CN210620670U - 抗体提取装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型公开了一种抗体提取装置。具体地，本实用新型的抗体提取装置包括预处理模块，孵育解离模块和中和纯化模块，本实用新型的装置适用于提取细胞表面抗原的抗体，操作简便，成本低廉，易于推广。

Description

抗体提取装置

技术领域

本实用新型涉及生物技术领域，特别涉及一种提取抗细胞表面抗原的抗体的装置。

背景技术

细胞膜是防止细胞外物质自由进入细胞的屏障，它保证了细胞内环境的相对稳定，使各种生化反应能够有序运行。但是细胞必须与周围环境发生信息、物质与能量的交换，才能完成特定的生理功能，因此细胞必须具备一套物质转运体系，用来获得所需物质和排出代谢废物。据估计细胞膜上与物质转运有关的蛋白占核基因编码蛋白的15～30％，细胞用在物质转运方面的能量达细胞总消耗能量的三分之二。

细胞膜在维持细胞通透性、生理信号转导等人体生理、病理状态下扮演重要的作用。细胞膜分子的结构及其功能为近年来生命科学研究的前沿热点。但如何鉴定细胞膜分子也是当前的难点。抗体因其与抗原受体具有特异性的亲和结合型而被广泛用于靶抗原分子的筛选与鉴定。针对于细胞表面(膜)的抗体为一种具有天然构象的抗体，其对于识别细胞膜抗原具有独特优势。然而，现有技术中的抗体提取装置还存在一些不足，本领域还需要研究新的提取抗细胞表面抗原的抗体的装置。

实用新型内容

本实用新型的目的在于提供一种提取抗细胞表面抗原的抗体的装置，本实用新型的抗体提取装置包括预处理模块，孵育解离模块和中和纯化模块，本实用新型的装置适用于提取细胞表面抗原的抗体，操作简便，成本低廉，易于推广。

与经典的用天然蛋白A/G的介质提取血清抗体的方法比较，利用本实用新型的设备提取抗体的特异性更高，只吸附针对细胞膜表面分子的抗体，对于后续研究细胞膜分子的结构与功能具有独特的优势。而且价格较为便宜，是一种很实用的抗体纯化技术。

具体地，本实用新型一种用于提取抗细胞表面抗原的抗体的装置，所述装置包括：

预处理模块，所述的预处理模块包括用于分离血清样品的分离袋，以及通过连接软管与所述分离袋的输入端口连接的血清储存袋和血小板储存袋；

孵育解离模块，所述的孵育解离模块包括将分离袋内分离出的第一上清液进行收集并对其进行孵育和解离的反应处理袋，以及通过连接软管与反应处理袋的输入端口连接的哺乳动物细胞储存袋、漂洗液储存袋和洗脱液储存袋；和

中和纯化模块，所述中和模块包括对反应处理袋输出的第二上清液进行超滤的超滤瓶，以及通过连接软管与所述超滤瓶的输入端口连接的中和液储存袋。

在另一优选例中，所述的预处理模块、孵育解离模块、中和纯化模块位于壳体之中。

在另一优选例中，所述分离袋的输出端口通过连接软管与反应处理袋连接。

在另一优选例中，所述分离袋的输出端口处设有第一过滤器。

在另一优选例中，所述反应处理袋设有废液排出口和上清液排出口，并且所述的上清液排出口与超滤瓶的输入端口相连，所述的废液排出口连接于废液瓶。

在另一优选例中，所述的废液排出口设有第二过滤器。

在另一优选例中，所述的上清液排出口设有第三过滤器。

在另一优选例中，所述超滤瓶的输出端口通过连接软管与产品储存瓶连接。

在另一优选例中，所述的装置还包括用于驱动液体流动的数控泵。

在另一优选例中，所述的连接软管上设有控制液体流动的电磁阀门。

在另一优选例中，所述的血清储存袋用于向分离袋中输注血清。

在另一优选例中，所述的血小板储存袋用于向分离袋中输注血小板。

在另一优选例中，所述的哺乳动物细胞储存袋用于向反应处理袋中输注哺乳动物细胞，较佳地为人脐带血管内皮细胞，更佳地为人脐带静脉血管内皮细胞。

在另一优选例中，所述的漂洗液储存袋用于向反应处理袋中输注漂洗液。

在另一优选例中，所述的洗脱液储存袋用于向反应处理袋中输注抗体洗脱液。

在另一优选例中，所述的中和液储存袋用于向超滤瓶中输注中和液。

在另一优选例中，所述的超滤瓶用于中和第二上清液并通过超滤去除混合溶液中的小分子。

在另一优选例中，所述的产品储存瓶用于储存提取的抗细胞表面抗原的抗体。

在另一优选例中，反应处理袋设置于一振荡器装置中。

与现有技术相比，本实用新型的优点在于：

本实用新型所述的抗体提取装置操作方法简便，成本低廉，不仅能够避免了人为因素和环境因素对纯化过程的污染，而且能够高效快速纯化抗体。本实用新型方便快捷，排除人为干扰纯化的流速，流量，可以稳定抗体纯化过程，提高抗体纯化效率。本实用新型的装置分离的抗体特异性高，只吸附针对细胞膜表面分子的抗体。

应理解，在本实用新型范围内中，本实用新型的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本实用新型的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本实用新型的一优选实施方式中的结构示意图。

图2显示了针对细胞膜表面抗体富集程度的ELISA测定结果。

具体实施方式

本实用新型涉及一种用于提取抗细胞表面抗原的抗体的装置。本实用新型所述的抗体提取装置操作方法简便，成本低廉，不仅能够避免了人为因素和环境因素对纯化过程的污染，而且能够高效快速纯化抗体。本实用新型方便快捷，排除人为干扰纯化的流速，流量，可以稳定抗体纯化过程，提高抗体纯化效率。本实用新型的装置分离的抗体特异性高，只吸附针对细胞膜表面分子的抗体。在此基础上，完成了本实用新型。

术语

如本文所用，术语“优选的”、“最优的”、“典型的”、“示例地”或“可选地”不限制本实用新型或其实施例的范围。

当列举一系列值时，仅是为了便利或简洁，包括所有可能的资范围以及该范围边界内或周围的单个数值。任何数值，除非另有规定，否则还包括实际近似值，且整数值不排除分数值。子范围值及实际近似值不应被视为专门公开的值。

除非上下文另有指示，参照单数形式的对象不排除复数形式。

工作原理

人血清中特异性抗体(IgG类抗体占主要)经与哺乳动物细胞孵育后，某类抗体会与细胞膜表面的抗原特异性结合，经离心、用细胞漂洗液漂洗细胞后，只有这类抗体牢固结合在细胞膜表面，在弱酸性条件抗体与细胞膜表面抗原结合呈分离状态，离心后可将洗脱液加入中和液，恢复抗体溶液的pH值到中性。将含有抗体的混合溶液加入到超滤离心管(该离心管作用是分子筛作用，抗体分子可被截流，小分子等杂质经过离心会滤掉，加入pH7.0-7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)重复洗涤2-3遍而达到纯化抗体的目的。

应用方法

应用本实用新型的装置提取针对细胞膜表面的抗体的方法包括步骤：

(a)预处理：提供若干(如10份)血清样品，将所述血清样品与20％浓度的健康人血小板溶液混合并孵育，得到第一混合溶液，将第一混合溶液离心后得到第一上清液；

(b)孵育：将所述第一上清液与哺乳动物细胞(如人脐带静脉血管内皮细胞)混合并孵育，得到第二混合溶液，将第二混合溶液离心后得到细胞沉淀物；

(c)漂洗：将所述细胞沉淀物用细胞漂洗液漂洗，得到细胞膜表面结合有抗体的细胞；

(d)解离：将上一步骤获得的细胞与抗体洗脱液混合，得到第三混合溶液，将第三混合溶液离心后得到第二上清液；

(e)中和：将所述第二上清液与中和液混合，得到第四混合溶液；和

(f)纯化：将第四混合液进行纯化(超滤离心)，去除第四混合溶液中的小分子，从而得到针对细胞膜表面的抗体。

关键试剂

本实用新型的装置在应用时所用到的关键试剂如下：

1.细胞漂洗液0.01M、pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)加2％浓度的小牛血清溶液，该试剂作用是用于悬浮、漂洗活的哺乳动物细胞(如人脐带血管内皮细胞)，且可保证离体的细胞在离心、静置等保持新鲜、活的状态。

2.细胞抗体洗脱液0.1M，pH 3.0柠檬酸溶液

该试剂作用是在酸性条件下将吸附在细胞膜表面的特异性抗体与细胞膜上抗原分离、洗脱下来。

3.中和液pH 9.0Tris/Hcl溶液

该试剂作用是经过0.1M，pH 3.0柠檬酸溶液洗脱下来的抗体，需要尽快回复到中性条件(即pH 7.0左右)才能保持抗体生物学活性，将酸性条件下洗脱的抗体溶液加入中和液pH 9.0Tris/Hcl溶液，让抗体置于中性环境中而保持其生物学活性。

抗体浓度、纯度的鉴定

1、抗体浓度测定

抗体也是蛋白质，因此其浓度测定按照常规蛋白质测定方法，一般有Bradford法测定，用可见紫外分光光计测定吸光度值，计算浓度。

2、抗体纯度测定

抗体纯度可参照蛋白电泳分离方法鉴定，因为IgG抗体一般有2条重链、每条链50kD(千道尔顿)；2条轻链，每条链25kD(千道尔顿)。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，在变性条件下，经考马斯亮蓝染色后，可见分离胶50kD位置处(抗体重链)、25kD位置处(抗体轻链)各有一个清晰的条带，无其它杂带或杂带较弱。

HLA-I类抗体

HLA-I类抗体为人白细胞分化抗原I类抗体，因为HLA-I抗原在人有核细胞表面均有表达，因此，在用流式细胞术检测细胞膜表面抗体时，用HLA-I类抗体作为阳性参考对照。如需要分离、鉴定特异性结合细胞膜表面的抗原，一般在实验时，可先用混合的人血小板溶液(20％浓度)与待检测人血清孵育，把人血清中的HLA-I类抗体吸附掉再进行实验。

与现有技术的比较

用本实用新型的装置分离的抗体与用现有技术中的天然蛋白A和G树脂(ProteinA/G树脂)分离抗体的比较如下：

利用本实用新型的装置，用活的哺乳动物细胞(如人静脉血管内皮细胞)，吸附病人血清中抗体，可获得特异性吸附细胞膜表面的一类抗体，这类抗体多为呈天然构象的抗体，可以通过流式细胞术鉴定，可进一步通过免疫共沉淀技术结合蛋白质谱方法可以鉴定出细胞膜分子，从而可以准确鉴定出自身免疫病、器官移植免疫排斥的细胞膜抗原分子。而利用ProteinA/G树脂吸附人血清中抗体，因人血清中抗体种类较多，含变性的、呈天然构象的抗体，若需鉴定血清中标志物较难获得精准的信息。

本实用新型的主要优点包括：

(a)本实用新型的装置操作方法简便，成本低廉。

(b)本实用新型的装置分离的抗体特异性高，只吸附针对细胞膜表面分子的抗体。

下面结合具体实施例，进一步阐述本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

抗体提取装置

如图1所示，本实用新型的装置包括壳体1以及位于壳体1中的预处理模块、孵育解离模块、中和纯化模块。

预处理模块，所述的预处理模块包括用于分离血清样品的分离袋2，以及通过连接软管与所述分离袋2的输入端口连接的血清储存袋3和血小板储存袋4。所述分离袋2的输出端口处设有第一过滤器。

孵育解离模块，所述的孵育解离模块包括将分离袋2内分离出的第一上清液进行收集并对其进行孵育和解离的反应处理袋5，以及通过连接软管与反应处理袋5的输入端口连接的哺乳动物细胞储存袋6、漂洗液储存袋7和洗脱液储存袋8。其中，所述反应处理袋5还设有废液排出口和上清液排出口，所述的废液排出口连接于废液瓶9。并且所述的废液排出口设有第二过滤器，所述的上清液排出口设有第三过滤器。

中和纯化模块，所述中和模块包括对反应处理袋5输出的第二上清液进行超滤的超滤瓶10，以及通过连接软管与所述超滤瓶10的输入端口连接的中和液储存袋11，其中所述超滤瓶10的输入端口与反应处理袋5的上清液排出口相连，所述超滤瓶10的输出端口通过连接软管与产品储存瓶12连接。

实施例2

装置的使用

(一)材料

人脐带静脉血管内皮细胞系、自身免疫性肝病的病人血清、Tris/Hcl溶液、柠檬酸钠溶液、超滤离心管、HLA-I类抗体、ELISA微孔板、PE标记的羊抗人IgG抗体、蛋白垂直电泳装置及相关试剂。

(二)方法

1.取自身免疫肝病病人血清6例，分多次置于本装置的血清储存袋3中，利用本装置的预处理模块，去除HLA类抗体；

2.培养人脐带血管内皮细胞，待对数生长期，取细胞置于PBS(含2％小牛血清)，并将其置于本装置的哺乳动物细胞储存袋6中；

3.按5×10⁶个血管内皮细胞与100μl的自身免疫肝病病人血清(即去除HLA类抗体的上清)的比例，将二者在反应处理袋5中混合，于室温(15-25℃)振摇孵育1小时后，利用过滤器，去除反应处理袋5中的上清液，获得吸附有血清抗体的细胞；

4.向反应处理袋5中加入漂洗液储存袋7中储存的预冷的PBS液(0.01M，pH 7.4)，漂洗细胞3遍，洗去非特异性结合的杂质，获得经漂洗的吸附有血清抗体的细胞；

5.向反应处理袋5中加入储存于洗脱液储存袋8中的柠檬酸溶液(0.01M，pH 3.0)，与吸附了血清抗体的细胞孵育，室温轻轻混匀5分钟，利用过滤器过滤，输送上清液至超滤瓶10中，向超滤瓶10中加入储存于中和液储存袋11中的pH 9.0的Tris/Hcl溶液，中和至中性，获得中性混合液；

6.利用超滤瓶10，对其中的中性混合液进行超滤，去除小分子杂质，从而获得纯化的抗体；

7.纯化的抗体储存于中产品储存瓶12中，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定提取抗体的纯度；用紫外分光光度计测定抗体浓度；用ELISA法测定抗体富集程度；用流式细胞术测定抗体对细胞表面分子结合的特异性。

针对细胞膜表面抗体富集程度的ELISA测定结果如图2所示。

吸附、洗脱抗体对靶细胞膜表面的结合能力分析(流式细胞术测定数据)如下表所示。

血清	平均荧光强度(MFI)
		健康人血清	6.21
HLA-I阳性参考血清	122.98
		慢性免疫性肝病病人血清吸附1次	44.11
慢性免疫性肝病病人血清吸附2次	72.34
		慢性免疫性肝病病人血清吸附后洗脱1次	49.58
慢性免疫性肝病病人血清吸附后洗脱第2次	74.99

在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种抗体提取装置，其特征在于，所述装置包括：

预处理模块，所述的预处理模块包括用于分离血清样品的分离袋(2)，以及通过第一连接软管与所述分离袋(2)的输入端口连接的血清储存袋(3)和血小板储存袋(4)；

孵育解离模块，所述的孵育解离模块包括将分离袋(2)内分离出的第一上清液进行收集并对其进行孵育和解离的反应处理袋(5)，通过第三连接软管与反应处理袋(5)的输入端口连接的哺乳动物细胞储存袋(6)，通过第四连接软管与反应处理袋(5)的输入端口连接的漂洗液储存袋(7)和通过第五连接软管与反应处理袋(5)的输入端口连接的洗脱液储存袋(8)；和

中和纯化模块，所述中和模块包括对反应处理袋(5)输出的第二上清液进行超滤的超滤瓶(10)，以及通过第八连接软管与所述超滤瓶(10)的输入端口连接的中和液储存袋(11)。

2.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的预处理模块、孵育解离模块、中和纯化模块位于壳体(1)之中。

3.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述分离袋(2)的输出端口通过第二连接软管与反应处理袋(5)连接。

4.如权利要求3所述的装置，其特征在于，所述分离袋(2)的输出端口处设有第一过滤器。

5.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述反应处理袋(5)设有废液排出口和上清液排出口，并且所述的上清液排出口通过第六连接软管与超滤瓶(10)的输入端口相连，所述的废液排出口通过第七连接软管连接于废液瓶(9)。

6.如权利要求5所述的装置，其特征在于，所述的废液排出口设有第二过滤器。

7.如权利要求5所述的装置，其特征在于，所述的上清液排出口设有第三过滤器。

8.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述超滤瓶(10)的输出端口通过第九连接软管与产品储存瓶(12)连接。

9.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的装置还包括用于驱动液体流动的数控泵。

10.如权利要求1所述的装置，其特征在于，所述的各个连接软管上设有控制液体流动的电磁阀门。

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