje:
(3) zahřívání lipidové suspenze z kroku (2) na teplotu asi shodnou s nebo vyšší než je nejvyšší teplota přechodu krystalické fáze z gelu na kapalinu u lipidů, přítomných v suspenzi.

18. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že v kroku (3) se lipidová suspenze zahřívá na teplotu alespoň asi 67 °C.

19. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že postup dále obsahuje:
(4) filtrování lipidové suspenze přes sterilizační filtr.

20. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že v kroku (4) • ·

44 4444

4 4 4 4 4 4 4 4 4 «

4 4 44 · 4 4 4 4 · *

44 444 44 44 4 4 4

4 44 «44 4 444

444444 44 4 44 44 se provádí filtrace s použitím dvou sterilizačních filtračních náplní.

21. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že v kroku (4) jsou sterilizační filtrační náplně při teplotě od asi 70 do 80 °C.

22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že v kroku (4) se použijí 0,2 pm hydrofilní filtry.

23. Způsob podle nároku 19 vyznačující se tím, že postup dále zahrnuje:
(5) dávkování filtrovaného roztoku z kroku (4) do lahvičky.

24. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tim, že postup dále zahrnuje:
(6) výměnu plynu v horním prostoru lahvičky z kroku (5) plynným perfluoruhlovodíkem.

25. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že plynným perfluoruhlovodíkem je perfluorpropan.

26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tim, že výměna plynu v horním prostoru se provádí použitím lyofilizační komory.

27. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že postup dále zahrnuje:
(7) sterilizaci lahvičky z kroku (6).

9* 99 99 9999 99 99

9 99 99 9 9999

9999 9 9 9 «99»

99 999 99 ·9 99 9

9 99 999 9999

9999 99 99 9 99 99

28. Způsob podle nároku 27 vyznačující se tím, že v kroku (7) se lahvička sterilizuje při asi 126 až 130 °C po 1 až 10 minut.

29. Způsob přípravy lipidové směsi vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) uvedení do kontaktu alespoň dvou lipidů s prvním nevodným rozpouštědlem;

(b) koncentrování roztoku na hustý gel;

(c) uvedení do kontaktu hustého gelu s druhým nevodným rozpouštědlem; a (d) spojení získaných pevných látek.

30. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že v kroku (a) jsou lipidy:

(i) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholin;

(ii) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfotidová, monosodná sůl; a (iii ) N-(methoxypolyethylenglykol 5000 karbamoyl)-1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin, monosodná sůl.

31. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že v kroku (a) je prvním nevodným rozpouštědlem směs methanolu a toluenu.

32. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že v kroku (c ) je druhým nevodným rozpouštědlem methyl-terc.butylether.

» 0 • * •0 ·»*·

0« 0«

0 0 0 0 0 0 · • · 00 · · » ·

00 000 00 00 00 0 0 0 0 «00 0000

00 0 0 00 00 0 0 0 00

33. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že v kroku (a) se roztok zahřívá na teplotu postačující k úplnému rozpuštění lipidů v rozpouštědle.

34. Způsob podle nároku 33 vyznačující sé tím, že v kroku (a) se roztok ohřívá na asi 25 až 75 °C.

35. Způsob podle nároku 30 vyznačující se tím, že v kroku (d) se shromážděné pevné látky promyjí methyl-terc.butyletherem a suší ve vakuu.

36. Fosfolipidová suspenze vyznačující se tím, že obsahuj e:

(a) lipidovou směs v množství asi 0,75-1,0 mg/ml suspenze;

(b) chlorid sodný v množství asi 6,8 mg/ml suspenze;

(c ) glycerin v množství asi 0,1 ml/ml suspenze;

(d) propylenglykol v množství asi 0,1 ml/ml suspenze; a (e) vodu;

přičemž suspenze se připraví postupem zahrnujícím:

(1) uvedení do kontaktu lipidové směsi s nevodným rozpouštědlem, přičemž lipidová směs se v podstatě rozpustí v nevodném rozpouštědle;

(2) uvedení do kontaktu roztoku z kroku (1) s vodným roztokem za vzniku lipidové suspenze;

(3) zahřívání lipidové suspenze z kroku (2) na teplotu asi stejnou nebo vyšší, než je nejvyšší teplota přechodu krystalické fáze z gelu na kapalinu u lipidů přítomných v suspenzi; a • ti titititi • ti • ti ·· ti titi titititi • ti • tititi titi • ti ti • titi • titi • ti ti ti titi ti • titi ti • titi ti • titi · titi titi (4) filtrování lipidové suspenze přes sterilizační filtr.

37. Fosfolipidové suspenze podle nároku 36 vyznačující se tím, že lipidová směs obsahuje:

(a) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfatidylcholin;

(b) 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfotidovou, monosodnou sůl; a (c ) N- (methoxypolyethylenglykol 5000 karbamoyl)-1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamin, monosodnou sůl.

38. Fosfolipidové suspenze podle nároku 37 vyznačující se tím, že se nevodné rozpouštědlo zahřívá na teplotu asi 50 až 55 °C před uvedením do kontaktu s lipidovou směsí.

39. Fosfolipidové suspenze podle nároku 37 vyznačující se tím, že poměr lipidové směsi k nevodnému rozpouštědlu je asi 10 mg/ml. 40. Fosfolipidové suspenze podle nároku 37 vyznačující se

tím, že vodným roztokem je směs solného roztoku, glycerinu a propylenglykolu.

41. Fosfolipidové suspenze podle nároku 40 vyznačující se tím, že je přítomno 0,75 mg/ml lipidové směsi.

42. Fosfolipidové suspenze podle nároku 37 vyznačující se tím, že se zahřívá vodný roztok na teplotu asi 50 až 55 °C před uvedením do kontaktu s roztokem z kroku (1).

··» φ

φ φφ φφ • φ φ φ φφ* •Φ φφφφ • φ · φφφ φφ φφφ φφφφ φφ φφφ φφ φ φ φ φ « φφ φφ

43. Fosfolipidová suspenze podle nároku 37 vyznačující se tím, že v kroku (3) se lipidová suspenze zahřívá na teplotu alespoň asi 67 °C.

44. Fosfolipidová suspenze podle nároku 43 vyznačující se tím, že v kroku (4) se použijí dva 0,2 pm hydrofilní filtry.