CN87108349A - 用于植物保护的dna分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括编码胰蛋白酶抑制剂的结构基因的重组DNA分子，具体说是豆科植物的胰蛋白酶抑制剂，更具体说是来自豇豆(豇豆胰蛋白酶抑制剂或CpTI)，或者说所涉及的重组DNA分子包括的结构基因编码具有与CpTI相似的性质和/或与之具有相当程度的同源性的蛋白质。

本发明还涉及包括这样一种DNA分子的重组DNA质粒，以及将此DNA掺入植物核基因组中。

Description

本发明涉及通过植物基因工程抵抗病虫害而保护植物。本发明尤其涉及通过将编码抗昆虫的专门基因转移到植物中，从而保护棉花和谷类作物，但也可应用于其他作物，即那些由于大田和储藏病虫害造成严重经济损失的作物。这些作物包括棉花、玉米、水稻、大豆、甜菜、小麦、水果、蔬菜和葡萄等。具体地说，本发明涉及来自豆科植物的胰蛋白酶抑制剂基因，尤其是豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）。

虫害给作物造成的损失平均为农业年产量的5-15%。据估计，这一损失的经济价值为每年好几十亿美元。此外，每年还要花费用于杀虫剂及喷雾撒粉装置的资金。例如，棉花作物对于某些虫害非常感感，其中包括昆虫。仅仅在美国，就至少有125种昆虫对棉花造成经济损失。棉花杀虫剂在全球杀虫剂费用中占有最大比例，1985年为13.35亿美元，相当于总费用的31%。在美国，每年的损失平均为5亿美元，而且，种植者为了获得有收益的产品，还在杀虫剂及其施用方面用去了差不多同样的资金。棉花从种子到收获阶段都受到虫害的侵袭。一般说来，早期侵袭的虫害影响产量，而晚期侵袭的虫害则影响质量。

一组主要的棉花虫害即棉铃虫〔属于棉铃虫属（Heliothis），包括美洲烟夜蛾（H.virescens）、棉铃虫（H.armigera）和美洲棉铃虫（H.zea）〕。除了棉花以外，棉铃虫还侵染范围很广的植物，侵袭多种谷物如玉米和高粱，以及其他作物如烟草、菜豆、大豆和向日葵。

另一组棉花虫害是红铃虫（Pectinophora    gossypiella），它在全球范围内是棉花最重要的虫害，在发展中国家，它能毁坏高达70%的作物。另一组虫害是棉象虫（Anthonomus    spp.，包括A.grandis）。棉铃虫、红铃虫和棉象虫的幼虫严重降低棉花产量，因为它们在棉蕾（芽）和棉桃中生长，导致棉蕾和小棉桃的死亡和脱落。在较大的棉桃中，棉绒变色并腐烂。另一个严重侵袭棉花的昆虫属是粘虫属（Spodoptera），包括斜蚊夜蛾（S.litura）和棉花叶虫（S.littoralis）。粘虫也是玉米、水稻、高粱和烟草的虫害。

由于虫害而减产的另一种主要作物是玉米。1985年，全世界用于玉米杀虫剂的总费用为4.7亿美元。仅仅在美国，每年由于昆虫危害造成的损失估计在9亿美元之上。条叶甲（Diabrotica    spp.）是一种重要虫害，在美国，统计其造成10-30%的减产。在美国，玉米的另一种毁灭性虫害是欧洲玉米螟（Ostrinia    nubilalis），第一代螟虫在叶和茎上生长，从而使营养穗得不到养分。在美国，1970-75年期间由玉米螟造成的年损失计算为每年3.1亿美元。玉米的其他重要虫害还有米象（Sitophilus    oryzae）、美洲棉铃虫（在美国，它造成的损失估计为每年7千5百万-1亿4千万美元之间）、二化螟（Chilo    suppressalis）和地老虎（Agrotis    spp.），它们也侵袭棉花、烟草和多种蔬菜。

尽管可以得到范围很广的化学杀虫剂，昆虫的危害仍然是一个严重问题。许多杀虫剂有严重缺陷，即对于人类和野生生物具有很高的毒性及相对较高的植物毒性。昆虫对于化学杀虫剂的抗性也是一个日益加剧的问题。

植物育种学家为了降低虫害侵袭导致的损失，已试图通过常规的育种程序，将抗昆虫基因导入作物品种中。大多数植物对大多数昆虫表现出抗性，抗性能够是物理的或化学的。例如，许多植物叶片上的毛能够阻止小昆虫靠近叶面进行噬咬。在另外的例子中，植物利用多种复杂的次生化学物质使其组织具有排斥性或毒性。这些种类的抗性可能受到许多基因的控制，因此植物育种学家很难利用它们。抗性品种通常表现出产量降低，因此在经济上是行不通的。这也许是因为专一的昆虫抗性与其他有害特征结合在一起，而人们一直不能将这两种效应轻易地分离开来。

目前，植物生物工程领域的最近发展提供了这种一种前景，即通过在现有种质中加入编码专一特性的基因而扩展植物改良的范畴。分离和转移抗除莠剂、抗病、提高产品质量和抗昆虫基因的研究正在进行之中。

有人认为，通过基因工程建立的抗昆虫植物在多方面优于使用化学杀虫剂〔关于此讨论参见Agrow（1986）（29）中的报告〕。这些优点包括：

1）保护季节长

2）总是在最敏感的阶段处理昆虫

3）保护不受天气影响

4）保护难于处理的植物组织

5）只作用于吞食作物的昆虫

6）物质仅限于植物组织中

（7）活性因子是可生物降解和非毒性的

但也有好几种可能的限制因素：

1.能够进行转移的植物种

尽管这是一个关键因素，但转化主要粮食作物的技术可能不久即将实现。最近关于棉花转化的报道〔Umbeck，P.，Johnston，G.，Barton，K.，Swain，W.，基因转化的棉花（Gossypium    hirsutum    L.）植株.Bil/Technology    5：263-266，1987〕和玉米转化的权利要求表明，在转化研究中的大量投资很快将产生合适的实施方案。

2.抗虫害的活性范围

一般说来，杀虫剂具有广谱的抗虫害活性。通过基因工程导入作物的生物杀虫剂将需要在足够范围内具有活性，以使它们能够得到有价值的使用。

已经提交了利用苏云金杆菌（Bacillus    thuringiensis）晶体蛋白基因产生昆虫抗性植物的专利申请（EPO    84306494.0和86300291.1）。然而，在申请案EPO    84306494.0中，说明书仅仅指出，烟草天蛾（Manducasexta）“在转化的含有可在植物中表达的全长杀虫蛋白基因的烟草愈伤组织上饲养时，可观察到由苏云金杆菌晶体蛋白毒性导致的症状”。还没有给出含有此基因的植物的杀虫效应的资料。86300291.1号申请确实给出了关于基因转移的烟草植株中苏云金杆菌基因效应的资料，但那些数据仅限于一种昆虫，即烟草天蛾。

将苏云金杆菌基因插入植物中以提高昆虫抗性的潜在缺陷是，不同的菌株产生具有不同特性的毒素。这可能意味着必须将好几种苏云金杆菌基因结合起来，以使作物对虫害的抗性谱有足够宽的范围。

3.不利的副效应

这一点将是很重要的，即含有昆虫抗性基因的基因转移植物的产量不能有任何明显的降低。

人们一直有些担心，将抗昆虫基因导入作物中可能会产生环境效应，即使得害虫不间断地与“内装的杀虫剂”相接触。可以认为，这将给害虫施加很高的选择压力并加速抗性的发展。然而，一个相反的论点是，胰蛋白酶抑制剂直接作用于主要消化酶的活性位点。昆虫通过靶位点的可存活突变而发展抗性的机会可能会很低。可能只有通过昆虫代谢体系中复杂的多重变化，才能够建立抗性，使抑制剂在行使杀虫功能之前去毒。

在文献中已经有值得考虑的推测，认为植物含有多种蛋白，它们可能通过抑制消化酶或其他酶而赋予植物以抗病原体或抗昆虫危害的性能（Ryan，C.A.调节天然的植物保护反应的昆虫诱导的化学信号，DennoR.F.&    McClure    M.S.（eds）.Variable    Plants    and    Herbivoresin    Natural    and    Managed    Systems，pp    43-60，Academic    Press，1983）。

以前已经表明，只有存在于植物发育某一特殊阶段（即成熟的种子）的天然的胰蛋白酶抑制剂，才能在掺入人工食物中后，对于多种其他植物的虫害表现出强大的毒性。令人惊奇的是，如果将胰蛋白酶抑制剂基因转移到另一种植物中后（使其能在植物的整个发育阶段表达），基因转移植物的抗昆虫性则大大加强。因此，有可能将编码抗广谱虫害的专一性基因转移到有益于农业的作物基因型中。

最近有证据表明，蛋白酶抑制剂是植物营养值和昆虫消化生理间复杂的相互作用中的一部分（Broadway，R.M.，Duffey，S.S.，Pearce，G.，Ryan，C.A.植物蛋白酶抑制剂：一道抵抗草食昆虫的防御？Ent.Exp.Appl.41：33-38，1986）。然而，直至目前，还设有决定性的证据表明，蛋白酶抑制剂在植物中表达后确实提高抗昆虫性。

本发明涉及编码豆科植物胰蛋白酶抑制剂多肽成分的DNA重组分子。更具体地说，本发明涉及携有豇豆（Vigna    unguiculata）胰蛋白酶抑制剂基因编码顺序的DNA重组质粒、它的生产及利用它将豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）的表达特性转移到其他植物中，以提高它们对于各种虫害的抗性。

以前的实验已经确定，豇豆种子中存在的CpTI量与豇豆抗豆象甲虫侵袭的性能有关（Gatehouse，A.M.R.，Gatehouse，J.A.Dobie，P.，Kilminster，A.M.，Boulter，D.，豇豆昆虫抗性的生化基础.J.Sci.Food    Agric.30：948-958，1979;Gatehouse，A.M.R.Boulter，D.，豇豆和其他豆科植物的胰蛋白酶抑制剂对于豆象甲虫的抗代谢效应的评价，J.Sci.，Food    Agric.34：345-350，1983）。在美国专利4，640，836（1987年2月3日批准）中，描述了利用豇豆中天然的胰蛋白酶抑制剂剂保护植物以抵抗虫害的侵袭，所用方法是使昆虫与有效杀伤量的一种或多种来自豇豆的胰蛋白酶抑制剂相作用。该专利报道，纯化的CpTI对于下列鳞翅目害虫具有抵抗活性：美洲烟夜蛾;棉花叶虫;玉米禾螟（Chilopartellus）;棉铃虫和鞘翅目害虫杂拟谷盗（Tribolium    confu-sum）。表1概括了已经出版的CpTI在人工食物中抗虫害效应的研究资料。本发明提供了这样的DNA分子，它编码在基因工程生物中产生各种CpTI所需的基因信息。

任何一种含有CpTI基因的基因工程作物必须对人类和环境是安全的。有许多理由表明CpTI基因将是安全的。

在世界上许多地区，豇豆是一种主要的粮食作物（Singh，S.R.Rachie，K.O.1985，Cowpea    research，production    and    utilization.Wiley）。虽然一般是煮熟了吃，但也能够生吃。

另外，在人的消化道中（及其他哺乳动物的消化道中），蛋白通过好几种不同类型的酶降解。CpTI对胃蛋白酶的钝化作用非常敏感（A.Gatehouse，未发表结果），老鼠饲喂试验的初步数据表明，给老鼠饲喂含有CpTI的膳食并不降低体重的增长（D.Boulter，未发表结果）。

表1    在人工膳食研究中CpTI的杀虫活性

昆虫    侵袭的作物种    参考文献

鳞翅目害虫玉米禾螟    玉米、高粱、甘蔗和水稻    US4，640，836

棉铃虫    棉花、菜豆、玉米和高粱    US4，640，836

美洲烟夜蛾    棉花、烟草    US4，640，836

美洲棉铃虫    玉米、棉花、菜豆和烟草    US4，640，836

棉花叶虫    棉花、烟草、高粱和水稻    US4，640，836

鞘翅目害虫杂拟谷盗    大多数面粉    US4，640，836

豆象甲虫    豇豆、大豆    Gatehouse    and

Boulter（1983）

本发明的主要目的是提供重组的质粒构建体，它含有在载体中的CpTI基因的完整编码顺序，该载体能够导入靶植物中并有助于重组植物的选择，还能使导入的基因在这些植物中得到表达，这样的植物被转化后由于组织中CpTI多肽的存在而提高了对虫害的抗性。

本发明提供了包括编码胰蛋白酶抑制剂的结构基因的DNA分子，最好是来自豆科植物的胰蛋白酶抑制剂，尤其是来自豇豆（豇豆胰蛋白酶抑制剂或CpTI），或者结构基因编码其性质与CpTI相类似的蛋白，并根据惯常的科学标准，它与CpTI具有足够程度的同源性，使人们通常能够将它看作是CpTI定族中的一员。

下面对附图作出说明，在附图中：

图1    表明来自豇豆的Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂的氨基酸顺序;

图2    表明CpTI    fⅣ的氨基酸顺序，及在那些最适于作为CpTIcDNA的合成的混合寡核苷酸探针的区域所推测的可能的编码顺序;

图3    表明插入pAGC1中的编码链的核苷酸顺序;

图4    表明对应于CpTI的全链长cDNA克隆的分离战略;

图5    表明用在pROK2载体中的pUSSRc    3/2构建体转化烟草植株的战略;

图6    表明插入pUSSRc    3/2中编码链的核苷酸顺序;

图7    表明插入pUSSRd    4/6编码链的核苷酸顺序;

图8    是对转化烟草（N.tabacum）的叶组织中CpTI表达的Western印迹分析;以及

图9    是+5/5和-2/8中转化顺序的基因组组成的Southern印迹分析。

豇豆的Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂由中度重复的基因族所编码，它在豇豆子叶中以四种同功抑制剂的形式表达，这四种形式可通过离子交换层析分离。通过酶失活的离体试验测定，四种同功抑制剂都具有相似的胰蛋白酶抑制剂活性：

总的    fⅠ    fⅡ    fⅢ    fⅣ

相对抑制活性    1.00    1.07    1.14    1.05    0.7

豇豆中主要的同功抑制剂年fⅣ。这些基因与CpTI具有足够的同源性，能与在0.45M    NaCl，0.045M柠檬酸钠中（3×SCC）和68℃下的CpTI的全链长cDNA探针杂交。图1给出了fⅣ同功抑制剂一级顺序的实例〔由测定蛋白质顺序确定（Sammour，R.H.A.1985，Ph.D.thesis，University    of    Durham，UK）或从CpTI    cDNA顺序测定而推测〕。其它的豇豆家族中胰蛋白酶抑制剂多肽的成员由这些顺序的变异体组成，但它们的蛋白酶抑制活性并不受到损害。

图1表明了下列：

1）CpTI    fⅣ主要同功抑制剂（封闭的氨基端、中间的15、16残基和羧基端无法确定）

2）CpTI    cDNA    d4/6的预测顺序

3）CpTI    cDNA    c3/2的预测顺序

顺序以Dayof的单字码表示（Atlas    of    Protein    Sequence    and    Structure，Vol.5，1972.Nat.Biomed.Res.Foundation，Washington    D.C.，USA）。

豇豆的胰蛋白酶抑制剂基因在成熟晚期的子叶中表达。因此，豇豆胰蛋白酶抑制剂蛋白必须从成熟的种子中分离。这些蛋白中反常的高度交联使它们的抗原性很弱，因此很难依赖利用抗体的方法去鉴别和分离相应的基因。豇豆中主要的胰蛋白酶抑制剂的氨基酸顺序被用来预测其信使RNA的可能的核苷酸顺序。此多肽有四个区域包括四个或更多的连续残基，其中每一个区域能够用不多于两个的不同的信使RNA密码编码。发现这样的区域适于混合的寡核苷酸探针顺序的规范，它们覆盖所有的编码可能性，并且其长度足以对所需基因表现出足够的专一性，正如图2所示那样。

因此，分离得到了豇豆“晚期”子叶中纯化的聚腺苷酸RNA。

首先，利用常规的逆转录反应将mRNA拷贝到互补DNA中。第二链的合成利用DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段在以自身作为引物的cDNA上进行。用S1核酸酶处理以去掉双链cDNA中的端环，分子的末端在“抛光”反应中利用Klenow片段修复。

合成的八核苷酸Bam    HI连接子的顺序为5′-d（GGGATCCC），将它与修复过的双链cDNA连接，用Bst    Ⅰ充分消化（一种Bam    HI的异裂酶）。利用T4    DNA连接酶，将有连接子的双链cDNA与质粒pBR322连接，此质粒已预先用Bst    Ⅰ线性化，并通过小牛肠磷酯酶处理而部分去磷酸化（以降低载体末端的自我连接）。

此连接反应的产物用来转化感受态大肠杆菌910株，使其具有氨苄青霉素抗性（此特性由该质粒载体携带）。通过四环素敏感性鉴别重组体（pBR322的四环素抗性基因由于在Bam    HI位点插入了DNA而失活）。

根据Grunstein和Hogness（Grunstein，M.& Hogness，D.S.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72：3961，1975）的方法，通过原位菌落杂交筛选重组体中的CpTI顺序，用16个不同的³²P-标记的、混合的、合成的寡核苷酸

5′CCACCAAAAACATTG

G    G    G    C

（第二行碱基指该核苷酸处的另一种选择的碱基）进行筛选，它们对应于图2中C区的16种不同的14聚体互补顺序。此探针对大约14%的克隆显示阳性标记，随后确认其中有些并不是来自胰蛋白酶抑制剂信使。然而，在含有质粒pAGC1的14聚体阳性克隆中，当将Bam    HI位点的插入片段转移至病毒载体M13    mp    9中并用确立的M13双脱氧链终止法测定顺序后，确定该克隆无疑确实含有部分CpTI信息。此插入片段中的唯一的长开放读码框的预测氨基酸顺序表明，它与主要的CpTI一级顺序和已经出版的其他豆科植物Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂的一级顺序有很大程度的同源性（Shimokawa，Y.，Abe，O.，&    Kuromizu，K.，豆科植物双头蛋白酶抑制剂的种系发生关系，Nature    &    Culture    11：39-45，1984）。该顺序与出版的大豆SBI基因编码顺序的相应区域有65%的同源性（Hammond，R.W.，Foard，D.E.&    Larkins，B.A.，大豆中编码Bowman-Birk蛋白酶抑制剂基因的分子克隆及分析，J.Biol.Chem.259：9883-90，1984）。

质粒pAGC1含有来自CpTImRNA的顺序，包括183bp编码顺序，即包括图3所示的顺序。此顺序编码CpTI的C-端一半。本发明需要CpTI的完整编码顺序，因此，如上所述和如图4所示，利用高效cDNA克隆技术，利用合成寡核苷酸和pAGC1二者作为探针制备一个新的文库。

在人胎盘RNA酶抑制剂的存在下，通过逆转录酶将豇豆子叶的mRNA拷贝至cDNA中。第二链合成在RNA酶H的存在下，用无核酸酶的DNA聚合酶Ⅰ进行。双链cNAD的末端通过T4DNA聚合酶消化酶消化而填平。反应产物以平端与质粒pUC19连接，该质粒已用限制性内切酶HincⅡ线性化，并已用小牛肠磷酯酶去磷酸化。此连接混合物用来转化感受态大肠杆菌JM83株，使其变为氨苄青霉素抗性。在YT-Amp-BCIG-琼脂平板上以白色菌落检测出重组体，挑出后于YT-Amp-琼脂上的硝化纤维素滤膜做双份培养。

这些重组体之一称为pUSSRc    3/2，通过下述方法，它被鉴别为是CpTI信使顺序的（几乎）完整长度的拷贝：

1）与pAGC1的Bam    HI插入片段进行原位菌落杂交具有强烈的杂交作用。

2）插入后段与合成的混合14聚体有微弱的，但是阳性的杂交。

3）pUSSRc    3/2中的插入片段大小测定为582bp，可与550±50核苷酸的CpTI    mRNA的大小比较，后者是通过Northern印迹法，用pAGC1    Bam    HI插入片作为探针从豇豆子叶总RNA中测定的。

4）通过已确立的化学顺序分析法（Maxam，A.M.&    Gilbert，W.，用相专一性的化学断裂测定末端标记DNA的顺序，Meth.Enz.65：499-560，1980），测定插入片段的顺序。它与pAGC1中插入片段的全长度完全同源。从它唯一的长开放读码框预测的氨基酸顺序表明，它与豆科植物胰蛋白酶抑制剂在对应于成熟蛋白的区域具有高度的同源性。此顺序在读框内的转译起始密码ATG（蛋氨酸）的5′端延伸了几个碱基对。

质粒pUSSRc    3/2含有来自CpTI的（几乎）全部mRNA的顺序，包括前体和成熟蛋白的完整编码区，3′-非转译区，即包括图6所示的顺序。

质粒pUSSRd    4/6含有不同的同功抑制剂成熟蛋白的完整编码区，但缺乏天然的转译起始区ATG密码，并因此缺乏未知量的前导肽顺序。它包括图7所示的顺序。

如下文所述和如图5所示，将CpTI顺序从大肠杆菌克隆载体pUC19转移至植物转化载体根癌农杆菌（Agrobacterium    tumefaciens）Ti质粒。

质粒pUSSRc    3/2用限制性内切酶Sca    Ⅰ、Alu    Ⅰ和Xmn    Ⅰ消化，消化产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，得到550bp长的平端片段。此片段含有CpTI的完整编码顺序，终止于高ATG转译起始密码5′端20bp处和高TAA转译终止密码3′端92bp处。此片段以平端形式与质粒pROK2的Sma    Ⅰ位点连接。

质粒pRoK2是根癌农杆菌Ti质粒的双载体系统，它是由Dr.M.Bevan和Dr.T.Kavanagh特别设计和构建的，是为了使克隆的cDNA顺序转移到植物中并在其中进行组成性表达。它是从Bin    19产生的（Bevan，M.W.用于植物转化的农杆菌双载体，Nucl.Acids.Res.12：8711-12，1984），将一个表达盒插入T-DNA的左右边界之间，该表达盒包括来自花椰菜花叶病毒（CaMV）基因组的800bp片段，它含有CaMV35S    RNA的启动子，以及来自农杆菌T-DNA胭脂碱合成酶基因的250pb片段，它含有其转录终止信号和mRNA多腺苷酸信号。这些元件被掺入Ti双表达载体pRoK1中（Baulcombe，D.C.，Saunders，S.R.，Bevan，M.V.，Mayo，M.A.&    Harrison，B.D.来自转化植株核基因组的生物学活性病毒卫星RNA的表达，Nature    321：446-9，1986），pRoK2与它的主要区别在于，pRoK2在启动子和终止片段之间有一个多连接子克隆位点。此多连接子包括SmaⅠ位点，此位点中插有CpTI    cDNA片段。这些顺序在转化的植物细胞中，在插入片段上游10bp处予以组成性转录起始，在插入片段下游的200核苷酸处予以多腺苷酸化。

pRoK-CpTI构建体被克隆到感受态大肠杆菌MC1022株中，通过其卡那霉素抗性选择转化体。以单个克隆中制备微量质粒DNA进行限制性分析以鉴定构建体。pRoK-CpTI+5克隆包含的CpTI插入片段其方向是表达CpTI多肽的正确取向，即：

CaMV-PROM-3′-CpTI-3′-NOS-TERM

pRoK-CpTI-2克隆在相反方向上含有CpTI插入片段，即：

CaMV-PROM-3′-CpTI-5′-NOS-TERM

以此作为对照。

将T-DNA（L）/NOS-NEO/CAMV-PROM：CpTI：NOS-TERM/T-DNA（R）构建体转移至根癌农杆菌Ti质粒中，转移在携有Ti质粒pAL4404的根癌农杆菌LBA4404、携有pRoK-CpTI+5或pRoK-CpTI-2的大肠杆菌HB101、以及携有可动质粒pRK2013的大肠杆菌hb101之间以三母体接合的方式进行。

转移结合体通过它们在基本琼脂平板上、在卡那霉素、链霉素和利福霉素存在下于30℃生长的能力进行选择。为了确保完全去掉非抗性细菌，抗性菌落在选择平板上划线培养两次以上。

如下面所述和如图5所示，用携有含Ti质粒的CpTI+5和CpTI-2的农杆菌转化烟草（栽培品种Samsun    NN）和N.plumbaginifolia的叶圆片。通过由构建体中NOS-NEO基因赋予的卡那霉素抗性选择转化体。将小苗转移至诱导根生成的含有卡那霉素的琼脂培养基中以再生转化植株。使生根的植株在置于Sherer生长室中并装有珍珠石/堆肥的花盆中生长。

对单个植株接种美国烟夜蛾幼虫，测定给植株造成的损坏程度和昆虫随着时间的生长存活情况，从而测定植物对于昆虫的抗性。使用美洲烟夜蛾是因为它在美国对棉花和烟草二者都是商业上的重要害虫。使用的幼虫小于24小时龄，1-2mm长度。

测定了用CpTI+5构建体转化的植株对于昆虫侵袭的抗性水平，此抗性水平与对照植株呈现出明显的覆盖（表2）。然而，以单个植株为基础，在5个CpTI+5转化体（尤其是烟草+5/5，+5/21和+5/D4;N.plumbagini-folia+5/T104和+5T109）中大约有1个，对于美洲烟夜蛾幼虫伤害的抗性表现出明显持久的上升，并降低植株上昆虫的存活和发育（表4）。

利用免疫结合的ELISA试验已经证实，这些抗性植株表达一种类似CpTI的蛋白。在兔中产生抗CpTI的抗血清，并用于确立的ELISA和点免疫结合法，与来自CpTI+5和CpTI-2植株的冰冻干燥叶片物质的50mM    Tris/HCl    pH9.5提取物相作用，利用市售的β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶联的羊抗兔IgG作为第二抗体，利用一种合适的发色底物以测量抗体的结合。抗性植株的提取物中都具有可测水平的CpTI抗原，而对照植株（CpTI-2）的提取物中没有。通过胰蛋白酶活性抑制剂试验，已经直接在抗性植株叶片提取物的硫酸铵分离物中证实有胰蛋白酶抑制活性。所观察到的CpTI活性水平可与掺入人工膳食中并被证实能抗代谢的水平相比较。

用所述载体转化的植物中有很大一部分将含有稳定地插入基因组中的DNA片段，该片段含在CpTI基因和NPT    Ⅱ标记基因。卡那霉素抗性的分离分析和Southern印迹试验的结果证实了这一点。

表2    转化烟草植株的初步生物测试结果

给出了CpTI+5和对照植株组的平均和标准误差，以及单个植株表明抗昆虫性明显提高的结果。括号中的加号表明比对照的平均值更好的结果：多于1×S.D.〔（+），p＜0.159〕;多于1.96×S.D.〔（++），p＞0.025〕和多于2.58×S.D.〔（+++），p＜0.005〕。

1.6株烟草或2株N.plumbaginifolia的平均值，以1（最小伤害）至5（严重伤害）的标度独立测定对于植株的全部伤害。

2.在从顶端起第3片成熟叶上测定。

3.用8个新形成的幼虫侵染植物7天后。

4.以纯化的CpTI    fⅣ（象标准样品一样泳动）的等量表示，单位为ng/100μl叶片提取液。注意ELISA对于存在的胰蛋白酶抑制剂（TI）的绝对量测定值偏低，主要由于抗血清的交叉反应性太弱。

通过转化获得的新的表型特征应当根据经典的孟德尔遗传学遗传。最初的转化体在有插入片段的每一个基因位点应当是半合子的，该特征的表现可期望遵循孟德尔显性规律。为了证实新性状的稳定表达，分析来自转化植株的S₁子代（自花传粉产生的第一代植物）的卡那霉素抗性和CpTI的表达。

可以利用与上面所述不同的战略得到CpTI编码顺序，涉及下列中某些或全部改变：

1）除了所述的混合的14聚体（区域C）外，或用以代替它，可以使用编码CpTI多肽其他区域的合成寡核苷酸。

2）可以使用部分或全链长的cDNA克隆（或合成寡核苷酸）作为探针，从由豇豆基因组DNA制备的重组DNA基因组文库中获取基因组顺序的拷贝，所获顺序列中包括CpTI基因家族的成员。

3）可用CpTI一级顺序确定化学合成的核苷酸序列，该顺序编码CpTI定族中的一员。

下面进一步说明本发明：

（1）多腺苷酸RNA的分离

收集-商业品种豇豆（Californian    black-eye）接近成熟的种子。从子叶上无菌去掉种皮和胚胎，使子叶冰冻在液氮中。

10g冰冻子叶在含有0.2g    DTT的试管中加热至-20℃，向其中于100℃下加入26ml的0.2M硼酸钠pH9.0，30mM    EDTA，1%SDS。混合物在Polytron匀浆器中以5档速度匀浆30秒，然后于37℃下与0.5mg/ml蛋白酶K保温1小时。于0℃下加入2ml    2M    KCl，使混合物离心。使上清液中的LiCl为2M，于4℃下过夜沉淀不溶物。

离心收集沉淀，用25ml    LiCl于0℃下洗涤2次，再悬浮于0.2M    KAc中并用乙醇沉淀。

沉淀再悬浮于8ml    10mM    Tris-HCl    pH7.4，1mM    EDTA中，用等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25∶25∶1）去蛋白二次。最终的水相用乙醇沉淀，使RNA再次从0.2M    KAc中沉淀，然后根据Aviv和Leder（Aviv，H.&    Leder，P.通过寡朐苷酸纤维素层析纯化生物活性的球蛋白mRNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA    69″1408-12，1972）所述，通过寡聚（dT）-纤维素柱层析分离多腺苷酸RNA。

（2）用于克隆的cDNA的制备

采用两种不同的方法合成cDNA。第一方法产生克隆在pAGC1中的部分cDNA顺序，它随后被用作CpTI基因顺序的探针，而第二种高效方法产生几乎是全链长的cDNA。由于两种方法都能产生CpTI编码顺序，两种方法都给予了叙述。首先描述前一种方法。

（3）cDNA    Ⅰ的合成

通过在反应混合物中保温进行5μg子叶poly A+RNA的逆转录，反应液中含有50μCi³H-dCTP（50Ci/mMOL;Radiochemical Centre，Amersham，UK）作为示踪物，dATP、dCTP、dGTP和dTTP每种1mM，5mM DTT，1mg/ml寡聚（dT），50单位人胎盘核糖核酸酶抑制剂，50mM Tris-HCl pH8.0，10mM MgCl₂和100单位/ml AMV逆转录酶，条件为42℃ 2小时。终止反应，通过在100℃下加热3分钟并在0℃下猝冷使链分离。离心去除变性的蛋白。

（4）第二链的合成

45μl逆转录反应上清液与50μl    100mM    HEPES    pH6.9，20mM    MgCl，70mM    KCl，5mM    DTT，dATP、dCTP、dGTP和dTTP每种1mM，25单位DNA聚合酶Ⅰ大（Klenow）片段于15℃下保温4小时。用苯酚和氯仿萃取反应混合物，通过柱层析分离高分子量的反应产物，层析柱为10ml床体积的Sephadex（商标）G-50-S柱，用10mM    Tris-HCl    pH    7.4，50mM    NaCl，1mM    EDTA洗脱。

（5）用于克隆的双链DNA末端的处理

从上述柱中排出的部分制成含有0.3M NaCl，30mM NaAc pH4.5，3mM ZnCl₂的1ml体积，与250单位S1核酸酶于37℃下保温30分钟以去掉端环。加入5mM EDTA，用苯酚和氯仿两次萃取混合物，乙醇沉淀后再悬浮于20μl的50mM Tris-HCl pH7.8，10mM MgCl₂，10mM 2-巯基乙醇，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.25mM中，与5单位DNA聚合酶大片段于15℃保温30分钟以修复末端。

合成的Bam HI连接子顺序为5′-d（GGGATCCC）〔BCL〕，使它在含有1μg连接子，50mM Tris-HCl pH7.8，10mM MgCl₂，10mM 2-巯基乙醇，1mM ATP和11单位多核苷酸激酶的10μl体积中磷酸化。使其在25℃下保温4小时。

使末端填平的双链cDNA和激酶活化的连接子混合，用激酶反应缓冲液将体积调整为50μl，与5单位T4DNA连接酶于15℃下保温过夜。

在80℃下保温5分钟终止连接子的连接反应。反应体积调整为200μl，并含有100mM Tris-HCl pH7.4，8mM MgCl₂，与10单位限制性内切酶BstⅠ于37℃下保温8小时。

用等体积的苯酚萃取两次和用等体积的氯仿萃取两次，使反应混合物去蛋白，然后上到10ml床体积的Sephadex    G-50-S柱中，用10mM    Tris-HCl    pH7.4，50mM    NaCl，1mM    EDTA洗脱。由此柱排除的部分直接用于与载体质粒连接。

（6）用pBR322作为载体克隆到大肠杆菌910株中

根据已经确立的方法，通过内切酶BstⅠ处理使超螺旋的质粒pBR322（GIBCO-BRL，Uxbridge，UK）线性化，通过小牛肠碱性磷酯酶处理使其部分去磷酸化（以降低载体末端的自连接）。

每个连接反应含有大约100ng处理过的载体和估计为50ng的加有连接子的双链cDNA，它们在20μl的66mM Tris-HCl pH7.6，6.6mM MgCl₂，10mM DTT，0.5mM ATP中，使其与2单位T4DNA连接酶于15℃下保温过夜。

用0.1M CaCl₂将3μl等分的连接混合物稀释至50μl，根据标准方法，用它转化100μl一批的CaCl₂处理过的大肠杆菌910株（得自Prof.W.Brammar，Dept.of Biochemistry，University of Leicester，UK）。

每次转化得到大约800个氨苄青霉素（50μg/ml）的抗性菌落。将它们拷贝到含有氨苄青霉素或四环素（50μg/ml）的琼脂平板上，发现有大约25%的菌落是氨苄青霉素抗性、四环素敏感性的重组体。

360个重组体菌落涂布在硝化纤维素滤膜上，根据Hanahan，D.和Meselson，M.（质粒筛选和高密度菌落，Gene    10：63-67，1980）所述方法制备滤膜复本后保存在-80℃用于通过原位杂交进行筛选。

（7）筛选CpTI编码序列重组体

由于没有一个对于CpTI    cDNA顺序具有绝对专一性的探针，携有这种顺序的克隆根据一系系列试验来鉴别，这些试验基于：

1）在子叶RNA中可望有丰富的CpTI    mRNA

2）与混合的合成14聚体寡核苷酸杂交，该将会体互补于CpTI    fⅣ多肽区域C的可能的编码顺序

3）插入顺序的大小接近于预测的全链长CpTI    cDNA的大小

4）直接测定插入顺序以确保它具有（部分）胰蛋白酶抑制剂的编码潜力。

携有将用于杂交的细菌菌落的硝化纤维素滤膜首先在含有250μg/ml氯霉素的琼脂平板上保温12-16小时，使质粒拷贝数扩增。从平板上取下滤膜，集落向上地置于一系列Whatman    3mm滤纸垫上，该滤纸经过下述连续浸渍：10%SDS    3分钟;0.5M    NaOH，1.5M    NaCl5分钟;1M    Tris-HCl    pH8.0，1.5M    NaCl    5分钟，3×SSC（1×SSC＝0.15M    NaCl，0.015M柠檬酸钠）5分钟两次。使滤器风干，在真空炉中于80℃下烘烤2小时。

预测子叶mRNA中的CpTI mRNA为中等丰度，它的水平多少反映了该蛋白质的含量，即大约为总量的1%。如上面（3）所述，在50μCi³²P-dCTP（410Ci/m Mol）的存在下，使2μg豇豆子叶poly A+RNA通过逆转录进行放射性标记。从Sephadex G-50-S柱中回收高分子量的反应产物，用10mM Tris-HCl pH7.4，1mM EDTA洗脱。³²P-标记的DNA在10ml 3×SSC，0.1%SDS，0.02%牛血清清蛋白（BSA），0.02%聚乙烯吡咯烷酮（PVP），0.02%Ficoll，250μg/ml声波处理变性的鲑鱼精子DNA，100μg/ml多聚腺苷酸中于65℃下预保温1小时。使滤膜四次在3×SSC，0.1%SDS中于65℃下每次30分钟，然后在3×SSC，0.1%SDS，BSA、PVP和Ficoll各0.02%，250μg/ml声波处理变性的鲑鱼精子DNA中于65℃下4小时进行预杂交。预处理的探针加到吸干的滤膜上并于65℃下保温16小时。吸干滤膜，依次用大约2ml/cm表面积的下述溶液洗涤，3×SSC，0.1%SDS在室温下5分钟两次，3×SSC，0.1%SDS于65℃下40分钟3次，2×SSC于室温下5分钟两次，干燥后用富士RX X-胶片于室温下曝光19小时进行放射自显影。

大约30-40%的集落给出放射自显影信号，信号强度与如果它们含有探针中中等至较高重复度的顺序所期望的一致。

混合的寡核苷酸是定制的，由Genex    Corporation合成所有不同的16种14聚体：5′-dCC〔A/G〕CA〔A/G〕AA〔A/G〕CA〔T/C〕TG。利用专一于T、T+C、C、A＞C、A+G和G的反应，通过确立的化学修饰序列测定法证实此序列。通过已确立的方法，利用寡核苷酸激酶，使寡核苷酸与P-ATP反应而在其5′-端进行放射性标记。

硝化纤维素滤膜在3×SSC，0.1%SDS中于65℃下预保温30分钟四次，然后在6×SSC，0.1%SDS，BSA、PVP和Ficoll各0.02%，1mM    EDTA，125μg/ml鲑鱼精子DNA中于45℃下预保温8小时。滤膜在类似的混合物中于37℃下与标记的14聚体杂交21小时。滤膜在6×SSC，0.1%SDS中于25℃下洗涤10分钟四次，然后于39℃下洗涤5分钟两次。滤膜在6×SSC中冲洗，干燥后用单个Dupont    Cronex增感屏于-80℃下在预闪光处理的富士、TX胶片上曝光21小时。重组体中约14%具有高于本底的清晰标记。

由根据前面的两个标准可能是CpTI cDNA阳性的24种重组体的10毫升培养物制备质粒DNA，这些重组体由Bam HI限制性片段在琼脂糖凝胶电泳上的迁移，确定这些质粒中DNA插入片段顺序的大小。插入片段的大小范围在大约400-1800碱基对。由于估计CpTI不会长于500bp，选择四个所含插段不长于此的克隆进行顺序分析。这些克隆的Bam HI插段转移至单链噬菌体载体M13mp 9的Bam HI位点中，利用已经确立的方法，用³⁵S-硫-dATP和双脱氧链终止法测定其顺序。检查所获顺序及其互补顺序，看它们编码的产品是否与CpTI fⅣ的一级顺序有同源性，是否与其他豆科植物Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂有同源性，并检查它们与已发表的大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂基因顺序的同源性（Hammond，R.W.，Foarde，D.E.，& Larkins，B.A.大豆中编码Bowman-Birk胰蛋白酶抑制剂基因的分子克隆及分析，J.Biol.Chem.259：9883-90，1984）。

质粒pAGC1含有上面给出的CpTI部分cDNA序列。质粒pUSSRa    11/7含有同样的编码顺序，但缺乏5′-端进一步的6个核苷酸。另外两种质粒含是未辨明的顺序，这些顺序与CpTI编码顺序无关。

（8）高效cDNA合成

采用一种改进的cDNA合成法以获得含有完整CpTI编码顺序的重组体。此方法更可能产生完整长度的cDNA，因为合成第二链时它不需要端环作引物，因此省略了对于S1核酸酶消化的要求。

5.4μg豇豆子叶mRNA在40μl的50mM Tris-HCl pH8.3;10mM MgCl₂;10mM DTT;4mM焦磷酸钠;dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1.25mM;100μg/ml寡（dT）12-18;120单位AMV逆转录酶;40单位人胎盘DNA酶抑制剂和2μCi³²P-dCTP（作为示踪物）中于43℃下保温80分钟。将其转移至熔冰中终止反应，使其中EDTA为20mM，然后通过两次苯酚/氯仿萃取去除蛋白。在水相中加入2M乙酸铵和1μg/μl高度纯化的牡蛎糖原（作为载体）后，用乙醇沉淀其中的核酸。核酸沉淀从2M乙酸铵中再沉淀后再悬浮在10μl水中。

第一链合成产物在35μl总体积中保温，其中含有：20mM Tris-HCl pH7.5;100mM KCl;10mM硫酸铵;5mM MgCl₂;0.15mM NAD;50μg/ml无核酸酶的BSA;40μMdATP、dCTP、dGTP和dTTP;8.5单位/ml大肠杆菌RNA酶H;230单位/ml DNA聚合酶Ⅰ;10单位/ml大肠杆菌DNA连接酶;条件为12℃1小时，然后于22℃下再加1小时。终止反应，按照前述反应处理产物。为了去掉第一链残留于3′端所有突出的尾部，双链cDNA在25μl的33mM Tris-乙酸pH7.9;66mM KAc;10mM AgAc;0.5mM DTT;dTTP;2.5单位T4 DNA聚合酶中于12℃下保温1小时。反应产物如上述处理。

（9）用pUC19作为载体克隆到大肠杆菌JM83株中

根据确立的技术，用限制性内切酶HincⅡ处理使超螺旋的质粒pUC19（GIBCO-BRL，Uxbridge，UK）线性化，用小牛肠磷酯酶处理使其去磷酸化。

含有大约100ng处理过的载体和估计为20ng双链cDNA的平端连接反应在20μl的66mM Tris-HCl pH7.5;6.6mM MgCl₂;10mM DTT;0.5mM ATP和2单位T4 DNA连接酶中于4℃下保温过夜。连接反应液中加入乙酸铵到2M后进行乙醇沉淀。沉淀再溶于10μl 0.1M CaCl₂中，根据确立的方法，用它们转化100μl一批的感受态大肠杆菌JM 83株（得自Dr J Messing，Dept.of Biochemistry，University of Minnesota，USA）。在Yt-BCIG-氨苄青霉素-琼脂平板上以白色菌落选择重组体。283个重组体菌落在硝化纤维素滤膜上做双份平板培养。

（10）筛选重组体中的CpTI编码序列

在这一步，CpTI cDNA序列的鉴别特征是能与pAGC1插入片段和合成的14聚体寡核苷酸二者杂交。如上述（第7部分）将来自重组体克隆的DNA固定在硝化纤维素滤膜上。从pAGC1的Bam HI限制片段中通过2%琼脂糖凝胶电泳分离pAGC1插入片段，并用市售可得的缺口转译药盒通过缺口转译用³²P-dCTP标记。如前所述用寡核苷酸激酶对合成的14聚体进行³²P-标记。如前述进行与集落滤膜的杂交，最后，用2×SSC于65℃下洗涤pAGC1插入片段探针，用6×SSC于39℃下洗涤合成的寡核苷酸。

质粒pUSSRc    3/2与pAGC1插入片段的杂交非常强烈，与14聚体稍弱一些，而pUSSRd    4/6与14聚体的杂交非常强列，与pAGC1插入片段稍弱一些。根据确立的方法，用氯化铯梯度从这些克隆中纯化质粒DNA，并测定其限制性图谱。通过化学修饰DNA顺序测定法确定插段的核苷酸序列。

质粒pUSSRc    3/2含有几乎是完整长度的前面通过pAGC1举例说明的CpTI同功抑制剂的cDNA序列。质粒pUSSRd    4/6所含的cDNA序列中包括不同CpTI同功抑制剂成熟蛋白的完整编码序列，与同功抑制剂fⅣ的关系更为密切，但缺乏部分5′-前导序列。

（11）pUSSRc    3/2CpTI编码序列转移至农杆菌BIN表达载体中

10μg    pUSSRc    3/2DNA用限制性内切酶AluⅠ、ScaⅠ和XmnⅠ在33mM    Tris-乙酸pH    7.8;66mM    KAc;10mM    MgAc;4mM亚精胺和0.5mM    DTT（TA缓冲液）中消化。产生唯一的552bp片段，它含有CpTI的完整编码序列，通过6%丙烯酰胺凝胶电泳分离将它从消化液中纯化出来。如上所述，用限制性内切酶SmaⅠ使质粒载体pRoK    2（由Dr    M    Bevan提供，Plant    Breeding    Institute，Cambridge，UK）线性化，用小牛肠磷酯酶去磷酸化，钝头连接到550bp片段上。连接反应液直接用来转化大肠杆菌MC1022株（Dr    M    Bevan，同上），使其具有卡那霉素（50μg/ml）抗性。

从10ml单个的转化集落制备质粒DNA，通过制作限制性图谱分析插段的唯一性及定向。在正确定向上携有插段的克隆，即：

CaMV启动子-5′CpTI编码序列3′-NOS终止子被称为pROKCpTI+（克隆号码）。那些错误定向的克隆，即：

CaMV启动子-3′CpTI编码序列5′-NOS终止子被称为pROKCpTI-（克隆号码）。

（12）转移至根癌农杆菌

制备下述的10ml过夜培养物：

根癌农杆菌LB4404杜（Dr    M    Bevan，同上，于30℃在液体营养基+500μg/ml链霉素+100μg/ml利福霉素中;

携有pRoK    CpTI+5或pROK    CpTI-2的大肠杆菌MC1022株，于37℃在L-液体培养基+50μg/ml卡那霉素中：

携有pRK    2013的大肠杆菌HB101株（Dr    M.Bevan，同上），于37℃在L-液体培养基+500μg/ml链霉素+100μg/ml利福霉素中。

两种农杆菌各取200μl混合，即可动菌株和一种含有CpTI的菌株，涂布在L-琼脂平板上于30℃下保温过夜。细菌菌落悬浮于5ml Tris-HCl pH7.0;10mM MgCl₂中，取出等分量涂布在含有链霉素（500μg/ml）、利福霉素（100μg/ml）和卡那霉素（50μ/ml）和基本琼脂平板上，于30℃下保温2天。为确保抗所有三种抗生素的抗性菌落，将单个集落在同样的选择性平板上培养两次以上。

（13）CpTI基因转移至烟草和N.plumbaginifolia中

从纯烟草（Samsun品种）和N.plumbaginifolia（一种未命名的二倍体烟草品种，最初得自Institut    National    de    Recherche    Agronomigue，Versailles，Paris，France）植物叶片上用打孔器切取圆片，并与携有Ti-RoK CpTI质粒构建体的根癌农杆菌的过夜培养物保温。叶圆片吸干后转移至含有羧苄青霉素（500μg/ml）和卡那霉素（100μg/ml）的苗再生培养基平板上，此培养基参见已发表的方法（Fraley，R.T.，Rogers，S.G.，Horsch，R.B..Sanders，P.，Flick，J.，Adams，S.，Bittner，M.，Brond，L.，Fink，C.，Fry，J.E.，Galluppi，G.，Goldberg，S.，Hoffman，N.L.，Woo，S.，细菌基因在植物细胞中的表达.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7.1983;Horsch，R.B.，Fry，J.E.，Hoffman，N.L.，Eichholtz，D.，Roger，S.G.，Fraley，R.T.，将基因转化至植物中的简单而普通的方法，Science 227：1229-31，1985）。卡那霉素抗性小苗转移至含有羧苄青霉素和卡那霉素的根诱记培养基中。通过苗培养得到了重复的生根的单

生根良好的小植株移栽至50∶50堆肥和珍珠石的花盆中，在Sherer生长室中于25℃在16小时光照下生长。

这些植株似乎具有正常的表型，如生长习性、生长速率、开花时间、种子存活力等（见表3）。

表3    转化植株的表型特征与未转化对照的比较

对照    +5/5

开花的平均时间（天）    104    108

开花时的植物平均高度（cm）    19.6    21.5

种子存活力（%发芽）    93    99

（14）转化植株抗昆虫性的生物测试

美洲烟夜蛾蛹（f）〔鳞翅目;夜蛾科〕烟草芽虫或番茄芽虫由USDA（Brownsville，Texas，USA）提供。到达英国后，培养物以13小时光照长度维持在25℃下。幼虫阶段饲喂以琼脂为基质的膳食，其中含有苜蓿、青豆粉、小麦胚芽、基本维生素和矿物盐;成虫喂养在补充有维生素的蜂蜜溶液上。

高大约12cm的烟草植株的高约8cm的N.plumbaginifolia植株，装在单个密封的plantaria中置于生长室内。用8个12-24小时龄的美洲烟夜蛾幼虫（发现在这样的条件下，8个幼虫对于在对照植株上的成活来说是最佳数目）侵染这些植株。在植株上7天以后，取下所有存活的幼虫，在乙酸甲酯中麻醉，保存在Bouins固定剂中测定。植物的伤害这样估计：将植物上的可见伤害分为1-5的任意标度，并测定特定叶片的吞食面积（顶端向下第3成熟叶，通常是伤害最重的）。表2给出了此实验的结果。表4中给出了表明CpTI水平的数据，和每个植株上的%昆虫存活率。

表现出中至高水平抗昆虫性的植株（与某些对照照植株一起）用第一或第二龄期幼虫进行进一步侵染。

美洲烟夜蛾在无性繁殖植株上的饲养试验

利用茎切段以8-16植株组复制烟草转化体+5/5，+5/21和-2/8，使其在含有卡那霉素的琼脂中生根。使它们在堆肥中生长至大约12cm高，然后如前所述，密封的plantaria中的每个植株接种8个新形成的美洲烟夜蛾幼虫。7天以后，取下存活的幼虫（除了几株留下长期监测的植株外），如前测定昆虫存活率和生长情况。植物伤害以叶片吞食百分比进行估计，利用Sightsystems    Ltd.（Newbury，UK）提供的‘VIP’图象分析仪和软件对特定叶片进行图象分析测定。

结果概括于表5中。在表达CpTI的转化体+5/5和5/21上，美洲烟夜蛾幼虫的死亡率高得多，生长也显著降低。这些植株所受伤害也比对照株少。

表4    转化烟草植株中的CpTI抗美洲烟夜蛾的杀虫活性的生物测试

仅仅记录了那些在两种饲养试验中使用的植株。

+从侵染前取下的刚刚完全展开的叶片提取的可溶蛋白中，利用点免疫结合试验检测CpTI。标准是从非转化植杜的对照蛋白提取物中亲和纯化的CpTI。

≠在叶片可溶蛋白提取物中测定胰蛋白酶抑制剂活性，以每毫克叶片蛋白微克等量的亲和纯化的CpTI表示。用于此试验的叶片是来自更成熟植株（生物测试以后）的刚展开的叶片。

植物    测出的CpTI    胰蛋白酶    %

来源 （μg/mg可溶蛋白）⁺抑制剂活性^≠昆虫存活

-2/2    ＜1    100

-2/4    ＜1    87.5

-2/7    ＜1    100

-2/8    ＜1    1.7    87.5

+5/1    1.1    87.5

+5/3    1.3    100

+5/4    ＜1    100

+5/5    9.6    9.9    37.5

+5/9    5.8    62.5

+5/11    3.8    62.5

+5/14    4.2    75.0

+5/19    2.5    62.5

+5/21    6.2    7.0    50

+5/23    ＜1    100

表5    美洲烟夜蛾和饲养试验

（＊）p＜0.05;（＊＊）p＜0.025;（＊＊＊）p＜0.01

参数    -2/8    +5/5    显著性

昆虫存活（%）    58.65    41.96    （＊）

存活者平均大小（mm）    15.42    10.57    （＊＊＊）

活昆虫重/植株（mg）    236.4    63.9    （＊＊＊）

吞食叶面积（%）    52.3    21.1    （＊＊＊）

-2/8    +5/21

昆虫存活（%）    86.36    72.73    （＊＊）

存活者平均大小（mm）    12.50    10.54    （＊＊＊）

活昆虫重/植株（mg）    193.5    109.8    （＊＊＊）

吞食叶面积（%）    49.6    30.1    （＊＊＊）

（15）其他虫害的饲养试验

进行饲养试验以测定烟草（+5/5）CpTI基因抗其他一些棉花和谷物的重要虫害的效果：

（a）美洲棉铃虫

美洲棉铃虫蛹得自Glasshouse    Crops    Research    Institute（Littlehampton）和USDA（Brownsville，Texas，USA），如前述美洲烟夜蛾那样保存。+5/5和-2/8的无性繁殖体如上述每株用8个新形成（＜24小时龄）的幼虫侵染并进行生物检测。

在早期试验中，对照植株上只有16/192幼虫存活（在+5/5上大约为10/224），每株的存活平均数几乎为零，因而没有用处。然而，使用年幼一些的植株（6cm高），则对照上的存活率达到30%，能够作出有意义的比较（表6）。表达CpTI的植株显然对美洲棉铃虫的侵袭和存活有更强的抗性。

（b）棉花叶虫

棉花叶虫蛹得自May    &    Baker    Ltd.，Ongar    Research    Station，Essex，UK，如前述美洲烟夜蛾那样保存。+5/5和-2/8的无性繁殖体如上述用8个新形成（＜12小时龄）的幼虫侵染并进行生物检测。这种昆虫对植物的伤害在较低的叶片上更为明显，因此，利用这一区域的叶片作图象分析。如表7所示，再次发现表达CpTI的植株对棉花叶虫幼虫的侵袭和存活有更强的抗性。

表6    美洲棉铃虫在+5/5上的饲养试验

（＊）：p＜0.05;（n.s.）：不显著

参数    -2/8    +5/5    显著性

昆虫存活（%）    30.00    17.70    （＊）

存活者平均大小（mm）    10.38    9.29    （n.s.）

活昆虫重/株（mg）    51.4    32.2    （n.s.）

吞食叶面积（%）    41.61    13.31    （n.s.）

表7    棉花叶虫在+5/5上的饲养试验

（＊）：p＜0.05;（＊＊＊）：p＜0.025;（n.s.）：不显著

参数    -2/8    +5/5    显著性

昆虫存活（%）    61.25    43.75    （＊）

存活者平均大小（mm）    14.39    14.70    （n.s.）

活昆虫重/株（mg）    323.5    265.1    （n.s.）

吞食叶面积（%）    27.24    10.40    （＊＊＊）

这一点也许很有趣，虽然存活昆虫的平均大小之间没有显著差异，但在大小的分布上却似乎有显著差异。在对照植株上，大小分布似乎是连续的，而在+5/5上却是双峰分布（bimodal）的，个体大小比平均值小许多或甚至更大。我们认为，这可能由于前者受到了CpTI的抗代谢效应的影响，而后者可能已达到能够抵抗此效应的大小（某些情况下也许通过同类相食）。

（c）烟草天蛾

烟草天蛾卵由Dr.S.Reynolds（School of Biological Sciences，University of Bath，Bath，UK）提供。+5/5和-2/8植株的卡那霉素抗性S₁子代如上述用4个新形成的幼虫（小于24小时龄）侵染并进行生物测试。

烟草天蛾幼虫比测试的其他鳞翅目昆虫大得多，并迅速导致对照植株的大部分破坏。由于此原因，有必要减少每株使用的昆虫数，并且，不是测定特定叶片的伤害，而必须去估计对整个植株的伤害。发现表达CpTI的植株对此害虫的抗性增强（表8）。

表8    烟草天蛾在+5/5上的饲养试验

（＊）：p＜0.05;（＊＊＊）：p＜0.01

参数    -2/8    +5/5    显著性

昆虫存活（%）    82.14    64.29    （＊＊＊）

存活者平均大小（mm）    26.68    22.72    （＊）

活昆虫重/株（mg）    1.00    0.46    （＊＊＊）

吞食的植株（%）    80.10    60.45    （＊＊＊）

（16）转化植株CpTI表达的测定

转化植株组织中CpTI表达的研究方法或者依赖于使用抗CpTI抗血清的各种免疫交叉反应技术，或者依赖于直接检测胰蛋白酶抑制剂的离体活性。

（a）兔抗CpTI抗血清的制备

在兔中制备含有抗CpTI初级抗体的血清。CpTI通过戊二醛与兔血清清蛋白（RSA）交联。给兔子注射悬浮在500μl    Freunds完全佐剂中的500μl    CpTI-RSA。以大约一周的间隔进一步四次注射悬浮在500μl    Freunds非完全佐剂中的500μl    CpTI-RSA。最后，加强注射0.5mg在磷酸盐缓冲液中未修饰的CpTI，三周以后，注射0.25mg    CpTI-RSA后收集免疫血清。

制作此抗血清时遇到的困难表明CpTI是一种弱抗原。应当记住，所产生的抗体是抗全CpTI的，而由pUSSRc    3/2所编码的同功抑制剂只是其一部分。抑制剂上最可能的抗原位点在多肽的可变区中，因此，不了解究竟有多大比例的抗体实际上与导入的CpTI基因产物发生交叉反应。因此，如果使用总CpTI作为标准，这些方法则可能低估单种同功抑制剂的量。

（b）植物组织蛋白提取物的制备

从生长的幼叶、洗过的根切下的茎制备蛋白粗提物。以便用于某些初始ELISA、点免疫印迹法取来这些物质，在液态空气中冰冻，碾成粉末并冰冻干燥。以40μg干重/ml    50mM    Tris-HCl    pH9.5于4℃下在旋转轮上提取过夜。随后用硫酸铵沉淀部分进行ELISA、胰蛋白酶抑制剂离体试验和Western印迹试验。收集叶片，如上述冰冻和研磨。立即在50mM    Tris-HCl    pH9.5;1mM    DTT中以1mg湿重/2.7μl于4℃下提取过夜。离心沉淀不溶物，取1ml上清液加硫酸铵至95%饱和度于4℃下沉淀过夜。离心蛋白沉淀，再悬浮在400μl提取缓冲液中，对50mM    Tris-HCl    pH9.5透析。用Bradford蛋白检测法（Bradford，M.M.，利用蛋白质-染料结合原理快速灵敏地定量测定毫克级蛋白质。Anal.Biochem.72：248-54，1976）测定蛋白浓度。

（c）酶联免疫吸附检测（ELISA）

利用市售可得的过氧化物酶联第二抗体ELISA药盒，通过ELISA测定转化植株叶片提取物的CpTI表达。这些检测的结果足以定性鉴别出高表达植株，但认为在定量上都是很不可靠的。这是由于CpTI的弱抗原性和能与ELISA平板结合的蛋白水平偏低所致。

（d）胰蛋白酶抑制剂的离体检测

根据Erlanger等人的方法（Erlanger，B.F.，Kakowsky，N.，Cohen，W.两种新的胰蛋白酶发色底物的制备及其性质.ABB    95：271-278，1961），利用-N-苯甲酰基-DL-精氨酸-p-硝基酰苯胺HCl（BAPNA）作为底物，测定样品中的胰蛋白酶抑制剂活性。此方法测定的CpTI活性水平比ELISA的测出值高得多（表2）-在很大程度上更加符合从观察到的生物活性所预料的那样。然而，这种检测方法也易受不可控制的变化的干扰的影响。

（e）蛋白的点免疫印迹检测

含有5μg蛋白的组织提取物结合在硝化纤维素滤膜上，然后根据Jahn，R.，Schiebler，W.，Greengard，P.所述方法（利用硝化纤维素膜滤器对蛋白进行定量的点免疫结合检测.Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：1684-87，1984），利用¹²⁵I-驴抗兔抗体进行点免疫结合检测。已知量的纯化的CpTI各标准被一起加到5μg未转化烟草提取物中。放射自显影以后，或者通过单个“点”的闪烁计数定量，或者通过用LKB Ultrascan积房激光密度测定仪对放射自显影图象扫描进行定量。

用此方法得到的结果能很好地重复。由于抗体的交叉反应性不强，所估计的+5/5中大约0.9%的总蛋白是CpTI可能仍然低估了。

通过此方法测定了幼叶和老叶、茎和根组织中的CpTI表达水平。在此特殊实验中，高水平的非专一性抗体结合“本底”，使每个样品的可靠检测水平限制在大约18mg（0.4%蛋白质），从而使+5/5幼叶的表达水平测定值非常低。然而，结果（表9）清楚表明：

随着叶片成熟CpTI的相对含量下降：

在转化植株的茎中存在有CpTI;

在根中的表达甚至占总蛋白更高的比例。

表9    不同的植物组织提取物中表达的CpTI占可溶蛋白的百分比

幼叶    成熟叶    茎    根

+5/5    0.6    ＜0.4    0.6    1.0

-2/8    ＜0.4    ＜0.4    ＜0.4    ＜0.4

对照    ＜0.4    ＜0.4    ＜0.4    ＜0.4

（f）Western印迹检测

通过Western印迹法也证实了转化烟草植株中存在有CpTI。使+5/5和-2/8植株幼叶的可溶蛋白提取液的硫酸铵沉淀物在非还原条件下进行17%聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳。胰蛋白酶亲和柱纯化的CpTI和豇豆TVu2027种子的可溶蛋白提取物作为标准一起电泳。根据Towbin等人所述（Towbin，H.，Staehelin，T.，Gordon，J.，蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶上电泳转移至硝化纤维素片上，方法及某些应用.Proc.Natl.Acad.Sci.USA    76：4350-4，1979）进行Western印迹检测。图9的印迹表明，在+5/5叶片中存在有能与CpTI抗体发生交叉反应的物质带，而在-2/8中没有，这些带对应于豇豆种子中的CpTI主带。

图9表明了下列：

A）亲和纯化的CpTI

B）豇豆TVu    2027的种子提取物

C）-2/8叶片组织

D）+5/5叶片组织

（17）转化体的基因分析

（a）卡那霉素抗体的分离分析

使最初的烟草转化植株结出自花传粉的种子。收集成熟种子并于4℃保存在密封瓶中。种子表面用20%“Chloros”消毒，使其在生长室中在含有0.5×Murashige和Skoog培养基盐类和200μg/ml卡那霉素的0.8%琼脂上发芽。

在S₁子代籽苗中可清楚分辨出四种表型：

非成活的：种子不能发芽

卡那霉素抗性：在200μg/ml卡那霉素上生长良好，发育出高度分枝的根系和“健康的”绿色真叶。

卡那霉素敏感性：种子发芽，但发育中根不分枝，不能正常发育出真叶，而且子叶白化。

中间抗性型：种子发芽并发育出真叶。但根系分枝显然比完全抗性籽苗的少（将籽苗从琼脂上拉下则尤其明显），可观察到叶片有一些白化斑。

来自转化植株的种子的存活力很高-至少与未转化烟草（Samsum品种）种子在相似条件下（但没有卡那霉素）的发芽率一样高。

表10中概括的结果表明，卡那霉素抗性象简单的孟德尔特性那样表现，在所测植株中存在于一个或两个位点上，产生典型的孟德尔分离比例3∶1或9∶3∶3∶1。正如所期望的那样，该特性一般是显性的，但似乎有可变的外显率。因此，某些双位点植株中的中间表型的出现表明，某些位点比其他位点表现出强得多的表型效应。应当注意，母本植株-2/2和+5/19在此选择水平上（其卡那霉素浓度为最初所用的两倍）应不会增殖，确实，-2/2系已在100μg/ml卡那霉素上的连续栽培中而消失了。由于只涉及到一个或两个位点，在S₂子代中能鉴别出纯合子植株。

表10 转化烟草植株的S₁子代中卡那霉素抗性的分离分析

〔＊〕φ²在任何情况下不超过临界值

表型

非存    敏感    中间    抗性    %

植株 活 型 型 型 发芽 分离比例 φ^2[＊]评注

+5/1    4    7    -    169    98    （9+3+3）∶1    1.552    2个“强”位点

+5/2    4    19    -    67    96    3∶1    0.388    1个“强”位点

+5/3    6    16    -    68    93    3∶1    1.587    1个“强”位点

+5/5    4    78    -    233    99    3∶1    0.001    1个“强”位点

+5/6    4    17    -    69    96    3∶1    1.256    1个“强”位点

+5/7    4    25    -    61    96    3∶1    0.760    1个“强”位点

+5/8    3    2    -    85    97    （9+3+3）∶1    1.699    2个“强”位点

+5/9    5    14    -    71    94    3∶1    3.298    1个“强”位点

+5/14    0    22    -    68    100    3∶1    0.148    1个“强”位点

+5/15    0    23    -    67    100    3∶1    0.148    1个“强”位点

+5/19    6    58    26    0    93    11∶5    0.023    2个很“弱”位

点;在此选

择水平上即

中间抗性型

也需要三个

拷贝

+5/21    8    13    31    128    96    （9+3）∶3∶1    0.859    1个“强”，

1个“弱”位点

+5/23    7    15    -    68    92    3∶1    2.124    1个“强”位点

非存    敏感    中间    抗性    %

植株    活    型    型    型    发芽    分离比例    φ    评注

-2/2    8    68    -    14    91    1∶3    2.747    1个“弱”位点

在此选择水

平上抗性需

要二个拷贝

-2/7    1    24    -    65    99    3∶1    0.173    1个“强”位点

-2/8    14    58    90    63    94    5∶6∶5    2.577    2个“弱”位点

＞2拷贝-抗

性;2拷贝

-中间型;

＜2拷贝-敏

感型

最初采用的-2/2〔1〕，在100μg/ml卡那霉素的继续培养中，确实已丧失。由于只包含1或2个位点，因此，在S₂子代中，纯合的植物可看作是相同的。

（b）抗昆虫性表型的遗传

+5/5的10个卡那霉素抗性S₁子代（称为+5/5〔1〕A11-20）用棉花叶虫进行生物测试（表11），然后使之生长并自花受精结出S₂种子。此种子在含有200μg/ml卡那霉素的1/2MS琼脂上发芽。来自4/10植株的S₂种子不表现卡那霉素抗性表型的分离，经测试，产生的分离比例与对这样规模的样品所期望的一致。有趣的是，根据生物测试，4个纯合子植株的抗昆虫性列为第一、第二、第三和第五。

表11 用棉花叶虫在S₁植株（+5/5〔1〕）上的饲养试验

（＊）：p＜0.05    （＊＊）：p＜0.025

参数    对照    +5/5〔1〕    显著性

昆虫存活（%）    45.00    30.00    （＊）

存活者平均大小（mm）    23.38    18.42    （＊）

活昆虫重/株（g）    3.37    0.94    （＊）

吞食叶面积（%）    70.32    42.35    （＊＊）

（c）Southern印迹法

根据标准方法，从基因转移植株刚成熟的叶片中分离高分子量的基因组DNA。10μg基因组DNA用EcoRⅠ和HindⅢ各40单位于38℃下消化过夜，在1%琼脂糖凝胶上电泳分离限制性片段。为了提供“标记物”片段和重建拷贝数，用EcoRⅠ和HindⅢ消化比例为5∶1的pRoK CpTI+5和pROK CpTI-2的混合物。使消化质粒中相当于每10μg烟草DNA每个烟草基因带1，5和20拷贝转移顺序一起电泳。DNA通过“Southern”法转移到硝化纤维素上，用³²P-dCTP标记的、缺口转译的pRoK CpTI+5探针杂交。在0.5×SSC，0.1% SDS中于68℃进行高严紧度洗涤，然后进行放射自显影。图10中指明了+5/5和-2/8植株自显影图象中重要带的来源，其中，（A）表明pRoK CpTI+5和pRoK CpTI-2构建体中的鉴别限制性位点，（B）是Southern印迹的放射自显影图象。

主要结论可总结如下：

1）所有测试植株至少含有1个CaMV    35S启动子、CpTI-NOS终止构建体的未重排拷贝，正如在+5中480Kp和1200Kp带的存在，以及-2中610和1070Kp带的存在所表明的那样。

2）所有都含有基因插入片段的多份拷贝（见下面）。

3）大多数拷贝存在于“头至尾”的串联排列中-产生2570Kp的带。此插入段段是串联重复体，它说明了基因拷贝数和基因位点数之间的差别的原因。

4）强烈表明构建体内有内部重排的带是不常见的，但在某些植株中可鉴别到（如5/8，图11）。

5）更高分子量的带可能是由于下列结果：

a）非完全消化

b）“末端片段”插入宿主DNA中

c）基因重排

d）Ti质粒的转移

（d）基因拷贝数

拷贝数由积分激光密度测量仪进行扫描测定，用质粒DNA基因组拷贝数重建体作为标准，对Southern印迹和基因组DNA印迹点进行扫描测定。表12给出了结果。可注意到在拷贝数和CpTI表达之间没有关系（因此，与抗昆虫性也无关）。据推测，插入片段的插入位点的性质更加重要。

表12    转化植株中插入片段的拷贝数

n.d.-未测定

每个基因带的插入片段拷贝

植株    从Southern印迹测得    从点印迹测得

+5/1    36    42

+5/2    16    17

+5/3    n.d.    n.d.

+5/5    3    5

+5/6    n.d.    n.d.

+5/7    7    11

+5/8    17    22

+5/9    8    8

每个基因带的插入片段拷贝

植株    从Southern印迹测得    从点印迹测得

+5/4    2    7

+5/15    2    2

+5/19    9    12

+5/21    n.d.    n.d.

+5/23    13    13

-2/2    n.d.    3

-2/7    3    6

-2/8    7    13

Claims (15)

1、一种DNA重组分子，它包括编码胰蛋白酶抑制剂的结构基因。

2、根据权利要求1的DNA分子，其中的结构基因编码来自豆科植物的胰蛋白酶抑制剂。

3、根据权利要求1的DNA分子，其中的结构基因编码来自豇豆（Vigna  unguiculata）的胰蛋白酶抑制剂（豇豆胰蛋白酶抑制剂或CpTI），或者编码的蛋白具有CpTI类似性质和/或与之有相当程度的同源性。

4、根据权利要求3或4的DNA分子，它产生于豇豆。

5、根据权利要求3或4的DNA分子，其中的结构基因的编码链具有图6所示的碱基234至476的碱基顺序，或其片段。

6、根据权利要求3或4的DNA分子，其中的结构基因的编码链具有图7所示碱基79至332的碱基顺序或其后段。

7、根据权利要求1至6中任一项的DNA分子，其中的结构基因所编码的蛋白具有图1所示的氨基酸顺序，或者该蛋白具有与之相等的免疫学或生物学活性，包括该蛋白的修饰形式。

8、根据权利要求5的DNA分子，它如图6所示在编码链的5′端和3′端具有额外的碱基顺序。

9、根据权利要求6的DNA分子，它如图7所示在编码链的5′端和3′端具有额外的碱基顺序。

10、一种DNA重组质粒，它包括插入载体DNA中的根据权利要求1至9中任何一项的DNA分子。

11、根据权利要求10的DNA重组质粒，其中的载体DNA来自根癌农杆菌Ti质粒。

12、根据权利要求11的DNA重组质粒，其中的Ti质粒在其左右T-DNA边界之间具有启动子片段和一个转录终止子片段，CpTI片段插在启动子和终止子片段之间。

13、一种产生一个改造植物的方法，包括将权利要求1至9中任何一项的DNA整合入植物的核基因组。

14、一种产生含有并能够表达CpTI基因的植物的方法，包括用根据权利要求10至12中任何一项的重组质粒转化植物组织或细胞，选择转化植物组织或细胞，从这样的转化组织或细胞再生植株。

15、一种通过权利要求13或14的方法修饰或转化的植物，或者这种植物的后代。

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