CN215678048U - 一种基于多重调制技术的超分辨荧光显微成像测量系统 - Google Patents

Abstract

一种基于多重调制技术的超分辨荧光显微成像测量系统属荧光显微成像技术领域，本实用新型将多重调制技术引入到超分辨荧光显微成像系统中，打破了原有的光学远场衍射极限对光学系统极限分辨率的限制，在荧光分子帮助下很容易超过光学分辨率的极限，达到纳米级分辨率。并能降低系统中连续耗散光与样品的作用时间，且不改变耗散光的强度，可在保证和提高系统空间分辨率的同时，降低耗散光所引起的光毒性，实现超分辨荧光显微成像并拓宽其应用领域。

Description

一种基于多重调制技术的超分辨荧光显微成像测量系统

技术领域

本实用新型属荧光显微成像技术领域，具体涉及一种基于多重调制技术的超分辨荧光显微成像测量系统。

背景技术

在生命科学、物理和材料科学的研究当中，光学显微镜作为一种直观的探测手段，一直受到人们的重视，并成为研究活细胞和生物体不可或缺的一部分。当前生命科学领域中的动物细胞线粒体中的蛋白结构已经解析，但是蛋白质定位、蛋白质动态行为和电子传递过程还没有技术手段进行研究。传统的显微成像技术显然已经不能满足该问题的研究，因此需要提升显微成像的空间分辨率获取更加清晰的图像，以便对蛋白质进行精确定位。

1994年，Hell和Wichmann提出了受激发射损耗显微术，并首次“突破”衍射极限的远场光学显微镜技术。这项技术需要两束光源，激发光和损耗光。前者照射荧光标记的样品，令其发光；后者形成中空型的面包光圈，用于淬灭激发光形成光斑周围的激发态荧光分子，进而减小有效荧光发光面积，获得小于衍射极限的发光点。故受激发射损耗显微术成像系统的分辨率直接由聚焦在所激发的荧光光斑尺寸决定。当前该技术主要依托的激光光源类型为脉冲光作为激发光；连续光作为耗散光。然而连续光作为耗散光，长时间作用研究样品上容易损伤样品，诱发光毒性。而降低连续光的强度虽然可以降低光毒性，但同时也会减弱对激发光周围激发态荧光粉子的淬灭程度，影响系统的空间分辨率。

发明内容

本实用新型的目的在于提供一种降低连续光光毒性的超分辨荧光显微成像测量系统。利用声光调制器和斩波器同时调制超分辨荧光显微镜中的连续光，保证连续光可以更好的淬灭激发光周围激发态荧光分子的同时，降低连续光与研究对象的作用时间。利用该方法，甚至可以进一步提高连续光的强度，进一步淬灭荧光分子而不损伤研究对象。在本系统当中将用声光调制器和斩波器一起调制系统中的连续激光，缩短连续激光作用到样品的时间，从而降低连续激光作用到样品上的光毒性。其中声光调制器和斩波器一起通过同步调制系统与飞秒激光器输出的飞秒脉冲同步。该系统应用到超分辨荧光系统中的耗散光光路上时，可以缩短耗散光作用到样品上的时间，降低耗散光的光毒性。这样被调制后的耗散光的总光强只有原有的25％。而淬灭荧光的时间尺度内，耗散光的强度并没有发生变化。

本实用新型由激光产生及调节部分Ⅰ、探测部分Ⅱ、接收部分Ⅲ组成，其中激光产生及调节部分Ⅰ、探测部分Ⅱ、接收部分Ⅲ位于同一高度的光学平台上；激光产生及调节部分Ⅰ、探测部分Ⅱ和接收部分Ⅲ自右至左顺序排列。

所述的激光产生及调节部分Ⅰ由飞秒激光器1、全反镜Ⅰ2、固体激光器组3、λ/4波片4、λ/2波片5、涡旋相位板6、声光调制器7、倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器8、全反镜Ⅱ9和二向色镜Ⅰ10组成，飞秒激光器1设有端口a，声光调制器7设有端口b；固体激光器组3由532nm固体激光器、561nm固体激光器和647nm固体激光器组成；飞秒激光器1、固体激光器组3、倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器8自左至右排列；固体激光器组3、λ/4波片4、λ/2波片5、涡旋相位板6、声光调制器7、二向色镜Ⅰ10自前至后顺序排列，且位于同一水平线上；全反镜Ⅰ2、倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器8、全反镜Ⅱ9自前至后顺序排列，且位于同一水平线上；飞秒激光器1的端口a与声光调制器7的端口b连接。

飞秒激光器1产生的激光经全反镜Ⅰ2反射的光依次经倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器8、全反镜Ⅱ9投射穿过二向色镜Ⅰ10；固体激光器组3产生的激光经λ/4波片4、λ/2波片5、涡旋相位板6、声光调制器7、二向色镜Ⅰ10折射。

所述的探测部分Ⅱ由振镜11、二向色镜Ⅱ12、反射式物镜13和样品台14组成，振镜11、二向色镜Ⅱ12、反射式物镜13和样品台14自后至前顺序排列，且位于同一水平线上。

所述的接收部分Ⅲ由计算机15、信号积分器16、光电倍增管17、光谱仪18和全反镜Ⅲ19组成，其中计算机15上设有端口c和端口d；信号积分器16上设有端口e和端口f；光电倍增管17上设有端口g；光谱仪18上设有端口h；信号积分器16和光谱仪18左右排列，且均位于计算机15的前方；光电倍增管17固接于光谱仪18的前面；全反镜Ⅲ19置于计算机15和光谱仪18之间，接收的入射光经全反镜Ⅲ19反射到光谱仪18；光谱仪18的端口h与计算机15的端口c连接；信号积分器16的端口e与计算机15的端口d连接；光电倍增管17的端口g与信号积分器16的端口f连接。

激光产生及调节部分Ⅰ中飞秒激光器1产生的飞秒激光，经全反镜Ⅰ2、倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器8和全反镜Ⅱ9，并穿过二向色镜Ⅰ10进入到探测部分Ⅱ；激光产生及调节部分Ⅰ中固体激光器组3产生的激光经λ/4波片4、λ/2波片5、涡旋相位板6和声光调制器7后，经二向色镜Ⅰ10反射进入到探测部分Ⅱ；进入探测部分Ⅱ中的激光经振镜11反射、二向色镜Ⅱ12透射，再由反射式物镜13会聚至样品台14上，同时由反射式物镜13和二向色镜Ⅱ12反射将样品台14上的成像接入接收部分Ⅲ，再由接收部分Ⅲ中的反射镜19将激光引入光谱仪18，通过光电倍增管17将其转换为电信号，并通过信号积分器16和计算机15接收信号。

本实用新型将多重调制技术引入到超分辨荧光显微成像系统当中，能降低系统中连续耗散光与样品的作用时间，且不改变耗散光的强度，可在保证和提高系统空间分辨率的同时，降低耗散光所引起的光毒性，实现超分辨荧光显微成像并拓宽其应用领域。

附图说明

图1为一种基于多重调制技术的超分辨荧光显微成像测量系统的结构示意图；

图2为激光产生及调节部分Ⅰ的结构示意图；

图3为探测部分Ⅱ的结构示意图；

图4为接收部分Ⅲ的结构示意图；

图5为系统同步时序图；

其中：Ⅰ.激光产生及调节部分 Ⅱ.探测部分 Ⅲ.接收部分 1.飞秒激光器 2.全反镜Ⅰ 3.固体激光器组 4.λ/4波片 5.λ/2波片 6.涡旋相位板 7.声光调制器 8.倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器 9.全反镜Ⅱ 10.二向色镜Ⅰ 11.振镜 12.二向色镜Ⅱ 13.反射式物镜 14.样品台 15.计算机 16.信号积分器 17.光电倍增管 18.光谱仪 19.全反镜Ⅲ。

具体实施方式

下面结合附图描述本实用新型。

如图1所示，本实用新型由激光产生及调节部分Ⅰ、探测部分Ⅱ、接收部分Ⅲ组成，其中激光产生及调节部分Ⅰ、探测部分Ⅱ、接收部分Ⅲ位于同一高度的光学平台上；激光产生及调节部分Ⅰ、探测部分Ⅱ和接收部分Ⅲ自右至左顺序排列；激光产生及调节部分Ⅰ中飞秒激光器1产生的飞秒激光，经全反镜Ⅰ2、倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器8和全反镜Ⅱ9，并穿过二向色镜Ⅰ10进入到探测部分Ⅱ；激光产生及调节部分Ⅰ中固体激光器组3产生的激光经λ/4波片4、λ/2波片5、涡旋相位板6和声光调制器7后，经二向色镜Ⅰ10反射进入到探测部分Ⅱ；进入探测部分Ⅱ中的激光经振镜11反射、二向色镜Ⅱ12透射，再由反射式物镜13会聚至样品台14上，同时由反射式物镜13和二向色镜Ⅱ12反射将样品台14上的成像接入接收部分Ⅲ，再由接收部分Ⅲ中的反射镜19将激光引入光谱仪18，通过光电倍增管17将其转换为电信号，并通过信号积分器16和计算机15接收信号。

如图2所示，所述的激光产生及调节部分Ⅰ由飞秒激光器1、全反镜Ⅰ2、固体激光器组3、λ/4波片4、λ/2波片5、涡旋相位板6、声光调制器7、倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器8、全反镜Ⅱ9和二向色镜Ⅰ10组成，飞秒激光器1设有端口a，声光调制器7设有端口b；固体激光器组3由532nm固体激光器、561nm固体激光器和647nm固体激光器组成；飞秒激光器1、固体激光器组3、倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器8自左至右排列；固体激光器组3、λ/4波片4、λ/2波片5、涡旋相位板6、声光调制器7、二向色镜Ⅰ10自前至后顺序排列，且位于同一水平线上；全反镜Ⅰ2、倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器8、全反镜Ⅱ9自前至后顺序排列，且位于同一水平线上；飞秒激光器1的端口a与声光调制器7的端口b连接；飞秒激光器1产生的激光经全反镜Ⅰ2反射的光依次经倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器8、全反镜Ⅱ9投射穿过二向色镜Ⅰ10；固体激光器组3产生的激光经λ/4波片4、λ/2波片5、涡旋相位板6、声光调制器7、二向色镜Ⅰ10折射。

如图3所示，所述的探测部分Ⅱ由振镜11、二向色镜Ⅱ12、反射式物镜13和样品台14组成，振镜11、二向色镜Ⅱ12、反射式物镜13和样品台14自后至前顺序排列，且位于同一水平线上。

如图4所示，所述的接收部分Ⅲ由计算机15、信号积分器16、光电倍增管17、光谱仪18和全反镜Ⅲ19组成，其中计算机15上设有端口c和端口d；信号积分器16上设有端口e和端口f；光电倍增管17上设有端口g；光谱仪18上设有端口h；信号积分器16和光谱仪18左右排列，且均位于计算机15的前方；光电倍增管17固接于光谱仪18的前面；全反镜Ⅲ19置于计算机15和光谱仪18之间，接收的入射光经全反镜Ⅲ19反射到光谱仪18；光谱仪18的端口h与计算机15的端口c连接；信号积分器16的端口e与计算机15的端口d连接；光电倍增管17的端口g与信号积分器16的端口f连接。

激光产生及调节部分Ⅰ与探测部分Ⅱ通过二向色镜10相连；探测部分Ⅱ与接收部分Ⅲ通过二向色镜12相连。探测部分Ⅱ中的振镜11、二向色镜12、反射式物镜13和样品台14位于激光的产生与调节部分Ⅰ正左方；接收部分Ⅲ的反射镜19、光谱仪18、光电倍增管17、信号积分器16和计算机15位于探测部分Ⅱ正左方。

用专用电缆分别连接：飞秒激光器1的端口a与声光调制器7的端口相连；光谱仪18的端口h与计算机15的端口c相连；信号积分器16的端口e与计算机15的端口d相连；光电倍增管17的端口g与信号积分器的端口f相连。

初步调整各光学器件中心高度：飞秒激光器1、全反镜Ⅰ2、固体激光器组532/561/647nm3、λ/4波片4、λ/2波片5、涡旋相位板6、声光调制器7、倍频带宽压缩器以及皮秒光学参量放大器8、全反镜Ⅱ9以及二向色镜10使其位于同一水平中心线上；振镜11、二向色镜12、反射式物镜13以及样品台14位于同一水平中心线上；计算机15、信号积分器16、光电倍增管17、光谱仪18以及全反镜19位于同一水平中心线上。精确调整各光学器件中心多维度位置：调整探测部分Ⅱ中各镜片、振镜11和反射式物镜13的位置，在探测部分内形成稳定的荧光。微调所有设备和镜架的高度、左右和前后位置、倾角和俯仰保证出现强度值在竖直和水平方向上均匀分布的光谱。

实施例：

如图5所示，利用声光调制器首先将连续光(系统中的耗散光)调制成兆赫兹，通过时序控制系统，保证连续光(耗散光)同飞秒激发光同时照射到样品上，获得超分辨荧光信号。然后利用斩波器斩频1千赫兹，二次调制被声光调制器调节后的连续光。进一步降低连续光作用到样品上的作用时间。声光调制器和斩波器共同作用就可以在保证连续光强度不变的情况下，将作用到样品上连续光的作用时间降低75％，进一步降低了光毒性。

Claims (1)

1.一种基于多重调制技术的超分辨荧光显微成像测量系统，其特征在于：由激光产生及调节部分(Ⅰ)、探测部分(Ⅱ)、接收部分(Ⅲ)组成，其中激光产生及调节部分(Ⅰ)、探测部分(Ⅱ)、接收部分(Ⅲ)位于同一高度的光学平台上；激光产生及调节部分(Ⅰ)、探测部分(Ⅱ)和接收部分(Ⅲ)自右至左顺序排列；所述的激光产生及调节部分(Ⅰ)由飞秒激光器(1)、全反镜Ⅰ(2)、固体激光器组(3)、λ/4波片(4)、λ/2波片(5)、涡旋相位板(6)、声光调制器(7)、倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器(8)、全反镜Ⅱ(9)和二向色镜Ⅰ(10)组成，飞秒激光器(1)设有端口a，声光调制器(7)设有端口b；固体激光器组(3)由532nm固体激光器、561nm固体激光器和647nm固体激光器组成；飞秒激光器(1)、固体激光器组(3)、倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器(8)自左至右排列；固体激光器组(3)、λ/4波片(4)、λ/2波片(5)、涡旋相位板(6)、声光调制器(7)、二向色镜Ⅰ(10)自前至后顺序排列，且位于同一水平线上；全反镜Ⅰ(2)、倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器(8)、全反镜Ⅱ(9)自前至后顺序排列，且位于同一水平线上；飞秒激光器(1)的端口a与声光调制器(7)的端口b连接；飞秒激光器(1)产生的激光经全反镜Ⅰ(2)反射的光依次经倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器(8)、全反镜Ⅱ(9)投射穿过二向色镜Ⅰ(10)；固体激光器组(3)产生的激光经λ/4波片(4)、λ/2波片(5)、涡旋相位板(6)、声光调制器(7)、二向色镜Ⅰ(10)折射；所述的探测部分(Ⅱ)由振镜(11)、二向色镜Ⅱ(12)、反射式物镜(13)和样品台(14)组成，振镜(11)、二向色镜Ⅱ(12)、反射式物镜(13)和样品台(14)自后至前顺序排列，且位于同一水平线上；所述的接收部分(Ⅲ)由计算机(15)、信号积分器(16)、光电倍增管(17)、光谱仪(18)和全反镜Ⅲ(19)组成，其中计算机(15)上设有端口c和端口d；信号积分器(16)上设有端口e和端口f；光电倍增管(17)上设有端口g；光谱仪(18)上设有端口h；信号积分器(16)和光谱仪(18)左右排列，且均位于计算机(15)的前方；光电倍增管(17)固接于光谱仪(18)的前面；全反镜Ⅲ(19)置于计算机(15)和光谱仪(18)之间，接收的入射光经全反镜Ⅲ(19)反射到光谱仪(18)；光谱仪(18)的端口h与计算机(15)的端口c连接；信号积分器(16)的端口e与计算机(15)的端口d连接；光电倍增管(17)的端口g与信号积分器(16)的端口f连接；激光产生及调节部分(Ⅰ)中飞秒激光器(1)产生的飞秒激光，经全反镜Ⅰ(2)、倍频带宽压缩器及皮秒光学参量放大器(8)和全反镜Ⅱ(9)，并穿过二向色镜Ⅰ(10)进入到探测部分(Ⅱ)；激光产生及调节部分(Ⅰ)中固体激光器组(3)产生的激光经λ/4波片(4)、λ/2波片(5)、涡旋相位板(6)和声光调制器(7)后，经二向色镜Ⅰ(10)反射进入到探测部分(Ⅱ)；进入探测部分(Ⅱ)中的激光经振镜(11)反射、二向色镜Ⅱ(12)透射，再由反射式物镜(13)会聚至样品台(14)上，同时由反射式物镜(13)和二向色镜Ⅱ(12)反射将样品台(14)上的成像接入接收部分(Ⅲ)，再由接收部分(Ⅲ)中的反射镜(19)将激光引入光谱仪(18)，通过光电倍增管(17)将其转换为电信号，并通过信号积分器(16)和计算机(15)接收信号。

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