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CN1961073A - 切割型dance、dance复合体及其使用方法 - Google Patents

切割型dance、dance复合体及其使用方法 Download PDF

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CN1961073A
CN1961073A CNA2005800175594A CN200580017559A CN1961073A CN 1961073 A CN1961073 A CN 1961073A CN A2005800175594 A CNA2005800175594 A CN A2005800175594A CN 200580017559 A CN200580017559 A CN 200580017559A CN 1961073 A CN1961073 A CN 1961073A
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CNA2005800175594A
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中邨智之
平井希俊
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Kyoto University NUC
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Abstract

本发明提供一种开发具有可调节弹性纤维形成的新型作用机制的药物的筛选方法，及该方法中必要的各种手段。更具体的是，本发明提供一种由DANCE的切割得到的多肽以及编码该多肽的多核苷酸；DANCE的切割方法；由DANCE的切割得到的抗多肽的抗体；DANCE切割量的测定方法·试剂盒；DANCE突变体以及编码该突变体的多核苷酸；各种DANCE复合体及其制备方法；可调节DANCE的活性的物质或DANCE特异的蛋白酶的筛选方法，以及由此得到的物质；弹性纤维形成调节剂；以及至少含有DANCE和编码该DANCE的多核苷酸的试剂盒等。

Description

切割型DANCE、DANCE复合体及其使用方法
技术领域
本发明涉及一种通过切割DANCE所得的多肽以及编码该多肽的多核苷酸；切割DANCE的方法；通过切割DANCE所得的抗多核苷酸的抗体；DANCE切割量的测定方法·试剂盒；DANCE突变体以及编码该突变体的多核苷酸；各种DANCE复合体及其制备方法；调节DANCE的活性得到的物质或DANCE特异的蛋白酶的筛选方法，以及由此得到的物质；弹性纤维形成调节剂；以及至少含有DANCE和编码DANCE的多核苷酸的试剂盒等。
背景技术
弹性纤维是在肺·动脉·皮肤等弹性组织中富含的，并决定组织弹性的细胞外纤维。人体老化的重要特征是组织弹性的丧失，从而产生肺气肿、动脉硬化及皱纹、皮肤松弛等。这是在老龄化社会中重要性日益增加的课题，其大多是由弹性纤维劣化·断裂引起的。尽管弹性纤维很重要，但关于弹性纤维形成以及劣化的分子机制的详细情况仍然不明确。
弹性纤维形成时，弹性蛋白沿着称为微原纤维的纤维沉积，并且弹性蛋白通过赖氨酰氧化酶家族的酶[赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase：LOX)、赖氨酰氧化酶样(lysyl oxidase-like：LOXL)1-4]进行交联是很重要的(Molnar，J等人，Biochim Biophys Acta 1647：220-4(2003)、Rosenbloom，J等人，Faseb J.7：1208-18.(1993))。但是关于该过程基于何种分子机制在生物体内进行，仍知之甚少。又，据认为微原纤维主要是指肌原纤蛋白1、肌原纤蛋白2、LTBP2(潜在的TGFb-结合蛋白，latent TGFb-binding protein 2)这样的细长的高分子量蛋白质，但因肌原纤蛋白1、肌原纤蛋白2基因敲除小鼠的任何一种均未发现弹性纤维的异常，所以难以认为这些蛋白质对弹性纤维形成有贡献(Pereira，L.等，Nat.Genet.17：218-22(1997)、Putnam，E.A.等人，Nat.Genet.11：456-8(1995)、Chardhry，S.S等人，Mol.genet.10：835-43(2001))，由于LTBP2基因敲除小鼠胎生早期致死，所以不明确LTBP2是否对弹性纤维形成有贡献(Shipley，J.M.等人，Mol，CellBiol.20：4879-87(2000))。
本发明人等，采用信号序列诱捕(Signal Sequence Trap)法克隆称为DANCE(发育动脉以及神经嵴表皮生长因子(EGF)样(developmental arteries and neural crest epidermal growthfactor(EGF)-like)；也称为纤蛋白-5)的分泌蛋白质(Nakamura，T.等人，J，Biol.Chem.274：22476-83(1999))，发现其敲除小鼠制成时，全身的弹性纤维扩散(Nakamura，T等人，Nature 415：171-5(2002))。因此，DANCE基因缺失小鼠的表型与人体的老化非常相似，皮肤松弛没有弹性、引起重度肺气肿、动脉扭曲且硬化。即，DANCE是弹性纤维形成中必须的蛋白质。又，本发明人等，标明DANCE与整联蛋白的结合在生物体内起重要作用(Nakamura，T.等，J，Biol.Chem.274：22476-83(1999))。
最近，报道弹性蛋白交联酶之一，LOXL1的敲除小鼠与DANCE敲除小鼠非常相似均引起弹性纤维的形成异常(Liu，X.等，Nat.Genet.36：178-82(2004))。LOXL1与DANCE结合，且在DANCE敲除小鼠中LOXL1不再定位于弹性纤维上，因此推测DANCE作为衔接头起到使LOXL1酶锚定于适当位置的作用。LOXL1敲除小鼠的表型比DANCE敲除小鼠的表型弱，且出现稍晚，因此认为DANCE的作用不仅是锚定LOXL1，而且DANCE规定弹性蛋白交联酶的定位，该见解对理解DANCE有助于弹性纤维形成的分子机制是很重要的。
但是，如果考虑弹性纤维是沿着微原纤维形成的，则认为DANCE仅与弹性蛋白交联酶结合是不充分的，DANCE还需与微原纤维的构成蛋白质结合。但是，DANCE与微原纤维的何种蛋白质结合仍不明确。据认为如果能明确DANCE的详细机能，则可以开发具有可调节弹性纤维形成的新型作用机制的药物，所以亟待阐明这一机制。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种筛选方法，其借助于阐明DANCE机能的一部分，进而利用所阐明的机能开发可调节弹性纤维形成的药物的筛选方法，关于弹性纤维形成的状态的诊断方法，该筛选方法以及诊断方法中必要的各种手段等。
本发明人等，为解决上述技术问题潜心研究，结果发现在生物体内切割DANCE的一部分即引起机能变化。切割型DANCE丧失与细胞表面整联蛋白的结合能力，及DANCE之间的结合能力，而获得对微原纤维的构成蛋白质LTBP2更强的结合能力。
又，本发明人等发现DANCE与LTBP2结合，DANCE之间结合，DANCE与赖氨酰氧化酶结合等。认为DANCE与这些蛋白质的结合对于弹性纤维形成的调节是很重要的。
本发明人等基于以上的见解完成本发明。即，本发明提供了下述内容：
<1>一种多肽，其包含与序列号6表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，且由DANCE特异的蛋白酶切割DANCE而得到。
<2>一种多肽，其包含序列号6表示的氨基酸序列。
<3>一种多核苷酸，其具有编码上述<1>中所述多肽的碱基序列。
<4>一种多核苷酸，其包含序列号5表示的碱基序列。
<5>一种多肽，其包含与序列号8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，且由DANCE特异的蛋白酶切割DANCE而得到。
<6>一种多肽，其包含序列号8表示的氨基酸序列。
<7>一种多核苷酸，其具有编码上述<5>中所述多肽的碱基序列。
<8>一种多核苷酸，其包含序列号7表示的碱基序列。
<9>一种DANCE的切割方法，其特征在于将DANCE与DANCE特异的蛋白酶接触。
<10>一种抗体，其对上述<1>或<2>中所述的多肽具有特异的亲和性。
<11>一种单克隆抗体，其对上述<5>或<6>中所述的多肽具有特异的亲和性。
<12>一种方法，其特征在于在来自动物的生物材料中测定DANCE的切割量。
<13>一种DANCE的切割量测定用试剂盒，其特征在于含有抗DANCE抗体。
<14>一种DANCE突变体，其在DANCE中DANCE特异的蛋白酶对DANCE的切割位点处引入氨基酸突变以使DANCE显示出对该DANCE特异的蛋白酶的抗性。
<15>一种多核苷酸，其具有编码上述<14>中所述的多肽的碱基序列。
<16>一种DANCE复合体，其至少含有2个DANCE。
<17>根据<16>中所述的复合体，其至少含有可识别形态的2种DANCE。
<18>根据<16>或<17>中所述的复合体，其进一步含有赖氨酰氧化酶和/或LTBP2。
<19>一种DANCE复合体，其含有至少1个DANCE，以及赖氨酰氧化酶和/或LTBP2。
<20>一种至少含有2个DANCE的DANCE复合体的制备方法，其特征在于使至少2个DANCE接触而形成复合体。
<21>一种含有至少1个DANCE，以及赖氨酰氧化酶和/或LTBP2的DANCE复合体的制备方法，其特征在于将至少1个DANCE与赖氨酰氧化酶和/或LTBP2接触。
<22>一种筛选可调节DANCE特异的蛋白酶活性的物质的方法，其包含以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)将被检物质与DANCE特异的蛋白酶接触的步骤；
(b)测定由于上述(a)步骤产生的DANCE特异的蛋白酶的活性，将该活性与未接触被检物质时的DANCE特异的蛋白酶的活性进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的比较结果，对调节DANCE特异的蛋白酶活性的被检物质进行选择的步骤。
<23>根据上述<22>中所述的方法，其为鉴定弹性纤维形成调节剂的方法。
<24>一种筛选可调节DANCE特异的蛋白酶活性的物质的方法，其包含以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)向动物给予被检物质的步骤；
(b)测定由于上述(a)步骤产生的DANCE特异的蛋白酶的活性，将该活性与未给予被检物质时的DANCE特异的蛋白酶的活性进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的比较结果，对调节DANCE特异的蛋白酶活性的被检物质进行选择的步骤。
<25>一种筛选下述物质的方法，该物质可调节含有至少2个DANCE的DANCE复合体的形成，该方法包含以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)被检物质存在下，使至少2个DANCE相接触的步骤；
(b)测定由于上述(a)步骤产生的DANCE复合体的量，将该量与不存在被检物质的情况下DANCE复合体的量进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的比较结果，对调节DANCE复合体的形成的被检物质进行选择的步骤。
<26>根据上述<25>中所述的方法，其中使用可识别形态的至少2种DANCE。
<27>一种筛选下述物质的方法，该物质可调节含有至少1个DANCE，以及赖氨酰氧化酶和/或LTBP2的DANCE复合体的形成，该方法包含以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)被检物质存在下，将至少1个DANCE与赖氨酰氧化酶和/或LTBP2接触的步骤；
(b)测定由于上述(a)步骤产生的DANCE复合体的量，将该量与不存在被检物质的情况下DANCE复合体的量进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的比较结果，对调节DANCE复合体的形成的被检物质进行选择的步骤。
<28>一种弹性纤维形成调节剂，其由上述<23>～<27>中所述的任一种方法得到。
<29>一种DANCE特异的蛋白酶的筛选方法，其以DANCE的切割活性为指标。
<30>一种DANCE特异的蛋白酶，其由上述<29>中所述的方法得到。
<31>一种多核苷酸，其具有编码由上述<29>中所述的方法得到的DANCE特异的蛋白酶的碱基序列。
<32>一种弹性纤维形成调节剂，其含有上述<30>中所述的DANCE特异的蛋白酶，或上述<31>中所述的的多核苷酸。
<33>一种试剂盒，其含有以下(a)以及(b)：
(a)DANCE或具有编码DANCE的碱基序列的多核苷酸；
(b)以下(i)～(vi)的至少1种成分；
(i)(a)中DANCE的可识别的形态的DANCE；
(ii)具有编码(a)的DANCE可识别的形态的DANCE的碱基序列的多核苷酸；
(iii)赖氨酰氧化酶；
(iv)具有编码赖氨酰氧化酶的碱基序列的多核苷酸；
(v)LTBP2；
(vi)具有编码LTBP2的碱基序列的多核苷酸。
<34>一种DANCE特异的蛋白酶表达细胞的鉴定方法，其含有以下步骤(a)以及(b)：
(a)特定的动物细胞与DANCE接触的步骤；
(b)评价DANCE是否被切割的步骤。
本发明的筛选方法，使可调节弹性纤维形成的新型作用机制的医药开发或DANCE特异的蛋白酶的鉴定成为可能，故是有用的。又，本发明的测定方法，使弹性纤维形成的状态的诊断成为可能，故是有用的。进一步，本发明的多肽、复合体以及试剂盒，可适用于实施本发明的方法，预防、治疗或改善需要对弹性纤维形成进行调节的状况，或者作为研究·诊断用试剂等。
附图说明
图1表示DANCE缺失突变体的结构。横线框：信号序列；白色框：钙结合性EGF样(cbEGF)模体；黑色框：RGD模体；竖线框：C末端结构域；斜线框：FLAG标记物。
图2表示293T细胞中的人、小鼠DANCE的强制表达。
图3表示小鼠皮肤成纤维细胞的培养上清液中DANCE的表达。
图4表示小鼠肺组织的蛋白质印迹。
图5表示全长DANCE、N末端切割DANCE的纯化。
图6表示由丝氨酸蛋白酶抑制剂引起的DANCE的切割抑制。
图7表示体外培养物中人DANCE的切割位点、以及突变型DANCE的氨基酸突变位点。
图8表示突变型DANCE(R77A)的DANCE切割量的降低。
图9表示平滑肌细胞培养物中的DANCE结合蛋白质。
图10表示使用DANCE缺失突变体分析DANCE之间的结合、DANCE与LTBP2的结合必需区域。
图11表示DANCE与赖氨酰氧化酶的结合。
图12表示各种年龄的人的皮肤中DANCE蛋白质的表达。
Ba：背部；F：脸部；N：颈部；Bu：臀部；T：嘴唇·肿瘤摘除时的剩余皮肤(有炎症)
图13表示DANCE突变蛋白质对血管内皮细胞的细胞黏着试验的结果。
发明详细的说明
1.切割型DANCE，以及编码该切割型DANCE的多核苷酸
本发明提供一种由DANCE特异的蛋白酶对DANCE进行切割所得的多肽，以及编码该多肽的多核苷酸。
“DANCE”包含由序列号2表示的氨基酸序列，或序列号4表示的氨基酸序列(去除从序列号2表示的氨基酸序列推定的信号序列的氨基酸序列)组成的多肽，或其等同物(例如含SNP、单元型的变体、哺乳动物直向同源物等)。具体而言，包含序列号2或序列号4表示的氨基酸序列的多肽的同等物是具有与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，且由DANCE特异的蛋白酶切割的多肽。本发明中，发现这样的DANCE由DANCE特异的蛋白酶切割。基于该见解成功地提供一种由DANCE的切割而得到的新型多肽。
DANCE的哺乳动物直向同源物没有特别的限制，例如优选牛、羊、猪、山羊、猴子、家兔、大鼠、仓鼠、豚鼠以及小鼠的直向同源物，更优选人、猴子、大鼠或小鼠的直向同源物。
本说明书中，“DANCE特异的蛋白酶”是指在序列号2表示的氨基酸序列的DANCE中的第77位氨基酸和第78位氨基酸之间切割的蛋白酶。DANCE特异的蛋白酶的特征在于，被作为丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑酶肽抑制，不被作为半胱氨酸蛋白酶抑制剂的E64抑制。又，确认DANCE特异的蛋白酶在皮肤成纤维细胞、293T细胞、肺组织等中的表达。进一步确认DANCE特异的蛋白酶，对第77位的精氨酸被丙氨酸取代的突变型DANCE的切割能力降低。
因此，关于由DANCE特异的蛋白酶对DANCE的切割而得到的本发明的多肽之一，是包含相当于序列号2表示的氨基酸序列中第24位到第77位的氨基酸序列(即，序列号6表示的氨基酸序列)的多肽，或其同等物。具体而言，包含序列号6表示的氨基酸序列的多肽的同等物，是具有与序列号6表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的多肽。
又，本发明提供的由DANCE的切割生成的其他多肽，是包含相当于序列号2表示的氨基酸序列中第78位到第448位的氨基酸序列(即，序列号8表示的氨基酸序列)的多肽，或其同等物。具体而言，包含序列号8表示的氨基酸序列的多肽的同等物，是具有与序列号8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的多肽。
与序列号6或序列号8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，是指在序列号6或序列号8中所示的氨基酸序列中取代、缺失、插入或附加1或2个以上(例如1～30个，优选1～20个，更优选1～10个，最优选1～5个)的氨基酸的氨基酸序列。
又，作为与序列号6或序列号8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，可使用与序列号6或8所示的氨基酸序列具有约70％以上，优选约80％以上，更优选约90％以上，进一步优选约95％以上，更进一步优选约97％以上，最优选99％以上的同一性的氨基酸序列。同一性(％)可使用该领域中常用的程序(例如，BLAST、FASTA等)在默认设置状态下确定。又，另一方面，同一性(％)可使用该领域中众所周知的任意的算法，例如Needleman等(1970)(J.Mol.Biol.48：444-453)、Myers以及Miller(CABIOS，1988，4：11-17)的算法等确定。Needleman等的算法，是代入GCG软件包(可从 www.gcg.com得到)的GAP程序中，同一性(％)，例如可使用BLOSUM 62matrix或PAM250matrix，以及gap weight：16、14、12、10、8、6或4，以及length weight：1、2、3、4、5或6中的任一种确定。又，Myers以及Miller的算法，是代入GCG序列比对软件包的一部分即ALIGN程序中。为了比较氨基酸序列，利用ALIGN程序时，例如可使用PAM120weight residue table、gap length penalty 12、gap penalty 4。
又，包含与序列号6或序列号8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的多肽，优选分别保持与包含序列号6或序列号8表示的氨基酸序列的多肽同质的活性(这里“活性”与功能意思相同)。“同质的活性”是指活性定性的等同，优选定量的也等同，也可在容许的范围内(例如，约0.5～约2倍)不同。
作为与包含序列号6表示的氨基酸序列的多肽同质的活性，例如可列举出整联蛋白结合活性、同型复合体形成活性(换言之，DANCE之间的结合活性)。因此，与包含序列号6表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的多肽，优选保持整联蛋白结合位点即共有序列Arg-Gly-Asp(RGD)模体(相当于序列号6表示的氨基酸序列中第31位～第33位的氨基酸序列)，和/或同型复合体形成位点。同型复合体形成位点的正确位置，可由缺失解析等已公知的方法鉴定。
作为包含与序列号6表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的多肽的优选例，可列举出包含序列号10表示的氨基酸序列的多肽(小鼠直向同源物)、包含序列号14表示的氨基酸序列的多肽(大鼠直向同源物)。
作为与包含序列号8表示的氨基酸序列的多肽同质的活性，例如可列举出赖氨酰氧化酶结合活性、赖氨酰氧化酶样-1结合活性、LTBP2结合活性等。因此，与包含序列号8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列的多肽，优选保持赖氨酰氧化酶结合位点、赖氨酰氧化酶样-1(lysyl oxidase-like 1)结合位点、LTBP2(Latent TGF-β-bindingprotein 2)结合位点中的至少1个以上，优选2个以上，更优选全部。例如，认为LTBP2结合位点存在于DANCE中央的钙结合性EGF(cbEGF)样模体[代表性的，如(D/N)X(D/N)(E/Q)Xm(D/N)*Xn(Y/F)：其中，m、n为变量，星号表示β羟基化]连续的结构域中(例如，参照实施例6)，但赖氨酰氧化酶结合位点、赖氨酰氧化酶样-1结合位点、LTBP2结合位点的更准确的位置，可由缺失解析等已公知的方法鉴定。
作为包含与序列号8表示的氨基酸基本上同一的氨基酸序列的多肽的优选例，可列举出包含序列号12表示的氨基酸序列的多肽(小鼠直向同源物)、包含序列号16表示的氨基酸序列的多肽(大鼠直向同源物)。
本发明还提供一种编码包含序列号6或序列号8表示的氨基酸序列的多肽或其等同物的多核苷酸。本发明的多核苷酸，可为DNA或RNA中的任一种。
作为编码包含序列号6或序列号8表示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸的优选例，可列举出包含序列号5或序列号7表示的碱基序列的多核苷酸。
另一方面，编码包含序列号6表示的氨基酸序列的多肽的等同物的多核苷酸，是与序列号5表示的碱基序列的互补序列在严格性强的(high stringent)条件下杂交，但与序列号7表示的碱基序列的互补序列在严格性强的条件(优选中等程度(moderate)的严格条件)下不杂交的多核苷酸。
又，编码包含序列号8表示的氨基酸序列的多肽的等同物的多核苷酸，是与序列号7表示的碱基序列的互补序列在严格性强的条件下杂交，但与序列号5表示的碱基序列的互补序列在严格性强的条件(优选中等程度的严格条件)下不杂交的多核苷酸。
上述严格性强的条件可参考已报道的条件设定(Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，6.3.1-6.3.6，1999)。例如作为严格性强的条件下的杂交条件，可列举出6×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)/45℃之后，以0.2×SSC/0.1％SDS/50～65℃清洗一次以上。又，作为中等程度的严格条件下的杂交条件，例如可列举出2×SSC/30℃之后，以1×SSC/0.1％SDS/30～50℃清洗一次以上。
作为编码包含序列号6表示的氨基酸序列的多肽的等同物的多核苷酸的优选例，可列举出包含序列号9表示的碱基序列的多核苷酸(小鼠直向同源物)、包含序列号13表示的碱基序列的多核苷酸(大鼠直向同源物)。
作为编码包含序列号8表示的氨基酸序列的多肽的等同物的多核苷酸的优选例，可列举出包含序列号11表示的碱基序列的多核苷酸(小鼠直向同源物)、包含序列号15表示的碱基序列的多核苷酸(大鼠直向同源物)。
2.切割型DANCE，以及编码该切割型DANCE的多核苷酸的制备方法
2.1.非切割方法
本发明的多核苷酸，可由已公知的方法制备。例如，编码包含序列号6或序列号8表示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，可由从其表达部位(例如心脏、卵巢、结肠等)提取总RNA，从mRNA制备cDNA之后，使用适当的引物进行PCR而克隆。又，编码包含序列号6或序列号8表示的氨基酸序列的多肽的等同物的多核苷酸，可由于如上述克隆的多核苷酸中引入突变而制备。作为诱变法，例如合成寡核苷酸定点诱变法(带缺口的双链体(gapped duplex))法、随机引入点突变的方法(例如以亚硝酸或亚硫酸处理)、盒式诱变法、接头扫描法、错配引物法等方法。
又，本发明的多肽也可由已公知的方法制备。例如，于表达载体中插入如上述制备的本发明的多核苷酸，将得到的重组载体导入适当的宿主细胞中、得到转化体之后，培养转化体，产生本发明的多肽，然后可回收本发明的多肽。本发明还提供一种重组载体，以及导入该载体的转化体。
作为表达载体没有特别的限制，可在原核细胞和/或真核细胞的各种宿主细胞中表达编码本发明的多肽的基因，且产生这些多肽即可。例如，可列举出质粒载体、病毒载体(如腺病毒、反转录病毒)等。
使用细菌，特别是大肠杆菌作为宿主细胞时，表达载体一般至少由启动子-操纵基因、起始密码子、编码本发明多肽的DNA、终止密码子、终止子区域以及可复制单位构成。
使用酵母、动物细胞或昆虫细胞作为宿主时，表达载体优选至少含有启动子、起始密码子、编码本发明多肽的DNA、终止密码子。又，还可含有增强子序列、编码本发明多肽的基因的5’端以及3’端的非翻译区、剪接接合区、聚腺苷酸化位点、选择标记区或可复制单位等。又，根据需要还可含有常用的基因扩增基因(标记)。
细菌中用以表达本发明的多肽的启动子-操纵基因，含有启动子、操纵基因以及Shine-Dalgarno(SD)序列(如AAGG等)。例如宿主为大肠杆菌属细菌时，可示例优选含有Trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子、tac启动子等的大肠杆菌。作为酵母中用以表达本发明的多肽的启动子，可列举出：PH05启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子；宿主为芽孢杆菌属细菌时，可列举出：SL01启动子、SP02启动子、penP启动子等。又，宿主为哺乳动物细胞等的真核细胞时，可列举出：来自SV40的启动子、反转录病毒的启动子、热激启动子等。
关于终止子区域、可复制单位、增强子序列、聚腺苷酸化位点以及剪接接合位点，可使用已公知的物质。
作为选择标记，可使用已公知的物质。例如可示例：四环素、氨苄青霉素或卡那霉素等抗生素抗性基因等。
作为基因扩增基因，例如：二氢叶酸还原酶(DHFR)基因、胸苷激酶基因、新霉素抗性基因、谷氨酸合成酶基因、腺苷脱氨酶基因、鸟氨酸脱羧酶基因、潮霉素B磷酸转移酶基因、天冬氨酸转氨甲酰酶基因等。
本发明的重组载体，可通过将至少上述的启动子、起始密码子、编码本发明的多肽的DNA、终止密码子以及终止子区域连续且环状地连接于适当的可复制单位而制备。此时，根据需要可使用由限制酶的消化或使用T4DNA连接酶连接等常用方法产生的适当的DNA片段(例如，连接体、其他的限制酶酶切位点等)。
本发明的转化体，可通过于宿主细胞中引入上述的重组载体而制备。
作为转化体的制备中使用的宿主细胞，只要适合上述的表达载体，且可转化则无特别的限制，可示例：本发明的背景技术中通常使用的天然细胞或人工建立的重组细胞等各种细胞(例如，细菌(埃希氏杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌))、酵母(酵母菌属、毕赤氏酵母菌属等)、动物细胞或昆虫细胞(优选Sf9)等。
表达载体向宿主细胞的引入可使用已公知的方法进行。例如，对于动物细胞，如可根据Graham的方法(Virology，Vol.52，p.456，1973)进行转化；对于昆虫细胞，如可根据Summers等的方法(Mol.Cell.Biol.，Vio.3，p.2156-2165，1983)进行转化。
本发明的多肽，可通过用营养培养基培养含有如上述制备的表达载体的转化体而制备。
营养培养基优选含有转化体生长所必需的碳源、无机氮源或有机氮源。作为碳源，例如：葡萄糖、葡聚糖、可溶性淀粉、蔗糖等；作为无机氮源或有机氮源，例如：铵盐类、硝酸盐类、氨基酸、玉米浆、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、豆饼、马铃薯提取液等。根据需要也可含有其他的营养素(例如，无机盐(如氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁)、维生素类、抗生素(如四环素、新霉素、氨苄青霉素、卡那霉素等)等)。
转化体的培养可由已公知的方法进行。培养条件，如温度、培养基的pH值以及培养时间，可适宜选择以便可大量生产本发明的多肽。
再者，下面示例对应于宿主细胞使用的具体的培养基以及培养条件，但并不限定于此。
宿主为动物细胞时，作为培养基例如可使用含约5～20％的胎牛血清的MEM培养基(Science，Vol.122，p.501，1952)、DMEM培养基(Virology，Vol.8，p.396，1959)、RPMI1640培养基(J.Am.Med.Assoc.，Vol.199，p.519，1967)、199培养基(proc.Soc.Exp.Biol.Med.，Vol.73，p.1，1950)等。培养基的pH值优选约6～8，培养在通常约30～40℃下进行约15～72小时，根据需要可进行通气或搅拌。
宿主为昆虫细胞时，例如可列举含胎牛血清的Grace’s培养基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.82，p.8404.1985)等，其pH值优选约5～8。培养在通常约20～40℃下进行15～100小时，根据需要可进行通气或搅拌。
宿主为细菌、放线菌、酵母、线状菌时，例如含有上述营养源的液体培养基较合适。优选pH值为5～8的培养基。
宿主为大肠杆菌时，作为优选培养基可示例：LB培养基、M9培养基(Miller等，Exp.Mol.Genet，Cold Spring HarborLaboratory，p.431，1972)等。此时，培养根据需要进行通气、搅拌，同时在通常14～43℃下进行约3～24小时。
宿主为芽孢杆菌属细菌时，根据需要进行通气、搅拌，同时在通常30～40℃下进行约16～96小时。
宿主为酵母时，作为培养基，例如可列举Burkholder基本培养基(Bostian，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.77，p.4505，1980)，优选pH值为5～8。培养在通常约20～35℃下进行约14～144小时，根据需要可进行通气或搅拌。
本发明的多肽，可从经培养的如上述的转化体回收，优选分离、纯化。
作为分离、纯化方法，例如盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法；透析、超滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量的差异的方法；离子交换色谱法及羟基磷灰石色谱法等利用电荷的方法；亲和色谱法等利用特异的亲和性的方法；逆相高效液相色谱法等利用疏水性差异的方法；等电点电泳等利用等电点差异的方法等。
又，通过在转化体中产生附有标记物(例如，组氨酸标记物、Flag标记物)等的多肽，且使用对该标记物具有亲和性的物质(例如，Ni2+树脂、对标记物特异的抗体)，可更简便地分离、纯化本发明的多肽。
进一步，本发明的多肽可在无细胞体系中合成。无细胞体系中的本发明的多肽的合成，例如可使用大肠杆菌、兔网织红细胞、麦胚提取液等。又，本发明的多肽可由固相合成法、液相合成法等已公知的有机化学的方法制备。
2.2.切割方法
又，本发明的多肽，通过使DANCE与DANCE特异的蛋白酶接触，切割DANCE而得到。本发明还进一步提供这种切割方法。
本方法中DANCE与DANCE特异的蛋白酶的接触，只要是在序列号2表示的氨基酸序列中第77位与第78位氨基酸之间切割，则可以为任何形式，作为达成该切割的接触形式，例如可列举培养表达DANCE以及DANCE特异的蛋白酶两者的细胞。该细胞的培养，可基于上述转化体的培养进行。
表达DANCE以及DANCE特异的蛋白酶两者的细胞，只要表达这两种蛋白质即可并无特别的限制。这种细胞，例如可通过将DANCE特异的蛋白酶表达载体引入DANCE表达细胞(如，天然表达DANCE的细胞，或由于基因操作而可能表达DANCE的细胞)中、将DANCE表达载体引入DANCE特异的蛋白酶表达细胞中、将DANCE表达载体以及DANCE特异的蛋白酶表达载体引入任意的细胞中等而制备。
又，以增强表达为目的，可在DANCE和/或DANCE特异的蛋白酶的表达细胞中分别引入DANCE和/或DANCE特异的蛋白酶的表达载体。
DANCE表达细胞可以是原代培养细胞或细胞系。作为DANCE的主要表达部位，没有特别的限制，例如已知心脏、肾脏、胰腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、动脉、肺、子宫、皮肤，所以来自这些表达部位相应的组织的细胞本身，或从其衍生的细胞可用作DANCE表达细胞使用。原代培养细胞、细胞系可由已公知的方法制备(如，参照CurrentProtocols in Cell Biology，John Wiley&Sons，Inc.(2001)；機能細胞の分離と培養，丸善書店(1987))。
关于DANCE特异的蛋白酶表达细胞，为原代培养细胞、细胞系均可。例如确认在皮肤成纤维细胞、293T细胞等细胞，以及肺、皮肤等组织中DANCE特异的蛋白酶的表达，所以这些细胞本身，或来自这些组织的细胞，或从该等衍生的细胞，可作为DANCE特异的蛋白酶表达细胞使用。又，在评价某细胞是否具有DANCE切割活性的结果表明，其是具有DANCE切割活性的细胞后，也可将其作为DANCE特异的蛋白酶表达细胞使用。本发明还提供一种使用动物细胞(如人细胞等哺乳动物细胞)鉴定这种DANCE特异的蛋白酶表达细胞的方法。
作为本切割方法中使用的细胞种类，可使用与上述转化体制备中使用的宿主相同种类的细胞，其中优选昆虫细胞、动物细胞(如哺乳动物细胞)。
DANCE表达载体，可由与表达本发明的多肽的载体相同的方法制备。
DANCE特异的蛋白酶表达载体，可由后述DANCE特异的蛋白酶的筛选方法中所示的方法制备。再者，DANCE特异的蛋白酶表达载体，在后述的表达筛选中，可从DANCE特异的表达载体浓缩的转化体得到，也可作为与除DANCE特异的蛋白酶以外的基因产物表达载体的混合物使用。
作为本切割方法中接触的其他形式，可列举向含DANCE特异的蛋白酶的组分中添加DANCE。含DANCE特异的蛋白酶的的组分，只要具有DANCE的切割活性即可并无特别的限制，例如可列举：DANCE特异的蛋白酶表达细胞的培养上清液、该细胞的提取液、表达DANCE特异的蛋白酶的组织的提取液、该培养上清液或提取液的粗纯化溶液等。又，DANCE特异的蛋白酶分离纯化时，也可以通过含DANCE的组分或分离的DANCE与分离的DANCE特异的蛋白酶的混合，来进行DANCE的切割。
DANCE特异的蛋白酶对DANCE的切割，可采用抗DANCE抗体的免疫学手法(如，免疫沉淀法、蛋白质印迹法)等确认。
本切割方法，不仅用于本发明的多肽的制备，还可在本发明的筛选方法中作为指标应用。
3.抗由DANCE的切割产生的N末端以及C末端多肽的抗体
本发明还提供一种抗由DANCE特异的蛋白酶对DANCE的切割产生的N末端的多肽(即，包含序列号6表示的氨基酸序列的多肽或其同等物)的抗体，以及抗产生的C末端的多肽(即，包含序列号8表示的氨基酸序列的多肽或其同等物)的抗体。
作为本发明的抗体的制备中使用的抗原，可使用包含序列号6或序列号8表示的氨基酸序列的多肽或其同等物，或者其部分肽。作为部分肽，只要具有抗原性即可并无特别限制，例如由选自序列号6或序列号8表示的氨基酸序列，或与序列号6或序列号8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列中的至少6个，优选至少8个，更优选至少10个，进一步优选至少15个以上的连续的氨基酸组成的多肽。
本发明的抗体，可为多克隆抗体或单克隆抗体，可由众所周知的免疫学手法制备。该抗体，不仅可以是完整的抗体分子，而且可以是片段只要其具有对于本发明的蛋白质的抗原结合位点(CDR)，例如可列举Fab、F(ab’)2、ScFv、minibody等。
例如，多克隆抗体，可通过将上述抗原(根据需要，也可于牛血清蛋白、KLH(匙孔血蓝蛋白，Keyhole Limpet Hemocyanin)等载体蛋白上交联形成复合体)，与市售的佐剂(例如，完全或不完全弗氏佐剂)一起，于动物皮下或腹腔内每隔2～3周给药2～4次左右(由众所周知的抗原抗体反应测定部分采血的血清的抗体效价，确认其上升)，自最终免疫约3～10天后取全血纯化抗血清而得到。作为给予抗原的动物，可列举：大鼠、小鼠、家兔、山羊、豚鼠、仓鼠等哺乳动物。
又，单克隆抗体，可由细胞融合法制得。例如将上述抗原与市售佐剂一起2～4次于小鼠皮下或腹腔内给药，最终给药的3天后摘取脾脏或淋巴结，取白细胞。将该白血球和骨髓瘤细胞(例如，NS-1、P3X63Ag8等)进行细胞融合得到对于该因子产生单克隆抗体的杂交瘤。细胞融合可为PEG法或电压脉冲法。产生期望的单克隆抗体的杂交瘤，可通过使用众所周知的EIA或RIA法等从培养液上清中检测与抗原特异的结合的抗体而进行选择。产生单克隆抗体的杂交瘤的培养，可在体外，或者小鼠或大鼠，优选小鼠腹水中等的体内进行，抗体可分别从杂交瘤的培养上清液以及动物的腹水中取得。
进一步，本发明的抗体，可为嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体。嵌合抗体，可参考例如“实验医学(临时增刊号)，Vol.6，No.10，1988”、日本专利特公平3-73280号公报等进行制备；人源化抗体，可参考例如特表平4-506458号公报、特开昭62-296890号公报等进行制备；人抗体，可参考例如“NatureGenetics，Vol.15，p.146-156，1997”、“Nature Genetics，Vol.7，p.13-21，1994”、日本专利特表平4-504365号公报、WO94/25585号公报、“日経サィェンス，6月号，第40～50页，1995年”、“Nature，Vol.368，p.856-859，1994”、特表平6-500233号公报等进行制备。
本发明的抗体，可特异的检出或抑制本发明的多肽之一，所以例如用以实施本发明的筛选方法，以及作为弹性纤维形成调节剂及关于DANCE的研究·诊断用试剂有用。
4.DANCE切割量以及切割活性的测定方法、试剂盒
本发明提供一种以测定由DANCE特异的蛋白酶对DANCE的切割量和/或切割活性为特征的方法，其中提供一种在来自动物的生物样品中测定由DANCE特异的蛋白酶对DANCE的切割量为特征的方法，以及该测定中所使用的试剂盒。
本方法中，使用来自动物的生物样品时，使用的动物为温血动物即可，并无特别限制，例如可为哺乳动物。哺乳动物没有特别的限制，例如可列举：人、牛、羊、猪、山羊、猴子、家兔、大鼠、仓鼠、豚鼠以及小鼠。
生物样品，为可从上述动物取得的样品即可并无特别限制。作为生物样品，例如可列举从皮肤、动脉、肺、子宫等组织取得的样品。
DANCE切割量可由已公知的方法测定。例如DANCE切割量可通过使用抗DANCE抗体的免疫学方法(例如蛋白质印迹法)测定。该情形，不限于上述本发明的抗体，还可使用任意的抗DANCE抗体(例如，使用跨过DANCE的切割位点的部分肽作为抗原制备的抗体)。该抗体，可基于上述抗体的制备方法进行制备。
DANCE切割量的测定中使用抗DANCE抗体时，例如可通过使用标记的抗DANCE抗体，或并用抗DANCE抗体和标记的2次抗体，测定DANCE切割量。
作为抗DANCE抗体的标记，可列举：碱性磷酸酶、葡糖氧化酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶等酶，荧光物质等。这些标记与抗DANCE抗体的结合可采用已公知的方法，例如戊二醛法、马来酰亚胺法等进行。
标记是酶时，作为底物，选择与所选酶相对应的适当的底物。例如，作为酶选择碱性磷酸酶时，可列举使用对硝基苯磷酸(PNPP)等，作为此时的显色剂，可使用邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)等。又，关于清洗液、反应终止液、底物溶解液，也没有特别的限制，可根据所选的酶，适宜使用已公知的物质。
又，DANCE的切割活性，例如，通过构建、使用具有DANCE切割位点的多肽的一端结合荧光分子，另一端结合猝灭剂，仅在产生切割时发出荧光的系统，进行测定。这种系统的构建，可采用已公知的方法进行。
作为DANCE切割活性的测定中使用的荧光分子，只要可评价DANCE切割活性即可并无特别限制，例如可列举：FITC、6-FAM、HEX、TET、EDANS、Alexa(注册商标)Fluor(Invitrogen)等。
作为DANCE切割活性的测定中使用的猝灭剂，只要可评价DANCE切割活性即可并无特别限制，例如可列举：TAMRA、Dabcyl、Eclipse、QSY猝灭剂色素(Invitrogen)等。
本发明的测定方法，例如实施本发明的筛选方法，以及使弹性纤维形成的状态中的诊断，特别是使分子水平的解析变得可能，故是有用的。
又，本发明涉及一种可用于测定DANCE切割量和/或切割活性的试剂盒。
可用于测定DANCE切割量的本发明的试剂盒，除上述抗DANCE抗体之外，还可含有DANCE、2次抗体、标记酶的底物、生物样品的处理中必要的试剂等。作为对照该试剂盒还可含有通过DANCE的切割产生的多肽(即，本发明的多肽)的一种，或两种。该试剂盒，还可含有标明DANCE切割活性可作为弹性纤维形成的指标的观点的说明书。
本发明的测定用试剂盒，提供了可简便地测定DANCE切割量和/或切割活性的方法，故是有用的。
5.DANCE突变体，编码该DANCE突变体的多核苷酸
又，本发明提供一种在DANCE特异的蛋白酶对DANCE的切割位点诱发氨基酸突变，所形成的对该蛋白酶显示出抗性的DANCE突变体，以及编码该多肽的多核苷酸。
本发明的DANCE突变体，其特征在于，为了显示对DANCE特异的蛋白酶的抗性在序列号2或序列号4表示的氨基酸序列中，或在与序列号2或序列号4表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列中，蛋白酶酶切位点(Arg-Gly：相当于序列号2表示的氨基酸序列中第77位～第78位的氨基酸，以及序列号4表示的氨基酸序列中第54位～第55位的氨基酸)或其附近的氨基酸(例如，序列号2表示的氨基酸序列中第70位～第85位，优选第72位～第83位，更优选第74位～第81位，进一步优选第76位～第79位的氨基酸；或者序列号4表示的氨基酸序列中第47位～第62位，优选第49位～第60位，更优选第51位～第59位，进一步优选第53位～第56位的氨基酸)发生突变(例如，缺失、附加、取代)。这里的“基本上同一”与上文中所述的意思相同。
“对DANCE特异的蛋白酶显示出抗性”，是指DANCE特异的蛋白酶对DANCE的切割能力，在其发生突变后降低(例如降低75％以下，优选50％以下)，切割能力的降低程度没有特别的限制。DANCE突变体是否对DANCE特异的蛋白酶显示出抗性，可由上述切割方法进行正常DANCE、DANCE突变体的切割处理之后，测定·比较正常DANCE、DANCE突变体的切割量而确认。
作为本发明的DANCE突变体，例如可列举：由序列号2表示的氨基酸序列中，或与序列号2表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列中，第77位的精氨酸被丙氨酸取代的氨基酸序列组成的多肽；以及由序列号4表示的氨基酸序列中，或与序列号4表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列中，第54位的精氨酸被丙氨酸取代的氨基酸序列组成的多肽。
本发明还提供一种含本发明的DANCE突变体的重组载体，以及含该载体的转化体。
本发明的DANCE突变体以及编码该突变体的多核苷酸，例如作为本发明的筛选方法中的负对照，以及作为弹性纤维形成调节剂(例如用于弹性纤维的形成)以及研究用试剂有用。
6.DANCE复合体
6.1含有至少2个DANCE的DANCE复合体(复合体I)
本发明提供一种含有至少2个DANCE的DANCE复合体(复合体I)。
本复合体I可进一步含有赖氨酰氧化酶和/或LTBP2。赖氨酰氧化酶和/或LTBP2可如后述制备。
本复合体I还可进一步含有整联蛋白和/或赖氨酰氧化酶样-1。作为本发明中可使用的整联蛋白，可列举各种整联蛋白，其中优选α5β1、αubβ3、全部的αvβ、α9β1。这些整联蛋白以及赖氨酰氧化酶样-1，及其表达部位是众所周知的，基因的克隆、表达细胞的制备可由已公知的方法进行。
优选复合体I含有可识别形态的至少2种类的DANCE。这里“可识别的形态”是指，至少2个DANCE存在差异，该差异可检出。作为DANCE的可识别形态的组合，可示例：标记DANCE与非标记DANCE的组合、2个不同的标记DANCE的组合。
DANCE的标记，只要标记体与非标记体或不同种类标记体可识别即可并无特别的限制，例如可列举：由表位标记、由放射性同位素(例如，35S)标记。
作为DANCE的标记中使用的表位，例如可列举出：谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、流感血凝素(HA)、硫氧还蛋白(Trx)、组氨酸(His)标记物、FLAG标记物、Myc标记物等。
本发明的复合体I可进一步含有选自赖氨酰氧化酶、LTBP2、整联蛋白、以及赖氨酰氧化酶样-1中的1个以上的情形，其可标记也可不标记。
表位标记DANCE，可由已公知的方法制备。例如于编码表位的核苷酸上适宜地连接编码DANCE的多核苷酸，制备DNA构建物，通过在宿主细胞中表达该DNA构建物而制备表位标记DANCE。另一方面，放射性同位素(例如，35S)标记DANCE，可由含有放射性同位素的培养基培养DANCE表达细胞而制备。
本发明还提供一种上述复合体I的制备方法。复合体I的制备方法的特征在于使至少2个DANCE接触而形成复合体。
又，制备复合体I时，也可进一步使之与赖氨酰氧化酶和/或LTBP2接触。也可进一步与整联蛋白和/或赖氨酰氧化酶样-1接触。
复合体I的形成，可由DANCE的制备(即，伴随着DANCE的制备的必然的结合)，或着由分别制备的至少2种的DANCE(标记DANCE-非标记DANCE、2个不同的标记DANCE)的接触而完成。
更具体的是，复合体I的形成，可由分离的DANCE(例如，可识别形态)与分离的DANCE的接触，以及将DANCE表达载体引入DANCE表达细胞(含体外，体内)等而完成。
复合体I，特别是含有可识别形态的至少2种DANCE的复合体，以及该复合体的制备方法，在可调节DANCE复合体的形成的物质的筛选方法中作为指标，以及作为弹性纤维形成调节剂及关于DANCE的研究用试剂有用。
6.2.含至少1个DANCE以及赖氨酰氧化酶的DANCE复合体(复合体II)
本发明提供一种含至少1个DANCE以及赖氨酰氧化酶的DANCE复合体(复合体II)。
本复合体II可进一步含有DANCE(例如，可识别形态的DANCE)和/或LTBP2。本复合体II还可进一步含有整联蛋白和/或赖氨酰氧化酶样-1。再者，LTBP2、整联蛋白、赖氨酰氧化酶样-1可分别如上述标记，也可不标记。
本发明还提供一种上述复合体II的制备方法。复合体II的制备方法的特征在于将至少1个DANCE与赖氨酰氧化酶接触而形成复合体。
又，制备复合体II时，也可进一步与DANCE(例如，可识别形态的DANCE)和/或LTBP2接触。进一步，也可与整联蛋白和/或赖氨酰氧化酶样-1接触。
复合体II的形成，例如可由未标记DANCE与未标记赖氨酰氧化酶的接触、未标记DANCE与标记赖氨酰氧化酶的接触、标记DANCE与未标记赖氨酰氧化酶的接触、具有同种的标记的DANCE与赖氨酰氧化酶的接触、或者分别具有不同标记的DANCE与赖氨酰氧化酶的接触而完成。
更具体的是，复合体II的形成，可由分离的DANCE与分离的赖氨酰氧化酶的接触、将赖氨酰氧化酶表达载体引入DANCE表达细胞，以及将DANCE表达载体导入赖氨酰氧化酶表达细胞(含体外，体内)等而完成。
赖氨酰氧化酶，及其表达部位是众所周知的。因此，赖氨酰氧化酶表达载体，以及赖氨酰氧化酶表达细胞(例如，原代培养细胞、细胞系)可由已公知的方法制备。例如，确认赖氨酰氧化酶在血管平滑肌、皮肤、成纤维细胞等细胞，以及动脉、皮肤、肺、子宫等组织中表达，所以从这些细胞、组织可克隆赖氨酰氧化酶基因，又，可制备赖氨酰氧化酶表达细胞。
复合体II，以及该复合体的制备方法，在可调节DANCE复合体的形成的物质的筛选方法中作为指标，以及作为弹性纤维形成调节剂以及关于DANCE的研究用试剂有用。
6.3.含至少1个DANCE以及LTBP2的DANCE复合体(复合体III)
本发明提供一种含至少1个DANCE以及LTBP2的DANCE复合体(复合体III)。
本复合体III可进一步含有DANCE(例如，可识别形态的DANCE)和/或赖氨酰氧化酶。本复合体III还可进一步含有整联蛋白和/或赖氨酰氧化酶样-1。再者，赖氨酰氧化酶、整联蛋白、赖氨酰氧化酶样-1可分别如上述标记，也可不标记。
本发明还提供一种上述复合体III的制备方法。复合体III的制备方法的特征在于将至少1个DANCE与LTBP2接触而形成复合体。
又，制备复合体III时，也可进一步与DANCE(例如，可识别形态的DANCE)和/或赖氨酰氧化酶接触。进一步，也可与整联蛋白和/或赖氨酰氧化酶样-1接触。
复合体III的形成，例如可由未标记DANCE与未标记LTBP2的接触、未标记DANCE与标记LTBP2的接触、标记DANCE与未标记LTBP2的接触、具有同种的标记的DANCE与LTBP2的接触、或者分别具有不同标记的DANCE与LTBP2的接触而完成。
更具体的是，复合体III的形成，可由分离的DANCE与分离的LTBP2的接触，以及将LTBP2表达载体引入DANCE表达细胞，以及将DANCE表达载体导入LTBP2表达细胞(含体外，体内)等而完成。
LTBP2及其表达部位是众所周知的。因此，LTBP2表达载体，以及LTBP2表达细胞(例如，原代培养细胞、细胞系)可由已公知的方法制备。例如，确认LTBP2在血管平滑肌细胞、皮肤成纤维细胞等细胞，以及动脉、皮肤、肺、子宫等组织中表达，所以从这些细胞、组织可克隆LTBP2基因，又，可制备LTBP2表达细胞。
复合体III以及该复合体的制备方法，在可调节DANCE复合体的形成的物质的筛选方法中作为指标，以及作为弹性纤维形成调节剂及关于DANCE的研究用试剂有用。
7.筛选方法
本发明提供各种筛选方法。本发明的筛选方法大致分为可调节DANCE特异的蛋白酶的活性的物质的筛选方法(筛选方法I、II)、可调节DANCE复合体的形成的物质的筛选方法(筛选方法III～V)、DANCE特异的蛋白酶的筛选方法(筛选方法VI)。以下详述各种筛选方法。
7.1.可调节DANCE特异的蛋白酶的活性的物质的筛选方法(体外)(筛选方法I)
筛选方法I，只要不使用动物评价DANCE特异的蛋白酶的活性即可并无特别的限制，例如含有以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)将被检物质与DANCE特异的蛋白酶接触的步骤；
(b)测定由上述(a)步骤产生的DANCE特异的蛋白酶的活性，将该活性与未接触被检物质的情况下的DANCE特异的蛋白酶的活性进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的比较结果，对调节DANCE特异的蛋白酶活性的被检物质进行选择的步骤。
再者，可调节DANCE特异的蛋白酶的活性的物质，不仅包含称为DANCE特异的蛋白酶的激动剂、拮抗剂，还包含就本筛选方法I的本质而言，可改变DANCE特异的蛋白酶的表达量的物质。
步骤(a)中，作为被检物质，可为任意众所周知的化合物以及新型化合物，例如可列举：核酸、糖类、脂质、蛋白质、肽、有机低分子化合物、采用组合化学技术制备的化合物文库、由固相合成或噬菌体展示法制备的随机肽文库、或者来自微生物、动植物、海洋生物等的天然成分等。
被检物质与DANCE特异的蛋白酶的接触，与“2.2.切割方法”中所述的接触相同。
步骤(b)中，DANCE特异的蛋白酶的活性，可基于DANCE切割量和/或切割活性进行评价。例如，DANCE切割量以及切割活性，可由“4.DANCE切割量以及切割活性的测定方法、试剂盒”中所述的方法进行测定。
DANCE切割量和/或切割活性的比较，可基于被检物质的存在或不存在的情况下、DANCE切割量和/或切割活性有无显著性差异而进行。再者，被检物质不存在下DANCE切割量和/或切割活性，可在被检物质存在下DANCE切割量和/或切割活性的测定之前测定，也可同时测定，但从实验的精密度、重现性观点考虑，优选两者同时测定。
然后，步骤(c)中，选择可调节DANCE特异的蛋白酶的活性的被检物质。这样选择的被检物质，作为弹性纤维形成调节剂或研究用试剂有用。例如抑制DANCE特异的蛋白酶的活性的物质，对维持弹性纤维形成有用。
7.2.可调节DANCE特异的蛋白酶的活性的物质的筛选方法(体内)(筛选方法II)
筛选方法II，只要是使用动物评价DANCE特异的蛋白酶活性即可并无特别限制，例如，包含以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)给予动物被检物质的步骤；
(b)测定由上述(a)步骤产生的DANCE特异的蛋白酶的活性，将该活性与未给予被检物质的情形的DANCE特异的蛋白酶的活性进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的结果，对调节DANCE特异的蛋白酶活性的被检物质进行选择的步骤。
再者，可调节DANCE特异的蛋白酶的活性的物质，不仅包含称为DANCE特异的蛋白酶的激动剂、拮抗剂，还包含就本筛选方法II的本质而言，可改变DANCE特异的蛋白酶的表达量的物质。
步骤(a)中，作为被检物质，可使用与筛选方法I中相同的物质。
被检物质对动物的给药，可由已公知的方法进行。给药量·频率、给药期间可任意设定。再者，本方法适用的动物，与“4.DANCE切割量的测定方法、试剂盒”中所述的动物相同。
步骤(b)中，DANCE特异的蛋白酶的活性，例如可基于从对象动物采取生物样品后，该生物样品中的DANCE切割量进行评价。生物样品、DANCE切割量的测定方法，与“4.DANCE切割量的测定方法、试剂盒”中所述的相同。
DANCE切割量的比较，基于被检物质给药时、未给药时，DANCE切割量有无显著性差异而进行。再者，被检物质未给药时的DANCE切割量，可在被检物质给药时的DANCE切割量的测定之前测定，也可与之同时测定，但从实验的精密度、再现性的观点考虑，优选二者同时测定。
然后，步骤(c)中，选择可调节DANCE特异的蛋白酶的活性的被检物质。这样选择的被检物质，作为弹性纤维形成调节剂或研究用试剂有用。例如抑制DANCE特异的蛋白酶的活性的物质，对维持弹性纤维形成有用。
7.3.可调节含有至少2个DANCE的DANCE复合体(复合体I)的形成的物质的筛选方法(筛选方法III)
筛选方法III，只要可评价复合体I的形成即可并无特别的限制，例如，包含以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)被检物质存在下，至少2个DANCE相接触的步骤；
(b)测定由上述(a)步骤产生的DANCE复合体的量，将该量与不存在被检物质的情形的DANCE复合体的量进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的比较结果，对调节DANCE复合体的形成的被检物质进行选择的步骤。
步骤(a)中，作为被检物质，可使用与筛选方法I中相同的物质。
至少2个DANCE的接触，与“6.1.含有至少2个DANCE的DANCE复合体(复合体I)”中所述的接触相同。再者，本筛选方法III中优选使用可识别形态的DANCE。
步骤(b)中，复合体I的量，例如可由并用免疫沉淀法(例如参照实施例6)和光密度测定法；表面等离振子共振等相互作用解析法；基于ELISA的方法等进行测定。
复合体I的量的比较，可基于被检物质存在或不存在下，复合体I的量有无显著性差异而进行。再者，被检物质不存在下复合体I的量，可在被检物质存在下复合体I的量的测定之前测定，也可与之同时测定，但从实验的精密度、再现性的观点考虑，优选二者同时测定。
然后，步骤(c)中，选择可调节复合体I的形成的被检物质。这样选择的被检物质，作为弹性纤维形成调节剂或研究用试剂有用。例如促进复合体I的形成的物质，在弹性纤维形成中有用。
7.4.可调节含有至少1个DANCE以及赖氨酰氧化酶的DANCE复合体(复合体II)的形成的物质的筛选方法(筛选方法IV)
筛选方法IV，只要可评价复合体II的形成即可并无特别的限制，例如，包含以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)被检物质存在下，使至少1个DANCE与赖氨酰氧化酶接触的步骤；
(b)测定由上述(a)步骤产生的DANCE复合体的量，将该量与不存在被检物质的情形的DANCE复合体的量进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的比较结果，对调节DANCE复合体的形成的被检物质进行选择的步骤。
步骤(a)中，作为被检物质，可使用与筛选方法I中相同的物质。
至少1个DANCE与赖氨酰氧化酶的接触，与“6.2.含有至少1个DANCE以及赖氨酰氧化酶的DANCE复合体(复合体I)”中所述的接触相同。
步骤(b)中，复合体II的量，例如可由并用免疫沉淀法(例如参照实施例7)和光密度测定法；表面等离振子共振等相互作用解析法；基于ELISA的方法等进行测定。
复合体II的量的比较，可基于被检物质存在或不存在下，复合体II的量有无显著性差异而进行。再者，被检物质不存在下复合体II的量，可在被检物质存在下复合体II的量的测定之前测定，也可与之同时测定，但从实验的精密度、再现性的观点考虑，优选二者同时测定。
然后，步骤(c)中，选择可调节复合体II的形成的被检物质。这样选择的被检物质，作为弹性纤维形成调节剂或研究用试剂有用。
7.5.可调节含有至少1个DANCE以及LTBP2的DANCE复合体(复合体III)的形成的物质的筛选方法(筛选方法V)
筛选方法V，只要可评价复合体III的形成即可并无特别的限制，例如，包含以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)被检物质存在下，使至少1个DANCE与LTBP2接触的步骤；
(b)测定由上述(a)步骤产生的DANCE复合体的量，将该量与不存在被检物质的情形的DANCE复合体的量进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的比较结果，对调节DANCE复合体的形成的被检物质进行选择的步骤。
步骤(a)中，作为被检物质，可使用与筛选方法I中相同的物质。
至少1个DANCE与LTBP2的接触，与“6.3.含有至少1个DANCE以及LTBP2的DANCE复合体(复合体III)”中所述的接触相同。
步骤(b)中，复合体III的量，例如可由并用免疫沉淀法(例如参照实施例6)和光密度测定法；表面等离振子共振等相互作用解析法；基于ELISA的方法等进行测定。
复合体III的量的比较，可基于被检物质存在或不存在下，复合体III的量有无显著性差异而进行。再者，被检物质不存在下复合体III的量，可在被检物质存在下复合体III的量的测定之前测定，也可与之同时测定，但从实验的精密度、再现性的观点考虑，优选二者同时测定。
然后，步骤(c)中，选择可调节复合体III的形成的被检物质。这样选择的被检物质，作为弹性纤维形成调节剂或研究用试剂有用。
7.6.DANCE特异的蛋白酶的筛选方法(筛选方法VI)
筛选方法VI的特征在于以DANCE的切割活性为指标筛选DANCE特异的蛋白酶。
DANCE特异的蛋白酶，例如可从表达该蛋白酶的细胞得到。DANCE特异的蛋白酶表达细胞，与“2.2.切割方法”中所述的细胞相同。
例如，作为筛选方法VI，可使用表达克隆的方法(例如，参照Molecular Cloning(第二版)；Current protocols in Molecular Biology(第3版)，Acad.Press(1993)；Antibody Engineering：A PracticalApproach，IRL Press at Oxford University Press(1996))。
具体的是，通过从DANCE特异的蛋白酶表达细胞制备cDNA，且将该cDNA插入适当的表达载体的启动子的下游，制备重组表达载体，制备cDNA文库。通过将该重组表达载体引入该载体适合的宿主细胞中，制备表达来自DANCE特异的蛋白酶表达细胞的基因产物的转化体，从该转化体中选择产生DANCE特异的蛋白酶的转化体。然后，通过确定引入产生DANCE特异的蛋白酶的转化体中的cDNA编码的基因序列，可得到DANCE特异的蛋白酶。
作为本筛选方法VI中使用的宿主细胞，可使用任何不具有DANCE的切割活性，或DANCE的切割活性极低的细胞。某细胞是否具有DANCE的切割活性，可藉向该细胞中引入DANCE表达载体，确认有无对表达的DANCE的切割来评价。
作为cDNA的制备中使用的细胞，可使用DANCE特异的蛋白酶表达细胞，例如，来自皮肤成纤维细胞、293T细胞、动脉平滑肌细胞等细胞，以及肺组织、子宫组织等组织的细胞。
cDNA文库的制备，可采用已公知的方法进行。首先，从DANCE特异的蛋白酶表达细胞，采用酸性硫氰酸胍·苯酚·氯仿(AGPC)法等方法制备总RNA。然后，采用oligo(dT)固定化纤维素柱法等方法，或者使用市售的试剂盒(例如，Quick Prep mRNA PurificationKit(Pharmacia制备))，制备mRNA。然后，从制备的mRNA制备cDNA文库(例如参照Molecular Cloning(第2版)、Current protocols inMolecular Biology(第3版))。作为cDNA文库的制备中使用的表达载体，只要在使用的宿主细胞中可表达插入片段即可，并无特别的限定。
可直接使用制备的cDNA文库，但为了浓缩目标基因，也可使用采用不表达DANCE特异的蛋白酶的细胞的mRNA，实施消减法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85，5783(1988)。)而制备的cDNA文库。
又，选择不表达DANCE的细胞作为宿主细胞时，除如上述制备cDNA以外，还将DANCE表达载体引入宿主细胞。作为将重组载体引入宿主细胞的方法，只要是向动物细胞内引入DNA的方法即可任意使用。例如可列举出：电穿孔法、磷酸钙法、脂质转染法。
通过在培养基中培养如上述得到的转化体，可表达被引入的cDNA编码的基因产物。培养基培养转化体的方法，可根据培养宿主时使用的通常的方法进行。例如，作为培养基，可使用一般使用的RPMIl640培养基、αMEM培养基、DMEM培养基、199培养基，或者在这些培养基中添加胎牛血清等的培养基等。培养通常在pH6～8，30～40℃，5％CO2存在下等条件下进行1～7天。又，培养中根据需要，还可在培养基中添加卡那霉素、青霉素等抗生素。
本筛选方法VI中，培养上述转化体之后，可由采用蛋白质印迹法等方法确认培养上清液中DANCE切割的有无或程度，从而选择产生DANCE特异的蛋白酶的转化体。根据需要，通过重复操作上述步骤，可得到DANCE特异的表达载体得以浓缩的转化体。选择的转化体中引入的cDNA的分离，以及分离的cDNA的基因序列的确定，可采用已公知的方法进行。再者，本发明还提供编码这样得到的DANCE特异的蛋白酶的多核苷酸。
筛选方法VI，还可以表达克隆的方法以外的方法进行。具体的是，通过制备DANCE特异的蛋白酶表达细胞的提取液或培养上清液，并以DANCE的切割活性作为指标分馏该提取液或培养上清液，可纯化DANCE特异的蛋白酶。作为纯化方法，例如可列举出：溶剂萃取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、阴离子交换层析法、阳离子交换层析法、疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、层析聚焦法、等电点电泳等电泳法，或者这些方法的组合。
又，现在人类等的基因组分析已经完成，也可通过基于记录在数据库中的序列，表达部位等信息，同源性检索等手段克隆蛋白酶，并逐一评价各蛋白酶的DANCE切割活性，从而筛选DANCE特异的蛋白酶。再者，得到DANCE特异的蛋白酶，被作为丝氨酸蛋白酶抑制剂抑酶肽抑制的结论。因此，本筛选方法，从偏重效率的观点考虑，优选筛选丝氨酸蛋白酶。
本筛选方法VI，使DANCE特异的蛋白酶的筛选变得可能，故是有用的。又，由该筛选方法得到的DANCE特异的蛋白酶，作为弹性纤维形成调节剂(例如，用以破坏弹性纤维)，在DANCE的切割中，以及用以实施本发明的筛选方法，是有用的。
8.试剂盒
又，本发明，提供含有以下(a)以及(b)的试剂盒。
(a)DANCE，或具有编码DANCE的碱基序列的多核苷酸；
(b)以下(i)～(vi)的至少1种成分；
(i)(a)中DANCE的可识别的形态的DANCE；
(ii)具有编码(a)中DANCE的可识别的形态的DANCE的碱基序列的多核苷酸；
(iii)赖氨酰氧化酶；
(iv)具有编码赖氨酰氧化酶的碱基序列的多核苷酸；
(v)LTBP2；
(vi)具有编码LTBP2的碱基序列的多核苷酸。
又，本发明的试剂盒，可含有标明可以使用本试剂盒以调节弹性纤维的形成，或进行筛选的说明书。
本发明的试剂盒，除上述成分外，还可含有整联蛋白、具有编码整联蛋白的碱基序列的多核苷酸、赖氨酰氧化酶样-1、具有编码赖氨酰氧化酶样-1的碱基序列的多核苷酸。这些可采用已公知的方法制备。
本发明的试剂盒，除上述成分外，还可进一步含有抗DANCE、赖氨酰氧化酶、LTBP2、整联蛋白、赖氨酰氧化酶样-1的抗体。这些抗体，可基于上述的抗体制备法制备。
本发明的试剂盒，可以提供可进行上述筛选方法I～VI，以及关于DANCE的其他的研究等的简单的方法，并且作为弹性纤维调节剂(例如用以形成或维持弹性纤维)有用。
9.弹性纤维形成调节剂
本发明的调节剂，含有本发明的多肽、抗体、DANCE突变体、复合体或构成该复合体的多种成分、DANCE特异的蛋白酶，或其编码多核苷酸等。
本发明的调节剂，可通过添加任意的载体，例如医药上容许的载体，以预防、治疗或改善需要对弹性纤维形成进行调节的状态。
例如，本发明的调节剂，含有形成或再生弹性纤维的成分时，该调节剂，用以预防、治疗或改善需要对弹性纤维形成进行调节的状态，如肺气肿、血管损伤、皮肤松弛、创伤、弹性纤维劣化(如，由衰老或紫外线所引起的)、肌肤龟裂、动脉硬化、大动脉瘤，或者用于美容的目的。
另一方面，本发明的调节剂，含有抑制弹性纤维的形成的成分时，该调节剂，用以预防、治疗或改善需要对弹性纤维形成进行抑制的状态，例如心肌梗塞。
作为医药上容许的载体，例如可列举出：蔗糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纤维素、滑石粉、磷酸钙、碳酸钙等赋形剂；纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚丙基吡咯烷酮、明胶、阿拉伯胶、聚乙二醇、蔗糖、淀粉等粘合剂；羧甲基纤维素、羟丙基淀粉、钠-乙二醇-淀粉、碳酸氢钠、磷酸钙、柠檬酸钙等崩解剂；硬脂酸镁、二氧化硅、滑石粉、十二烷基硫酸钠等润滑剂；柠檬酸、薄荷醇、甘氨酰赖氨酸·铵盐、甘氨酸、橘子粉末等芳香剂；苯甲酸钠、亚硫酸氢钠、羟苯甲脂、羟苯丙酯等防腐剂；柠檬酸、柠檬酸钠、醋酸等稳定剂；甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸铝等混悬剂；表面活性剂等分散剂；水、生理盐水、橙汁等稀释剂；可可油脂、聚乙二醇、精炼煤油等基质蜡等，但并不限定于此。
口服给药中优选的制剂是，在水、生理盐水、橙汁等的稀释剂中溶解有效量的配位体的溶液剂；作为固体或颗粒含有有效量的配位体的胶囊剂、散剂或片剂；在适当的分散溶剂中混悬有效量的配位体的混悬剂；溶解有效量配位体的溶液在适当的分散溶剂中分散乳化的乳剂等。
作为非口服给药(例如，皮下注射、肌肉注射、局部注射、腹腔内给药等)中优选的制剂是，含水或非含水的等渗的无菌注射液制剂，其中还可含有抗氧剂、缓冲液、抑菌剂、等渗剂等。还可列举含水或非含水的无菌混悬液制剂，其中还可含有混悬剂、增溶剂、增粘剂、稳定剂、防腐剂等。该制剂可封入如安瓿或小瓶等单位给药量或多次给药量的容器中。又，可将有效成分以及医药上容许的载体冷冻干燥，以在临使用前于适当的无菌赋形剂中溶解或混悬的状态保存。
本发明的制剂的给药量，根据有效成分的种类·活性、病情的严重度、作为给药对象的动物种类、给药对象的药物可接受性、体重、年龄等而不同，通常作为成年人1天的有效成分量为约0.001～约100mg/kg。
本说明书中列举的全部的出版物中标明的内容，全部引入本说明书中作为参考。
由以下的实施例更具体地说明本发明，但实施例仅为本发明简单的示例，并不限定本发明的范围。
实施例
1.材料以及方法
1.1.表达质粒的构建
本发明中使用的表达质粒，如下述进行制备。再者，这些构建在确认全部碱基序列之后，用于表达实验。
pEF6/ssFLAG：
在pEF6/V5-A质粒(Invitrogen)的Kpn I-Pme I位点，插入合成核苷酸
ggtaccgctagcgaattcaccatgtctgcacttctgatcctagctcttgttggagctgcagttgctgactac
aaagacgatgacgacaagactagtcatcatcaccatcaccattctagagaaggatccgatatccgcggccgc
atcgattgactagctgaggccgcaaaccc(序列号17)及其互补链合成核苷酸。因此，Kpn I-Nhe I-EcoRI-前原胰蛋白酶信号肽(MSALLILALVGAAVA(序列号18))-FLAG标记物(DYKDDDDK(序列号19))-Spe I-6xHis标记物(HHHHHH(序列号20))-Xba I-BamHI-EcoRV-Not I-Cla I位于延伸因子(Elonggation Factor)启动子的下游，牛生长激素聚腺苷酸化序列的上游。
pEF6/ssMyc：
在pEF6/ssFLAG质粒的EcoRI-Spe I位点，插入合成核苷酸
gaattcaccatgtctgcacttctgatcctagctcttgttggagctgcagttgctgactacgaagaggacgaa
caaaaactcatctcagaagaggatctgactagt(序列号21)及其互补链合成核苷酸。因此，Kpn I-Nhe I-EcoRI-前原胰蛋白酶信号肽(MSALLILALVGAAVA(序列号18))-Myc标记物(EQKLISEEDL(序列号22))-Spe I-6xHis标记物(HHHHHH(序列号20))-Xba I-BamHI-EcoRV-Not I-Cla I位于延伸因子启动子的下游、牛生长激素聚腺苷酸化序列的上游。
pEF6/ssFLAG：
在pEF6/V5-A质粒(Invitrogen)的Kpn I-Pme I位点，插入合成核苷酸
tggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattctgcagatatccagcacagtggcggccgtct
agagactacaaagacgatgacgacaagagagggtctcatcatcaccatcaccattgagcggccgcaaaccc(序列号23)及其互补链合成核苷酸。因此，Kpn I-BamHI-Spe I-EcoRI-EcoRV-Xba I-FLAG标记物(DYKDDDDK(序列号19))-6xHis标记物(HHHHHH(序列号20))-终止密码子-NotI位于延伸因子启动子的下游、牛生长激素聚腺苷酸化序列的上游。
pEF6/ssFLAG-hDANCE：
将由序列号2表示的氨基酸序列组成的人DANCE的第25位氨基酸至终止密码子使用引物tctagagcacagtgcacgaatggctttg(序列号24)以及gcggccggtcagaatgggtactgcgacacatatatccg(序列号25)采用PCR法进行扩增，且采用产品说明书中标明的方法克隆至pCR4-BluntTopo(Invitrogen)，确认序列之后用Xba I-Not I切割，并插入pEF6/ssFLAG的Spe I-Not I位点。
pEF6/ssMyc-hLTBP2：
将人LTBP2的第36位氨基酸至终止密码子使用引物
tctagacaaagggaccccgtagggagatacgag(序列号26)以及gcggccgcctggtactccttggcagtgcagtggg(序列号27)采用PCR法进行扩增，与上述同样插入pEF6/ssMyc的Spe I-Not I位点。
pEF6-hDANCE-FLAG：
将包含序列号2表示的氨基酸序列的人DANCE的第1位氨基酸至最后的第448位氨基酸使用引物gaattcttcttctcgccttcgcatctcctcc(序列号28)以及tctagagaatgggtactgcgacacatatatccg(序列号29)采用PCR法进行扩增，与上述同样克隆、测序后，用EcoRI-Xba I切割并插入pEF6/FLAG的EcoRI-Xba I位点(图1)。
pEF6-hDANCE(R77A)-FLAG：
使用Quick Change in vitro mutagenesis Kit(Stratagene)将人DANCE的第77位氨基酸的精氨酸取代为丙氨酸。其他过程与pEF6-hDANCE-FLAG相同。
pEF6-hDANCE ΔND-FLAG：
将包含序列号2表示的氨基酸序列的人DANCE的第1位氨基酸至第26位氨基酸，第78位氨基酸至第448位氨基酸分别用PCR法扩增，该扩增片段在Nhe I位点连接后，插入pEF6/FLAG的EcoRI-Xba I位点(图1)。
pEF6-hDANCE ΔN-FLAG：
将包含序列号2表示的氨基酸序列的人DANCE的第1位氨基酸至第26位氨基酸，第113位氨基酸至第448位氨基酸分别用PCR法扩增，该扩增片段在Nhe I位点连接后，插入pEF6/FLAG的EcoRL-XbaI位点(图1)。
pEF6-hDANCE ΔM-FLAG：
将包含序列号2表示的氨基酸序列的人DANCE的第1位氨基酸至第112位氨基酸，第315位氨基酸至第448位氨基酸分别用PCR法扩增，该扩增片段在Nhe I位点连接后，插入pEF6/FLAG的EcoRI-XbaI位点(图1)。
pEF6-hDANCE ΔC-FLAG：
将包含序列号2表示的氨基酸序列的人DANCE的第1位氨基酸至第315位氨基酸用PCR法扩增，插入pEF6/FLAG的EcoRI-Xba I位点(图1)。
将人赖氨酰氧化酶(GenBank检索号：AF039291.1)cDNA编码的多肽(第417个氨基酸)的第22位氨基酸至第417位氨基酸用PCR法扩增，插入pEF6/ssMyc的XbaI/NotI位点。
1.2.细胞、转染
表达试验中使用293T细胞。转染使用LipofectAMINE Plus试剂，以产品说明书中标明的方法进行。转染后第24小时，将培养基换为无血清培养基，进一步培养48小时，将上清液或细胞溶解产物用于蛋白质印迹法，以及体外结合分析法。
新生小鼠的皮肤成纤维细胞，用“Current Protocols in CellBiology”中标明的方法提取、培养。
牛大动脉平滑肌，购自Cambrex。
1.3.重组DANCE
使用293T细胞和pEF6-hDANCE-FLAG制备人DANCE稳定表达细胞系，使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)从其培养上清液纯化重组DANCE后，使用脱盐柱(Amersham)进行脱盐。
1.4.抗体
抗小鼠DANCE抗体BSYN1923，由将对应于小鼠DANCE76-98氨基酸的合成肽对家兔免疫而制成，且使用固定抗原肽的柱子进行亲和纯化。购自Chemicon和Elastin Products Company(EPC)的抗弹性蛋白单克隆抗体，购自EPC的肌原纤蛋白1多克隆抗体及单克隆抗体、肌原纤蛋白2多克隆抗体、LTBP2单克隆抗体。购自Sigma的抗FLAGM2抗体和抗FLAG M2琼脂糖，购自Santa Cruz的抗Myc(9E10)抗体。从Elastin Products Company，INC购入多克隆抗弹性蛋白抗体(PR533)。从Molecular Probes购入抗家兔Alexa Fluor 488抗体、抗小鼠Alexa Fluor 546抗体。
1.5.使用35S-Met，Cys的代谢标记(metabolabelling)、免疫沉淀、体外结合分析、蛋白质印迹
以“Molecular Cloning，3rd Ed”中标明的方法进行。
1.6.成纤维细胞培养
人成纤维细胞由京都大学附属医院整形外科提供。在24孔平板的底部放置盖玻片(Cover Glass)，在其上每1个孔接种7.5×104个人成纤维细胞，添加10％FBS在DMEM培养基中37℃，5％CO2下培养，第3天用PBS清洗后，换为不添加FBS的DMEM/F12培养基，添加纯化的DANCE蛋白质、切割型DANCE蛋白质4μg/ml，或者FBS。继续在37℃，5％CO2下培养，第14天进行固定、免疫染色。
1.7.免疫染色
培养第14天，用1ml的PBS清洗3次后，用100％甲醇，-20℃下固定30分钟。用PBS清洗后，用含2％BSA的PBS，在室温下阻断30分钟之后，与多克隆抗弹性蛋白抗体(稀释率1/100)以及单克隆抗FLAG抗体(稀释率1/100)在室温下孵化1小时以上。用PBS清洗，进一步与抗家兔Alexa Fluor 488抗体(稀释率1/100)、抗小鼠AlexaFluor 546抗体(稀释率1/100)在室温下孵化1小时。用PBS清洗后，用4％多聚甲醛在室温下固定10分钟，再用PBS清洗后，用含有DAPI的Vectashield将样品封固在载玻片上。用共焦显微镜进行观察。
实施例1：DANCE的一部分在体外、在体内、的N末端切割
1.1.人以及小鼠DANCE在293T细胞中的强制表达
将紧邻信号肽切割位点下游附有FLAG标记物的人以及小鼠DANCE cDNA转染至293T细胞，换为无血清培养基之后继续培养48小时，将15μl培养上清液用SDS-PAGE展开，进行蛋白质印迹。抗体使用将对应于小鼠DANCE第76-98位氨基酸的肽对家兔免疫而得到的BSYN，以及抗FLAG M2抗体。
其结果，如图2所示，BSYN不能识别人DANCE，且作为2条带检出小鼠DANCE。与此相反，抗FLAG M2抗体，作为1条带检出人·小鼠DANCE。
1.2.来自小鼠成纤维细胞中的DANCE的表达
培养来自新生儿期的DANCE敲除小鼠(参照Nature 415：171-175(2002))及其同胎的对照小鼠的皮肤的成纤维细胞，用35S-Met，Cys标记24小时之后，将培养上清液用BSYN抗体免疫沉淀。免疫沉淀物用SDS-PAGE展开，采用放射自显影术进行检测。
其结果，来自DANCE+/+小鼠的皮肤成纤维细胞中检出2条带，来自DANCE-/-小鼠的皮肤成纤维细胞中未检出带(图3)。
1.3.小鼠肺组织的蛋白质印迹
将12周龄的DANCE敲除小鼠及其同胎的对照小鼠的肺组织提取物用SDS-PAGE展开，用BSYN抗体进行蛋白质印迹。
其结果，DANCE+/+小鼠的肺组织中DANCE作为2条带检出，DANCE-/-小鼠的肺组织中未检出带(图4)。
实施例2：切割型DANCE的N末端，与DANCE的第78位以后的氨基酸一致
将羧基末端附有FLAG标记物及6xHis标记物的人DANCE cDNA转染至293T细胞，建立稳定表达系。由800ml无血清培养上清液使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)纯化重组DANCE，用SDS-PAGE展开，用Coomasie-Blue染色。主要的2条带中，切出对应于切割型DANCE的带，采用Edman降解分析N末端氨基酸序列(图5)。
其结果，切割型DANCE的N末端氨基酸序列，与DANCE的第78位以后的氨基酸一致。
因此，认为该低分子量蛋白质，通过在DANCE的第77位氨基酸与第78位氨基酸之间切割而生成。
实施例3：DANCE的切割被丝氨酸蛋白酶抑制剂抑制
将羧基末端附有FLAG标记物及6xHis标记物的人DANCE cDNA转染293T细胞，在含半胱氨酸蛋白酶抑制剂(E64)或丝氨酸蛋白酶抑制剂(抑酶肽)的无血清培养基中培养48小时，使用Ni-NTA琼脂糖从该培养上清液沉淀重组蛋白质，用SDS-PAGE展开，用抗FLAGM2抗体进行蛋白质印迹。
其结果，DANCE的切割未被E64抑制，但被抑酶肽抑制(图6)。
因此，表明DANCE由丝氨酸氧化酶切割。
实施例4：DANCE的Arg77置换为Ala则难以切割
将DANCE的第77位精氨酸置换为丙氨酸的突变型DANCE(C末端附有FLAG、6xHis标记物)(图7)的表达载体，以及正常型DANCE(C末端附有FLAG、6xHis标记物)的表达载体转染293T细胞，无血清培养基中培养48小时，使用Ni-NTA琼脂糖从该培养上清液沉淀重组蛋白质，用SDS-PAGE展开，用抗FLAG M2抗体进行蛋白质印迹。
其结果，明确该突变型DANCE，对蛋白酶引起的切割显示出抗性(图8)。
实施例5：DANCE形成同型复合体，且也与LTBP2结合
将在9cm平板上接种的牛大动脉平滑肌细胞，用35S-Met，Cys标记24小时之后，混合培养上清液和重组人DANCE(C末端附有FLAG、6xHis标记物)50μg，将用抗FLAG琼脂糖(Sigma)沉淀后的物质用SDS-PAGE展开，进行放射自显影。将相同的培养上清液用抗弹性纤维构成蛋白质(弹性蛋白、肌原纤蛋白1、肌原纤蛋白2、LTBP2)的市售抗体免疫沉淀，用相同的SDS-PAGE凝胶展开，进行放射自显影。
其结果，明确DANCE形成同型复合体，以及DANCE与LTBP2结合(图9)。
实施例6：人DANCE与DANCE或LTBP2的结合区域的分析
由实施例5的结果，分析DANCE之间的结合区域，DANCE对LTBP2的结合区域。
将附有FLAG标记物的人DANCE构建体(图8)、附有Myc标记物的人DANCE构建体以及人LTBP2构建体分别转染293T细胞。无血清培养基中培养48小时后，混合各自的培养上清液和细胞提取液，作为蛋白质溶液。将来自附有FLAG标记物的DANCE构建体的蛋白质溶液，与来自附有Myc标记物的DANCE或LTBP2的蛋白质溶液在冰上混合1小时，用抗FLAG抗体沉淀，沉淀后的物质用SDS-PAGE展开，用抗Myc抗体或抗FLAG抗体检测。
其结果，明确DANCE之间的结合中，N末端结构域是必需的；DANCE与LTBP2的结合中DANCE的中央结构域是必需的(图10)。又，明确当DANCE的N末端或C末端结构域缺失时，DANCE与LTBP2的结合更强。
实施例7：DANCE可与赖氨酰氧化酶结合
本发明人等发现赖氨酰氧化酶的基因缺失小鼠的表型(J.Biol.Chem.278(16)：14387-93(2003)；Circulation 106(19)：2503-9(2002))，与本发明人等以前报道的DANCE基因缺失小鼠的表型(Nature 415：171-175(2002))非常类似。因此，本发明人等认为DANCE与赖氨酰氧化酶的复合体的形成可能对其机能的发挥很重要，并评价DANCE是否与赖氨酰氧化酶结合。再者，试验除将用抗FLAG抗体沉淀的物质用SDS-PAGE展开，用抗Myc抗体检测以外，其他与实施例6同样进行。
其结果，表明DANCE与赖氨酰氧化酶结合(图11)。
考察
1.DANCE与LTBP2的结合
本发明人等，发现DANCE与LTBP2特异的结合。该结合通过在DANCE的中央的钙结合性EGF样模体连续的结构域发生。至今，本发明人等报道DANCE的氨基酸末端结构域与细胞表面整联蛋白结合，Liu等报道DANCE的羧基末端侧的一半与LOXL1结合。但是已知弹性蛋白未在细胞表面上密集沉淀，而是沿着微原纤维沉淀，从而形成成熟的弹性纤维(Matrix Biol.19：455-6(2000))。因此，DANCE与LOXL1的结合若促进弹性蛋白在微原纤维的沉淀·交联，则DANCE应该与微原纤维结合。微原纤维是较长的细胞外纤维，认为是由肌原纤蛋白1、肌原纤蛋白2、LTBP2等细长的蛋白质分子构成。肌原纤蛋白的1，2的任一种的敲除小鼠都不会产生弹性纤维的形成异常，则否定了肌原纤蛋白与DANCE的结合。LTBP2属于LTBP家族，但是不与Latent TGF β结合，是弹性纤维中存在的蛋白质，因LTBP2敲除小鼠早期胎生致死，所以其在生物体内的作用仍不明确(Mol.CellBiol.20：4879-87(2000))。此次本发明人等的发现，表明通过LTBP2将DANCE固定在微原纤维，使弹性蛋白交联酶存在于微原蛋白上，从而帮助弹性蛋白沿着微原纤维沉淀·交联。
2.DANCE之间的结合
至今仍不明确DANCE是否以单体的形式作用，是否形成二聚体或多聚体，此次，作为在平滑肌培养上清液中存在的主要的DANCE结合蛋白质识别出DANCE。这表明DANCE形成同型复合体(二聚体或多聚体)。DANCE之间的结合通过氨基酸末端的结构域进行。以前，本发明人等标明DANCE的氨基酸末端结构域在细胞表面整联蛋白上结合(J.Biol.Chem.274(32)：22476-22483(1999))，此次的数据暗示作为氨基酸末端结构域的新的机能，其促进DANCE之间的结合。
3.DANCE氨基酸末端结构域的切割
本发明人等，发现在体内，体外DANCE的一部分在氨基酸末端结构域切割。该切割由未鉴定的丝氨酸蛋白酶引起，若切割位点的精氨酸置换为丙氨酸则切割难以进行。从DANCE氨基酸末端结构域的机能推测，切割型DANCE，(1)未与细胞表面整联蛋白结合，(2)DANCE之间不结合，且(3)与全长DANCE相比，切割型DANCE与LTBP2的结合更强。(1)～(3)的新发现表明生物体内由蛋白酶对DANCE的切断控制DANCE的机能变化，从而成为弹性纤维形成的控制机制而起作用。基于该观点，药剂引起的DANCE切割蛋白酶的抑制或促进，可用于弹性纤维劣化的预防·再生促进。
4.DANCE与赖氨酰氧化酶的结合
LOX1基因缺失小鼠显示出弹性纤维形成异常。认为LOX1与DANCE直接结合，通过DANCE而在弹性纤维形成部位固定，进行弹性蛋白的交联。但是，LOXL1基因缺失小鼠的表型比DANCE基因缺失小鼠的表型弱，所以不能说明与LOXL1的结合是DANCE的全部作用。赖氨酰氧化酶基因缺失小鼠也表现出弹性纤维形成异常，此次本发明人发现的DANCE与赖氨酰氧化酶的结合，表明DANCE通过固定赖氨酰氧化酶而有效地进行弹性蛋白的交联。
实施例8：调节DANCE的切割的物质的筛选
将羧基末端附有FLAG标记物及6xHis标记物的人DANCE cDNA转染293T细胞，在被检物质的存在与不存在的情况下的无血清培养基中培养48小时，将培养上清液使用Ni-NTA琼脂糖沉淀的人DANCE，用SDS-PAGE展开，用抗FLAG M2抗体进行蛋白质印迹。被检物质的存在或不存在的情况下，定量分析各自的2条带，从而评价被检物质是否可调节DANCE的切割。
实施例9：各种年龄的人的皮肤上全长型以及切割型DANCE的表达
为了考察整形外科手术中切除的皮肤组织中DANCE的表达，使用抗人DANCE抗体进行蛋白质印迹(图12)。从任何一个检体均可检出全长型以及切割型DANCE蛋白质，但是发现根据年龄以及皮肤的摘取部位不同表达水平有较大的差异。首先脸部皮肤中，0岁儿童全长型、切割型DANCE表达水平均较高，特别是全长型DANCE表达水平很高，而成年人的全长型、切割型的表达水平较低，特别是全长型有降低的倾向。发现在不被光照射的其他部位的皮肤中，即使是成年人，全长型、切割型均有保持着适当的DANCE表达水平的倾向。
参考例1：切割型DANCE不具有通过整联蛋白的细胞黏着促进活性
全长型DANCE通过细胞表面整联蛋白促进血管内皮细胞的黏着和伸展。至今本发明人报道全长型DANCE作为整联蛋白αvβ3、αvβ5、α9β1的配体。据认为作为配体的结构域，在DANCE氨基酸末端结构域的RGD模体周围，所以分别将通过1个氨基酸发生置换的来自RGD的RGE DANCE突变体(RGE DANCE)，以及氨基酸末端切割型DANCE(ΔND DANCE)的重组蛋白进行纯化，与全长型DANCE一起进行血管内皮细胞的细胞黏着试验(图13)。全长型DANCE，依靠用于包被的蛋白质浓度促进细胞黏着，而RGE DANCE几乎没有细胞黏附活性，ΔND DANCE完全没有细胞黏附活性。
参考例2：DANCE的氨基酸末端结构域在弹性纤维形成中是必需的
继而，验证了蛋白酶引起的DANCE的氨基酸末端结构域切割对弹性纤维形成是否有影响。
接种人皮肤成纤维细胞使其融合，换为无血清培养基或含10％胎牛血清的培养基培养2周，用由抗弹性蛋白抗体的免疫染色分析弹性纤维的形成。
其结果，发现含10％胎牛血清的培养基中形成弹性纤维。无血清培养基中细胞虽生存，但几乎没有形成弹性纤维。但是若于无血清培养基中加入重组DANCE至4μg/ml，则形成多于或等于含血清培养基中的弹性纤维。用抗FLAG抗体发现此时加入的重组DANCE的存在，其与形成的弹性纤维共存。另一方面，加入ΔND-DANCE的培养基中弹性纤维形成非常少，认为ΔND-DANCE几乎没有弹性纤维形成活性，或非常弱的活性。
因此，由于蛋白酶对DANCE氨基酸末端结构域的切割，使DANCE失活，所以DANCE切割蛋白酶的抑制剂可用作通过增加全长型DANCE来促使弹性纤维的形成或维持的药剂。
工业实用性
本发明的筛选方法，可用于通过调节弹性纤维形成的新型作用机制来开发药物，或鉴定DANCE特异的蛋白酶。又，本发明的测定方法可用于弹性纤维形成的状态的诊断。进一步，本发明的多肽、抗体、复合体以及试剂盒可用于实施本发明的方法，也可用于预防、治疗或改善需要对弹性纤维形成进行调节的状态，或作为研究·诊断用试剂等。
本申请，以2004年3月29日在日本申请的专利2004-096685为基础，其内容并入本说明书中。
                                    序列表
<110>Kyoto University
<120>切割型DANCE、DANCE复合体及其使用方法
<130>
<150>JP 2004-096685
<151>2004-3-29
<160>29
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>1347
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1347)
<400>1
atg cca gga ata aaa agg ata ctc act gtt acc att ctg gct ctc tgt     48
Met Pro Gly Ile Lys Arg Ile Leu Thr Val Thr Ile Leu Ala Leu Cys
1               5                   10                  15
ctt cca agc cct ggg aat gca cag gca cag tgc acg aat ggc ttt gac     96
Leu Pro Ser Pro Gly Asn Ala Gln Ala Gln Cys Thr Ash Gly Phe Asp
            20                  25                  30
ctg gat cgc cag tca gga cag tgt tta gat att gat gaa tgc cga acc     144
Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr
        35                  40                  45
atc ccc gag gcc tgc cga gga gac atg atg tgt gtt aac caa aat ggc     192
Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly
    50                  55                  60
ggg tat tta tgc att ccc cgg aca aac cct gtg tat cga ggg ccc tac     240
Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg Thr Asn Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr
65                  70                  75                  80
tcg aac ccc tac tcg acc ccc tac tca ggt ccg tac cca gca gct gcc    288
Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Pro Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala
                85                  90                  95
cca cca ctc tca gct cca aac tat ccc acg atc tcc agg cct ctt ata    336
Pro Pro Leu Ser Ala Pro Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg Pro Leu Ile
            100                 105                 110
tgc cgc ttt gga tac cag atg gat gaa agc aac caa tgt gtg gat gtg    384
Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Ser Asn Gln Cys Val Asp Val
        115                 120                 125
gac gag tgt gca aca gat tcc cac cag tgc aac ccc acc cag atc tgc    432
Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys
    130                 135                 140
atc aat act gaa ggc ggg tac acc tgc tcc tgc acc gac gga tat tgg    480
Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp
145                 150                 155                 160
ctt ctg gaa ggc cag tgc tta gac att gat gaa tgt cgc tat ggt tac    528
Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr
                165                 170                 175
tgc cag cag ctc tgt gcg aat gtt cct gga tcc tat tct tgt aca tgc    576
Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys
            180                 185                 190
aac cct ggt ttt acc ctc aat gag gat gga agg tct tgc caa gat gtg    624
Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Glu Asp Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val
        195                 200                 205
aac gag tgt gcc acc gag aac ccc tgc gtg caa acc tgc gtc aac acc    672
Asn Glu Cys Ala Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys Val Asn Thr
    210                 215                 220
tac ggc tct ttc atc tgc cgc tgt gac cca gga tat gaa ctt gag gaa    720
Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu
225                 230                 235                 240
gat ggc gtt cat tgc agt gat atg gac gag tgc agc ttc tct gag ttc    768
Asp Gly Val His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe
                245                 250                 255
ctc tgc caa cat gag tgt gtg aac cag ccc ggc aca tac ttc tgc tcc    816
Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Thr Tyr Phe Cys Ser
            260                 265                 270
tgc cct cca ggc tac atc ctg ctg gat gac aac cga agc tgc caa gac    864
Cys Pro Pro Gly Tyr Ile Leu Leu Asp Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp
        275                 280                 285
atc aac gaa tgt gag cac agg aac cac acg tgc aac ctg cag cag acg    912
Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Asn Leu Gln Gln Thr
    290                 295                 300
tgc tac aat tta caa ggg ggc ttc aaa tgc atc gac ccc atc cgc tgt    960
Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro Ile Arg Cys
305                 310                 315                 320
gag gag cct tat ctg agg atc agt gat aac cgc tgt atg tgt cct gct    1008
Glu Glu Pro Tyr Leu Arg Ile Ser Asp Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala
                325                 330                 335
gag aac cct ggc tgc aga gac cag ccc ttt acc atc ttg tac cgg gac    1056
Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp
            340                 345                 350
atg gac gtg gtg tca gga cgc tcc gtt ccc gct gac atc ttc caa atg    1104
Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met
        355                 360                 365
caa gcc acg acc cgc tac cct ggg gcc tat tac att ttc cag atc aaa    1152
Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys
    370                 375                 380
tct ggg aat gag ggc aga gaa ttt tac atg cgg caa acg ggc ccc atc    1200
Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile
385                 390                 395                 400
agt gcc acc ctg gtg atg aca cgc ccc atc aaa ggg ccc cgg gaa atc    1248
Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro Arg Glu Ile
                405                 410                 415
cag ctg gac ttg gaa atg atc act gtc aac act gtc atc aac ttc aga    1296
Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg
            420                 425                 430
ggc agc tcc gtg atc cga ctg cgg ata tat gtg tcg cag tac cca ttc    1344
Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe
        435                 440                 445
tga
1347
<210>2
<211>448
<212>PRT
<213>智人
<400>2
Met Pro Gly Ile Lys Arg Ile Leu Thr Val Thr Ile Leu Ala Leu Cys
1               5                   10                  15
Leu Pro Ser Pro Gly Asn Ala Gln Ala Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp
            20                  25                  30
Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr
        35                  40                  45
Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly
    50                  55                  60
Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg Thr Asn Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr
65                  70                  75                  80
Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Pro Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala
                85                  90                  95
Pro Pro Leu Ser Ala Pro Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg Pro Leu Ile
            100                 105                 110
Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Ser Asn Gln Cys Val Asp Val
        115                 120                 125
Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys
    130                 135                 140
Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp
145                 150                 155                 160
Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr
                165                 170                 175
Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys
            180                 185                 190
Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Glu Asp Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val
        195                 200                 205
Asn Glu Cys Ala Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys Val Asn Thr
    210                 215                 220
Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu
225                 230                 235                 240
Asp Gly Val His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe
                245                 250                 255
Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Thr Tyr Phe Cys Ser
            260                 265                 270
Cys Pro Pro Gly Tyr Ile Leu Leu Asp Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp
        275                 280                 285
Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Asn Leu Gln Gln Thr
    290                 295                 300
Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro Ile Arg Cys
305                 310                 315                 320
Glu Glu Pro Tyr Leu Arg Ile Ser Asp Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala
                325                 330                 335
Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp
            340                 345                 350
Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met
        355                 360                 365
Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys
    370                 375                 380
Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile
385                 390                 395                 400
Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro Arg Glu Ile
                405                 410                 415
Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg
            420                 425                 430
Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe
        435                 440                 445
<210>3
<211>1278
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1278)
<400>3
cag gca cag tgc acg aat ggc ttt gac ctg gat cgc cag tca gga cag    48
Gln Ala Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln
1               5                    10                 15
tgt tta gat att gat gaa tgc cga acc atc ccc gag gcc tgc cga gga    96
Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly
            20                  25                  30
gac atg atg tgt gtt aac caa aat ggc ggg tat tta tgc att ccc cgg    144
Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg
        35                  40                  45
aca aac cct gtg tat cga ggg ccc tac tcg aac ccc tac tcg acc ccc    192
Thr Asn Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Pro
    50                  55                  60
tac tca ggt ccg tac cca gca gct gcc cca cca ctc tca gct cca aac    240
Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala Pro Pro Leu Ser Ala Pro Asn
65                  70                  75                  80
tat ccc acg atc tcc agg cct ctt ata tgc cgc ttt gga tac cag atg    288
Tyr Pro Thr Ile Ser Arg Pro Leu Ile Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met
                85                  90                  95
gat gaa agc aac caa tgt gtg gat gtg gac gag tgt gca aca gat tcc    336
Asp Glu Ser Asn Gln Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser
            100                 105                 110
cac cag tgc aac ccc acc cag atc tgc atc aat act gaa ggc ggg tac    384
His Gln Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr
        115                 120                 125
acc tgc tcc tgc acc gac gga tat tgg ctt ctg gaa ggc cag tgc tta    432
Thr Cys Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu
    130                 135                 140
gac att gat gaa tgt cgc tat ggt tac tgc cag cag ctc tgt gcg aat    480
Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn
145                 150                 155                 160
gtt cct gga tcc tat tct tgt aca tgc aac cct ggt ttt acc ctc aat    528
Val Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn
                165                 170                 175
gag gat gga agg tct tgc caa gat gtg aac gag tgt gcc acc gag aac    576
Glu Asp Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Ala Thr Glu Asn
            180                 185                 190
ccc tgc gtg caa acc tgc gtc aac acc tac ggc tct ttc atc tgc cgc    624
Pro Cys Val Gln Thr Cys Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg
        195                 200                 205
tgt gac cca gga tat gaa ctt gag gaa gat ggc gtt cat tgc agt gat    672
Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Asp Gly Val His Cys Ser Asp
    210                 215                 220
atg gac gag tgc agc ttc tct gag ttc ctc tgc caa cat gag tgt gtg    720
Met Asp Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val
225                 230                 235                 240
aac cag ccc ggc aca tac ttc tgc tcc tgc cct cca ggc tac atc ctg    768
Asn Gln Pro Gly Thr Tyr Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Ile Leu
                245                 250                 255
ctg gat gac aac cga agc tgc caa gac atc aac gaa tgt gag cac agg    816
Leu Asp Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg
            260                 265                 270
aac cac acg tgc aac ctg cag cag acg tgc tac aat tta caa ggg ggc    864
Asn His Thr Cys Asn Leu Gln Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly
        275                 280                 285
ttc aaa tgc atc gac ccc atc cgc tgt gag gag cct tat ctg agg atc    912
Phe Lys Cys Ile Asp Pro Ile Arg Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Arg Ile
    290                 295                 300
agt gat aac cgc tgt atg tgt cct gct gag aac cct ggc tgc aga gac    960
Ser Asp Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp
305                 310                 315                 320
cag ccc ttt acc atc ttg tac cgg gac atg gac gtg gtg tca gga cgc    1008
Gln Pro Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg
                325                 330                 335
tcc gtt ccc gct gac atc ttc caa atg caa gcc acg acc cgc tac cct    1056
Ser Val Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro
            340                 345                 350
ggg gcc tat tac att ttc cag atc aaa tct ggg aat gag ggc aga gaa    1104
Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu
        355                 360                 365
ttt tac atg cgg caa acg ggc ccc atc agt gcc acc ctg gtg atg aca    1152
Phe Tyr Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr
    370                 375                 380
cgc ccc atc aaa ggg ccc cgg gaa atc cag ctg gac ttg gaa atg atc    1200
Arg Pro Ile Lys Gly Pro Arg Glu Ile Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile
385                 390                 395                 400
act gtc aac act gtc atc aac ttc aga ggc agc tcc gtg atc cga ctg    1248
Thr Val Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu
                405                 410                 415
cgg ata tat gtg tcg cag tac cca ttc tga                            1278
Arg Ile Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe
            420                 425
<210>4
<211>425
<212>PRT
<213>智人
<400>4
Gln Ala Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln
1               5                   10                  15
Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly
            20                  25                  30
Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg
        35                  40                  45
Thr Asn Pro Val Tyr Arg Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Pro
    50                  55                  60
Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro Ala Ala Ala Pro Pro Leu Ser Ala Pro Asn
65                  70                  75                  80
Tyr Pro Thr Ile Ser Arg Pro Leu Ile Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met
                85                  90                  95
Asp Glu Ser Asn Gln Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser
            100                 105                 110
His Gln Cys Asn Pro Thr Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr
        115                 120                 125
Thr Cys Ser Cys Thr Asp Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu
    130                 135                 140
Asp Ile Asp Glu Cys Arg Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn
145                 150                 155                 160
Val Pro Gly Ser Tyr Ser Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn
                165                 170                 175
Glu Asp Gly Arg Ser Cys Gln Asp Val Asn Glu Cys Ala Thr Glu Asn
            180                 185                 190
Pro Cys Val Gln Thr Cys Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg
        195                 200                 205
Cys Asp Pro Gly Tyr Glu Leu Glu Glu Asp Gly Val His Cys Ser Asp
    210                 215                 220
Met Asp Glu Cys Ser Phe Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val
225                 230                 235                 240
Asn Gln Pro Gly Thr Tyr Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Ile Leu
                245                 250                 255
Leu Asp Asp Asn Arg Ser Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg
            260                 265                 270
Asn His Thr Cys Asn Leu Gln Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly
        275                 280                 285
Phe Lys Cys Ile Asp Pro Ile Arg Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Arg Ile
    290                 295                 300
Ser Asp Asn Arg Cys Met Cys Pro Ala Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp
305                 310                 315                 320
Gln Pro Phe Thr Ile Leu Tyr Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg
                325                 330                 335
Ser Val Pro Ala Asp Ile Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro
            340                 345                 350
Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu
        355                 360                 365
Phe Tyr Met Arg Gln Thr Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr
    370                 375                 380
Arg Pro Ile Lys Gly Pro Arg Glu Ile Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile
385                 390                 395                 400
Thr Val Asn Thr Val Ile Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu
                405                 410                 415
Arg Ile Tyr Val Ser Gln Tyr Pro Phe
            420                 425
<210>5
<211>162
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(162)
<400>5
cag gca cag tgc acg aat ggc ttt gac ctg gat cgc cag tca gga cag    48
Gln Ala Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln
1               5                   10                  15
tgt tta gat att gat gaa tgc cga acc atc ccc gag gcc tgc cga gga    96
Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly
            20                  25                  30
gac atg atg tgt gtt aac caa aat ggc ggg tat tta tgc att ccc cgg    144
Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg
        35                  40                  45
aca aac cct gtg tat cga                                            162
Thr Asn Pro Val Tyr Arg
    50
<210>6
<211>54
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Gln Ala Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln
1               5                   10                  15
Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly
            20                  25                  30
Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg
        35                  40                  45
Thr Asn Pro Val Tyr Arg
    50
<210>7
<211>1116
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1116)
<400>7
ggg ccc tac tcg aac ccc tac tcg acc ccc tac tca ggt ccg tac cca    48
Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Pro Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro
1               5                   10                  15
gca gct gcc cca cca ctc tca gct cca aac tat ccc acg atc tcc agg    96
Ala Ala Ala Pro Pro Leu Ser Ala Pro Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg
            20                  25                  30
cct ctt ata tgc cgc ttt gga tac cag atg gat gaa agc aac caa tgt    144
Pro Leu Ile Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Ser Asn Gln Cys
        35                  40                  45
gtg gat gtg gac gag tgt gca aca gat tcc cac cag tgc aac ccc acc    192
Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr
    50                  55                  60
cag atc tgc atc aat act gaa ggc ggg tac acc tgc tcc tgc acc gac    240
Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp
65                  70                  75                  80
gga tat tgg ctt ctg gaa ggc cag tgc tta gac att gat gaa tgt cgc    288
Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg
                85                  90                  95
tat ggt tac tgc cag cag ctc tgt gcg aat gtt cct gga tcc tat tct    336
Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser
            100                 105                 110
tgt aca tgc aac cct ggt ttt acc ctc aat gag gat gga agg tct tgc    384
Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Glu Asp Gly Arg Ser Cys
        115                 120                 125
caa gat gtg aac gag tgt gcc acc gag aac ccc tgc gtg caa acc tgc    432
Gln Asp Val Asn Glu Cys Ala Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys
    130                 135                 140
gtc aac acc tac ggc tct ttc atc tgc cgc tgt gac cca gga tat gaa    480
Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu
145                 150                 155                 160
ctt gag gaa gat ggc gtt cat tgc agt gat atg gac gag tgc agc ttc    528
Leu Glu Glu Asp Gly Val His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe
                165                 170                 175
tct gag ttc ctc tgc caa cat gag tgt gtg aac cag ccc ggc aca tac    576
Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Thr Tyr
            180                 185                 190
ttc tgc tcc tgc cct cca ggc tac atc ctg ctg gat gac aac cga agc    624
Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Ile Leu Leu Asp Asp Asn Arg Ser
        195                 200                 205
tgc caa gac atc aac gaa tgt gag cac agg aac cac acg tgc aac ctg    672
Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Asn Leu
    210                 215                 220
cag cag acg tgc tac aat tta caa ggg ggc ttc aaa tgc atc gac ccc    720
Gln Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro
225                 230                 235                 240
atc cgc tgt gag gag cct tat ctg agg atc agt gat aac cgc tgt atg    768
Ile Arg Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Arg Ile Ser Asp Asn Arg Cys Met
                245                 250                 255
tgt cct gct gag aac cct ggc tgc aga gac cag ccc ttt acc atc ttg    816
Cys Pro Ala Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu
            260                 265                 270
tac cgg gac atg gac gtg gtg tca gga cgc tcc gtt ccc gct gac atc    864
Tyr Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile
        275                 280                 285
ttc caa atg caa gcc acg acc cgc tac cct ggg gcc tat tac att ttc    912
Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe
    290                 295                 300
cag atc aaa tct ggg aat gag ggc aga gaa ttt tac atg cgg caa acg    960
Gln Ile Lys Ser Gly Ash Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr
305                 310                 315                 320
ggc ccc atc agt gcc acc ctg gtg atg aca cgc ccc atc aaa ggg ccc    1008
Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro
                325                 330                 335
cgg gaa atc cag ctg gac ttg gaa atg atc act gtc aac act gtc atc    1056
Arg Glu Ile Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile
            340                 345                 350
aac ttc aga ggc agc tcc gtg atc cga ctg cgg ata tat gtg tcg cag    1104
Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln
        355                 360                 365
tac cca ttc tga                                                    1116
Tyr Pro Phe
    370
<210>8
<211>371
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Pro Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Pro Pro Leu Ser Ala Pro Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg
            20                  25                  30
Pro Leu Ile Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Ser Asn Gln Cys
        35                  40                  45
Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr
    50                  55                  60
Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg
                85                  90                  95
Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser
            100                 105                 110
Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Glu Asp Gly Arg Ser Cys
        115                 120                 125
Gln Asp Val Asn Glu Cys Ala Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys
    130                 135                 140
Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu
145                 150                 155                 160
Leu Glu Glu Asp Gly Val His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe
                165                 170                 175
Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Thr Tyr
            180                 185                 190
Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Ile Leu Leu Asp Asp Asn Arg Ser
        195                 200                 205
Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Asn Leu
    210                 215                 220
Gln Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro
225                 230                 235                 240
Ile Arg Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Arg Ile Ser Asp Asn Arg Cys Met
                245                 250                 255
Cys Pro Ala Glu Asn Pro Gly Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu
            260                 265                 270
Tyr Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile
        275                 280                 285
Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe
    290                 295                 300
Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr
305                 310                 315                 320
Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro
                325                 330                 335
Arg Glu Ile Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile
            340                 345                 350
Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln
        355                 360                 365
Tyr Pro Phe
    370
<210>9
<211>162
<212>DNA
<213>小鼠(Mus musculus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(162)
<400>9
cag cag cag tgc aca aac ggc ttt gac ctg gac cgc cag tca gga cag    48
Gln Gln Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln
1               5                   10                  15
tgt cta gat att gat gaa tgc cgg acc atc cct gag gct tgt cgt ggg    96
Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly
            20                  25                  30
gac atg atg tgt gtc aac cag aat ggc ggg tat ttg tgc atc cct cga    144
Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg
        35                  40                  45
acc aac cca gtg tat cga                                            162
Thr Asn Pro Val Tyr Arg
    50
<210>10
<211>54
<212>PRT
<213>小鼠
<400>10
Gln Gln Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Ser Gly Gln
1               5                   10                  15
Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly
            20                  25                  30
Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg
        35                  40                  45
Thr Asn Pro Val Tyr Arg
    50
<210>11
<211>1113
<212>DNA
<213>小鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1113)
<400>11
ggg cct tac tca aat ccc tac tct aca tcc tac tca ggc cca tac cca    48
Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro
1               5                   10                  15
gca gcg gcc cca cca gta cca gct tcc aac tac ccc acg att tca agg    96
Ala Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ser Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg
            20                  25                  30
cct ctt gtc tgc cgc ttt ggg tat cag atg gat gaa ggc aac cag tgt    144
Pro Leu Val Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Gly Asn Gln Cys
        35                  40                  45
gtg gat gtg gac gag tgt gca aca gac tca cac cag tgc aac cct acc    192
Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr
    50                  55                  60
cag atc tgt atc aac act gaa gga ggt tac acc tgc tcc tgc acc gat    240
Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp
65                  70                  75                  80
ggg tac tgg ctt ctg gaa ggg cag tgc cta gat att gat gaa tgt cgc    288
Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg
                85                  90                  95
tat ggt tac tgc cag cag ctc tgt gca aat gtt cca gga tcc tat tcc    336
Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser
            100                 105                 110
tgt aca tgc aac cct ggt ttc acc ctc aac gac gat gga agg tct tgc    384
Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Asp Asp Gly Arg Ser Cys
        115                 120                 125
caa gat gtg aac gag tgc gaa act gag aat ccc tgt gtt cag acc tgt    432
Gln Asp Val Asn Glu Cys Glu Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys
    130                 135                 140
gtc aac acc tat ggc tct ttc atc tgc cgc tgt gac cca gga tat gaa    480
Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu
145                 150                 155                 160
ctt gag gaa gat ggc att cac tgc agt gat atg gac gag tgc agc ttc    528
Leu Glu Glu Asp Gly Ile His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe
                165                 170                 175
tcc gag ttc ctc tgt caa cac gag tgt gtg aac cag ccg ggc tca tac    576
Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Ser Tyr
            180                 185                 190
ttc tgc tcg tgc cct cca ggc tac gtc ctg ttg gat gat aac cga agc    624
Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Val Leu Leu Asp Asp Asn Arg Ser
        195                 200                 205
tgc cag gat atc aat gaa tgt gag cac cga aac cac acg tgt acc tca    672
Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Thr Ser
    210                 215                 220
ctg cag act tgc tac aat cta caa ggg ggc ttc aaa tgt att gat ccc    720
Leu Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro
225                 230                 235                 240
atc agc tgt gag gag cct tat ctg ctg att ggt gaa aac cgc tgt atg    768
Ile Ser Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Leu Ile Gly Glu Asn Arg Cys Met
                245                 250                 255
tgt cct gct gag cac acc agc tgc aga gac cag cca ttc acc atc ctg    816
Cys Pro Ala Glu His Thr Ser Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu
            260                 265                 270
tat cgg gac atg gat gtg gtg tca gga cgc tcc gtt cct gct gac atc    864
Tyr Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile
        275                 280                 285
ttc cag atg caa gca aca acc cga tac cct ggt gcc tat tac att ttc    912
Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe
    290                 295                 300
cag atc aaa tct ggc aac gag ggt cga gag ttc tat atg cgg caa aca    960
Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr
305                 310                 315                 320
ggg cct atc agt gcc acc ctg gtg atg aca cgc ccc atc aaa ggg cct    1008
Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro
                325                 330                 335
cgg gac atc cag ctg gac ttg gag atg atc act gtc aac act gtc atc    1056
Arg Asp Ile Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile
            340                 345                 350
aac ttc aga ggc agc tcc gtg atc cga ctg cgg ata tat gtg tcg cag    1104
Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln
        355                 360                 365
tat ccg ttc                                                        1113
Tyr Pro Phe
    370
<210>12
<211>371
<212>PRT
<213>小鼠
<400>12
Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ser Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg
            20                  25                  30
Pro Leu Val Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Gly Asn Gln Cys
        35                  40                  45
Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr
    50                  55                  60
Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg
                85                  90                  95
Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser
            100                 105                 110
Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Asp Asp Gly Arg Ser Cys
        115                 120                 125
Gln Asp Val Asn Glu Cys Glu Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys
    130                 135                 140
Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu
145                 150                 155                 160
Leu Glu Glu Asp Gly Ile His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe
                165                 170                 175
Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Ser Tyr
            180                 185                 190
Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Val Leu Leu Asp Asp Asn Arg Ser
        195                 200                 205
Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Thr Ser
    210                 215                 220
Leu Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro
225                 230                 235                 240
Ile Ser Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Leu Ile Gly Glu Asn Arg Cys Met
                245                 250                 255
Cys Pro Ala Glu His Thr Ser Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu
            260                 265                 270
Tyr Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile
        275                 280                 285
Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe
    290                 295                 300
Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr
305                 310                 315                 320
Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro
                325                 330                 335
Arg Asp Ile Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile
            340                 345                 350
Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln
        355                 360                 365
Tyr Pro Phe
    370
<210>13
<211>162
<212>DNA
<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(162)
<400>13
cag caa cag tgc acc aac ggc ttt gac ctg gac cgc cag aca gga cag    48
Gln Gln Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Thr Gly Gln
1               5                   10                  15
tgt tta gat att gat gaa tgt cgg acc atc cct gag gct tgc cgt ggg    96
Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly
            20                  25                  30
gac atg atg tgt gtc aac cag aat ggc ggg tat ctg tgc atc cct cga    144
Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg
        35                  40                  45
acc aac cca gtg tat cga                                            162
Thr Asn Pro Val Tyr Arg
    50
<210>14
<211>54
<212>PRT
<213>褐家鼠
<400>14
Gln Gln Gln Cys Thr Asn Gly Phe Asp Leu Asp Arg Gln Thr Gly Gln
1               5                   10                  15
Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg Thr Ile Pro Glu Ala Cys Arg Gly
            20                  25                  30
Asp Met Met Cys Val Asn Gln Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Ile Pro Arg
        35                  40                  45
Thr Asn Pro Val Tyr Arg
    50
<210>15
<211>1116
<212>DNA
<213>褐家鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1116)
<400>15
ggg ccc tac tcc aat ccc tac tct aca tcc tac tca ggc cca tac cca    48
Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro
1               5                   10                  15
gca gcc gca cca cca gtg cca gct tcc aac tac ccc acg att tcc agg    96
Ala Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ser Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg
            20                  25                  30
cct ctt gtc tgt cgc ttt ggg tat cag atg gat gaa ggc aac cag tgt    144
Pro Leu Val Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Gly Asn Gln Cys
        35                  40                  45
gtg gat gtg gac gag tgt gcg aca gat tca cac cag tgc aac cct acc    192
Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr
    50                  55                  60
cag atc tgt atc aac acg gaa gga ggg tac acc tgc tcc tgc act gat    240
Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp
65                  70                  75                  80
ggg tac tgg ctt ctg gaa ggg cag tgc cta gat att gat gaa tgt cgc    288
Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg
                85                  90                  95
tat ggt tac tgc cag cag ctc tgt gcg aat gtt cct gga tcc tat tcc    336
Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser
            100                 105                 110
tgt acg tgt aac cct ggc ttc acc ctc aac gat gat gga agg tct tgc    384
Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Asp Asp Gly Arg Ser Cys
        115                 120                 125
caa gat gtg aac gag tgt gaa act gag aac ccc tgt gtt cag acc tgc    432
Gln Asp Val Asn Glu Cys Glu Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys
    130                 135                 140
gtc aac acc tat ggt tct ttc atc tgc cgc tgt gac cca gga tat gaa    480
Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu
145                 150                 155                 160
ctg gag gaa gat ggc att cac tgc agt gat atg gat gag tgc agc ttc    528
Leu Glu Glu Asp Gly Ile His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe
                165                 170                 175
tcc gag ttc ctc tgt caa cat gag tgt gtg aac cag ccg ggc tca tac    576
Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Ser Tyr
            180                 185                 190
ttc tgc tca tgc cct cca ggc tac gtc ttg ttg gaa gat aac cga agc    624
Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Val Leu Leu Glu Asp Asn Arg Ser
        195                 200                 205
tgc cag gat atc aat gaa tgt gag cac cgg aac cac aca tgc act ccc    672
Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Thr Pro
    210                 215                 220
ctg cag act tgc tac aat ctg caa ggg ggc ttc aaa tgt atc gac ccc    720
Leu Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro
225                 230                 235                 240
atc gtc tgc gag gag cct tat ctg ctg att ggg gat aac cgc tgt atg    768
Ile Val Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Leu Ile Gly Asp Asn Arg Cys Met
                245                 250                 255
tgc cct gct gag aat act ggc tgc agg gac cag cca ttc acc atc ttg    816
Cys Pro Ala Glu Asn Thr Gly Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu
            260                 265                 270
ttt cgg gac atg gat gtg gta tca gga cgc tct gtt cct gct gac atc    864
Phe Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile
        275                 280                 285
ttc cag atg caa gca acg acc cga tac cct ggc gcc tat tac att ttc    912
Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe
    290                 295                 300
cag atc aaa tct ggg aac gag ggt cga gag ttc tac atg cgg caa aca    960
Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr
305                 310                 315                 320
ggg cct atc agt gcc acc ctg gtg atg aca cgc ccc atc aaa ggg cct    1008
Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro
                325                 330                 335
cgg gac atc cag ctg gac ttg gag atg atc acc gtc aac act gtc atc    1056
Arg Asp Ile Gln Leu Asp Leu Glu Met Ile Thr Val Asn Thr Val Ile
            340                 345                 350
aac ttc aga ggc agc tcc gtg atc cga ctg cgg ata tac gtg tcc cag    1104
Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln
        355                 360                 365
tat ccg ttc tga                                                    1116
Tyr Pro Phe
    370
<210>16
<211>371
<212>PRT
<213>褐家鼠
<400>16
Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Ser Thr Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Pro
1               5                   10                  15
Ala Ala Ala Pro Pro Val Pro Ala Ser Asn Tyr Pro Thr Ile Ser Arg
            20                  25                  30
Pro Leu Val Cys Arg Phe Gly Tyr Gln Met Asp Glu Gly Asn Gln Cys
        35                  40                  45
Val Asp Val Asp Glu Cys Ala Thr Asp Ser His Gln Cys Asn Pro Thr
    50                  55                  60
Gln Ile Cys Ile Asn Thr Glu Gly Gly Tyr Thr Cys Ser Cys Thr Asp
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Trp Leu Leu Glu Gly Gln Cys Leu Asp Ile Asp Glu Cys Arg
                85                  90                  95
Tyr Gly Tyr Cys Gln Gln Leu Cys Ala Asn Val Pro Gly Ser Tyr Ser
            100                 105                 110
Cys Thr Cys Asn Pro Gly Phe Thr Leu Asn Asp Asp Gly Arg Ser Cys
        115                 120                 125
Gln Asp Val Asn Glu Cys Glu Thr Glu Asn Pro Cys Val Gln Thr Cys
    130                 135                 140
Val Asn Thr Tyr Gly Ser Phe Ile Cys Arg Cys Asp Pro Gly Tyr Glu
145                 150                 155                 160
Leu Glu Glu Asp Gly Ile His Cys Ser Asp Met Asp Glu Cys Ser Phe
                165                 170                 175
Ser Glu Phe Leu Cys Gln His Glu Cys Val Asn Gln Pro Gly Ser Tyr
            180                 185                 190
Phe Cys Ser Cys Pro Pro Gly Tyr Val Leu Leu Glu Asp Asn Arg Ser
        195                 200                 205
Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Glu His Arg Asn His Thr Cys Thr Pro
    210                 215                 220
Leu Gln Thr Cys Tyr Asn Leu Gln Gly Gly Phe Lys Cys Ile Asp Pro
225                 230                 235                 240
Ile Val Cys Glu Glu Pro Tyr Leu Leu Ile Gly Asp Asn Arg Cys Met
                245                 250                 255
Cys Pro Ala Glu Asn Thr Gly Cys Arg Asp Gln Pro Phe Thr Ile Leu
            260                 265                 270
Phe Arg Asp Met Asp Val Val Ser Gly Arg Ser Val Pro Ala Asp Ile
        275                 280                 285
Phe Gln Met Gln Ala Thr Thr Arg Tyr Pro Gly Ala Tyr Tyr Ile Phe
    290                 295                 300
Gln Ile Lys Ser Gly Asn Glu Gly Arg Glu Phe Tyr Met Arg Gln Thr
305                 310                 315                 320
Gly Pro Ile Ser Ala Thr Leu Val Met Thr Arg Pro Ile Lys Gly Pro
                325                 330                 335
Arg Asp Ile Gln Leu Asp Leu Glu MetIle Thr Val Asn Thr Val Ile
            340                 345                 350
Asn Phe Arg Gly Ser Ser Val Ile Arg Leu Arg Ile Tyr Val Ser Gln
        355                 360                 365
Tyr Pro Phe
    370
<210>17
<211>173
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码前原胰蛋白酶信号肽，FLAG标签，6xHis标签以及限制性酶切位点的DNA
<400>17
ggtaccgcta gcgaattcac catgtctgca cttctgatcc tagctcttgt tggagctgca    60
gttgctgact acaaagacga tgacgacaag actagtcatc atcaccatca ccattctaga    120
gaaggatccg atatccgcgg ccgcatcgat tgactagctg aggccgcaaa ccc           173
<210>18
<211>15
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>前原胰蛋白酶信号肽
<400>18
Met Ser Ala Leu Leu Ile Leu Ala Leu Val Gly Ala Ala Val Ala
1               5                   10                  15
<210>19
<211>8
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>FLAG标记物
<400>19
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1               5
<210>20
<211>6
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>6 x His标记物
<400>20
His His His His His His
1               5
<210>21
<211>105
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码前原胰蛋白酶信号肽，Myc标记物和限制性酶切位点的DNA
<400>21
gaattcacca tgtctgcact tctgatccta gctcttgttg gagctgcagt tgctgactac    60
gaagaggacg aacaaaaact catctcagaa gaggatctga ctagt                    105
<210>22
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>Myc标记物
<400>22
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1               5                   10
<210>23
<211>143
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>编码FLAG标记物，6 x His标记物和限制性酶切位点的DNA
<400>23
tggtaccgag ctcggatcca ctagtccagt gtggtggaat tctgcagata tccagcacag    60
tggcggccgt ctagagacta caaagacgat gacgacaaga gagggtctca tcatcaccat    120
caccattgag cggccgcaaa ccc                                            143
<210>24
<211>28
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>扩增人DANCE的PCR引物
<400>24
tctagagcac agtgcacgaa tggctttg                                       28
<210>25
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<400>25
gcggccggtc agaatgggta ctgcgacaca tatatccg                            38
<210>26
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>扩增人LTBP2的PCR引物
<400>26
tctagacaaa gggaccccgt agggagatac gag                                 33
<210>27
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>扩增人LTBP2的PCR引物
<400>27
gcggccgcct ggtactcctt ggcagtgcag tggg                                34
<210>28
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>扩增人DANCE的PCR引物
<400>28
gaattcttct tctcgccttc gcatctcctc c                                   31
<210>29
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>扩增人DANCE的PCR引物
<400>29
tctagagaat gggtactgcg acacatatat ccg                                 33

Claims (34)

1.一种多肽，其包含与序列号6表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，且由DANCE特异的蛋白酶切割DANCE而得到。
2.一种多肽，其包含序列号6表示的氨基酸序列。
3.一种多核苷酸，其具有编码权利要求1中所述多肽的碱基序列。
4.一种多核苷酸，其包含序列号5表示的碱基序列。
5.一种多肽，其包含与序列号8表示的氨基酸序列基本上同一的氨基酸序列，且由DANCE特异的蛋白酶切割DANCE而得到。
6.一种多肽，其包含序列号8表示的氨基酸序列。
7.一种多核苷酸，其具有编码权利要求5中所述多肽的碱基序列。
8.一种多核苷酸，其包含序列号7表示的碱基序列。
9.一种DANCE的切割方法，其特征在于将DANCE与DANCE特异的蛋白酶接触。
10.一种抗体，其对权利要求1或2中所述的多肽具有特异的亲和性。
11.一种单克隆抗体，其对权利要求5或6中所述的多肽具有特异的亲和性。
12.一种方法，其特征在于在来自动物的生物材料中测定DANCE的切割量。
13.一种DANCE的切割量测定用试剂盒，其特征在于含有抗DANCE抗体。
14.一种DANCE突变体，其在DANCE中DANCE特异的蛋白酶对DANCE的切割位点处引入氨基酸突变以使DANCE显示出对该DANCE特异的蛋白酶的抗性。
15.一种多核苷酸，其具有编码权利要求14中所述的多肽的碱基序列。
16.一种DANCE复合体，其至少含有2个DANCE。
17.根据权利要求16中所述的复合体，其至少含有可识别形态的2种DANCE。
18.根据权利要求16或17中所述的复合体，其进一步含有赖氨酰氧化酶和/或LTBP2。
19.一种DANCE复合体，其含有至少1个DANCE，以及赖氨酰氧化酶和/或LTBP2。
20.一种至少含有2个DANCE的DANCE复合体的制备方法，其特征在于使至少2个DANCE接触而形成复合体。
21.一种含有至少1个DANCE，以及赖氨酰氧化酶和/或LTBP2的DANCE复合体的制备方法，其特征在于将至少1个DANCE与赖氨酰氧化酶和/或LTBP2接触。
22.一种筛选可调节DANCE特异的蛋白酶活性的物质的方法，其包含以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)将被检物质与DANCE特异的蛋白酶接触的步骤；
(b)测定由于上述(a)步骤产生的DANCE特异的蛋白酶的活性，将该活性与未接触被检物质时的DANCE特异的蛋白酶的活性进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的比较结果，对调节DANCE特异的蛋白酶活性的被检物质进行选择的步骤。
23.根据权利要求22中所述的方法，其为鉴定弹性纤维形成调节剂的方法。
24.一种筛选可调节DANCE特异的蛋白酶活性的物质的方法，其包含以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)向动物给予被检物质的步骤；
(b)测定由于上述(a)步骤产生的DANCE特异的蛋白酶的活性，将该活性与未给予被检物质时的DANCE特异的蛋白酶的活性进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的比较结果，对调节DANCE特异的蛋白酶活性的被检物质进行选择的步骤。
25.一种筛选下述物质的方法，该物质可调节含有至少2个DANCE的DANCE复合体的形成，该方法包含以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)被检物质存在下，使至少2个DANCE相接触的步骤；
(b)测定由于上述(a)步骤产生的DANCE复合体的量，将该量与不存在被检物质的情况下DANCE复合体的量进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的比较结果，对调节DANCE复合体的形成的被检物质进行选择的步骤。
26.根据权利要求25中所述的方法，其中使用可识别形态的至少2种DANCE。
27.一种筛选下述物质的方法，该物质可调节含有至少1个DANCE，以及赖氨酰氧化酶和/或LTBP2的DANCE复合体的形成，该方法包含以下步骤(a)、(b)以及(c)：
(a)被检物质存在下，将至少1个DANCE与赖氨酰氧化酶和/或LTBP2接触的步骤；
(b)测定由于上述(a)步骤产生的DANCE复合体的量，将该量与不存在被检物质的情况下DANCE复合体的量进行比较的步骤；
(c)基于上述(b)的比较结果，对调节DANCE复合体的形成的被检物质进行选择的步骤。
28.一种弹性纤维形成调节剂，其由权利要求23～27所述的任一种方法得到。
29.一种DANCE特异的蛋白酶的筛选方法，其以DANCE的切割活性为指标。
30.一种DANCE特异的蛋白酶，其由权利要求29中所述的方法得到。
31.一种多核苷酸，其具有编码由权利要求29所述的方法得到的DANCE特异的蛋白酶的碱基序列。
32.一种弹性纤维形成调节剂，其含有权利要求30所述的DANCE特异的蛋白酶，或权利要求31中所述的的多核苷酸。
33.一种试剂盒，其含有以下(a)以及(b)：
(a)DANCE或具有编码DANCE的碱基序列的多核苷酸；
(b)以下(i)～(vi)的至少1种成分；
(i)(a)中DANCE的可识别的形态的DANCE；
(ii)具有编码(a)的DANCE可识别的形态的DANCE的碱基序列的多核苷酸；
(iii)赖氨酰氧化酶；
(iv)具有编码赖氨酰氧化酶的碱基序列的多核苷酸；
(v)LTBP2；
(vi)具有编码LTBP2的碱基序列的多核苷酸。
34.一种DANCE特异的蛋白酶表达细胞的鉴定方法，其含有以下步骤(a)以及(b)：
(a)特定的动物细胞与DANCE接触的步骤；
(b)评价DANCE是否被切割的步骤。
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