CZ182399A3 - Enzymatický způsob přípravy 7ß-(4-karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny pomocí modifikované oxidázy D-aminokyselin z Trigonopsis variabilis produkované v Escherichia coli - Google Patents
Enzymatický způsob přípravy 7ß-(4-karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny pomocí modifikované oxidázy D-aminokyselin z Trigonopsis variabilis produkované v Escherichia coli Download PDFInfo
- Publication number
- CZ182399A3 CZ182399A3 CZ991823A CZ182399A CZ182399A3 CZ 182399 A3 CZ182399 A3 CZ 182399A3 CZ 991823 A CZ991823 A CZ 991823A CZ 182399 A CZ182399 A CZ 182399A CZ 182399 A3 CZ182399 A3 CZ 182399A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- leo
- gene
- ser
- glee
- enzyme
- Prior art date
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 34
- 241001480015 Trigonopsis variabilis Species 0.000 title claims abstract description 23
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 title claims abstract description 5
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 title claims abstract description 5
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 title claims 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 12
- -1 4-carboxybutanamido Chemical group 0.000 title 1
- YGBFLZPYDUKSPT-MRVPVSSYSA-N cephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)C[C@H]21 YGBFLZPYDUKSPT-MRVPVSSYSA-N 0.000 title 1
- 108010003989 D-amino-acid oxidase Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 35
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 102000004674 D-amino-acid oxidase Human genes 0.000 claims abstract 10
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 58
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 16
- IXUSDMGLUJZNFO-BXUZGUMPSA-N (7R)-7-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCCC(O)=O)[C@@H]12 IXUSDMGLUJZNFO-BXUZGUMPSA-N 0.000 claims description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N cephalosporin C Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 6
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 claims description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 claims 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 abstract description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 abstract description 9
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 5
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 abstract 1
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 abstract 1
- 101150046567 DAO gene Proteins 0.000 description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 25
- 102100026908 D-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 24
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 241000282322 Panthera Species 0.000 description 19
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 7
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 5
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 4
- SIFXMYAHXJGAFC-WDSKDSINSA-N Arg-Asp Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O SIFXMYAHXJGAFC-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 4
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N Met-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WEDDFMCSUNNZJR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 4
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 4
- GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N Thr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXDLGHLJTHMDII-WISUUJSJSA-N 0.000 description 4
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 3
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N Thr-Arg Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N HYLXOQURIOCKIH-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 3
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HKRXJBBCQBAGIM-FXQIFTODSA-N Arg-Asp-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)CN=C(N)N HKRXJBBCQBAGIM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FRBAHXABMQXSJQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N Asp-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N PSZNHSNIGMJYOZ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 2
- FAEIQWHBRBWUBN-FXQIFTODSA-N Asp-Arg-Ser Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)CN=C(N)N FAEIQWHBRBWUBN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DWBZEJHQQIURML-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 2
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 2
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 2
- XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N Dimethoxyethane Chemical compound COCCOC XTHFKEDIFFGKHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 2
- NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N His-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 NIKBMHGRNAPJFW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- VIJMRAIWYWRXSR-CIUDSAMLSA-N His-Ser-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 VIJMRAIWYWRXSR-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- WRPDZHJNLYNFFT-GEVIPFJHSA-N His-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N)O WRPDZHJNLYNFFT-GEVIPFJHSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- KSIPKXNIQOWMIC-RCWTZXSCSA-N Met-Thr-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N KSIPKXNIQOWMIC-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 2
- VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N Ser-Asp Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O VBKBDLMWICBSCY-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N Ser-Ser-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PYTKULIABVRXSC-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- NQVDGKYAUHTCME-QTKMDUPCSA-N Thr-His-Arg Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N)O NQVDGKYAUHTCME-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 2
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 2
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 2
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- VTESCYNPUGSWKG-UHFFFAOYSA-N (4-tert-butylphenyl)hydrazine;hydrochloride Chemical compound [Cl-].CC(C)(C)C1=CC=C(N[NH3+])C=C1 VTESCYNPUGSWKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 7beta-aminocephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 0.000 description 1
- 102100039160 Amiloride-sensitive amine oxidase [copper-containing] Human genes 0.000 description 1
- KSUALAGYYLQSHJ-RCWTZXSCSA-N Arg-Met-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KSUALAGYYLQSHJ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N Arg-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N IJYZHIOOBGIINM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- LFAUVOXPCGJKTB-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N LFAUVOXPCGJKTB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 101710110830 Beta-agarase Proteins 0.000 description 1
- 101100398835 Caenorhabditis elegans leo-1 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N D-alpha-phenylglycine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N Epichlorohydrin Chemical compound ClCC1CO1 BRLQWZUYTZBJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000702192 Escherichia virus P2 Species 0.000 description 1
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000427940 Fusarium solani Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- OZBDSFBWIDPVDA-BZSNNMDCSA-N His-His-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)N OZBDSFBWIDPVDA-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N His-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 KRBMQYPTDYSENE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 102100030483 Histatin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102100021628 Histatin-3 Human genes 0.000 description 1
- 101100491236 Homo sapiens AOC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001082500 Homo sapiens Histatin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000898505 Homo sapiens Histatin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101001021281 Homo sapiens Protein HEXIM1 Proteins 0.000 description 1
- 101000889523 Homo sapiens Retina-specific copper amine oxidase Proteins 0.000 description 1
- JSZMKEYEVLDPDO-ACZMJKKPSA-N Ile-Cys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O JSZMKEYEVLDPDO-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 1
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 1
- QAHFGYLFLVGBNW-DCAQKATOSA-N Met-Ala-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN QAHFGYLFLVGBNW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- HDNOQCZWJGGHSS-VEVYYDQMSA-N Met-Asn-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HDNOQCZWJGGHSS-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- RXWPLVRJQNWXRQ-IHRRRGAJSA-N Met-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(O)=O)C1=CNC=N1 RXWPLVRJQNWXRQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N Phosgene Chemical compound ClC(Cl)=O YGYAWVDWMABLBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100039141 Retina-specific copper amine oxidase Human genes 0.000 description 1
- 241000221523 Rhodotorula toruloides Species 0.000 description 1
- FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N Ser-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N Ser-His Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 YZMPDHTZJJCGEI-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- AABIBDJHSKIMJK-FXQIFTODSA-N Ser-Ser-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O AABIBDJHSKIMJK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N Ser-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO LDEBVRIURYMKQS-WISUUJSJSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005422 blasting Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 101150077852 dao1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- HAXVIVNBOQIMTE-UHFFFAOYSA-L disodium;2-(carboxylatomethylamino)acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CNCC([O-])=O HAXVIVNBOQIMTE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010045673 endodeoxyribonuclease XBAI Proteins 0.000 description 1
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000005226 mechanical processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006880 nzcym-medium Substances 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
- C12N9/0024—D-Amino acid oxidase (1.4.3.3)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
- C12P35/06—Cephalosporin C; Derivatives thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Enzymatický způsob přípravy 7β-(4-karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny pomocí modifikované oxidázy Daminokyselin z Trigonopsis variabilis produkované v
Escherichia coli
Oblast vynálezu
Vynález popisuje enzymatický způsob přípravy 7β-(4karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny. Podrobněji řečeno vynález popisuje způsob izolace genu kódujícího enzym s oxidázovou aktivitou na D-aminokyseliny pomocí technik rekombinantní DNA, klonování uvedeného genu do mikroorganismu rodu Escherichia, modifikaci uvedeného enzymu pomocí způsobů proteinového inženýrství, hyperprodukci tohoto upraveného enzymu kultivací uvedených mikroorganismů a extrakci upraveného enzymu pro přípravu 7β-(4-karboxybutanamiido) cefalosporanové kyseliny. Tato kyselina je meziproduktem pro přípravu 7-aminocefalosporanové kyseliny, která slouží dále jako meziprodukt pro přípravu široké škály antibakteriláních látek z rodiny cefalosporinů.
Dosavadní stav techniky .
7β-(4-karboxybutanamido)cefalosporanová kyselina je rovněž nazývána kyselina glutaryl-7-aminocefalosporanová a z tohoto důvodu je v dalším textu zkracována jako GL-7ACA. Pro produkci 7β-(4-karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny z cefalosporinů C se používá oxidáza D-aminokyselin (dále zkracovaná jako DAOj z různých mikroorganismů jako například z Trigonopsis variabilis (Biochem. Biophys. Res. Commun. (1993) 31; strana 709), Rhodotorula gracilis (J. Biol. Chem. (1994) 269; strana 17809) a Fusarium solani (J. Biochem. (1990) 108: strana 1063). Produkce DAO pomocí těchto mikroorganismů má mnohé nevýhody. Zaprvé úroveň vykazované DAO aktivity je velmi nízká, a zadruhé tyto •9 99··
-29099 · • 9 • 900 «
► 91
999
00 » 9 9 9 » 0 0 9
009 009 organismy vykazují spolu s uvedeným enzymem další nežádoucí enzymatické aktivity jako například esterázovou a katalázovou. První jmenované nežádoucí enzymatická aktivita rozkládá kyselinu GL-7ACA, čímž dochází ke snížení výnosu a tím i zvýšení nákladů na purifikaci produktu. Druhá jmenovaná enzymatická aktivita odbourává peroxid vodíku, který je nutný pro katalýzu. Je tudíž nezbytné do fermentační nádoby přidávat peroxid vodíku, čímž dochází k dalšímu zdražování produkce a současně to způsobuje ztráty v aktivitě enzymu, což znemožňuje jeho opakovaného použití.
Uvedenému enzymatickému znečištění se lze vyhnout se pouze purifikaci DAO aktivity, což však výrazně zvyšuje náklady a ztěžuje- enzymatický způsob získávání GL-7ACA z cefalosporinu C.
V poslední době byl popsán způsob izolace genu kódujícího DAO v T. variabilis a jeho exprese v E. coli a v T. variabilis (viz japonská patentová přihláška č. 71180/1988; Evropská patentová přihláška č.93202219.7, Kromě toho byl rovněž klonován a coli a A-Chremonium chrysogenum gen solani (viz japonská patentová publikace č. 0583817A2) exprimován v buňkách E. kódující DAO aktivitu z F.
přihláška č. 2000181/1990; 1063, Bio/Technology (1991)
J. Biochem. (1990) 108: strana
9: strana 188) a teprve nedávno
R.
byl klonován a exprimován E. coli gen kódující DAO z gracilis (viz španělský patent P9600906).
Se zřetelem k velkému průmyslovému významu, který má dostupnost přečištěné DAO aktivity pro produkci GL-7ACA, je cílem vynálezu produkce enzymu s DAO aktivitou, který by byl navíc snadno purifikovatelný. ' V této souvislosti je známo, že jeden z nejúčinnějších způsobů purifikace proteinů je afinitní . chromatografie (Sassenfeld, Η. M, (1990), Trends Biotechnol. 8: strana 88). Pro afinitní chromatografií je nutno najít vhodné chromatografické médium, které umožňuje • · 4 4 4 4 4 4 4 44 44 ···· 444 4444 • 4 4 4 4 4 4 4 44 4 • 444 4 44 444 444
4 4 4 4 4 4
4444 444 44 444 44 44 selektivní vazbu a/nebo eluci požadovaného proteinu. Uvedené médium musí obsahovat nějakou rozpoznávací molekulu nebo ligand ligand pro uvedený protein tak, aby interakce mezi proteinem a jeho ligandem byla dostatečně specifická a silná, aby umožnila selektivní eluci proteinu. Vývoj média pro afinitní chrornatografii není jednoduchý a proto nebyl dodnes popsán žádný způsob ' afinitní purifikace DAO enzymatické aktivity v jednom kroku.
Dále je známo, že některé postupy genového inženýrství dovolují modifikovat proteiny tak, že dojde ke zlepšení určitých vlastností, které pak usnadní purifikaci proteinu. Například byly vyvinuty různé systémy modifikace' struktury proteinu umožňující jeho afinitní purifikaci (viz Sii, D. a Sadana, (1991) J. Biotechnol. 19: strana 83; Narayanan, S.
J. (1990) Trends Biotechnol. 8: strana 12; (1991) Curr. Opinion Biotechnol. 2: strana Η. M. (1990) Trends Biotechnol. É
R. a Crane, L. Scouten, W. H. 37; Sassenfeld, strana
88). V podstatě tyto modifikace spočívají ve fúzi proteinu s polypeptidem, který specifickou interakcí s určitým chromatografickým médiem usnadňuje afinitní purifikaci tohoto fúzního proteinu. Jednou z těchto modifikací je například fúze požadovaného proteinu s polyhist.idinovou .sekvencí. Tuoto modifikací získává fúzní protein schopnost purifikace pomocí afinitní chromatografie na médiu, které obsahuje ionty dvojmocného kovu (Arnols,
Bio/Technology 9: strana 151; Bio/Technology 6: strana 1321).
Hochuli
F. H.
další,
:.1991(
1988' proteinu v principu se zlepšenými j ednoduché a
Ačkoli získání fúzního purifiakčními vlastnostmi je efektivní, hlavní nevýhoda této techniky spočívá ve skutečnosti, že modifikace primární struktury proteinu znamená změny, které mohou výrazným způsobem ovlivnit i jeho sekundární, terciální a kvartérní strukturu. Takové změny struktury mohou ovlivnit protein takovou měrou, že částečně «« ···· ··
-4nebo úplně ztratí funkčnost. Výsledkem je pak protein, který je nepoužitelný pro funkci, pro kterou byl navržen. Proto je získávání fuzních proteinů vždy spojeno se značnou měrou nejistoty, protože vlastnosti konečného produktu jsou velmi nepředvídatelné. Tato nejistota je o to větší, jde-li o první fúzní experiment, tj. v případě kdy není známý výsledek předchozí fúze. Právě v této .nejistotě konečného výsledku při získávání fúzního proteinu spočívá novost vynálezu, protože v současnosti nelze předpovídat s určitostí co bude výsledkem experimentu, při němž dojde k fúznímu spojení proteinů.
I.
Ve vědecké literatuře není popsán žádný způsob přípravy enzymu DAO z T. variabilis geneticky upraveného takovým způsobem, který by umožňoval jeho. purifikaci v jediném kroku, a rovněž umožňoval jeho hyperprodukci v aktivní formě buď v E. coli nebo v libovolném jiném mikroorganismu..
Podstata vynálezu
Výchozím bodem vynálezu je kvasinka T. variabilis ATCC 20931 jakožto zdroj deoxyribonukleové kyseliny (dále označované zkratkou DNA)· Z této' kvasinky byla získána genomová DNA, obsahující gen nesoucí -genetickou informaci související se syntézou DAO (v dalším textu označovaný též jako dáo-gen). Zmiňovaná DNA byla použita k vytvoření DNA knihovny v E. Analýza DNA hybridizačnimi coli za použití fágového vektoru k-GEM12. knihovny byla provedena standardními technikami. Jako sondy byly použity syntetické oligonukleotidy, navržené na základě oblastí podobnosti zjištěných mezi různými DAO. Tímto způsobem byly získány sady rekombinantních klonů E. coli, jež obsahovaly fragment DNA původem z T. variabilis, kódující dao-gen.
• ·
-5• ······ AA ·· • AAA A A · · • A A A A A · · A · • · · · * A A * A AAA
AAAA A A ·· AA AAA AA AA
Takto získaný fragment DNA byl nakloňován do plazmidového vektoru získaného· z kmene E. coli. Rekombinantní vektor byl použit pro získání sekvence fragmentu DNA obsahujícího daogen kvasinky T. variabilis (viz Sekvence id.č.: 1). Analýza zmiňované sekvence umožnila charakterizaci dao-genu, jenž sestává ze dvou exonů a jednoho intronu.
Jelikož součástí takto získaného fragmentu DNA, obsahujícího genomovou sekvenci dao-genu původem z T. variabilis, byl i jeden intron, nemohl být tento fragment DNA přímo použit pro expresi v E. coli. Byly proto podniknuty x kroky ke získání dao-genu neobsahujícího zmiňovaný intron. Za tím účelem byl dao-gen amplifikován pomocí PCR za užití dvou syntetických oligonukleotidů. První z nich byl navržen takovým způsobem, aby obsahoval následující prvky: vazebné místo pro ribozóm, iniciační mísLo translace, úplnou sekvenci prvního exonu a počáteční nukleotidy 5'-konce druhého exonu. Druhý oligonukleotid zahrnoval komplementární sekvenci 3'-konce odpovídající druhému exonu dao-genu včetně terminačního kodónu translace. Tyto syntetické oligonukleotidy obsahovaly též různá restrikční místa vhodná ke klonování fragmentů DNA. Tímto způsobem byl získám nový fragment DNA, který byl po izolaci nakloňován do plazmidového vektoru E. coli (viz obrázek 1) . S využitím vytvořených restrikčních míst byl fragment DNA, obsahující úplný dao-gen bez zmiňovaného intronu, dále klonován do různých plazmidových vektorů E. coli. Tyto plazmidové vektory obsahovaly promotory, umožňující' velmi silnou genovou expresi v hostitelské bakterii (hyperprodukci). Aktivita DAO produkované různými klony byla stanovena kolorimetrickými metodami a HPLC chromatografii.
• to • to to • ••to • toto ««toto ·· toto <· · · » · · · · • · · · · · ···· to · · · *· ··· ··· • · · to toto • toto ·· ·« to toto toto
Tak byly získány řekombinantní klony E. coli, produkující velké množství aktivního enzymu DAO.
Poté byl dao-gen modifikován připojením nukleotidové sekvence kódující polyhistidin. Za tím účelem byl plazmid obsahující dao-gen vystaven působení restrikčního enzymu, jenž štěpil v místě iniciačního kodónu translace, a štěpením vzniklé konce DNA byly zarovnány Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I z E. coli. Zarovnané konce byly poté spojeny za přítomnosti syntetického linkeru obsahujícího kodóny polyhistidinu. Tak byl vytvořen plazmid nesoucí modifikovaný dao-gen na 5'-konci své kódující oblasti (Sekvence id.č: 2). Takto vytvořený řekombinantní plazmid byl přenesen do kmene E. coli a selektován hybridizačními metodami za použití oligonukleotidů polyhistidinového linkeru jako sond. Vznik požadovaného fúzního genu byl ověřen sekvenováním modifikovaného dao-genu.
Produkce DAO modifikované polyhistidinovým řetězcem (v dalším textu označované jako hisDAO) byla poté zkoumána s využitím různých kmenů E. coli jakožto hostitelských buněk rekombinantních plazmidů. Tímto způsobem bylo ověřeno, že modifikovaný enzym hisDAO je aktivní.
Předem vyselektované řekombinantní klony E’. coli využité k produkci hisDAO se kultivují na médiu, obsahujícím zdroj uhlíku, zdroj dusíku a anorganické soli. Inkubační teplota by se měla pohybovat od 18°C do 37°C a pH musí být udržováno v rozmezí 5 až 9. Pro kultivaci v malém měřítku lze použít baňky různých objemů -. od 50 až do 1000 ml, přičemž množství kultivačního média by mělo činit 10% až 50% objemu baňky.. Doba kultivace může sahat od 12 do 90 hodin.
·· · «· ···· ·· ·· ·»·· ··· ««·· • · · · ··· 4 · « · * · · · · · · ··· ··· • · · · · · · ···· ««· ·· ··· ·· ·· . Výsledky produkce DAO prostřednictvím rekombinantních mikroorganismů mohou být ještě zlepšeny volbou kultivačních podmínek vhodných pro zachování stability rekombinantních vektorů. Toho je dosaženo přídavkem antibiotik, pro něž rekombinantni vektor s dao-genem obsahuje markér rezistence, jako např. ampicilin, chloramfenikol, kanamycin, tetracyklin apod. Kromě stabilizace produkce se tak předejde i možnému zamoření kultivačního média jinými nežádoucími mikroorganismy a navíc se tím eliminují ty kmeny, jež přestaly produkovat DAO v důsledku ztráty rekombinantního vektoru.
Rekombinantni . buňky produkující hisDAO byly od kultivačního média odděleny centrifugací a poté byly rozrušeny či permeabilizovány působením chemických, enzymatických či mechanických procesů. Pro získání enzymového extraktu o vyšší čistotě byla hisDAO přečištěna v jednom kroku za použití áfinitní chromatografie na koloně Co2+-IDA. Za tímto účelem byl hrubý enzymový extrakt nanesen na kolonu naplněnou Co2+-IDA pryskyřicí a znečišťující proteiny byly vymyty 20 mM fosfátovým pufrem o pH 7,0 obsahujícím 0,2 M NaCl. Enzym hisDAO byl pak eluován 10 mM roztokem imidazolu.
V případě, že se jako chromatografický sorbent použije Cu2+-IDA nebo Zn2+-IDA namísto Co^+-IDA, enzym hisDAO zůstane pevně navázán na nosič v aktivní formě a není možné jej eluovat ani vysokými koncentracemi imidazolu. Tak lze vhodným výběrem sorbentu po vymytí znečišťujících proteinů vytvořit imobilizovaný enzymový systém.
Za použití enzymu hisDAO získaného a přečištěného z rekombinantních klonů E. coli, jež exprimovaly příslušný chimérický gen, byla z cefalosporinu C získána GL-7ACA.
• ·
Dialvzované a koncentrované enzymové extrakty získané chromatografii na Co“+-IDA nosiči mohou být imobilizovány rovněž tak, že se nechají zreagovat s·jinými vhodnými inertními sorbenty, přičemž imobilizovanou hisDAO je možno používat opakovaně.
Novost vynálezu spočívá ve skutečnosti, že byl poprvé ukázán způsob exprese enzymu DAO z kvasinky T. variabilis modifikovaného hisDAO v prokaryotických orgamismech (jako je například E. coli) v aktivní formě a dále' způsob jeho izolace v jediném kroku pomocí afinitní chromatografie. Nadto bylo dosaženo přírůstku v produkci DAO. vzhledem ke množství získanému u T. variabilis, což usnadní použití tohoto enzymu v průmyslovém měřítku. Možnost produkce hisDAO v různých kmenech E. coli, jež nevytvářejí nežádoucí enzymy, jako například katalázu nebo různé esterázy, a též možnost zvyšování její stability a zlepšení katalytických vlastností, docílené dalšími modifikacemi za použití technik proteinového inženýrství, jsou dalšími aspekty umocňujícími novost tohoto vynálezu.
Vynález bude dále 'podrobně ilustrován na příkladech uvedených v dalším textu.
Příklad 1: Stanovení aktivity DAO
Stanovení aktivity DAO bylo provedeno postupem popsaným v literatuře (J. Biol. Chem. (1967) 242: strana 3957). Jako substrát byl použit 25 mM D-fenylglycin. Směs , byla inkubována v 50 mM fosfátovém pufru o pH 8,0 po dobu 15 až 30 minut, poté byla reakce zastavena přídavkem 1/10 objemu čisté kyseliny octové. Aktivita enzymu je dána změnou • · 0 0 0 0 • 0
0 0 0
0 0
-9absorbance při 252 nm. Benzoylmravenčí kyselina, jež při reakci vzniká, přitom vykazuje při vlnové délce 252 nm a množství 89,77 nmol absorbanci 1,0.
2. Příprava DNA vektorů a kompetetních buněk E. coli pro transformaci
Plazmidové vektory pBluescript I KS (+)' (Apr) (Stratagene) and pKK233.2 (Apr) (Pharmacia) byly připraveny alkalickou lýzou (viz Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Kmeny E. coli nesoucí zmiňované plazmidy inkubovány po dobu 16 hodin v 500 ml LB média s přídavkem ampicilinu (100 pg/ml) při 37°C za současného protřepávání na orbitální třepačce při 250 otáčkách/min. Tato plazmidová DNA byla přečištěna centrifugací na CsCl gradientu.
Kompetentní buňky E. coli TG1 a E. coli DH5a byly získány postupem využívajícím RbCl (viz Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA).
3. Příprava donorové DNA nesoucí genetickou informaci vztahující se, k biosyntéze DAO
Kmen T. variabilis (ATCC 20931) byl kultivován na médiu YPMG (0,3 % sladového výtažku, 0,3 % kvasničného výtažku, 0,5 % peptonu a 1 % glukózy) . Směs byla inkubována po dobu 3 6 hodin (OD66o = 5,0) při teplotě 30°C na orbitální třepačce při 250 min-1.
4·· ···
-10Buňky byly poté ponechány sedimentovat, promyty a rozrušeny, zymolyázou. Deoxyribonukleová kyselina byla extrahována způsobem popsaným v literatuře (Sherman a kol. (1986): Laboratory Course for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) . Za účelem dosažení vyšší čistoty byla DNA vystavena působení RNA-ázy, několikrát extrahována fenolem a směsí chloroformu s isoamylalkoholem (CIA) v poměru 24:1 a poté vysrážena isopropanolem. Vysr^žená DNA byla promyta nejprve 100% ethanolem, poté 70% ethanolem a nakonec byla rozpuštěna v 10 mM Tris-HCl pufru o pH = 7,5, obsahujícím 1 mM EDTA (dále pufr TE).
Příklad 2:
1. Vytvoření DNA knihovny kvasinky T. variabilis
Celková DNA T. variabilis kmene ATCC 20931 byla získána postupem popsaným ve třetí části příkladu 1. 300 pg ž celkové DNA bylo částečně rozštěpeno 20 jednotkami restrikčního enzymu .Sau3AI v reakčním objemu 600 μΐ při teplotě 37°C. Ze směsí byly odebrány tři vzorky po 200 μΐ, a to 45 s, 1 minutu a 2 minuty od zahájení reakce. Štěpení bylo zastaveno přidáním vychlazené 20mM EDTA. Výsledek štěpení byl ověřen elektroforézou na 0,7% agarózovém gelu. Vzorky byly poté spojeny a po dobu 10 minut zahřívány při teplotě 68°C. Směs byla ponechána zvolna vychladnout na pokojovou teplotu a následně navrstvena na 38 ml sacharózového gradientu o koncentraci 10 až 40 %. Gradient byl centrifugován při 26000 min'1 po dobu 24 hodin při teplotě 15°C. Směs byla poté rozdělena na vzorky o objemu 0,5 ml a 10 μΐ z každého vzorku bylo analyzováno na 0,4% • · · · • · • · · · · · • · ·· ··
-11agarózovém gelu. Vzorky, v nichž velikost fragmentů DNA dosahovala velikosti 18 až 22 kb, byly spojeny a zředěny destilovanou vodou tak, aby výsledná koncentrace sacharózy byla asi 10%. Poté, byla DNA vysrážena ethanolem a suspendována v 50 μΐ TE pufru, přičemž 3 μΐ roztoku byly analyzovány na 0,4% agarózovém gelu. Tim bylo ověřeno, že fragmenty- DNA dosahují požadované velikosti a že jejich koncentrace činí přibližně 50 ng/μΐ.'
Souběžně byla způsobem podle Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, s mírnýni úpravami připravena DNA bakteriofága. λ-ΘΕΜ12 (Promega). Za tím účelem byly pěstovány bakterie E. coli kmene NM538 po dobu 10 hodin na médiu NZCYM s přídavkem 0,2 % maltózy. Byla měřena optická denzita suspenze při 600 nm. Objem kultury odpovídající 3 χ 109 buněk byl 10 minut centrifugován rychlostí 4000 min-1 při 4°C na stolní centrifuze a následně byly buňky suspendovány v 1,2 ml SM - pufru. K těmto buňkám bylo přidáno 3 χ 10' PFU (plak formujících jednotek) fága λ-ΘΕΜ12 a směs byla bez protřepávání inkubována při 37°C po dobu 30 min. Do připravených 500 ml baněk obsahujících 100 ml NZCYM-0,2% maltózového média a temperovaných na 37°C bylo naočkováno po 200 μΐ suspenze infikovaných buněk. Baňky byly inkubovány při 37°C, dokud nedošlo k lýze kultivovaných buněk (po 5 až 6 hodinách). K lyzátu byla přidána DNA-áza (1 pg/ml) a RNA-áza (2 pg/ml) a enzymy byly ponechány působit 45 minut při pokojové teplotě. Poté bylo k.lyzátu přidáno 5,8 g NaCl na každých 100 ml objemu a směs byla ponechána 60 min. v ledové lázni. Po uplynutí uvedené doby byl lyzá,t filtrací zbaven buněčných zbytků a po přídavku 20 ml 50% PEG-6000 na 100 ml lyzátu byla směs chlazena 60 min v ledové • ·
-12lázni a následně odstřeďována po dobu 20 min při 10000 x g a 4°C. Precipitát byl poté suspendován v 1 ml TE - pufru a dvakrát extrahován CIA za účelem odstranění zbytků PEG-6O00, aniž by se přitom, porušil vlastní ,fág. Následovala dvojnásobná extrakce neutrálním fenolem, jednou směsí fenol - CIA a jednou samotným CIA. K vodné fázi bylo přidáno tolik 4M roztoku NaCl, až jeho koncentrace dosáhla -0,5 M, a DNA byla vysrážena dvojnásobným objemem ethanoiu při teplotě -20°C. Po 20 min odstřelování v minicentrifuze při 12000 min“1 a teplotě 4°C byla precipitovaná DNA promyta 70% ethanolem, vysušena a suspendována v 50 μΐ TE - pufru.
Padesát pg bakteriofágové DNA bylo po dobu 2 hodin štěpeno endonukleázami BamHI a Xbal při teplotě ' 37°C. Rozštěpená DNA byla extrahována směsí fenol - CIA a samotným CIA, vysrážena ethanolem a suspendována v 50 μΐ TE - pufru. Po odebrání 2 μΐ vzorku byl ke zbylé směsi přidáván MgCl2 až do dosažení 10 mM koncentrace a směs byla inkubována hodinu při 42°C, aby bylo podpořeno spojování kohezních konců vektoru do cyklické struktury. Znovu byly odebrány μΐ směsi, jež byly společně s dříve odebraným vzorkem analyzovány na 0,5% agarózovém gelu. Poté co byla ověřena recirkularizace vektoru spojením kohezních konců, byla směs navrstvena na 38 ml 10-ti až 40% sacharózového gradientu, v tomto- případě nebyla DNA před navrstvením na gradient zahřívána na 68°C, neboť by to vedlo k separaci kohezních konců. Gradient byl centrifugován při 26000 min“1 a 15°C. po dobu 24 hodin a následně byl beze zbytku rozdělen na frakce po 0,5 ml, přičemž z každé bylo 15 μΐ analyzováno na 0,5% agarózovém gelu. Ty frakce, jež neobsahovaly postradatelný centrální fragment (neboli vycpávku), byly spojeny a zředěny destilovanou vodou tak, aby koncentrace sacharózy • Β ·· ·· ♦ · · « • ·
Β
-13činila zhruba 10 %. Poté byla DNA vysrážena ethanolem a suspendována v 50 μΐ TE - pufru, přičemž 2 μΐ vzniklého roztoku byly použity pro elektroforézu na 0,5% agarózovém gelu, aby se ověřila nepřítomnost centrálního fragmentu a aby bylo možno' odhadnout přibližnou koncentraci DNA, jež činila asi 100 ng/μΐ.
Dále byla provedena série ligací za použití 0,25 pg inzertu a množství vektoru v rozmezí od 0,25 do 0,75 pg, tj. při proměnlivém poměru inzert/vektor. Reakční směsi byly inkubovány při teplotě 12 až 14°C po dobu 16 hodin. Poté, co bylo na 0,4% agarózovém gelu ověřeno, že ligační reakcí vznikly fragmenty DNA o větších rozměrech než byla velikost vektoru či inzertu, byly všechny reakční směsi spojeny, vysráženy ethanolem a suspendovány ve 4 μΐ ligačního pufru.
Pakážování rekombinantní fágové DNA, vzniklé předchozí ligační reakcí, bylo provedeno za pomoci in vitro sady pakážovacích extraktů Packagene (Promega). Produkt pakážovací reakce, suspendovaný v 500 μΐ SM - pufru, byl použit k infikování E. coii kmene NM538. Tato infekce posloužila k titraci množství vzniklých fágů. Dále byly infikovány buňky E. coii kmene NM539 (Promega) s cílem určit procentní zastoupení rekombinantních fágů. Bakterie E. coii kmene NM539 jsou lysogenní vzhledem .k fágu P2 a produkují lytické plaky pouze . pokud fág, jenž je napadl, nenese postradatelný centrální fragment. Vytvořená DNA - knihovna obsahovala asi 200 000 PFU a okolo 85% fágů neslo exogenní fragment DNA.
Po provedení těchto výpočtů byly infikovány E. coii NM539 a vzniklá úplná genetická knihovna byla kultivována na Petriho miskách o průměru 150 mm.
«* • · 0 · • 0 ·
-142. Identifikace klonů obsahujících dao-gen
Úplná DNA knihovna byla přenesena na nitrocelulózové filtry a proces výběru pozitivních fágů byl proveden v literatuře popsaným, hybridi začním postupem (Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA). Proces začal prehybridizací nitrocelulózových filtrů'. Ty byly· inkubovány po 3 hodiny při 42°C v hybridizačnim pufru. Hybridizace byla provedena po odstranění pufru použitého při' prehybridizaci, a to přidáním nového hybridizačního pufru spolu s 10 pmol oligonukleotidů OA (5'-TCTTGTCCTCGACACC-3') a OB (5'GACGTGGATTGTCAACTG-3'). Oligonukleotidy byly předtím standardním postupem (Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA) označeny na 5'- koncích izotopem 32P za použití T4 polynukleotid-kinázy a [γ-32Ρ]ΑΤΡ (ICN Biochemicals) . Filtry byly inkubovány 16 h při' 42°C, dvakrát promývány po dobu 20 minut při pokojové teplotě 2 X SSC-0,1% SDS pufrem a následně dvakrát 0,1 X SSC-0,1% SDS pufrem po dobu dalších 20 minut při hybridizační teplotě. Nakonec byly nitrocelulózové filtry exponovány s rentgenovým filmem Hyperfilm-MP (Amersham) mezi reflexními deskami. Expozice trvala 48 hodin a probíhala při -70°C.
Poté, co byl dokončen proces prehybridizace, hybridizace, promývání. a autoradiografie, bylo vybráno ' 63 klonů dávajících pozitivní signál s oligonukleotidovými sondami OA a OB. Pasteurovou pipetou bylo jednotlivě odebráno pouze devět pozitivních lytických plaků a každý z nich byl suspendován v 1 ml SM - pufru s přídavkem 50 μΐ chloroformu. Fágy přítomné v roztoku byly ztitrovány. Za tím účelem bylo třeba zmiňovaný roztok 5000-krát zředit, tak aby .
9 9 • 9 9
9 9' • · · ·« 99··
9 9 9 9·
-1520 μΐ tohoto roztoku po infekci dalo vniknout 500 až 1000 lytických plaků na jednu Petriho misku. Poté, co byl obsah každé Petriho misky přenesen na odpovídající nitrocelulózový filtr, bylo znovu přikročeno k hybridizaci s týmiž sondami OA a OB. Autoradiografii bylo zjištěno, že 20 až 50% fágů z každé Petriho misky dává pozitivní hybridizační signál. Proto bylo nutné přečistit každý z pozitivních.fágů v třetím hybridizačním cyklu. Za tím účelem byly Pasteurovou pipetou odebrány ty lytické plaky, jež byly znatelně izolovány od sousedních nebo byly obklopeny jinými rovněž pozitivními lytickými plaky. Následně byly suspendovány v 1 ml SM pufru s přídavkem 50 μΐ chloroformu. Po zředění takto připraveného fágového roztoku na stonásobný objem byly 15 μΐ alikvoty použity pro infekci bakteriální kultury. Titry fágového roztoku odpovídaly cca 300 lytickým plakům na Petriho misku. Zpracováním lytických plaků stejným postupem jako v předchozích dvou cyklech bylo dosaženo toho, že 100% fágů na každé Petriho misce bylo pozitivních. Takto bylo přečištěno 9 samostatných lytických plaků. Každý z nich byl suspendován ve 100 μΐ SM -' pufru s přídavkem 10 μΐ chloroformu. Ze 2 μΐ tohoto roztoku byly získány souvislé lytické plaky s cílem namnožit zmiňované pozitivní fágy na pevném nosiči. Povrchová vrstva agarózy byla odebrána a jejím suspendováním v 5 ' ml SM - pufru byly pro každý z pozitivních fágů získán roztok o-přibližné koncentraci. 10? PFU/μΙ.
Výše zmiňované oligonukleotidy OA a OB byly využity v Southernově blotu (Sambrook a další (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York', USA) též jako sondy k určení fragmentů genomové DNA nesoucích dao-gen T. variabilis. Za
4
4 • 44
-16-.
4444 • 4
444 • 4 4
4
444 tím účelem byla za dále popsaných podmínek provedena hybridizace s D.NA rozštěpenou restrikčními endonukleázami (Pharmacia) BamHI, EcoRI, HindlII, Knpl, Pstl,· PvuII, Xbal a Xhol a rozdělenou na agarózovém gelu. Gel, použitý k rozdělení fragmentů DNA na základě rozdílné velikosti molekul, byl následně inkubován 15 min v 0,25 M HCI za mírného protřepávání a při pokojové teplotě, dále 1 hodinu v denaturujícím a 1 hodinu v neutralizujícím roztoku. Gel byl poté položen na sloupec filtračních papírů Whatman 3 MM navlhčených 10 x SSC pufrem. Na něj byl přiložen nitrocelulózový filtr BA85 (.0, 45 pm, Schleicher & Schuell) týchž rozměrů, navlhčený 2 x SSC,. přičemž bylo třeba se vyvarovat tvorby bublin. Nitrocelulózový filtr byl dále překryt dvěma listy papíru Whatman 3 MM navlčenýmí 2 x SSC pufrem a vrstvou suchých filtračních papírů stejného rozměru, přičemž tloušťka této vrstvy činila 8 až 10 cm. Takto vytvořený balík byl nahoře zatížen závažím o hmotnosti zhruba 500 g. Přenos byl ponechán probíhat 16 hodin. Jakmile byla DNA přenesena, nitrocelulózový filtr byl opatrně ponořen na 5 minut do 6 x SSC, poté 1 hodinu vysoušen při pokojové teplotě. Poté byl filtr zapékán ve vakuu mezi dvěma listy papíru Whatman 3 MM při teplotě 80°C po dobu 3 hodin tak, aby DNA pevně přilnula k filtru. Poté byla provedena prehybridizace a hybridizace za podmínek popsaných při screeningu DNA knihovny. Výsledky autoradiografie poukázaly na výskyt specifických hybridizačních pásů pro každý ze štěpů. Velikost těchto pásů byla konkrétně následující: 10,2 kb pro EcoRI štěp, 3,7 kb pro BamHI, 3,5 kb pro HindlII, 11,6 kb pro KpnI, 11,3 kb pro Pstl, 4,8 kb pro PvuII, 2,8 kb pro Xbal a 4,7 kb pro Xhol.
-17·· ···· ·« ·* ϊ · · » · · · • ♦ ··· · · · « • · · · ··· ··· • · » , .
·· »·· »· .«
3. Klonování fragmentu DNA kódujícího dao-gen
Po přečištění fágové DNA, v podstatě stejným způsobem, jako bylo popsáno v části 1 příkladu 2 pro bakteriofág' X-GEM12, bylo provedeno její štěpení endonukleázou Sáli, zjištěný proužek o velikosti 9 kb byl překlonován do plazmidů pBluescript I KS ( + ) (Stratagene) rozštěpeného Sáli. K tomu byly použity DNA ligáza fágu T4 (Amersham) , ATP a pufr doporučený dodavatelem enzymu. Výsledná ligační směs byla inkubována po dobu 5 hodin při 12°C a poté byla použita k transformaci vhodných buněk E. coli TG1 (Amersham). Transformanti byli selektováni na plotnách s LB médiem s přídavkem ampicilinu (100 pg/ml), X-gal (40 μς/ιαΐ) a 0,2mM IPTG. Z klonů s bílým selekčním fenotypem byl izolován plazmid pALTl. S použitím Southernova postupu a sondy.OB byl dao-gen lokalizován v 3,7 kb BamHI fragmentu obsaženém v plazmidů pALTl. Tento BamHI fragment byl překlonován do plazmidů pBluescript I KS (+) (Stratagene) rozštěpeného endonukleázou BamHI. Tak byly izolovány plazmidy pALT2 a pALT3, nesoucí 3,7 kb BamHI fragment v obou orientacích (obr. 1) .
4. Sekvenování fragmentu nesoucího dao-gen
Nukleotidová sekvence fragmentu neseného plazmidem pALT2 byla určena s použitím téhož plazmidů postupem popsaným v literatuře (Sanger a kol. (1977) Proč. Nati. Aca. Sci. USA 74, strana 5463 až 5464) s použitím sekvenační sady s T7 DNA polymerázou (Pharmacia) a [35S]dATP. Určená sekvence je zobrazena v Sekv.id. č. : . 1. Analýzy této sekvence a její porovnání s ostatními známými sekvencemi z mezinárodních
444(
I · 4 » 4 4 4 4 » 4 « » 4 (
4 4 · 4 • 4
4»
-18*4 44 ► 4 4 4 * 4 4 4
444 444 databází (GeneBank/EMBL) ukázaly, že klonovaný fragment kóduje dao-gen T. variabilis.
Příklad 3:
1. - Eliminace intronu z dao-genu pomocí PCR
Vzorek DNA z plazmidů pALT2 o hmotnosti 0,15 pg byl smíchán s 10 μΐ (25 μΜ) každého z těchto oligonukleotidů: DAO1 (5'CATGCCATGGCTAAAATCGTTGTTATTGGGGCCGGTGTTGCCGGTTTAAC-3') , j enž kóduje úplnou sekvenci prvního exonu a první nukleotidy na 5'- konci druhého exonu a obsahuje jedno restrikční místo pro Ncol, a DAO2 (5'-CCCAAGCTTCTAAAGGTTTGGACGAG-3'), obsahující restrikční místo pro HindlII a sekvenci 3'-konce, odpovídající druhému exonu dao-genu, včetně terminačního kodónu translace. K této směsi byly přidány 2,5 jednotky Taq-polymerázy (Perkin - Elmer) spolu s vhodným, dodavateli doporučeným, pufrem a preparát byl podroben amplifikačnímu procesu v PCR cykleru Gene-ATA.Q (Pharmacia) ve 30 cyklech. Každý cyklus se skládal z fáze při 95°C (1 min) , 50°C (2 min) a 72°C (2,5 min). Výsledek amplifikace byl po provedení elektroforézy na 1% agarózovém gelu zviditelněn barvením ethidiumbromidem.
DNA
Fragment o velikosti cca 9 kb získaný prostřednictvím PCR byl přečištěn extrakcí z agarózového gelu s použitím β-agarázy (Biolabs) v souladu s doporučeními výrobce. Množství 0,2 pg přečištěného fragmentu bylo spojeno s 1 μg vektoru M13tgl30 (Amersham), rozštěpeného enzymem HincII (Pharmacia). K ligací byla použita T4-DNA ligáza (Amersham), ATP a pufr doporučený výrobcem. Tímto způsobem byl vytvořen fág M13DA0 (obr. 1), jenž byl' poté sekvenován, • · • · ·
-19aby se ověřilo, zda byl intron skutečně odstraněn. Nukleotidová- sekvence fragmentu obsaženého ve fágu M13DA0 byla určena na tomtéž rekombinantním fágu postupem popsaným v literatuře (Sanger a kol. (1977) Proč. Nati. Aca. Sci. USA 74, strana 5463 až 5464) s využitím sekvenační sady s T7 DNA polymerázou (Pharmacia) a [35S]dATP. Nukleotidová sekvence ukázala, že klonovaný fragment má velikost 0,9 kb a obsahuje sekverici dao-genu z T. variabilis bez zmiňovaného intronu.
2. Nakloňování dáo-genu bez intronu do plazmidů pKK233.2 Vzorek DNA o hmotnosti 0,1 pg z plazmidů pKK233.2 byl štěpen restrikčními endonukleázami Ncol a HindlII (Pharmacia) při 37°C v pufru doporučovaném dodavateli po dobu 1 hodiny a poté byl zahříván na 65°C po dobu 10 min, aby se reakce ukončila. Rozštěpený plazmid byl smíšen s 0,2 pg fágu M13DA0 štěpeného týmiž, výše zmíněnými, restrikčními endonukleázami, a obě DNA byly spojeny prostřednictvím T4 DNA-ligázy (Amersham) za přítomnosti ATP a v pufru doporučeném výrobcem.
Výsledná ligační směs byla použita k transformaci kompetetních buněk E. coli kmene TG1. Transformantů byli izolováni na LB médiu s přídavkem ampicilinu (100 pg/ml). Tímto postupem byl získán klon obsahující rekombinantní plazmid pKDAO3 (obr. 1), jenž nesl fragment DNA o velikosti 0,9 kb vytvořený amplifikací s využitím PCR. Tento fragment se nacházel mezi restrikčními místy Ncol a HindlII plazmidů pKK233.2, tj. byl exprimován pod kontrolou trc promotoru.
·· ·· • · • · ··
-20• ·
4 44 ··
Příklad 4
1. Vytvoření chimérického DAO enzymu obsahujícího navíc histidinových zbytků
Za účelem připojení polyhistidinové sekvence na N-konec enzymu DAO z T. variabi.lis bylo 0,1 pg plazmidu pKDA03 štěpeno restrikční endonukleázou Ncol (Pharmacia) po dobu 1 hodiny při teplotě 37°C a za podmínek doporučených dodavatelem. Reakce byla zastavena zahřátím směsi na 65°C a udržováním této teploty po dobu 10 minut. Takto rozštěpený plazmid byl zarovnán Klenowovým fragmentem DNA-polymerázy I z E. coli (Pharmacia) v souladu s doporučeními dodavatele a reakce byla opět ukončena zahříváním směsi při 65°C podobu 10 minut. Výsledný linearizovaný plazmid byl spojen s fragmentem DNA, obsahujícím nukleotidovou sekvenci kódující 6 histidinových zbytků. Reakce byla katalyzována T4 DNA ligázou (Amersham) za přítomnosti ATP a s použitím pufru doporučeného výrobcem. Fragment kódující 6 histidinových zbytků byl získán smíšením' 1,5 pg dvou komplementárních oligonukleotidů, nazvaných HIS1 (5'CATCATCACCACCATCACTT-3') a HIS2 (5'-AAGTGATGGTGGTGATGATG-3'), jež byly zahřívány při 100°C po dobu 5 minut a poté ochlazeny na pokojovou teplotu, čímž došlo k hybridizaci a zformování dvouvláknového fragmentu DNA.
Výsledná ligační směs byla použita k transformaci kompetetních buněk E. coli kmene TG1. Transformanti byli izolováni na LB médiu s přídavkem ampicilinu (100 pg/ml). Tímto postupem byl získán klon obsahující rekombinantni plazmid pKDAOHIS, jenž nesl dao-gen spojený na 5'-konci se sekvencí 18 nukleotidů kódujících 6 histidinových zbytků. Aby se ověřilo, zda plazmid pKDAOHIS (viz obrázek 1) obsahuje očekávanou chimérickou konstrukci, byla postupem
9
999 • 9 9 9
9 9 9
··
9 9
219
9999 9 popsaným v literatuře (Sanger a kol. (1977) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74, strana 5463 až 5464) zjištěna sekvence tohoto rekombinantního plazmidů. Přitom bylo využito sekvenační sady s T7 DNA polymerázou (Pharmacia) a [:'3]dATP. Zjištěná sekvence je uvedena v Sekv. id.č.: 2.
Kmen E. coli TG1 transformovaný plazmidem pKDAOHIS byl 20 hodin kultivován na médiu LB při teplotě 25°C a při 250 min“1. Buňky byly poté odděleny 10 minutovou centrifugaci při 5000 g a rozrušeny ultrazvukem. Aktivita DAO byla stanovena způsobem popsaným v části 1 příkladu 1. Pro takto získanou DAO byla naměřena aktivita 350 U/mg proteinu. Tím bylo potvrzeno, že získaný chimérický enzym DAO s histidinovým řetězcem (hisDAO) je aktivní. Dále bylo za použití SDS - elektroforézy na polyakrylamidovém gelu ověřeno, že v souladu s očekáváním jsou molekuly enzymu hisDAO poněkud větší než molekuly nativní DAO. Kmen E. coli TG1 transformovaný plazmidem pKDAOHIS byl dne 10. VI. 1997 uložen ve· Španělské sbírce typových kultur (CECT) na oddělení mikrobiologie fakulty biologických věd. University Valencia,. 46100 Burjasot (Valencia) pod katalogovým číslem CECT4888.
Příklad 5
I. - Příprava afinitního nosiče agaróza - kovový chelát Směs 5,7 ml epichlorhydrinu (3-chlor-l,2-propenoxidu) a
II, 4 ml ethylenglykoldimethyléteru byla zvolna přidána k suspenzi 7 g agarózy CL6B v 57 ml 0,1 M NaOH obsahujícího 340 mg NaBH4 a při 25°C byla ponechána za stálého mírného • · · · • 9 9 9
999 999
• 9
99 promíchávání po dobu 4 hodin. Takto získaný agaróza-epoxid byl promyt dostatečným množstvím destilované vody a přidán k roztoku, připravenému smícháním 2,5 ml 2 M iminodiacetátu sodného, 19 ml 0,1 M NaHCO3 pufru o pH 11. Tato suspenze byla za neustálého mírného míchání ponechána 12 hodin při 25°C. Nakonec byl nosič promyt destilovanou vodou a suspendován ve vodném roztoku soli požadovaného kovu (.5 mg/ml). Takto vytvořený nosič agaróza - kovový chelát byl promyt dostatečným množstvím vody .a připraven pro následné použití. Při použití C0CI2 jako soli kovu byl uvedeným způsobem získán nosič agaróza - kobaltový chelát.
2. Přečištění chimérického enzymu hisDAO na nosiči agaróza - kobaltový chelát
Kolona naplněná nosičem agaróza - kobaltový chelát byla ekvilibrována 20 mM fosfátovým pufrem (pH 7,0) a 0,2 M NaCl. Na kolonu byl nanesen rozpustný buněčný extrakt, získaný způsobem popsaným v předchozím příkladě z buněk E. coli kmene TG1 transformovaných plazmidem pKDAOHIS. Po nanesení extraktu byla- kolona promyta dostatečným množstvím téhož ekvilibračního pufru, čímž byly eliminovány všechny ostatní proteiny s výjimkou hisDAO, který zůstal zadržen na koloně. Enzym hisDAO byl poté eluován za použití 20 mM fosfátového pufru o pH '7,0 obsahujícího 10 mM imidazol. Frakce obsahující enzym hisDAO byly jímány a posléze dialyzovány proti 20 mM fosfátovému pufru (pH 7,0). Takto připravený enzym o aktivitě 9000 U/mg vykazuje více než 90% stupeň čistoty a je bezprostředně použitelný k přeměně cefalosporinu C na GL-7ACA.
• · · · · · · · · · · 9 9 9 · ··· · · · · • · · · 9 99 999999
9 9 9 9 9 9
9999 999 99 999 99 99
Popis obrázků
Obrázek 1 - konstrukce plazmidú pKDAOHIS
Dao-gen, neobsahující žádný intron a s restrikčním místem Ncol sekvenci kodónu ATG kódujícího první methionin proteinu, byl získán pomocí PCR z plazmidú pALT2. Fragment amplifikovaný prostřednictvím PCR byl poté překlonován do restrikčního místa HincII vektoru M13tgl30, čímž vznikl plazmid M13DA0. Fragment NcoI-HindlII získaný z M13DA0 byl překlonován do NcoI-HindlII . restrikčních míst plazmidú pKK233.2 za vzniku pKDA03. Tento plazmid nesl dao-gen, jehož exprese je řízena promotorem trc z E. coli. V posledním kroku byl vřazen na 5'-konec dao-genu fragment DNA, kódující polyhistidinový řetězec, čímž vznikl plazmid pKDAOHIS.
·· · ·« « · · ···· · · • · · · · · · · · ·
-9/1- ·· ····· · · ·
Yt · ···· ·»···
INFORMACE O SEKVENCI ID. Č. 1: ..........
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 3668 párů basí (B) TYP: deoxyribonukleová kyselina (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: dao-gen (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:'
| (A) | JMÉNO/KLÍČ: | CDS | 1481. | .1503, 1543..2506 |
| (A) | JMÉNO/KLÍČ: | CDS | 2952. | .3668 |
| (D) | ORGANISMUS: | - Trigonopsis variabilis |
(xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 1:
GGATCCTTAC GAGGAAGATC TGATAATGGA GAATTCTCTC GCTTTATGCC ATGACTTGCA 60
GGTTCCTCGG GTAATGGAAC CACTGACAAA TCGGCTGCTT GAGGTTTTGT TCCCTTCAAC 120
ACTTCATCTT CCAAGGTTCT AATTCGTAGT TTCTTCTCAT TCAATAAAGC TGCAAACCGC 130
TCCAACATTT GTAGATCATT ATTCTTTGTC TTCACGGCAA CTGTATCTAG TTCCTTCTGA 240
AGGTCCTTCG TTTCTTTGGT TAGTAGATCT ACCATGCCAG TTAAGCGATC AATCTCCTCT 300
TGGACCTCCT’TCTTGAGCGA TAGCTCTCAC CAGAACCAAT CAAAAAGAAC ACCAGGATCG ' 360 GTACATGTTC CTTGTCGGGA TAGGGACAGT GATCCCAAAG TAATTGATAG ATCCTGAACT 420
TTCTGGGTAA TCGAGATAAT AACCGAACTC AAATCTTGTG ATGGCTTGGC GTTCAATTGA 480
ATGTTTTCGC TAGAAAGCCT CGGACTCTTA CGTTGGTCTT CATCTGTAAG CGACCGCGTG 540
AACACTTGTT GGAATAAGTC ATTCCATTCA CTTTCACTTT GAGGACTTCT ATTTGACCGT 600
AGATCTTTAA TTGACTCATT TCCAGTTACT GAAAGTTAGC TGGAAGCTTT CAACATGTCC 660
TCACCAGAGG TTTGATAGAG GTCTAACGAT GGCTTCATAC AGGČTGTGAA TGTGATTGTT. 720
TCGCCAGTCT CAACTCTGAC GATCAAACGC TTAGATCCAC CAATCTCAAT ACCGAACGAG· 730
TTAATTCGAC TCATTGCTCA ATATGATTGA TCGCGCGGGA TGACATCGAA GGTGACAACC 840
GTACGCGAAA GATGCGTGAC GATAAGGACA ACGACTAAGG GAGTAGATGG ACTGGGGAGT 900
GAAGGAAATG TGAGACTAGA GAAAAGCCAC TGACTGAGAG TAAAACAGCC ATGATTAGAC 960
AATCAGCCAT GACAGCACTA TAACGTGATA TGATAAGTAA GGCTCTGTTG CCCGCTGACG 102 0
GCCAACGGCT GACGGCCAAC TTGATGATTC TACCACAAAA AATCATACGA GAAGTCAACG 1080
AAAAGTCCTT AGTTTGGAAT TCCAGACATG GCAGAATTTA ACGGCCACTA CAGTTGGCCG 1140
TTCGTAAACG AGACAAGTGA CTCATGGCAG CACCGTCTCA GTCCACCGGT CTAAAGCACT 1200
TGGTGCCAGA TGAATTTGGA AACTGTCACC TTATAGAATT ACTTTTGGAT AGTTTTTGTA 1260
AGGCTGGAGA CTTGTAAGCC TGACTCAGTT GACTCATCGG CGAAAGCTTC CTATCTTGGA 1320
GCTAAGATCG CCTGATCGTT TTGCCCTACT TATCTTGGTT GCATGAGTTG GCCGGTCAGA 1330
GCCGCATTCT AGCCAAAGGG TTATAGCGTT ACACTCTTGA TAGGCAAATC CGTGCTCGGA 1440
TTATATATAA GGCAAAAGTC GATTCAACGG’ ATCAATAAAA ATG GCT AAA ATC GTT 1495 . Met Ala Lys Ile Val 1 5
GTT ATT GG . GTAAGTGCCT TGATACCAGA CGGCTGACAT TTGTTTAG T GCC GGT 154 8 val rie Gly Ala Gly
| GTT | GCC | GGT | TTA | ACT | ACA | GCT | CTT | CAA | CTT | CTT | , CGT | AAA | GGA | CAT | GAG | 1596 |
| Val | Ala | Gly | Leu | Thr | Thr | A i a | Leu | Gin | Leu | Leu | Ard | S | Gly | His | Glu | |
| 15 | 20 | 25 | ||||||||||||||
| GTT | ACA | ATT | GTG | TCC | gag' | m m rp . 1 x | ACG | CCC | GGT | GAT | CTT | AGT | ATC | GGA | TAT | 164 4 |
| v a 1 | Thr | Ile | Val | Ser | Glu | Phe | Thr | Pro | G1 ν- | Asp | Leu | Ser | Ile | Gly | Tyr | |
| 30 | 3 5 | 40 | ||||||||||||||
| ACC | TCG | CCT | -TGG | GCA | GGT | Gcc | AAC | TGG | ότα | ACA | TT” | TAC | GAT | GGA | GGC | i - |
| Thr | Ser | Pro | Trp | Ala | Gly | Ala | Asn | Trp | Leu | Thr | Fhe | T y r | Asp | Gly | Gly | |
| 45 | 50 | 55 | ||||||||||||||
| AAG | TTA | GCC | GAC | TAC | GAT | GCC | C-TC | TCT | TAT | CCT | ATC | TTG | CGA | GAG | CTG | 1740 |
| I.ys, | Leu | Ala | Asp | Tyr | Asp | Ala | Val | Ser | Tyr | Pro | Ile | Leu | Arg | Glu | Leu | |
| 60 | 65 | 70 | ||||||||||||||
| GCT | CGA | AGC | AGC | CCC | GAG | GCT | GGA | ATT | CGA | CTC | ATC | AAC | CAA | CGC | TCC | Γ7 88 |
| Ala | Arg | Ser | Ser | Pro | Glu | Ala | Gly | Ile | Arg | Leu | Ile | Asn | Gin | Arg | Ser | |
| 75 | 80 | 85 | 90 |
| • · • · • • to | to • to • • to to | • to • · • to • · • · | ···· • • toto • · • | • · ·· • ·· β · · • « · toto • | ||||||||||||
| CAT | GTT | CTC | AAG | CGT | GAT | CTT | CCT | AAA | CTG | GAA | GGT | **GCC | *ÁTG | TCG | to · · GCC | to · toto 1836 |
| His | Val | Leu | Lys | Arg | Asp | Leu | Pro | Lys | Leu | Glu | cly | ?λ 1 a | Met | Ser | Ala | |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||||
| ATC | TGT | CAA | CGC | AAC | CCC | TGG | TTC | AAA | AAC | ACA | Ul- | ..•A 1 | TCT | TTC | GAG | 1384 |
| ile | Cys | Gin | Arg | Asn | Pro | Trp | Phe | Lys | Asn | Thr | Va. | Asp | Ser | Phe | Glu | |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||||
| ATT | ATC | GAG | GAC | AGG | TCC | AGG | ATT | GTC | CAC | GAT | GAI | ,j . o | GCT | TAT | CTA | 1932 |
| Ile | Ilc | Glu | Asp | Arg | Ser | Arg | Ile | Val | His | Asp | Asc | V a i | Aid | Tyr | Leu | |
| 125 | 130 | 1 3 5 | ||||||||||||||
| GTC | GAA | rprprp | GCT | TCC | GTT | TGT | ATC | CAC | ACC | GGA | GTC | AC | TTG | AAC | TGG | 1980 |
| Val | Glu | Phe | Ala | Ser | Val | Cys | Ile | His | Thr | Gly | Val | Tyr | Leu | Asn | Trp | |
| i an | i a s | 1 5 ~ | ||||||||||||||
| CTG | ATG | TCC | CAA | TGC | TTA | TCG | CTC | GGC | GCC | ACG | GTG | GTT | AAA | CGT | CGA | 2028 |
| Leu | Met | Ser | Gin | Cys | Leu | Ser | Leu | Gly. | Ala | Thr | Val | Val | Lys | Arg | Arg | |
| 155 | 160 | 165 | 170 | |||||||||||||
| GTG | AAC | CAT | ATC | AAG | GAT | GCC | AAT | TTA | CTA | CAC | TCC | TCA | GGA | TCA | CGC | 2076 |
| Val | Asn | His | Ile | Lys | Asp | Ala | Asn | Leu | Leu | His | Ser | Ser | Gly | Ser | Arg | |
| 175 | 180 | 185 | ||||||||||||||
| CCC | GAC | GTG | ATT | GTC | AAC | TGT | AGT | GGT | CTC | TTT | GCC | CGG | TTC | TTG | GGA | 212-4 |
| Pro | Asp | Val | Ile | Val | Asn | Cys | Ser | Gly | Leu | Phe | Ala | Arg | Phe | Leu | Gly | |
| 190 | 195 | 200 | ||||||||||||||
| GGC | GTC | GAG | GAC | AAG | AAG | ATG | TAC | CCT | ATT | CGA | GGA | CAA | GTC | GTC | CTT | 2172 |
| Gly | Val | Glu | Asp | Lys | Lys | Met | Tyr | Pro | Ile | Arg | Gly | Gin | Val | Val | Leu | |
| 205 | 210 | 215 | ||||||||||||||
| GTT | CGA | AAC | TCT | GTT | CCT | TTT | ATG | GCC | TCC | TTT | TCC | AGC | ACT | CCT | GAA | 2220 |
| Val | Arg | Asn | Ser | Leu | Pro | Phe | Met | Ala | Ser | Phe | Ser | Ser | Thr | Pro | Glu | |
| 220 | 225 | 230 | ||||||||||||||
| AAA | GAA | AAT | GAA | GAC | GAA | GCT | CTA | TAT | ATC | ATG | ACC | CGA | TTC | GAT | GGT | 2268 |
| Lys | Glu | Asn | Glu | Asp | Glu | Ala | Leu | Tyr | Ile | Met | Thr | Arg | Phe | Asp | Gly | |
| 235 | 240 | 245 | 250 | |||||||||||||
| ACT | TCT | ATC | ATT | GGC | GGT | TGT | TTC | CAA | CCC | AAC | AAC | TGG | TCA | TCC | GAA | 2 316 |
| Thr | Ser | Ile | Ile. | Gly | Gly | Cys | Phe | Gin | Pro | Asn | Asn | Trp | Ser | Ser | Glu | |
| 255 | 260 | 265 | ||||||||||||||
| CCC | GAT | CCT | TCT | CTC | ACC | CAT | CGA | ATC | CTG | TCT | AGA | GCC | CTC | GAC | CGA | 2364 |
| Pro | Asp | Pro | Ser | Leu | Thr | His | Arg | Ile | Leu | Ser | Arg | Ala | Leu | Asp | Arg | |
| 270 | 275 | 280 | ||||||||||||||
| TTC | CCG | GAA | CTG | ACC | AAA | GAT | GGC | CCT | CTT | GAC | ATT | GTG | CGC | GAA | TGC | 2412 |
| Phe | Pro | Glu | Leu | Thr | Lys | Asp | Giv | Pro | Leu | Asp | Ile | V a 1 | Arg | Glu | Cys | |
| 285 | 290 | 2 95 | ||||||||||||||
| GTT | GGC | CAC | CGT | CCT | GGT | AGA | GAG | GGC | GGT | CCC | CGA | GTA | GAA | TTA | GAG | 2 460 |
| Val | Gly | His | Arg | Pro | Gly | Arg | Glu | Gly | Gly | Pro | Arg | Val | Glu | Leu | Giu | |
| 300 | 305 | 310 | ||||||||||||||
| AAG | ATC | CCC | GGC | GTT | GGC | TTT | GTT | GTC | CAT | AAC | TAT | G GT | GCC | GCC | GGT | 2508 |
| Lys | Tle | Pro | Gly | Val | Gly | Phe | Val | Val | His | Asn | Tyr | Gly | Ala | Ala | Gly | |
| 315 | 320 | 325 | 330 | |||||||||||||
| GCT | GGT | TAC | CAG | TCC | TCT | TAC | GGC | ATG | GCT | GAT | GAA | GCT | GTT | TCT | TAC | 2 3 56 |
| Ala | Gly | Tyr | Gin | Ser | Ser | Tyr | Gly | Met | Ala | Asp | Glu | Ala | Val | Ser | Tyr | |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||||
| GTC | GAA | AGA | GCT | CTT | ACT | CGT | CCA | AAC | CTT | TAGAAATCAT GTATACAATT | J c 'J 6 | |||||
| Val | Glu | Arg | Ala | Leu | Thr | Arg. | Pro | Asn | Leu | |||||||
| 350 | 355 |
ATTCTCTCTC TATAAATCTA ATTTTTTTGT GTGGTCTAAT ATTCGTAAAC ACGTCGCAGT 2666 CGTCTATGTC GCCCTCGTCA CCGTGTCCAA AGTCGTAAAG TGACTGATTG CAATTGCGAC 2726 AACACGTGAC TCGACCTGCC TCCTTACCTC CCATCAACAA CAAAA.GAAGC TGGCTAAGAT 2786 AGAGGTCTGT TGACGAGCAC TCGTAAGAAC GGCAAACATA GAAAGGAGGC T.CTATAATTA 284 6 CCTGGAAACT GTGTTATATA CTATCACTAG TGAGGGTGAG TGATTAGAAG CAAGGGGACT 2906 AGAATACTGA CATGGATAGA GATCCAGGAG CCTTATAAAT AATCA ATG AAT ACA ATT 2963
Met Asn Thr Ile
| GAT | TTG | GAA | TCT | TGG | GAT | GAT | GAT | CCA | GAT | TTC | GCA | GAT | GAC | TTT | GAG |
| Asp | Leu | Glu | Ser | Trp | Asp | Asp | Asp | Pro | Asp | Phe | Ala | Asp | Asp | Phe | Glu |
| 360 | 365 | 370 | 375 | ||||||||||||
| AAT | TTA | AAG | ACT | CCA | GCT | CCT | ACG | TTT | TAT | GAA | GCC | AAC | GAT | GAG | ATT |
| Asn | Leu | Lys | Thr | Pro | Ala | Pro | Thr | Phe | Tyr | Glu | Ala | Asn | Asp | Glu | Ile |
| 380 | 385 | 390' |
···· • · · · Β ···· ΒΒΒ ΒΒ ΒΒΒ
| AGG | GAT | GGA | GAA | GAA | GAG | GAT | GAT | ΓΠφΓΠ i 1 i | TTC | TCT | CAA | GAT | TTC | GAG | TTG |
| Arg | Asp | Gly | Glu | Glu | Glu | Asp | Asp | Phe | Phe | Ser | Gin | Asp | Phe | Glu | Leu |
| 395 | 400 | 405 | |||||||||||||
| GAT | GAT | AAG | AAT | ACA | CTC | GGA | CGA | CAG | AAC | AAG | ATT | TCG | ACT | AGT | CAC· |
| Asp | Asp | Lys | Asn | Thr | Leu | Gly | Arg | Gin | As n | Lys | Ile | Ser | Τ’Ηγ | Ser | His |
| 410 | 415 | 4 2 | n o | ||||||||||||
| CTA | AAG | TCC | GCG | AGT | CAG | GAA | CAA | GCA | GAG | ACC | TCC | TTT | CGT | GAC | TCG |
| Leu | Lys | Ser | Ala | Ser | Gin, | Glu | Glh | Ala | Glu | Thr | Ser | Phe | Arg | Asp | Ser |
| 425 | 430 | 435 | |||||||||||||
| AAC | GCT | GGC | GTC | AAT | GCT | TTC | AGC | TGG | GGG | ACT | ATA | AAA | GCC | TTA | GGA |
| Asn | Ala | Gly | Val | Asn | Ala | Phe | Ser | Cys | Gly | Thr | Ile | Lys | Ala | Leu | Gly |
| 440 | 445 | 450 | 455 | ||||||||||||
| AAG | AAT | AGG | ATG | ACG | ACG | GTG | GAA | GAG | AAG | TGG | GAA | AAG | GAA | GTT | AGA |
| Lys | Asn | Arg | Met | Thr | Thr | Val | Glu | Glu | Lys | Trp | Glu | Lys | Glu | Val | Arg |
| 460 | 465 | 470 | |||||||||||||
| CGC | GAT | CAA | ATT | GGG | TTC | AAT | GAA | GCT | ACT | CTT | AGA | GCT | CAT | GAG | ACT |
| Arg | Asp | Gin | iie | Gly | Phe | Asn | Glu | Ala | Thr | Leu | Arg | Ala | His | Glu | Thr |
| 475 | 480 | 485 | |||||||||||||
| ACC | AGA | GAA | TGG | TTA | AAA | TCC | CAG | ACT | GGC | GAA | GCT | GGG | ACT | AAA | AGC |
| Thr | Arg | Glu | Trp | Leu | Lys | Ser | Gin | Thr | Gly | Glu | Ala | Gly | Thr | Lys | Ser |
| 490 | 495 | 500 | |||||||||||||
| AAG | GTC | TTT | AGC | CCA | ATT | CTC | GAC | GGA | TCA | TTC | TTC | GAA | CCG | CCT | TTG |
| Lys | Val | Phe | Ser | Pro | Ile | Leu | Asp | Gly | Ser | Phe | Phe | Glu | Pro | Pro | Leu |
| 505 | 510 | 515 | |||||||||||||
| GAA | TCT | AAA | GTC | AGG | CGT | TAT | CAT | TCA | CCC | CGG | AAA | CAG | GCA | CCT | CCT |
| Clu | Ser | Lys | Val | Arg | Arg | Tyr | His | Ser | Pro | Arg | Lys | Gin | Ala | Pro | Pro |
| 520 | 525 | 530 | |||||||||||||
| CCT | CCT | CCT | GAC | GAT | TTT | TCA | GAT | GCA | TTT | GAA | CTA | TCT | ACA | GAA | GAG |
| Pro | Pro | Pro | Asp | Asp | Phe | Ser | Asp | Aia | Phe | Glu | Leu | Ser | Thr | Glu | Glu |
| 535 | 540 | 545 | 550 | ||||||||||||
| CCA | GTG | AAA | TTA | AAA- | GTC | CAA | CCA | GTT | CAA | CCT | CAT | ATG | ACG | CCT | GCT |
| Pro | L ř U | Lys | Leu | Lys | Val | Gin | Pro | Val | Gin | Pro | His | Met, | Thr | Pro | Al a |
| 555 | 560 | 565 | |||||||||||||
| CTG | AGT | GAT | AAT | GAT | CTA | TGG | GGT | GAG | GAA | TCT | ATT | GGT | GTG | CGA | CGA |
| Leu | Ser | Asp | Asn | Asp | Leu | Trp | Gly | Glu | Glu | Ser | Ile | Gly | Val | Arg | Arg |
| 570 | 575 | 580 | |||||||||||||
| GGA | GGC | AGG | GAC | TCG | TCA | AGT | ATG | GGA | GGA | TCC | |||||
| Cly | Gly | Arg | Asp | Ser | Ser | Ser | Met | Gly | Gly | Ser |
585 590 ·· CB β· Β Β Β
ΒΒΒ ··' Β « Β · ·
3107
315 5
3203
3251
3299
3347
3395
3443
91
3539
3537
3635
3668
INFORMACE Ο SEKVENCI ID.' Č. 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1128 párů basí (B) TYP: deoxyribonukleová kyselina (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: dao-gen s přídamou sekvencí kódující histidinovou kotvu na 5'konci (ix) CHARAKTERISTICKÉ RYSY:
(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS 16..1107 (D) ORGANISMUS: Trigonopsis variabilis (xi) POPIS SEKVENCE ID.Č. 2:
• · · · • « i
- 27 • · · · • · • · • · • · · · · · A • A A A • A A AAA • A • A A A
CACAGGAAAC AGACC ATG CAT CAT CAC CAC CAT CAC TTC ATG GCT AAA ATC 51
Met His His His His His His Phe Met Ala Lys Ile 1 5 10
| GTT | GTT | ATT | GGG | GCC | GGT | GTT | GCC | GGT | TTA | ACT | ACA | GCT | CTT | CAA | CTT | 99 |
| va-i | Val | Ile | Gly | Ala | Gly | Val | Ala | Gly | Leu | Thr | Thr | Ala | Leu | Gin | Leu | |
| 15 | 20 | 25 | ||||||||||||||
| CTT | CGT | AAA | GGA | CAT | GAG | GTT | ACA | ATT | GTG | TCC | GAG | TTT | ACG | CCC | GGT | 147 |
| Leu | Arg | Lys | Gly | His | Glu | Val | Thr | Ile | Val | Ser | Glu | Phe | Thr | Pro | Gly | |
| .30 | 35 | 40 | ||||||||||||||
| GAT | CTT | AGT | ATC | GGA | TAT | ACC | TCG | CCT | TGG | GCA | GGT | GCC | AAC | TGG | CTC | 195 |
| Asp | Leu | Ser | Ile | Gly | Tyr | Thr | Ser | Pro | Trp | Ala | Gly | Ala | Asn | Trp | Leu | |
| 4 5 | 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| ACA | TTT | TAC | GAT | GGA | GGC | AAG | TTA | GCC | GAC | TAC | GAT | GCC | GTC | TCT | TAT | 243 |
| Thr | Phe | Tyr | Asp | Gly | Gly | Lys | Leu | Ala | Asp | Tyr | Asp | Ala | Val | Ser | Tyr | |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
| CCT | ATC | TTG | CGA | GAG | CTG | GCT | CGA | AGC | AGC | CCC | GAG | GCT | GGA | ATT | CGA | 291 |
| Pro | Ile | Leu | Arg | Glu | Leu | Ala | Arg | Ser | Ser | Pro | Glu | Ala | Gly | Ile | Arg | |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||||
| CTC | ATC | AAC | CAA | CGC | TCC | CAT | GTT | CTC | AAG | CGT | GAT | CTT | CCT | AAA | CTG | 339 |
| Leu | Ile | Asn | Gin | Arg | Ser | His | Val | Leu | Lys | Arg | Asp | Leu | Pro | Lys | Leu | |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||||
| GAA | GGT | GCC | ATG | TCG | GCC | ATC | TGT | CAA | CGC | AAC | CCC | TGG | TTC | AAA | AAC | 387 |
| Glu | Gly | Ala | Met | Ser | Ala | Ile | Cys | Gin | Arg | Asn | Pro | Trp | Phe | Lys | Asn | |
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||||
| ACA | GTC | GAT | TCT | TTC | GAG | ATT | ATC | GAG | GAC | AGG | TCC | AGG | ATT | GTC | CAC | 435 |
| Thr | Val | Asp | Ser | Phe | Glu | Ile | Ile | Glu | Asp | Arg | Ser | Arg | Ile | Val | His | |
| L25 | 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| GAT | GAT | GTG | GCT | TAT | CTA | GTC | GAA | TTT | GCT | TCC | /•'mm ϋϋ | TGT | ATC | CAC | ACC | 483 |
| Asp | Asp | Val | Ala | Tyr | Leu | Va l | Glu | Phe | Ala | Ser | Val | Cys | Ile | His | Thr | |
| 145. | 150 | 155 | ||||||||||||||
| GGA | GTC | TAC | TTG | AAC | TGG | CTG | ATG | TCC | CAA | TGC. | TTA | TCG | CTC | GGC | GCC | 531 |
| Giy | Val | Tyr | Leu | Asn | Trp | Leu | Met | Ser | Gin | Cys | Leu | Ser | Leu | Gly | Ala | |
| 160 | 165 | 170 | ||||||||||||||
| ACG | GTG | GTT | AAA | CGT | CGA | Gí G | AAC | CAT | ATC | AAG | GAT | GCC | AAT | TTA | CTA | 5 7 9 |
| Thr | V a 1 | Val | Lys | Arg | Arg | r - i v m | Asn | His | Ile | Lys | Asp | Ala | Asn | Leu | Leu'· | |
| 17 5 | 180 | 185 | ||||||||||||||
| CAC | TCC | TCA | GGA | TCA | CGC | CCC | GAC | GTG | ATT | GTC | AAC | TGT | AGT | GGT | CTC | 62' |
| His | Ser | Ser | Gly | Ser | Arg | Pro | Asp | Val | Ile' | Val | Asn | Cys | Ser | Gly | Leu | |
| 1 90 | 195 | 200 | ||||||||||||||
| TTT | GCC | CGG | TTC | TTG | GGA | GGC | GTC | GAG | GAC | AAG | AAG | ATG | TAC | CCT | ATT | 67 5 |
| phe | Ala | Arg | Phe | Leu | Gly | Gly | Val | Glu | Asp | Lys | Lys | Met | Tyr | Pro | Ile . | |
| 205 | 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| CGA | GGA | CAA' | GTC | GTC | CTT | GTT | CGA | AAC | TCT | CTT | CCT | TTT | ATG | GCC | TCC | 723 |
| Arg | Gly | Gin | Val | Val | Leu | Val | Arg | Asn | Ser | Leu | Pro | Phe | Met | Ala | Ser | |
| 225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
| TTT | TCC | AGC | ACT | CCT | GAA | AAA | GAA | AAT | GAA | GAC | GAA | GCT | CTA | TAT | ATC | 771 |
| Phe | Ser | Ser | Thr | Pro | Glu | Lys | Glu | Asn | Glu | Asp | Glu | Ala | Leu | Tyr | Ile | |
| 240 | 245 | 250 | ||||||||||||||
| ATG | ACC | CGA | TTC | GAT | GGT | ACT | TCT | ATC | ATT | GGC | GGT | TGT | TTC | CAA | CCC | 819 |
| Met | Thr | Arg | Phe | Asp | Gly | Thr | Ser | Ile | Ile | Gly | Gly | Cys | Phe | Gin | Pro | |
| 255 | 260 | 265 | ||||||||||||||
| AAC | AAC | TGG | TCA | TCC | GAA | CCC | GAT | CCT | TCT | CTC | ACC | CAT | CGA | ATC | CTG | 867 |
| Asn | Asn | Trp | Ser | Ser | Glu | Pro | Asp | Pro | Ser | Leu | Thr | His | Arg | Ile | Leu | |
| 270 | 275 | 280 | ||||||||||||||
| TCT | AGA | GCC | CTC | GAC | CGA | TTC | CCG | GAA | CTG | ACC | AAA | GAT | GGC | CCT | CTT | 915 |
| Ger | Arg | Ala | Leu | Asp | Arg | Phe | Pro | Glu | Leu | Thr | Lys | Asp | Gly | Pro | Leu | |
| 285 | 290 | 295 | 300 |
• · ·* »· 4 4 · 4 4 4 4 • · · 4··· 4 44 · * · >4 4 »4 444 444 • 4 4 4 4 4 4
4444 444 44 444 «4 44
| GAC | ATT | GTG | GGC | GAA | TGC | GTT | GGC | CAC | CGT | CCT | GGT | AGA | GAG | GGC | GGT | 963 |
| Asp | Tle | Val | Arg | Glu. | Cys | Val | Gly | His | Arg | Pro | Gly | Arg | Glu | Gly | Gly | |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||||
| ccc | CGA | GTA | GAA | TTA | GAG | AA.G | ATC | CCC | GGC | GTT | GGC | TTT | GTT | GTC | CAT | 1011 |
| Pro | Arg | Val·· | Glu | Leu | Glu | Lys | Ile | Pro | Gly | Val | Gly | Phe | Val | Val | His | |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||||
| AAC | TAT | GGT | GCC | GCC | GGT | GCT | GGT | TAC | CAG | TCC | TCT | TAC | GGC | ATG | GCT | 1059 |
| Asn | Tyr | Gly | Ala | Ala | Gly | Ala | Gly | Tyr | Gin | Ser | Ser | Tyr | Gly | Met | Ala | |
| 335 | 340 | 345 | ||||||||||||||
| GAT | GAA | GCT | GTT | TCT | TAC | GTC | GAA | AGA | GCT | CTT | ACT | CGT | CCA | AAC | CTT | 1107 |
| Asp | Glu | Ala | Val | Ser | Tyr | Val | Glu | Arg | Ala | Leu | Thr | Arg | Pro | Asn | Leu | |
| 350 | 355 | 360 | 364 |
TÁGAAGCTTG GCTGTTTTGG C 1128
Claims (8)
- PATENTOVE NÁROKY1. Způsob produkce modifikované oxidázy D-aminokyselin z Trigonopsis variabilis v libovolném hostitelském organismu vyjma člověka, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:a) izolaci DNA genu kódujícího enzym s oxidázovou aktivitou k D-aminokyselinám z libovolného kmenu mikroorganismu, který takový enzym produkuje;b) eliminaci intronů, které uvedený gen obsahuje pomocí způsobů založených na použití syntetických oligonukleotidů a polymerázové řetězové reakce PCR;c) vložení fragmentu DNA získaného v bodu (b) do plazmidu, který je schopen replikace v hostitelském organismu;d) fúzi syntetické sekvence oligonukleotidů kódující šest histidinových zbytků s 5'koncem strukturního regionu genu kódujícího oxidázovou aktivitu k D-aminokyselinám a zbaveného intronů;e) transformacihostitelského organismu rekombinantním plazmidem získaným v bodu (d)f) kultivaci tras formovaných buněk hostitelského organismu podle bodu (e) ve vhodném kultivačním médiu za podmínek, které umožňují produkci oxidázy D-aminokyselin;g) získání oxidázy D-aminokyselin z kultury podle bodu (f) pomocí afinitní chrornatografie30·· 9 · * 99 9 9 9 9 999 9 99 . 9 9 9 9 9 9 99 ' 9 9 9 999 9 9 9 9 • · · · · · ♦ · · · 99 9 • · * · · · · • ··· · · a 9 9 9 9 9 9 9 9 9
- 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že gen kódující oxidázu D-aminokyselin je genem Trigonopsis variabilis.
- 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že hostitelským organismem je Escherichia coli.
- 4. Způsob podle libovolného z předchozích nároků vyznačující se t í m ·, že afinitní chromatografie použitá k izolaci modifikovaného enzymu je založena na na médiu obsahujícím divalentní kationty.
- 5. Oxidáza D-aminokyselin modifikovaná, ..produkovaná a izolovaná způsobem podle libovolného z předchozích nároků.
- 6. Způsob využívající oxidázu D-aminokyselin podle nároku 5 v enzymatické syntéze 7β-(4-karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny.
- 7. Způsob podle nároku 6 vyznačující se tím, že se cefalosporin C podrobí reakci s oxidázou D-aminokyselin ve vodném médiu.' (
- 8. Způsob podle nároku 6 a 7 v y z n a č u j i c í se tím, že pří enzymatické reakci je oxidáza D-aminokyselin imobilizována.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES009702008A ES2131018B1 (es) | 1997-09-25 | 1997-09-25 | Un procedimiento enzimatico para preparar acido 7beta-(4-carboxibutanamido)cefalosporanico utilizando la enzima d-aminoacido oxidasa de trigonopsis variabilis modificada producida en escherichia coli. |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ182399A3 true CZ182399A3 (cs) | 1999-09-15 |
Family
ID=8300695
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ991823A CZ182399A3 (cs) | 1997-09-25 | 1998-09-24 | Enzymatický způsob přípravy 7ß-(4-karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny pomocí modifikované oxidázy D-aminokyselin z Trigonopsis variabilis produkované v Escherichia coli |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6635458B2 (cs) |
| EP (1) | EP0969088A1 (cs) |
| JP (1) | JP2001506868A (cs) |
| KR (1) | KR20000069110A (cs) |
| CN (1) | CN1246147A (cs) |
| AU (1) | AU9162898A (cs) |
| CA (1) | CA2272354A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ182399A3 (cs) |
| EE (1) | EE9900205A (cs) |
| ES (1) | ES2131018B1 (cs) |
| HU (1) | HUP0000797A2 (cs) |
| IL (1) | IL129533A0 (cs) |
| LT (1) | LT4628B (cs) |
| LV (1) | LV12359B (cs) |
| SK (1) | SK64899A3 (cs) |
| WO (1) | WO1999015632A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA988754B (cs) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100342014C (zh) * | 2004-04-08 | 2007-10-10 | 百瑞全球有限公司 | 重组d－氨基酸氧化酶 |
| CN1912130B (zh) * | 2005-08-08 | 2011-06-15 | 百瑞全球有限公司 | 一种用于制备7-氨基头孢霉烷酸的两步酶法 |
| CN101016540B (zh) * | 2006-02-10 | 2010-04-07 | 台湾尖端先进生技医药股份有限公司 | C-端含有组氨酸标记的hoxb4重组蛋白质的制造方法及用途 |
| RU2412998C1 (ru) * | 2009-11-18 | 2011-02-27 | Общество с ограниченной ответственностью "Инновации и высокие технологии МГУ" | Мутантная оксидаза d-аминокислот |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2268022B1 (cs) * | 1974-04-22 | 1977-06-24 | Rhone Poulenc Ind | |
| JPS62262994A (ja) * | 1986-05-12 | 1987-11-16 | Asahi Chem Ind Co Ltd | Ｄ−アミノ酸オキシダ−ゼ遺伝子 |
| CA1340522C (en) * | 1987-03-10 | 1999-05-04 | Heinz Dobeli | Fusion proteins containing neighbouring histidines for improved purification |
| CA2100987C (en) | 1992-07-27 | 1999-06-15 | Kaoru Furuya | A transformant capable of producing d-amino acid oxidase |
| US5397653A (en) | 1993-04-30 | 1995-03-14 | Westinghouse Electric Corporation | Filler wire composition and method of welding turbine component with filter wire composition and its product thereof |
| ES2109194B1 (es) | 1996-04-22 | 1998-07-16 | Antibioticos Sa | Un procedimiento para producir la enzima d-aminoacido oxidasa de rhodotorula gracilis en celulas hospedantes. |
-
1997
- 1997-09-25 ES ES009702008A patent/ES2131018B1/es not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-09-23 ZA ZA988754A patent/ZA988754B/xx unknown
- 1998-09-24 KR KR1019997004579A patent/KR20000069110A/ko not_active Ceased
- 1998-09-24 AU AU91628/98A patent/AU9162898A/en not_active Abandoned
- 1998-09-24 EP EP98943898A patent/EP0969088A1/en not_active Withdrawn
- 1998-09-24 WO PCT/ES1998/000262 patent/WO1999015632A1/es not_active Application Discontinuation
- 1998-09-24 HU HU0000797A patent/HUP0000797A2/hu unknown
- 1998-09-24 US US09/308,683 patent/US6635458B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-09-24 CN CN98801336A patent/CN1246147A/zh active Pending
- 1998-09-24 JP JP51859999A patent/JP2001506868A/ja not_active Ceased
- 1998-09-24 IL IL12953398A patent/IL129533A0/xx unknown
- 1998-09-24 SK SK648-99A patent/SK64899A3/sk unknown
- 1998-09-24 EE EEP199900205A patent/EE9900205A/xx unknown
- 1998-09-24 CA CA002272354A patent/CA2272354A1/en not_active Abandoned
- 1998-09-24 CZ CZ991823A patent/CZ182399A3/cs unknown
-
1999
- 1999-05-11 LT LT99-051A patent/LT4628B/lt not_active IP Right Cessation
- 1999-05-25 LV LVP-99-87A patent/LV12359B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1999015632A1 (es) | 1999-04-01 |
| CN1246147A (zh) | 2000-03-01 |
| SK64899A3 (en) | 2000-05-16 |
| LV12359B (en) | 2000-03-20 |
| ES2131018B1 (es) | 2000-04-01 |
| HUP0000797A2 (en) | 2000-07-28 |
| IL129533A0 (en) | 2000-02-29 |
| CA2272354A1 (en) | 1999-04-01 |
| LT99051A (en) | 1999-10-25 |
| AU9162898A (en) | 1999-04-12 |
| ES2131018A1 (es) | 1999-07-01 |
| ZA988754B (en) | 1999-06-28 |
| LT4628B (lt) | 2000-02-25 |
| LV12359A (lv) | 1999-10-20 |
| KR20000069110A (ko) | 2000-11-25 |
| JP2001506868A (ja) | 2001-05-29 |
| US6635458B2 (en) | 2003-10-21 |
| EP0969088A1 (en) | 2000-01-05 |
| EE9900205A (et) | 1999-12-15 |
| US20030119087A1 (en) | 2003-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Harms et al. | S-formylglutathione hydrolase of Paracoccus denitrificans is homologous to human esterase D: a universal pathway for formaldehyde detoxification? | |
| JP3950196B2 (ja) | アルコールデヒドロゲナーゼ及びキラルヒドロキシ化合物の酵素的生産へのその使用 | |
| KR100506134B1 (ko) | 신규한 카르보닐 환원효소 및 이것을 코딩하는 유전자 및 이러한 환원효소 및 유전자 이용방법 | |
| JPH0751070A (ja) | ニトリラーゼ活性を有するポリペプチド | |
| Morii et al. | 3-Ketosteroid-Δ1-dehydrogenase of Rhodococcus rhodochrous: sequencing of the genomic DNA and hyperexpression, purification, and characterization of the recombinant enzyme | |
| Alonso et al. | Engineering the D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis to facilitate its overproduction in Escherichia coli and its downstream processing by tailor-made metal chelate supports | |
| CZ182399A3 (cs) | Enzymatický způsob přípravy 7ß-(4-karboxybutanamido)cefalosporanové kyseliny pomocí modifikované oxidázy D-aminokyselin z Trigonopsis variabilis produkované v Escherichia coli | |
| US6187574B1 (en) | Process for producing the enzyme D-amino acid oxidase of Rhodotorula gracilis in host cells | |
| JP4307609B2 (ja) | コエンザイムｑ１０の製造法 | |
| CA2365092A1 (en) | Sorbitol dehydrogenase, gene encoding the same and use thereof | |
| EP1553175A1 (en) | Cephalosporin C acylase mutants | |
| CA2389789A1 (en) | Genes involved in cyclododecanone degradation pathway | |
| JP5230234B2 (ja) | 還元酵素及びその利用 | |
| JP3486942B2 (ja) | 耐熱性エステラーゼ | |
| JP4022784B2 (ja) | 新規なヘキソキナーゼ | |
| JP4039037B2 (ja) | 還元酵素遺伝子及びその利用 | |
| KR20070069196A (ko) | 당전이 효소의 효소활성을 향상시키는 방법 | |
| JP2729045B2 (ja) | サルコシンオキシダーゼおよびその製造法 | |
| JPH10248574A (ja) | 新規な乳酸酸化酵素 | |
| MXPA99004513A (en) | ENZYMATIC PROCESS FOR THE PREPARATION OF CEPHALOSPORANIC 7$b(g)-(4-CARBOXYBUTANAMIDE) ACID BY MEANS OF THE MODIFIED ENZYME D-AMINOACID OXIDASE OF TRIGONOPSIS VARIABILIS | |
| JP2001275669A (ja) | 新規カタラーゼ遺伝子及び該遺伝子を用いた新規カタラーゼの製造方法 | |
| JP4161232B2 (ja) | サルコシンオキシダーゼ活性を有する新規なタンパク質およびその製造方法 | |
| JPH11225769A (ja) | 糖類変換酵素をコードするｄｎａ、それを含む組換えｄｎａ並びに形質転換体 | |
| JPH0779775A (ja) | Ｎａｄ（ｈ）結合型酸化還元不均化酵素およびその遺伝子 | |
| KR20100088820A (ko) | 신규 나이트릴레이즈 및 이를 이용한 시아노 카르복실산의 생산방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |