CN87104540A

CN87104540A - 人溶菌酶的生产

Info

Publication number: CN87104540A
Application number: CN198787104540A
Authority: CN
Inventors: 菊池正和; 吉村浩二; 中滨一雄
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-06-30
Filing date: 1987-06-30
Publication date: 1988-02-24
Also published as: EP0251730A3; TW205070B; EP0255233A3; KR880000591A; CA1305439C; KR880000587A; CN87104541A; EP0251730A2; US4945051A; EP0255233A2

Abstract

公开了一种DNA序列，其中编码信号肽并具有下述结构：

M-R-S-F-L-L-L-A-L-C-F-L-P-L-A-A-L-G的DNA段结合于编码人溶菌酶的DNA段的5′端，还公开了一种用上述DNA序列转化的细胞和生产人溶菌酶的方法，该方法包括培养上述在培养物中积累人溶菌酶的细胞并对人溶菌酶进行回收等。

上述技术使得大量生产可作为药物使用的人溶菌酶成为可能。对于通过分泌生产人溶菌酶来说，本发明的信号肽优于鸡蛋清溶菌酶的信号肽。

Description

本发明涉及生产人溶菌酶的DNA重组技术。更具体地说，本发明涉及人溶菌酶基因的表达、重组质粒、转化细胞及其产物。

溶菌酶是一种较小的酶蛋白，分子量约为14，000。溶菌酶分布于活体组织中，人们认为它是作为防御物质而起作用的，它通过溶解各种细菌而抵抗细菌感染。溶菌酶的功能可能是通过β-葡糖苷酶活性来溶解细菌细胞壁的多糖。鸡蛋清中含有大量溶菌酶，因此从其中能够比较容易地分离到高纯度的溶菌酶。这样的溶菌酶可为了防腐目的加到干酪、香肠和海产品中，或用于将牛奶转化成人的哺乳奶（Katsuya Hayashi和Taiji Imofo，《溶菌酶》，Nankodo，Japan，1974）。而且，溶菌酶作为医疗药剂可用于止血、消炎、组织再生和抗肿瘤等（参见“Saikin-no-Shinyaku”（日本新药）Vol.34.107，Yakuji Nippo，Tokyo，Japan，1983），并且，它已经作为消炎酶药剂上市了。

将来自鸡蛋清的溶菌酶用于医疗目的时，通常导致过敏症状如疹子和发红等。这些现象一般称为对外源蛋白免疫应答的副作用。为了克服上述弊病，本发明者开始了研究以建立一种大量生产人溶菌酶的方法。

人溶菌酶的氨基酸序列是已知的，它由130个氨基酸组成（“Biochemical Data Book”，1：189，1979，日本生化学会主编）。以此氨基酸序列为基础，化学合成了编码人溶菌酶的DNA片段（Ikehara，M.等人，Chem.Pharm.Bull.，34：2202，1986）。

为了利用DNA重组技术生产人溶菌酶，Muraki等人试图在大肠杆菌中进行表达，但用这种表达系统没能得到活性人溶菌酶（Muraki，M等人，Agric.Biol.Chem.，50：713，1986）。

已经发现，通过酵母的分泌作用得到了一种活性人溶菌酶（Jigami等人，《1986年日本农业化学学会概要》，P.343，1986）。但其产量非常低，只有600微克/升。根据Jigami等人的报道，在人溶菌酶的表达中，与编码人溶菌酶的DNA片段相结合，使用了一种编码信号肽的CDNA片段，此信号肽具有将所需蛋白分泌到细胞外的信息。作为编码信号肽的CDNA片段，使用的是编码鸡蛋清溶菌酶信号肽的CDNA片段（天然型）（此信号肽的序列与Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5759-5763，1980中公开的相同）。然而，进行了这样的结合后，如上所述，从酵母细胞中分泌到胞外的溶菌酶数量仍然很少。

本发明者利用DNA重组技术对于活性人溶菌酶的大规模生产进行了详尽的研究，研究结果是完成了本发明。

虽然，人溶菌酶基因目前还未被克隆，但已经确定了溶菌酶的氨基酸序列。因此，以此氨基酸序列为基础，Ikehara等人已经化学合成了编码人溶菌酶的DNA（Ikehara，M.等人，同上）。

因此，有可能利用此化学合成的DNA通过DNA重组技术大量生产人溶菌酶。

作为与编码人溶菌酶的DNA片段一起使用的编码信号肽的DNA片段，可以提及的有编码下述结构式的信号肽的DNA片段：

M-R-S-F-L-L-L-A-L-C-F-L-P-L-A-A-L-G

考虑到要在酵母中进行表达，因此，最好是利用酵母中高频率使用的密码制备编码蛋清溶菌酶信号肽的DNA片段。使用这样的DNA片段，发现能以增加的水平达到大量获取人溶菌酶的预定目标。密码子使用率已有过报道（J.Biol.Chem.，257：3026-3031，1982）。优选的酵母密码子的实例在下面以RNA密码子的形式给出。

氨基酸密码子氨基酸密码子氨基酸密码子

Ala GCU，GCC His CAC Tyr UAC

Ser UCU，UCC Glu GAA Cys UGU

Thr ACU，ACC Gly GGU Asn AAC

Val GUU，GUC Gln CAA Pro CCA

Ile AUU，AUC Lys AAG Met AUG

Asp GAC Leu UUG Trp UGG

Phe UUC Arg AGA

图1给出了通过寡聚核苷酸的集中和连接合成人溶菌酶基因的方法的示意图;

图2表明人溶菌酶基因中TaqⅠ-XhoⅠ片段的DNA序列;

图3表明信号肽的DNA序列;

图4是构建人溶菌酶分泌质粒的示意图;

根据Ikehara等人制备合成基因时，DNA序列的选择要考虑到下述因素：

1）使用最适于酵母的且被认为适于合成基因表达的密码子，2）造成一个限制性酶（此处是XbaⅠ）的专一性识别位点，它可作为克隆的标记使用，或有助于表达载体建成后的基因的再构建，3）避免在单链或双链中的自我互补或互相互补的序列（适当组合者除外）。

人溶菌酶基因可以根据上述进行化学合成。

必须将合成基因插入适当的载体中，以通过再克服使它增殖。虽然，只要能插入此基因的任何载体都可使用，但这儿引用几个具体的实例：大肠杆菌载体pACYC 177、大肠杆菌-酵母穿梭载体pPH017、pGLD906和pGLD906-1（日本专利，未审查公开号为61-43991）、枯草杆菌（Bacillus Subtilis）载体pTEX201（Yoshimura，K.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.，23：250，1986）。

利用含有这样得到的合成基因的载体转化各种宿主生物。转化本身的方法是众所周知的，但如果使用大肠杆菌作为宿主生物，则根据Cohen等人的方法进行转化（Cohen，S.N.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69：2110，1972），如果使用酵母作为宿主生物，则使用Hinnen等人的方法（Hinnen.A等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：1927，1978），如果使用枯草杆菌作为宿主生物，则利用原生质体法（Chang，S.和Cohen，S.N.，Gen.Genet.，168：111，1979）或感受态法（Dubnau，D.和Abelson，R.D.，J.Mol.Biol.，56：209，1971）。作为宿主生物，可以使用的有例如大肠杆菌294、大肠杆菌W3110、大肠杆菌C600、啤酒酵母（Saccharomyces Cerevisiae）AH22R^-、枯草杆菌1A1、枯草杆菌1A339和枯草杆菌1A340等。

然后，为了表达此基因，首先通过例如碱性提取法（Birnboim，H.C.和Doly，J.，Nucleic Acids Res.，7：1513 1979）从转化体中分离插入了基因的质粒DNA。通过用合适的限制性酶处理所得到的质粒DNA，可以将插入的基因切出来，并可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。所有这些方法都是已知的并在文献中有详细记载（参见例如《分子克隆》，1982，冷泉港实验室）。将分离的基因以正确定向连接到一个合适的表达载体中，使它位于启动子和信号肽编码区的下游，从而建成一个表达质粒。

作为编码信号肽的优选的DNA，可以提及的有根据酵母密码本化学合成的DNA。虽然，化学合成DNA中的合适密码子是酵母中最常用的密码子，但制备限制性酶识别位点时可以使用较低频率的密码子。DNA的化学合成可以根据例如Crea等人的方法进行（Crea，R.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75：5765，1978）。

如前所述，将编码信号肽的DNA片段连在编码人溶菌酶的DNA片段的5′，即可制得这样一个DNA片段：其中编码信号肽的DNA段与编码人溶菌酶的DNA段的5′端相连接。

DNA片段也可通过下述方法制备：a）使编码信号肽和人溶菌酶N-端部分的DNA段与编码缺乏N-端部分的人溶菌酶的DNA段相连接，b）使编码缺乏C-端部分的信号肽的DNA段与编码信号肽的C-端部分和人溶菌酶的DNA段相连接，c）使编码缺乏C-端部分的信号肽的DNA段、编码信号肽C-端部分和人溶菌酶N-端部分的DNA段、以及编码缺乏N-端部分的人溶菌酶的DNA段相连接。

有许多表达载体在本领域内是已知的，只要能用来表达此基因，则其中的任何一个都可使用。合适的表达载体的例子有pPHO17、pGLD906、pGLD906-1（同上）、pcDX（Okayama，H.和Berg，P.，Mol.Cell.Biol.，3：280，1983）和pKSV-10（Pharmacia公司产品）。

作为启动子，如果用酵母作为宿主，可以使用的有例如PHO5启动子、GLD启动子、PGK启动子、ADH启动子、PHO81启动子。如果用动物细胞作为宿主，可以作为启动子使用的有例如SV40早期基因启动子、金属硫蛋白（Metallothionein）启动子及热休克启动子等。

使用促进剂也对表达起作用。

作为用于表达的宿主，可以提及的有酵母（如啤酒酵母）、鼠L细胞和中国仓鼠卵母细胞。但也可使用其它的真核细胞。

转化酵母的方法前面已有过描述。转化真核细胞（如动物细胞）的方法记载于下述文献中，例如，蛋白、核酸和酶，28（1983）“重组DNA的导入细胞及表达”（Kyoritsu Shuppan）。

利用这样得到的分泌质粒转化宿主细胞，从而得到所需的转化体。然后以任何已知方法培养转化体。

用于酵母的培养基可以是例如Burkholder基本培养基（Bostian，K.L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4505，1980;Amer.J.Bot.，30：206，1943）或它的修改培养基。培养一般可在15-40℃的温度下进行10-96小时，较好是在24-37℃下培养24-72小时，如果需要则伴以通气和/或搅动。

对于用真核细胞（如动物细胞）作为宿主的转化体的培养，可以作为培养基使用的有Eagle培养基（H.Eagle，Science，130：432，1959）、Dulbecoo改进的Eagle培养基（Orgad Larb和William J.Ritter，J.Biol.Chem.，258：6043，1983）或类似的培养基等。培养一般可在30-42℃，较好是在35-37℃的温度下进行大约1-10天。

完成培养以后，通过公知的方法分离细胞和上清液。为了收集残留在细胞中的人溶菌酶，通过常规方法使细胞破碎，例如用超声波或French加压法进行破碎、进行机械破碎（如压榨）和用溶解酶进行破碎等。如果有必要，可以用表面活性剂（如Triton-X100和脱氧胆酸盐）对这样制备的人溶菌酶进行进一步萃取。为了得到需要的人溶菌酶，通过常规的蛋白纯化方法纯化上清液中或这样制备的萃取液中的人溶菌酶，这些方法包括盐析、等电点沉淀、凝胶过滤、离子交换层析和高效液相层析（HPLC、FPLC等）等。

具有医疗活性如消炎、止血、组织再生和抗肿瘤等的人溶菌酶，可作为消炎酶药剂用于洗眼剂中或作为防腐剂用于食品中。将人溶菌酶用于医疗目的时，它不会表现出使用鸡蛋清溶菌酶时由于免疫应答导致的副作用。然而，迄今为止，人们只是以很小的数量得到人溶菌酶。

如上所述，本发明使得提供大量可作为药物使用的人溶菌酶成为可能。对于通过分泌生产人溶菌酶来说，本发明的信号肽优于蛋清溶菌酶的信号肽。

实例

下面，将通过参考实例和实例更为详细地说明本发明。但是，这些实例不能认为是对本发明范围的限制。

实例3中公开的啤酒酵母AH22R^-/pGFL735已寄存于日本大阪发酵研究所（IFO，寄存号为IFO-10227），并从1987年2月5日起，寄存于日本国际商业和工业部工业科技署的发酵研究所（FRI，寄存号为FERM P-9173），该寄存物已转换成根据布达佩斯条约的寄存物，并以FERM BP-1346的寄存号贮藏于FRI。

参考实例1 克隆载体pBR322X的构建

使5微克大肠杆菌载体pBR322与1.5单位BalⅠ限制性酶在40微升反应缓冲液（10毫克分子/升Tris-Hcl pH7.5，10毫克分子/升MgCl₂，1毫克分子/升二硫苏糖醇）中于37℃下反应5小时，然后，用苯酚萃取反应混合物，并根据常规方法用乙醇沉淀DNA。在此DNA中加入50毫微克磷酸化的Xhol连接子d〔pCCTCGAGG〕（New England Biolabs产品），并根据常规方法用T4DNA连接酶将它们互相连接起来。用此反应液转化大肠杆菌DH1，并根据上述碱性提取法从这样得到的氨苄青霉素抗性和四环素抗性菌落中提取质粒，从而得到在BalⅠ位点处带有XhoⅠ位点的质粒pBR322X。

参考实例2 在N-端附近带有TaqⅠ位点的人溶菌酶基因片段的制备

在Ikehara等人的报道（同上）中，人溶菌酶基因是通过示于表1中的52个寡聚核苷酸组制备的。

表1

上链号码下链号码

U1 TCGAGATGAAGGTTT L26 TCGAGCTATTAAAC

U2 TTGAGAGATGCGAAT L25 ACCACAACCTTGAAC

U3 TAGCCAGAACTTTGAAG L24 GTATTGTCTGACATC

U4 AGATTGGGTATGGAC L23 TCTATTTTGGCATCT

U5 GGCTACCGTGGTATT L22 GTTTCTCCAAGCGAC

U6 TCTTTAGCCAACTGG L21 CCAGGCTCTAATACCCTG

U7 ATGTGTCTTGCTAAG L20 TGGGTCACGGACAAC

U8 TGGGAATCCGGCTATAAC L19 TCTCTTAGCGCAGGC

U9 ACTAGAGCTACCAAT L18 AACAGCATCAGCAAT

U10 TACAACGCTGGCGAC L17 GTTGTCCTGAAGC

U11 CGTTCTACAGACTATGG L16 AAAGCTGAGCAAGAT

U12 TATTTTCCAAATTAACT L15 AAGTGACAGGCGTTGAC

U13 CTAGATATTGGTG L14 GGCACCTGGAGTCTTGC

U14 TAACGATGGCAAGACTC L13 CATCGTTACACCAATAT

U15 GAGGTGCCGTCAACGCC L12 CTAGAGTTAATTTGG

U16 TGTCACTTATCTTGC L11 AAAATACCATAGTCTGT

U17 TCAGCTTTGCTTCAG L10 AGAACGGTCGCCAGC

U18 GACAACATTGCTGAT L9 GTTGTAATTGGTAGC

U19 GCTGTTGCCTGCGCT L8 TCTAGTGTTATAGCCG

U20 AAGAGAGTTGTCCGT L7 GATTCCCACTTAGCAAG

U21 GACCCACAGGGTATT L6 ACACATCCAGTTGGC

U22 AGAGCCTGGGTCGCT L5 TAAAGAAATACCACG

U23 TGGAGAAACAGATGC L4 GTAGCCGTCCATACC

U24 CAAAATAGAGATGTC L3 CAATCTCTTCAAAGT

U25 AGACAATACGTTCAAGG L2 TCTGGCTAATTCGCATC

U26 TTGTGGTGTTTAATAGC L1 TCTCAAAAACCTTCATC

根据Ikehara等人的报道，合成称为U2-taq的CGAGAGATGCGAAT和称为L2-taq的TCTGGCTAATTCGCATCTCT以分别代替表1中的U2和L2。然后根据Ikehara等人的报道，用U2-taq、U3至U26、L2-taq、L3至L26等片段中的每一种形成寡聚核苷酸组的杂交体（图1）。根据实例2记载的方法，将这些组中的每一种片段连接起来，然后使两个5′端进行酶促磷酸化。

参考实例3 含有Taql位点的人溶菌酶基因片段的再克隆

使2.6微克参考实例1中构建的质粒pBR322X与6单位限制性酶Xhol和6单位限制性酶ClaⅠ在35微升反应液（33毫克分子/升乙酸缓冲液pH7.9，66毫克分子/升乙酸钾，10毫克分子/升乙酸镁，0.5毫克分子/升二硫苏糖醇，0.01%牛血清清蛋白（BSA）中于37℃下反应1小时，用苯酚去掉反应液中的蛋白并用冷乙醇进行沉淀。将此DNA（200毫微克）与100毫微克参考实例2中制备的人溶菌酶基因片段混合，并使之在10微升反应液（66毫克分子/升Tris-Hcl pH7.6，10毫克分子/升ATP，10毫克分子/升亚精胺，100毫克分子/升Mgcl₂，150毫克分子/升DTT，2毫克/毫升BSA，5单位T₄DNA连接酶）中于14℃下反应过夜，使它们相互连接起来。根据Cohem等人的方法用此反应液转化大肠杆菌DH1。根据上述的碱性提取法从这样得到的转化体中分离质粒。检测其分子量和限制性酶切图谱，从而得到了插入了人溶菌酶基因片段的pLYS22年。分离pLYS221中的EcoRⅠ-XhoⅠ片段并根据双脱氧核苷酸链终止法测定其碱基序列，其结果是得到了人溶菌酶基因的Taql-XhoⅠ片段，此片段与示于图2中的假设片段完全一致。

此片段编码人溶菌酶氨基酸序列的第4谷氨酸至第130缬氨酸。

实例1 编码信号序列的DNA片段的制备

用苯丙氨酸、亮氨酸和丙氨酸分别取代已知的蛋清溶菌酶信号肽氨基酸序列中的第四亮氨酸、第六异亮氨酸和第八缬氨酸（Jung，A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，77：5759，1980）。为了得到高水平的表达，确定核苷酸序列时要进一步考虑下述因素：

（1）优先选择酵母中高频率使用的密码子;

（2）为了增强表达，在ATG的上游使用一个酵母PGK基因的序列;

（3）有可能构建杂交信号。

这样合成的核苷酸序列示于图3中。如图所示，在含有溶菌酶编码区的5′端有一个XhoⅠ位点，在3′端有一个TaqⅠ位点。完整序列由八个寡聚核苷酸组（＃1-＃8）组成，它们是通过磷酰胺法制备的（Caruthers，M.H.等人，Tetrahedron Letters，22：1859，1981）。

使核苷酸组＃2至＃7（每种10微升，含5微克）相互混合，在其中进一步加入10倍浓度的20微升激酶缓冲液（0.5克分子/升Tris-Hcl，0.1克分子/升Mgcl₂，0.1克分子/升巯基乙醇，pH7.6），20微升的10毫克分子/升ATP、20微升（50单位）的T₄寡聚核苷酸激酶（Takara Shuzo Inc.产品）和80微升蒸馏水。然后使混合物于37℃下反应2小时，然后在65℃下处理20分钟以终止反应。在反应混合物中加入核苷酸组＃1和＃8每种10微升（5微克），并加入10微升T₄连接酶（NEB Inc.产品），使混合物于14℃下反应过夜。使得到的反应混合物在10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。从凝胶上切下76bp的片段，通过电洗脱将它从凝胶中提取出来。将它溶于45微升蒸馏水中，在其中加入6微升10倍浓度的激酶缓冲液（同上）、6微升10毫克分子/升ATP和2微升（5单位）T₄寡聚核苷酸激酶（同上）。使混合物于37℃下反应1小时后保存在-20℃下。

在图3中采用了氨基酸的单字母表达法（由IUPAC-IUB生物化学命名所确定的规则）。

例如：

A：丙氨酸

B：天冬氨酸或天冬酰胺

C：半脱氨酸

D：天冬氨酸

E：谷氨酸

F：苯丙氨酸

G：甘氨酸

H：组氨酸

I：异亮氨酸

K：赖氨酸

L：亮氨酸

M：蛋氨酸

N：天冬酰胺

P：脯氨酸

O：谷氨酰胺

R：精氨酸

S：丝氨酸

T：苏氨酸

V：缬氨酸

W：色氨酸

Y：酪氨酸

Z：谷氨酸或谷氨酰胺

X：未知的或其它氨基酸

实例2 分泌表达质粒的构建

用120单位的EcoRⅠ（Nippon Gene Inc.产品）和120单位的XhoⅠ（Nippon Gene Inc.产品）于37℃下对参考实例3中得到的质粒pLYS221（236微克）处理2个小时，以切下人溶菌酶编码区的片段。该片段进一步用26单位的TaqⅠ（Nippon Gene Inc.产品）于65℃下处理1小时，从而得到缺乏N-端部分的人溶菌酶编码区的片段。

使大约1微克所得片段与0.5微克实例1中得到的编码信号序列的DNA混合，使混合物在800单位T4连接酶（同上）的存在下于16℃下反应16小时，跟着用XhoⅠ（42单位）进行处理。

将这样得到的XhoⅠ片段（10毫微克）与1毫微克用XhoⅠ处理酵母表达载体pGLD906-1（日本专利未审查，公开号61-43991）得到的DNA混合，使二者在T4连接酶存在下连接起来。

用与上述相同的方式用反应混合物转化大肠杆菌DH1，从而得到许多含有GLD启动子的质粒，在启动子的下游插入有信号序列编码区和人溶菌酶基因，方向与启动子的方向相同。这种质粒之一命名为pGFL735并用于下述试验中（参见图4）。

实例3 酵母转化体的制备

根据Hinnen等人的方法（同上），用实例2中得到的质粒pGFL735转化啤酒酵母AH22R^-，从而得到转化体啤酒酵母AH22R^-/pGFL735。

实例4 转化体的培养

在一只试管中倒入5毫升Burkholder修改培养基Ⅲ（Amer.J.Bot.，30：206，1943;KH₂PO₄0.44克/升，葡萄糖11克/升，天冬酰胺5.6克/升，蔗糖89克/升），在其中接种啤酒酵母AH22R^-/pGFL735转化体，于30℃下摇床培养3天。将1毫升培养物转移到含有4毫升同一培养基的另一试管中，在30℃下摇床培养1天。将2毫升培养物进一步转移到含有18ml同样的Burkholder修改培养基Ⅲ的200毫升培养瓶中，使混合物在30℃下摇床培养4天。培养期间，在24、50和72小时时取样。

实例5 人溶菌酶产量的测定

使实例4中得到的培养物离心，检测所得上清液中的人溶菌酶。

根据《Worthigton Enzyme Manual》（P.100，Worthigton Biochemical Corporation，USA，1972）的方法测定人溶菌酶活性。用Sigma公司生产的人溶菌酶作为标准。“一个单位”定义为用Micrococcus Lysodeikticus（Sigma产品）作为底物，在0.1克分子/升磷酸缓冲液（pH6.2）中于25℃下反应1分钟，使450nm的光吸收降低0.001所需的酶量。生成的人溶菌酶的数量如下：

人溶菌酶（毫克/升）

培养时间上清液

24 0.8

50 3.2

72 5.2

实例6 表达的人溶菌酶的纯化和分离

首先用与实例4所述相似的方法培养转化体啤酒酵母AH22R^-/pGFL735。

使得到的培养物（1.9升）离心，将这样得到的上清液吸附在用50毫克分子/升磷酸钠缓冲液（pH6.5）平衡的CM-Cellulose柱（φ1.6厘米×12.5厘米）上。用150毫升上述缓冲液洗涤柱子，然后用含有0.5克分子/升Nacl的上述缓冲液洗脱，则得到几乎形成单峰的人溶菌酶。发现回收率大约为70%。

使上述得到的人溶菌酶进行HPLC以进一步纯化。这样，将0.25毫升含有0.2毫克人溶菌酶的洗脱液上到TSK凝胶ODS120T柱中。用水+0.1%三氟乙酸（TFA）洗涤后，通过在0.1%TFA中的含有0-100%CH₃CN的梯度法进行洗脱，从而得到均一的人溶菌酶。

实例7 人溶菌酶的性质

（1）分子量

用2-巯基乙醇处理实例6中得到的蛋白，并使它进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶（15%）电泳（180V，2小时）。考马斯亮蓝染色显示出单一蛋白区带。此带表现出来的泳距和与之同时进行电泳的人溶菌酶样品的非常相同。因此，认为此蛋白质的分子量为14.7kd，与人溶菌酶的分子量一致。

（2）氨基末端的氨基酸序列：

利用汽相蛋白质序列仪（Applied Biosystem Inc.生产，470型）使实例6中得到的蛋白进行自动Edman降解（J.Biol.Chem.，256：7990，1981），以分析其氨基末端的氨基酸序列。利用Micropack SPC 18-3柱，通过高效液相层析（Varian Inc.产品）对产生的乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）进行鉴别和定量分析，从而得到示于下表中的结果。因此，揭示出氨基酸序列为H-Lys-Val-Phe-Glu-Arg-X-Glu-Leu-Ala-Arg-（X：未鉴别）。

循环 PTH-氨基酸

（微微摩尔）（%）

1 Lys 1071 57.4

2 Val 1176 63.0

3 Phe 1013 54.3

4 Glu 1043 55.9

5 Arg -^＊-

6 X^＊＊- -

7 Glu 1046 56.0

8 Leu 1106 59.2

9 Ala 1246 66.7

10 Arg -^＊-

＊未计算

＊＊未鉴别

（3）氨基酸组成

将实例6中得到的蛋白置于一玻璃管中进行水解和真空干燥。在试管中加入6当量浓度Hcl或含有4%巯基乙酸的6当量浓度Hcl并在真空下密封。水解在110℃下进行24小时。水解以后，在真空中去掉盐酸，使残余物溶于0.02当量浓度Hcl中进行氨基酸分析。氨基酸分析值从两种水解物得到的值取平均值。然而，对于色氨酸，采用用含有4%巯基乙酸的盐酸进行水解得到的值。结果示于下表中。

氨基酸组成

氨基酸分析值测定的＊理论的

Asp 0.7475（微摩尔） 18 18

Thr 0.2153 5.2 5

Ser 0.2324 5.6 6

Glu 0.3972 9.6 9

Pro 0.0561 1.4 2

Gly 0.4652 11.2 11

Ala 0.5925 14.3 14

Half Cys -^＊＊- 8

Val 0.3550 8.5 9

Met 0.0823 2.0 2

Ile 0.2025 4.9 5

Leu 0.3415 8.2 8

Tyr 0.2550 6.1 6

Phe 0.0839 2.0 2

Lys 0.2168 5.2 5

His 0.0412 1.0 1

Arg 0.5723 13.8 14

Trp 0.2032 4.9 5

＊：以Asp的值为18计算

＊＊：未测定

如上所述，实例中得到的人溶菌酶的氨基酸组成与人溶菌酶氨基酸组成的理论值非常一致。因此，实例中得到的人溶菌酶被认为是天然型的人溶菌酶。

勘误表

文件名称页行补正前补正后

说明书 1 10 Imofo， Imoto，

5 倒2 片段的5′ 片段的5′端

11 8 pLYS22年。 pLYS221。

12 倒3 C：半脱氨酸 C：半胱氨酸

15 10 使450nm 使450mμ

17 倒3

｝浓度Hcl 浓度HCl

倒5

Claims

1、一种DNA序列，其中一个编码信号肽并具有下述结构：

M-R-S-F-L-L-L-A-L-C-F-L-P-L-A-A-L-G的DNA片段连接于编码人溶菌酶DNA段的5′。

2、根据权利要求1的DNA序列，其中编码信号肽的DNA段具有示于图3中的DNA序列。

3、根据权利要求1的DNA序列，此序列是pGFL735。

4、一种用权利要求1、2或3中的DNA片段转化的细胞。

5、根据权利要求4的细胞，此细胞是啤酒酵母AH22R^-/pGFL735（FERM BP-1346）。

6、一种生产人溶菌酶的方法，其特征在于该方法包括培养权利要求4的细胞，在培养物中积累人溶菌酶并对它进行回收。