CS244906B2 - Production method of antigen agent for limitation or prevention of tooth defects - Google Patents

Description

244906

Vynález se týká způsobu výroby antigen-ního přípravku pro použití ke snížení vý-skytu zubního kazu. O mikroorganismu Etreptococcus mutansse má za to, že hraje důležitou úlohu při o-nemocnění zubním kazem i mnoho labora-toří dokázalo, že je možné snížit výskyt zub-ního kazu u pokusných zvířat aktivní imu-nizací vakcínou z této bakterie. Bylo napří-klad dokázáno, že u opic Macaca fascisula-ris, krmených dietou bohatou na cukr, do-chází k význačnému snížení výskytu zubní-ho kazu po imunizaci buď intaktním S. mu-tans, nebo materiálem bohatým na buněčnéstěny (Bowen, British Dental Journal, sv.126, 1969, str. 159 až 160, Bowen a spol.,British Dental Journal, sv. 139, 1975, str.45 až 50, Cohen a spol., British Dental Jour-nal, sv. 147, 1979, str. 9 až 14).

Bylo rovněž prokázáno, že žádná ochra-na nenastane, použijí-li se buněčné stěny S. mutans, na které bylo působeno trypsi-nem, aby se rozrušily bílkoviny, což doka-zuje, že je to pravděpodobně některá bílko-vinná složka S. mutans, které je zapotřebípro ochrannou imunizaci (Colman a Cohen,Pathogenic Streptococci, 1979, str. 214, vy-dané Μ. T. Parkerem, Reedbooks, Chertsey,Anglie). Při každém imunizačním procesu je dů-ležité mít možnost poznat bakteriální slož-ku, která se účastní ochrany. Jedním z ob-vyklých důvodů pro to je to, že přípravkylze potom zkoušet před použitím, aby bylojisté, že složka nezbytná k protekci je pří-tomna. Kromě toho čištění ochranného an-tigenu umožňuje výrobu vakcíny, ze kterélze odstranit nežádoucí nebo toxické slož-ky.

Byla vyvolána pozornost v přísadě S. mu-tans, když bylo demonstrováno, že tentoorganismus obsahuje složky, které antigen-ně reagují zkříženě se savčí srdeční tkání(viz například Hughes se spol. Infect. Im-mun., 27, 1980, str. 576 až 588J. Vědomí e-xistence takových srdečních zkříženě reak-tivních antigenů S. mutans činí žádoucímje identifikovat a charakterizovat tak, abyje bylo možno vyloučit z vakcínových pří-pravků.

Britský patentový spis č. 2 033 223 B popi-suje dvě bílkoviny, které lze Izolovat z bu-něčných stěn S. mutans a které mají anti-genní vlastnosti. Jedna z těchto antigenníchbílkovin (značkovaný antigen A) je chrá-něna v přihlášce, další (antigen B) má pro-kazatelnou zkříženou reaktivitu se srdeč-ní tkání a předpokládá se, že jako složkavakcíny pro humánní použití je nepřijatel-ný. Antigen A a B lze definovat následujícísérií kritérií: a. jsou přítomny v buněčných stěnáchkmenů S. mutans genetické skupiny I (Coy-kendall, J. Gen. Microbiol. 83, 1974, str. 327).Tato genetická skupina obsahuje kmeny sé- rotypů c, e a f, definované Perchem a spol.(Acta Path. Microbiol. Scand. B 82, 1974,str. 357). b. zůstávají přítomny v buněčné stěně povaření s vodným roztokem (10 g/litr) sod-né soli dodecylsíranu (SDS) po dobu 20 mi-nut. c. podle stanovení elektroforézy na SDS--polyakrylamidovém gelu (SDS—PAGE) jsouzřejmě jejich molekulové hmotnosti, pro A:asi 29 000; pro B: asi 190 000. d. podle stanovení isoelektrickou foku-sací v akrylamidovém gelu jsou jejich iso-elektrické body pro A: asi 4,3; pro B: asi5,4, a v případě antigenů A, antigenní bíl-koviny. e. jsou ničeny proteolytickými enzymy a f. neposkytují zkříženou reakci se srdeč-ní tkání.

Nyní bylo shledáno, že další skupinu an-tigenních bílkovin (antigen C) lze izolovatz buněčných stěn kmenů S. mutans genetic-ké skupiny I. Tato skupina bílkovin se dápoužít k přípravě monospecifického anti-séra a zdá se, že se účastní ochrany protizubnímu kazu, vyvolané vakcinací buněčný-mi stěnami S. mutans. Nebyla prokázánažádná zkřížená reaktivita se srdeční tká-ní savců.

Vynálezem je tedy způsob výroby antigen-ního přípravku pro omezování nebo pre-venci zubního kazu, z bakterií skupiny Strep-tococcus mutans genetické skupiny I, kte-rýžto přípravek je v podstatě prost antige-nů poskytujících zkříženou reakci se srdeč-ní tkání, odvoditelných od Streptococcusmutans, kterýžto způsob zahrnuje kultivacibakterií skupiny Streptococcus genetickéskupiny I v kultivačním prostředí k produk-ci buněčné kultury, odstranění alespoň bu-něčných stěn z buněčné kultury pro získá-ní bílkovinného roztoku, kterým je filtrátkultury, buněčný extrakt nebo jejich kom-binace, a oddělování požadovaného anti-genního přípravku od bílkovinného roztokuseparačním postupem, který zahrnuje stu-peň afinitní chromatografie, jenž obsahujeuvádění bílkovinného roztoku s imobilizova-nou protilátkou, vymývání nežádoucích ma-teriálů z imobilizované protilátky a eluová-ní antigenního přípravku z imobilizovanéprotilátky; tento způsob se podle vynálezuvyznačuje tím, že imobilizovaná protilátkamá specifitu k jedné nebo více antigennímbílkovinám, (dále označovaným jako anti-gen C), které mají následující vlastnosti: a) jsou přítomny na buněčných stěnáchkmenů Streptococcus mutans, genetické sku-piny I, b) jsou rozrušovány nebo extrahoványzpracováním uvedených buněčných stěnvroucím vodným roztokem (10 g v litru)dodecylsulfátu sodného (SDS) po dobu 10minut, ale zůstávají sdruženy s uvedenými 244906 buněčnými stěnami po zpracování vodnýmSDS (10 g/1) při 15 °C, c) mají mol. hmotnost 70 000 + 5 000,stanoveno SDS-polyakrylamidovou gelovouélektroforézou (SDS-PAGE), d) jsou rozrušovány proteolytickým enzy-mem, e) mají isoelektrický bod 4,45 + 0,24 a f) neposkytují zkříženou reakci se srdeč-ní tkání.

Antigen C je přítomen jak na buněčnýchstěnách, tak i v bezbuněčných filtrátech kul-tury S. mutans adaptací obvyklých technikpoužívaných k odstranění bílkovin z buněč-ných struktur, s výhodou se však separujebuď z filtrátů bezbuněčné kultury, nebo zcelkových buněčných extraktů S. mutans,které obvykle obsahují méně látek, kteréby mohly interferovat s čisticími pocho-dy.

Pozadu je-li se směs antigenu C a anti je-nu A, je potom zapotřebí připravit oba an-tigeny afinitní chromatografií na imobilizo-vané protilátce a potom je spojit, nebo smčsmůže být připravena v jediném stupni po-mocí afinitní chromatografie na kombinaciimobilizované protilátce s kombinací anti--antigenu C a anti-antigenu A. Při alternativním provedení způsobu po-dle vynálezu imobilizovaná protilátka ob-sahuje kombinaci protilátek, přičemž prváprotilátka má specifitu k jedné nebo víceantigenních bílkovin obsahujících antigenC a druhá protilátka má specifitu k jednénebo více antigenním bílkovinám (dále jen„antigen A“), které mají následující vlast-nosti: a) jsou přítomny na buněčných stě-nách kmenů Streptococcus mutans, gene-tické skupiny I, bj zůstávají sdruženy s uvedenými buněč-nými stěnami po vaření s vodným rozto-kem SDS (10 g/1) po dobu 20 minut, c) mají molekulovou hmotnost 29 000,stanoveno postupem SDS-PAGE, d) mají isoelektrický bod asi 4,3, ej jsou rozrušovány proteolytickým enzy-mem, fj nedávají zkříženou reakci se srdečnítkání. Při způsobu podle vynálezu se s výhodoupoužívá kmene Streptococcus mutans, séro-typu C.

Antigenního přípravku vyrobeného podlevynálezu lze použít: ve formě framaceutic-kého přípravku,^ například vakcíny, přidá-ním vhodných farmaceuticky přijatelnýchředidel nebo nosičů, například adjuvans(například hydroxid hlinitý}, stabilizátorů abakteriostatik. Podání vakcíny se může u-skutečnit subkutánní, intramuskulární, in-travenózní nebo submukosální injekční for-mou, typicky v dávkách 1 až 50 ^g, zejmé-na asi 10 μζ veškerých antigenů na kg tě-lesné hmotnosti. Imunizaci lze uskutečnit rovněž orální cestou, například polknutímtobolky obsahující antigenní přípravek ne-bo opakovaným použitím ústní vody nebozubní pasty obsahující antigen C.

Je výhodou, že ochrana proti zubnímukazu poskytované antigení bílkovinou po-dle vynálezu vychází z protilátek proti to-muto antigenu produkovaných imunitní re-akcí organismu. Takové protilátky lze rov-něž pěstovat mimo subjekt, který má být i-munizován, obvyklými technikami, napří-klad injekcí vhodného antigenního příprav-ku z S. mutans, včetně antigenu C, napří-klad kravám nebo králíkům následovanouvykrvácením. Podávání přípravků protilá-tek vyrobených tímto způsobem a zahrnují-cích obvyklá farmaceuticky přijatelná zře-ďovadla nebo nosiče, je rovněž účinné připrevenci nebo snižování zubního kazu.

Kultivačním médiem může být kteréko-liv obvyklé médium pro S. mutans, s výho-dou například Todd-Hewittovo živné mé-dium, trypton/kvasničný extrakt nebo ně-snadncst následujícího čištění je výhodnéchemicky definované prostředí. Antigen Cje uvolňován do živného prostředí ve všechstadiích kultivace. Buňky mohou být pěsto-vány přetržitě a s výhodou izolovány v ran-ně stacionární fázi (typicky 15 až 25 ho-din při teplotě 37 °C). Buňky mohou býtpřípadně pěstovány v kontinuální kultuře,s výhcdcu ve zředovacím poměru asi me-zi 0,01 a 0,1, zejména asi 0,05 hod.-1.

Roztokem bílkovin mohou být filtráty kul-tury, získané odstraněním celých buněk, ne-bo buněčný extrakt, zbavený buněčnýchstěn a zbytků. Případně to může být směstěchto roztoků vzniklých rozrušením stěncelé kultury a potom odstraněním buněč-ných stěn a zbytků. Buněčné stěny mohoubýt odstraněny jako celé buňky nebo frag-menty po desintegraci, a to obvyklými tech-nikami, například odstředěním nebo filtra-cí.

Typické produkty a způsoby podle vyná-lezu budou dále popsány na příkladech sodkazem na připojené výkresy, na kterýchjednotlivé obrazce mají následující význam.

Obr. 1 znázorňuje titraci (metodou ELI-SA) sérové IgG protilátky proti antigenu Cpřipravené ze vzorků séra od pokusnýchopic [jak je popsáno Bowenem a spol., 1975(pokus Cj], vynesením střední absorban-ce p-nitrofenolu při 405 nm proti séru IgGpro 4 kontrolní opice (označeno na výkre-se křížky x) a pro 4 opice imunizované bu-něčnými stěnami S. mutans (označeno krouž-ky O).

Obr. 2 srovnává časový vývoj zubního ka-zu v trvalém ozubení u tří opic (Macacafascicularis) imunizovaných buněčnými stě-nami S. mutans, s vývojem u pěti opic vkontrolní skupině [jak je popsáno Cohe-nem a spol. 1979 (pokus 19)], kde středníhodnoty vývoje zubního kazu u imunizova-ných opic jsou označeny plnými čtvereč- 244906 7 ky a u kontrolních opic plnými krouž-ky φ.

Obr. 3 znázorňuje titraci (metodou ELI-SAj sérové IgG protilátky proti antigenu Cpřipravené ze vzorků séra od čtyř pokus-ných opic [jak je popsáno Cohenem a spol.1979 (pokus 19}], vynesením střední hod-noty absorbance p-nitrofenolu při 405 nmproti séru IgG pro 4 kontrolní opice (na vý-krese označeno plnými kroužky φ) a pro4 opice imunizované buněčnými stěnami S.mutans (označeno plnými čtverečky Ri).Antigen C 1. Příprava buněčných stěn

Byl použit S. mutans široce známéhokmene Ingbritt. Tento kmen byl popsánKrassem (Archs Oral Biol. 11, 1966, str.429 až 436) a je klasifikován jako genetic-ká skupina I Coykendallem a jako sérotypc podle Perche se spol. Tento kmen byl u-ložen v National Collection of IndustrialBacteria, Aberdecn, Skotsko jako NCIB11516. Podobné výsledky byly docíleny spoužitím kmene z National Collection ofType Cultures, Colindale, Londýn (NCTC10 449), který je blízký kmeni Ingbritt.

Bakterie byly pěstovány v prostředí po-psaném Ellwoodem se spol. (Archs OralBiol. 19, 1974, str. 659 až 664} v 600 mlchemostatu při rychlosti ředění 0,05 hod-1,přičemž pH se udržuje automaticky přidá-váním hydroxidu draselného na hodnotě6,5. Bakterie byly izolovány pomocí odstře-dění, promyty fyziologickým roztokem a za-hřívány při teplotě 60 °C, po dobu 30 minutk inaktivaci autolytických enzymů. Potombyly rozdrceny protřepáním s Ballotinihoskleněnými kuličkami č. 12 v Mickleho tká-ňovém desintegrátoru. Rozdrcené buňky by-ly odděleny od skleněných kuliček filtracía promyty dvakrát vodou a dvakrát 1 M NaClpředtím, než byly resuspendovány v SDS(10 g/Iitr) ve vodě pomocí Potterova tká-ňového homogenizátoru. Neporušené bak-terie byly odděleny od stěn odstředěním zanízké rychlosti a stěny byly promyty dů-kladně fyziologickým roztokem a vodoupřed lyofilizací.

Podobné výsledky byly docíleny za pou-žití bakterií rostoucích šaržovitě na Todd--Hewittově živném prostředí (J. Path. andBacteriol. 35, 1932, str. 973 až 974) nebona prostředí obsahujícím glukózi, tryptona kvasničný extrakt za kontroly pH a buďrozrušením buněk v Braunově homogenizá-toru, nebo jejich vystavením dlouhodobéextrakci pomocí SDS při teplotě místnos-ti. Příprava antiséra

Lyofilizované buněčné stěny byly suspen-dovány ve sterilním fyziologickém roztokuv koncentraci 1 mg/ml a použity k imuniza- ci opic (viz níže) nebo králíků. Králíci do-stali tři intramuskulární injekce vždy potřech týdnech, vždy 1 mg stěn ve fyziolo-gickém roztoku obsahujícím 10 % hydroxi-du hlinitého jako adjuvans. Potom byli vy-krváceni vpichem do srdce 1 týden po po-slední injekci.

Imunoelektroforetické pokusy

Antisérum proti buněčným stěnám, při-pravené postupem popsaným vpředu, bylopoužito jak při charakterizaci, tak i při čiš-tění antigenu C. Když byly použity bílko-viny z filtrátu kultury kmene Ingbritt (ne-bo příbuzných kmenů) jako antigen ve zkří-ženém imunoelektroforetickém pokuse, pro-vedeném způsobem popsaným Axelsenem sespol. (v „Manual af quantitative Immuno-electrophoresis, Oslo, 1973) a provedena e-lektroforéza na antisérum proti buněčnýmstěnám, byla pozorována tři maxima sráže-ní. Pomocí pokusů s použitím intermediár-ní gelové techniky (Axelsen se spol., str.71) s interroediárním gelem obsahujícímbuď antigen A a B, nebo monospecifickáantiséra proti A a B, bylo možné ukázat, žedvě z maxim, srážení byla vyvolána antige-nem A a B a třetí odlišným antigenem, to-tiž C. S cílem studovat charakter antigenu C,byl antigenní přípravek podroben různýmvlivům před tím, že byl zkoumán zkříženouimunoelektroforézou. Bylo nalezeno, že an-tigen C byl zničen při inkubaci po dobu tříhodin při teplotě 37 °C se 200 /zg/ml proteo-lytického enzymu trypsinu nebo pronázy.Antigen C má tedy charakter bílkoviny.

Vzorky antigenu C byly zničeny rovněžpři expozici pufrům o hodnotě pH nižší než5,0, po dobu tří hodin z čehož plyne, že jerovněž acidolabilní.

Informace o fyzikálních vlastnostech an-tigenu C byly získány zkříženou imuno-elektroforézou, kde prvá rozměrová separa-ce byla SDS-polyakrylamidová gelová elek-troforéza k rozdělení bílkovin na základěmolekulární hmotnosti (podrobnosti meto-dy v práci: Russell, J. Gen. Microbiol. 114,1979, 109 až 115) nebo zkříženou imunoe-lektrofokusací na agaróze [Rosen, Aman,J. Immunol.'Meth. 1979, 28, 1), kde se bíl-koviny dělí na základě svého náboje. Výsledky ukázaly, že antigen C měl zdán-livou molekulární hmotnost 70 000 + 5 000(SD) a isoelektrický bod 4,45 + 024.

Antigen C by mohl být rovněž detegovánimunodifúzními pokusy s antisérem stěn ne-bo čistého antigenu C (viz níže). Imunodi-fúze bylo tudíž použito k důkazu, že anti-geny identické s C byly produkovány 6 dal-šími kmeny S. mutans sérotypu c a rovněžpředstaviteli sérotypů e a f.

4. Čištění antigenu C Údaje shora uvedené ukazují, že antigen 244906 9 C je přítomen jak v buněčných stěnách,tak i v bezbuněčném filtrátu kultury. Ačko-liv antigen C lze extrahovat ze stěn vhod-nými prostředky, je výhodné čistit jej z fil-trátu kultury, protože ten obsahuje ménělátek, které mají snahu interferovat s čis-ticími postupy.

Zatímco antigen C může být čištěn rutin-ními laboratorními postupy sloupcové chro-matografie, s použitím například vhodnýchmatric gelové permeace a výměny iontů,nejvýhodněji jej lze izolovat imunosorbent-ní afinitní chromatografií a protokoly za-ložené na této technice jsou uvedeny ní-že. a. S. mutans kmen Ingbritt rostl v semi-definovaném médiu (Russel, FEMS Micro-biol. Lett. 6, 1979, str. 197 až 1993 ranněstacionární fáze a buňky byly odstraněnyodstředěním, po kterém následovala filtra-ce skleněnými vlákny. Inhibitor proteázy fe-nylmethylsulfonylfluorid (PMSF) byl při-dán do finální koncentrace 1 mM, spolu sazidem sodným (finální koncentrace 0,02proč) k inhibici bakteriálního růstu. Filtrátbyl potom pasážován sloupcem pro afinitníchromatografií obsahujícím kuličky neroz-pustného glukózavého polymeru mutanu aagarózového gelu (Sepharose Cl—6B) při-praveného v podstatě tak, jak je popsánoRussellem (J. Gen. Microbiol. 112, 1979, str.197 až 201), s cílem odstranit glukosyltrans-ferázové enzymy a další bílkoviny vázajícídextran, které lze jinak vázat na následu-jící imunosorbentní sloupce (Russell, FEMSMicrobiol. Lett, 1981, 11, 279). Filtrát kultu-ry byl potom pasážován postupně sérií tříimunoserbentních sloupců obsahujících i) monospecifickou protilátkou proti an-tigenu A, ii) monospecifickou protilátkou proti an-tigenu B, ii) buněčné stěny. Třetí sloupec potom obsahoval protilátkyproti antigenům A, B a C, avšak když anti-geny A a B se odstraní ze vzorku před do-sažením třetího sloupce, byl zadržen je-nom antigen C a mohl být potom eluovánvhodným činidlem, například 3 M thiokya-nátem sodným. Imunosorbentní sloupce by-ly připraveny standardními metodami, přinichž frakce séra s obsahem imunoglobuli-nu G byly kopulovány se zesítěnou agaró-zou (bromkyanem aktivovaná Sepharose 4B,Pharmacia Fine Chemicals Ltd) způsoby do-poručenými výrobcem.

Antigen C, připravený výše uvedenýmizpůsoby, byl potom použit k posílení mo-nospecifického antiséra, umožňující sesta-vení C-specifických imunosorbentních sloup-ců, které dovolovaly čištění antigenu v jed-nom stupni. b. Alternativní způsob čištění antigenu Czahrnoval imunosorbentní afinitní chroma-tografii následovanou hydrofobní interakčníchromatografií. Při této metodě byl filtrát 10 kultury chromtografován nejprve na afinlt-ním. sloupci obsahujícím mutan a ssfarózu,potom imunosorgentním sloupcem obsahu-jícím protilátky proti buněčným stěnám.

Antigeny A, B a C byly zadrženy tako-vým sloupcem a mohly být eluovány 3 Mthiokyanátem sodným v 0,05 M Tris-JCl-puf ru (pH 7,5). Thiokyanát sodný byl odstra-něn dialýzou a roztok antigenních bílko-vin ekvilibrován v 0,05 M Tris-HCl-pufru(pH 7,5), obsahujícím 1M síran amonný.Tento roztok byl potom chromatografovánna sloupci obsahujícím fenylsefarózu C1-4B(Pharmacia Fine Chemicals). Bílkoviny, zadržené na sloupci, byly po-tom eluovány gradientem se snižující se kon-centrací síranu amonného a se současněvzrůstající koncentrací ethylenglykolu (fi-nální koncentrace 0 % a 50 %). Antigen Cbyl eluován mezi koncentrací 0,6 a 0,7 M sí-ranu amonného (15 až 20 % ethylenglyko-lu v přebytku k antigenu A a B.

Antigen C připravený výše uvedeným způ-sobem byl potom použit k posílení mono-specifického antiséra, umožňujícího sesta-vení C-specifického imunosorbentního sloup-ce, který dovoloval čištění antigenu v je-diném stupni.

Ochrana před zubním kazem pomocí imu-nizace buněčnými stěnami

Imunizace buněčnými stěnami S. mutanskmene Ingbritt, připravenými výše popsa-ným způsobem,, prokázala ve dvou odděle-ných pokusech, že poskytuje ochranu protikazům u opic (Macaca fascicularis) a po-drobnosti těchto pokusů byly publikoványBowenem se spol. British Dental Journal1975, sv. 1939, str. 45 až 78) a Cohenemse spol. (British Dental Journal, 1979, sv.147, str. 9 až 14). V pokuse C, jak je popsáno Bowenem sespol., 5 kontrolních zvířat udržovaných nadietě podporující kaz, bylo srovnáno se 4zvířaty imunizovanými buněčnými stěnami.Pět roků po začátku pokusu byl celkový po-čet kazových lézí u kontrolních zvířat 64,zatímco u zvířat v imunizované skupině by-ly nalezeny jenom 4 léze. Ochrana byla u-držována nejméně po dobu 9 roků (Cohense spol., 1979). Vyšetřování vzorků séra po-kusných zvířat, odebraného po 5 rocích odzačátku pokusu pomocí zkřížené imunce-lektroforézy prokázalo, že imunizace bu-něčnými stěnami indukovala protilátky pro-ti antigenu A, B a C. Tato citlivá technikaneodhalila existenci protilátky proti něja-kým dalším antigenům.

Kvantitativní hodnocení reakce protilátekbylo prováděno imunoserbentním testem svázanými enzymy (ELISA), technikou mi-krodestičky podle Voliéra se spol. (1977,Flowline Publications). Mikrotitrační mis-ky z plastické hmoty byly potaženy čistýmantigenem C v koncentraci zhruba 1 ^g/ml. 244906 11

Kvantitativní hodnocení množství opičíprotilátky vázané na antigen, bylo docíle-no inkubací s antihumánním IgG, konju-govaným na alkalickou fosfatázu {SigmaChemical Co) a stanovením následné tvor-by chromoforu (p-nitrofenol) měřením je-ho absorbance při 405 nm. Obr. 1 ukazujevýsledky titrace antiséra u kontrolní a imu-nizované skupiny opic. Výsledky jsou uve-deny tebelární formou v tabulce 1. 12

Imunizace buněčnými stěnami vedla kvýznamnému zvýšení hladiny protilátky pro-ti antigenu C. Lze uvést, že dříve bylo u-kázáno, že i neimunizovaná kontrolní zví-řata vyvíjejí protilátku proti antigenům S.mutans v závislosti na věku (Russell a Bei-ghton, Infection and Immunity 1981, sv. 35,str. 741 až 744).

Tabulkal Ředění Kontrola Imunizováno 1/20 1,35 + 0,275 1,996 + 0,01 1/40 0,91 + 0,21 1,859 + 0,09 1/80 0,747 + 0,21 1,64 + 0,21 1/160 0,566 + 0,13 1,33 + 0,29 1/320 0,386 + 0,09 0,968 + 0,27 1/640 0,262 + 0,06 0,677 + 0,20 1/1 280 0,18 +0,05 0,430 + 0,13 1/2 560 0,115 + 0,03 0,296 + 0,08 V příkladu 19 popsaném Cohenem se spol.(1979) byla srovnána skupina kontrolníchopic se skupinou imunizovanou buněčnýmistěnami připravenými z S. mutans kmeneIngbritt, kultivovaného v chemostatu zře- ďovací rychlostí (D) 0,05 hod“1. Postup ka-zu u těchto zvířat je znázorněn na obr. 2a ukazuje, že stěny buněk kultivované přiD -=- 0,05 hod-1 vedly k význačné ochra-ně. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Doba od začátku pokusu(měsíce)

Průměrná velikost kazu + SEKontrola Imunizováno 11 0 0 16 1,0 + 0,45 0 18 1,4 + 0,75 0 21 2,4 + 0,97 0 25 3,2 + 1,88 0 29 3,4 + 1,63 0 31 3,6 + 1,60 0,33 + 0,3 34 5,2 + 1,67 0,33 + 0,3 36 5,75 + 1,86 0,33 + 0,3 45 . 7,25 + 2,62 1,33 + 0,29 Hladiny protilátek proti antigenu C ve tivní výsledky získané se vzorky séra o- vzorcích séra, odebraných v různých sta- debraného 3 roky po začátku pokusu jsou diích pokusu, byly měřeny pomocí ELISA. znázorněny na obr. 3. Výsledky jsou uvede- Pokus prokázal, že zvířata imunizovaná bu- ny tabelární formou v tabulce 3. něčnými stěnami kultivovanými při D = 0,05 Existuje přesvědčující korelace mezi in- h-1 měla zvýšené titry protilátek proti dukcí vysoké hladiny protilátek proti anti- antigenu C a tyto titry byly signifikantně genu C a ochranou proti kazu. vyšší než u kontrolních zvířat. Reprezenta- Tabulka 3 Ředění Kontrola Imunizováno 1/20 0,262 + 0,08 0,752 + 0,15 1/40 0,253 + 0,07 0,478 + 0,08 1/80 0,188 + 0,04 0,400 + 0,05 1/160 0,173 + 0,04 0,330 + 0,0,4 1/320 0,144 + 0,02 0,228 + 0,04 1/640 0,145 + 0,03 0,181 + 0,04

Claims (3)

1. "44900 14 13 Reakce protilátek imunizovaných opic Sérum ze zvířat imunizovaných buněčný-mi stěnami obsahovalo protilátky proti an-tigenu C. Takové protilátky by mohly býtsnadno prokázány imunodifúzí nebo imuno-elektroforetickými pokusy používajícími čis-tý antigen C. Žádné takové protilátky byneměly být pozorovány v séru z kontrolníchneimunizovaných zvířat. Je zřejmé, že exis-tence protilátky proti antigenu C koreluje s ochranou u opic imunizovaných buněčný-mi stěnami. Pokusy s imunizací opic různými vakcí-nami byly prováděny v těchto laboratoříchpo dobu 12 let. Vzorky séra mnoha zvířatz těchto pokusů jsou ještě dostupné a bylyvyšetřovány na přítomnosti protilátek protiantigenu C. Výsledky jsou shrnuty níže vtabulce 4 a potvrzují korelaci mezi přítom-ností protilátek proti antigenu C a ochra-nou. Tabulka 4 Pokus č. Vakcína Zmenšení výskytu Protilátky proti C kazu 4 stěny 100 % + 11 buňky 50 % + 14 buňky 60 % + 17 GTF (glukosyltransferáza) 0 % — 19 (30 měsíců) stěny 100 % + PŘEDMĚT

   1. Způsob výroby antigenního přípravkupro omezování nebo prevenci zubního ka-zu, z bakterií skupiny Streptococcus mutansgenetické skupiny I, kterýžto přípravek je vpodstatě prost antigenů poskytujících zkří-ženou reakci se srdeční tkání, odvoditel-ných od Streptococcus mutans, kterýžtozpůsob zahrnuje kultivaci bakterií skupinyStreptococcus genetické skupiny I v kulti-vačním prostředí k produkci buněčné kul-tury, odstranění alespoň buněčných stěn zbuněčné kultury pro získání bílkovinnéhoroztoku, kterým je filtrát kultury, buněč-ný extrakt nebo jejich kombinace, a oddě-lování požadovaného antigenního příprav-ku od bílkoviného roztoku separačním po-stupem, který zahrnuje stupeň afinitní chro-matografie, jenž obsahuje uvádění bílkovin-ného roztoku do styku s imobilizovanou pro-tilátkou, vymývání nežádoucích materiálůz imobilizované protilátky a eluování anti-genního přípravku z imobilizované protilát-ky, vyznačující se tím, že imobilizovaná pro-tilátka má specificitu k jedné nebo více an-tigenním bílkovinám, které mají následují-cí vlastnosti: jsou přítomny na buněčnýchstěnách kmenů Streptococcus mutans, ge-netické skupiny I, jsou rozrušovány neboextrahovány zpracováním uvedených bu-něčných stěn vroucím vodným roztokem okoncentraci 10 g v litru dodecylsulfátu sod-ného (SDS) po dobu 10 minut, ale zůstá-vají sdruženy s uvedenými buněčnými stě-nami po zpracování vodným roztokem do-decylsulfátu sodného o koncentraci 10 g/1při 15 °C, mají molekulovou hmotnost70 000 + 5 000, stanoveno SDS-polyakrylami- VYNÁLEZU dovou gelovou elektroforézou (SDS-PAGE),jsou rozrušovány proteolytickým enzymem,mají isoelektrický bod 4,45 + 0,24 a ne-poskytují zkříženou reakci se srdeční tká-ní.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznačující setím, že imobilizovaná protilátka obsahujekombinaci protilátek, přičemž prvá protilát-ka má specificitu k jedné nebo více anti-genních bílkovin, které mají následujícívlastnosti: jsou přítomny na buněčných stě-nách kmenů Streptococcus, genetické sku-piny I, jsou rozrušovány nebo extrahoványzpracováním uvedených buněčných stěnvroucím vodným roztokem o koncentraci10 g v litru dodecylsulfátu sodného (SDS)po dobu 10 minut, ale zůstávají sdruženys uvedenými buněčnými stěnami po zpraco-vání vodným roztokem dodecylsulfátu sod-ného o koncentraci 10 g/1 při 15 CC, majímolekulovou hmotnost 70 000 + 5 000, sta-noveno SDS-polyakrylamidcvou gelovou e-lektroforézou (SDS-PAGE), jsou rozrušová-ny proteolytickým enzymem, mají isoelek-trický bod 4,45 + 0,24 a neposkytují zkří-ženou reakci se srdeční tkání, a druhá pro-tilátka má specifitu k jedné nebo více anti-genním bílkovinám, které, mají následujícívlastnosti: jsou přítomny na buněčných stě-nách kmenů Streptococcus mutans, gene-tické skupiny I, zůstávají sdruženy s uve-denými buněčnými stěnami po vaření s vod-ným roztokem dodecylsulfátu sodného okoncentraci 10 g/1 po dobu 20 minut, majímolekulovou hmotnost 29 000, stanovenopostupem SDS-PAGE, mají isoelektrický bod

   244906 asi 4,3, jsou rozrušovány proteolytickým en-zymem a nedávají zkříženou reakci se sr-deční tkání. 16
3. 3. Způsob podle bodu 1 nebo podle bo-du 2, vyznačující se tím, že bakterií jekmen Streptococcus mutans, sérotyp C. 2 listy výkresů