CN87102246A - 体外生产传染性细菌的孢子和含孢子的杀虫组合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明介绍了一种用于田间、果园、牧场、草地、庭院控制蛴螬类的杀虫剂组合物，它含有作为活性成分的有效杀虫剂量的无孢子囊孢子，这些孢子是选自体外产生的乳白病病原体孢子及其混合物，该杀虫剂还含有一种载体或稀释剂。

Description

体外生产传染性细菌的孢子和含孢子的杀虫组合物的方法

本发明涉及新型杀虫组合物，它包括体外产生的引起金龟子幼虫乳白病的细菌孢子，还涉及制备该组合物方法的改进。

目前控制金龟子科昆虫如日本甲虫的最有效方法是用在这些昆虫的幼虫中引起乳白病的宿主特异性细菌感染这些幼虫。乳白病对于该幼虫是致死的，但对于其它种类的动物或植物则是无害的。已知乳白病细菌包括日本甲虫芽孢杆菌的各种变种（包括变种pocllial，lentimorbus，melolonthae，rhopaea，新西兰Ⅰ型，Ⅱ型等），但并不限于此。

当这些细菌处于营养期时（杆状），不宜用于制备杀虫剂。杆状营养期的细胞是敏感的，在有关杀虫剂运用法或在田间散布等条件下它们是不能残活的。相反，这些细菌的孢子对不良环境有抵抗力，而且在田间以液体、粉剂、颗粒或饵料等方式运用后保持着生活能力（和感染性）、而且其后能延长寿命。

由于乳白病的高致死率，乳白病病原体的宿主特异性以及不存在因施用化学杀虫剂而给环境带来不利影响的问题，所以乳白病孢子尤其适合用于杀伤组合物。然而，特别是大量而经济地获得有效的孢子存在各种困难，防碍了这种杀虫剂被广泛地采用。

许多研究者企图使日本甲虫芽孢杆菌和其它乳白病细菌在体外形成孢子的努力都已失败。Dutky首次提出了一种在体内产生日本甲虫芽孢杆菌孢子的方法。该方法例如美国专利号2，293，890中所描述的，包括：用活的日本甲虫芽孢杆菌孢子（得自患病的幼虫的血淋巴）注射进活的日本甲虫幼虫，让其病情发展，然后干燥患病的幼虫，制成粉末，将得到的物质施用于田间。

显然这种体内方法是一种极其费时、费钱且劳动强度大的事情。而且它只能生产有限量的日本甲虫芽孢杆菌产品，一方面是由于从幼虫部分所获的孢子的量很少，另一方面则是由于金龟子幼虫仅仅在某些月份（三月到五月以及八月到十月）才能得到或生长。

为了满足对于乳白病孢子的来源的迫切需要，研究人员已转向了体外方法。令人遗憾的是，仅有有限数量的乳白病细菌在体外形成孢子的报道。虽然在人工培养基（液体或固体）上能够产生大量的营养细胞，但是孢子形成的平均数一般不超过约10～30%，而且据报道孢子的感染性或实际上被削弱（如果这样的话就没有商业价值），或根本就没有。见M.G.Klein，“Advances    in    the    use    of    B.popilliae    for    Pest    Control”in    Micr.Contr.of    Pests    and    Plant    Diseases，Burgess，H.D.（Editos）1981    Academic    Press，pp.184-192。

St.Julien和L.A.Bulla在Current    Topics    in    Comparatiue    Pathobiology，T.C.Cheng（Editor）1973，G.，Vol2，Academil    Press，pp57-87上报道：在由酵为提取物、Mueller-Hinton培养基（1%）、海藻糖和磷酸组成的固体培养基上形成的NRRLB-2309    M菌落细胞中，其孢子形成高达20%。Mueller-Hinten培养基含有极少量的淀粉（0.15%），因此St.Julien和Bulla培养基仅含有约0.0015%的淀粉。

Rhodes等的美国专利号3，308，038是关于通过下列方法，诱导日本甲虫芽孢杆菌的NRRL-B-2309亚株在体外形成孢子仅3～5%的程度方法是：（a）将营养细胞在摇瓶中（或以0.15～0.5vvm通气）培养18～24小时，该摇瓶中盛有含0.2%（重量/体积）葡萄糖或果糖或海藻糖，1.5～2.0%酵母提取液，且用足量的K₂HPO₄将pH调至7.2～7.5（0.3%）;（b）将细胞转接至含有琼脂、酵母提取液、乙酸钠和K₂HPO₄的斜面或平面上，以形成非密集的菌落;（c）培养菌落42天，直至形成孢子。

Bonnefoi的美国专利号3，071，519是关于生产大量苏云金芽孢杆菌孢子的方法，它包括在一种pH为5.5至8.5之间的液体培养基中培养这种细菌的原种（该培养基含有氨化氮，多糖、麦芽糖、葡萄糖和糊精中的至少一种，以及作为微量元素的钙、锌、锰和镁中的一种或多种），直至形成孢子，然后收集孢子。但是，苏云金芽孢杆菌不是乳白病细菌。而且，苏云金芽孢杆菌已被证明比乳白病细菌更容易地在体外生长。

Srinivasan的美国专利号3，503，851是关于在体外产生日本甲虫芽孢杆菌的方法，它包括在一种液体培养基中培养日本甲虫芽孢杆菌，该培养基含有酵母提取液、葡萄糖、甘油、氯化钠、硫酸铵、K₂HPO₄、MnSO₄·H₂O、CaCl₂、ZnSO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、FeSO₄·7H₂O以及少量的含氯脂族化合物如氯乙酰胺、氯仿或三氯乙烷。据说这样孢子形成率达到大至80%。

首先，由于下面两个原因，使用含氯脂族化合物是不可取的：（a）这些化合物易挥发，因此需要不断地向通气培养基中补充，从而增加了产品的成本;（b）这些化合物是有毒的-它们的蒸气将给植物，人带来危害，而它们还会在产品中留有一定量，将被释放到环境中，从而危害农作物。由于这些原因，Srinivasan的方法既不可处理又非商业化生产所想要的。

其次，Srinivasan储存的菌株不是日本甲虫芽孢杆菌。据报道，这些菌株在Agricultural    Handbook，infra，Table    50，pp260-261（引自上面Sriniuasan的专利所讨论的）上鉴定有误，后来经鉴定，它们不是日本甲虫芽孢杆菌（巨大芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，多粘芽孢杆菌等）。其文章也含有将蜡状芽孢杆菌和多粘芽孢杆菌与日本甲虫芽孢杆菌相混淆的报道。

Skole的美国专利号3，950，225是关于一种日本甲虫芽孢杆菌和缓病芽孢杆菌的两步（发酵和形成孢子）方法的。营养细胞的生长是在一种含有酵母提取物、K₂HPO₄、葡萄糖和三糖的培养基中完成的。然后将所得到的细胞团转移进作为孢子形成培养基的甘蔗糖厂动物炭废水中培养。该专利坚决主张按照这个方法，得到了100%的孢子形成率，但是没有给出这个数据是根据什么计算的。该专利没有谈到以每单位体积（培养基）为基准的孢子数。而且，在仅有的一个实例中，该专利提出将从75毫升营养细胞生长培养基的6.5±0.5克细胞团转移到5升废炭水中。这意味着体积要增加66倍以上，这在商业化上是极不现实的。最后Skole的专利没有体外产生的孢子的感染性数据。

这样，许多研究者就体外诱导日本甲虫芽孢杆菌的孢子形成的详细草案进行了发表开或用请了专利。但是，所有这些方案中还没有发现一个能适合于大规模生产日本甲虫芽孢杆菌孢子的有效方法，满足基本的需要。

这些需要是：

＊每单位发酵体积中应该产生大的细胞群体;

＊高百分率的细胞形成孢子;

＊生长和孢子形成的发生应该顺从于大规模生产的条件;

＊产生的孢子应具有萌发和感染能力。

目前，日本甲虫芽孢杆菌变种（它可能含有少量的缓病芽孢杆菌变种）是唯一的商业生产的乳白病芽孢杆菌，且仅在体内产生。

以前的技术在提供一种有效的体外产生乳白病孢子的方法（尤其是适合于商业化的方法）上的失败与乳白病芽孢杆菌尤其是日本甲虫芽孢杆菌及其变种的形态学和性质上的某些观点有关（或可能起因于它）。这些观点被本技术领域的熟炼人员所普遍掌握。在该领域文献中许多参考资料已经证明并构成“认可的名言”。

日本甲虫芽孢杆菌在文献中通常被称为专性昆虫病原体，它是在一个膨大的孢子囊中形成的，不能自溶以释放游离孢子（见R.J.Milner，infra，P.46）。这一细菌是过氧化氢酶阴性的，且不能在营养肉汤上生长。它被认为是对生长有极其苛刻需要的细菌。

文献中关于日本甲虫芽孢杆菌的公认观点是：除了少数情况下该细菌于体外在固体培养基上生长和极少数于体内外，它们几乎总是停留在孢子囊中。这样，孢子囊的出现可以被看作是鉴定该种的重要标志。事实上，著名的研究人员已经指出，在液体培养基生长而没有孢子囊的孢子不是日本甲虫孢杆菌。见Agriculture    Handbook，No.427，R.E.Gordon等（Agriculture    Research    Seruice，U.S.D.A.，1973）和R.J.Milner，“lndentification    of    the    Brcillus    popilliae    Group    of    lnsect    Pathogens”in    Micr.Conlr.of    Pests    and    Plant    Diseases，Burges，H.D.（Editon）1981    Acadenui    Press，pp.45-59。因此，即使研究人员在含乙酸的培养基以外的其它培养基中观察到裸露的乳白病孢子（无孢子囊），他们也不能鉴定它。Sharpe，E.S.等在1984    Appl.Microbiol.19（4）：681-688中报道：在日本甲虫芽孢杆菌NRRL-B-2309M菌株的孢子形成菌落（即在固体培养基）中偶而观察到游离孢子。研究人员在体外孢子形成率上得到微少的结果且检测到极其微弱的感染性。它们的口服感染性试验结果（其中土壤是用每克30×10个孢子接种）为阴性。这些结果使研究人员得出结论：

显而易见，体外日本甲虫芽孢

杆菌B-2309M孢子不能够通过天然

途经即昆虫消化道感染日本甲

虫幼虫〔Sharpe等，supra，atp.6886〕

R.G.Milner在supra上报道，为了研究孢子表面的详细结构，可以利用超声波使孢子和类芽孢体从孢子囊中释放出来，但这并不包括从液体培养基中直接收集裸孢子。

本领域所公认的另一个问题是生物检定，其中日本甲虫芽孢杆菌（或任何乳白病孢子）是通过注射给金龟子幼虫，提供了一个孢子感染的可靠试验。已发现这种注射生物检测比口服生物检定（如土壤接种生物检定）需要的感染剂量水平低。口服生物检定实际上更困难，执行时更费时，注射测定适合感染性指示或选择。而且，常报道说通过注射发现有感染性的孢子当通过口服试验时不具有感染性。但相反的结果没有报道。

所有以上提到的观察结果使本技术领域的熟练技术人员无疑地确信：如果孢子在注射服用时无感染性，那么它们在口服试验时也不会有感染性。

总之，现有技术（至本发明完成之时）已承认上面所介绍的乳白病芽孢杆菌尤其是日本甲虫孢杆菌的形态学和性质以及不能够大规模在体外有效培养日本甲虫芽孢杆菌的陈述是正确的。

据此，本发明的目的之一就是提供一种促进乳白病芽孢杆菌体外孢子形成的方法，使其达到比现有技术显著大的程度，尤其是在产量方面。

本发明的目的之二是提供一种通过增加这些病原体外孢子形成有效性来获得大量乳白病芽孢杆菌的方法。

本发明的目的之三是要提供一种获得大量活的、可萌发的且具感染性的乳白病孢子的方法，尤其是当这些孢子是口服时。

本发明的目的之四是提供一种含有在体外产生的乳白病孢子的杀虫组合物，它用于对付在田间、果园、花园和试验田中的金龟子和其它易感害虫的侵袭。

本发明的这些以及其它的目的，对于本领域的那些熟炼技术人员来说，在下面的说明书、权利要求书及附图中是显而易见的。

图1是日本甲虫芽孢杆菌在体内及体外的液体和固体培养基中的生长和孢子形成方式的图解。

图2是日本甲虫芽孢杆菌感染百分数的平方根与在一次注射生物检定中每一注射所服用的孢子剂量的对数的函数关系图。

图3是从概率上讲的日本甲虫芽孢杆菌的感染百分数与一次土壤接种生物检定中的孢子浓度的对数的函数关系图。

本发明的一个方面就是关于促进乳白病芽孢杆菌在体外形成孢子的方法，它包括：在一个无菌、通气、控制了pH的培养基中培养所说的芽孢杆菌的营养细胞直至生长期结束，该培养基由酵母提取物、可溶性糖、连二磷酸钾和碳酸钙组成;将硫酸锰作为孢子形成佐剂加进所说的培养基中，然后将所说细胞培养足够长的一段时间，使得其孢子形成达80%以上。对于呈现健康的营养生长的菌株采用这一方法在一发酵罐中得到的产量至少在约10⁹个孢子/每毫升液体培养基的水平。

更好的是，生长培养基中也含有作为生长刺激因子的可溶性淀粉。最好还使用吸附剂树脂作为补充孢子形成佐剂。

另一方面，本发明是关于一种杀虫组合物，它含有作为活性组分的杀虫有效量的无孢子囊乳白病孢子，这种孢子是在体外培养物中产生的。

更好的是，该无孢子囊的孢子是一种至少来自两种不同菌株的孢子的混合物。

最好是，本发明的组合物包括无孢子囊和具孢子囊的乳白病菌孢子的混合物，所说的无孢子囊的孢子在这种组成中经口服试验感染性时至少具有参与的性质。但是，需要体内孢子的百分数不超过孢子总含量的0.01%，主张市场产品孢子含量不多于0.07%，是只含体内孢子。

本发明通过特别指出的实施方案进行详细的叙述。首先叙述了一种在体外生产裸乳白病孢子的较好方法，然后叙述了日本甲虫芽孢杆菌的生长和孢子形成方式以及它的感染性。

但是可以理解的是，本发明不仅仅限于日本甲虫芽孢杆菌，而能够应用于在金龟子科幼虫和其它昆虫上引起乳白病的所有生物（这些昆虫能够被这些生物感染）。本发明的组合物也不限于按下述方法产生的裸孢子。

为了避免染菌，观察乳白病细菌培养物的每一期的严格卫生水平是非常重要的。由于这个原因，经常转移营养细胞、经常进行显微镜和生物化学测定以及存活性和感染性试验是重要的。

菌株可以通过营养细胞的经常移植或无菌地保存存活的孢子来保藏。这样，为了保存菌株，生长和孢子形成的条件应是无菌的;为了生产，收集和破碎的条件如果不是无菌的话也应至少是卫生的。

按照本发明，首先要建立保藏好乳白病芽孢杆菌培养物的方法。尽管任何正常的形成孢子的乳白病芽孢杆菌的感染菌株都可以用于本发明，如NRRL菌株B-2309、B-2309-S、B-2309M和它们的感染衍生物，但来自NRRL菌株B-2309T、B-2524、B-3195，B-3391、B-4154和它们的感染衍生物的形成孢子的分离物是较好的。下列日本甲虫芽孢杆菌菌株是更可取的：ATCC-53256（RL    I-1182-W），ATCC-53257（RLI-8015-14G），ATCC-53258（RL    I-D-63）和ATCC-53259（NRRL-B-2309-Micro-1）。最好的是ATCC-53256（RL    I-D-1182-W）。

实际上用本发明的体外方法在孢子形成的结束收集的所有孢子都是无孢子囊的。孢子是在孢子囊中，但当孢子成熟时孢子囊就在培养物中自动裂开。

当按本发明的方法产生的孢子注射给金龟子幼虫时，其感染性实际上比可接受的水平低。另外，每次注射的孢子剂量越高并不导致感染性越高（见图2和表Ⅰ）。恰恰相反，剂量反应很快就达到最大值，然后就开始下降。与此相对照，当口服试验本发明的孢子时其感染极强，且剂量越高，其感染性越高（见图3和表Ⅱ）。

由于以前的技术倾向于认为无孢子囊的孢子不是乳白病孢子，且由于这些孢子不能够通过注射达到充分的感染，所以本领域的权威反对用这些孢子制作杀虫组合物，或用于抵抗田间、花园、果园、牧场、草地中的金龟子的侵袭。

保存菌种可采用熟知的固体培养基。无菌固体J培养基最好变动含量为（组分重量/培养基体积）：约1%胰酶解胨（可以从Difco、Detroit、Michigan得到）;约0.5%酵母提取液（Difco）;约0.3%K₂HPO₄;约0.2%葡萄糖和约1～2%琼脂（Difco），溶解于蒸馏水中。改良的液体J-培养基含1.5%酵母、0.2%海藻糖（或葡萄糖）、0.6%K₂HPO₄和1.5%琼脂则更合适。海藻糖或另一种可溶性糖可以代替葡萄糖，但海藻糖更合适。培养基成分应该灭菌处理，最好用高压灭菌锅灭菌;糖最好单独灭菌然后加进其它已灭过菌的培养基成分中。

营养细胞的保存应在25-30℃培养，最好28℃培养，为了保证菌株不变，最好经常将细胞转移到新鲜培养基上（每周一次或两周一次），这还有助于防止可能由细菌产生的有害物质和孢子形成抑制物质的积累。菌株的长期保存可用冷冻真空干燥营养细胞，或最好无菌地储存孢子。

在诱导孢子形成之前，最好使用液体（深层培养）培养来实现。较好的液体培养基含有约0.1～0.2%的营养可溶性糖（最好是0.1%的海藻糖，因为其它的糖尤其是葡萄糖具有显著的抑制孢子形成效应）;约0.5～1.5（最好1.0%）酵母提取物（酪蛋白水解物至少可以代替部分酵母提取物）;约0.1～0.6%K₂HPO₄（0.3%最好）;约0.0～0.3%CaCO₃（最好0.2%）和蒸馏水。最好是，该液体生长培养基也含有约0.1～2.0%（最好为1%）可溶性淀粉。这些成分最好无菌过滤，然后加到预先单独高压灭菌过的CaCO₃中。或者，都采用高压灭菌技术灭菌，但即使这样，可溶性糖也应该单独灭菌。

生长培养基的起始pH应调至6.8到8.1之间，最好是7.6±0.2。已知的辅助的基本无素和化合物的盐如锰、铜、铁和锌都可以加进去，但钠应该避免，因为已经知道它对某些菌株具有抑制营养生长的作用。但是，该培养基最好由先前已述的没有辅助物质的成分组成。使用这种培养基，不仅能促进营养生长，而且所得孢子的孢子形成值和感染性要比采用传统技术得到的大和强。可溶性淀粉据信主要是一种对孢子形成有害的物质的吸附剂或络合剂，即它是一种刺激剂而不是一种营养物。

细菌的接种物由保存的菌种制备。最好在无菌条件下使用深层培养基的培养物。当细胞密度为约1×10⁷至约1.5×10⁹（最好在杆菌处于对数生长期1×10杆菌/毫升）时，接种物已可使用，通常培养一夜的时间（10～24小时）。但不同的菌株其生长率是不同的。接种物最好在通气或机械搅拌的条件于32℃培养。

深层培养是在一发酵罐中开始的。将适量体积的种子（最好为发酵罐工作体积3～12%）加到培养基中。培养物培养约12～24小时，直至生长期完成（即对数生长期后期）。更好的培养条件是在32±1℃连续机械搅拌（200～250rpm），且在pH不低于约6.2（对于最适生长，最好为7.2±0.2）的条件下通气（0.2～0.5vvm的无菌空气）。pH的控制，它对于获得最大细胞产量是非常重要的，可以通过加入HCl或无钠碱来达到。最适pH值随菌株不同而变化，但是基本上都处于上面所限定的范围之内。

在高速搅拌和/或高通气速率的情况下常常会起泡沫，这是不希望的。如果必要的话，可以通过加进适当的消泡剂，如从Hodag    Chemical    Corporation，Skokie，Iliinois得到的HODAG    FD-62，它是一种以硅酮为基的抗起泡剂，来控制起泡，也可使用另一种人工合成的抗起泡剂或植物油，还可采用机械手段。如果使用消泡剂，它应是无菌乳浊液或溶液的形式。所加体积百分比为5%的HODAG    FD-62的乳浊液与培养基体积比为3ml/升;它最好在发酵已开始而还未起泡的时候加进去（通常是在发酵开始后的4～6小时之内）。

在生长期期间，培养时间的长短取决于营养细胞分裂的速率，但通常持续12～24小时。形成孢子的较好细胞密度是0.5～1.5×10⁹细胞/毫升。虽然实际上所得到的细胞密度（尤其是大规模的）稍低，但与蛴螬血淋巴中的细胞密度（通常为1-2×10¹⁰细胞/毫升）相比，它是有利的。

然后加入作为形成孢子佐剂的硫酸锰，以促进孢子形成。另外，当在生长期菌株没有很好地生长时，最好特别地加进一种吸附树脂。已发现这两种加入物能促进孢子形成，且产生能萌发的具有感染性的孢子。虽然MnSO₄更好，但可用其它微量无机物代替它，如常用的铁、锌、钴或镍的无机盐，也可用这些元素的有机盐如脂族羧酸盐（如乙酸或丙酸）。其它离子交换和/或吸附树脂可以单独或结合使用，如阳离子交换树脂Amberlite IR-120（Rohm & Haas）或Dowex 50 WX4（Dow Chemical CO.）;阴离子交换树脂Amberlite IRA-410或IR-45（都由Rohm & Haas生产）;或非离子交换树脂Diaion HP-10（Mitsubishi Chemical lndustries in Japan）。非离子交换树脂AmberliteXAD-7（Rohm & Haas）最好。

所加MnSO₄的量在有效发酵体积中约5.0毫克/升至约250毫克/升之间，最好在约50毫克/升。

所加树脂约为发酵体积的1～15克/升，最好为3克/升。浓度越高并不导致孢子形成越高，但对于某些菌株，浓度越低则导致实际上的孢子形成越少。最适树脂量随菌株而不同。其中，某些菌株在以上范围内浓度越大则孢子形成越多。生长旺盛的菌株不需要树脂。

形成孢子的更好条件通常与营养细胞的生长相同，但pH最好在约6.8±0.1（pH高达到8.1±0.1也可能忍受，但不是必需的）。控制pH是重要的，根据需要，可以通过加入HCl或无钠碱来实现。

根据本发明，孢子形成率达80%，甚至高达95%。所说的孢子形成率是以生长期末期的营养细胞的密度为基础的。

如果需要，树脂可以在收集孢子前通过过滤而除去。

孢子可以通过加进滑石（MgSiO₄）或水含硅酸铝和离心收集。滑石（为400筛目的颗粒，约0-10克/升;最好5克/升）是用于帮助孢子从培养基中分离。分离最好通过高速离心来实施，沉淀中的主要成分是滑石、树脂（如果使用且没有预先除去）、孢子和CaCO₃。最好将沉淀物重新悬浮于含0.1%海藻糖（10克/毫升）的蒸馏水中，然后冻干。这里和下面段落所给出的量适合于商业化生产。

该初级发酵产物的干重量为孢子形成培养的约7.7～12.5克/升。

初级发酵产物不应是吸湿的;通过离心除去无用的和废的培养基有助于实现。或者，可以采用过滤浓缩孢子而不加滑石、CaCO₃等，用水冲洗几次（以洗掉其中的废培养基），然后冻干或喷雾干燥。如果不用滑石和CaCO₃，每克初级发酵产物的孢子菌数应该更高。

按照本发明的商业化实施方案，滑石离心的冻干初级发酵产物的较好组成如下：

成熟孢子-约15～21%;

CaCO₃（400筛目）-约10～14%

树脂-约28～0%;

滑石-约47～65%;

海藻糖-约0.9～1.4%

较高的孢子密度是约0.9-1.5×10¹¹孢子/每克含滑石和树脂冻干产物。

如前所述，几乎所有上面讨论过的在液体培养基中体外产生的乳白病孢子在收集时没有孢子囊。由于这些孢子当口服试验时感染性特强，所以它们是乳白病孢子。因此，根据本发明，以日本甲虫芽孢杆菌为例，图1给出了乳白病芽孢杆菌的生长和孢子形成的方式。

图1描述了日本甲虫芽孢杆菌的不同生长和孢子形成方式取决于该生物生长的环境。体内方式ABCDA是通过叉线显示。固体培养基中的体外方式ABCDA和ABCEA是通过实线和虚线表示，以表示偶然的观察到（在固体培养基中孢子形成是难以完成的）。

最后，在液体培养基中的体外方式是以圆圈线表示。

杆状细菌是环中A点的孢子发芽，然后经过营养细胞生长循环而产生的。如果施加不利的环境条件，杆菌要么死亡，要么形成孢子。孢子形成的起始点B是标明在液体和固体培养基一孢子囊中孢子在体内和体外的发育。渐渐地，内孢子和副孢子的形成变得很明显，在体内和固体培养基中，孢子将在D成熟为含有副孢子体的日本甲虫芽孢杆菌型孢子或不含折射的副孢子体的缓病芽孢杆菌型孢子。在液体培养基中，孢子囊最终将在E（孢子成熟之时）裂解，且除极少数情况外，观察不到折射的副孢子体。在固体培养基中也偶而观察到这种类型的生长发育。

在本发明之前，孢子成熟途经C-E-A没有与日本甲虫芽孢杆菌联系起来，或即使联系起来了，它也没有与口服试验时具感染性的乳白病孢子联系起来。因此，在本发明之前，无孢子囊的孢子不应被（本领域技术人员）认为是能够形成一种杀虫组合物，而这种组合物是应用于田间、花园、果园、牧场、草地和试验田。

但是，本发明的裸孢子的感染性已被证实。实际上，已发现当口服试验而不是注射本发明的裸孢子时，其感染性最强（相对于体内产生的孢子囊所带的孢子）。

详查图2，它是在文献中报道的一些注射测定的结果、与用在体内产生（带孢子囊）的孢子、和在体外产生的孢子所得到那些结果的对比。以用作测定乳白病的日本甲虫蛴螬百分数平方根绘出对注射孢子剂量对数的曲线关系时，文献报道阈剂量为10孢子逐渐增加到100%乳白病时其剂量约为10⁵。

当剂高达约10⁵孢子/注射时，在这里所报道的实验中（用黑体线环标记）作为阳性对照实施的个别体内试验是在文献所报到的感染性的范围之内。但对于更高的剂量，随着补加孢子剂量的变化补加感染率降低，且实际上最终感染性减弱。这表明在注射感染性下降后有一最大极限剂量。

当测试本发明的体外产生的孢子通过注射的感染性时，发现其感染性总是比文献中报道的同样剂量的体内孢子的感染性要低，且实际上低于阳性对照试验的值。对于任何给定剂量，体内孢子感染性要高几倍以上，在更高剂量时，感染性的差异是增加多倍而不是降低。而且，在可比较的剂量下，从液体培养物来的孢子（对于NRRLB-4154变种用X标记，对于NRRL    B-3391变种用空正方块标记）通常比其它变种的冻干孢子更具感染性。

从以上结果可以明显看出：如果注射检定是进行的独一感染性试验，则其结果是令人泄气的。该结果表明在大多数情况下，为了提高任何疾病注射的实际百分率，每一蛴螬将被成千上万的孢子感染。这种低感染性可能很容易被背景水平所蔽。从这些结果，本领域普通技术人员会得出结论：按照本发明体外产生的孢子在用于田间的杀虫组合物中实际上不具有适用性。因此，如果本发明人继续接受普遍特有的观点，即对于给定剂量注射生物检定具有比口服试验生物检定更高的感染性，那么他们就会放弃将体外产生的孢子用于杀虫组合物的进一步努力。

详细参照图3和表Ⅱ，下面叙述了土壤接种生物检定的结果。

这些结果表明在土壤接种生物检定中（其中体外孢子加到了带有日本甲虫三龄幼虫的土壤中），体外产生的孢子的感染性比相同浓度下的体内孢子的感染性要低。但不象注射检定，浓度越高，感染性继续增强，且在体内孢子浓度的6至约18倍的任何浓度下达到体内孢子的感染性。

而且，已证明在体内USDA标准材料ATCC-53256菌株与ATCC-53259（配方Z）的混合物比在体内USDA标准的ATCC-53256或ATCC 53259与参照配合的体内物质的混合物的感染性更强。配方Z具有可与6.4倍于图3所示的体内物质（USDA标准）的浓度的体内产物相比的感染性。一个含有0.006%USDA标准（体内孢子）、3.906%的ATCC-53258、48.044%的ATCC-53256和48.044%的ATCC-53259的配方是与这一浓度相符合的，且特别合适。这一配方其孢子含量的换算大约为3×10¹¹孢子/1磅。

图3中的曲线与全部数据点相符，近似表示整个数据的最适点（除了在4×10⁹孢子/克处含有ATCC-53256的物质以外）。

本配方的一个重要特征在于：它们含有非常少量的体内产生的孢子。虽然较高比率的体内孢子的产生是可能的，但它们不是必需的且不经济。因此虽然原则上对于本发明的配方唯一需要的是它们含有大量体外产生的孢子真实的提供感染性的配方，但实际上最好使用含有小量体内产生的孢子的配方，（与体外产生的孢子相结合）其结果将在经济上产生具有合格感染性的配方。

当然，由于孢子的感染性是依赖于菌株的，所以上述的范围仅作为标线使用，而不能笼统地用于体内和体外产生孢子的每一菌株。在每一种情况下结合使用体外和体内产生的孢子。作为一整体的组合物含有足够的有实际上增加组合物感染性作用的体外产生的孢子。

按照本发明的最终杀虫组合物，最好也包括一种载体或稀释剂。固体组合物最好是粉末状、颗粒状、丸状或饵料形。固体载体包括滑石、碳酸钙、水合硅酸铝、高岭土、玉米棒、蛭石和其混合物，但并不限这些。水合硅酸铝（对于粉末配方）和玉米棒（对于颗粒配方）尤其合适。当活性成分是以初级发酵产物（如下面实例1中的产物）的形式出现时，载体或搀入含量最好达组合物体积的98.5%至99.9%。

液体组合物一般含有相同数量的悬浮于液体稀释剂（如矿物水和水）中的活性成分（其比率最好为1∶9）。

液体可喷洒组合物也含有润湿剂（如0.5～1.0%    Wetanol，Glycol    Chanicals    lnc.，New    York，N.Y）、乳化剂（如0.1～0.5%吐温多乙氧基醚（Tween    80    polysorbate），ICI    Ameriocas，Wilmington，DE）和分散剂（如2～4%来自GAF，Chattanuga，Tenn.的Blancol或3%的来自Hopco    Chemical    Co.，Newark，N，J的Lomar）。活性组分将以一种可湿润粉末形式使用，其含量相当于每磅干重含7～12克初级发酵产物，它也含有与基础剂同样多的补充搀入物（如滑石或水含硅酸铅等）以改善固体的可悬浮性。

下面通过特别的实施例来进一步描述本发明，但它们并不限定本发明的范围。

实例1：体外产生乳白病孢子的方法

将活的日本甲虫芽孢杆菌NRRL-B2309菌株的种子培养物接种于琼脂平皿上。该细胞系保存在含有溶于蒸馏水的1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取液（Difco）、0.3%KHPO、0.2%海藻糖和1.5%琼脂（Difco）的J培养基中。该培养基在加入海藻糖之前于120℃/15磅高压灭菌15～20分钟。糖单独进行高压灭菌后再加进其它经高压灭菌过的组分中。倾倒平皿或斜面用B2309培养物接种，于25℃培养。细胞至少每周转移到新鲜培养基中一次。

从保存的培养物制备出深层培养物。首先，制备含有1.0%可溶性淀粉、0.1%海藻糖（Kodak）、0.5%酵母提取液（Difco）、0.3%K₂HPO₄、0.1%CaCO₃（400目）和蒸馏水的液体培养基（起始pH7.6）。培养基于120℃/15磅下高压灭菌15～20分钟。海藻糖与其它成分单独灭菌。无需加入HCl来调整pH。

用从保存培养物得来的种子培养物无菌接种于一种含有300毫升上述液体培养基的摇瓶中，然后在摇台上于32±1℃以约250rpm的转速培养14小时。

当显微镜计数达到1×10⁹杆菌/毫升时，将3.3%接种物加到10升上述培养基中。培养温度为32℃、250rpm的机械搅拌和通气量为0.2空气体积/培养基体积/分（vvm）的条件下进行。培养4小时之后，无菌加进30毫升5%HODAG HD-62抗起泡剂（于120℃/15磅高压灭菌15～20分钟）。pH不加KOH或HCl进行调节，它从培养开始时的7.6下降至对数生长期结束时的6.25。

生长曲线是用显微镜检测的。当细胞数达到1.2×10⁹个杆菌/毫升（大约在接种后18小时）时，通过无菌加入KOH将pH升至6.8，然后加入孢子形成佐剂。

孢子形成佐剂于121℃（15磅）单独高压灭菌15～20分钟，然后按下列比率无菌地加到发酵罐中：

1.溶解于蒸馏水中的50毫克/毫升的MnSO₄溶液以每升发酵有效体积1毫升的比率加入。

2.用甲醇和蒸馏水彻底冲洗过的吸附树脂（Amberlite    XAD-7）在高压灭菌前以每升3克（干树脂重）的比率按发酵罐使用体积加入，使其最终量达到在300毫升水中有30克树脂。

孢子形成期的条件是：温度-32±1℃;机械搅拌-250rpm;用无菌空气为0.5vvm、压力为0.5磅的条件下搅拌。加入佐剂后pH没有进行调节，它在整个孢子形成期慢慢上升直至最终值8.0。pH高达8.2是允许的，但不是必需的，因为它并不伴随着孢子形成的极限化。孢子形成期在从孢子形成佐剂加入后的约20小时内完成。孢子形成期的完成（95%）是用显微镜学方法测定的。

过滤除去树脂以后，通过连续经过高速离心除去废培养基中的可溶性成分和不吸湿的初级发酵产物而收集孢子。离心之前以5克/升的量将水合硅酸铝（400目）加入培养物。该物质有助于B2309孢子与不溶性的碳酸钠和树脂一起从悬浮液中分离。离心是在Model    NoT1-P    Sharples台式离心机（由Penwalt公司制造）上进行的。

将沉淀物（即孢子-滑石-固体成分混合物）重新悬浮于含0.1%海藻糖的蒸馏水中（每克沉淀物10毫升），然后将悬浮液冻干。膏状物重81.4克，混合物中的孢子干重量为48.8克。10.6升培养物/孢子形成培养基中的实际孢子产量是1.21×10¹³个孢子。这与占生长期结束时的细胞数的95%的孢子含量相一致。这样制得的初级发酵产物是老化的，因为新鲜制备孢子的发芽性比老化孢子的要低。将它结合进适用于田间应用的组合物中。

实例2：体外产生乳白病孢子的方法

采用与实例1同样的步骤，但不将树脂作为孢子形成剂加入。已发现使用树脂可以改善某些菌株如ATCC-53258和ATCC-53259的孢子形成率，但对于ATCC-53256的孢子形成率没有发现显著的效果。

实例3：注射生物检定

注射生物检定是按照Dutky等在美国专利号2，293，890中叙述的方法进行的，它在这作为本文的参考资料。

下面的表Ⅰ除了特别说明外，每次试验的40个蛴螬或用从冷冻液体培养物中沉淀的孢子样品或用从体内物质的血淋巴载玻片得到的样品或用在蒸馏水中恢复冻干孢子制品进行注射。注射体积为每次0.003毫升，且对每个蛴螬仅施使一次注射。每次注射的孢子剂量和所用甲虫芽孢杆菌见下面的表Ⅰ。

注射之后，每星期检测两次蛴螬病状。显示乳白病症状的蛴螬和死蛴螬都是通过显微镜观察进行检测的。

结果如下表Ⅰ所示。

表Ⅰ

孢子    剂量    结果

来源    （孢子/蛴螬）    （乳病数/测定总数）    感染百分数

体内

（血淋巴载玻片） 6.62×10⁶22/39^a56.41

孢子 6.62×10⁵32/40 80.00

6.62×10⁴26/40 65.00

6.62×10³13/14 32.50

体外 1.02×10⁶6/39^b15.30

1.02×10⁵5/40 12.50

ATCC-53256 1.02×10⁴4/40 10.00

1.02×10³1/40 2.50

体外 1.36×10⁶1/40 2.50

1.36×10⁵4/40 10.00

ATCC-53259 1.36×10⁴3/39^b7.50

1.36×10³0/30 0.00

体外 9.10×10⁶0/40 0.00

9.10×10⁵1/40 2.50

ATCC-53258 9.10×10⁴0/39 0.00

9.10×10³2/40 5.00

9.10×10²3/40 7.50

体外 1.91×10⁶0/40 0.00

NRRL.B-2519 1.91×10⁵0/40 0.00

1.91×10⁴0/40 0.00

体外

NRRL.B-3391 2.51×10⁶13/40 32.50

2.51×10⁵5/40 12.50

2.5×10⁴1/39^b2.56

体外 6.29×10⁵5/18^a27.78

NRRL.B-4154 6.29×10⁴1/18^a5.56

6.29×10³2/29^a7.00

H₂O-注射 0 0/20 0.00

0    0/20    0.00

不注射    0    0/40    0.00

0    1/20    5.00

a    1    未成

b    成熟的

c    蛹

实例4：土壤接种生物检定

土壤接种生物检定是按Dutky所发展的且由Schwartz，P.H.等1970在J.Inbert.Pathol.15：，126-128上叙述的方法完成，其方法如下：首先通过将孢子与碳酸钙和含有已发芽的红尖的根的土壤混合而制备孢子浓缩物。土壤样品是放在塑料盘中，每一盘中含有两大汤匙量的土壤。该土壤用甲醛湿润（40%USP溶液）且用水以1∶1000稀释。每一盘中加进一个幼虫。

作为整个试验过程中的必要，土壤是湿的且已发芽的红尖被代换。其结果见下面的表Ⅱ。

表Ⅱ

每千克土壤    结果    感染性

孢子来源    的接种量    乳病数/测定总数    （%）

USDA标准 2.0×10⁹18/28^a64.29

0.5×10⁹21/34^a61.76

（体内） 2.0×10⁹12/26^a46.15

2.0×10⁹21/26^a00.77

1×10⁸孢子/克 0.5×10⁹19/31^a61.29

0.1×10⁹10/28^a，b35.71

2.0×10⁹17/31^a54.84

体内刺突 2.0×10⁹23/25^a92.00

ATCC-53258 2.0×10¹²19/40 47.50

2.0×10¹⁰8/27^a29.63

粗浓缩物 2.0×10⁹2/10^a20.00

ATCC-53258 2.0×10¹²25/32^a81.25

2.0×10¹⁰15/30^a50.00

浓缩物 2.0×10⁹2/35^a5.71

配方A 2.0×10¹⁰10/26^a38.46

2.0×10⁹5/23^a21.74

2.0×10¹⁰12/29^a41.38

2.0×10⁹6/32^a18.75

配方B 2.0×10¹⁰27/34^a79.40

2.0×10⁹13/31^a41.90

配方C 2.0×10¹⁰20/27^a74.07

2.0×10⁹12/25^a48.00

配方D 2.0×10¹⁰19/28^a67.86

2.0×10⁹9/23^a39.13

ATCC-53256 2.0×10¹²10/36^a27.78

2.0×10¹⁰20/37^a54.05

2.0×10⁹4/35^a11.43

ATCC-53259 2.0×10¹⁰14/31^a45.16

2.0×10⁹7/35^a20.00

2.0×10⁸2/39^a5.26

对照 0.0 0/25^a00.00

0.0 0/19^c00.00

0.0    0/20    00.00

0.0 0/31^a00.00

配方 X₁2.0×10⁹4/30^a13.33

″ X₂4.0×10⁹7/36^a19.44

″ X₃8.0×10⁹13/34^a38.24

配方 Y₁2.0×10⁹3/29^a10.34

″ Y₂4.0×10⁹5/29^a17.24

″ Y₃8.0×10⁹14/35^a40.00

配方 Z₁2.0×10⁹5/28^a17.86

″ Z₂4.0×10⁹5/39^a12.82

″ Z₃8.0×10⁹15/34^a44.12

″ Z₄16.0×10⁹24/39^a61.54

a    40分解的剩余物

b    1成熟的

c    20分解的剩余物

USDA标准是用浓度为1×10⁸个孢子/克接种。

“体内刺突”是从被感染蛴螬和碳酸钙的冻干混合物（含有2.4×10⁴个孢子/克）得到的体内物质。

ATCC-53258粗浓缩物是按本发明的方法制备的含有0.825×10¹¹个孢子/克的冻干初级发酵产物。

ATCC-53258浓缩物是ATCC粗浓缩物（重量百分含量为99.96%）和体内刺突（0.04%）的混合物。

配方A由用水合硅酸铝稀释到1×10⁸个孢子/克的ATCC-53258浓缩物组成。

配方B除了含有99.2%（重量）的ATCC-53258粗浓缩物和0.8%（重量）的体内刺突外，与配方A相同。这一配方依次用水含硅酸铝稀释至1×10⁸个孢子/克。

配方C除了含有99.6%的ATCC-53258粗浓缩物和0.4%的体内刺突外，与配方B相同。用水含硅酸铝将其稀释至1×10⁸个孢子/克。

配方D除了含有99.8%的ATCC-53258粗浓缩物和0.2%体内刺突外，与配方C相同，它用水合硅酸铝稀释到1×10⁸个孢子/克。

ATCC-53256是按本发明的方法产生的冻干初级发酵产物，每克含有1.34×10¹¹个孢子。

ATCC-53259是按本发明的方法产生的冻干初级发酵产物，每克含有1.53×10¹¹个孢子。

配方X、Y、Z含有各种数量的USDA标准、ATCC-53258粗浓缩物，以及下列数量的ATCC-53256或ATCC-53259。

孢子百分产物（重量）

USDA    ATCC-53258

配方X    标准    粗浓缩物    ATCC-53258    ATCC-53259

X₁0.032 19.944 79.974 -

X₂0.018 11.109 88.873 -

X₃0.009 5.882 94.109 -

配方

Y₁0.032 19.994 - 79.974

Y₂0.018 11.109 - 88.873

Y₃0.009 5.882 - 94.109

配方

Z₁0.032 19.994 39.987 39.987

Z₂0.018 11.108 44.437 44.437

Z₃0.008 5.882 47.055 47.055

Z₄0.005 3.030 48.482 48.482

虽然本发明已如上描述的很具体，但本领域普通技术人员仍容易地认识到，许多补充、删减或修改都可能在本发明和下列的权利要求书的范围之内。

Claims (18)

1、一种应用田间、果园、牧场、草地、花园或试验田中的控制蛴螬类的杀虫剂组合物，它包括作为活性成分的有效杀虫剂量的无孢子囊孢子和一种载体或稀释剂，而这些孢子是选自一组乳白病病原体孢子和其混合物且于体外产生。

2、如权利要求1所述的组合物，其中所说的孢子是日本甲虫芽孢杆菌孢子。

3、如权利要求1所述的组合物，其中所说的载体是选自滑石、碳酸钙、含水硅酸铝、高岭土、玉米棒、蛭石以及其混合物。

4、如权利要求1所述的组合物，其中所说的孢子是至少两株同种所说病原体的孢子的混合物。

5、如权利要求1所述的组合物，它也包括有孢子囊的体内产生的孢子，该无孢子囊的孢子至少对所述组合物的口服感染性有实际效果。

6、如权利要求1所述的组合物，其孢子数是那些仅此以体内产生的带有孢子囊的孢子作为活性成分的杀虫组合物中所含的孢子数的6到18倍。

7、如权利要求5所述的组合物，在该组合物中的孢子总数中，无孢子囊孢子占约100%至99.9%，有孢子囊孢子占0.0%至0.01%。

8、如权利要求1所述的组合物，其中所说的量为足够使该组合物的感染性在通过土壤接种生物检定测定时至少达到50%。

9、如权利要求5所述的组合物，其中所说的组合物中的体内产生的孢子的量在通过土壤接种生物检定时至多为仅含有孢子囊的体内产生的孢子的相似杀虫组合物中的孢子数的0.007%。

10、如权利要求4所述的组合物，其中所说的病原体是日本甲虫芽孢杆菌;所说的孢子是ATCC-53259和ATCC-53256菌株的孢子的混合物。

11、如权利要求10所述的组合物，它还包括占该组合物中孢子总含量的0.006%的有孢子囊孢子和约3.9%的ATCC-53258菌株，其余为50/50的ATCC-23259与ATCC-53256的孢子的混合物。

12、一种体外生产乳白病芽孢杆菌孢子的方法，它包括：

在通气和控制pH的条件下，在具有下列组成的液体培养基中培养所说芽孢杆菌的营养细胞：

约0.1～2.0%的可溶性淀粉;

约0.1～0.2%的海藻糖;

约0.5～1.5%的酵母提取液;

约0.0～0.3%的CaCO₃;

在营养生长期结束时将作为孢子形成佐剂的硫酸锰以约5～250毫克/磅的量加入且培养该培养物直至孢子开始形成。

13、如权利要求12所述的方法，它包括加入也作为孢子形成佐剂的吸附树脂，其中所说的树脂是选自Amberlite  IR-120，Dowex50  WX4，Amberlite  IRA-410，Amberlite  IR-45和Diaion  HP-10，其数量范围在约1至15毫克/毫升之间。

14、如权利要求12所述的方法，其中所述的芽孢杆菌是日本甲虫芽孢杆菌，且所述的液体培养基包括：1.0%的可溶性淀粉;0.1%的海藻糖;0.5%的酵母浸出液;0.3%的K₂HPO₄和0.2%的CaCO₃（重量百分比）;且所说的孢子形成佐剂包括50毫克/升MnSO₄。

15、如权利要求14所述的方法，其中所说的孢子形成佐剂进一步包括3克/升的Amberlite  XAD-7吸附树脂。

16、一种体外生产日本甲虫孢子的方法，使其在培养物中的量至少达到80%，该方法包括：

提供该芽孢杆菌的种子培养物;

通过将该芽孢杆菌的营养细胞无菌地转移至一种液体培养物培养基中而形成一种接种物;

将该接种物无菌地接种到一预先灭菌过的培养基中。该培养基包括约0.1～2.0%的可溶性淀粉;约0.1～2.0%的营养可溶性糖;约0.5～1.5%的酵母提取液;约0.1～0.6%的K₂HPO₄;约0.0～0.3%的CaCO₃以及蒸馏水，且其pH在约6.8至8.1之间;

在32±1℃、0.5磅且pH为约7.2至7.4的条件下，通过机械搅拌和以约0.2～0.5vvm的速度通无菌空气在一发酵罐中发酵所说的已接种培养物，直至所说营养细胞的细胞密度达到约1×10⁹杆菌/毫升;

无菌地将已灭过菌的孢子形成佐剂加到所说的营养细胞发酵培养物中，所说的佐剂包括至少一种：用蒸馏水配成的最终浓度为约0.5～250毫克/升的MnSO₄溶液和1～15克/升的干重量的离子交换树脂;

在约32±1℃、0.5磅、机械搅拌、0.5vvm的无菌空气及pH约等于或高于6.8的条件下将所说的培养物培养一段时间，使得孢子形成能够完成。

17、如权利要求16所述的方法，其中所说的树脂是选自Amberlite  IR-120，Douex  50  WX4，Amberlite  IRA-410，Amberlite  IR-45和Diaion  HP-10。

18、如权利要求16所述的方法，其中所说的培养基包括：1.0%可溶性淀粉;0.1%海藻糖;0.5%酵母提取液;0.3%K₂HPO₄和0.2%CaCO₃（重量百分比）;所说的孢子形成佐剂至少包括50毫克/升的MnSO₄和3克/升的Amberlite XAD-7吸附树脂中的一种。

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