CS221270B2 - Method and device for fixing the antigene and antidotes - Google Patents

Description

Předložený vynález -se týká způsobu stanovení antigenů a protilátek a zařízení k provádění tohoto způsobu. Týká -se obzvláště způsobu kvantitativního stanovení antigenů a protilátek fixací protilátky nebo- antigenu na nerozpustné částečky nosiče s velmi nepatrným průměrem částic, čímž se nerozpustné částečky nosiče sensibilisují, sensibilisované částečky nosiče se nechají reagovat s odpovídajícím antigenem, protilátkou -nebo jejich směsí a reakční směs se ozáří světlem o specifické vlnové délce.

Existuje stálá potřeba způsobu -rychlého a přesného- kvalitativního i kvantitativního stanovení biologicky aktivních látek, například antigenů a protilátek, které se vyskytují v extrémně nepatrných koncentracích. Existuje dále- velká potřeba zjišťovat přítomnost -drog nebo léčiv v tělních -tekutinách. Dále je pno lékařskou diagnosu často důležité, možnost podat zprávu o přítomnosti rozličných látek, které jsou v těle přírodní cestou -syntetisovány, nebo jsou - do těla přivedeny.

Dosud je již známé -dokazovat polokvantltativně protilátky nebo antigeny tak, že se částečky latexu, na které byl fixován antigen nebo protilátka, nechají re-agovat s odpovídajícím -antigenem nebo protilátkou na skleněné destičce a visuálně se pozoruje stav aglutinace.

V posledních letech je v následujících publikacích navrhováno, stanovovat protilátky a antigeny kvantitativně za použití výše uvažovaných částeček latexu tak, že seprotilátka nebo antigen fixují na částečky latexu, protilátka uložená na nosném- materiálu něho- na nosném materiálu uložený antigen se nechá reagovat s příslušným antigenem -nebo protilátkou, čímž se částečky latexu aglutinují nebo sbalují a měří -serychlost opadávání zákalu zbylé kapaliny za pomoci - vid.it^eliu<^l^O světla a -stanoví -seantigen nebo protilátka za -využití aglutinačního zjevu latexu použitého jako činidla:

A. Croatica Chemica Acta, 42 (1970), 467 až 466 -a

B. European Journal of Biochemistry, Vol. 20, č. 4 - (1971), 558 až 560.

Vzhledem k tomu, že metoda podle výše uvedeného- návrhu slouží k tomu, aby se měřením rychlosti opadávání zákalu stanovily antigeny nebo protilátky, je potřebné použít latex sensibilisovaný antigenem nebo protilátkou -s extrémně nízkou koncentrací, která například leží v rozmezí 0,07 až 0,028 proč., reakce latexu a antigenu nebo protilátky se musí provádět ve stacionárním stavu, musí se odstranit některé nečistoty, které mohou způsobovat zakalení vzorku, a učinit podobná - opatření. Jako důsledek -toho je nevýhodnost výše uvažované metody proto, že rychlost reakce antigenu a protilátky je nezbytně snížená, takže jak přesnost, tak také reprodukovatelnost stanove ní antigenu nebo protilátky je nedostatečná a pří oddělování znečištěnin jsou zapotřebí extrémně komplikovaná opatření. Z tohoto důvodu je těžké stanovit výše uvedenou metodou antigeny, jako je například fibrinogen, humanochoriongonadotropin nebo podobné materiály, u nichž jsou zapotřebí komplikovaná opatření pro přípravu potřebných činidel a u nichž je těžké dosáhnout reprodukovatelného aglutinačního efektu substance, která je obsažena v krvi nebo- v -moči, to znamená že obsahuje různé jiné látky, které mohou reakci škodlivě ovlivňovat.

V časopise Imunochemistry, Vol. 1.2 (1975) 3-4-9- až 351, bylo- již navrženo stanovovat protilátky a antigeny kvantitativně tak, že se aglutinované- latexové částečky výše uvažované, ozáří laserovým paprskem a měří se- spektrální linie ohnutého světla laserového paprsku, aby -se zjistila střední difusní konstanta (D), která ukazuje na brownův pohyb aglutinovaných částeček, který je naopak proporcionální k velikosti -aglutinovaných částeček.

Vzhledem k tomu, že při této- metodě- se latex -nesoucí protilátky nebo antigeny vyskytuje v extrémně nepatrných koncentracích, například v koncentraci pouze 0,001 proč., je rychlost -reakce antigenu a protilátky snížena tak, že jak přesnost, tak také reprodukovatelnost této metody je -nedostatečná. Dále má tato- metoda tu nevýhodu, že je zapotřebí komplikovaných výpočtů za použití -spektrální analysy, což způsobuje nutnost komplikovaných opatření a musí se odstraňovat před měřením- některé znečištěniny obsažené ve vzorku. Z tohoto· -důvodu -se také tato metoda nemohla - v praxi dobře -osvědčit.

V poslední citaci je dále popsáno, že stanovení s pomocí metody měření zákalu, uvedené dříve (citace A) dává extrémně nepřesné výsledky (viz str. 350, o-br. 2).

Vzhledem k tomu je úkolem předloženého vynálezu -vypracování - způsobu a - zařízení k provádění -tohoto - způsobu, - kterým by bylo· - možno- rychle -stanovit - protilátky - a/nebo antigeny - ve zkoumaném vzorku - s - vysokou přesností - - a s -dobrou -reprodukovate!ností.

Další -cíl vynálezu spočívá v tom, vytvořit způsob a zařízení k rychlému důkazu skutečnosti, - že koncentrace protilátky nebo antigenu ve vzorku leží pod nebo nad určenou hodnotou a -toto- měření uskutečnit s extrémně nepatrným množstvím vzorku.

Dalším cílem vynálezu je objevení způsobu a zařízení ke stanovení extrémně nízkých množství antigenu a/nebo- protilátky, která mohla být dosud zjištěna pouze pomocí radioimunitního testu (RIA = Radioimunoa-ssay), s přesností, která by odpovídala- hodnotám dosaženým- při radioimunitním testu, přičemž by se pracovalo podstatně rychleji a bezpečněji.

Další úkol předloženého vynálezu spočívá v tom, vypracovat z^působ pro kvantitativní stanovern antgenů ^kte^:rý ^by^l h^yl vhodný nejen ke stanovení multivalentních nebo polyfunkčních antigenů, nýbrž také ke stanovení neú^plných antigenů ja^ko je napnklad haptenen.

Dalším úkolem předloženého vynálezu je vypracování způsobu stanovení protilátek a/nebo antigenů při kterém se využívá nejen aglutinace protilátek: a/ne^bo antigenů nýbrž také jejich inhibičního účinku.

Jak již bylo· dříve popsáno, ukazují se dříve známé metody,· u kterých se stupeň aglutinace, který byl dosažen tak, že se protilátkou a/ne^bo antigenem sensUbihsované ^částečky latexu uvedly .do styku se vzorkem, který obsahoval antigen nebo· protilátku, stanoví podle rychlosti ubývání zákalu latexové kapaliny, jako málo přesné a špatně reprodukovatelné, neboť reakce za použití extrémně zředěného latexu musí probíhat ve· stacionárním stavu. Dále je při těchto· již známých metodách potřebné, aby se ze vzorku odstranily některé nečistoty, · které by měřený z^ákal mohl^y nějakým způsobem· ovlivňovat.

Je zřejmé, že když se chce stanovit anti^gen a^/nebo protHátka ve vzor^ku s v^ysokou přesností a dobrou rep-rodukovatelností, má se· nerozpustný materiál· ·nosⁱče^, který je sensibilisován protilátkou nebo antigenem, například částečky latexu, použít v pokud možno v^yso^ké koncentraci při uv^ádění do· styku se zpracovávaným vzorkem, který obsahuje antigen a/nebo protitatku. Tento antigen nebo protilátka má reagovat s protilátkou nebo antigenem uloženým na nosn^ém materiáki a tím se má urychlit z^působená reakce antigenů a protilátky, přičemž tato reakce se má provádět za pohybu rea^kční směsi a ne ve stacionár-mm •stavu reakční směsi.

N^yní ^bylo zji^štěno^{, ž}e se pri prov^ění reakce antigenu a protilátky mezi antigenem nebo· protll^át^kou^, ktert jsou v po^ku^d možno vysoké koncentraci uložené na nerozpustných ^částeč^kách nos^iče a odpovtáající protilátkou nebo· antigenem obsaženým ve zkouman^ém vzorky za nestacionármch podmínek a k současnému kvantitativnímu důkazu rozsahu, v jakém tato reakce probíhý docílí o^bzv^láště vý^hodných výstavů když · se:

1. použije nerozpustný nosný materiál se stře^dním poměrem částeček menSm než 1,6 μη,

2. rea^kčni směs v^ytvořen^{á p}ri. reakrn antigenu a protilátky ozáří světlem o vlnové délce v rozmezí 0,6 až 2,4 μΐη, jehož vlnová ^dél^ka je minimáteě o faktor ^1,5 ^1^ než je střední průměr částeček nosiče, a

3. měří se intensita světla vedeného reakční směsí.

Základ tohoto způsobu je zřetelný' z toho, že míra reakce antigenů a protilátky za přítomnosti senstoihsovaných nerozpustných částe^če^k nosiče je velmi přesně proporcionálrn s intensitou světía veden^ého reakční směsi. Je vidět, že míra reakce antigenů a prottíátky je ta^ké proporcionální s množstvím [nebo· koncentrací) protilátky a/nebo anti^genů ve vzorky za předpo^kladu^{, ž}e se reakce ^prov^ádí za s^peciíic^kých podmínek.

P‘redm^ětem v^yn^álezu ted^y je způso^b stanovení antigenů a protilátek, který je vyznačený tím, že se protilátka, nebo antigen fixují nebo· vážou na částečky nerozpustného nosiče· s ^pr^ůměrným nebo· středním průměrem menším ne^{ž 1,6} μπι ^čím^ž se nerozpustné částečky nosiče sensibillsují nebo se· učiní citlivými, protilátka nanesená na nosném materiálu a/nebo na nosiči. nanesený anti^gen se nechá reagovat s o^ovtáajímm antigenem nebo protilátkou nebo s jejich směsí v kapalném médiu rea^m směs se· ozáří světlem o vlnové .tólce v rozmez^í 0,6 až 2,4 μΐη, přičemž vlnová délka . , je· · minimálně l^,5krát vět^ší, ne^ž je střednú pramě-r částeček nosného materiálu a změří · se· extinkce reakční směsi.

Výše uve^dený z^půso^b podle· předíožíeného v^ynálezu umožiňuje stanovern pro^tiláte^k a/ /nebo antigenů ve vzorku s extrémně· vysokou přesností za použití · techniky, která se ^podstatně Mší od dosavadní·^ metod pri .mž •se stanovuje zákal nebo střední difúzní konstanta.

Světlo o vlnové délce v· rozmezí 0,6 až 2,4 μη, které se používá při způsobu podle předloženého vynálezu je v oblasti blízké infračervené nebo zčásti v oblasti viditelné, která sousedí s infračervenou. Výhodně se používá podle předloženého· vynálezu světlo, jehož vlnová délka je v blízkosti infračervené oblasti a je v rozmezí 0,8 až 1,.8 ^m, výhodně 1 až 1,4 fim. Pro· zkoumání molekulárních struktur a vlastností molekul je j^iž znám^é prov^áděm spektrum ana^lýz^y, pri které se používá světla v oblasti infračervené s vlnovou délkou minimálně· 2,5 ^m· nebo světla v ultrafialové oblasti s vlnovou ’ délkou menší než 0,4 μπι. Světlo v oblasti blízké oblasti infračervené nebo· na tuto oblast navazující viditelné světlo, které se používá při způsobu podle předloženého vynálezu a které je v dalším označováno jako „svetto ^bl^íz^ké infračervené oMasti“, ^bylo dosud pouze omezeně používáno· a mělo pouze· nepatrný význam.

Nyní bylo· zjištěno, že výše uvažované světlo blízké infračervené oblasti je podle předloženého vynálezu obzvláště vhodné, neboť proniká velmi dohře vodnými médii, jako· je voda, vodné roztoky a podobně, které se používají všeobecně· jako· základní média pro antigeny nebo protilátky, například voda, séra, moč, vodné solné roztoky a podobně, jakož i jako základní média pro výše uvažované latexy. Obzvláště světlo blízké infračervené oblasti o· vlnové délce: 0,8· až

1,4 рт а 1,53 až 1,88 je vodnými médii pouze v nepatrné míře absorbováno. Dále bylo zjištěno, že když se reakcí s protilátkou nebo antigenem sensibilisovaných částeček nerozpustného nosiče, které mají střední průměr menší než 1,6 μΐη, výhodně v rozmezí 0,1 až 1 ^m, s antigeny a/nebo protilátkami ve vzorku za tvorby aglutinátů vzniklá reakční směs ozáří výše uvažovaným světlem blízkým infračervené oblasti o vlnové délce, která je minimálně 1,5,krát a výhodně minimálně dvakrát větší, než je střední průměr částeček nosného materiálu, intenzita 2krát větší, než je střední průměr částeček nosného materiálu, odpovídá intensita světla prošlého reakční směsí velmi přesně aglutinačnímu stupni dosaženému reakcí antigenu s protilátkou. Propustnost pro výše uvažované světlo použité podle předloženého vynálezu odpovídá extinkci A, která se může určit pomocí spektrofotometru, například pomocí spektrofotometru, který se používá všeobecně pro infračervenou spektrofotometru, takže se propustnost v následujícím označuje kvůli jednoduchosti jako extinkce.

Extinkce A určená za pomoci infračerveného spektrometru, odpovídá následujícímu vzorci:

A = log—γ— , ve kterém značí

I_o intenzitu světla prošlého kyvetou, která obsahuje pouze rozpouštědlo a

I intenzitu světla prošlého kyvetou, která obsahuje roztok o určované koncentraci.

Proto se označuje výše uvažovaná propustnost v následujícím kvůli jednoduchosti jako „extinkce (A)“.

Podle předloženého vynálezu může stanovení extinkce A probíhat za pomoci spektrofotometru, který je podobný spektrofotometru používanému pro oblast blízkou infračervenému světlu, přičemž se použije světlo podle předloženého' vynálezu výše uvažované oblasti blízké infračervenému světlu a využije se výše uvedený vzorec, ve kterém značí I_o intenzitu světla výše uvažované oblasti blízké infračervenému světlu, které prošlo kyvetou obsahující směs částeček nosiče sensibilisovaných protilátkou nebo antigenem, nebo suspensi částeček nerozpustného nosiče v základním médiu vzorku a

I značí intenzitu světla výše uvažované oblasti blízké infračervenému světlu, které prošlo kyvetou obsahující směs, která vznikla reakcí suspense obsahující antigenem nebo' protilátkou sensibilisovaných částeček nerozpustného^ nosného materiálu s antigenem a/nebo protilátkou obsažených ve vzorku.

Krátce řečeno, odpovídá výše uvažovaná extinkce A relativnímu poměru I_o/I. Když základním médiem vzorku je kapalné transparentní médium, může se stanovení hodnoty I_o provádět pohodlně tím způsobem, že se použije suspense, která obsahuje nerozpustné částečky nosiče sensibilisované protilátkou nebo antigenem, přičemž tato suspense se zředí například vodou na koncentraci stejnou, jako má směs.

Další formy provedení a výhody předloženého vynálezu vyplývají z dalšího popisu a příkladů, přičemž je třeba brát zřetel na přiložené obrázky. V obrázcích značí:

Obr. 1: Absorpční spektrum vody za použití světla oo vlnové délce v rozmezí 0,6 až 2,4 um, které procházelo absorpční kyvetou o tloušťce 1 mm;

Obr. 2: Křivka změny extinkce s průměrem částeček polystyrénového latexu;

Obr. 3: Křivka změny extinkce v závislosti na reakční době reakce antigenu a protilátky;

Obr. 4: Schematický diagram, který reprodukuje základní stavbu zařízení podle vynálezu;

Obr. 5: Perspektivní pohled na absorpční kyvetu, která je vhodná jak pro vzorky, tak také pro kontrolní vzorky nebo slepé zkoušky;

Obr. 6: Schematické znázornění míchacího zařízení, které je výhodně použito;

Obr. 7: Kalibrační křivku fibrinogenu (Fg) při vlnové délce 1,2 μιη, která byla zjištěna za použití standardního fibrinogenového roztoku a částeček polystyrénového latexu, sensibilisovaných antifibrinogenem, o středním průměru 0,481 μπι;

Obr. 8: extinkční kalibrační křivku, která byla získána při vlnové délce 1,2 μΐη, za použití částeček kysličníku křemičitého se středním průměrem 0,32 ^m, sensibilisovaným antifibrinogenem a řady standardních fibrinogenových roztoků;

Obr. 9: Kalibrační křivku pro čas, který je zapotřebí, aby se dosáhlo při vlnové délce 1,2 <um extinkce s hodnotou 5, když se nechá reagovat antifibrinogenem sensibilisované latexové činidlo vždy se standardními fibrinogenovými roztoky s různou koncentrací;

Obr. 10: Extinkční kalibrační křivku, která byla zjištěna při vlnové délce 1,2 ^m, přičemž se nechalo reagovat oxytocinantisérum s různými koncentracemi standardního oxytocinového roztoku a potom se reakční směs smísila s částečkami latexu, které byly sensibilisovány oxytocinem;

Obr. 11: Extinkční kalibrační křivku, která byla určena při vlnové délce 1,0' ρτη, a která se získala tak, že se nechalo reagovat antihumánní choriongonadotropinové sérum se standardními roztoky humanochoriongonadotropinu (hCG) o různé koncentraci a získaná reakční směs se smísila s latexovými částečkami sensibilisovanými humanochoriongonadotropinem; a

Obr. · 12: Křivku změny průkazné citlivosti s koncentrací polystyrénového· latexu sensibilisovaného antífibrinogenem.

Například je na obr. 1 znázorněno· nanesením vlnové ^dél^ky sv&^tla na osu ůseěe^k a procentuální transrnisse světla na osu pořadrnc, procentuální transmissm spektrum vodní vrstvy o tloušťce 1 mm v oblasti vlnových (télek o^d ϋ,ι6 db ²,4 «πι. Z o^br. ¹ je vidět, že světlo^ o· vlnové délce v rozmezí od 0,6 do 1,4 pm, prochází vodou, která je pro latex i vzorky převážně používaným základním· médiem, prakticky bez zřetelné absorpce, a že světlo s vlnovou délkou od 1,53 do 1,88 «in rovněž v podstatě prochází, takže se světlo· s vlnovou délkou v těchto oblastec^h m^ůže pn z^půso^bu podta předložen^ého vynálezu používat. Z obr. 1 je dále vidět, že světlo ·ϋ vlnové ^délce v rozsahu 2.,1 až ²,3'5· vykazuje pro vodu transmtai v rozmez^{í 2}0 · %, takže se· toto sv^ětto s takovou vlnovou délkou m^ůže použft ta^ké v komtanam s vysoce citlivým fotometrem, i kdyby to nebylo výhodné.

^Obr. ² u^kazuje vzta^h mezi extin^ polystyrénového· ^latexu (s obsahem ^pevné látey ¹ % hmotnostní)^{, kt}er^á je nanesena na ose ρ^α^ί^ a vteovou d^él^kou svёtla^{, k}terá je nanesena na ose ůseček, když se provádí stanovem v absorpčních· ^kyvet^ách o Houbce· 2 mm. [V obr. ² re^produ^kuje· ^křivka A změnu extinkce polystyrénového latexu, jeho^ž částeč^ky map středte průměr ^0,481 «πρ zatímco knvka В znfeorňuje změnu extinkce polyst^yré.nov^ého latexy jehtó ^částeč^ky mají stfedrn velikost ^0,804 «m. P^i stanovem extin^kce se výhodně latex z^dt pnčemž násobením pozorované hodnoty extinkce z^řed’ovacím fatoorem- se ?us^ká -.hodnota extinkce.

Z obr. · 2 je vidět, že extinkce latexu se silně · zvětšuje při vlnové délce menší než 0,6 «m, takže je těžké · stanovit změny transmisse; světla reakční směsi a^genu a protilátey za · použiH světla o takovéto vLnove délce. Když se· však ·použije ·světla o vlnové ^délce mimm-áteě 0,8 «m^ a obzvtašte minim^áln^ě 1 «rn^ tak je extínkce tetexu jako takov^ého relativně nepatrná ^Z tohoto drn vodu je světlo o vlnov^é d^élce minlm^ně 0,8 um a· výhodně 1 «m pro výše uvažované měření transrnisse světla vhodné.

K^dyž se. v· obr. ² srovn^á knvka A s tam uvedenou křivkou B, dá se zjistit, že extinkce· tatexu se se zvyšujícím se staedrnm prům^ěrem částeček ^pol^ystyrenového latexu zv^{y š}uje. ^Z toho ^důvodu je ς^θ¹^ že částe^ k^y latexu s extrémně velteým středním průměrem jsou podle .předloženého· vynálezu nevhodná ^při pokusec^h se· u^zalos že ^po^dle· předteženého vyrál-ezu jsou v^ho^dné ^částe^čky nosného matertate o prfimyném nebo středním průměru menším· než 1,6· pm, že částečky latexu se středním průměrem · ·0,1 až 1 pm jsou výhodněji a nejvýhodn^ěj^ší jsou částečky se stasdním průměrem ^0,2 až 0,8 «m.

Na obr. ·3; je znázorněn vztah mezi změnou. extinkce reakční směsi antigenu a protilátky, která je nanesena na ose pořadnic, v závislosti na vlnové délce světla, která je nanesena v «ιη na ose ůseček, při různých reakčních časech, když se reakce antigenu a protilátky provádí stejně jako je popsáno v příkladě 1, s tím rozdílem, že se používá polystyrénový tatex se· sledním průměrem částic 0,234 «m. Na obrázku 3· znázorněné ^křiv^ky C, D a E platí pro extinkci reakčrn směsi po reakci antigenu a protilátky po 3, 10, případně 2D minutách.

^Z obr. ³ se dá zjⁱstl·t^, ze extínkce· reakčrn směsi antigenu a protilátky za· použití světla o v^nov^é délce men^ší než ^0,6 pim v rozsahu vlnové délky asi 0,6 až 0,4 pm, neodpovídá míře reakce (to znamená reakční dďběh a že při použití svěťte o men^ší vlnové délce než 0,4 «rn se extinkce v závislosti na pr^ůběhu rea^kce zfeteteě neměm. Na druhé straně· ukazují při použití světla o vlnové délce minimálně asi 0,75· pm extinkce reakční sm^ěsi velm^{i d}°br^{é k}orelace mezi realtem dobou nebo ^pr^ůběhem reakce nebo rea^kčrnm stu^pn^ěm. Čárkovaně zn^ázorněné oblasti křivek C, D a E na obr. 3 tedy znamenají, že extinkce nemůže být v tomto rozmez^í vínových ^déle^k sama pn zv^ětšen^é šířce štěrbiny přesně stanovena, neboť absorpce vodou je v této oblasti vlnových déie^:k příliš vysoká.

Jak je vidět z dále uvedeného příkladu 4, docílí se· při použití polystyrénového· latexu se středním průměrem· částic 0,804 pm dobré korelace mezi extinkcí reakční směsi antigenu a protilátky a koncentrací antigenu, když se použije světlo o vlnové délce, ^která je minimateě o ^fa^kter 1,5 vyš^ ne^ž je střední průměr částeček, například · když se použiie světla o vlnové délce asi 1,2' pm. za předpokladu, že · koncentrace · antigenu ve vzor^ku nen^í v^ětší než ^0,6 «g/rnl. V tomto případě se může tedy · provádět kvantitativní stanovení podle předloženého· vynálezu ozářením světlem o vlnové délce 1,2 pm nebo · také více.

Když se použijí latexové částečky s relatívně· nepatrným středním prAm^em, je výhodné, jak je patrno· i z obr. '3^, použít světla blízkého infračervené oblasti s· vlnovou délkou v rozmezí as.i 0,8 až 1,4· pm a výhodně v rozmezí 1 až 1,4 pm a více, přičem^ž tato vlnová ^dél^ka je minimálně o ·^fak^tor ² vět^ší ne^ž staedm průměr Částeček nosiče.

Podle jedné formy provedení předloženého vynátezu se izá^ a^by se použila reatóm směs· z nosného materiálu se specifickou veHkostí ^stoček na němž je· nanesena určitá protilátka nebo určitý antigen a určitého anti/enu nebo určité protilátky nebo jejich směsi ve zkoumané kapalině, která se ozá^ří světtam· o v^ho^dn^é vlnové d^élce v rozsahu

0,6 až 2,4 jum. Tímto se nejdříve zjistí rozsah vlnových délek, ve - kterém e-xistuje· kvantitativní vztah mezi změnou koncentrace zvláštního antigenu, protilátky nebo jejich směsí (včetně reakčního produktu] ve zkoumané kapalině a extinkcí -reakční směsi. Potom se· použije ke stanovení extinkce světlo; jehož specifická vlnová délka leží uvnitř tohoto rozmezí vlnových délek.

Podle předloženého vynálezu je tedy možné stanovit množství nebo koncentraci antigenu a/nebo · protilátky ve vzorku tak, že se použijí nerozpustné částečky -nosiče se středním průměrem ne větším než 1,6 /zm, který je výhodně v rozmezí -0,1 až 1,0 jwm, ještě výhodněji v rozmezí 0,2 až 0,8 μΐη, protilátka nebo · antigen se fixuje na nosný materiál (to znamená, že se nosný materiál sensibilisuje protilátkou nebo- antigenem], nosný materiál sensibilisovaný -se nechá reagovat s antigenem a/nebo protilátkou obsaženou ve vzorku a měří se extinkce reakční směsi za použití světla o vlnové délce v rozmezí 0,6 až 2,4 μπι, výhodně· v rozmezí 0,6 až 1,8 (zm, ještě výhodněji v rozmezí 0,8 až 1,4 fzm -a· nejvýhodněji v rozmezí 1 až 1,4 ;im. - Jak již bylo uvažováno, má mít použité světlo takovou vlnovou délku, která je minimálně l,5krát, výhodně nejméně dvakrát, a ještě výhodněji -minimálně 2i,5krát větší, než je střední průměr částeček nosiče.

Podle předloženého vynálezu se používají jako -částečky nosného- materiálu mikročástečky z organických polymerů, které jsou v podstatě nerozpustné v médiích používaných v médiích podle předloženého- vynálezu a mají -střední průměr uvnitř výše uvedeného rozmezí, například latexy organických polymerů, jako je polystyren a styren-butadienové kopolymery, které - je možno získat -emulsní polymeraci. Dále je- možno použít dispergované kokové bakterie, jako jsou stafylokoky a streptokoky, Bacillus prodigiosus, Rickertsia, - fragmenty buněčných stěn -a podobně, jakož i mikročástečky anorganických kysličníků, jako je například kysličník křemičitý, kysličník hlinitokřemičitý a kysličník -hlinitý, jemné práškovité minerály, kovy a podobně.

Podle předloženého- vynálezu se protilátka nebo antigen, který -reaguje s antigenem a/nebo protilátkou stanovovanou ve vzorku, fixuje- na výše uvedené nerozpustné částečky nosného· -materiálu (aby se nosný materiál sensibiilsoval). K tomuto účelu se- může protilátka- nebo antigen na -nosič fyzikálně a/nebo chemicky adsorbovat.

U protilátek se jedná o proteiny, zatímco antigeny náležejí do skupiny nejrůznějších látek, například jsou to proteiny, polypeptidy, -steroidy, polysacharidy, lipidy, pyl, prach -a- podobně. Již byla popsána řada způsobů k fixování těchto protilátek nebo- antigenů, obzvláště protilátek, na nerozpustnéčástečky nosného materiálu. Aby byly neúplné -antigeny fixovány na nerozpustný nosný materiál, je výhodné tento nosný materiál chemicky modifikovat, například za pomoci kupplačního činidla a potom antigen chemicky vázat na modifikovaný -nosný materiál.

V protikladu k dosavadním způsobům, při nichž -se stanovuje -zákal nebo, střední difusní konstanta za pomoci laserových paprsků, umožňuje způsob podle předloženého vynalezu takové podmínky, při kterých mohou částečky nerozpustného nosiče sensibilisované protilátkou a/nebo antigenem aktivněji působit na - odpovídající antigen a/nebo protilátku.

K tomuto- účelu se mohou při - způsobu podle předloženého vynálezu použít nerozpustné částečky nosiče, například -latexové částečky, které jsou sensibilisovány protilátkou a/nebo - antigenem (v následujícím označované jako „sensibilisované částečky nosiče“] ve formě suspense, která má - koncentraci větší než 0,05 % hmotnostních -a výhodně koncentraci v rozmezí 0,1 až 1 % hmotnostní a ještě výhodněji v rozmezí 0,2 až -0,6 % hmotnostních. Když - je koncentrace sensibiiisovaných - částeček nosiče příliš vysoká, jak je -to patrno- z obr. 2, je propustnost suspense natolik -snížena, že je- ztíženo měření extinkce podle předloženého- vynálezu. Uvnitř koncentračního rozsahu, ve kterém je možné měření extinkce·, jsou však vyšší koncentrace sensibiiisovaných částeček -nosiče v suspensi výhodné, neboť je tím umožněno zvýšení citlivosti kvantitativního stanovení -antigenů a protilátek.

Podle- předloženého vynálezu a v protikladu k dosavadním metodám se sensibilisované částečky nosiče -nechají reagovat se vzorkem obsahujícím -antigen a/nebo protilátku za - nestacionárních podmínek, to- znamená, že se -nenechá stát. K tomuto- účelu se- může reakce provádět s výhodou za pohybu reakční - - směsí. - Vzhledem k - tomu, že se reakce -většinou provádí v tenké komůrce, dosáhne se pohybu reakční směsi pohodlně například tak, že se kyvetou pohybuje vertikálně nebo horizontálně -tyč. Přirozeně se mohou nechat reagovat sensibilisované částečky nosiče a zkoumaný vzorek mimo kyvetu za přesně určených podmínek a po- určenou dobu a potom se může reakční směs přivést do kyvety k měření extinkce. Aby však byly reakční podmínky při veškerých měřeních reprodukovatelné, obzvláště se zřetelem na reakční dobu, mohou -se sensibilizované částečky nosiče nechat reagovat přímo v kyvetě, která je umístěna přímo ve spektrofotometru, čímž je umožněno přesnější stanovení. Toto přesnější stanovení je -umožněno tím, že se extinkce stanovuje bezprostředně po proběhnutí určené reakce, nebo tím, že se stanoví čas, který je nutný k tomu, aby se dosáhlo předem určené hodnoty extinkce, když se reakce provádí za přesně stanovených podmínek.

Tak umožňuje předložený vynález nejen stanovení koncentrace antigenu a/nebo protilátky ve vzoAu, což ^bylo dosud možné pouze vizuálně polokvantitativním způsobem, nýbrž umožňuje také stanovení antigenu a^/ne^bo prot^ilátky ve sto^pových množstvích, což bylo dosud možné pouze za pomoci radioimunitního testu (RIA). Toto stanovení je možné provést s takovou přesností, která je srovnatelná s radioimunitním testem. Ke stanovern anti^genu a^/ne^bo protilátk^y ve vzorku podte pře^dložen^ého v^ynrn lezu, který obsahuje neznámé množství antigenu a/nebo protilátky, se připraví řada srovnávací vzorků ^které jsou z^ře^děné^, za použití standardního vzorku, který obsahuje definované množství antigenu a/nebo protilátky, takže se zředí za použití různých faktorů. Potom se může každý zředěný i nezředěný vzorek nebo standardní vzorek nechat podle předloženého vynálezu reagovat za předem stanovených podmínek s neroz^pustnými častečkamⁱ nosiče^, které jsou sen sibilizován^y o^ovídajmí protdátkou nebo od^povídaj^íc^ím antígenem v ^de^finovan^ém množství ^přiěemž se s^tanov^í extíce ka^ždé reakční směsí a zjisH se cejc^hovací křivka ^pro obzvláštrn komhinace antigeⁿu a/ne^b° protilátky se sensíbilizovanými částečkami no^siče, která dává vztah mezi množstvta (koncentrací) antígenu ne^bo protHátky a extinkcí (přičemž tento druh cejchovam křivk^y je v následupmm ozna^čován pro jednoduchost jako „kahbračrn ^křivka A“). ^Nakon^ec se stanovovaný neznámý vzorek n^echá rea^govat se stejnými senstailizovanými částečkami nosme, Itíeré byty použity ^ke zjišťování kahbraí křivky^, přičOmž ^se měří extíce rea^kčm sm&í MnožsM ^(nebo koncentrace) prkomn^o antig^enu ^a/neb° protilát^ky v neznámém vzorci se potom ^může z^jistit tak že tímto zp^ůsobem změřená hodnota extinkce se srovn^á s Wibírn křivkou A.

Alternativně se m^ůže při vý^še popsaní z^jišť'^ování kalibračm křivky zhotovtí ^kahb^račⁿí křivka^, která u^dává vztah mezi mno^žstvím (ne^bo koncentrací) antíg^en^u n^eb° p^rotilátky v použitém kalibračním vzorku a reakční dobop kter^á je zapotří к do^sažem př^ede^m stanovené ho^dnoty extíce (přičemž tento druh ^křiv^ky je v n^ásl^eduj^ícím ^pr^o jednoduchost označov^án p°^uz^e · jako „křivk^a B“). Také v tomto ^přípa^dě se . m^ůže re^ak^cí neznámého vzortou se stejnými sansibilisovanými částečkami n^{osiče a} z^a v postatě ste^jných podmínek ja^ké byly použity ^pro z^hotevení ^ka^libra^čm ^iv^ ί:ηονΗ ^množst^ví (nebo koncentrace) antígenu a^/neb^{o p}rotilátk^y v nezn^ám^ém vzor^ku ^tak, že ^se měří čas, který u^plyne do dosažem p^ředem určené hodnoty extinkce.

T^ak ^se může ^po^dle pře^dlo^žen^ého vynáte zu stanovit množs^v^í n^ebo ^koncent^{race a}nti^genu ^a/nebo protilát^ky v nezníém vz^oi’^ku tím z^půso^bem^, že se ^buď

A. měn extíce neznám^ého vzor^ku . . (přičemž se z ^důvoěu Vibrace použije kahbrační křivka A) nebo se

B. stanov^í rea^kčm r^ych°st nebo reaMrn doba potřebná k dosažení předepsané hod noty extíce (pncíemž se ^ke ^kaUbraci použije kalibrační křivky B).

^{Jak j}iž byte pop^sáno^, je vý^še uve^de.ná mete^da A ja^ko system stan^ovení s větší ^pře^{s ností vhod}ná nejen po^tom^{, k}d^yž je koncentr^ace antígenu a^/ne^bo prottíátky v nemá ^mém vz°r^ku retatívně vysoký ný^brž také p^otom, ^když je ta^k ne^patrná^, že ji bylo ' do^sud m^ožn^o stanovtí pouze za použití radioimunitního testu (RIA). Na druhé straně je výše uve^dená meto^da B, u ^které se měří ^rea^kčn^í rychtes^ v^hodná ^k tomu, ab^y se ste novtía retatívně vyso^ká množsM (nebo ^koncentrace) antígenu a^/nebo protilátk^y v ⁿeznámém vzor^ku a je vý^hodná obzvláště proto, že měření je dosti jednoduché. Jak se ukázalo^, m^á výše uveden^á Vibrační křivka A p^oněku^d tvar S^, namtato p^řím^{é l}j^^^e^^, ₍ což v^ša^k nemá ^žádný nepnznivý vliv na ^přesnost stanovení ^po^dstatou ^toho^, že kalibračrn ^křiv^ka má tvar S ja^k je výše po^psáno^{, j}e zřejmě to, že reakční rychlost tvar křivky p^ři mžsmh ^koncentracmh anti^genu a/nebo proti^látky ovlⁱv^ňuje^, zatímco při v^yššíc^{h k}oncentracích nastupuje sycení aktivních míst nosn^ého matertehi. Je ^pří.rozen^ě možn^é zvětštt lineám Mst WMy tearu S ta^k, že se zvolí obzvláštní podmínky ke zhotovení kaHbracrn Wíy a při stanovování nezníého vzorku se pracuje potom obzvláště uvnitř tohoto rozmezí.

Jak již bylo dříve popsáno, je způsob podle předloženého vynálezu vyznačený . tím, že se sensíbilisované částečky nosiče uvedou do kontaktu s pokud možno velkou koncentrací vzorku a s ním se nechají reagovat. Proto má kyveta použitá ke stanovení extínkce rea^kčn^í směsi tatovou tlouš^ťкu^{, k}terá je menší než tloušťka kyvety, která se používá pro analýzu spektra ve viditelné obtastí.

V^ýhodn^é jsou tedy kyvety ^o tiší v ^rozm^ezí 0^,5 ^{až 4} mm a o^bzvlá^ště v rozmez^í 1 až 2,5 mm. ^Když se cht^ stanovit stopová mno&M antígenu ne^bo protilátky s po^ku^d možno v^yso^kou ^esnost^ což ^dosud ^{by l}o mo^žno dosáhnout pouze radioimunitním testem (^RI^AL je otavíte vý^hodn^é:

a) pou^žít antígen nebo protHátku s ^pokud možno vysokou rovnovážnou konstantou,

b) použít latexové částečky se středním prům^ěrem ⁰,3 až °,6 ^/tm, ^přičemž rozmez^í veltaosti č^áste^če^k má bý^{t p}o^ku^d možno úzké,

c) stanovovat extinkci světlem o vlnové délce v rozmezí 1,2 až 1,4 /tm,

d) použít relativně dlouhé reakční doby, například v rozmezí 1 až 3 hodiny a

e) zvýšit: toncentrarn sensibihsovan^o ^la221270 texového materiálu, za předpokladu, že se extinkce dá měřit.

Když se na druhé straně chce stanovit neznámý vzorek v relativně krátkém čase měřením reakční rychlosti (za použití kalibrační křivky B), je výhodné:

f) použít latexové částečky s relativně velkým středním průměrem,

g) zvýšit koncentraci částeček nosiče v latexu, za předpokladu, že je možné měření extinkce a

h) pokud možno zkrátit reakční dobu a použít například reakční doby v rozmezí 5 sekund až 10 minut, výhodně v rozmezí 10 sekund až 3 minuty.

Když se v tomto případě nanese doba, která je zapotřebí к dosažení předem určené hodnoty extinkce na osu pořadnic a koncentrace na osu úseček, a sice v logaritmickém měřítku, získá se kalibrační křivka ve formě přímky.

Předložený vynález byl výše popsán s ohledem na stanovení antigenu a/nebo protilátky ve vzorku, které je založeno na tom, že se ve vzorku obsažený antigen a/nebo ve vzorku obsažená protilátka aglutinuje se sensibilisovanými částečkami nosiče (to znamená použití LA-systému). Způsob podle předloženého vynálezu je také vhodný ke stanovení takového vzorku, u kterého je principem měření inhibiční účinek proti výše uvažované aglutinaci (to znamená, že se použije Ll-systém).

Neúplné antigeny, například heptaeny, se mohou například stanovit tak, že se způsob podle předloženého vynálezu použije na LI-systém. V tomto případě se může například fixovat antigen na nerozpustné částečky nosiče, jak to bylo použito při způsobu podle vynálezu, tímto způsobem sensibilisované částečky nosiče se nechají reagovat po kompetitivní reakci s daným množstvím protilátky, která zreagovala s antigenem o dříve stanovené koncentraci (například se standardním roztokem antigenu) a potom se stanoví extinkce získané reakční směsi. Tato opatření se opakují při různých koncentracích standardního roztoku antigenu, čímž se konečně získá kalibrační křivka C.

Nakonec se nechá reagovat neznámý vzorek se stejnou protilátkou stanovené koncentrace, načež se získaná reakční směs nechá reagovat se sensibilisovaným nosným materiálem. Tyto reakce by se měly provádět za v podstatě stejných podmínek, jaké byly použity při stanovení kalibrační křivky C. Extinkce reakční směsi získané reakcí se sensibilisovanými částečkami nosiče se potom stanoví a její hodnota se srovná s kalibrační křivkou C, čímž se stanoví množství (nebo koncentrace) protilátky v neznámém vzorku.

Způsobem podle výše uvažovaného Ll-systému se může stanovit také protilátka v neznámém vzorku tak, že se stanovovaná protilátka fixuje na nerozpustné částečky nosiče. Dále je v případě přání možné současně fixovat na nerozpustný nosič antigen a protilátku různého druhu a potom stanovovat antigen a protilátku v neznámém vzorku.

Tak se podaří podle předloženého vynálezu stanovit kvantitativně velký počet antigenů a/nebo protilátek, například

1. při zkouškách krve pacientů nebo dárců krve, což Je nezbytné nouzové opatření; například se mohou stanovovat substance krevních skupin, Au-antigen nebo HB-antigen nebo jiné znečištěniny v krvi nebo produkty vzniklé odbouráváním fibrinu nebo fibrinogenu (FDP), což se v novější době ukazuje jako prospěšné při dohledu na uzdravení pacientů s transplantací ledvin nebo při selhání ledvin;

2. při stanovení humanochoriongonadotropinu (hCG), který hraje důležitou rolí při diagnóze těhotenství nebo při sledování uzdravení chorionepitheliomu;

3. při stanovení humanochoriongonadotropinu nebo estriolglucuronidu, který představuje produkt látkové výměny folikulámího hormonu, v moči, přičemž toto stanovení má význam pro udržování těhotenství;

4. při stanovení oxytocinu v krvi, kterážto látka způsobuje stahování dělohy;

5. při stanovení určitých hormonů kůry nadledvinek, jako jsou například kortíkoidní hormony, aldosteron nebo adrenokortikotropní hormony (ACTH);

6. při stanovení insulinu u diabetiků nebo při stanovení folikulo-stimulačního hormonu (FSH), luteisačního hormonu, estrogenů, hormonu žlutého tělíska a podobně;,

7. při stanovení, u kterého se jedná o gastrointestinální hormony; a

8. při důkazu a stanovení protilátek v tělních tekutinách pacientů, kteří trpí alergiemi, syfilidou, hemolytíckou streptokokcídiosou, zarděnkami, autoimunitnító nemocemi, jako je například kollagenosa a jinými infekčními nemocemi.

Způsob podle předloženého vynálezu se může samozřejmě použít také ke kvalitativnímu nebo polokvantitativnímu stanovení těchto antigenů a/nebo protilátek.

Podle další formy provedení se týká předložený vynález zařízení ke stanovení antigenů a protilátek, které se používá při provádění způsobu podle předloženého vynálezu, a které je vyznačené

a) nerozpustnými částečkami nosiče pro antigen nebo protilátku, přičemž částečky nosiče mají střední průměr menší než 1,6

b) absorpční kyvetou o tlouštice v rozmezí 0,5 až 4 mm pro reakční směs získanou reakcí protilátky nebo antigenu fixovaných na nerozpustných částečkách nosiče s odpovídajícím antigenem nebo protilátkou nebo s jejich směsí v kapalném mé^diu a

c) fotometrem s ozařovacím zařízením k ozařování světlem o vlnové délce v rozmezí 0,6 až 2,4 μΐη.

Měřicí zařízení podle předloženého vyná^lezu může vedte ^po^dstatnýc^h znaků zaNzení a), b) a c) mít podobnou stavbu jako · dosavadní fotometrická zařízení.

Jak je vidět z obr. 4, zahrnuje základní stavba zařízení podle předloženého vynálezu ozařovací zařízení se zdrojem světla 1 a filtrem nebo prismatem 2; kyvetu 3 na vzorek pro měření reakce antigenů a proti^látky a srovnávací ^kyvet:u ^{4 p}ro sle^pý vzorek sloužící pro kompensaci; fotočlánky 5 a 6 pro měření světla, které prošlo odpovídajícími kyvetami za tvorby elektrických signálů zesnova^č 7 ^k zesílení elektrické® signálu a ukazovací nebo zapisovací zařízení 8 k · ukazování nebo zápisu zesíleného elektrického signálu.

Pokud se jedná o zdroj světla, může to být běžná wolframová lampa, jejíž světlo se pomocí filtru nebo prismatu 2 monochromatisuje, aby se vytvořil světelný paprsek se stanovenou vlnovou délkou v rozsahu 0,6 až 2,4 jtm, výhodně v rozsahu 0,8 až · 1,4 ^rn a ještě výhodněji v rozmezí 1 až 1,4 ^m. Tento ' pa^prse^k se potom vede s^krz ^kyvet^{y 4} a 5. Prisma · nebo filtr se může zvolit z takových produktů, které jsou vhodné k tomu, aby ηonochroηatisoval^y světlo za tvorby světla o vlnové délce ležící uvnitř oblasti vtoových ^délek vý^še uve^dených. Na^pří^klad se · může použít interferenční filtr, který dá · vá vtéovou dél® ¹²⁰⁰ ± 50 ja® fUtr, nebo se může použít křemenné nebo skleněné · prisma.

^Tímto z^půso^bem monocloromatisované světlo se spojí za pomoci štěrbiny nebo čočky, dříve než se vede kyvetou 3 se vzorkem a srovnávací kyvetou 4. Kyveta 3 na vzorek a srovnávací kyveta mohou být zhotoveny z ^průhledného slria nebo z ^průhledné s^yntetické pryskyřice (například akrylové pryskyřice] a mohou mít krabicovitý tvar s pravoúhlým ne^bo ^podlouh^lým ^pr^ůřezem (jak je ukázáno na obr. 5).

Tloušťka kyvety, to znamená vzdálenost mezi stěnami a a b (kterými je světlo vedeno), ^po^případ^ě mezi sténou na ^kterou je světlo ^přiv^ád^ěno . a sténou pro^leMo^ mů^že být v rozmezí 0,5 až 4 mm a výhodně v rozmez^í 1 až ^2,5 mm. Stěny ^prostupn^é pro sv^ětlo mají výhodně stupeň transmisse minimálně 30 % a výhodně 80 % nebo více pro sv^ětlo s vlnovou ^dél®u v rozmez^{í 0,}6 až 2,4 μηι.

Do zkušební kyvety 3 se dává reakční směs, která se získala tak, že se nechal reagovat antigen a/nebo protilátka nebo jejich směs s o^ovíd.aj® protilátkou ne® antigenem, které byly fixovány na nerozpustné částečky nosiče, v ^ka^paln^ém m^édiu a výše popsaným způsobem podle předloženého vy nálezu. Do srovnávací kyvety 4 se dává srovnávací vzorek, který obsahuje pouze disper si ^otitetky nebo an^en^ které jsou ^popřípadě fixovány na nerozpustné částečky nosiče, v kapalném médiu. Světelný paprsek, který prošel kyvetami 3, popřípadě 4, se zachytí fotočlánky 5, popřípadě 6, kde je přeměněn na elektrický signál, jehož síla je přímo úměrná intenzitě světla pohlceného odpovídající fotobuňkou. Mohou se použít ta^kov^é fotočtenty 5 a 6 za ^před^pokladu, že jsou vhodné k tomu, aby přijmuté světlo přeměňovaly na elektrický signál, jehož síla je přímo úměrná intenzitě světla. Například se mohou použít fotovodivé články se sirní^kem olovna^m. Elektrická signály v^ytvo^řené tímto způsobem ve fotočlánku se mohou za pomoci zesilovače 7 běžným způsobem zesílit a přivést na ukazovací zařízení, popřípadě na zapisovací zařízení 8.

Když se do ukazovacího nebo zapisovacího mechanismu zabuduje časový mechanismus, je možné měřit extinkci automatickv po proběhnutí předem určené reakční doby, nebo· měřit čas, který je zapotřebí, aby se dosáhlo předem stanovené hodnoty extinkce.

Podle výhodné formy provedení zařízení podle předloženého vynálezu je zkušební kyveta 3 opatřena míchacím zařízením, například pohybovatelnou míchací tyčí umístěnou v kyvetě.

Na obr. 6 je znázorněna výhodná forma provedení pohybového mechanismu pro pohýb směsi 9 sestávající ze vzorku a sensibilisovaných částeček nosného materiálu (například sensibilisovaného latexu), který je znázorněn ve zkušební kyvetě 3 podle předloženého vynálezu.

Jak je vtoět z o®. ⁶, může se za íácetem pohybu směsi 9 v kyvetě 3 pohybovat směrem nahoru a dolů míchací tyč 11 tvaru L tak, že se připojená tyč 14 tvaru T pohybuje nahoru a dolů, přičemž připojená tyč 14 je ^přes svoj^{í h}orní ^ploc^hou ^desku ¹⁴‘ v záběru s otáčejícím se kotoučem 12, který je poháněn excentrickou hřídelí 13. Vztahovou značkou 17 je označen kryt na odclonění sv^a, kterým je pri^jená ^{tyč 14, př}es rouru 15 vedena, která je na a v krytu 17 upevněna. Připojená tyč 14 se otáčením excentrického kotouče 12 stlačuje dolů a potom se opět pohybuje nahoru působením pružiny 16, která je umístěna mezi krytem 17 a horn^{í pl}oc^hou deskou 14‘ ^ipojené ^tyče I⁴.

Když se zkušební kyveta 3, která je znázorněna v zařízení podle předloženého vynálezu na obr. 4, opatří vestavbou, která je zn^ázoměna na obr. ⁶, mů^že se ^veté ³ odclonit od slunečního světla a směs sestávající ze stanovovaného vzorku a s^j^í^í-bilj^sovaných částeček nosiče (sensibilisovaného latexu) se může v kyvetě 3 promíchávat pomocí míchací tyče 11 tvaru L. · Zatímco se kyveta ozařuje světlem zvolené vlnové délk^y uvnitf oblasti bhz® mfiačierven®!!! sv^ět2'212 7 ‘0

20Г lu, je · možné směsí · ' pohybovat, aniž by se porušil světelný paprsek. Tím · se může · · při použití · výše · · uvedeného zařízení ¹ urychlit · požadovaná reakce, přičemž je dále možné ' rea^kcⁱ · bezprostředně· po · ^probě^hnutí ^pMem určené reakční ' doby · ukončit · a · stanovit přesné reakční dobu, po které · se dosáhne · předem · -stanovené ' hodnoty extinkce.

Následující - příklady slouží k · dalšímu objasnění · · předloženého vynálezu.

Pří klad·1

1. Příprava latexového 'činidla - sensibilisovaného · antifibrmogenovou protilátkou · - (Antifibrinogenlaatex-reagens, Anti-Fg-latexreagens)

K 10 ml roztoku · anti-humanofibriíiogenové (Fg) protilátky (o koncentraci'2 mg/ml) v glycinovém pufru se přidá 1 mml ' polystyrenového· latexu se · středním průměrem částeček ^0,481 · um [o^bsa^h pevn^é Шку · ЙШ ¹⁰ ' % · hmotnostních). Reakční ' ' směs se· míchá · podobu 30 minut při teplotě ' místnosti, · potom· se · zahřeje na teplotu · 40 °C a· míchá · se · po · dobu dalších 30 minut při této teplotě a nakonec se contri^fu^guje· za · cWazení na · teptetu · 2 · až · 4 °C po dobu 50 minut· při · rychlosti otáčení 12 ⁰⁰⁰ min^-1. Sraženina · se · oditaM dekantací ' a získané · částečky latexu, které jsou sensibilisovány antifibrmogenovou protilátkou, se suspendují 'v albuminov-ém · roz ^to^ku · z · hov^ího· séra · (o · ^koncentraci · 0,2 hmotnostních) za · tvorby, latexového činidla sensibilisovaného antifib-rmogenem o · kon centraci. ¹ % hmotnostní

2. Zhotovení kalibrační křivky

Do· z^kumav^ky··z um^é.hmoty · (o vnitřním průměru · 7 · mm’ · a^:délce 70umm) se dá 0,1 mi latexovém člmdta. · připraveného: ^podle · ode stávce · 1 · a · 0,3 · ml · standardního · fibrinogenového roztoku · (v· isotoniekém-roztoku/ chlos řictu so^dn^ého^, který· . obsahuje 0,2· · %; hmot* nostních · albuminu · z · hovězího · · séra), · ve- kterém' · · je · · fibrinogen· obsažen; v. koncentracích udaných v tabutae 1; Reakční · směs· se třepe, po · dobu · · 20 · minut · na · třepačce se? 2Θ0 · pohyby ·za minuta, ab^y · mohla · proběhnou·reakce mezi* antigenem · a .· protilátkou.· Bezprostřědfe· ně · potom · · se reakční kapalina: obsažeráb · ve · zkumavce · ^převede· . do · skleněn^é · absorpční kyvety · o· tloušťce* 2 · mm ·. a- stanov-nse extinkR ce pn vlnové détae použitého · sv^ěti^a · ^2. · na automatickém íspe-ktrofoto-grafír (Hitaschi Ltd., model EPS-3; .· přičemž? se · · jako· srovnávací rozto^k · pouSvá.· suspense· 0,l· ml··latexos vého · · činidla · obsahujícího · antШbriπogkπ;

· je· z^ře^děno · . 0,3 mt · isc^tonio^kého-^- roztca ^ku . . ctaondu so^dného^, který · obsahuje 0,2 % hmotnostní albuminu·z tov^ho·séra·). Maření se · · provádí · s · každým' · fibrmogenovým roztokem dvakrát: · Získané výsledky,· jsou*ua vedeny v tabulce 1.

TABULKA · 1 koncentrace · standardní^ho fibrmogenového roztoku · (um/ml) ¹ m^ěř·.

extinkce · při 1,2 um

2. měř.

stř; hodn.

0,1	0,336	0,363	0,350
0,2	0,836	0,778	0,807
0,3	1/083'	1,167	1(125:
0,4	1,330	1,333	1,332
0,5	1,403	1,430	1,41(7'

Když · se výše uvedené · hodnoty· vynesou graficky, ·· a sice koncentrace · standardního fibrmogenového roztoku na · osu úseček a extinkce (střední · hodnota) při 1,2· ^m · (vlnová · délka použitého · světla) · na osu · pořadnic, získá se · kalibrační · křivka- uvedená'’ na obr. 7.

3. Kvantitativní stanovení fibrinogenu v neznámém vzorku

Pacientovi se odejme vzorek krve, moči nebo tekutiny z hrudníku (z oblasti · pohrudnice) a · oddělí · se · · sérum nebo· · plasma·,..když se jedná při .· zkoušce o vzorek · · krve. Potom se alikvotní podíl 0,3 ml vzorku nebo zře^děn^ého · · vzor^ku zře^dí 0Д · п¹ · latexovšo.' · činidla · obsahujícího antifibrincgen, připrave né^ho · ^podte · odstavce · · ¹ 'a· z^působem ^přesn^ě podle odstavce · 2 se · stanoví · ^x-tinkce· re^čn^í sm^ěsi. ^Za použitf ^hbračnr ^vky · získdB» né · metodou · podle · odstavce · · 2. se odtóte^? podle získané hodnoty extinkce koncentrace fi^^b^r^^^iu^g^e^nu^.· Přitom· získané · výsledky jsou uvedeny · v. tabulce II.

Za · účelem srovnání jsou, v tabulce 2;u* ve^den^y · táké · ^ho^dnot^^y^> ^kter^é · b^ylý zfeká^··po* mocí · běžných · radiotaunitnícbí test^ů · (RIA* -metoda.) [S;· M. · Ratkey· a · kol., Brit. Jí·HanmatoL ³⁰·· ^975) · ¹⁴5^-· až. И9] > · a · b^né; metody na nosiči ^ujimaki, Tamura a, Takahashi,· Rins-ho Kagaku,; (Clinical· Science);. 12 (¹⁹76)_: ⁵⁰⁷; a · ^Fujⁱmaki^, Ikematsu, Ta-kettehi a · Kato, Rinsho · B^yor.i (jápanese · Journal · of dni^cal^; Pathology)· 21 ·. (1973) · 973.

TABULKA 2

č.	neznámý vzorek	zjištěná hodnota extinkce	koncentrace fibrinogenu vzorku íag/mll	v neznámém metoda s nosičem
materiál	zřeďovam faktor
metoda podle vynálezu	metoda RIA
1	moč	x 2	0,764	0,402	0,359	0,5
2	moc	x 16	0,162	5,178	5,117	8,0
3	moč	x 1	1,233	0,347	0,368	0,5
4	moč	x 1	0,090	0,021	0,024	méně než 0,5
5	moc	x 1	0,011	0,003	0,006	méně než 0,5
6	moč	x 1	0,175	0,042	0,037	méně než O,5
7	moč	x 1	0,066	0,016	0,011	méně než 0,5
8	moc	x 1	0,171	0,041	0,008	méně než 0,5
9	moč	x 1	0,020	0,005	0,007	méně než 0,5
10	moč	x 1	0,199	0,048	0,072	méně než 0,5
11	sérum	x 10	0,310	0,760	0,800	1,0
12	sérum	x 10	0,330	0,812	0,863	0,9
13	sérum	x 10	0,520	1,317	1,335	1,25
14	sérum	x 10	0,348	0,858	0,892	1,0
15	plasma prostá fibrinogenu kapalina	x 10	0,550	1,400	1,520	2,0
16	z hrudní dutiny napadené rakovinou	x 640	1,210	217,12	197,4	320

Z výše uvedených výsledků . je patrno, že hodnoty ^koncen^trace fibrlnogenu zjištěné způsobem podle předloženého vynálezu v po^dsta^{tě d}oibře souhlasí s ho^otamk ^kter^é byly dosaženy pomocí radioimunitního testu, který v současné době představuje nejpřesnější metodu stanovení. Korelační koeficient mezi metodou podle předloženého vynálezu a radioimunitní metodou činí 0,999.

Příklad 2

Způsobem popsaným v příkladě 1, odstavec 1, se př^iprav^{í l}atexov^é činelo sensiMlisované antífibrmogenem (které obsahuje ¹ % ^hmotnostm lat:exovýc^h čiástecek) s tím rozdílem, že se použije jiného polystyrénového latexu se středním průměrem částeček 0,234 ^m (který je možno získat od firmy Dow C^ei^ica^l Compan^y a má obsa^h pevné látky ¹⁰ °/o hmotnostních).

Potom se smfá ahkvótrn ^podU ⁰,l m^l tímto způsobem získaného latexového činidla sensibilisovan^ého ant^ifibrmo^genem s ^0,3 ml standardního fibrrnogenového roztoku (který obsahuje 0,5 <m fibrrnogenu v jednom litru) a reakční směs se třepe po dobu 5 minut při teplotě místnosti na třepacím zařízení ze strany na stranu při 250 kmitech za minutu. Přitom se nechá proběhnout reakce mezi antigenem a protilátkou. Nakonec se určí extinkce reakční směsi za použití světla o vlnové délce 1,2 um způsobem popsaným v příkladu 1, odstavec 2. K potvr zení reprodukovatelnosti měření se opakuje celý postup ještě třikrát. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 3.

Dále se opakuje výše uvedená metoda stanovení s tím rozdílem, že se místo standardního . fibrínogenového roztoku použije séra, které bylo isolováno ze vzorku krve získaného . z pamenta. ^itom se stejný způsob stanovení opakuje čtyřikrát v různých dnech, aby se . .zaručila reprodukovatelnost stanovení tělní tekutiny. Získané výsledky při tomto měření jsou rovněž uvedeny v tabulce 3.

měření č.

průměrná hodnota varianční koeficient

TABULKA 3 extinkce standardní fibrinogenový srnm roztok

0,582

0,565

0,562

0,545

0,564 ± 0,010

1,8 %

0,294

0,280

0,306

0,287

0,292 ± 0,010

3,4 %

Jak je vidět z hodnot uvedených v předchozí tabulce. 3, je způsob podle předloženého vynálezu · zcela reprodukovatelný jak při stanovení standardního fibrinogenového vzorku, tak při stanovení skutečných vzorků tělních · tekutin (sérum).

Příklad 3

К . 5 ml glycinov^ého pu^frov^ého rozto^ku se dá 100' mg' kysličníku křemičitého · ve formě mik-ročásteče-k (které · je možno· připravit tak, jak je · popsáno · v příkladě 1 zveřejněné japonské patentové · přihlášky c. 120497/75) se středním · průměrem · 0,32 /m (ačkoliv má 15'· % · téchté · ^částe^če^k průntér ^0,5 · ^/tm ne^bo více) a · směs se podrobí působení ' ultrazvuku o frekvenci 28 k-H-z· · po dobu · jédňé hodiny. Během této operace se ^dosáhne sus^pendování mikročásteček kysličníku· křemičitého. ^otom se připraví podle příkladu 1, odstavec 1, činidlo ve formě suspense kysličníku křemičitého sensíbilisovaného antifibrinovou protilátkou, _s tím rozdílem.;· že se místo polystyrénového latexu s velikostí částeček 0,481 /tm, použitého v příkladě 1, odstavec 1, použije tímto . způsobem vyrobená suspense· kysličníku křemičitého a.s.t^ím rozdílem, . že se . použije jiná koncentrace albumrnov^ého roztoku z hovězfoo · s^éra (0^,0-5 · % . hmotnostních). Potom.se za použití . suspendovaného · činidla kysličníku křemičitého sensibilisovaného antifibrínogenem stanoví extinkce standardního roztoku fibrinogenu zp^ůsobem ^popsaným- v pri^kla^dě 1, o^ds.tavec

2. Získané výsledky jsou . uvedeny v tabulce 4.

TABULKA · 4 koncentrace standardního. extinkce ^fi^bi^,n^c^g^en^ové^ho rozté^ku · při ^1,2 /tm (/ig/ml)

0,028

0,126

0,287

0,460

0,631

0^,2

0,4

0,6

0,8 1,0

Jak je popsáno v příkladě 1, odstavec 2, vytvon se · nanesernm výše·' · uvedených'^hodnot do grafu kalibrační křivka, která je· znázorněna na · obr. 8. Z' obr; 8-· je‘patrno, žě/zřetelná přímá linie vztahu · . mezi · koncentrací fibrňnogenu a extinkcí! nastává potom, když koncentrace · standardního · roztoku fibriiiogenu je 0,4 /tg/ml a více;

Potom se podrobí neznámé · vzorky (moč, sérum a kapalina z hrudní dutiny), které byly, získány, od pacientů, a které jsou.uvedené · v metodě-stanovení v · příkladě. . 1, · odstavec · 3,· aby. se zjistil obsah · fibrňnogenu v neznámém vzorku. Získané: výsledky.. jsou uvedeny v následující tabulce 5.

TABULKA · 5^;

č.	neznámý vzorek	extinkce	koncentrace . fibrinogenu, v neznámém vzorku Ng/ml)
materiál	zřeďovací faktor.
způsob podle vynálezu	metoda RIA
1	moč	x - 1	0,125	0,400	0,359
2	moč	x 10	0,210	5,000	5,117-·
3	moc	x 1	0,110	0,380	0,368
4	sérum	x 1	0,440	0,770	0J8O0.
5	sérum	x 1	0,490	0,830	0,892'
6	kapalina . z. hrudní	x 400	0,211	200	197,4

dutiny s rakovinou

Příklad·4

Stanoví se extinkce při vlnové délce použitého světla 1,2 a 1,7 /tm způsobem popsaným v příkladě 1, odstavec 1 a 2, s tím rozdílem, že se místo polystyrénového latexu se středním průměrem částeček 0,481 /tm (Dow Chemical) · použije polystyrénový la tex: se · stře^dmm · ^pr^ůměrem · částeček· 0^,804 /tm- (Dow · Chemical · Company,. s, obsahem· pevné . látkry· 10' % · hmotnostních) · a· kromě: toho se použije jiné koncentrace albuminu· z-hověztoo s^éra (^0,1 % hmotnostních). Získan^é výsled^ky jsou uvedeny · v násle^dující tabulce . 6.

TABULKA^ 6 koncentrace . standardního, fiibrinogenového . roztoku extinkce . při

1,2 μπ. 1,7 um

0,2	0,127	0,083
0,4	0,258	0,198
0,6	0,418	0,452'
0,8	0,388	0,592
1,0	0,258	0,622

Z hodnot uvedených v předchozí tabulce 6 je patrno, že se dosáhne zřetelné korelace mezi koncentrací fibrňnogenu a extinkci' v tom-c-případě; když . je . v^lnov^{á dé}lka . použitého světla- o .. faktor. více než 2 větší, . než. je.: . střední- průměr pevných, částeček nosného, materiálu (částečky . polystyrénového latexu).P ř í k 1 a d 5

Způsobem popsaným v příkladě 1, odstál vec 1, se. připraví latexové činidlo sensibi-lisované ·- antihumanchoriongonadotropinem - s ^tím rozdUem, že se místo antíhumanofibrl·no^genov^é prottíátky použije anhhumanochoriongonadotropinové protilátky . (Anti-KCG) . a . polystyrénový latex o velikosti - částeček .. 0,481 j^rn . se nahradí - polystyrénovým . latexem se střední velikostí ' částeček. 0,234. ^m.

^Za použití ta^kto získatóho tetexov^o činidla sensibilisovaného antihumanochoriongonad.otropinem se stanoví extinkce způsobem . popsaným v příkladě . 1, odstavec 2. Při tomto stanovení se ^pou^žívá světte o vlnov^é délce 1,2. «m, ale místo standardního rozto ku fibrrnogenu ^: se . používá .standardní . roztok humanochoriongonadotropinu. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 7.

TABULKA 7

koncentrace standardního roztoku . humanochoriongonadotropinu (IE/ml)	extinkce při . 1,2 μΐη
0,1	0,048
0,2	0,130
0,3	0,168
0,4	0,261
0,5	0,360
0,7	0,630
1,0	0,972.

Za použití hodnot .. uvedených . v . tabulce 7.· se ^ei^s^iOjí . . výše popsaným .. způsobem .kalibrační knvka. Na ^druhé straně se získají o^d r^ůzných ^pacie-n^tů . vz.o.r^ky moči,.. které·. se. použijí . pro . stanovení . humanochoriongonadotropinu . přítomného v moči. Při . tomto stanovení . se . postupuje stejně, jako je popsáno. . v příkladě .. 1, . odstavec . 3? Získané výsledky.. jsou uvedeny . v. následující . tabulce 8.

TABULKA 8

č.	neznámý . vzorek	extinkce-ι	koncentrace hCG . v. neznámém. vzorku . . (IE/ml)
materiál	zřeďovací faktor
způsob . podle, vynálezu	metoda RIA
1	moč	xl	0,400	0,564	0,482
2	moč	x 1	1,122	0,96'6	1,120
3	moč	x 1	0,955	0,944	0,857
4	moč	x 1	0,990	0,952:	0.,925.

Příklad . 6

Do . skleněné. . absorpční kyvoty. o . tloušťce 2: mm;. která- je. opatřena. míchací ¹ tyčí . tvaru L, . . se: dá 0,1 . ml . latexového . činidla ΒθηΒϋοϊ-lisovaného. antifibrinogenem, připraveného podle příkladu . 2. .a.0,3 . ml .standardního . roztoku . fibrínogenu .. o . koncentracích . uvedených v. následující. tabulce· 9l Extinkce.' reakční směsi i při; vínové; délče: použitého:. světlal . 1,2. μη sec kontinuálně . hlídá . jako v . příklad*·!, odstave® .2, .aby? se*zjistila doba; která.je. .potřebná k; tomu, . aby .. se . tosáhlb? extinkce. 0,5,. přičemž!. se: míchací .' tyč: pohybuje·. definovanou rychlostí 200 vibrací za minutu ve ver tikálním směru. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce . 9.

TABULKA 9 koncentrace standardního- . doba potřebná roztoku . fibrínogenu k . dosažení hodno'(mg/ml) ty . extinkce . 0,5 . (sj

2‘26,9

4'11,3

66,4

8. ·4,7

102,9

Výše uvedené hodnoty se vynesou na dvojitý logaritmický papír, pnčemž se koⁿcentrace stan^dar^dn^ího fibrinogenové^ho roztok nanese na osu úseček a ^do^ba ^po^třebn^{á k} dosažení hodnoty extinkce 0,5 se nanese na osu ^pořa^dnic. Ttao z^půso^bem se zís^ká ^kalibrační křivka. Tato kalibrační křivka má tvar přímky, jak je vidět z obrázku 9.

Potom se ^dá do al^bsor^pčn^í k^yvety o ftoušťce 2 mm, která je opatřena míchací tyčí tvaru L 0^,3 ml n^ěja^kého nezn^ám^ého vzoráu (moč^, s^érum a te^kutrna z hrudní dutiny], ^kter^é b^yly zfe^ny o^d r^ůznýc^{h p}acientů a přidá se 0,1 ml výše uvažovaného latexového činidla sensibilisovaného antifibrínogenem. Výše popsaným způsobem se měří čas, který je zapotřebí k ‘ dosažení hodnoty extinkce 5, při použití světla o vlnové délce 1,2 /im. Hodnota koncentrace fibrniogenu, která odpovídá tomuto času se dá odečíst z kalibrační křivky připravené výše popsaným způsobem. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 10.

TABULKA 10

č. neznámý vzorek doba potřebná materiál zráďovam к dosažní exttace faktor 0,5 (s) koncentrace fibrinogenu ve vzoráu (ug/ml) způsob podle metoda vynálezu RIA

1	moč	x 1	9,2	4,5	5,117
2	kapalina z hrudní dutiny s rakovinou	x 50	11	195	197,4
3	sérum	x 1	25	2,1	2,210
4	sérum	x 1	20	2,5	2,302
5	sérum	x 1	3,8	8,6	9,020
6	sérum	x 1	12	3,7	3,723

Příklad 7

1. Příprava latexového činidla sensibilisovaného oxytocinem

Smísí se 1,0 ml oxytocinového roztoku o koncentraci 220 IE/ml ve vodném 0,1 N roztoku kyseliny octové · s polystyrénovým latexem v množsM ^0,5 ml o středm vel^osU průměru částeček 0,481 /im (Dow Chemical Compan^y, o^bsah pevn^{é látky} čim ¹⁰ % hmotnostních). Reakční směs se míchá při teplotě místnosti po dobu 2 hodin a potom se během 20 minut a za chlazení na teplotu 2 až 4 cc odstřeďuje při 12 000 otáčkách za minutu. Sraženina se oddělí dekantací a zís^kan^{é l}at:exov^é č^ásteč^ky sensibiUsovató oxytocinem se dispergují ve 4 ml pufrového roztoku z kyseliny ethylendíamintetraoctové a ^^п^ ^který obsahuje 0^ % ^hmotnostních albuminu z hovězího séra. Přitom se v^ytvon ^la^texov^é mntote sensibihsovaM oxytocinem, které obsahuje latexové · částečky v ^koncentraci 1 % ^hmotnostnL

2. Stanovení optimální koncentrace oxytocinového antiséra

Smísí se alikvótní podíl 0,1 ml latexového činidla sensibilisovaného oxytocinem, připraveného podle odstavce 1, s 0,1 ml isotonic^kého· roztoči chloridu sodn^ého a ^0,2 m^l oxytocrnov^ého an^tis^éra^, která je naře^děno o faktory uvedené · v tabulce 11 isotonickým roztokem chloridu sodného. Potom se reakční směs třepe na třepacím zařízení s přímočarým pohybem, které pracuje při 200 pohybech za minutu. Reakční směs se takto třepe po dobu 12 minut a stanoví se extink ce při vlnové délce použitého světla 1,2 ^m, z^působem ^po^psaným v' ^příkla^dě 1, o^avec 2. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 11.

TABULKA 11

zřeďovací faktor oxytocinového anfts^a	extinkce při 1,2 μτη
x 20	1,175
x 30	0,618
x 40	0,393
x 50	0,327
x 80	0,220
x 100	0,162

Z výše uvedených hodnot je zřejmé, že optimální koncentrace oxytocinového antiséra je při zřeďovacím faktoru asi 30.

3. Zhotovení kalibrační křivky

Do zkumavky z umělé hmoty se dá 0,2 ml roztoku, který se získal naředěním oxytocinového antiséra použitého v odstavci 2 o ^fa^ktor ³⁰ a ^0,1 m^l stan^dardního oxytocinov^ého rozto^ku (ve vo^dné ^0,1 N ^kyseHn^ě octov^é) o koncentracmh uve^dených v n^ásledující tabulce · 12 a směs se dobře promísí. ^potom se rea^kčrn směs nech^á stát po dobu ³⁰ minift pH teplote mfetnosti a ^přidá se 0,1 ml latexového činidla sensibilisovaného oxytocinem, připraveného podle odstavce 1. Získaná směs se třepe po dobu 12 minut na ^třepacím zařfeení s ^pnmo^čarým ^poh^ybem ^pri ²⁰⁰ taftech za mrnurá. ^Tímto z^působem zfe^kaná ^kapahna se ^převede do stané^

221 2 7 05

ЗЯ absorpční ку vety a tloušťce 2, mm ar stanoví 1; odstavec 2. Získané- výsledky jsou, uvede? se,extinkce při vlnové délce použitého svět- ny v následující tabulce 12.

Ia 1,2. ₍um,;.. způsobem popsaným v příkladě

TABULKA. 12

koncentrace standardního roztoku oxytocinu (μΙΕ/ml)	extinkce D+ při 1,2 wm
2000 1500 1000 500, 300 0	0,395 0,183 0,450 0,128 0,483 0,095 0,525 0,053 0,550 0,028 0,578 —

D.t = extinkce při,koncentraci standardního oxytocinového roztoku nula minus extinkce při . udané koncentraci.

Když^; se nanesou číselné hodnoty uvedené v předcházející tabulce graficky, a sice koncentrace standardního oxytociňového roztoku na osu úseček a hodnota D na osu pořadnic, získá se přímka, jak je to patrno z obr: 10. Za použiti kalibrační křivky zís^ kané tímto způsobem, je možné dosáhnout stanovení oxytocinu v séru těhotných žen.

Příklad- 8

1. Příprava latexového činidla sensibilisovaného humanochoriongonadotropinem

V 5 ml 0,05 N kyseliny chlorovodíkové se rozpustí 7900 IE/ml humanochoriongonadotropinu. (hCG) a reakční směs, se hydrolysuje po dobu jedné hodiny při teplotě 80 °C. Potom i se roztok dialysuje a odsátím se přefiltruje, hydrolysovaný humanochoriongonado.tropin se rozpustí ve 2 ml 0,05. M borátového pufrového roztoku (s hodnotou pH 8,7) az zředí se na celkový objem 10 ml. Potom se.- pomalu přidává, alikvotní podíl 5 ml 2.% roztoku: polystyrénového., latexu (který je možno získat od firmy^ Dów, chemical,. s obsahem pevné látky 10 % hmotnostních), se středním průměrem částeček 0,481 к roztoкш hydmlysovaného. humanoclioriangpnadotropinu. Získané částečky latexu sensibilisovaného: humanochoriongonadotropinem se potom centrifugu jí. po - dobu. 20 minut, při 13 000. otáčkách za minutu, načež, se. odstředěné, sensibilisované latexové částečky oddělí; a suspenduje se. v. 10 ml O,2?/o roztoku albuminu,z hovězího.séra v boritanovém pufrovém roztoku. Sus-p.ense.se potom odstředí, přičemž sraženina se při centrifugách promyje boritanovým pufrem a nakonec se suspenduje v, 10 ml i roztoku , pufru. . Tímto způsobem se získá latexové činidlo, sensibilisované humanchoriongonadotropinem,., které obsahuje 1 % hmotnostní latexových částem cek.

2. Zhotovení kalibrační křivky

Optimální koncentrace antihumanchoriongonadotropinového séra se zjistí způsobem popsaným v příkladě 7, odstavec 2 (zřeďovací faktor má v tomto případě hodnotu 100). Potom se dá do zkumavky z umělé hmoty 0,2 ml roztoku antihumanochoriongonadótropinového séra, který se získá naředěním séra isotonickým roztokem chloridu sodného o faktor 300 a 0,1 ml standardního humanchoriongonadotropinového roztoku o koncentracích uvedených v následující tabulce 13 a reakční směs se třepe po dobu 10 minut. Potom se přidá 0,1 ml latexového činidla sensibilisovaného humanochoriongonadotropinem a reakční smměs se třepe po dobu 10 minut na třepacím kmitavém zařízení při 200 kmitech za minutu. Získaná kapalina se převede do skleněné absorpční kyvety o tloušťce 2 mm a změří se způsobem popsaným v příkladě 1, odstavec 2, extinkce při_; vlnové délce použitého světla 1,0 Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 13.

TABULKA 13

Koncentrace standardního qxtinkce humanochoriongonadotropino- při 1,0 ,um vého roztoku (IE/ml)

0,140.

0,208

0,1 0,271

Když se výše uvedené číselné hodnoty vynesou graficky a sice logaritmus koncentrace standardního humanochoriongonadotropinového roztoku na osu úseček a extinkce na osu pořadnic, tak se získá kalibrační křivka, která je znázorněna na obr. 11, která má v oblasti koncentrací, ve kterých přichází v úvahu měření, v podstatě lineární průběh.

Tím je umožněno za použití této kalibrační křivky stanovení humanochoriongonadotropinu v séru.gravidních žen.

Příklad 9

Ve zkumavce z umělé hmoty se smísí 0,1 mililitru latexového činidla sensibilisované221270 ho antifibrinogenem připraveného podle příkladu 1, odstavec 1, (přičemž střední průměr částeček polystyrénového latexu činí 0,481 μπι a sensibilisované latexové částečky jsou v koncentraci 1 % hmotnostního) a 0,3 ml standardního fibrinogenového roztoku (v isotonickém roztoku chloridu sodného, který obsahuje 0,5 % hmotnostních albuminu z hovězího séra) o koncentracích uvedených v následující tabulce 14. Reakční směs se třepe na kmitavém třepacím zařízení při 200 kmitech za minutu. Nakonec se určí extinkce při vlnové délce použitého světla 1,2 μΐη způsobem popsaným v příkladě 1, odstavec 2. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 14.

TABULKA 14

koncentrace standardního roztoku fibrinogenu (mg/ml)	extinkce při 1,2 ,um
10	0,048
20	0,125
40	0,324
60	0,540
80	0,718
100	0,802

Když se na základě výše uvedených číselných hodnot zhotoví kalibrační křivka, zjis tí se dobrá korelace mezi koncentrací standardního fibrinogenového roztoku a extinkcí. Z toho důvodu je možné způsobem podle předloženého vynálezu stanovit extrémně nepatrná množství fibrinogenu v rozsahu nanogram/milimetr, a to s takovou citlivostí, která je srovnatelná s radioimunitním testem (RIA).

Příklad 10

Připraví se latexové činidlo sensibilisované antifibrinogenem, způsobem podle příkladu 1, odstavec 1, které obsahuje částečky latexu sensibilisované antifibrinogenem v koncentraci 0,75 % hmotnostních, 1 % hmotnostní, případně 2,0 hmotnostních, s tím rozdílem, že se použije jiný latex o velikosti částeček 0,35 μπι. Pro každé latexové činidlo sensibilisované antifibrinogenem, připravené tímto způsobem, se způsobem popsaným v příkladě 1, odstavec 2, zhotoví kalibrační křivka (při vlnové délce použitého světla 1,2 μπι a době třepání 10 minut). Tyto kalibrační křivky jsou znázorněny na obr. 12. Jak je z obr. 12 patrno, zvyšuje se citlivost důkazu fibrinogenu s koncentrací sensibilovaných latexových částeček v latexovém činidle sensibilisovaném antifibrinogenem.

Claims (32)

1. Způsob stanovení antigenů a protilátek, vyznačený tím, že se protilátky nebo antigeny fixují na nerozpustné částečky nosiče se středním průměrem menším než 1,6 μΐη, nerozpustné částečky se sensibilisují, protilátky nanesené na nosném materiálu a/nebo na nosném materiálu nanesené antigeny se nechají reagovat s odpovídajícími antigeny nebo protilátkami nebo s jejich směsí v kapalném médiu a změří se extinkce reakční směsi po ozáření světlem o vlnové délce v rozmezí 0,6 až 2,4 μΐη, která je nejméně 1,5krát větší, než je střední průměr částeček nosiče.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že použitý nerozpustný nosný materiál má střední průměr částic v rozmezí 0,1 až 1,0 μΐη.

3. Způsob podle bodu 2 vyznačený tím, že použitý nerozpustný nosný materiál má střední průměr částic v rozmezí 0,2 až 0,8 μΐη.

4. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že částečky nosiče sestávají převážně z jemného prášku organické vysokomolekulární látky nebo anorganického materiálu, který je v kapalném médiu v podstatě nerozpustný.

5. Způsob podle bodu 4 vyznačený tím, že se jako jemného prášku vysokomolekulární organické látky použijí jemně rozmělněné

YNÁLEZU syntetické pryskyřice, bakterie nebo části buněčných stěn.

6. Způsob podle bodu 4 vyznačený tím, že se jako jemného prášku organické vysokomolekulární látky použijí částečky polystyrénového latexu.

7. Způsob podle bodu 4, vyznačený tím, že použitý jemný prášek z anorganického materiálu sestává nejméně z jedné látky ze skupiny, zahrnující kovy, anorganické kysličníky nebo minerály.

8. Způsob podle bodu 4, vyznačený tím, že se jako jemného prášku z anorganického materiálu používá jemně rozemletého kysličníku křemičitého, kysličníku hlinitého nebo kysličníku hlinitokřemičitého.

9. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se reakce nerozpustných částeček nosného materiálu sensibilisovaných protilátkami nebo antigeny, a antigeny nebo protilátkami nebo jejich směsí, provádí za takových podmínek, aby byl vzájemný kontakt částeček nosiče pokud možno silně urychlen.

10. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se reakce nerozpustných částeček nosného materiálu sensibilizovaných antigenem nebo protilátkou, s antigeny nebo protilátkami nebo jejich směsí, provádí za takových podmínek, které urychlují vzájemný kontakt částeček nosiče a potom se měří extinkce vzniklé reakční směsi.

11. Způsob podle bodu 9 nelbo 10, vyznačený tím, že se reakce provádí za pohybu reakční směsi.

12. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se množství nebo koncentrace antigenů nebo protilátek nebo obou materiálů ve zkoumané kapalině stanovuje tak, že se napřed za specifických podmínek nechá reagovat antigen, protilátku nebo oba materiály obsahující kapalinu s odpovídající protilátkou a/nebo antigenem, nanesenými na nosný materiál a ,po stanovené době se měří extinkce reakční směsi.

13. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se množství nebo koncentrace antigenů nebo protilátky nebo obou materiálů ve zkoumané kapalině stanoví tak, že se za specifických podmínek nechá reagovat antigen, protilátku nebo oba tyto materiály obsahující kapalinu s odpovídajícími antigeny a/nebo protilátkami nanesenými na nosný materiál a stanovuje se doba, která je zapotřebí, aby se dosáhlo dříve určené extinkce reakční směsi.

14. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se použije světla o vlnové délce 0,8 až 1,4 pm.

15. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se použije světla o vlnové délce v rozmezí 1,0 až 1,4 μιη.

16. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že .použité světlo má takovou vlnovou délku, která je minimálně dvakrát větší, než je střední průměr částic nosiče.

17. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se částečky nosiče používají v takovém množství, že koncentrace nosného materiálu v reakční směsi je 0,1 až 1 °/o hmotnostní.

18. Způsob podle bodu 17, vyznačený tím, že se částečky nosiče používají v takovém množství, že koncentrace nosného materiálu v reakční směsi je v rozmezí 0,2 až 0,6 % hmotnostních.

19. Způsoib podle bodu 1, vyznačený tím, že se jako kapalné médium používá voda nebo směs vody a s vodou mísítelného organického rozpouštědla.

20. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se к suspenzi částeček nosiče, na které jsou fixovány charakteristické antigeny nebo protilátky, přidává zředěná nebo nezředěná zkoumaná kapalina, která obsahuje antigeny nebo protilátky a nechá se reagovat.

21. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se nejprve přidá antigen nebo protilátka ke zkoumané kapalině, která obsahuje sta novované antigeny nebo protilátky a nechá se reagovat, načež se přidá suspenze nerozpustných částeček nosiče, na kterém je fixován antigen nebo protilátka a tato suspenze se nechá reagovat s reakční směsí vytvořenou při první reakcí.

22. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že protilátky nebo antigeny se na částečky nerozpustného nosiče fixují fyzikální a/nebo chemickou adsorpcí.

23. Způsoib podle bodu 1, vyznačený tím, že jsou antigeny nebo protilátky fixovány, popřípadě vázány na nerozpustné částečky nosného materiálu chemickou vazbou za pomoci kopulačního činidla.

24. Zařízení ke stanovení antigenů a protilátek, vyznačené tím, že sestává z nerozpustných částeček nosiče pro antigeny a protilátky, přičemž částečky nosiče mají střední průměr menší než 1,6 μπι a jsou umístěny do absorpční kyvety o tloušťce 0,5 až 4 mm pro reakční směs vzniklou reakcí antigenů nebo protilátky fixovaných na nerozpustném nosiči s odpovídajícími antigeny nebo protilákami nebo jejich směsí v kapalném médiu a fotometru s ozařovacím zařízením к ozáření kyvety světlem o vlnové délce ležící v rozmezí 0,6 až 2,4 μιη.

25. Zařízení podle bodu 24, vyznačené tím, že částečky nerozpustného nosiče mají střední průměr v rozmezí 0,1 až 1,0 μτη.

26. Zařízení podle bodu 25, vyznačené tím, že částečky nerozpustného nosiče mají střední průměr v rozmezí 0,2 až 0,8 μπι.

27. Zařízení podle bodu 24, vyznačené tím, že tloušťka absorpční kyvety je 1 až 2,5 mm.

28. Zařízení podle bodu 24, vyznačené tím, že stěna absorpční kyvety, skrz kterou je vedeno světlo, je zhotovena z transparentního skla nebo transparentní syntetické pryskyřice, která vykazuje pro světlo o vlnové délce v rozmezí 0,6 až 2,4 μΐη propustnost minimálně 3O°/o.

29. Zařízení podle bodu 24, vyznačené tím, že fotometr obsahuje zařízení pro ozařování, které poskytuje světlo se specifickou vlnovou délkou v rozmezí 1,0 až 1,4 μιη.

30. Zařízení podle bodu 24, vyznačené tím, že fotometr obsahuje zařízení pro ozařování, které poskytuje světlo se specifickou vlnovou délkou v rozmezí 0,8 až 1,4 μιη.

31. Zařízení podle bodu 24, vyznačené tím, že kyveta je opatřena zařízením pro pohybování reakční směsí.

32. Zařízení podle bodu 31, vyznačené tím, že zařízení pro pohybování reakční směsí zahrnuje v kyvetě umístěnou pohyblivou míchací tyč.