CS270703B1 - Způsob sekreční produkce cizorodých proteinů kultivací transformovaných kvasinkových buněk - Google Patents

Abstract

Í5ešení se týká přípravy cizorodých proteinů kvasinkovou buňkou S. cerevisiae modifikovanou postupy genového inženýrství. Buňky kvasinek transformované deriváty obojetného vektoru pJDBa, obsahujícího kombinaci kódujících sekvencí s genem pro kvasinkový a—fak1 tor -MFa, zabezpečují v médiu vysokou kon— ‘ centraci proteinového produktu vneseného genu. Deriváty vektoru pJDBoc jsou označené pJDBaCH í a pJDBaCHE, obsahují sekvenci genu pro tole- ® cí prochymosin připojenou za správnou signální sekvenci MFa. Navržená konstrukce transformujícího vektoru řeší obecný způsob připojení sekvence, kódující expresi maturovaného cizorodého proteinu, za využití proteasového systému KEX2 hostitelské buňky kvasinek, který provádí porttranslační úpravu uvolňující při produkci protein z primárního translačního produktu.

Description

Vynález se týká způsobu sekreční produkce cizorodých proteinů kvasinkovou buňkou. Pro produkci cizorodých bílkovin se používají nejčaatěji buňky prokaryotických organismů Escherichia coll a Bacillus subtilis a eukaryotické buňky kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Aby byl cizorodý gen kódující bílkovinu udržen a exprimován v novém hostiteli, je třeba konstruovat vhodné pomocné molekuly DNA, tzv. expresní vektory, do kterých je cizorodý gen vkládán in vitro pomocí technologie rekombinantní DNA. Vektorové molekuly DNA obsahují řadu sekvencí, které usnadňují selekci bunék, do kterých vektor, resp. rekombinantní DNA vstoupily (transformovaných bunék), replikaci těchto DNA. v jednom nebo více hostitelích (pendlující) „shuttle” vektory) a transkripci, respektive translaci vloženého cizorodého úseku v novém hostiteli. V poslední době jsou zvláště oceňovány takové vektory, které zajišťují nejen expresi cizorodého genu nebo jeho části, ale i sekreci funkčního proteinového produktu nebo jeho prekursoru do periplasmového prostoru nebo dokonce do kultivačního média. V těchto případech totiž není třeba izolovat a složitě purifikovat cizorodý protein z nitra hostitelské buňky. Zvláště vhodnými hostitelskými organismy jsou kvasinkové buňky S.cerevisiae, u kterých je počet vlastních proteinů produkovaných do média poměrně m alý. což usnadňuje purifikaci cizorodé bílkoviny z média. V literatuře byla popsána řada kvasinkových genů, jejichž úvodní, tzv. signální sekvence mohou být využity k zajištění sekrece cizorodého proteinu. Mezi nimi hraje významnou roli zvláště dobře probádaný gen MF«, který kóduje sexuální kvasinkový teromon, tzv. a-faktor, viz obr. 1. Tento gen se stal důležitou částí různých vektorů popsaných v literatuře, které zajišťují nejen expresi, ale i sekreci cizorodých proteinů z kvasinky S. cerevisiae (Bitter et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 81 : 533o, 1984).

Podstatou způsobu sekreční produkce cizorodých proteinů kvasinkovou buňkou Saccharomyces cerevisiae podle vynálezu je, že kvasinková buňka se transformuje deriváty obojetného vektoru pJDB nesoucího kombinaci kódujících sekvencí s genem pro kvasinkový a—faktor -MFa, přičemž kombinace sekvencí je následující t

- sekvence zajištující replikaci vektoru v bakteriích Escherichia coll,

- sekvence zajištující replikaci vektoru v kvasinkách S. cerevisiae,

- sekvence zajišťující selekci transformovaných klonů E. coli na základě amp^r a

- sekvence zajišťující selekci transformovaných klonů S. cerevisiae leu2~ na základě komplementace leu2 mutace.

Přítomnost unikátních klonovacích míst uvnitř MFa genu umožňuje připojení cizorodé kódující sekvence za signální sekreční sekvenci MFa. Struktura vektoru pJDBa obsahujícího sekvenci kódující aminokyseliny rozpoznávané KEX2 proteasovým systémem S. cerevisiae umožňuje navíc využití tohoto systému k zajištění sekrece maturované bílkoviny do média.

Pro deriváty vektoru pJDBCt je charakteristický obsah cizorodých kódujících sekvencí vložených do faktoru MFa genu ve vektoru pJDBa, Deriváty označené pJDBaCH a pJDBaCHE obsahují sekvenci genu pro telecí prochymosin připojenou za signální sekvenci MFa ve vektoru pJDBa, přičemž pJDBaCHE obsahuje prochymosinovou sekvenci připojenou ve správné translační fázi za signální sekvenci MFa., která zajišťuje expresi a sekreci funkčního chymosinu v kvasinkové buňce S. cerevisiae. Takto transformované buňky S. cerevisiae produkují a sekretují funkční chymosin do média.

Pro konstrukci vektoru pJDB«C byly sekvence MFct získány jako součást plasmidu p69A (Kurjan a Herskowitz, Cell 3o ; 933), který není sám použitelný jako expresně-sekreční vektor, protože neobsahuje unikátní místa pro klonování cizorodých genů, viz obr. 2. Kromě uvedených kódujících sekvencí obsahuje použitelný fragment tohoto plasmidu i regulační sekvence promotoru a terminátoru a sousední kvasinkové chromosomální úseky. Všechny sekvence potřebné pro konstrukci expresně-sekrečního vektoru leží v plasmidu mezi dvěma cílovými místy EcoRI, viz obr. 2.

Z restrikční mapy, viz obr. 2, a úplné sekvence části tohoto úseku, viz obr. 1, plyne, že na začátku každé z kopií Qt-faktoru Je HindlII místo, které lze použít pro připojení cizorodého genu za signální sekreční sekvenci MF . Vložení v potřebné orientaci lze dosáhnout substitucí cizorodého genu za HindlII - Sáli fragment MFa. Protože však plasmid p69A obsahuje větší počet

CS 27o7o3 Bl

Hind III a Sall míst i mimo segment „ol” a jejich odstranění by bylo značně obtížné, bylo výhodnější přenést MRt do jiného pendlujícího vektoru - pJDB2o7 (Beggs, Molecular genetics in yeast, Alfred Benzon Symp. 16 : 383, 1981) — ze kterého byla Hind III a Sall místa odstraněna předem. Schéma konstrukce takového plasmidu pJDBd, při které byl použit také plasmid pBR322, je na obr. 2. Buňky E. coli transformované plasmidem pJDBd byly selektovány na základě amp^r,

Do plasmidu pJDBa byl podle vynálezu vložen EcoRI fragment nesoucí MFa několika způsoby, ale pouze inserce do EcoRI místa vně plasmidového LEU2 genu poskytla dva vhodné výsledné vektory pJDBa lišící se orientací MFa. Při analýze vzniklých plasmidu bylo využito restrikční mapování a projev amp^r, LEU2 a MFd genu v E. coli a S. cere vis iae.

Vektor pJDBa je tvořen dvoj řetězcovou cirkulární DNA o konturové délce cca 7,4 kbp. Skládá se z těchto hlavních funkčních částí, viz obr. 2 t

a) Fragment DNA obsahující ori (replikační počátek) z ColEl plasmidu, který zajišťuje replikaci vektoru a jeho derivátů v bakterii Escherichia coli. Vzhledem k tomu, že ColEl je plasmid s relaxovanou formou replikace, může být vektor pJDBa (nebo jeho deriváty) v bakteriální buřiče amplifikován po přidáni chloramfenikolu a izolován v dostatečném množství,

b) Fragment DNA obsahující bakteriální gen amp^r, pocházející z plasmidu pBR322, který zajišťuje transformované buřiče E. coli resistenci proti účinku antibiotika ampicilinu a poskytuje možnost selekce transformant. Účinnost transformace E, coli HBlol (Maniatis et al. , 1982) tímto vektorem je řádově srovnatelná s účinností transformace jinými pendlujícími vektory (E. coli, S. cerevisiae ) odvozenými od plasmidu pBR322.

c) Fragment 2 yU DNA (forma B) ze S. cerevisiae obsahující ars (zkratka odvozená od výrazu „autonomously replicating sequence”), která zajišťuje replikaci vektoru a jeho derivátu v řadě druhů kvasinkových buněk (např. S. cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe a Kluyveromyces lactis). '

d) Gen LEU2 ze S. cerevisiae, který má zeslabený promotor, takže je produkován menší počet kopií příslušné mRNA v S. cerevisiae, a tím je snížena i produkce funkčního enzymu patřícího k metabolické dráze pro synthesu leucinu, ve srovnání s genem LEU2 vybaveným normálním promotorem. Pokud je vektorem pJDBa nebo jeho deriváty transformována leu2~ mutanta S. cerevisiae, která nemůže růst na minimálním médiu bez přídavku leucinu, získává transformant schopnost růst na tomto médiu. Vzhledem k zeslabené expresi LEU2 genu je selekčním tlakem zvyšován počet kopií vektoru v transíormantách rostoucích na minimálním médiu, neboť nízký počet kopií vektoru nezajistí dostatečné množství leucinu. LEU2 gen se tedy podílí jednak na udržení vysokého počtu kopií vektoru pJDBa v transformovaných buňkách rostoucích na minimálním médiu a jednak na poměrně dobré stabilitě vektoru v rámci populace, viz příklad 1.

e) Fragment DNA ze S. cerevisiae obsahující gen MFa včetně promotoru a terminátoru, viz obr. 1. Tyto sekvence zajišťují produkci d-faktoru z transformovaných buněk S. cerevisiae pérovacího typu a do média a mohou být použity pro sekreci cizorodé bílkoviny kódované exogenní sekvencí, kterou lze vložit vhodným způsobem do genu MFa a zaměnit tak část jeho původní sekvence. Rozložení restrikčních míst je znázorněno na obr, 1 a 2, Pro konstrukci rekombinantních DNA, derivátů vektoru pJDBa, které mohou zajistit sekreci cizorodé bílkoviny jsou zvláště významná restrikční místa Hind III a Salt, která dovolují výměnu určitých úseků vektoru za úsek vybraného cizorodého genu za využití metod technologie rekombinantní DNA popsané v literatuře (např. Maniatis et al. , Molecular cloning, A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982),

Pro zajištění exprese a sekrece telecího chymosinu (syřldlo) transformovanou buňkou S. cerevlsiae byl tímto způsobem do vektoru pJDBa vložen prochymoalnový gen z plasmidu p424, ohraničený místy HindlII a Sáli, bez ohledu na fázi translace - pJDBdCH, viz obr. 3. V druhém kroku byla provedena úprava tohoto plasmidu, která posunula prochymosinovou sekvenci do správné translační fázo - pJDBaCHE, viz obr. 3, což bylo možno analyzovat podle nepřítomnosti HindlII

CS 27o7o3 Bl místa. Oba vektory - pJDBACH a pJDBdCHE - byly dále charakterizovány re s trik Sním štěpením (EcoRl, Sáli, Pstl, BamHI, Smál), viz obr. 3, a potvrzením funkce všech důležitých genových sekvencí (ori, amp^r, LEU2 a 2 yU ars) v hostitelích E. coli nebo S. cerevisiae.

Jako hostitelský kmen pro transformaci připraveným vektorem pJDB&CHE byl použit kmen S. cerevisiae GRF18 (« his3~leu2~). Transformace byla provedena buj na úrovni protoplastů v přítomnosti CaClg a PEG4ooo (modifikovaným způsobem podle Xin—Liang Zhu et al. Mol. Gen. Genet. 194 t 31, 1984), nebo kompetentních buněk připravených působením LÍCI (Rodriguez a Tait, Recombinant DNA Techniques : An Introduction, The Benjamin / Cummings Publishing Company. inc. , London, Amsterdam, Don Mills Ontario, Sydney, Tokyo, 1983).

U několika klonů transformovaných protoplastovou. resp. Lid metodou byla stanovena ploidie pomocí měření distribuce objemu buněk v populaci daného klonu na Coulter Counteru. LÍCI transformanty byly, podle očekávání, ve všech případech haploidní, zatímco protoplastové trans formanty byly v mnoha případech diploidní, vznikly tedy zřejmě fúzí během transformace.

Na tomto přikladli transformace kmene GRF18 vektorem pJDBcCCHE bylo ukázáno, že expresně-sekrečním vektorem pJDBa, resp. jeho deriváty, lze transformovat jak protoplasty, tak intaktní kvasinkové buňky, a získat tak transformanty s různou ploidií.

pJDBac ΚΕ/G RF18 transformanty byly testovány na schopnost produkovat funkční chymosin pomocí testu sráženi mléka (,,milk—clotting).

Testován byl jednak pufr, ve kterém byly předem resuspendovány buňky S. cerevisiae GRF18 transformované pJDBCCCHE, narostlé na agarové plotně, jednak tekuté postkultivační médium, viz tabulka 2. Jako kontroly byly použity klony GRF18 transformované pJDBaCH nebo pJDBa a rodičovský kmen GRF18, Pozitivní výsledek byl zaznamenán pouze v případě, kdy byl použit pufr nebo médium po kultivaci kmene pJDBaCHE nebo kontrolní preparát telecího chymoslnu (Serve) a potvrzuje nejen expresi prochymosinového genu v použitím systému vektor-hostilel, ale i sekreci genového produktu do média ve formě aktivního enzymu. Tento výsledek je potvrzen i inhibicí srážecí aktivity pepstatinem (inhibitor aspartatových pro teas), zatímco v paralelním testu použitý PMSF (phenylmethylsulfonylíluoridi inhibitor serinových proteas) byl neúčinný,

Tedy pouze kmen, který byl transformován plasm idem obsahujícím prochymosinový gen ve správné translační fázi za preprosekvencí MFa produkuje do média látku s aktivitou v srážecím (milk-clotiing) testu. Tato aktivita je stejně jako aktivita komerčního preparátu chymosinu inhibovatelná pepstatinem, resp. není inhibovatelná PMSF. Protože ani původní rodičovský kmen GRF18, ani GRF18 transformovaný vektorem pJDBa, resp. pJDBaCH, který obsahuje prochymosinový gen zařazený v nesprávné translační fázi, podobnou aktivitu nevykazují, lze předpokládat, že touto aktivní látkou je chymosin produkovaný do média jako aktivní enzym.

Dále jsou uvedeny příklady konstrukce sekrečně-expresních plasmidů, produkce chymosinu v kultivačním médiu a použití plasmidů pJDBa pro obecnou sekreci cizorodého proteinového produktu do média.

Příklad 1

Konstrukce sekrečně-expresního vektoru pJDBď

Konstrukce vektoru pJDBif (obr. 2)

Vektor pJDB2o7 (cca lo yUg) byl štěpen restrikční endonukleasou HindIII (lo jednotek| Maniatis et al., Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982). Kohesivni 5 konce cca 5 yug štěpené plas mid o vé DNA byly doplněny pomocí Klenowova fragmentu DNA polymerasy l (5 jednotek). Po následném štěpení Pst! (5 jednotek) byl vzorek DNA rozdělen elektroforézou (0,8 % agarosový gel) a větší fragment nesoucí LEU2, 2yU are a část amp^r byl puriííkován elektroelucí z vyříznuté části gelu. Vektor pBR322 (cca lo yUg) byl štěpen Pstl (lo jednotek) a PvuII (lo jednotek). DNA byla elektroforeticky rozdělena (0,8 % agarosový gel) a menší fragment obsahující ori a část amp^r byl

CS 27o7o3 Bl purifikován opět elektroelucí. Velikost purífikovaných fragmentů stanovená elektroforetlcky v o,8 % agarosovém gelu odpovídala předpokládaným rozměrům odvozeným z restrikčnfch map výchozích plasmidů pBR322 a pJDB2o7. Takto získané fragmenty (cca loo ng byly ligovány T4—DNA ligasou (cca 1,5 Jednotky) v lo yul reakčního objemu pří 26 °C 6 h. Llgační směsí (cca 5o ng) byly transformovány kompetentní buňky E. coli HBlol a vysety na ŽA (4 % živný agar; šarišské Michalany) obsahující 5o ^ug ampicillnu/ml. Z Jednotlivých amp^r klonů narostlých v 1 ml ŽB—amp média (2,5 % živný bujón; šarišské Michalany; obsahující 5o yUg ampicilinu/ml) přes noc při 37 °C v termostatu byla izolována plaemldová DNA (Holmes a Quigley, Anal. Biochem. 114 : 193, 1981). Velikost molekul plasmldcvé DNA byla porovnána elektroforetlcky v o,8 % agarosovém gelu s velikostí výchozího plasmidů pJDB2o7. DNA čtyř vzorků obsahujících DNA menší než pJDB2o7 byla dále charakterizována pomocí restrikčnfch endonukleas EcoRI, Pstl, Hind III, Sall a BamHL

Předpokládaný konstrukt pJDBtT se od výchozího plasmidů pJDB2o7 liší takto :

a) neobsahuje restrikční místa HindlII, Sáli a BamHl

b) je celkově menší o cca 1,45 kbp

c) obsahuje pouze 2 EcoRI místa (uvnitř LEU2 genu a mezi LEU2 a amp¹ geny)

d) velký EcoRI fragment . pJDBď je větší než největší fragment pJDB2o7

Prověření funkce markerových genů na plasmidů pJDB ;

a) Transformované buňky E. coll (použitá metoda transformace - Maniatie et al. , Molecular cloning· A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, pp. 25o, 1982) jsou resistentní k ampicilinu (5o yUg/ml), což potvrzuje přítomnost genu amp^r a funkčního ori.

b) Plasmid pJDB<T transformuje S. cerevisiae GRF18 (ft hls3”ieu2'*) se stejnou účinností jako plasmid pJDB2o? (použitá metoda transformace - Xin Liang Zhu et al., Mol. Gen. Genet. 194 ; 31, 1984), což svědčí o přítomnosti funkčního 2yU ars.

c) Transformované buňky auxotrofního kmene GRF18 (ft his3~leu2⁺) rostou na minimálním agarovém médiu (1 % glukosa, o,l % KH₂PO₄, o,l % MgSO_4> o,5 % (NH^SC^, o,l % Wickerhamův roztok vitaminů (Maráz a Ferenczy, Protoplasta - applications In microbial genetics, Ed. Peberdy, J. F., Nottingham· 34, 1979), 1,5 % agar) bez leucinu, což svědčí o přítomnosti funkčního LEU2 genu v pJDBď. Transformované buňky nerostou na minimálním médiu bez histidinu.

Konstrukce vektoru pJDBft. (obr. 2)

Vektor pJDB<ý (cca lo yUg) byl parciálně štěpen EcoRI (lo jednotek; Maniatis et al., Molecular Cloning· A laboratory manual· Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982), DNA byla elektroforetlcky rozdělena /0,8% agarosový gel/ a lineární forma vektoru byla izolována elektroelucí z gelu. Vektor p69A (cca lo yUg) byl štěpen EcoRI (lo jednotek) a po elektroforéze byl rovněž elektroelucí z o,8% agarosového gelu purifikován fragment velikostně odpovídající EcoRI fragmentu obsahujícímu kompletní MF« gen včetně promotorových a terminátorových sekvencí (cca 1,6 kbp.) viz obr. 2. Fragment reprezentující linearizovaný vektor pJDB<f (cca 5o ng) a EcoRI fragment obsahující MFft gen (cca loo ng) byly ligovány T4-DNA ligasou (o,l Jednotky) v reakčním objemu lo yul při 15 °C 5 h. Ligační směsí (cca 5o ng) byly transformovány kompetentní buňky E. coli HBlol a transformanty selektovány na základě resistence k ampicilinu (5o yUg/ml) na ŽA-amp médiu. Z jednotlivých transformovaných klonů narostlých přes noc v 1 ml ŽB-amp médiu při 37 °C v termostatu byla izolována plasmidová DNA (Holmes a Quigley, Anal. Biochem. 114 t 193, 1981) a na elektroforetlckém gelu byla porovnána její velikost s velikostí vektoru pJDBď. Ty izoláty, které obsahovaly plasmidovou DNA větší než vektor pJDBtf byly dále charakterizovány pomocí restrikčnfch endonukleas EcoRI, Pstl, HindlII a Sáli. Při rekombinacl výchozích fragmentů in vitro mohly vznikat 4 základní typy rekombinantních plasmidů, z nichž 2 Jsou vhodné z hlediska cíle konstrukce. Vhodné konstrukty bylo možné jednoduše vybrat

CS 27o7o3 Bl na základě transformace S. cervisiae GRF18 (Xin—Liang Zhu et al. ₍ Mol. Gen, Genet. 194 : 31, 1984); pouze vektor, který obsahoval gen MFé mezi genem LEU2 a amp^r nesl funkční LEU2 gen, který komplementoval po transformaci hostitelského kmene S. cerevisiae GRF18 (Λ his3 leu2~) Jeho leu2 mutantní alelu. Oba typy orientací bylo možné odlišit pomocí restrikčního Štěpení Pstl, Dobře odlišitelný od ostatních možností je vektor, ve kterém je MFd vložen vhodným způsobem vně LEU2 genu v orientaci znázorněné na obr. 2. V tomto případě nevznikají Pstl fragmenty středních velikostí, nýbrž pouze velký fragment cca 5,9 kbp a dva malé fragmenty cca o,8 a o,7 kbp. Plasmid tohoto typu byl získán — pJDBct (obr. 2).

Byla prověřena a potvrzena funkce všech důležitých sekvencí na plasmidu pJDBA; ori a amp^r pomocí transformace E. coli; LEU2 a 2yU ars pomocí transformace S. cerevisiae.

Navíc byly transformanty GRF18 testovány na nadprodukci -faktoru zonálním testem, který je založen na skutečnosti, že růst buněk S. cerevisiae pérovacího typu a je inhibován Ο-faktorem produkovaným buňkami typu A. Zonální test byl proveden následujícím způsobem: o,l ml suspenze stacionárních buněk S. cerevisiae AH215 (a his3”leu2*) bylo naneseno na povrch minimální agarové plotny s histidinem a leúčinem (5o yug/ml). Na tento podklad byly dále naneseny testované klony S. cerevisiae GRF18 a plotny byly inkubovány při 3o °C 3 až 4 dny. Kolem klonů GRF18 transformovaných vektorem pJDB se na podkladu AH215 objevila ínhibiční zóna, což svědčí o nadprodukci d-faktoru těmito klony. Kolem rodičovského kmene GRF18 detegovatelná zóna nebyla zjištěna.

Stabilita vektoru pJDBOÍ :

Stabilita expresně-sekrečního vektoru pJDBd v hostitelském kmenu S« cerevisiae GRF18 byla testována následujícím způsobem:

Kolonie S. cerevisiae GRF18/pJDB narostlé na selektivním minimálním agarovém médiu s histidinem (5o yUg/ml) (MA-his) byly resuspendovány v destilované vodě a vysety na neselektivní minimální agarové médium s histidinem a leucinem (5o yug/tnl) (MA-his, leu). Jednotlivé kolonie byly odebrány, resuspendovány v destilované vodě, počítáním v komůrce byl stanoven počet buněk a neředěná suspenze byla opět vyseta na MA-hisJeu médium. Jednotlivé kolonie byly testovány na schopnost růst na MA-his bez přítomnosti leucinu. Frakce kolonií, která na MA-his médiu nenarostla, byla cca 7 %.

Protože na jednu kolonii připadá asi lo^ buněk, které vzniknou z jedné buňky přibližně za 2o generací, lze uzavřít, že za 2o generací ztratí vektorovou DNA asi 7 % buněk.

Příklad 2

Klonování cDNA genu pro telecí prochymosin a kontrukce plasmidových derivátů pJDBaCH a pJDBOLCHE

Gen pro telecí prochymosin byl k dispozici jako součást plasmidu p424 (Sedláček et al., Folia Biologica (Praha), 33 : 145, 1987), ve kterém je vložen od páté aminokyseliny do polylinkeru HíndlII-Pstl-SalI-BamHI - prochym-Pstl-SalI-BamHI-Smal-EcoRI v orientaci BamHI-Pstl, viz obr. 3. Prochymosinový gen bylo možné vložit substitučním způsobem do vektrou pJDBd. výměnou za Hind III—Sall fragment. Ze sekvencí obou genů však vyplývá, že takto vložený' prochymosinový gen není ve správné translační fází se sekrečnf sekvencí MF , viz obr. 3. Proto bylo třeba rozdělit postup konstrukce na dva kroky.

V prvním byl in vitro rekombinován vektro pJDBd, ze kterého byl vystřižen krátký úsek pomocí HindlII a Sáli (cca 5 ^Ug DNA vektoru pJDBO, bylo štěpeno 5 jednotkami HindlII a Sáli; Maniatis et al. , Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982) s prochymosinovým fragmentem HindHI-Sall připraveným následujícím způsobem :

I

CS 27o7o3 Bl

a) plasmid p424 (cca lo /Ug) byl nejprve parciálně štěpen Sáli (lo jednotek) a lineární forma byla po elektroforetlckém rozdělení (o,8% agaroeový gel) izolována z gelu elektroelucí,

b) Izolované íragmenty byly Štěpeny HindlII (cca 5 jednotek), rozděleny elektroforesou v o,8% agarosovém gelu a fragment HindlII—Sail nesoucí prochymosinový gen byl izolován opět elektro— elucí. Vektor pJDBa. Štěpený HindlII a Sáli (cca 5o ng) a HíndlII-SalI fragment obsahující prochymosinový gen (cca loo ng) byly ligovány T4—DNA ilgasou (o,l jednotky) při 15 °C 6 h. Ligační směsí (cca 5o ng) byly transformovány bakterie E. coli HBlol a transformanty selektovány na základě amp^r na ŽA-amp médiu. Z jednotlivých transformovaných klonu narostlých pře· noc v ŽB-imp médiu při 37 °C v termostatu byly izolovány plasmidy (Holmes a Quigley, AnaL Biochem. 114 t 193, 1981) a jejich velikost byla porovnána eiektroíoreticky s velikostí výchozího vektoru pJDBa. Plasmidy větSÍ než vektor pJDBa byly dále charakterizovány Štěpením pomocí restrlkčních endonukleas EcoRI, HindlII, Pstl, Sall, Smál a BamHL Předpokládaný konstrukt pJDBa CH ae od výchozího vektoru pJDBO. liší takto ;

a) obsahuje navíc Smál, 3 BatnHI, 1 EcoRI, 1 Sall a 2 Pstl místa uvnitř prochymosinového fragmentu

b) je celkově větší o cca 1,13 kbp

c) Po štěpení Sáli se z vektoru pJDBaCH vyštěpuje fragment obsahující prochymosinový gen, který velikostně odpovídá Salt—HindIII prochymosinovému fragmentu použitému pro klonování. Druhý fragment po štěpení Sáli velikostně odpovídá lineární formě výchozího plasmidu pJDBa..

d) Po štěpení Pstl vzniká navíc fragment velikosti téměř odpovídající Hindlil-Sali prochymosinovému fragmentu (o 87 bp kratší).

V druhém kroku byl izolován amplifikovaný vektor pJDBaCH z E. coli (Maniatia et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,· 1982) a posun fáze trahslace byl proveden následujícím způsobem s pJDBfitCH (cca 1 /Ug) býl linearlzován pomocí HindlII (1 jednotka) a koheslvní 5* konce byly doplněny in vitro pomocí Klenowova fragmentu DNA polymerasy 1 (1 jednotka). Ligace cca 3o ng takto připravené plasmidové DNA T4—DNA ligasou (1,5 jednotky) probíhala v re akčním objemu lo yul pří 26 °C 8 h. Llgační směsí (cca 5o ng) byly transformovány buXky E. coli a byly selektovány smp^r klony na ŽA-amp médiu. Z jednotlivých klonů narostlých přes noc v ŽA-amp médiu pří 37 °C v termostatu byly izolovány plasmidy (Holmes a Quigley, Anal. Biochem. 114 í 193, 1981) a štěpeny restrlkční endonukleaaou HindlII. Po elektroforetické analýze byly vybrány tři izoláty, u kterých nedošlo k linearizaci plasmidové DNA působením HindlII, které tedy neobsahovaly HindlII restrikční místo - pJDBaCHE. Jejich struktura byla dále ověřena restrlkčnfm štěpením (EcoRI, Sáli, Pstl, BamHI, Smál). Takto vzniklý vektor pJDBa C HE se restrikčně Uší od vektoru pJDBccCH pouze nepřítomností HindlII místo.

Dále byla prověřena a potvrzena funkce všech důležitých sekvencí na vektorech -pJDBaCH a pJDBotCHE ; ori, amp¹, LEU2 a 2/U ars v obou hostitelích E. coli a S. cerevislae, viz příklad 1.

Příklad 3

Transformace S. cerevisiae rekomblnantním vektorem pJDBaCHE a sekreční produkce telecího chymosínu.

Jako hostitelský kmen pro transformaci vektorem pJDBaCHE byl použit kmen S. cerevisiae

GRFlfl (a his3~leu2^-). Transformace byla provedena dvojím způsobem :

a) Transformace protoplastů GRF18 v přítomnosti ^CaC1 ₂ ° PEG4ooo modifikovaným způsobem podle Xin-Liang Zhu et al., (Mol. Cen. Genet. 194 t 31, 1984).

Kultura S. cerevisiae GRF18 narostlá do exponenciální fáze v YEG kultivačním médiu (1 % glukosa. o,5 % yeast extract) byla centrifugována, promyta destilovanou H₂O a inkubo

CS 27o7o3 Bl vána 15 min v 1% β—mercaptoethanolu/HgO při laboratorní teplotě. Buňky byly dále promyty 1M sorbitolem a inkubovány v čerstvě připraveném roztoku zymolyaay (o.l mg zymolyasy/lo ml 1M sorbitolu). Kontrola tvorby protoplastů byla průběžně prováděna mikroskopicky. Protoplast/ byly promyty 1M sorbitolem a STC roztokem (1M sorbitol, lo mM Tris—HC1 pH 7,5, lo mM CaCi ) a nakonec resuspendovány v STC do výsledné koncentrace cca lo protoplastů / ml. K 2oo yul suspenze protoplastů v STC bylo přidáno cca 5 yug plasmidové DNA a po 15 min inkubace při laboratorní teplotě 2 ml PTC roztoku (4o % PEG4ooo, lo mM Tris-HCl pH 7,5, lo mM CaClg). Směs byla inkubována 3o min při laboratorní teplotě, centrifugována a sedimentované protoplasty resuspendovány v STC. Různě neředěná transformační směs, ke které byl přidán regenerační agar (3 % agar, o,3 M CaClg) vytemperovaný na 45 °C, byla vyseta ne. podklad selektivního osmoticky stabilizovaného (o,6 M KC1) minimálního agarového média obsahujícího histidin (So yug/ml) a kultivována při 3o °C 7 až 9 dní. U narostlých klonů byla testována auxotrofie na histidin. Frekvence transformace byla průměrně lo”⁴ transformant.

b) Transformace kompetentních buněk GRF18 připravených pomocí LiCl (Rodriguez a Tait, Recombinant DNA Techniques : An Introduction, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., London, Amsterdam, Don Mills Ontario, Sydney, Tokyo, 1983).

Kultura S. cerevisiae GRF18 narostlá v YEG médiu do O.D.g_4o » 1,5 až 2 byla centrifugována, resuspendována v TE pufru (lo mM Tris-HCl pH 7,5, o,l mM EDTA) & znovu centrifugo vána. Buňky byly resuspendovány v LA roztoku (o,l M lithium acetát, lo mM Tris-HCl pH 7,5, o,lmM EDTA) a inkubovány aerobně 6o min při 3o °C. Po centrifuged byly buňky resuspendovány v LAG roztoku (o,l M lithium acetát, lo mM Tris-HCl pH 7,5, o,l mM EDTA, 15 % glyce— rol) do výsledné koncentrace 2 až 5. lo buněk/ml. K o,3 ml suspenze bylo přidáno 5 až lo yug vektorové DNA, o,7 ml 5o % PEG4ooo a promíchaná směs byla inkubována 6o min při 3o °C a 5 min při 42 °C. Transformační směs byla pak vyseta na povrch selektivního minimálního agarového média s histidinem (5o yUg/ml) a inkubována při 3o °C cca 7 dní. Narostlé klony byly testovány na auxotrofii k histidinu. Frekvence transformace byla průměrně lo?.

pJDB(tCH/GRF18 transformanty byly testovány na schopnost produkovat funkční chymosin pomocí testu srážení mléka („milk-clotting”). Standardní provedení „milk-dotting testu” :

K 5 yul suspenze mléka (25o mg odtučněného Eliga rozpuštěného v o,l M CaClg) se přidá 5 yul různě ředěného testovaného vzorku a inkubuje se 2 h při 37 °C, nesražené mléko se odstraní filtračním papírem. V kontrolním experimentu s preparátem chymosinu (Serva) bylo potvrzeno, že v souladu s literárními údaji (Mellor et al., Gene 24 i 1, 1983) k tvorbě sraženiny dochází ještě ve vzorku obsahujícím cca o,o3 yug chymosinu.

Testován byl jednak pufr, ve kterém byly předem resuspendovány buňky S. cerevisiae GRF18 transformované pJDBitCHE, narostlé na agarové plotně, jednak tekuté postkultivační médium, viz tabulka 2. Jako kontroly byly použity klony GRF18 transformované pJDBaCH nebo pJDBct a rodičovský kmen GRF18. Pozitivní výsledek byl zaznamenán pouze v případě, kdy byl použit pufr nebo médium po kultivaci kmene pJDB CHE nebo kontrolní preparát telecího chymosinu (Serva), viz tabulka 1.

s

CS 27o7o3 Bl

Tabulka 1

Výsledky „milk-clotting testu

	pevné médium	tekuté médium
... his MA—, leu	sladina	MM-CA	YEPG
GRF18	—	—	—
pJDBa/GRF18	-	-	•	-
pJDBctCH/GRF18	-	-	-	-
pJDB«.CH/GRF18	+	+	4·	+

MA minimální agarové médium s 1% glukosou a histidlnem (5o yug/ml), v případ?

kmene GRF18 navíc s leucinem (5o yUg/ml)

MM—CA minimální médium s 2% glukosou a casamíno acids (o,5%)

YEPG komplexní médium (2% glukosa, 1 % yeast extrakt, 1 % pepton)

Testované klony byly odebrány z jednotlivých ploten a resuspendovány v 5o yul TM pufru (lo mM Tris—Cl, pH 6,5, lo mM MgCl^). Po centrlfugaci byly 5 yUl vzorky supematantu použity pro „milk-clotting test.

Dále bylo zjišťováno, zda je „milk-clotting aktivita vzorku inhibovatelná peps latinem nebo PMSF, Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Výsledky „milk-clotting testu + peps latin + PMSF

pJDBA/GRF18			-
pJDB«.CH/GRF18 .		-	-
pJDBaCHE/GRF18	+	—	4-
chymosin (Serva)	+	-	+

P říklad 4

Klonování syntetického genu nebo cDNA opatřené syntetickými přídatnými sekvencemi v pJDB a produkce proteinu sekretovaného do média

Příklad zajištění sekrece chymosinu pomocí vektoru pJDB , viz příklad 3, představuje jeden z nejjednodušeji řešitelných případů vkládání cizorodého genu za signální sekvenci MF , neboť* stačí zařadit prochymosinový gen do správné transiační fáze. Odstranění prosekvence prochymosinu zde totiž probíhá autokatalyticky (při pH média = 5), a to nezávisle na proteasových aktivitách sekrečního systému S. cerevisiae. Tato možnost se ovšem nabízí jen u některých polypeptidů a popsaný postup (viz příklad 2 a 3) nelze tedy aplikovat obecně na zajištění sekrece Jakékoliv cizorodé bílkoviny.

V této kapitole popisujeme na příkladu zajištění sekrece lidského epidermálního růstového faktoru (hEGF) způsob konstrukce umožňující sekreci produktu jakéhokoliv synteticky přípravě

CS 27o7o3 Bl veného genu pomocí signální sekvence genu MEH, Kontrukce vyžaduje, aby byl synteticky gen, začínající kodónem pro první aminokyselinu funkčního produktu a končící terminačním kodónem, nastaven krátkými sekvencemi na obou stranách. Na obr, 4 jsou znázorněny obecně použitelně přídatné sekvence, která zajistí snadné vkládání syntetické DNA do správné translační fáze za signální sekvenci MFU, a to substitucí za Hind HI—Sáli fragment vektoru pJDB . Kromě toho úvodní přídatná sekvence obsahuje bezprostředně před prvním kodónem cizorodého genu sekvenci determinující Lys-Arg nebo Arg-Arg - cílové místo pro velmi výkonný proteasový systém S. cerevisiae kódovaný genem KEX2. Tato proteasa zajistí účinnou sekreci funkčního proteinu do média.

Obr. 4 i Příklad přídatné sekvence zajištující vložení syntetického genu pro hEGF do vektoru pJDBct a sekreci funkčního produktu do média

KEX2

Ala Trp	Lys	Arg'	Asn	Ser
a GGT TGG	AAA	AGA	AAT	Tea
'AjCC	TTT	TCT	TTA	AGG

HindlII přídatná sekvence I.

kódu jící .sekvence genu hEGF·

Arg	Term
. CTG	TAA ©
. GAG	ATT jCAGCT

Sáli

II.

Obdobným způsobem lze připojovat i cizorodé geny o známé sekvenci. Použitím vhodné restrikční endonukleasy se oddělí co nejkratší úvodní část genu a nahradí se syntetickým nástavcem obsahujícím přídatnou sukvenci I, viz obr. 4, a scházející část genu. Na druhý konec se připojí krátký adaptér končící Sáli místem, obdoba přídatné sekvence II, viz obr. 4, Poznámka:

V některých případech je výhodné použít místo přídatné sekvence II_t viz obr. 4, sekvenci obsahující HindlII, potom lze cizorodou DNA substituovat HindΙΠ—HindIII fragment MFa,, viz obr. 1. Tento způsob vložení cizorodého genu umožňuje odlišení klonů transformovaných rekombinantní DNA od klonů transformovaných recyklisovaným vektorem, neboř pouze tyto klony produkují naveliko Λ-faktor, jsou tudíž detegovatelné způsobem popsaným v příkladu 1.

Claims (6)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1.

   Způsob sekreční produkce cizorodých proteinů kultivací transformovaných kvasinkových buněk Saccharomyces cerevisiae, vyznačující se tím, že kvasinková buňka se transformuje deriváty obojetného vektoru pJDBft, nesoucího kombinaci kódujících sekvencí s genem pro kvasinkový d-faktor - MF», přičemž kombinace sekvencí je následující

   - sekvence zajištující replikaci vektoru v bakteriích Escherichia eoli,

   - sekvence zajištující replikaci vektoru v kvasinkách S. cerevisiae,

   - sekvence zajištující selekci transformovaných klonů E. eoli na základě amp^r a

   - sekvence zajištující selekci transformovaných klonů S. cerevisiae leu2~ na základě komplementace leu2 mutace a transformované buňky se kultivují a sekretují funkční chymosin do média.

   lo CS 27o7o3 Bl
2. 2.

   Způsob sekreční produkce podle bodu 1, vyznačující se tím, že deriváty vektoru pJDBa. obsahují cizorodou kódující sekvenci vloženou do MFa genu ve vektoru pJDBa,
3. 3.

   Způsob sekreční produkce podle bodu 1 a 2, vyznačující se tím, že deriváty vektoru pJDBa. označené pJDBdCH a pJDBaCHE obsahují sekvenci genu pro telecí prochymosin připojenou za signální sekvenci MF«. ve vektoru pJDBa.
4. 4.

   Způsob sekreční produkce podle bodu 1 až 3. vyznačující se tím, že derivát vektoru pJDBa. označený pJDBaCH obsahuje prochymosinovou sekvenci připojenou ve správné translační fázi za signální sekvenci MFa a zajištující expresi a sekreci funkčního chymosinu v kvasinkové buňce S. cerevisiae. '
5. 5.

   Způsob sekreční produkce podle bodu 1 až 4, vyznačující se tím, že kvasinkové buňky S. cerevisiae transformované pJDBttCHE produkují a sekretují funkční chymosin do média.
6. 6.

   Způsob sekreční produkce podle bodu 1. vyznačující se tím, že cizorodé kódující sekvence jsou připojeny do vektoru pJDBa za sekvenci kódující aminokyseliny rozpoznávané KEX2 proteasovým systémem S. cerevisiae.