CS269496B1

CS269496B1 - Method of ferment hydrolysates production from milky raw materials

Info

Publication number: CS269496B1
Application number: CS887818A
Authority: CS
Inventors: Vladimir Ing Csc Husek
Original assignee: Husek Vladimir
Priority date: 1988-11-28
Filing date: 1988-11-28
Publication date: 1990-04-11
Also published as: CS781888A1

Abstract

Řešení se týká způsobu výroby enzymových hydrolyzátů z mléčných surovin obsahujících bílkoviny mléka, syrovátky a/nebo kasinu a jejich solí se sodíkem, draslíkem, vápníkem, hořčíkem a s amonnými ionty nebo s anionty jako jsou chloridy, sírany, fosfáty, octany, citráty, mravenčeny, k proteolýze se použijí preparáty proteolytických enzymů včetně syřidel charakteru aspartátových proteas jako je vepřový, drůbeží a hovězí pepsin a proteasy z plísní, neutrální bakteriální metaloproteas, pro hydrolýzu syrovátkových bílkovin a jejich směsí s kaseinem s výjimkou odstředěného mléka též trypsin, chymotrypsin a jejich směsi včetně tkáňových homogenátů. Vynález má využití v potravinářství, krmivářství a v biotechnologii .The present invention relates to a process for the production of enzyme preparations hydrolysates from dairy raw materials protein milk whey and / or casino and their sodium salts, potassium, calcium, magnesium, and ammonium ions or with anions such as chlorides, sulfates, phosphates, acetates, citrates, formates, preparations are used for proteolysis proteolytic enzymes including rennets character of aspartic proteases such as pork, poultry and beef pepsin and fungal proteases, neutral bacterial metalloproteases, for whey hydrolysis proteins and mixtures thereof with casein s except for skimmed milk, trypsin, chymotrypsin and mixtures thereof including tissue homogenates. The invention has utility in food industry, feed industry and biotechnology .

Description

CS 269 496 Bl 1CS 269 496 B1 1

Vynález se týká způsobu výroby enzymových hydrolyzátů z mléčných surovin tak, žek enzymové hydrolýze substrátů obsahujících bílkoviny mléka, syrovátky a/nebo kasein ajejich soli s kationty, jako je sodík, draslík, vápník, hořčík nebo amonné ionty, nebos anionty, jako jsou chloridy, sírany, fosforečnany, octany, mravenčany a citrany, sepoužijí preparáty proteolytických enzymů včetně syřidel, obsahující jako hlavní enzy-movou aktivní složku vepřový, drůbeží a nebo hovězí pepsin, aspartátové proteasy zplísní, neutrální bakteriální metaloproteas, pro hydrolýzu syrovátkových bílkovin ajejich směsí s kaseinem výjimkou odstředěného mléka též trypsin, chymotrypsin a jejichsměsi vzniklé izolací z živočišných tkání nebo obsažené v jejich homogenátech, enzymo-vá hydrolýza se provádí v roztoku a nebo v suspenzi bílkovinných substrátů při pH 1až 6,8, přednostně při pH 1 až 4 při použití pepsinů a ostatních aspartátových proteasa při pH 5 až 10 v případě metaloproteas a serinových proteas trypsinu a chymotrypsinu,s výhodou při pH 6,5 až 9 a při teplotě 20 až 60 °C, přednostně při teplotě 30 až 50 °Ctekuté hydrolyzáty mohou sloužit k dalšímu použití bud přímo, nebo mohou být ošetřenyultrafiltrací, ultraosmosou, mikrofiltrací a/nebo tepelně, mohou být dále koncentrová-ny reversní osmosou a/nebo odpařováním a sušeny bud přímo, nebo po tomto předběžnémošetření.BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to a process for the preparation of enzyme hydrolysates from milk raw materials, such as enzymatic hydrolysis of substrates containing milk, whey and / or casein proteins and their cationic salts such as sodium, potassium, calcium, magnesium or ammonium ions, since anions such as chlorides sulphates, phosphates, acetates, formates and citrates will use proteolytic enzyme preparations, including rennets, containing porcine, poultry and bovine pepsin, aspartic proteases, neutral bacterial metalloproteases, for hydrolysis of whey proteins and their casein mixtures except as the main enzyme active ingredient skimmed milk also includes trypsin, chymotrypsin and mixtures thereof formed by isolation from animal tissues or contained in their homogenates, the enzymatic hydrolysis is carried out in solution or in a suspension of protein substrates at pH 1 to 6.8, preferably at pH 1 to 4 using pepsins andother aspartic proteases at pH 5 to 10 in the case of metalloproteases and serine proteases of trypsin and chymotrypsin, preferably at pH 6.5 to 9 and at 20 to 60 ° C, preferably at 30 to 50 ° C either directly or by treatment with ultrafiltration, ultrasonic, microfiltration and / or heat, they can be further concentrated by reverse osmosis and / or evaporation and dried either directly or after this preliminary treatment.

Dosud se k přípravě enzymových hydrolyzátů bílkovin izolovaných z mléka ve forměčistých frakcí nebo skupin bílkovin, jako je kasein, používá též drahých a nedostatkovýchproteas taktéž v přečištěném stavu. Ani čisté substráty ani přečištěné enzymy nejsouvždy dostupné v dostatečném množství a musí být dováženy. Přitom pro řadu technickýchi potravinářských aplikací, včetně biotechnologií, nebo pro krmivářství postačují hy-drolyzáty nefrakcionovaných bílkovin preparáty proteolytických enzymů běžně dostupnýchz domácích zdrojů a nebo ve formě levných syřidlových preparátů.Until now, the preparation of enzyme hydrolysates of proteins isolated from milk in the form of pure fractions or groups of proteins, such as casein, also uses expensive and deficient proteases in a purified state. Neither pure substrates nor purified enzymes are always available in sufficient quantities and must be imported. At the same time, for many technical food applications, including biotechnology, or for feed, hypholysates of unfractionated proteins are sufficient to prepare proteolytic enzyme preparations commonly available from home sources or in the form of cheap rennet preparations.

Uvedené nevýhody odstraňuje způsob výroby enzymových hydrolyzátů z mléčných surovinpodle vynálezu tak, že k enzymové hydrolýze substrátů obsahujících bílkoviny mléka, sy-rovátky a/nebo kasein a jejich soli s kationty, jako je sodík, draslík, vápník, hořčíknebo amonné ionty, nebo s anionty, jako jsou chloridy, sírany, fosforečnany, octany,mravenčany a citrany, se použijí preparáty proteolytických enzymů, včetně syřidel obsa-hujících jako hlavní enzymovou aktivní složku vepřový, drůbeží a/nebo hovězí pepsin, aspar-tátové proteasy z plísní, neutrální bakteriální metaloproteasy, pro hydrolýzu syrovátkovýchbílkovin a jejich směsí s kaseinem s výjimkou odstředěného mléka též trypsin a jejich smě-si vzniklé izolací z živočišných tkání, nebo obsažené v jejich homogenátech, enzymová hy- *drolýza se provádí v roztoku nebo v suspenzi bílkovinných substrátů při pH 1 až 6,8, před-nostně při pH 1 až 4,4, při použití pepsinů a ostatních aspartátových proteas a při pH 5až 10 v případě metaloproteas a serinových proteas trypsinu a chymotrypsinu, s výhodoupři pH 6,5 až 9 a při teplotě 20 až 60 °C, přednostně při teplotě 30 až 50 °C, tekutéhydrolyzáty mohou sloužit k dalšímu použití bud přímo, nebo mohou být ošetřeny ultra-filtrací-ultraosmosou, mikrofiltrací a/nebo tepelně, mohou být dále koncentrovány re-versní osmosou a/nebo odpařováním a sušeny bud přímo, nebo po tomto předchozím ošetře-ní .The above drawbacks are avoided by the process for producing enzymatic hydrolysates from dairy raw materials according to the invention such that for enzymatic hydrolysis of substrates containing milk proteins, syrups and / or casein and their salts with cations, such as sodium, potassium, calcium, magnesium or ammonium ions, or with anions such as chlorides, sulphates, phosphates, acetates, formates and citrates, preparations of proteolytic enzymes, including rennets containing porcine, poultry and / or bovine pepsin, aspartate proteases from fungi, neutral bacterial metalloproteases, are used , for the hydrolysis of whey proteins and their mixtures with casein, with the exception of skimmed milk, also trypsin and mixtures thereof formed by isolation from animal tissues, or contained in their homogenates, enzyme hydrolysis is carried out in solution or suspension of protein substrates at pH 1 to 6.8, preferably at pH 1-4 4, using pepsins and other aspartic proteases and at pH 5 to 10 in the case of metalloproteases and serine proteases trypsin and chymotrypsin, preferably pH 6.5 to 9 and at 20 to 60 ° C, preferably 30 to 50 ° C the liquid hydrolysates can be used either directly or ultra-ultra-ultrasonic, microfiltration and / or thermally treated, can be further concentrated by reverse osmosis and / or evaporation and dried either directly or after this prior treatment .

Vynález má využití v, potravinářství, pro speciální účely výživy i v medicíně,pokud preparáty budou podávány s jinými potravinami nebo přímo při výživě sondou, dálev biotechnologii. Při hydrolýze může být použita i směs enzymů, nebo může po sobě ná-sledovat ošetření různými enzymy uvedenými v popisu vynálezu. 2 CS 269 496 B1 Příklad 1The invention has utility in, food, special nutritional purposes, and in medicine when administered with other foods or directly through tube feeding, further in biotechnology. A mixture of enzymes may also be used in hydrolysis, or may be followed by treatment with the various enzymes described in the specification. 2 EN 269 496 B1 Example 1

Odstředěné pasterované mléko, nebo ošetřené jiným způsobem, jako je sterilace nebo UHTohřev, se podrobí enzymové hydrolýze syřidlovými preparáty, obsahujícími jako hlavnísložku vepřový, drůbeži a/nebo hovězí pepsin, nebo aspartátové proteasy z plísní, jakoje Rhizomucor, Mucor a/nebo Endothia, používaných běžné také k výrobě syřídel. Substrátse vytemperuje na teplotu 20 až 50 °C, výhodně na 48 °C, při této teplotě se přidá pre-parát jednoho z uvedených aspartátových enzymů. Reakění směs se promíchává pomaloběž-ným michadlem, dávka enzymu se volí podle jeho aktivity vyjádřené např. v Soxhletovýchnebo pepsinových jednotkách a podle požadovaného stupně hydrolýzy, který se určí stanove-ním rozpustných dusíkatých látek v trichloroctové kyselině, nebo se produkty hydrolýzystanoví spektrofotometricky v trichloroctovém filtrátu. Po hydrolýze, obvykle za 5 až24 hodin, se pH upraví na pH 6,5 až 7, oddělí se případně vzniklé nerozpustné částice,např. odstředěním, hydrolyzát se podrobí mikrofiltraci. Pro účely výživy lze hydrolyzá-ty vyráběné podle vynálezu dodatečně ošetřit účinkem peptidas. Vznik solí při úpravě pHběhem výroby hydrolyzátů se řídí použitím kyselin, jako je sírová,chlorovodíková, fosforečná, citrónová, mravenčí, octová a mléčná, čímž vznikají i příslušné soli bílkovin, ná-slednou úpravou pH hydroxidy, jako je hydroxid sodný, draselný, vápenatý, hořečnatý aamonný, vznikají v hydrolyzátů i volné soli těchto kyselin a zásad, které pro další po-užití nejsou na závadu, často jsou obsaženy např. v živných médiích pro fermentaci růz-ných mikroorganismů.Skimmed pasteurized milk, or treated by other means, such as sterilizing or heating, is subjected to enzymatic hydrolysis with rennet preparations containing as main constituent pork, poultry and / or bovine pepsin, or aspartic proteases from mold, such as Rhizomucor, Mucor and / or Endothia used also common for the production of shafts. The substrate is brought to a temperature of 20 to 50 ° C, preferably to 48 ° C, at which temperature one of said aspartic enzymes is added. The reaction mixture is mixed with a slow-running stirrer, the dose of enzyme is chosen according to its activity expressed, e.g. . After hydrolysis, usually 5 to 24 hours, the pH is adjusted to a pH of 6.5 to 7, the optionally formed insoluble particles are separated, e.g. by centrifugation, the hydrolyzate is subjected to microfiltration. For nutritional purposes, the hydrolysates produced according to the invention can be additionally treated with peptidas. The formation of salts by pH adjustment during the production of the hydrolysates is controlled by the use of acids such as sulfuric, hydrochloric, phosphoric, citric, formic, acetic and lactic, thereby forming the corresponding protein salts, subsequently adjusting the pH with hydroxides such as sodium, potassium, calcium. Magnesium and ammonium, the free salts of these acids and bases are formed in the hydrolysates, which are not detrimental to further use, often contained, for example, in nutrient media for fermentation of various microorganisms.

Jako tepelné ošetření hydrolyzátů před mikrofiltraci, po ni nebo jako samostatného ošetře-ní se použije např. vysoká pasterace při 95 °C s výdrží 30 minut nebo sterilační záhře-vy, např. 120 až 140 °C, s výdrží 20 až 30 minut, pro speciální účely opakovaně, nebo sehydrolyzáty mohou ošetřit ultratepelným ohřevem UHT, např. 140 °C, s výdrží 3 až 10 sekundPříklad 2 Příklad podle bodu 1 s tím, že se hydrolyzát podrobí ultrafiltraci, nebo ultraosmose.For example, high temperature pasteurization at 95 ° C for 30 minutes or sterilizing heat, eg 120 to 140 ° C, with a duration of 20 to 30 minutes is used as heat treatment of the hydrolysates before, after, or as a separate treatment. for special purposes repeatedly, or the hydrolysates can be treated with ultra-thermally heated UHT, e.g. 140 ° C, with a duration of 3 to 10 seconds. Example 2 Example 1, wherein the hydrolyzate is subjected to ultrafiltration or ultra-osmosis.

Další použití mají jak permeát, tak koncentrát. Permeáty obsahující nízkomolekulárnípeptidy a volné aminokyseliny mohou být využity v biotechnologii, včetně přípravy tká-ňových kultur, koncentráty v biotechnologii, ke krmeni a pro výživu. Příklad 3 Příklad podle bodu 1 a 2 s tím, že se pro enzymovou hydrolýzu použije přímo fermentač-ní tekutina po oddělení mycelia a koncentraci ultrafiltraci, vzniklá při výrobě aspartá-tových plísňových proteas. Přiklad 4 Výchozím substrátem je mléko, obnovené, zahuštěné odstředěné mléko, obsah bílkovin vsubstrátu činí 3,5 až 20 % hmotnostních. Po úpravě pH na hodnotu 7 až 7,5 se k hydro-lýze při 45 °C použijí metaloproteasy ; Bacillue megatherium nebo jiného druhu neeporu-lujících druhů a mutant Bacillů. Může se výhodně použít též hrubě přečištěné fermentačnímédium, např. po odstředění, případně ještě zkoncentrované ultrafiltraci. Příklad 5 K enzymové hydrolýze se použije zahuštěné odstředěné mléko na 20 až 30 %, které se pro-teolyzuje trypsinem, chymotrypsinem, nebo pankreatickými homogenáty při pH 7, upravenonapř. NaOH nebo NH^OH. CS 269 496 B1 3 Přiklad 6Other uses have both permeate and concentrate. The permeate containing low molecular weight peptides and free amino acids can be used in biotechnology, including tissue culture preparation, biotechnology concentrates, feed and nutrition. EXAMPLE 3 Example 1 and 2, except that the fermentation fluid used for the enzymatic hydrolysis after separation of the mycelium and the concentration of ultrafiltration produced in the production of aspartic fungal proteases is used. Example 4 The starting substrate is milk, restored, thickened skimmed milk, the protein content of the substrate is 3.5 to 20% by weight. After adjusting the pH to 7 to 7.5, metalloproteases are used for hydrolysis at 45 ° C; Bacillue megatherium or other species of non-resistant Bacillus species and mutants. It is also advantageous to use coarsely purified fermentation broth, e.g. after centrifugation, optionally further concentrated by ultrafiltration. EXAMPLE 5 A concentrated skimmed milk of 20-30% is used for enzymatic hydrolysis, which is hydrolysed by trypsin, chymotrypsin, or pancreatic homogenates at pH 7, e.g. NaOH or NH 4 OH. EN 269 496 B1 3 Example 6

Enzymová hydrolýza se provede podle bodu 5 s tím rozdílem, že jako substrát slouží tva-roh a/nebo thermotvaroh. Příklad 7The enzymatic hydrolysis is carried out according to step 5, except that the horn is used as a substrate and / or thermotvaroh. Example 7

Substrát je shodný jako v bodě 6, použije se k hydrolýze aspartátových proteas, pepsi-nú nebo z plísní- pH se upraví kyselinou fosforečnou na pH 1,6, další ošetření hydro-lyzátu je obdobné jako v bodech 1 a 2. Produkty se podrobí sušení lyofilizací pro la-boratorní účely, pro běžné použití sprejově.The substrate is the same as in point 6, it is used for hydrolysis of aspartic proteases, pepsin or from mold - pH is adjusted to pH 1.6 with phosphoric acid, further treatment of the hydrolysate is similar to that of points 1 and 2. drying by lyophilization for laboratory purposes, for general use by spray.

Pokud je potřebné snížit ve výrobku obsah zbytkové laktózy nebo kyseliny mléčné, mo-hou se substráty těchto složek zbavit před hydrolýzou propráním vodou. Přiklad 8If it is necessary to reduce the residual lactose or lactic acid content of the product, the substrates of these components can be washed off with water before hydrolysis. Example 8

Způsob hydrolýzy podle vynálezu popsaný v bodě 7 s tím, že se substrát upraví pomocíNaOH na pH 7 a k hydrolýze se použije serinových proteas trypsinu nebo chymotrypsinu ajejich směsí. Příklad 9The hydrolysis process of the present invention described in claim 7, wherein the substrate is adjusted to pH 7 with NaOH and serine trypsin or chymotrypsin proteases and mixtures thereof are used for hydrolysis. Example 9

Jako substrát se k hydrolýze použije koprecipitát nebo koncentrát veškerých bílkovinmléka, získaný např. ultrafiltrací. V rozsahu pH 1 až 5 se k hydrolýze použijí aspartátové proteasy, např. drůbeží pep-sin. V rozsahu pH 7 až 7,5 metaloproteasy bakteriálního původu nebo serinové proteasy. Příklad 10As a substrate, a coprecipitate or a concentrate of all protein powders obtained by, for example, ultrafiltration is used for hydrolysis. In the range of pH 1 to 5, aspartic proteases, e.g. poultry peppers, are used to hydrolyze. In the pH range of 7 to 7.5 metalloproteases of bacterial origin or serine protease. Example 10

Kasein se suspenduje ve vodném roztoku tak, aby výsledný obsah bílkovin odpovídal 10 %hmotnostním pro hydrolýzu aspartátovými proteasami, jako je hovězí pepsin nebo proteasaz plísní Rhizomucor, se pH upraví kyselinou fosforečnou na pH 1, proteolýza se provádípři teplotě 45 °C po dobu 20 hodin, pak se upraví pH pomocí NH^OH, hydrolyzát se podro-bí mikrofiltraci a použije se jako bílkovinný hydrolyzát v biotechnologii. Příklad 11The casein is suspended in an aqueous solution so that the resulting protein content is 10% by weight for hydrolysis by aspartic proteases such as bovine pepsin or Rhizomucor mold proteasase, the pH is adjusted to pH 1 with phosphoric acid, proteolysis is carried out at 45 ° C for 20 hours then the pH is adjusted with NH 4 OH, the hydrolyzate is subjected to microfiltration and used as a protein hydrolyzate in biotechnology. Example 11

Sušené odstředěné mléko se obnoví na sušinu 5 až 15 %; pH se upraví kyselinou fosfo-rečnou nebo chlorovodíkovou a k hydrolýze se použije drůbeži pepsin. Hydrolýza probí-há při teplotě 40 °C, při pH 1,5 až 3 po dobu 5 hodin. Podle potřeby dalšího použitíse pH upraví v rozsahu pH 5 až 6,5 pomocí NaOH. Příklad 12The skimmed-milk powder is restored to a dry matter content of 5 to 15%; The pH is adjusted with phosphoric or hydrochloric acid and poultry pepsin is used for hydrolysis. The hydrolysis is carried out at 40 ° C, at pH 1.5 to 3 for 5 hours. If needed, the pH is adjusted to pH 5 to 6.5 with NaOH. Example 12

Způsob výroby podle bodu 11 s tím, že k hydrolýze se použije vepřový nebo hovězí pep-sin. Příklad 13The process of claim 11, wherein pork or bovine peppers are used for hydrolysis. Example 13

Jako substrát slouží suspenze připravená ze sýrů, k proteolýze při pH 1 až 4 se použi-je aspartátových proteas, při pH 7 až 8 neutrálních metaloproteas anebo serinových pro-teas. Příklad 14A cheese slurry is used as a substrate, aspartate proteases are used for proteolysis at pH 1-4, pH 7 to 8 of neutral metalloproteases or serine proteases. Example 14

Suspenze připravená z kaseinátů, např. kaseinátu sodného nebo draselného, s obsahembílkovin 10 S se převede do roztoku dalším přídavkem NaOH, pH se upraví na pH 8 a hydro-lýza se provede pomocí neutrálních metaloproteas z Bacillus megatherium. Příklad 15A suspension prepared from caseinates, e.g., sodium or potassium caseinate, with a 10 S protein content, is brought into solution by further addition of NaOH, the pH is adjusted to pH 8 and hydrolysis is carried out with neutral Bacillus megatherium metalloproteases. Example 15

Sušený nebo vlhký kasein přímo z výroby se jemně suspenduje ve vodě na sušinu 5 až 8 %,pH se upraví kyselinou citrónovou na pH 5 a hydrolýza se provede proteasou z plísníRhizomucor.Dried or moist casein directly from the factory is finely suspended in water to a dryness of 5 to 8%, the pH is adjusted to pH 5 with citric acid and hydrolysis is carried out by protease from fungiRhizomucor.

Claims

EXAMPLE 16 The process of Example 15, the hydrolysis is carried out with pepsin rennets such as pork, mustard or chicken pepsin, the pH of the hydrolysis being maintained by the addition of hydrochloric, phosphoric, acetic or lactic acid to pH 2.5 Example 17 For enzymatic hydrolysis by aspartic proteases, i.e. pepsins, e.g. in the form of rennet preparations or aspartic proteases from fungi, milk, milk mixture with the addition of whey proteins and / or casein, which was subsequently treated with bac- lactic acid cultures such as those contained in cream culture, lactobacilli cultures such as Lbe, casei, helveticus, acidophilus. Lbe. bulgaricus, Streptococcusthermophilus and / or yogurt culture, for the special purpose of preparing dietary preparations and bifidobacteria, a method for producing enzymatic hydrolysates from dairy raw materials, characterized in that substrates containing milk proteins, whey and / or casein and their salts with cations such as hydrogen, potassium, calcium, magnesium or ammonium ions, or with anions such as chlorides, sulfurates, phosphates, acetates, formates, citrates and lactates, are treated with proteolytic enzyme preparations including rennet containing as major enzyme activity of pork, poultry and / or bovine pepsin, aspartic proteases from fungi, neutral bacterial metalloproteins, for hydrolysis of whey proteins and mixtures thereof with casein, with the exception of centrifuged milk also with trypsin, chymotrypsin and mixtures thereof, enzymatic hydrolysis is performed solution or suspension of protein substrates at pH 1 to 6.8, preferably at pH 1 to 4 using pepsins and other aspartic proteases and at pH 5 to 10 for metallo-proteases and serine proteases of trypsin and chymotrypsin, preferably at pH 6.5 to 9; 20 to 60 ° C, preferably at 30 to 50 ° C, the liquid hydrolysates optionally treated by ultrafiltration, ultrasonic, microfiltration and / or heat treatment, optionally further concentrated by reverse osmosis and / or evaporation and dried either directly or after this pretreatment .