CN1947796A - 化学修饰的阿德福韦和泰诺福韦 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对药物分子进行化学修饰以改善现有药物的不足，具体来说是阿德福韦(Adefovir，PMEA)和泰诺福韦(tenofovir，PMPA)与聚乙二醇的结合物，阿德福韦和泰诺福韦和糖基化聚乙二醇结合的结合物，还涉及它们的制备方法和在抗病毒方面的应用。
Description
技术领域
本发明涉及对药物分子进行化学修饰以改善现有药物的不足，具体来说是阿德福韦(Adefovir，PMEA)或泰诺福韦(tenofovir，PMPA)与聚乙二醇的结合物，阿德福韦或泰诺福韦和糖基化聚乙二醇结合的结合物，还涉及它们的制备方法和在抗病毒方面的应用。
背景技术
阿德福韦和泰诺福韦是结构相近的核苷类似物，具有广谱的抗病毒活性，其结构式为：
其中A可选择H或CH3，当A代表H时，即为阿德福韦；当A代表CH3时，即为泰诺福韦。
临床试验发现阿德福韦和泰诺福韦都具有较好的抗艾滋病病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)活性。实验证实阿德福韦和泰诺福韦对体外培养的鸭肝细胞、人肝癌细胞系中乙型肝炎病毒的复制和表达具有显著的抑制作用。动物试验研究表明，阿德福韦和泰诺福韦对于体内的肝炎病毒的复制和表达也具有显著的抑制作用。在长期应用核苷类似物如拉咪夫定等治疗过程中，容易发生病毒基因的突变，从而发生抗药性。研究表明，阿德福韦和泰诺福韦不仅对于野生株具有显著的抑制作用，而且对于拉咪夫定等的耐药病毒株也具有显著的抑制作用(国外医学病毒学分册，2001，3/8，85-90；Hepatology 2004，40：1421-25)。
但在生理pH情况下，分子中直接暴露的膦酸根限制了阿德福韦和泰诺福韦对肠道的穿透力，使得它们在动物和人体中的生物利用度降低，限制了其对疾病的治疗作用。通过对阿德福韦上膦酸官能团的修饰，已经合成出阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil)和泰诺福韦酯(tenofovir disoproxil)，结构式如下：
阿德福韦酯
泰诺福韦酯
阿德福韦酯和泰诺福韦酯的抗病毒部分分别是PMEA和PMPA，进入体内完全转化为PMEA和PMPA而发挥作用。作为阿德福韦和泰诺福韦的前体药物，阿德福韦酯和泰诺福韦酯中膦酸盐上的电荷得到了屏蔽，增加了母体的脂溶性，提高了对肠道细胞膜的穿透力，其口服生物利用度也得到相应的增加。
但是，阿得福韦酯在人体内主要集中分布在肾、肝和肺，临床研究发现阿得福韦酯具有较大的肾毒性，因此只能采用10mg/天的非优化的治疗剂量，这在一定程度上限制了其对疾病的治疗效果。泰诺福韦酯的肾毒性比阿得福韦酯小，但口服剂量需要150-300mg，生物利用度较低，因此，目前仍在寻找更好的前体药物。
目前，临床得以应用的抗乙肝病毒(HBV)药物种类十分有限，已上市药物包括拉咪夫定、阿得福韦酯、恩地卡韦，这些药物的水溶性很差，难以制成注射途径给药的剂型，只有口服给药，临床特别缺乏注射给药途径的抗HBV药物，未满足临床上急重病人的需要。
当前，利用聚乙二醇修饰药物已是一种成熟的技术，药物经聚乙二醇修饰后，一方面分子量显著增加，另一方面聚乙二醇对药物形成屏障，可减少药物的肾清除。药物动力学性质也因而发生较大变化，吸收迟缓、分布容积减小、血浆半衰期延长。因此血药浓度能够长时间维持在较平稳的水平，从而使疗效增强，特别是在抗病毒治疗中，因为持续的抗病毒压力可防止病毒复制，从而抑制耐药变异株的产生。此外，给药间隔延长可提高患者对治疗的依从性，改善患者生活质量，这也有助于改善临床疗效。血药浓度的平稳化还有另外一个益处，即减少血浆药物浓度峰谷波动所引起的不良反应，提高了安全性。我们将阿德福韦和泰诺福韦与聚乙二醇结合可改善它们的药动学性质，以期得到长效低毒的抗病毒药物。
肝细胞半乳糖受体(hepatocyte galactose receptor，H-Gal-R)存在于哺乳动物的肝实质细胞膜上，能特异地识别和结合非还原半乳糖或N-乙酰半乳糖为末端的糖蛋白，通过胞吞作用将其转运到胞内溶酶体进行代谢，利用H-Gal-R介导的各种药物可定向转移到肝细胞内发挥作用。实验证实，H-Gal-R介导系统对肝有较高的亲和性，且肝吸收迅速。由于乙型肝炎病毒核心抗原存在于肝细胞内，核苷类药物需进入肝细胞，并经胸腺嘧啶核苷激酶催化磷酸化后方显效，而核苷类药物不易透过肝细胞，且乙肝病毒感染的细胞缺少胸腺嘧啶核苷激酶，宿主细胞磷酸化作用缓慢，达不到抑制病毒复制的有效浓度，大剂量给药可提高血药浓度，但在血中未被磷酸化的药物可迅速经肾排泄而出现血尿和肾功能障碍等毒副作用(World Chin J Digestol 2003 June；11(6)：799-802)。本发明将糖基化聚乙二醇结合到阿德福韦和泰诺福韦上，将药物定向转移到肝细胞内，从而提高了阿德福韦和泰诺福韦的治疗效果。
发明内容
本发明的目的是对具有广谱抗病毒活性的核苷类似物阿德福韦和泰诺福韦进行化学修饰以提供一种新的长效低毒的抗病毒药物，以及一种具有高度肝细胞靶向性的阿德福韦和泰诺福韦前药。
本发明的另一个目的是提供对阿德福韦和泰诺福韦进行化学修饰的方法。
本发明的再一个目的是提供上述阿德福韦和泰诺福韦前药在抗病毒领域、特别是抗乙肝病毒领域的应用。
本发明所述的阿德福韦和泰诺福韦与聚乙二醇或末端糖基化的聚乙二醇结合物，具有如下通式：
其中，A为H或CH3；
R为形式如X-Y的结构，即基团X和Y的组合，其中Y为H、C1-6的直链、支链或环状的烷基、乳糖和/或其衍生物、半乳糖和/或其衍生物，其中X为O、NH、O-CO、CO-O、S-S、SO2、O-NH、NH-O、O-CO-O、NH-CO-O、O-CO-NH、O-W、NH-W、O-CO-W、CO-O-W、O-W-O、O-W-NH、O-W-CO-O、NH-W-NH、NH-W-O、NH-W-CO-O、CO-O-W-O、CO-O-W-NH或CO-O-W-CO-O，其中W为低级烷基或芳基，X的作用是连接聚乙二醇的末端基团，特别是与乳糖或半乳糖的连接，乳糖、半乳糖与聚乙二醇的连接一般是以酯键和甙键、肽键、亚胺酯键偶连；
R’为CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2，n＝11-450；
R”为O、NH、O-CO、CO-O、S-S、SO2、O-NH、NH-O、O-CO-O、NH-CO-O、O-CO-NH、O-Z、NH-Z、O-CO-Z、CO-O-Z、O-Z-O、O-Z-NH、O-Z-CO-O、NH-Z-NH、NH-Z-O、NH-Z-CO-O、CO-O-Z-O、CO-O-Z-NH或CO-O-Z-CO-O，其中Z为低级烷烃或芳烃，R”是用于连接聚乙二醇长链R’和阿德福韦或泰诺福韦中磷酸酯的基团，以上基团自左到右分别与R’和磷酸酯链接；
上述的低级烷基为C1-6直链、支链或环状的亚烃基，芳烃为苯或其衍生物或芳香杂环化合物或其衍生物的亚基。
当A为H时为阿德福韦衍生物，当A为CH3时为泰诺福韦衍生物；
当Y为C1-6直链、支链或环状的烷基，可以为-CH3、-CH2CH3、-CH2CH2CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH2CH2CH3、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3、-CH(CH3)3、-CH2CH2CH2CH2CH3、-CH(CH3)CH2CH2CH3、-CH(CH2CH3)2、-C(CH3)2CH2CH3、-CH(CH3)CH(CH3)2、-CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)CH2CH3、-CH2C(CH3)3、-CH2CH2CH2CH2CH2CH3、-CH2CH(CH3)CH2CH2CH3、-CH2CH2CH(CH3)CH2CH3、-CH2CH2CH2CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)CH(CH3)2、-CH2C(CH3)2CH2CH3、-CH2CH2C(CH3)3、-CH2CH(CH2CH3)2、-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3、-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3、-CH(CH3)CH2CH(CH3)2、-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)、-CH(CH2CH3)CH(CH3)2、-C(CH3)(CH2CH3)2、-C(CH3)2CH2CH2CH3、-C(CH3)2CH(CH3)2、环丙基、环丁基、环丙基甲基、环戊烷、环丁基甲基、1-环丙基-1-乙基、2-环丙基-1-乙基、环己基、环戊基甲基、1-环丁基-1-乙基、2-环丁基-1-乙基、1-环丙基-1-丙基、2-环丙基-1-丙基、3-环丙基-1-丙基、2-环丙基-2-丙基和1-环丙基-2-丙基；
乳糖基和/或其衍生物、半乳糖基和/或其衍生物可以为硫代半乳糖、2-亚氨基-2-甲氧基-1-硫代-β-D-半乳糖吡糖苷、对-氨基苯基-α-D-乳吡喃糖苷、D(+)-半乳糖胺；
当Y为H、直链、支链或环状烷基时，提供的是一种聚乙二醇化的阿德福韦和泰诺福韦，Y优选为甲基，即单甲氧基聚乙二醇与阿德福韦和泰诺福韦的结合物；当Y为乳糖和/或其衍生物、半乳糖和/或其衍生物时，提供的是一种末端糖基化的聚乙二醇化阿德福韦和泰诺福韦，Y优选半乳糖基或硫代半乳糖基；
低级烷烃可以为亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基，芳香杂环化合物或其衍生物包括但不限于吡啶基、噻唑基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、硫萘基、吲哚基、亚吲哚基(indolenyl)，喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、2-吡咯烷酮基、吡咯啉基、三嗪基、噻蒽基、吡喃基、异苯并呋喃基、吩噁噻嗯基(phenoxathinyl)、异噻唑基、异噁唑基、吡嗪基、哒嗪基、嘌啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、1，2-二氮杂萘基、4aH-卡唑基、卡唑基、β-咔啉基、菲啶基、丫啶基、嘧啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、趺咱基、吩噁嗪基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、哌嗪基、奎宁环基、吗啉基、噁唑烷基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、羟吲哚基、苯并噁唑啉基。
所述n的数值意义是使聚乙二醇的分子量达到500-20000。
式(II)是指聚乙二醇两端均结合了阿德福韦或泰诺福韦的化合物，提供的也是一种具有缓释作用和良好安全性能的抗病毒前药。
本发明提供的是一种阿德福韦或泰诺福韦与聚乙二醇的结合物和它们与具有肝细胞定向作用的糖基化聚乙二醇结合的新化合物，它们能够用于治疗病毒性疾病，特别是治疗乙型肝炎，是一种高效、低毒且具有高度肝细胞靶向作用的抗病毒药物。
本发明化合物作为活性成分，可以加有或不加药用载体，按药学领域常规的生产方法制成不同给药途径的制剂。这些制剂可通过口服、直肠或肠胃外给药方式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂等，还可制成液体制剂如糖浆、口服液等。
由于本发明衍生物有良好的水溶性，可以加或不加药物载体制成注射剂、口服液等液体制剂。所述的注射剂包括注射液、注射用无菌粉针和注射用浓溶液。
注射液的制备方法为，将上述化合物加入注射用水中，搅拌至全溶，加入等渗调节剂搅拌至全溶，调节酸碱度，如果需要，还可以包括加入稳定剂、增溶剂，然后依次经过脱炭、粗滤、定容、精滤、灌封、灭菌即可。
口服液的制备方法为，直接将上述化合物加入到纯水中，根据情况可以加入甜味剂和/或防腐剂。
式(I)或式(II)所示的化合物可按如下方法制备：
阿德福韦(或泰诺福韦)聚乙二醇结合物的制备方法。
将单甲氧基聚乙二醇或其衍生物和阿德福韦(或泰诺福韦)加入有机溶剂中，在吡啶和二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下，20～120℃加热反应0.5～24小时，得到式(I)所示化合物。
将聚乙二醇或其衍生物和阿德福韦(或泰诺福韦)加入有机溶剂中，在吡啶和二环己基碳二亚胺(DCC)的存在下，40～120℃加热反应0.5～10小时，得到式(II)所示化合物。
阿德福韦(或泰诺福韦)与末端糖基化的聚乙二醇结合物的制备：
方法一：将由上述方法制得的阿德福韦(或泰诺福韦)与单甲氧基聚乙二醇的结合物用三甲基碘硅烷将甲氧基转化为醇羟基，再与琥珀酸酐反应，制得阿德福韦(或泰诺福韦)-聚乙二醇-丁二酸单酯，然后与对-氨基苯基-α-D-乳吡喃糖苷反应制得目标产品。
方法二：将阿德福韦(或泰诺福韦)与单甲氧基聚乙二醇(mPEG)的结合物用三甲基碘硅烷将甲氧基转化为醇羟基后，在碱性条件下，与1，2-二溴乙烷发生烃化反应，然后与2-S-(2，3，4，6-四-O-乙酰-β-1)-吡喃半乳糖基-2-异硫脲氢溴酸盐，在碳酸钾和亚硫酸氢钠存在下反应，最后在甲醇中，用甲醇钠还原糖基上的乙酰保护基，即得目标产品。
阿德福韦和泰诺福韦在经过聚乙二醇修饰之后，PEG对原药形成屏障，分子量显著增加，减少了药物的肾清除，降低了药物的肾毒性；另一方面药物动力学性质也发生较大变化，主要表现为吸收迟缓、分布容积减小、血浆半衰期延长等。由于药物半衰期延长，血药浓度能够长时间维持在较平稳、有效的水平，从而提高了药物的生物利用度，使疗效增强，特别是在抗病毒治疗中，持续的抗病毒压力可防止病毒复制，抑制耐药变异株的产生。此外，给药间隔延长可提高患者对治疗的依从性，改善患者生活质量，血药浓度的平稳化还有另外一个益处，即减少血浆药物浓度峰谷波动所引起的不良反应，提高了安全性。我们通过动物实验也证明了以上的这些结论。因此，与现有的阿德福韦和泰诺福韦的前体药物阿德福韦酯和泰诺福韦酯药物相比，本发明化合物具有显著进步。
我们将阿德福韦和泰诺福韦与末端连接乳糖或半乳糖的聚乙二醇结合，不仅具有聚乙二醇修饰的优点，而且可以利用肝细胞的胞吞作用，使药物容易透过肝细胞发挥抗病毒作用，使药物具有高度的靶向性，以降低药物的肾毒性等副作用，提高其抗病毒的能力。
本发明还解决了现有药物难以制成液体制剂的不足。阿德福韦和泰诺福韦原药以及现有的前药阿德福韦酯和泰诺福韦酯均难熔于水，难以制成液体制剂。但本衍生物有良好的水溶性，可以加或不加药物载体制成注射剂、口服液等液体制剂。目前，临床得以应用的抗乙肝病毒(HBV)药物只有口服给药，缺乏注射给药途径的抗HBV药物，不能满足临床上急重病人的需要。本发明的阿德福韦和泰诺福韦聚乙二醇化前药克服了现有技术的这一缺陷。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的举例说明，而非对本发明的限制。
本发明所使用的原料阿德福韦由文献：Holy A，Roseenberg I，Dvorakova H.Synthesis of N-(2-phosphonylmethoxyethyl)derivatives of heterocyclic base[J].Collect Czech Chem Commun，1989，5：2190～2195方法合成。泰诺福韦按专利US4808716、WO9804569所描述的方法合成。
实施例1阿德福韦-甲氧基聚乙二醇2000的制备
将140g(0.07mol)的单甲氧基聚乙二醇2000(mPEG2000)加入500ml甲苯中，加热熔解，蒸出甲苯约400ml，加入250ml的N，N-二甲基甲酰胺、70ml吡啶、9.6g(0.035mol)阿德福韦和27g二环己基碳二亚胺，加热升温至100℃，并在此温度下反应120分钟，冷却至室温，加入1000ml乙酸乙酯，搅拌2小时，过滤，母液回收溶剂，向残余物中加入500ml无水乙醇溶解，然后缓慢加入剧烈搅拌的2000ml无水乙醚中，冷却，过滤，滤饼室温减压干燥24小时，得130g。熔点49～52℃，含阿德福韦6.8％。
实施例2阿德福韦-甲氧基聚乙二醇胺2000的制备
将140g(0.07mol)除水后的聚乙二醇胺2000(mPEG-NH2)加入250ml的N，N-二甲基甲酰胺中，加入9.6g(0.035mol)阿德福韦和21g DCM，室温搅拌24小时，加入1000ml乙酸乙酯，搅拌2小时，过滤，母液回收溶剂，向残余物中加入500ml无水乙醇溶解，然后缓慢加入剧烈搅拌的2000ml无水乙醚中，冷却，过滤，滤饼室温减压干燥24小时，得126g产品。熔点49～53℃，含阿德福韦6.8％。
实施例3阿德福韦-甲氧基聚乙二醇1000的制备
按照实施例1方法制备，单甲氧基聚乙二醇1000和阿德福韦投料摩尔比为2∶1，得阿德福韦聚乙二醇1000，熔点为34～38℃，含阿德福韦13.6％。
实施例4阿德福韦-甲氧基聚乙二醇5000的制备
按照实施例1方法制备，单甲氧基聚乙二醇5000和阿德福韦投料摩尔比为2∶1，得阿德福韦聚乙二醇5000，熔点为50～55℃，含阿德福韦2.7％。
实施例5阿德福韦-甲氧基聚乙二醇10000的制备
按照实施例1方法制备，单甲氧基聚乙二醇10000和阿德福韦投料摩尔比为2∶1，得阿德福韦聚乙二醇10000，熔点为56～60℃，含阿德福韦1.3％。
实施例6阿德福韦-甲氧基聚乙二醇20000的制备
按照实施例1方法制备，单甲氧基聚乙二醇20000和阿德福韦投料摩尔比为2∶1，得阿德福韦聚乙二醇20000，熔点为58～64℃，含阿德福韦0.6％。
实施例7二阿德福韦-聚乙二醇2000的制备
将140g(0.07mol)的PEG2000(聚乙二醇2000)加入500ml甲苯中，加热熔解，蒸出甲苯约400ml，加入250ml的N，N-二甲基甲酰胺、70ml吡啶、19.2g(0.07mol)阿德福韦和54g二环己基碳二亚胺，加热升温至100℃，保温反应120分钟，冷却至室温，加入1000ml乙酸乙酯，搅拌2小时，过滤，母液回收溶剂，向残余物中加入500ml无水乙醇溶解，然后缓慢加入剧烈搅拌的2000ml无水乙醚中，冷却，过滤，滤饼室温减压干燥24小时，得132g产品。熔点48～52℃，含阿德福韦13.6％。
实施例8二阿德福韦-聚乙二醇10000的制备
按照实施例6方法制备，聚乙二醇10000和阿德福韦投料摩尔比为1∶1，得二阿德福韦聚乙二醇10000，熔点为56～60℃，含阿德福韦2.6％。
实施例9泰诺福韦-聚乙二醇的制备
按实施例1到6同样的方法制备泰诺福韦聚乙二醇，制得的聚乙二醇化泰诺福韦性状如表1。
表1聚乙二醇化泰诺福韦的件状
| 熔点(℃) | 泰诺福韦含量(％) | |
| 泰诺福韦-甲氧基聚乙二醇2000 | 49～55 | 2.8 |
| 泰诺福韦-甲氧基聚乙二醇10000 | 56～61 | 5.6 |
| 二泰诺福韦-聚乙二醇2000 | 48～55 | 12.6 |
实施例10阿德福韦-聚乙二醇2000-乳糖
1、阿德福韦-聚乙二醇2000-丁二酸单酯
将149g(0.035mol)阿德福韦-甲氧基聚乙二醇2000加入450ml氯仿中，加入7.0g三甲基碘硅烷，室温搅拌6小时，加入25ml水，搅拌10分钟，静置分层，取氯仿层，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，加入35.0g(0.35mol)丁二酸酐和20ml的吡啶，60℃左右回流反应48小时，减压蒸干，向残余物中加入150ml的0.1M的碳酸氢钠水溶液，抽滤，滤液用150ml的0.1M的盐酸酸化，并调节pH值至3-4，而后用乙酸乙酯150ml×3萃取，合并乙酸乙酯溶液，用饱和氯化钠溶液100ml×2洗涤，加入无水硫酸钠干燥，旋转蒸干溶剂，残余物加入30ml乙酸乙酯溶解，然后在剧烈搅拌下加入大量的无水乙醚中，冷却搅拌半小时，过滤，真空干燥至恒重，得120g阿德福韦-聚乙二醇2000-丁二酸单酯。熔点46-1-47.8℃。
2、阿德福韦-聚乙二醇2000-乳糖
取5g(0-001mol)阿德福韦-聚乙二醇2000-丁二酸单酯，加入20ml无水N，N-二甲基甲酰胺中，加入2ml三乙胺，在冰水浴中逐滴加入溶于2ml干燥N，N-二甲基甲酰胺的2g氯甲酸异丙酯的溶液中，搅拌混合物10分钟，然后加入0.002mol的对-氨基苯基-α-D-乳吡喃糖苷(Sigma)，冰浴下搅拌30分钟，再在室温下搅拌3小时，然后加入大量的无水乙醚中，沉淀产物。最后过ConA-Sepharose柱(Sigma)纯化，得阿德福韦-聚乙二醇2000-乳糖，收率73％。
实施例11阿德福韦-聚乙二醇2000-半乳糖
1、阿德福韦-聚乙二醇2000-乙酰化半乳糖
取149g(0.035mol)阿德福韦-甲氧基聚乙二醇2000，按上述方法用三甲基碘硅烷将聚乙二醇上的甲氧基转化为醇，水洗、干燥后蒸去溶剂氯仿，加入450ml乙酸乙酯溶解，加入15g无水碳酸钾，加热回流，滴加16g 1，2-二溴乙烷，回流反应4小时，冷至室温，过滤，减压蒸干，加入400ml丙酮和150ml水溶解，加入67g(0.14mol)2-S-(2，3，4，6-四-O-乙酰-β-1)-吡喃半乳糖基-2-异硫脲氢溴酸盐，和碳酸钾23g(0.167mol)，室温搅拌10分钟，加入亚硫酸氢钠14.6g(0.14mol)，避光室温搅拌24小时，减压蒸干，用500ml氯仿溶解，用饱和食盐水100ml×1洗涤，减压浓缩，所得残余物溶于水中，用柱色谱纯化(树脂HPD-300，洗脱剂：水/乙醇＝95/5)，洗脱液浓缩，用200ml乙酸乙酯溶解，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩乙酸乙酯至50ml，加入剧烈搅拌的大量无水乙醚中，冷却，过滤，真空干燥，得白色粉末状固体，熔点42-44℃，收率32％。
2、阿德福韦-聚乙二醇2000-半乳糖
取上述方法制得的阿德福韦-聚乙二醇2000-乙酰化半乳糖20g溶于100ml无水甲醇中，加入0.1N的甲醇钠的甲醇溶液20ml，室温搅拌6小时，减压浓缩，加入氯仿200ml溶解，用饱和氯化钠水溶液100ml×3洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩，用20ml乙酸乙酯溶解，加入剧烈搅拌的大量无水乙醚中，冷却，过滤，真空干燥，得白色粉末状固体，熔点40-42℃，收率82％。
实施例12
泰诺福韦mPEG2000和二泰诺福韦PEG2000在鸭体内对乙型肝炎病毒感染的治疗效果
将感染阳性鸭随机分组，每组6只，分设为1.病毒对照组，用生理盐水。2.泰诺福韦mPEG2000小剂量组(50mg/kg)。3.泰诺福韦mPEG2000中剂量组(100mg/kg)。4.泰诺福韦mPEG2000大剂量组(200mg/kg)。5.二泰诺德福韦PEG2000小剂量组(50mg/kg)，6.二泰诺福韦PEG2000中剂量组(100mg/kg)。7.二泰诺福韦PEG2000大剂量组(200mg/kg)。每天口腔灌喂2次。实验用药时间为10天，停药观察3天。观察指标：用药前(T0)、用药5天(T5)、用药10天(T10)、停药3天(P3)分别颈外静脉抽血，分离血清于-20℃保存待检。实验结果见表2、3。
表2泰诺福韦单甲氧基聚乙二醇2000和二泰诺福韦聚乙二醇2000治疗组
与病毒感染对照组鸭血清DHBA-DNA OD值比较(
x±S)
| 组别 | 剂量mg/kg(Bid×10) | 鸭数(只) | 鸭血清DHBV-DNA OD值 | |||
| T0 | T5 | T10 | P3 | |||
| 对照组泰诺福韦mPEG2000二泰诺福韦PEG2000 | 5010020050100200 | 6666666 | 1.084±0.200.99±0.061.01±0.111.14±0.091.15±0.091.10±0.101.08±0.14 | 1.00±0.190.90±0.23O.85±0.190.89±0.181.08±0.171.07±0.121.00±0.09* | 1.13±0.160.78±0.16*0.75±0.11*0.81±0.06**0.93±0.18*0.76±0.10*0.73±0.13* | 1.22±0.210.88±0.150.69±0.09**0.74±0.14**1.02±0.130.66±0.11*0.56±0.10** |
统计方法为，进行治疗前后自身配对t检验。将用药组不同时间DNA水平与同组用药前的DNA水平进行比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
表3泰诺福韦单甲氧基聚乙二醇2000和二泰诺福韦聚乙二醇2000治疗组
与病毒感染对照组鸭血清DHBA-DNA水平抑制率的比较
| 药物 | 剂量mg/kg(Bid×10) | 鸭数(只) | 抑制率(％) | ||
| T5 | T10 | P3 | |||
| 生理盐水 | 6 | 7.02 | -4.75 | -13.27 | |
| 泰诺福韦mPEG2000 | 50100200 | 666 | 9.0816.1522.19 | 21.5625.7428.94 | 11.1131.6835.09 |
| 二泰诺福韦PEG2000 | 50100200 | 666 | 6.092.737.41 | 19.1330.9132.41 | 11.3040.0048.15 |
生理盐水组用药后血清DHBA-DNA水平无明显变化，泰诺福韦mPEG2000小剂量用药10天血清DHBV-DNA水平显著降低(P＜0.05)，停药后第3天血清DHBV-DNA水平有所升高，泰诺福韦mPEG2000中、大剂量用药10天和停药后第3天均有血清DHBV DNA水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01；二泰诺福韦PEG2000小剂量用药10天血清DHBV-DNA水平显著降低(P＜0.05)，停药后第3天血清DHBV-DNA水平有所升高，二泰诺福韦PEG2000中、大剂量用药10天和停药后第3天均有血清DHBV DNA水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
结果显示泰诺福韦mPEG2000和二泰诺福韦PEG2000有明显抑制肝内DHBV-DNA复制的作用，并且在100mg/kg、200mg/kg剂量下未出现停药后的“反跳”现象。
实施例13药效试验
阿德福韦mPEG2000和二阿德福韦PEG2000在鸭体内对乙型肝炎病毒感染的治疗效果
将感染阳性鸭随机分组，每组6只，分设为1.病毒对照组，用生理盐水。2.阿德福韦mPEG2000小剂量组，剂量为50mg/kg。3.阿德福韦mPEG2000中剂量组，剂量为100mg/kg。4.阿德福韦mPEG2000大剂量组，剂量为200mg/kg。5.二阿德福韦PEG2000小剂量组，剂量为50mg/kg，6.二阿德福韦PEG2000中剂量组，剂量为100mg/kg，7.二阿德福韦PEG2000大剂量组，剂量为200mg/kg。每天口腔灌喂2次。实验用药时间为10天，停药观察3天。观察指标：用药前(T0)、用药5天(T5)、用药10天(T10)、停药3天(P3)分别颈外静脉抽血，分离血清于-20℃保存待检。实验结果见表4、5。
表4阿德福韦单甲氧基聚乙二醇2000和二阿德福韦聚乙二醇2000治疗组
与病毒感染对照组鸭血清DHBA-DNA OD值比较(
x±S)
| 组别 | 剂量mg/kg(Bid×10) | 鸭数(只) | 鸭血清DHBV-DNA OD值 | |||
| T0 | T5 | T10 | P3 | |||
| 对照组阿德福韦mPEG2000二阿德福韦EG2000 | 5010020050100200 | 6666666 | 0.914±0.161.266±0.031.313±0.271.071±0.090.962±0.111.192±0.121.088±0.16 | 0.784±0.151.209±0.081.132±0.20*0.882±0.11*0.928±0.091.099±0.110.905±0.13 | 0.799±0.101.119±0.07**1.084±0.18*0.594±0.11**0.940±0.120.994±0.09**0.830±0.15** | 1.017±0.121.059±0.07**0.923±0.13**0.4±0.11**0.972±0.101.005±0.04*0.737±0.14** |
统计方法为进行治疗前后自身配对t检验。将用药组不同时间DNA水平与同组用药前DNA水平进行比较：*P＜0.05，**P＜0.01。
表5阿德福韦单甲氧基聚乙二醇2000和二阿德福韦聚乙二醇2000治疗组
与病毒感染对照组鸭血清DHBA-DNA水平抑制率的比较
| 药物 | 剂量mg/kg(Bid×10) | 鸭数(只) | 抑制率(％) | ||
| T5 | T10 | P3 | |||
| 生理盐水 | 6 | 12.52 | 10.17 | -15.60 | |
| 阿德福韦mPEG2000 | 50100200 | 666 | 4.4713.1817.42 | 11.5716.2744.14 | 16.2927.2862.65 |
| 二阿德福韦PEG2000 | 50100200 | 666 | 3.227.5515.52 | 1.6916.1023.43 | -2.0815.1532.36 |
生理盐水组用药后血清DHBA-DNA水平无明显变化，阿德福韦mPEG2000小剂量用药10天和停药后第3天均有血清DHBV-DNA水平显著降低(P＜0.05)，阿德福韦mPEG2000中、大剂量用药5天、10天和停药后第3天均有血清DHBVDNA水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，二阿德福韦EG2000中、大剂量用药10天和停药后第3天均有血清DHBV DNA水平显著降低(P＜0.05或P＜0.01)。
结果提示阿德福韦mPEG2000和二阿德福韦PEG2000有明显抑制肝内DHBV-DNA复制的作用，并且未出现停药后“反跳”的现象。
实施例14急毒试验
对阿德福韦单甲氧基聚乙二醇2000进行安全性试验，一次静脉给与小鼠5g/kg(相当于阿德福韦0.3g/kg)剂量，没有出现小鼠死亡现象，表明聚乙二醇化阿德福韦安全性良好。
Claims (11)
1、阿德福韦和泰诺福韦的聚乙二醇化衍生物，其通式为：
其中，A为H或CH3；
R为形式如X-Y的结构，其中Y为H、C1-6的直链、支链或环状的烷基、乳糖和/或其衍生物、半乳糖和/或其衍生物，其中X为O、NH、O-CO、CO-O、S-S、SO2、O-NH、NH-O、O-CO-O、NH-CO-O、O-CO-NH、O-W、NH-W、O-CO-W、CO-O-W、O-W-O、O-W-NH、O-W-CO-O、NH-W-NH、NH-W-O、NH-W-CO-O、CO-O-W-O、CO-O-W-NH或CO-O-W-CO-O，其中W为低级烷基或芳基；
R’为CH2-(CH2-O-CH2)n-CH2，n＝11-450；
R”为O、NH、O-CO、CO-O、S-S、SO2、O-NH、NH-O、O-CO-O、NH-CO-O、O-CO-NH、O-Z、NH-Z、O-CO-Z、CO-O-Z、O-Z-O、O-Z-NH、O-Z-CO-O、NH-Z-NH、NH-Z-O、NH-Z-CO-O、CO-O-Z-O、CO-O-Z-NH或CO-O-Z-CO-O，其中Z为低级烷基或芳基，以上基团自左到右分别与R’和磷酸酯链接；
上述的低级烷烃为C1-6直链、支链或环状的亚烃基，芳烃为苯或其衍生物或芳香杂环化合物或其衍生物的亚基。
2、权利要求1所述的化合物，其特征在于X为O，Y为甲基、乳糖或半乳糖。
3、权利要求2所述的化合物，其特征在于X为O，Y为甲基。
4、权利要求2所述的化合物，其特征在于X为O，Y为半乳糖。
5、权利要求2所述的化合物，其特征在于X为O，Y为乳糖。
6、权利要求1所述的化合物，其特征在于R”为O。
7、权利要求1所述的化合物在制备抗病毒药物中的用途。
8、权利要求7所述的用途为在制备抗乙肝病毒药物中的用途。
9、一种药物组合物，含有权利要求1所述的化合物作为活性成分。
10、权利要求9的组合物，为口服剂型或注射剂型。
11、权利要求10所述的组合物，其特征在于口服剂型为片剂，胶囊剂、颗粒剂或口服液；注射剂包括注射液、注射用无菌粉针和注射用浓溶液。
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-
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