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CN1967249A - 抗心肌抗体四联诊断试剂盒 - Google Patents

抗心肌抗体四联诊断试剂盒 Download PDF

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Publication number
CN1967249A
CN1967249A CN 200510019807 CN200510019807A CN1967249A CN 1967249 A CN1967249 A CN 1967249A CN 200510019807 CN200510019807 CN 200510019807 CN 200510019807 A CN200510019807 A CN 200510019807A CN 1967249 A CN1967249 A CN 1967249A
Authority
CN
China
Prior art keywords
myocardial
antibody
antigen
solution
serum
Prior art date
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Pending
Application number
CN 200510019807
Other languages
English (en)
Inventor
廖玉华
王敏
汪朝晖
苑海涛
董继华
王朝晖
袁瑾
程翔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Original Assignee
Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology filed Critical Union Hospital Tongji Medical College Huazhong University of Science and Technology
Priority to CN 200510019807 priority Critical patent/CN1967249A/zh
Publication of CN1967249A publication Critical patent/CN1967249A/zh
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Abstract

本发明提供了一种抗心肌抗体四联诊断试剂盒，包括包被有与四种心肌抗原有相同抗原原性的人工合成的抗原多肽的包被反应板、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG酶标二抗、样品稀释液、浓缩洗液、显色剂A、显色剂B、阴性对照血清、终止液和说明书，本发明试剂盒对病毒性心肌炎和扩张型心肌病有较高的敏感性和较强的特异性。

Description

抗心肌抗体四联诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及医用检测试剂盒，特别是心肌抗体检测试剂盒。
背景技术
病毒性心脏病(VHD)是一组与病毒感染有关的心脏疾病，常见的有病毒性心肌炎(VMC)和扩张型心肌病(DCM)[参见Kandolf R，Klingel K，Zell R，et al.Molecular mechanismsin the pathogenisis of enteroviral heart disease：acute and persistent infections.Clin Immuno Immunopathol，1993，68(2)：153]。
近年来，VHD的发病率有逐渐增高的趋势。在病毒感染的流行期约有5％的患者发生心肌炎，其中12.5％可转化为DCM，而普通人群中DCM发病率仅8-10/10万人口[参见刘颖，廖玉华，涂源淑，柯萨奇病毒感染与抗ADP/ATP载体抗体在病毒性心脏病发病中的意义。临床心血管病杂志，1997；13：147]。
我国广西南宁地区66632人中DCM的普查患病率为84.04/10万，占该地区各种心脏病自然发病率的第4位[参见广西医学院内科，南宁地区医院内科，南宁地区心血管病协作组。广西南宁地区66632例人口普查心肌病调查报告。广西医学院学报，1979；1：57]。一般认为，DCM患者症状出现后5年生存率约40％，10年生存率仅22％左右。
目前超声心动图、胸部X线和心内膜心肌活检等检查是DCM临床诊断的常用工具。但超声心动图和胸部X线出现改变时，患者已有明显的心脏形态学改变，常伴有心力衰竭。心内膜心肌活检缺乏特异性，且难以在临床推广。故寻求对扩张型心肌病(DCM)进行早期诊断的有效方法，是本领域面临的重要课题。
发明内容
本发明的任务是提供一种抗心肌抗体四联诊断试剂盒，该试剂盒能实现对病毒性心肌炎的诊断，以及对扩张型心肌病(DCM)的早期诊断。
扩张型心肌病(DCM)患者血清中存在抗心肌自身抗体，检测疑诊扩张型心肌病(DCM)患者血清中抗心肌肽类抗体，可提高DCM的诊断水平。由于天然心肌抗原分离提纯困难，难以长期保存，限制了心肌抗体检测的临床应用。
本发明根据心肌抗原的氨基酸序列及抗原决定簇的分布状况，设计并合成多肽，并以此多肽作为抗原检测患者体内的抗心肌肽类抗体。
本发明提供的抗心肌抗体四联诊断试剂盒的组成包括：
1.包被反应板4块，每块96孔；
2.样品稀释液1瓶40ml；
3.浓缩洗液4瓶，每瓶50ml；
4.酶标二抗1瓶40ml；
5.显色剂A 4支，每支10ml；
6.显色剂B 4支，每支10ml；
7.阴性对照血清1支50μl；
8.终止液4支，每支10ml；
9.说明书1份。
包被反应板为四块96孔板，四块反应板分别包被有与四种心肌抗原有相同抗原原性的人T合成的抗原多肽。
样品稀释液是PH为7.4的磷酸缓冲液与小牛血清的混合液，磷酸缓冲液与小牛血清的容积比为9∶1；
浓缩洗液为含0.1％Tween-20的磷酸缓冲液，其PH为7.4；
酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG；
显色剂A：由磷酸氢二钠14.6g和柠檬酸9.33g溶于0.75％过氧化氢尿素4.6ml中，再加水至1000ml配制而成；
显色剂B：由四甲基联苯胺(TMB)200mg溶于无水乙醇100ml中，再加水至1000ml配制而成；
阴性对照血清为健康人血清；
终止液为2mol/L硫酸。
试剂盒检测试剂的制备
一、抗原肽的合成
合成与四种心肌抗原有相同抗原原性的抗原肽。
1.四种心肌抗原及合成的相应心肌细胞抗原肽段的氨基酸序列
四种心肌抗原是：
①心肌细胞线粒体内膜ADP/ATP载体蛋白抗原(ANT)；
②β1肾上腺素能受体抗原(β1)；
③M2-胆碱能受体抗原(M2)；
④心肌肌球蛋白重链抗原(MHC)。
合成的心肌细胞线粒体内膜ADP/ATP载体蛋白抗原(ANT)肽段的氨基酸序列：
ANT-1       Pro-Ile-Glu-Arg-Val-Lys-Leu-Leu-Leu-Gln
ANT-2       Tyr-Asp-Glu-Ile-Lys-Lys-Phe-Val
合成的β1肾上腺素能受体肽段的氨基酸序列：
His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-The-Asn-Arg-Cys
合成的M2-胆碱能受体肽段的氨基酸序列：
Val-Arg-The-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-The-Phe-Gly-The-Ala-Ile-Cys
合成的心肌肌球蛋白重链(MHC)肽段的氨基酸序列：
MHC-1        Glu-Ile-Glu-Arg-Lys-Leu-Ala-Glu-Lys-Asp
MHC-2        Val-Asp-Lys-Leu-Gln-Leu-Lys-Val
MHC-3        Ala-Lys-Ser-Arg-Asp-Ile-Gly-Ala-Lys-Gly-Leu-Asn-Glu
2.用SHIMADZU公司PSSM-8型多肽合成仪合成心肌抗原肽段，包括以下步骤：
(1)去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂(piperidine)去除氨基的保护基团。
(2)激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种激活剂所激活。激活的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。
(3)循环：这两步反应反复循环直到合成完成。
(4)裂解切割和脱保护：多肽从柱上切割下来，其保护基团被一种脱保护剂(TFA)洗脱和脱保护。
3.多肽抗原合成后分离与纯化：
用甲醇(优级纯)清洗5次，每次1分钟，再用t-J甲基醚(优级纯)清洗2次，此俩种清洗的目的是洗去游离的未结合的氨基酸。用脱树脂溶液(sigma公司的三氟乙酸)将合成好的多肽从树脂上切割下来，再用乙醚(分析纯)沉淀，离心分离，使脱树脂溶液(三氟乙酸)与合成好的多肽分离；倒掉上层的脱树脂溶液，最后用氮气(N2)将沉淀的合成好的多肽吹干，置-40℃冰箱保存备用。
二.抗原的包被
将ANT、β1、M2、MHC抗原多肽片段分别溶解于四个装有PH为9.2碳酸缓冲液的容器中，以每孔中100μl的碳酸缓冲液含1μg的相应多肽抗原量进行包被，置4℃冰箱18小时后，用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干后将含1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液作为封闭液，每孔150μl封闭，置37℃孵浴2h，以消除非特异性反应，拍干干燥后保存于4℃或-20℃冰箱备用。
三.试剂的配制：
(1)样品的稀释液：(容积比)9份磷酸缓冲液(PH7.4)+1份小牛血清；
(2)辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体；
(3)显色剂A：200mg溶于无水乙醇100ml加水至1000ml
(4)显色剂B：将磷酸氢二钠14.6g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素4.6ml溶于1000ml蒸馏水中即得显色剂B；
(5)终止液：为2mol/L H2S04；
(6)洗液：含0.1％Tween-20的0.01mol/L磷酸缓冲液(PH7.4)。
(7)阴性对照血清：健康人血清50μl。
使用本发明试剂盒检测的步骤：
1.取出分别包被有ANT、β1、M2、MHC多肽抗原的包被板；用样品稀释液稀释待测血清，稀释度为1∶100，每孔加100μl，置37℃温浴60分钟；
2用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干，每孔加1∶16000辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体100μl，置37℃温浴30分钟后，同上洗3次；
3.加显色剂：每孔分别加入显色剂A 50μl后，再在每孔中加入显色剂B 50μl，混匀，37℃温箱10分钟；
4.显色完毕后，立即加50μl终止液于各反应孔；
5.在酶标仪上450nm波长测定光密度值，实验中设置空白对照阴性；
6.结果判断：以空白对照为零，以P/N值≥2.1为阳性，P/N＝样本OD值/阴性对照OD值。
使用本发明诊断试剂盒的注意事项有：1.试剂的使用：整个检测工作中应严格防止交叉感染，严格按操作程序工作；2.试剂盒保存于2-8℃，试剂开封后如未用完，应密封干燥保存；3.洗涤时应注意洗净，拍干。4.不用批号的试剂盒中的组分不能混用，试剂瓶盖切勿交叉使用。
使用本发明试剂盒检测的步骤、使用本发明诊断试剂盒的注意事项和试剂的配制可作为使用说明书装入试剂盒中。
实验资料
1.用本发明试剂盒对临床上已经确诊的69例DCM患者和78例健康献血员血清进行了验证性检测，以检验本发明诊断试剂盒的敏感性和特异性。检测结果为：抗ANT抗体的敏感性62.3％，特异性93.6％；抗β1受体抗体的敏感性50.7％，特异性92.3％；抗M2-胆碱能受体抗体的敏感性40.6％，特异性94.9％；抗肌球蛋白重链抗体的敏感性44.9％，特异性96.2％。联合应用四种抗心肌多肽抗体检测DCM的敏感性和特异性分别高达82.6％和89.7％。通过比较我们还发现合成肽结果与天然心肌抗原的检测结果具有高度一致性，合成肽基本上可以反映心肌抗原的主要抗原决定簇，可以代替天然抗原用以检测患者血清中抗心肌自身抗体。
2.使用本发明试剂盒对病毒性心脏病患者抗心肌多肽抗体检测结果的比较：
对病毒性心脏病患者及健康人进行抗心肌多肽抗体检测，相互比较后发现，DCM组和慢性病毒性心肌炎(CVMC)组抗心肌多肽抗体阳性率明显高于急性病毒性心肌炎(AVMC)组及健康人组(P＜0.05，P＜0.01)，而急性病毒性心肌炎(AVMC)组与健康人组间无明显差异(P＞0.05)。同时慢性病毒性心肌炎(CVMC)组与DCM组间亦无明显差异(P＞0.05)，见表1及表2。各种抗心肌多肽抗体对DCM检测的敏感性及特异性分别为：ANT 57.1％，96.7％；β142.9％，93.3％；M2 38.1％，96.7％；MHC 38.1％，96.7％，见表3。
表1病毒性心脏病患者及对照组抗心肌多肽抗体检测分析(1)
  组别   病例数   抗心肌多肽抗体阳性[例数(％)]
  ANT   β1
  DCM组CVMC组AVMC组健康人组   21192130   12(57.1)**#⊿11(57.9)**#2(9.5)*1(3.3)   9(42.9)**#⊿12(63.3)**#3(14.4)*2(6.7)
注：与健康人组比较*P＞0.05**P＜0.01
与AVMC组比较#P＜0.05
与CVMC组比较⊿P＞0.05
表2病毒性心脏病患者及对照组抗心肌多肽抗体检测分析(2)
  组别   病例数   抗心肌多肽抗体阳性[例数(％)]
  M2   MHC
  DCM组CVMC组AVMC组健康人组   21192130   8(38.1)**#⊿12(63.3)**#2(9.5)*1(3.3)   8(38.1)**#⊿8(42.1)**#2(9.5)*1(3.3)
注：与健康人组比较*P＞0.05**P＜0.01
与AVMC组比较#P＜0.05
与CVMC组比较⊿P＞0.05
表3DCM患者抗心肌多肽抗体检测敏感性与特异性比较
  敏感性(％)   特异性(％)
  抗ANT抗体抗β1受体抗体抗M2受体抗体抗MHC抗体   57.142.938.138.1   96.793.396.796.7
检测结果说明本发明试剂盒在实际应用中对心肌病和DCM有较高的敏感性和很强的特异性。
本发明试剂盒的意义在于：
1.因DCM患者血清中存在抗心肌自身抗体，利用本发明试剂盒检测疑诊扩张型心肌病(DCM)患者血清中抗心肌肽类抗体，可提高DCM的诊断水平，实现早期诊断。
2.本发明试剂盒可用于监测病毒性心肌炎(VMC)向DCM转化。大量实验研究及临床资料表明：病毒性心肌炎可以转化为扩张型心肌病[参见Kandolf R，Klingel K，Zell R，ctal.Molecular mechanisms in the pathogeni sis of enteroviral heart disease：acuteand persistent infections.Clin Immuno Immunopathol，1993，68(2)：153]，许多慢性病毒性心肌炎患者体内存在抗心肌自身抗体，通过各种免疫学机制导致DCM的发病，即抗心肌抗体介导的心肌损害是DCM发病的一个始动因素及其早期发展的重要因素，故本发明试剂盒可用于监测VMC向DCM转化。
3.本发明试剂盒检测可用于指导DCM的防治。在DCM早期，对抗心肌抗体检测中抗ANT抗体阳性的患者，应用钙通道阻滞剂如地尔硫卓，抗β1受体抗体阳性的患者应用β受体阻滞剂如美多心安，阻止抗体效应，可以防止抗体介导的心肌损害，保护心肌，对DCM患者进行早期、及时干预，可降低患者的再住院率和死亡率。
附图说明
图1为抗原合成流程图见附，图中S、L为侧链保护基团。
具体实施方式
实施例1
试剂盒检测试剂的制备
一、抗原肽的合成
合成与四种心肌抗原有相同抗原原性的抗原肽。
1.四种心肌抗原肽段及其氨基酸序列是：
④心肌细胞线粒体内膜ADP/ATP载体蛋白抗原肽段(ANT)；
⑤β1肾上腺素能受体抗原肽段(β1)；
⑥M2-胆碱能受体抗原肽段(M2)；
④心肌肌球蛋白重链抗原肽段(MHC)。
ADP/ATP载体蛋白肽段的氨基酸序列：
ANT-1     Pro-Ile-Glu-Arg-Val-Lys-Leu-Leu-Leu-Gln
ANT-2     Tyr-Asp-Glu-Ile-Lys-Lys-Phe-Val
β1肾上腺素能受体肽段的氨基酸序列：
His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-The-Asn-Arg-Cys
M2-胆碱能受体肽段的氨基酸序列：
Val-Arg-The-Val-Glu-Asp-Gly-Glu-Cys-Tyr-Ile-Gln-Phe-Phe-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-The-Phe-Gly-The-Ala-Ile-Cys
心肌肌球蛋白重链(MHC)肽段的氨基酸序列：
MHC-1      Glu-Ile-Glu-Arg-Lys-Leu-Ala-Glu-Lys-Asp
MHC-2      Val-Asp-Lys-Leu-Gln-Leu-Lys-Val
MHC-3      Ala-Lys-Ser-Arg-Asp-Ile-Gly-Ala-Lys-Gly-Leu-Asn-Glu
2.用SHIMADZU公司PSSM-8型多肽合成仪合成心肌抗原肽段，包括以下步骤：
(1)去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂(piperidine)去除氨基的保护基团。
(2)激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种激活剂所激活。激活的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。
(3)循环：这两步反应反复循环直到合成完成。
(4)裂解切割和脱保护：多肽从柱上切割下来，其保护基团被一种脱保护剂(TFA)洗脱和脱保护。
3.多肽抗原合成后分离与纯化：
用甲醇(优级纯)清洗5次，每次1分钟，再用t-J甲基醚(优级纯)清洗2次，此俩种清洗的目的是洗去游离的未结合的氨基酸。用脱树脂溶液(sigma公司的三氟乙酸)将合成好的多肽从树脂上切割下来，再用乙醚(分析纯)沉淀，离心分离，使脱树脂溶液(三氟乙酸)与合成好的多肽分离；倒掉上层的脱树脂溶液，最后用氮气(N2)将沉淀的合成好的多肽吹干，置-40℃冰箱保存备用。
二.抗原的包被
将ANT、β1、M2、MHC抗原多肽片段分别溶解于四个装有PH为9.2碳酸缓冲液的容器中，以每孔中100μl的碳酸缓冲液含1μg的相应多肽抗原量进行包被，置4℃冰箱18小时后，用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干后将含1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲液作为封闭液，每孔150μl封闭，置37℃孵浴2h，以消除非特异性反应，拍干干燥后保存于4℃或-20℃冰箱备用。
三.试剂的配制：
(1)样品的稀释液：(容积比)9份磷酸缓冲液(PH7.4)+1份小牛血清；
(2)辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体；
(3)显色剂A：200mg溶于无水乙醇100ml加水至1000ml
(4)显色剂B：将磷酸氢二钠14.6g，柠檬酸9.33g，0.75％过氧化氢尿素4.6ml溶于1000ml蒸馏水中即得显色剂B；
(5)终止液：为2mol/L H2SO4；
(6)洗液：含0.1％Tween-20的0.01mol/L磷酸缓冲液(PH7.4)。
(7)阴性对照血清：健康人血清50μl。
四、试剂盒的装配
本发明抗心肌抗体四联诊断装配有：
1.包被反应板4块，每块96孔；
2.样品稀释液1瓶40ml；
3.洗液4瓶，每瓶50ml；
4.酶标二抗1瓶40ml；
5.显色剂A 4支，每支10ml；
6.显色剂B 4支，每支10ml；
7.阴性对照血清1支50μl；
8.终止液4支，每支10ml；
9.说明书1份。
实施例2
使用本发明诊断试剂盒的操作程序
1.配洗液：取适量浓洗涤液，按1∶9(容积比)比例用蒸馏水稀释备用；
2.加样品稀释液：用加样器在每个反应孔中加入100μl；
3.加标本和留空白对照：将每份待检标本各1μl分别加入已有样品稀释液的各孔中，留下一孔不加标本作为空白对照。
4.加阴性对照：在设定为阴性对照的2孔中加入阴性对照血清，每孔加1μl；
5.充分混合，37℃温箱温育60分钟；
6.洗板：倾去内容物，用洗涤液注满反应孔，静置3分钟，拍干如此重复3次；
7.加酶标二抗：每孔各加入酶标二抗100μl后，37℃温育30分钟；
8.洗板：倾去内容物，用洗涤液注满反应孔，静置3分钟，拍干如此重复3次；
9.加显色剂：每孔分别加入显色剂A50μl后，再在每孔中加入显色剂B50μl，混匀，37℃温箱10分钟；
10.终止：显色完毕后立即加50μl终止液于各反应孔；
11.判读：用空白对照孔调零，用酶标仪在450nm波长测吸光值。
结果判定：【样品吸光值-空白对照吸光值】/【阴性对照吸光值-空白对照吸光值】(P/N)≥2.1为阳性。
以下为本发明涉及的氨基酸序列表。
序列1为合成的心肌细胞线粒体内膜ADP/ATP载体蛋白抗原(ANT)肽段的氨基酸序列1；
序列2为合成的心肌细胞线粒体内膜ADP/ATP载体蛋白抗原(ANT)肽段的氨基酸序列2；
序列3为合成的β1肾上腺素能受体肽段的氨基酸序列；
序列4为合成的M2-胆碱能受体肽段的氨基酸序列；
序列5为合成的心肌肌球蛋白重链(MHC)肽段的氨基酸序列1；
序列6为合成的心肌肌球蛋白重链(MHC)肽段的氨基酸序列2；
序列7为合成的心肌肌球蛋白重链(MHC)肽段的氨基酸序列3。
                       序列表
<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院
<120>抗心肌抗体四联诊断试剂盒
<130>1
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>1
Pro Ile Gly Arg Val Lys Leu Leu Leu Gln
1               5                   10
<210>2
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Tyr Asp Glu Ile Lys Lys Phe Val
1               5
<210>3
<211>27
<212>PRT
<213>人类
<400>3
His Trp Trp Arg Ala Glu Ser Asp Glu Ala Arg Arg Cys Tyr Asn Asp
1               5                   10                  15
Pro Lys Cys Cys Asp Phe Val Thr Asn Arg Cys
        20                      25
<210>4
<211>26
<212>PRT
<213>人类
<400>4
Val Arg Thr Val Glu Asp Gly Glu Cys Tyr Ile Gln Phe Phe Ser Asn
1               5                   10                  15
Ala Ala Val Thr Phe Gly Thr Ala Ile Cys
            20                  25
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>5
Glu Ile Glu Arg Lys Leu Ala Glu Lys Asp
1               5                   10
<210>6
<211>8
<212>PRT
<213>人类
<400>6
Val Asp Lys Leu Gln Leu Lys Val
1               5
<210>7
<211>13
<212>PRT
<213>人类
<400>7
Ala Lys Ser Arg Asp Ile Gly Ala Lys Gly Leu Asn Glu
1               5                   10

Claims (3)

1.一种抗心肌抗体四联诊断试剂盒，包括：
A.分别包被有与心肌细胞线粒体内膜ADP/ATP载体蛋白抗原、β1肾上腺素能受体抗原、M2-胆碱能受体抗原和心肌肌球蛋白重链抗原四种心肌抗原有相同抗原原性的人工合成的抗原多肽的包被反应板，该人工合成的抗原多肽分别具有序列表中序列1至序列7的氨基酸序列。
B.辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG酶标二抗。
2.根据权利要求1所述的抗心肌抗体四联诊断试剂盒，其特征在于还包括样品稀释液、浓缩洗液、显色剂A、显色剂B、阴性对照血清、终止液和说明书，样品稀释液是PH为7.4的磷酸缓冲液与小牛血清的混合液，磷酸缓冲液与小牛血清的容积比为9∶1；浓缩洗液为含0.1％Tween-20的磷酸缓冲液，其PH为7.4；显色剂A由磷酸氢二钠14.6g和柠檬酸9.33g溶于0.75％过氧化氢尿素4.6ml中，再加水至1000ml配制而成；显色剂B由四甲基联苯胺(TMB)200mg溶于无水乙醇100ml中，再加水至1000ml配制而成；阴性对照血清为健康人血清；终止液为2mol/L硫酸。
3.根据权利要求1或2所述的抗心肌抗体四联诊断试剂盒在诊断病毒性心肌炎和扩张型心肌病中的应用。
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