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CN1934127B - Αβ免疫原性肽载体-偶联物及其生产方法 - Google Patents

Αβ免疫原性肽载体-偶联物及其生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及产生Aβ肽免疫原与蛋白质/多肽载体分子的偶联物的方法，所述偶联物可用作免疫原，其中肽免疫原通过载体或任选附着的接头分子的氨基酸残基上活化的官能团与蛋白质载体偶联，并且其中氨基酸残基上任何未偶联的反应性官能团通过加帽灭活，由此保留载体分子的免疫官能性，但降低可以进行使偶联物更不安全或者更不有效的不需要反应的倾向。此外，本发明还涉及由所述方法制备的所述免疫原性产品和含有所述免疫原性产品的免疫原性组合物。

Description

Αβ免疫原性肽载体-偶联物及其生产方法
相关申请的交叉引用
本申请根据U.S.C.§119(e)要求2003年12月17日提交的美国临时专利申请60/530,481的优先权，其在此用于所有目的作为参考整体引入。
背景技术
获得性免疫的本质是生物体对外源物质的出现作出反应并产生能够与其特异性相互作用并保护宿主免受其侵入的组分(抗体和细胞)的能力。″抗原″或″免疫原″是能够引发这种类型的免疫应答并且还能与致敏细胞以及针对其产生的抗体相互作用的物质。
抗原或免疫原通常为大分子，含有被免疫系统的不同组分识别并与之相互作用的独特的抗原位点或″表位″。它们可以由合成的有机化学品、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、RNA、DNA或多糖组成的单个分子形式存在，或其可以是细胞结构(细菌或真菌)或病毒的一部分(Harlow和Lane 1988a，b，c；Male等.，1987)。
如短肽的小分子虽然通常能与免疫应答产物相互作用，但是常常无法单独引起应答。这些肽免疫原或也称为″半抗原″实际上是不完全抗原，并且虽然不能通过自身产生免疫原性或引起抗体的产生，但可通过将其与合适的载体偶联而制备成具有免疫原性。载体通常为具有更高分子量的蛋白质抗原，当体内施用时能够产生免疫应答。
免疫应答中，由B-淋巴细胞连同T-辅助(TH)细胞产生抗体并分泌抗体。大多数半抗原-载体系统的情况下，B-细胞产生对半抗原和载体都具有特异性的抗体。在这些情况下，T淋巴细胞将对载体具有特异 性结合结构域，但不会单独识别半抗原。B和T-细胞以一种协同作用的方式协同诱导半抗原-特异性抗体的应答。在发生了这种免疫应答后，如果随后仅用半抗原攻击宿主，通常的应答结果是由初次免疫后形成的记忆细胞产生半抗原-特异性抗体。
通常模拟大分子上一些关键表位结构的合成半抗原与载体偶联对大″亲本″分子产生免疫应答。例如，可以从蛋白的已知序列合成短肽片段并且与载体偶联从而诱导针对天然蛋白质的免疫原性。这种用于产生免疫原的合成方法已成为当前许多用于疫苗产生的研究的基础。然而，许多情况中，尽管设计得很好，利用合成的肽-载体偶联物仅仅产生B-细胞应答，不会始终保证针对完整抗原的完全保护性免疫。由来自大病毒颗粒或细菌细胞的短肽表位产生的免疫应答可能只是足以产生B-细胞水平的记忆。这样的话，目前通常接受的观点是细胞毒性T-细胞应答是保护性免疫的更重要的指标。如今，利用用于B-细胞和T-细胞识别的适当的表位结合位点设计肽免疫原是免疫学中最具挑战性的研究领域之一。
通过将较小或较差免疫原性的分子与较大的″载体″分子偶联提高这些分子的免疫原性的方法已成功应用了数十年(参见，例如，Goebel等.(1939)J.Exp.Med.69：53)。例如，已描述了许多免疫原性组合物，其中通过利用这种″载体效应″，纯化的荚膜聚合物(capsularpolymer)与载体蛋白结合而产生更有效的免疫原性组合物(Schneerson等.(1984)Infect.Immun.45：582-591)。结合还显示出规避通常用游离多糖免疫婴儿时观察到的较差的抗体应答(Anderson等.(1985)J.Pediatr.107：346；Insel等.(1986)J.Exp.Med.158：294)。
利用多种交联/偶联剂，诸如同双功能、异双功能或零-长度交联剂成功产生了半抗原-载体偶联物。目前许多这样的方法可用于糖类、蛋白质和肽与肽载体的偶联。大多数方法产生胺、酰胺、尿烷、异硫脲或二硫键或有时为硫醚。利用将反应位点引入载体和/或半抗原分子上 反应性氨基酸分子侧链中的偶联剂的缺点在于如果反应位点不被中和其将与任何不需要的分子在体外(因此有害地影响偶联物的功能性或稳定性)或在体内(因此在用该制剂免疫的人或动物体内造成有害事件的潜在风险)反应。所述多余的反应位点可利用多种已知的化学反应而反应或″加帽″，以便灭活这些位点，但是这些反应可能另外破坏该偶联物的功能性。这一点在试图通过将反应位点引入载体分子中而产生偶联物时可能尤其是个问题，因为较大的体积和更复杂的结构(相对于半抗原)可能使其更易受化学处理的破坏作用的影响。事实上，没有已知的该方法的实例，即偶联物首先通过活化载体，然后在偶联反应中与半抗原反应，并且最后对剩下的反应位点″加帽″，同时维持得到的偶联物用作具有所需″载体效应″特性的免疫原性组合物的能力而进行制备。
发明概要
本发明涉及产生包括Aβ肽或Aβ片段或其类似物的肽免疫原与蛋白质/多肽载体的免疫原性偶联物的方法，其中该Aβ肽或Aβ片段或其类似物通过载体氨基酸残基如赖氨酸残基的衍生的官能团与载体偶联，并且其中该氨基酸残基的任意未结合的、衍生的官能团通过加帽灭活以阻断其与其他分子，包括蛋白质/多肽反应而保持载体的功能性，使得其保留针对肽免疫原引起在没有载体时不会出现的所需免疫反应的能力。此外，本发明还涉及通过上述方法产生的偶联物，以及含有所述偶联物的免疫原性组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及将包括Aβ肽或Aβ片段或其类似物的肽免疫原通过该肽免疫原的氨基酸残基的反应基团偶联至具有一个或多个官能团的蛋白质/多肽载体的第一种方法，该方法包括如下步骤：(a)衍生该蛋白质/多肽载体的一个或多个官能团以产生具有反应位点的衍生分子；(b)将步骤(a)的衍生的蛋白质/多肽载体在使肽免疫原通过官能团与衍生的蛋白质/多肽载体偶联的反应条件下与肽免疫原的氨基酸残基的反应基团反应；和(c)将偶联物与加帽试剂进 一步反应以灭活活化的蛋白质/多肽载体上的游离的反应性官能团，由此保持载体的功能性使其保持针对肽免疫原引发在没有载体时不会出现的所需免疫反应的能力。
在一个实施方案中，蛋白质/多肽载体选自人血清白蛋白、钥孔血蓝素、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、流感血球凝集素、PAN-DR结合肽(PADRE多肽)、疟疾环子孢子(CS)蛋白、乙型肝炎表面抗原(HBsAg19-28)、热休克蛋白(HSP)65、卡介苗(BCG)、霍乱毒素、减毒的霍乱毒素变体、白喉毒素、与白喉毒素交叉反应的CRM197蛋白、重组链球菌C5a肽酶、化脓链球菌(Steptococcuspyogenes)ORF1224、化脓链球菌ORF1664、化脓链球菌ORF2452、肺炎链球菌溶血素、减毒的肺炎链球菌溶血素变体、肺炎衣原体ORFT367、肺炎衣原体ORF T858、破伤风类毒素、HIV gp120T1、识别微生物表面粘附基质分子的组分(MSCRAMMS)、生长因子/激素、细胞因子和趋化因子。
在另一个实施方案中，蛋白质/多肽载体含有T-细胞表位。 
在另一个实施方案中，蛋白质/多肽载体为如上所述的例如破伤风类毒素、霍乱毒素或霍乱毒素变体的细菌类毒素。在一个优选的实施方案中，蛋白质/多肽载体为CRM197。
在另一个实施方案中，蛋白质/多肽载体可以是流感血球凝集素、PADRE多肽、疟疾CS蛋白、乙型肝炎表面抗原(HSBAg19-28)、热休克蛋白65(HSP 65)或来自结核分枝杆菌的多肽(BCG)。
在一个优选的实施方案中，蛋白质/多肽载体选自链球菌rC5a肽酶、化脓链球菌ORF1224、化脓链球菌ORF1664或化脓链球菌ORF2452、肺炎球菌溶血素、减毒的肺炎球菌溶血素变体、肺炎衣原体ORF T367和肺炎衣原体ORF T858。
在一个实施方案中，蛋白质/多肽载体为生长因子或激素，其刺激或增强免疫应答并且选自IL-1、IL-2、γ-干扰素、IL-10、GM-CSF、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。
在一个方面，本发明提供了包括Aβ肽或Aβ片段或其引起针对Aβ内某些表位的免疫原性应答的类似物的肽免疫原。本发明的免疫原性肽包括免疫原性的异源肽。一些免疫原性肽中，Aβ片段与载体连接形式免疫原性异源肽，并且随后利用本发明的方法该异源肽与载体连接形成偶联物。
在本发明的另一个方面，肽免疫原为包括Aβ的至少残基1-5的N-末端片段的多肽，Aβ的第一个残基为多肽的N-末端残基，其中多肽不含Aβ的C-末端片段。在本发明的另一个方面，肽免疫原为包括AβN-末端片段的多肽，该片段从Aβ的残基1-3开始并且终止于Aβ的残基7-11。在本发明的一些方面，肽免疫原为诱导针对Aβ的N-末端片段的免疫原性应答的因子，该片段从Aβ的残基1-3开始并且终止于Aβ的残基7-11，而不诱导针对Aβ43残基12-43内的表位的免疫原性应答。在本发明的另一个方面，肽免疫原为包括与异源氨基酸序列连接的Aβ片段的异源多肽，其诱导针对异源氨基酸序列的辅助T-细胞应答和由此针对N-末端片段的B-细胞应答。
在一些肽免疫原中，Aβ的N-末端片段以其C-末端与异源多肽连接。在一些肽免疫原中，Aβ的N-末端片段以其N-末端与异源多肽连接。在一些肽免疫原中，Aβ的N-末端片段以其N和C-末端与第一和第二异源多肽连接。在一些肽免疫原中，Aβ的N-末端片段以其N-末端与异源多肽连接，并且以其C-末端与该N-末端片段的至少另一拷贝连接。在一些肽免疫原中，多肽包括从N-末端到C-末端，Aβ的N-末端片段、该N-末端片段的多个另外的拷贝以及异源氨基酸片段。
在上述的一些肽免疫原中，多肽进一步包括N-末端片段的至少另一拷贝。在上述的一些肽免疫原中，该片段不含Aβ43中的至少5个C-末端氨基酸。
在上述肽免疫原的一些方面，所述片段包括来自Aβ高达10个的连续氨基酸。
在另一个方面，本发明提供了包括Aβ肽或Aβ片段或其引起针对Aβ内某些表位的免疫原性应答的类似物的肽免疫原，其可以是称为多个抗原肽(MAP)构型的构型。
在本发明上述的一些方面中，该肽免疫原来自Aβ的N-末端半。在本发明的一些方面中，肽免疫原为选自Aβ1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-10、1-11、1-12、1-16、3-6和3-7的Aβ片段。在本发明上述的一些方面中，该肽免疫原来自Aβ的内部区域。在本发明的一些方面中，所述肽免疫原为选自Aβ13-28、15-24、17-28和25-35的Aβ片段。在本发明上述的一些方面中，所述肽免疫原来自Aβ的C-末端。在本发明的一些方面中，所述肽免疫原为选自Aβ33-42、35-40和35-42的Aβ片段。在本发明的一些方面中，该肽免疫原为选自Aβ1-3、1-4、1-5、1-6、1-7、1-10、1-11、1-12、1-16、1-28、3-6、3-7、13-28、15-24、17-28、25-35、33-42、35-40和35-42的Aβ片段。在本发明的一些方面中，肽免疫原为选自Aβ1-5、Aβ1-7 、Aβ1-9和Aβ1-12的Aβ片段。在本发明的一些方面中，肽免疫原为选自Aβ1-5-L、Aβ1-7-L、Aβ1-9-L和Aβ1-12-L的Aβ片段，其中L为接头。在本发明的一些方面中，肽免疫原为选自Aβ1-5-L-C、Aβ1-7-L-C、Aβ1-9-L-C和Aβ1-12-L-C的Aβ片段，其中C为半胱氨酸氨基酸残基。
在本发明的一些方面中，肽免疫原为选自Aβ16-22、Aβ16-23、Aβ17-23、Aβ17-24、Aβ18-24和Aβ18-25的Aβ片段。在本发明的一些方面中，肽免疫原为选自Aβ16-22-C、Aβ16-23-C、Aβ17-23-C、 Aβ17-24-C、Aβ18-24-C和Aβ18-25-C的Aβ片段，其中C为半胱氨酸氨基酸残基。在本发明其他的方面中，肽免疫原为选自C-Aβ16-22、C-Aβ16-23、C-Aβ17-23、C-Aβ17-24、C-Aβ-18-24和C-Aβ18-25的Aβ片段，其中C为半胱氨酸氨基酸残基。
在上述的一些肽免疫原中，所述异源多肽选自具有T-细胞表位、B-细胞表位及其组合的肽。
在一个实施方案中，利用交联剂衍生蛋白质/多肽载体或任选附着的多肽接头的一个或多个氨基酸分子的官能团。在另一个实施方案中，衍生化试剂为零长度交联剂。在另一个实施方案中，衍生化试剂为同双功能交联剂。在又一个实施方案中，衍生化试剂为异双功能交联剂。
在一个优选的实施方案中，异双功能剂为与蛋白质/多肽载体的一个或多个氨基酸分子的伯胺或ε-胺官能团以及肽免疫原的一个或多个氨基酸分子的侧巯基反应的试剂。在一个实施方案中，异双功能剂为N-琥珀酰亚氨基溴乙酸酯。
在另一个实施方案中，伯胺或ε-胺官能团为赖氨酸。在另一实施方案中，用N-琥珀酰亚氨基溴乙酸酯衍生蛋白质/多肽载体的赖氨酸的伯胺或ε-胺官能团产生蛋白质/多肽载体上的赖氨酸分子上伯胺或ε-胺残基的溴乙酰化。在更优选的实施方案中，侧巯基为肽免疫原的半胱氨酸残基，其可定位于肽免疫原的氨基末端、肽免疫原的羧基末端或肽免疫原内。
在另一个实施方案中，侧巯基通过巯基化试剂如N-乙酰基高半胱氨酸硫内酯、Traut试剂(2-亚氨基四氢噻吩)SATA(N-琥珀酰亚氨基S-乙酰基硫乙酸酯)、SMPT(4-琥珀酰亚氨基氧化羰基-甲基2-吡啶基二硫甲苯)、磺基LC SPDP(磺基琥珀酰亚氨基吡啶基二硫丙酰氨基己酸酯)、SPDP(琥珀酰亚氨基吡啶基二硫丙酸酯)。在一个优选的 实施方案中，用于灭活活化的蛋白质/多肽上游离的反应性官能团的加帽试剂选自半胱胺、N-乙酰半胱胺和乙醇胺。
在尤其优选的实施方案中，用于灭活活化的蛋白质/多肽载体上游离的反应性官能团的加帽试剂选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢铵和氨。
在一个实施方案中，肽免疫原氨基酸残基的反应基团为游离的巯基。
在另一个实施方案中，一个或多个官能团在任选附着于蛋白质/多肽载体的接头上。在一个优选的实施方案中，接头为肽接头。在更优选的实施方案中，肽接头为聚赖氨酸。
在另一个实施方案中，本发明涉及将包括Aβ肽或Aβ片段或其Aβ类似物或其类似物的肽免疫原与具有以下结构的蛋白质/多肽载体偶联的第二种方法：
Figure S04841798920060825D000081
其中，
C为蛋白质/多肽载体并且X为蛋白质/多肽载体上氨基酸残基或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基的可衍生官能团，并且其中m为大于0但小于或等于85的整数，该方法包括如下步骤：
(a)对蛋白质/多肽载体或任选附着的接头分子的一个或多个官能团进行衍生以产生具有反应位点的衍生分子；
(b)将步骤(a)的衍生的蛋白质/多肽载体与肽免疫原的氨基酸残基的反应基团反应以形成共价偶联的肽免疫原-蛋白质/多肽载体偶 联物；以及
(c)将所述偶联物与加帽试剂进一步反应以灭活活化的蛋白质/多肽载体上游离的反应性官能团，使得加帽基团不能与其他分子，包括蛋白质/多肽自由反应，由此维持载体的功能性，使其保留针对肽免疫原引发在没有载体时不会出现的所需免疫反应的能力，以便产生具有下列通式的加帽肽免疫原-蛋白质/多肽载体偶联物：
Figure S04841798920060825D000091
其中，
C为蛋白质/多肽载体并且Xd为蛋白质/多肽载体的氨基酸残基或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基的衍生的官能团，以及其中，
P为共价附着于蛋白质载体氨基酸残基上或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基上衍生的官能团的肽免疫原分子，R为共价附着于蛋白质/多肽载体氨基酸残基上或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基上的衍生的官能团的加帽分子，n为大于0但小于或等于85的整数，并且p为大于0但小于85的整数。
用于上述第一种方法的详细实施方案也适用于通过第二种方法制备的所述偶联物。
在一个实施方案中，本发明涉及包括Aβ肽或Aβ片段或其类似物的肽免疫原/多肽载体偶联物，其中蛋白质/多肽载体具有下列通式：
Figure S04841798920060825D000092
其中，
C为蛋白质/多肽载体并且X为蛋白质/多肽载体上氨基酸残基或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基的衍生的官能 团，并且其中，m为大于0但小于或等于85的整数，并且其中加帽的肽免疫原-蛋白质/多肽载体偶联物具有下列通式：
Figure S04841798920060825D000101
其中，
C为蛋白质/多肽载体并且Xd为蛋白质/多肽载体氨基酸残基或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基的衍生的官能团，以及，其中P为共价附着于蛋白质载体的氨基酸残基或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基的肽免疫原分子，R为共价附着于蛋白质/多肽载体的氨基酸残基或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基的衍生官能团的加帽分子，由此维持载体的功能性，使其保留针对肽免疫原引发没有载体时不会出现的所需免疫反应的能力，n为大于0但小于或等于85的整数，以及p为大于0但小于85的整数。
用于上述第一种和第二种方法的详细的实施方案也适用于上述的偶联物。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的第二种方法产生的包括Aβ肽或Aβ片段或其类似物的肽免疫原/多肽载体偶联物，并且具有如下通式：
Figure S04841798920060825D000102
其中，
C为蛋白质/多肽载体并且Xd为蛋白质/多肽载体的氨基酸残基或 共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基的衍生的官能团，并且其中P为共价附着于蛋白质载体的氨基酸残基或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基的肽免疫原分子，R为共价附着于蛋白质/多肽载体的氨基酸残基或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基的衍生官能团的加帽分子，由此维持载体的功能性，使其保留针对肽免疫原引发没有载体时不会出现的所需免疫反应的能力，n为大于0但小于或等于85的整数，并且p为大于0但小于85的整数。
用于上述第二种方法的详细实施方案也适用于上述通过第二种方法产生的偶联物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包括通过本发明的第二种方法产生的肽免疫原与蛋白质/多肽载体偶联物，连同一种或多种药物可接受的赋形剂、稀释剂和佐剂的免疫原性组合物。
用于第二种方法的详细的实施方案和上述由此产生的偶联物也适用于上述的含有那些偶联物的免疫原性组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及诱导哺乳动物受试者免疫应答的方法，其包括将有效量的本发明免疫原性组合物施用于受试者。
适用于含有本发明的偶联物的免疫原性组合物的详细的实施方案也适用于涉及利用这些免疫原性组合物的方法的本发明的实施方案。
附图说明
图1：图解了用于Aβ肽片段与蛋白质/多肽载体CRM197偶联以形成Aβ/CRM197偶联物的化学过程的流程图。
图2：图解了用于作为肽免疫原-蛋白质/多肽偶联物如Aβ/CRM197 偶联物的偶联程度评价的S-羟甲基半胱氨酸和S-羟甲基半胱胺定量测 定的酸水解化学过程的流程图。
图3：该图图解了Aβ肽/CRM偶联反应的pH依赖性。
图4：该图图解了Aβ-肽/CRM偶联对肽：CRM比率的依赖性。
图5：用于Aβ1-7/CRM偶联的加帽过程的验证。反应的pH为9.15。肽反应时间为16小时，N-乙酰半胱胺加帽时间为8小时。
图6：用不同肽：CRM比率的肽进行偶联和加帽。反应的pH为9.0。肽反应时间为16小时，N-乙酰半胱胺加帽时间为8小时。
图7：用具有各种佐剂的Aβ肽偶联物免疫灵长类动物后第36天的灵长类动物的血清效价。
图8：用具有各种佐剂的Aβ肽偶联物免疫灵长类动物后第64天的灵长类动物的血清效价。
图9：随天数和治疗组变化的灵长类动物的效价。用含有明矾或RC529作为佐剂的Aβ1-7或Aβ1-5CRM197偶联物免疫灵长类动物并且在第29、36、57和54天测定抗-Aβ抗体的效价。
图10：利用采用tris-三(羟甲基)甲基甘氨酸预制凝胶的SDS-PAGE Western印迹分析表征肽-蛋白质偶联物。泳道为：标记(泳道1)；L-28375 24/01(泳道2)；L-28375 24/02(泳道3)；L-2837524/03(泳道4)；L-28375 24/04(泳道5)；L-28375 24/05(泳道6)；L-28375 24/06(泳道7)；L-28375 24/07(泳道8)；L-28375 24/08(泳道9)；L-28375 24/09(模拟物)(泳道10)和BrAcCRM197(泳道11)。
序列简述
  SEQ  ID  NO：   序列   描述
  1   DAEFR-C   Aβ1-5-C
  2   DAEFRHD-C   Aβ1-7-C
  3   DAEFRHDSG-C   Aβ1-9-C
 
  SEQ  ID  NO：   序列   描述
  4   DAEFRHDSGYEV-C   Aβ1-12-C
  5   DAEFR-GAGA-C   Aβ1-5-L-C
  6   DAEFRHD-GAGA-C   Aβ1-7-L-C
  7   DAEFRHDSG-GAGA-C   Aβ1-9-L-C
  8   DAEFRHDSGYEV-GAGA-C   Aβ1-12-L-C
  9   VEYGSDHRFEAD-C   Aβ12-1-C
  10   GAGA   接头肽
  11   PKYVKQNTLKLAT   流感血球凝集素：HA307-319
  12   AKXVAAWTLKAAA   PAN-DR肽(PADRE肽)
  13   EKKIAKMEKASSVFNV   疟疾CS：T3表位
  14   FELLTRILTI   乙型肝炎表面抗原HBsAg19-28
  15   DQSIGDLIAEAMDKVGNEG   热休克蛋白65：hsp65153-171
  16   QVHFQPLPPAVVKL   卡介苗(BCG)
  17   QYIKANSKFIGITEL   霍乱类毒素：TT830-844
  18   FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE   霍乱类毒素：TT947-967
  19   KQIINMWQEVGKAMY   HIVgp120T1
  20 DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- DAEFRHD   Aβ1-7/TT830-844C/TT947-967/Aβ1-7
  21 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSN KGAIIGLMVGGVVIA   Aβ1-42
  22   DAEFRHDQYIKANSKFIGITEL   AN90549：Aβ1-7/TT830-844   (以MAP4构型使用)
  23   DAEFRHDFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE   AN90550：Aβ1-7/TT947-967   (以MAP4构型使用)
  24 DAEFRHD- QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPK VSASHLE   AN90542：Aβ1-7/TT830-844+TT947-   967   (以线性构型使用)
  25   EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL   AN90576：Aβ3-9/TT830-844   (以MAP4构型使用)
  SEQ  ID  NO：   序列   描述
  26   AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD   AN90562：Aβ1-7/PADRE
  27   DAEFRHD-DAEFRHDD-  AEFRHDAKXVAAWTLKAAA   AN90543：Aβ1-7x3/PADRE
  28   AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-  DAEFRHD-DAEFRHD   PADRE/Aβ1-7x3
  29   DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA   Aβ1-7x3/PADRE
  30   DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR   Aβ1-7/白蛋白片段
  31   FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR   Aβ4-10/白蛋白片段
  32   EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR   Aβ3-9/白蛋白片段
  33   PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-  DAEFRHD-DAEFRHD   HA307-319/Aβ1-7x3
  34   DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-  DAEFRHD   Aβ1-7/HA307-319/Aβ1-7
  35   DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-  PKYVKQNTLKLAT   Aβ1-7x3/HA307-319
  36   DAEFRHD-DAEFRHD-  PKYVKQNTLKLAT   Aβ1-7x2/HA307-319
  37 DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT- EKKIAKMEKASSVFNV- QYIKANSKFIGITEL- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE- DAEFRHD   Aβ1-7/HA307-319/疟疾CS/  TT830-844/TT947-967/Aβ1-7
  38 DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD- QYIKANSKFIGITEL-C- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE   Aβ1-7x3/TT830-844/C/TT947-967
  39 DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C- FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE   Aβ1-7/TT830-844/C/TT947-967
  40 GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGY VDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFY STDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVV KVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLS LTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLS LPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEIN FETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVR RSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLK EHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEE   CRMβ197
 
  SEQ  ID  NO：   序列   描述
  FHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGAN YAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAAL SILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSI ALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFV ESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPFL HDGYAVSWNTVEDSIIRTGFQGESGHDI KITAENTPLPIAGVLLPTIPGKLDVNKSK THISVNGRKIRMRCRAIDGDVTFCRPKSP VYVGNGVHANLHVAFHRSSSEKIHSNEI SSDSIGVLGYQKTVDHTKVNSKLSLFFEI KS  
  41   ISQAVHAAHAEINEAGR   白蛋白片段
  42 DAEFGHDSGFEVRHQKLVFFAEDVGSNKG AIIGLMVGGVVIA   鼠源A(1-42
  43   VFFAEDVG-C   A(18-25-C
  44   LVFFAEDV-C   A(17-24-C
  45   KLVFFAED-C   A(16-23-C
  46   C-VFFAEDVG   C-A(18-25
  47   C-LVFFAEDV   C-A(17-24
  48   C-KLVFFAED   C-A(16-23
  49   VFFAEDV-C   A(18-24-C
  50   LVFFAED-C   A(17-23-C
  51   KLVFFAE-C   A(16-22-C
  52   C-VFFAEDV   C-Aβ18-24
  53   C-LVFFAED   C-Aβ17-23
  54   C-KLVFFAE   C-Aβ16-22
发明详述
本发明涉及产生肽免疫原-载体偶联物的方法，其中载体上在活化期间产生的未反应的活性官能团通过利用加帽试剂如N-乙酰半胱胺而灭活以防止其进一步反应。本发明还涉及通过那些方法产生的加帽的载体-肽免疫原性偶联物和包括所述偶联物的免疫原性组合物。
通过偶联而提高小的或教差免疫原性分子，如糖类的免疫原性的方法已成功使用了数十年(参见，例如，Goebel等.(1939)J.Exp.Med.69：53)，并且已描述了许多免疫原性组合物，其中纯化的荚膜聚合物通过利用″载体效应″与载体蛋白质偶联而产生更有效的免疫原性组合物。例如，Schneerson等.(J.Exp.Med.152：361-376，1980)描述了对微生物引起的侵入性疾病赋予免疫性的流感嗜血杆菌b多糖蛋白质偶联物。已显示PRP(多核糖基核糖醇磷酸盐，流感嗜血杆菌b的荚膜聚合物)的偶联物比基于单独的多糖的免疫原性组合物更有效(Chu等.，(1983)Infect.Immun.40：245；Schneerson等.(1984)，Infect.Immun.45：582-591)。还显示偶联能规避通常在孕妇中用游离的多糖免疫时观察到的教差的抗体反应(Anderson等.(1985)J.Pediatr.107：346；Insel等.(1986)J.Exp.Med.158：294)。
人针对其的常规免疫为标准操作的细菌毒素或类毒素(例如，破伤风或白喉)用作蛋白质载体的另外的优点为连同针对与荚膜聚合物有关的病原体的免疫一起诱导了针对毒素或类毒素的所需的免疫性。
抗原决定簇/半抗原-载体偶联物还用于产生可识别偶联的半抗原上分散的化学表位的高度特异性单克隆抗体。所产生的单克隆常常用于研究表位结构和天然蛋白质间的相互作用。多数情况下，用于产生这些单克隆的抗原决定簇/半抗原为代表大蛋白质表面上关键抗原位点的小肽片段。用于产生抗原决定簇/半抗原-载体偶联物的成功载体的标准是免疫原性的潜力、存在用于和抗原决定簇/半抗原偶联的合适的官能团、甚至在衍生化后仍然具有的适当的溶解度性质和在体内缺乏毒性。
通过本发明方法产生的偶联物满足这些标准。这些偶联物可以是利用此处所述的偶联方法产生的任何稳定的肽免疫原-载体偶联物。利用本发明的方法产生偶联物，其中具有下列结构的蛋白质/多肽载体共价附着于蛋白质/多肽载体：
其中，
C为蛋白质/多肽载体并且X为蛋白质/多肽载体上氨基酸残基或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基的衍生的官能团，并且其中，m为大于0但小于或等于85的整数，共价附着于肽免疫原并且其中肽免疫原-蛋白质/多肽载体偶联物具有下列通式，用下列通式表示：
Figure S04841798920060825D000172
其中，
C为蛋白质/多肽载体并且Xd为蛋白质/多肽载体的氨基酸残基或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基的衍生的官能团，P为共价附着于蛋白质/多肽载体的氨基酸残基上或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基上的衍生的官能团的肽免疫原，R为共价附着于蛋白质/多肽载体的氨基酸残基或共价附着于蛋白质/多肽载体的肽接头的任选氨基酸残基的衍生官能团的加帽分子，由此维持载体的功能性，使其保留针对肽免疫原引发没有载体时不会出现的所需免疫反应的能力，n为大于0但小于或等于85的整数，并且p为大于0但小于85的整数。
载体的选择
一些肽免疫原含有用于诱导免疫应答的合适表位，但太小而没有免疫原性。在这种情况下，肽免疫原与合适的载体连接以辅助引发免疫应答。在通过本发明的方法产生的肽免疫原-载体偶联物的上述图示 中，C为肽免疫原通过载体自身的氨基酸残基上衍生的官能团直接或通过共价附着于载体的肽接头上衍生的官能团间接偶联的蛋白质/多肽载体。合适的蛋白质/多肽载体包括但不限于，白蛋白(包括人血清白蛋白)、钥孔血蓝素、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、MSCRAMMS、破伤风类毒素或来自减毒的其他病原菌，包括变体，如白喉，大肠杆菌、霍乱或幽门螺杆菌的类毒素或减毒的毒素衍生物。一种所述的载体为与白喉毒素交叉反应的CRM197蛋白质(SEQ ID NO：40)。
其他的载体包括结合多个MHC等位基因，例如至少75％的所有人MHC等位基因的T-细胞表位。所述载体作为″通用的T-细胞表位″而往往为本领域所知。具有通用T-细胞表位的典型载体包括：
  流感血球凝集素：HA307-319   PKYVKQNTLKLAT  (SEQ.ID NO.11)
  PAN-DR肽(PADRE肽)   AKXVAAWTLKAAA  (SEQ.ID NO.12)
  疟疾CS：T3表位   EKKIAKMEKAS SVFNV  (SEQ.ID NO.13)
  乙型肝炎表面抗原：  HBsAg19-28   FELLTRILTI  (SEQ.ID NO.14)
  热休克蛋白65：hsp65153-171   QSIGDLIAEAMDKVGNEG  (SEQ.ID NO.15)
  卡介苗(BCG)   QVHFQPLPPAVVKL  (SEQ.ID NO.16)
  破伤风类毒素：TT830-844   QYIKANSKFIGITEL  (SEQ.ID NO.17)
  破伤风类毒素：TT947-967   NNFTVSFWLRVPKVSASHLE  (SEQ.ID NO.18)
  HIV gp120T1：   KQIINMWQEVGKAMY  (SEQ.ID NO.19)
  CRM197   参见序列简述(SEQ ID NO.：40)
  白蛋白片段   ISQAVHAAHAEINEAGR  (SEQ ID NO：41)
用于刺激或增强免疫应答并且可偶联肽免疫原或半抗原的其他载 体包括细胞因子，如IL-1、IL-1α和β肽、IL-2、γINF、IL-10、GM-CSF以及趋化因子，如MIP1α和β以及RANTES。免疫原性肽还可连接如在O′Mahony，WO97/17163和WO97/17614中所述的提高通过组织的运输的蛋白质/肽载体，上述文献在此用于所有目的作为参考整体引入。
更进一步载体包括重组链球菌C5a肽酶、化脓链球菌ORF1224、1664和2452、肺炎衣原体ORF T367和T858、肺炎球菌溶血素、减毒的肺炎球菌溶血素变体、生长因子和激素。
在本发明的一个优选实施方案中，载体蛋白为CRM197，在其主要序列中具有一个氨基酸改变的白喉毒素的无毒变体。由于单核酸密码子的改变，该分子氨基酸位点52的甘氨酸用谷氨酸替换。由于这种改变，蛋白质缺乏了ADP-核糖基转移酶活性并且变为无毒的。其具有58，408Da的分子量。CRM197根据美国专利5,614,382通过重组表达大量生产，该专利文献在此作为参考引入。糖类以及肽与CRM197的偶联通过赖氨酸残基的ε-氨基的连接进行。已通过一些商品化的产品证实CRM197为用于B-细胞表位的优良并且安全的载体。
免疫原性肽
如此处所用的，术语″肽免疫原″或″半抗原″为可对施用于哺乳动物而引起、促进或诱导产生免疫应答的任何蛋白质或亚单位结构/片段/源自其的类似物。尤其是，该术语用于指任何来源的多肽抗原决定簇(细菌、病毒或真核生物)，其可利用此处公开的方法与载体偶联。这种多肽免疫原/抗原决定簇可以是病毒、细菌或真核细胞来源的。
肽免疫原可与载体偶联而用作各种人类疾病的预防、治疗、防疫或改善中的免疫治疗剂。所述肽免疫原包括源自39-43个氨基酸，优选42个氨基酸的Aβ肽，其为阿尔茨海默氏病(AD)特有斑点的主要成份(参见US4,666,829；Glenner & Wong(1984)Biochem.Biophys.Res.Commun.120：1131，Hardy(1984)TINS 20：1131；Hardy(1997) TINS 20：154)，源自糊精的淀粉样肽，通过胰岛细胞产生的涉及II型糖尿病的多肽物质，源自参与动脉粥样硬化的低密度脂蛋白基因产物的肽，以及源自炎性细胞因子和生长因子如白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和GDF-8的抗原肽。所述真核生物的肽免疫原可包括T-细胞(CTL)或B-细胞表位，也称为β-淀粉样蛋白或A4肽。
Aβ，亦称作β-淀粉样肽或A4肽(参见US4,666,829；Glenner &Wong，Biochem.Biophys.Res.Commun.，120，1131(1984))为39-43个氨基酸的肽，其为阿尔茨海默氏病特有斑点的主要成份。Aβ通过大蛋白质APP经两种酶，称为β和γ分泌酶的加工产生(参见Hardy，TINS 20，154(1997))。APP中与阿尔茨海默氏病有关的已知突变发生在β或γ分泌酶位点附近或Aβ内。例如，位点717邻近APP加工为Aβ的γ-分泌酶裂解位点，并且位点670/671邻近β-分泌酶的裂解位点。认为该突变通过与裂解反应的相互作用引起AD，Aβ通过裂解反应形成以致提高所产生Aβ的42/43个氨基酸形式的量。
Aβ具有不常见的性质，其可固定和激活经典和替代补体级联反应。尤其是，其结合Clq并且最终结合C3bi。这种结合促进结合巨噬细胞而引起B-细胞的活化。此外，C3bi进一步分解并且随后以T-细胞依赖的方式结合至B-细胞上的CR2而导致这些细胞活化提高10,000倍。这种机理使Aβ产生超过其他抗原的免疫应答。
Aβ具有若干天然存在的形式。Aβ的人形式称为Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43。这些肽的序列及其与APP前体的关系通过Hardy等.，TINS 20，155-158(1997)的图1图解。例如，Aβ42具有如下序列：
H2N-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-IIe-Ala-OH(SEQ ID NO.21)。
Aβ41、Aβ40和Aβ39分别由于C-末端Ala、Ala-Ile和Ala-Ile-Val的缺失而不同于Aβ42。Aβ43因C-末端苏氨酸残基的存在而不同于Aβ42。
相比完整的分子，由于一些原因，为Aβ片段的肽免疫原更有利于用于本方法中。第一，由于Aβ内仅某些表位诱导阿尔茨海默氏病治疗有效的免疫原性应答，含有所述表位的片段的等质量剂量提供了比完整的Aβ剂量更高摩尔浓度的有效免疫原性表位。第二，Aβ的某些肽免疫原对淀粉样蛋白沉积物产生免疫原性应答而不对Aβ所源于的APP蛋白产生显著的免疫原性应答。第三，由于其尺寸较短，Aβ的肽免疫原比完整的Aβ更易于制造。第四，Aβ的肽免疫原不会以和完整的Aβ同样的方式聚集，简化了和载体的偶联物的制备。
Aβ的一些肽免疫原具有来自天然肽的至少2、3、5、6、10或20个连续氨基酸的序列。一些肽免疫原具有不超过来自Aβ的10、9、8、7、5或3个连续的残基。在优选的实施方案中，来自Aβ的N-末端半的肽免疫原用于制备偶联物。优选的肽免疫原包括Aβ1-5、1-6、1-7、1-10、1-11、3-7、1-3和1-4。例如Aβ1-5的命名表示包括Aβ残基1-5的N-末端片段。尤其优选开始于Aβ的N-末端并终止于Aβ残基7-11内残基的Aβ片段。也可但不优选利用片段Aβ1-12。在一些方法中，所述片段为除了Aβ1-10的N-末端片段。其他优选的片段包括Aβ13-28、15-24、1-28、25-35、35-40、35-42以及其他的内部片段和C-末端片段。
本发明的一些Aβ肽为免疫原性肽，其在施用于人患者或动物后产生特异性结合Aβ残基16和25之间一个或多个表位的抗体。优选的片段包括Aβ16-22、16-23、17-23、17-24、18-24和18-25。特异性结合残基16和25之间表位的抗体特异性结合可溶的Aβ而不结合Aβ斑。这类抗体可特异性结合患者或动物模型的循环系统中的可溶Aβ而不特异性结合患者或模型脑中的Aβ沉积斑。抗体与可溶Aβ的特 异性结合抑制Aβ整合在斑中由此抑制患者斑的发展或如果所述斑在施用治疗前已发展时抑制斑大小或出现频率的进一步增加。
优选，所施用的Aβ片段缺乏针对该片段产生T-细胞应答的表位。通常，T-细胞表位大于10个连续的氨基酸。因此，优选的Aβ片段为5-10个或优选7-10个连续的氨基酸或最优选7个连续氨基酸大小；即，足以产生抗体反应而不产生T-细胞应答的长度。由于这些表位不是片段的免疫原性活性所需的，并且可能在患者的局部引起不想要的炎症应答，优选缺乏T-细胞表位(Anderson等.，(2002)J.Immunol.168，3697-3701；Senior(2002)Lancet Neurol.1，3)。
由于这些肽针对Aβ肽持续产生高水平的免疫原性应答，优选片段Aβ15-25和其7-8个连续氨基酸的亚片段。这些片段包括Aβ16-22、Aβ16-23、Aβ16-24、Aβ17-23、Aβ17-24、Aβ18-24和Aβ18-25。尤其优选的Aβ15-25亚片段为7个连续氨基酸的长度。例如Aβ15-21的命名表示包括Aβ残基15-21而缺乏Aβ的其他残基，并且优选7-10个连续氨基酸的片段。这些片段可产生包括末端-特异性抗体的抗体应答。
Aβ的肽免疫原需要对清除或预防淀粉样蛋白沉积物的活性进行筛选(参见WO00/72880，其用于所有目的在此整体引入)。AβN-末端片段的施用诱导体内和体外识别Aβ沉积物的抗体的产生。缺少Aβ天然存在形式的至少一个，并且有时至少5个或10个C-末端氨基酸的片段用于一些方法中。例如，缺少来自Aβ43的C-末端5个氨基酸的片段包含来自Aβ的N-末端的最初的38个氨基酸。
除非另有陈述，Aβ的引用包括如上所述天然的人氨基酸序列以及包括等位、种的和诱导的变体的类似物。类似物常常由于保守取代而一般在一个、两个或几个位点区别于天然存在的肽。类似物一般呈现与天然肽至少80％或90％的序列同一性。一些类似物也包括非天然的 氨基酸或N-或C-末端氨基酸的一个、两个或几个位点的修饰。例如，Aβ位点1和/或7的天然天冬氨酸残基可以取代为异天冬氨酸。
非天然氨基酸的实例为D、α、α-双取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸、4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N，N，N-三甲基赖氨酸、8-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸、ω-N-甲基精氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺素、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜氨酸和异抗坏血酸。免疫原性肽也包括A β类似物及其片段。本发明的一些治疗剂为全-D肽，例如全-D Aβ、全-D Aβ片段或全-D Aβ或全-D Aβ片段的类似物。如WO00/72880所述，可在转基因动物模型中相比未治疗的或安慰剂对照组，筛选片段和类似物的预防或治疗效力。
肽免疫原也包括较长的多肽，其包括例如，Aβ肽的免疫原与其他的氨基酸。例如，优选的免疫原性肽包括含有连接至异源氨基酸序列的Aβ片段的融合蛋白，其诱导针对异源氨基酸序列的辅助T-细胞应答并且由此诱导针对Aβ片段的B-细胞应答。如WO00/72880所述，可在动物模型中相比未治疗的或安慰剂对照组，筛选这种多肽的预防或治疗效力。
Aβ肽、类似物、免疫原性片段或其他的多肽可以解聚或聚集的形式施用。解聚的Aβ或其片段指单体的肽单位。解聚的Aβ或其片段通常为可溶的，并且能自我聚集形成可溶的寡聚物、原纤维和ADDL。Aβ的寡聚物及其片段通常为可溶的并且主要以α-螺旋或无规卷曲的形式存在。聚集的Aβ或其片段指已结合在不溶的β-片层装配体中的Aβ寡聚物或其片段。聚集的Aβ或其片段也指纤丝状聚合物。原纤维通常不溶。一些抗体结合可溶的Aβ或其片段或聚集的Aβ或其片段。一些抗体结合可溶的Aβ或其片段以及聚集的Aβ或其片段。
免疫原性肽也包括单体免疫原性肽的多聚体。除了Aβ肽外的免疫原性肽应当诱导针对上述的一个或多个优选的Aβ片段(例如，Aβ1-3、1-7、1-10和3-7)的免疫原性应答。
本发明的免疫原性肽利用本发明的方法连接至载体以形成偶联物。该免疫原性肽可以其氨基末端、其羧基末端或两者连接至载体而形成偶联物。任选地，可在偶联物中存在该免疫原性肽的多个重复。
Aβ的N-末端片段可在其C-末端与载体肽连接而形成偶联物。在所述偶联物中，Aβ片段的N-末端残基构成偶联物的N-末端残基。因此，所述偶联物在诱导结合需要Aβ的N-末端残基为游离形式的表位的抗体中是有效的。本发明的一些免疫原性肽包括在C-末端与载体肽的一个或多个拷贝连接而形成偶联物的AβN-末端片段的多个重复。整合这种偶联物的AβN-末端片段往往以Aβ1-3开始而以Aβ7-11结束。Aβ1-7、1-3、1-4、1-5和3-7为优选的AβN-末端片段。一些偶联物包括串联的Aβ的不同的N-末端片段。例如，偶联物可包括Aβ1-7，紧接着为连接至载体的Aβ1-3。
在一些偶联物中，Aβ的N-末端片段在其N-末端与载体肽连接。相同类型的AβN-末端片段可用作C-末端连接体。一些偶联物包括连接至AβN-末端片段的N-末端的载体肽，其随后连接至串联的一个或多个另外的AβN-末端片段。优选，这种免疫原性的Aβ片段，一旦与合适的载体偶联就会诱导特异性针对Aβ片段而不针对Aβ的其他片段的免疫原性应答。
本发明的免疫原性肽包括免疫原性的异源肽。在一些免疫原性肽中，Aβ片段与载体连接而形成免疫原性异源肽。这种异源肽利用本发明的方法与载体连接形成偶联物。一些免疫原性异源肽包括连接至如US5,196,512、EP378,881和EP427,347所述的破伤风类毒素表位的Aβ片段。任选，免疫原性肽可与载体的一个或多个拷贝连接，例如， 在载体的N和C-末端连接而形成免疫原性异源肽。其他的这些免疫原性异源肽包括连接至US5,736,142中所述载体肽的Aβ片段。例如，免疫原性异源肽可包括Aβ1-7，其后紧接着Aβ1-3，随后为载体。所述免疫原性异源肽的实例包括：
线性构型的Aβ1-7/破伤风类毒素830-844+947-967
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE
(SEQ ID NO：24)
US5,736,142中所述的肽(所有均为线性构型)：
PADRE/Aβ1-7：
AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD(SEQ ID NO.：26)
Aβ1-7x3/PADRE：
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA(SEQ IDNO.：27)
PADRE/Aβ1-7x3：
AKXVAAWTLKAAA-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD(SEQ IDNO.：28)
Aβ1-7/PADRE：
DAEFRHD-AKXVAAWTLKAAA(SEQ ID NO.：29)
Aβ1-7/白蛋白片段： 
DAEFRHD-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO.：30)
Aβ4-10/白蛋白片段：
FRHDSGY-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO.：31)
Aβ3-9/白蛋白片段：
EFRHDSG-ISQAVHAAHAEINEAGR(SEQ ID NO.：32)
HA307-319/Aβ1-7x3：
PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD(SEQ IDNO.：33)
Aβ1-7/HA307-319/Aβ1-7：
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-DAEFRHD(SEQ ID NO.：34)
Aβ1-7x3/HA307-319：
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT(SEQ IDNO.：35)
Aβ1-7x2/HA307-319：
DAEFRHD-DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT(SEQ ID NO.：36)
Aβ1-7/HA307-319/疟疾CS/TT830-844/TT947-967/Aβ1-7
DAEFRHD-PKYVKQNTLKLAT-EKKIAKMEKASSVFNV-QYIKA
NSKFIGITEL-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE-DAEFRHD(SEQ IDNO.：37)
Aβ1-7x3/TT830-844/C/TT947-967
DAEFRHD-DAEFRHD-DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO.：38)
Aβ1-7/TT830-844/C/TT947-967
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITELCFNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO.：39)
Aβ1-7/TT830-844/C/TT947-967/Aβ1-7
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL-C-FNNFTVSFWLRVPKV-SASHLE-DAEFRHD
(SEQ ID NO.：20)
一些免疫原性异源肽包括用通式2x表示的免疫原性肽的多聚体，其中x为从1-5的整数。优选x为1、2或3，最优选2。当x为2时，所述多聚体具有以称为MAP4的优选构型连接的四个免疫原性肽(参见US5,229,490)。这种免疫原性肽随后利用本发明的方法与载体连接形成偶联物。
MAP4构型显示如下，其中通过在赖氨酸的N-末端和侧链胺启动肽合成而产生分支结构。取决于赖氨酸掺入序列中以及提供分支的次数，得到的结构将存在多个N-末端。在该实例中，在含有赖氨酸的分支核心上产生四个相同的N-末端。这种多重性大大提高了同源B-细胞的应答能力。
Figure S04841798920060825D000271
这种免疫原性异源肽的实例包括：
MAP4构型的Aβ1-7/破伤风类毒素830-844：
DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO.：22)
MAP4构型的Aβ1-7/破伤风类毒素947-967：
DAEFRHD-FNNFTVSFWLRVPKVSASHLE(SEQ ID NO.：23)
MAP4构型的Aβ3-9/破伤风类毒素830-844：
EFRHDSG-QYIKANSKFIGITEL(SEQ ID NO.：25)
2分支树脂上的DAEFRHD-QYIKANSKFIGITEL
Figure S04841798920060825D000272
Aβ肽、类似物、活性片段或其他多肽可以联合或多聚体的形式或以分离形式施用。治疗剂也包括单体免疫原性治疗剂的多聚体。除了AD肽外的药剂应当诱导针对上列一个或多个优选的Aβ片段(例如，1-10、1-7、1-3和3-7)的免疫原性应答，并且还可利用本发明的方法与载体偶联。优选地，这种药剂一旦偶联合适的载体，就将诱导特异性针对Aβ的这些片段而不针对Aβ其他片段的免疫原性应答。为了促进肽免疫原与载体的偶联，可将另外的氨基酸加至抗原决定簇的末端。另外的残基还可用于改进肽免疫原的物理或化学性质。如酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸等的氨基酸可在肽免疫原的C-或 N-末端引入。另外，还可引入含有氨基酸如甘氨酸和丙氨酸的肽接头。此外，抗原决定簇可通过由例如由烷酰基(C1-C20)或硫代羟乙酰基乙酰化对末端NH2-基团酰化、由例如氨、甲胺等末端-羧基酰胺化的修饰而与天然的序列相区别。在有些情况下这些修饰可提供用于连接支持物或其他分子的位点。
利用此处公开的方法产生本发明的偶联物的肽免疫原可通过键合结合而形成聚合物(多聚体)，或可配制为无键合的组合物如混合物。其中当肽与相同的肽连接，由此形成均聚物时，就存在多个重复表位单元。例如，多抗原肽(MAP)技术用于构建含有CTL和/或抗体肽以及肽的聚合物。″CTL表位″为源自所选的潜在靶抗原的表位区域的表位。当肽不同时，例如，提供代表不同的病毒亚型、亚型内不同的表位、不同的HLA限制特异性的混合物或含有T-辅助表位的肽、具有重复单元的杂聚物。除共价键外，也考虑能形成分子间和结构内键的非共价键合。
所述肽免疫原和其类似物通过固相肽合成或重组表达而合成，或获自天然来源。可从许多供应商购得肽自动合成仪，如AppliedBiosystems，Foster City，California。
可在细菌(如大肠杆菌)、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞中进行重组表达。重组表达的过程由Sambrook等.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor Press，NY，2nd ed.，1989)描述。一些免疫原性肽也可商业购得(例如，American Peptides Company，Inc.，Sunnyvale，CA，和California Peptide Research，Inc.，Napa，CA)。
也可筛选肽或其他化合物的随机文库获得适合的肽免疫原。可产生可以逐步方式合成的许多类化合物的组合文库。这种化合物包括多肽、β-转角模拟物、激素、寡聚N-取代的甘氨酸和寡聚氨基甲酸酯等等。可通过WO95/12608、WO93/06121、WO94/08051、WO95/35503 和WO95/30642(每篇用于所有目的作为参考引入)中描述的编码合成文库(ESL)方法构建较大的化合物的组合文库。肽文库还可通过噬菌体展示法产生(参见，例如，Devlin，WO91/18980)。
免疫原性肽的衍生化和与蛋白质载体偶联
肽免疫原与蛋白质/多肽载体的附着位点，以及用于将肽免疫原附于载体的交联剂的性质对于得到的针对其而生成的抗体的特异性都很重要。为了正确的识别，肽免疫原必须以合适的方向与载体偶联。为了抗体随后识别无载体的游离肽免疫原，肽免疫原-蛋白质/多肽载体偶联物必须以暴露且可接近的形式呈递肽免疫原。最优的方向常常通过将交联反应指向肽免疫原上特异位点而获得。对肽免疫原实现此目的的一种方法是在肽合成期间附着末端的半胱氨酸残基。这在肽的一端提供了用于与载体偶联的巯基。通过该基团的交联提供了肽免疫原仅在一端的附着，由此确保一致的方向。
在肽免疫原-载体偶联中，目的不是维持载体的天然状态或稳定性，而是以最合适的方式向免疫系统呈递半抗原。为了达到该目的，偶联化学过程的选择可控制产生针对半抗原的抗体所得到的效价、亲和力和特异性。有时选择含有足以长到以非限制的方式呈递抗原的间隔臂的交联剂可能是很重要的。而控制载体表面上肽免疫原的密度也可能很重要。太少的肽免疫原取代可能产生很少的或不产生应答。肽免疫原密度过高事实上可能引起免疫抑制和减少应答。此外，交联接头本身可能产生不想要的免疫应答。不仅在选择合适的交联剂中，而且在选择合适的蛋白质/多肽载体和肽免疫原的比率中均需要考虑这些问题。
目前存在多种将蛋白质/肽载体附着至肽免疫原的方法。很可能通过末端或通过赖氨酸的ε-氨基实现离子相互作用。残基和肽免疫原侧基之间的氢键也是可能的。最后，蛋白质/肽载体和免疫原性肽之间构象的相互作用可能产生稳定的附着。
利用不同的交联剂剂如零-长度的、同双功能的或异双功能的交联剂已成功产生了肽免疫原-载体偶联物。用于生物偶联的最小的适合的试剂系统为所谓的零-长度交联接头。这些化合物通过形成不含有另外原子的键而介导两个分子的偶联。因此，分子的一个原子为间隔物。在许多偶联方案中，由于向被交联的物质添加外源结构的化学组分的特性，最终的复合物结合在一起。在某些应用中，这些插入接头的存在可能对最终的用途是不利的。例如，在肽免疫原-载体偶联物的制备中复合物以对所附着的半抗原产生免疫应答的目的形成。有时，通过这种应答产生的一部分抗体具有对偶联过程中所用交联剂的特异性。零-长度交联剂通过介导两种物质之间的直接键合而消除了此类交叉反应性的可能性。
同双功能试剂，其为用于大分子修饰和偶联的首选交联剂，由两端含有相同官能团的双反应性化合物组成(Hartman和Wold，1966)。这些试剂可通过与两种分子上相同的共有基团的共价反应而将一个蛋白结合至另一个蛋白。因此，通过在同双功能试剂存在时将二者混合，一个蛋白的赖氨酸ε-胺或N-末端胺可仅交联至第二个蛋白上相同的官能团。
异双功能偶联试剂含有两种不同的反应基团，其可偶联至蛋白质和其他大分子上两种不同功能的靶。例如，交联接头的一部分可含有胺-反应基团，而另一部分可由巯基反应基团组成。结果是引导对所选的靶分子部分的交联反应，由此获得对偶联过程更好的控制的能力。
异双功能试剂用于在两步或三步过程中交联蛋白质和其他分子，
其限制了常常利用同双功能交联接头所获得的聚合度。
目前存在利用零-长度、同双功能或异双功能交联剂将肽免疫原与蛋白质/多肽载体偶联的许多方法。大多数方法产生胺、酰胺、尿烷、 异硫脲或二硫键有时为硫醚。将蛋白质或肽与肽偶联的更常规方法利用双功能交联剂。这些为在每端具有活性基团的小间隔分子。这些间隔分子可在每端具有相同或者不同的活性基团。最常见的活性官能团、偶联基团和形成的键为：
1.醛-氨基→仲胺
2.马来酰亚氨基-巯基(硫醚
3.琥珀酰亚氨基-氨基(酰胺
4.亚氨酯-氨基(-酰胺
5.叠氮基苯-氨基(苯胺
6.酰基卤-巯基(硫醚
7.吡啶基二硫化物-巯基(二硫化物
8.异硫氰酸酯-氨基(异硫脲。
给定载体蛋白的反应性，根据其通过交联剂的修饰而能偶联至肽免疫原的能力，通过其氨基酸组成和该分子三维结构中单个氨基酸的序列定位，以及通过该肽免疫原的氨基酸组成而进行确定。
对于蛋白质/肽载体和其他肽(例如，蛋白质/肽载体和肽免疫原)之间的接头(″L″)，间隔物一般选自Ala、Gly或其他非极性氨基酸或中性极性氨基酸的中性间隔物。在某些实施方案中，中性间隔物为Ala。可理解的是任选存在的间隔物不必由相同的残基组成并且由此可以是杂-或均-寡聚物。典型的间隔物包括Ala的均-寡聚物。存在时，间隔物通常为至少一个或两个残基，更通常为三个至六个残基。在其他实施方案中，蛋白质/多肽载体偶联至肽免疫原，优选蛋白质/肽载体位于氨基末端。肽可通过中性接头，如Ala-Ala-Ala等连接，并且优选进一步包含附着于赖氨酸残基((PAM)2Lys)的α和ε氨基的脂类残基如棕榈酸等，所述赖氨酸残基一般通过Ser-Ser键等附着于肽偶联物的氨基末端。
在本发明的一些方面，肽免疫原为选自Aβ1-5-L、Aβ1-7-L、A β1-9-L和Aβ1-12-L的Aβ片段。在本发明的一些方面，接头为GAGA(SEQ ID NO：10)。
为了促进肽免疫原与载体的偶联，另外的氨基酸可加至抗原决定簇的末端。另外的残基也可用于改进肽免疫原的物理或化学性质。氨基酸如酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸等，可在肽免疫原的C或N-末端引入。另外，还可引入含有氨基酸如甘氨酸和丙氨酸的肽接头。此外，抗原决定簇可通过由例如烷酰基(C1-C20)或硫代羟乙酰基乙酰化对末端的NH2-基团酰化、由例如氨、甲胺等对末端的-羧基酰胺化等的修饰而与天然的序列相区别。在有些情况下，这些修饰可提供用于连接支持物或其他分子的位点。
在本发明的一些方面，肽免疫原为选自Aβ1-5-C、Aβ1-7-C、Aβ1-9-C和Aβ1-12-C的Aβ片段，其中C为半胱氨酸氨基酸残基。在本发明的一些方面，肽免疫原为选自Aβ1-5-L-C、Aβ1-7-L-C、Aβ1-9-L-C和Aβ1-12-L-C的Aβ片段。
肽免疫原直接或通过在肽免疫原氨基或羧基末端的接头连接至蛋白质/肽载体。肽免疫原或蛋白质/肽载体的氨基末端可以是酰化的。此外，肽免疫原-蛋白质/肽载体偶联物可通过如下所述的一个或多个连接残基如Gly、Gly-Gly、Ser、Ser-Ser连接至某些烷酰基(C1-C20)脂类。其他有效的脂类部分包括胆固醇、脂肪酸等等。
肽免疫原可通过化学交联与载体连接。用于将免疫原与载体连接的技术包括利用N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基-硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson，J等.(1978)Biochem J，173：723)和琥珀酰亚氨基4-(N-马来亚氨基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)(如果肽缺乏巯基，此可通过半胱氨酸残基添加至半抗原而提供)形成二硫键。这些试剂在自身和一个蛋白质的肽半胱氨酸残基之间产生二硫键以及通过赖氨酸上的ε-氨基或其他氨基酸中的其他游离氨基产生酰胺键。各种所述 的二硫化物/酰胺-形成试剂描述在Immuno.Rev.62：85(1982)中。其他双功能偶联剂形成硫醚而不是二硫键。硫醚形成试剂包括6-马来酰亚氨基己酸、2-溴乙酸和2-碘乙酸、4-(N-马来酰亚氨基-甲基)环己烷-1-羧酸的反应性酯。羧基可通过将其与琥珀酰亚胺或1-羟基-2-硝基-4-磺酸、钠盐结合而活化。
最常见的是，赖氨酸残基为载体蛋白质上最丰富的氨基酸残基，并且这些残基利用交联剂修饰以产生随后偶联至半抗原的亲核(neucleophilic)位点。这种偶联通过具有化学活性的半抗原分子上的任何亲水侧链实现。仅举几个例子，这些包括精氨酸的胍基、谷氨酸和天冬氨酸的(-羧基、半胱氨酸的巯基和赖氨酸的ε-氨基。可使其可偶联至其他部分的蛋白质修饰利用交联剂实现，其与蛋白质载体或半抗原分子上的任何侧链反应。
在本发明的一个方面，有或无接头分子的载体蛋白用将反应位点引入载体蛋白分子的试剂进行官能化(衍生化)，所述载体蛋白分子可进行进一步的修饰而引入亲核基团。在一个实施方案中，载体与卤素乙酰化试剂反应，其优先与蛋白质氨基酸残基上的许多官能团如半胱氨酸的巯基、赖氨酸残基的ε-伯胺基、α-胺的α末端、甲硫氨酸的硫醚和组氨酸的咪唑基侧链氮反应(Gurd，1967)。在一个优选的实施方案中，载体蛋白的赖氨酸残基上的ε-伯胺基用bN-羟基琥珀酰亚氨基溴乙酸酯衍生而产生溴乙酰化的载体。肽免疫原和活化的蛋白质载体的偶联通过将活化载体缓慢添加至含有肽免疫原的溶液而进行。
通过利用本发明的方法，上述B节讨论的肽免疫原可偶联至上述A节讨论的任何载体。由本发明方法产生的偶联物用作用于被动/主动免疫疗法中产生针对Aβ抗体的免疫原。此外，可以将与载体连接的Aβ或Aβ片段施用给实验动物以产生Aβ的单克隆抗体。
在本发明的一个方面，偶联物为选自Aβ1-7-CRM197、(Aβ 1-7x3)-CRM197和(Aβ1-7x5)-CRM197的偶联物。在本发明的一个方面，偶联物为选自CRM197-Aβ1-5、CRM197-Aβ1-7、CRM197-Aβ1-9和CRM197-Aβ1-12的偶联物。在本发明的另一方面，偶联物为选自Aβ1-5-C-CRM197、Aβ1-7-C-CRM197、Aβ1-9-C-CRM197和Aβ1-12-C-CRM197、Aβ16-23-C-CRM197、Aβ17-24-C-CRM197、Aβ18-25-C-CRM197、CRM197-C-Aβ16-23、CRM197-C-Aβ17-24、CRM197-C-Aβ-18-25、Aβ16-22-C-CRM197、Aβ17-23-C-CRM197、Aβ18-24-C-CRM197、CRM197-C-Aβ16-22、CRM197-C-Aβ17-23和CRM197-C-Aβ18-24、Aβ1-9-C-CRM197和Aβ1-12-C-CRM197的偶联物。在本发明的又一方面，偶联物为选自Aβ1-5-L-C-CRM197、Aβ 1-7-L-C-CRM197、Aβ1-9-L-C-CRM197和Aβ1-12-L-C-CRM197的偶联物。
加帽
利用将反应位点引入载体和/或半抗原分子上反应性的氨基酸分子侧链的偶联试剂的缺点为反应位点如果不中和，将在体外或体内与任何不需要的分子自由反应。在本发明的方法中，未反应的官能团的加帽通过具有反应侧基的偶联物与灭活/加帽该反应基团的试剂反应而完成。用于本发明偶联方法的典型的灭活/加帽试剂包括半胱胺、N-乙酰半胱胺和乙醇胺。或者，加帽通过与氨或碳酸氢铵反应而完成，两者都将卤代乙酰基转化为氨基乙酰基。加帽还可利用氢氧化钠或碳酸钠在碱性pH(9.0-9.8)下完成，其将卤代乙酰基转化为羟基乙酰基。与和半胱胺衍生物、乙醇胺等的反应相反，将卤代乙酰基转化为氨基乙酰基或羟基乙酰基的一种潜在优点为通过与氨或氢氧化物/碳酸盐反应导入相对较小的化学官能团。得到的加帽官能团，例如氨基乙酰基或羟基乙酰基，提供了在偶联物的载体蛋白部分中相对较小的干扰。根据需要利用已知的方法纯化加帽的肽免疫原-载体蛋白，如层析法(凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析或亲和层析)、渗析、超滤-渗滤、利用硫酸铵或醇的选择性沉淀等。
免疫原性偶联物和组合物
将免疫原性组合物中加帽的肽免疫原-载体蛋白偶联物施用给预防和/或治疗目的的哺乳动物，尤其是人。本发明的偶联物可用于引发和/或加强对免疫原的免疫反应。例如，CTL-载体偶联物可用于治疗和/或预防病毒感染、致淀粉样疾病、癌症等。或者，也可以使用诱导抗体反应的多肽免疫原-载体偶联物。
在治疗应用中，本发明的偶联物可施用于已患有致淀粉样疾病如阿尔茨海默氏病的个体。视情况而定，那些处于疾病潜伏期或急性期的患者可用本发明的偶联物单独或和其他治疗一起进行治疗。
在治疗应用中，本发明的免疫原性组合物以足以对淀粉样斑点引发有效的CTL应答或体液应答，并且治愈或至少部分抑制疾病发展、症状和/或并发症的量施用给患者。足以实现该目的的量被定义为″治疗有效量″。对该用途有效的量将部分取决于肽组合物、给药方式、所治疗疾病的阶段和严重程度、患者的体重和常规的健康状态以及处方医师的判断。
本发明免疫原性组合物的治疗有效量通常在用于治疗或预防给药的首次免疫的范围内，用于70kg患者为约0.1μg至约10,000μg肽，通常约0.1至约8000μg，优选约0.1至约5000μg，并且最优选在0.1至1,000μg之间。这些剂量后紧接着依据数周至数月的加强方案的约0.1μg至约1000μg肽的加强剂量，其取决于测定特异性免疫应答的患者的应答和病症。
此外，本发明可预防性用于预防和/或改善致淀粉样疾病。有效量如上所述。另外，视情况而定，本领域普通技术人员也知晓如何调整或改进预防性治疗，例如通过加强和调整剂量以及剂量给药方案。
治疗给药可从疾病的最初征兆开始。随后为加强剂量直至疾病发展停止或逆转或病征显著减轻并随后延续一段时间。
用于治疗或预防性治疗的本发明免疫原性组合物可通过用于预防和/或治疗性治疗的肠胃外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、颅内、腹膜内、鼻内或肌内的方法给药。免疫原性剂的一种一般给药途径为皮下，虽然其他途径可能同样有效。另一种常见途径为肌内注射。这类注射最常见在手臂或腿肌肉中进行。在一些方法中，制剂直接注射入已积累沉积物的特定组织中，例如颅内注射。肌内注射或静脉内输液优选用于抗体的给药。在一些方法中，特定的治疗抗体直接注射入颅骨。由于给药容易，本发明的免疫原性组合物尤其适于口服给药。本发明进一步提供了用于肠胃外给药的免疫原性组合物，其包括溶解或悬浮于可接受载体，优选水性载体中的肽或偶联物溶液。
可使用各种稀释剂、赋形剂和缓冲液，例如水、缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、0.3％的甘氨酸、透明质酸等。这些组合物可通过常规的公知灭菌技术灭菌，或可无菌过滤。所得含水溶液可以包装就此使用，或冻干，冻干制剂在给药前与无菌溶液组合。组合物可以含有接近生理条件所需的药用助剂，如缓冲剂，张力调节剂，湿润剂等，例如，醋酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙，脱水山梨醇单月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯等。
对于固体组合物，可以使用常规的无毒固体载体。这些可包括例如，药物级甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，滑石粉，纤维素，葡萄糖，蔗糖，碳酸镁等。对于口服给药，药物可接受的无毒组合物是通过掺入正常使用的任何赋形剂，如前面列出的那些载体，和通常10-95％的活性成分，即，一或多种本发明的偶联物而形成，并且所述活性成分更优选25％-75％的浓度。
药物制剂中本发明的免疫原性组合物的浓度可以广泛变化，即，从按重量计低于约0.1％，通常是或至少约2％至20％至50％或更高水平，并主要根据所选择的特定给药方是由液体体积，粘性等选择。
本发明的偶联物也可以通过脂质体施用，其用来将偶联物靶向特定组织，如淋巴组织，或选择性靶向感染的细胞，以及提高肽组合物的半衰期。脂质体包括乳剂，泡沫，胶束，不溶性单层，液晶，磷脂分散体，片状层等等。在这些制剂中，待递送的组合物作为脂质体的一部分，单独或与例如结合淋巴细胞中普遍存在的受体的分子一起引入。这些分子包括结合CD45抗原的单克隆抗体，或与其它治疗或免疫原性组合物一起。因此，由所需的本发明组合物填充的脂质体可指向淋巴细胞的位点，然后在那里脂质体将递送所选择的治疗/免疫原性肽组合物。本发明中使用的脂质体是从标准的胶囊-形式脂类形成的，其通常包括中性和带负电荷的磷脂和甾醇，如胆固醇。脂类的选择通常考虑如脂质体大小，血流中的酸不稳定性和脂质体的稳定性来进行。可利用多种方法制备脂质体，如Szoka，等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)，美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028，和5,019,369所述，此处作为参考引入。
对于气雾剂给药，优选本发明的组合物与表面活性剂和推进剂一起以精细粉碎的形式提供。组合物典型的百分比是按重量计0.01％-20％，优选1％-10％。表面活性剂当然应该是无毒的，并优选溶于推进剂中。这种试剂的代表为含有6至22个碳原子的脂肪酸例如己酸，辛酸，月桂酸，棕榈酸，硬脂酸，亚油酸，亚麻酸，油硬酸和油酸与脂肪族多元醇或其环酐形成的酯或偏酯。可以使用混合酯，如混合或天然甘油酯。表面活性剂可以构成组合物重量的0.1％-20％，优选0.25-5％。组合物的余量一般是推进剂。如所期望的，也可以包括载体，如用于鼻内递送的卵磷脂。
本发明的偶联物可选择性地与其他试剂结合给药，其在淀粉样蛋白病和/或其病征的治疗和/或改善中至少部分有效。在阿尔茨海默氏病和唐氏综合症的情况下，其中淀粉样沉积物在脑中出现，本发明的偶联物可与提高本发明的制剂通过血脑屏障的其他试剂一起给药。
免疫原性组合物一般含有佐剂。佐剂为当与免疫原或抗原一起给药时增强免疫应答的物质。许多细胞因子或淋巴因子已显示具有免疫调节的活性，并且因此可用作佐剂，包括但不限于，白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参见，例如美国专利5,723,127)、13、14、15、16、17和18(和其变体形式)、干扰素-α，β和γ、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(参见，例如美国专利5,078,996)、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、GSF和肿瘤坏死因子α和β。在本发明中有用的其他佐剂包括趋化因子，包括而不限于，MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。粘附分子，如选择蛋白，例如L-选择蛋白、P-选择蛋白和E-选择蛋白也可用作佐剂。其他有用的佐剂包括，但不限于粘蛋白样分子，例如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1，整联蛋白家族成员如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95，免疫球蛋白超家族成员如PECAM、ICAM，例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3、CD2和LFA-3、共刺激分子如CD40和CD40L、生长因子包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管内皮细胞生长因子，受体分子包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6。另一种佐剂分子包括Caspase(ICE)。参见国际专利公开WO98/17799和WO99/43839，其用于所有目的在此作为参考整体引入。
用于增强免疫应答的合适的佐剂包括但不限于，美国专利4,912,094中所述的MPLTM(3-O-去酰化单磷酰脂类A；Corixa，Hamilton，MT)，其用于所有目的在此作为参考引入。还适于用作佐剂的是合成的脂类A类似物或氨基烷基葡糖胺磷酸盐化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，其可从Corixa获得，并且在此作为参考引入的美国专利6,113,918中描述。一种所述AGP为命名为529的2-[(R)-3-十四烷酰基氧化十四烷酰氨基(tetradecanoyloxytetradecancylamino)]乙基2-脱氧-4-O-膦酰基-3-O-[(S)-3-十四烷酰基氧化十四烷酰 基]-2-[(R)-3-十四烷酰基氧化十四烷酰基-氨基]-b-D-吡喃葡糖苷(亦称RC529；Corixa)。这种529佐剂被配制成水性剂型(529AF)或稳定的乳剂剂型(529SE)。
其它的佐剂包括矿物油和水乳剂、钙盐如磷酸钙、铝盐(明矾)如氢氧化铝和磷酸铝等、Amphigen、Avridine、L121/鲨烯、D-丙交酯-聚交酯/糖苷、普卢尼克酸(pluronic acid)、多元醇、胞壁酰二肽、灭活的博德特氏菌(Bordetella)、皂角苷如StimulonTM QS-21(Antigenics，Framingham，MA)，其在作为参考引入本文的美国专利5,057,540中描述，以及由其产生的如ISCOMS(免疫刺激复合物)的颗粒、结核分枝杆菌、细菌脂多糖、合成的多核苷酸如含CpG基序的寡核苷酸(作为参考引入本文的美国专利6,207,646)、百日咳毒素(PT)或大肠杆不耐热毒素(LT)，由其是LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；参见例如用于所有目的作为参考引入本文的国际专利公开WO93/13302和WO92/19265。
还可用作佐剂的为霍乱毒素及其变体，包括在公开的国际专利申请WO00/18434中所述的那些(其中氨基酸位点29的谷氨酸被另一氨基酸(除了天冬氨酸，优选组氨酸)取代)。类似的CT毒素或变体描述在国际专利申请WO02/098368中(其中氨基酸位点16的异亮氨酸被另一氨基酸取代，单独或与氨基酸位点68的丝氨酸被另一氨基酸取代组合；和/或其中氨基酸位点72的缬氨酸被另一氨基酸取代)。其他CT毒素在公开的国际专利申请WO02/098369中描述(其中氨基酸位点25的精氨酸被另一氨基酸取代；和/或一个氨基酸被插入氨基酸位点49；和/或两个氨基酸被插入氨基酸位点35和36)。
可理解的是说明书中对解释所述结果的任何理论的参考文献并不是为了限制本发明的范围。与本发明起作用所用的方法无关，在此所述的结果和优点可参照本发明的下列实施例而获得。
对本领域技术人员显而易见的是在不背离所附权利要求的精神或范围的条件下可对本发明进行多种改变和修改。说明书提及的所有出版物、专利和专利申请用于所有目的作为参考整体引入，如所述的每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地作为参考引入的程度一样。
实施例1
CRM197与Aβ肽的偶联
半抗原/抗原肽的偶联通过利用如下所述的方法将具有39个赖氨酸残基的活化载体CRM197与具有侧巯基的半抗原/抗原肽反应而进行(图1)。所有Aβ肽在羧基末端含有半胱氨酸残基以促进这些肽通过半胱氨酰基巯基与载体蛋白偶联。这些肽通过固相合成产生。
I.活化
CRM197的游离氨基通过与过量的溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)反应而进行溴乙酰化(Bernatowicz和Matsueda，1986)。将10％(v/v)1.0M的NaHCO3 (pH8.4)添加至CRM197的冰冷溶液(～15mg)。与所用的CRM197等量的溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯溶于200μl二甲基甲酰胺(DMF)中，缓慢添加至CRM197，并且在室温下暗处温和混合1小时。得到的溴乙酰化(活化)蛋白质通过流过利用PBS/1mM EDTA(pH7.0)作为洗脱液的脱盐(P6-DG)柱而进行纯化。纯化后，合并对应活化CRM197的级份并且通过BCA蛋白质分析法评估蛋白质浓度。用溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯处理前后，蛋白质氨基与2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBSA)反应，用作溴乙酰化的指示(Means等.，1972)。
II.偶联
偶联前，肽与5，5′-二硫-双(2-硝基苯甲酸)[Ellman′s试剂]反应以验证游离-SH基团的含量(降低62-88％之间)。对于最初的四个Aβ肽(氨基酸1-7无接头、氨基酸1-12具有GAGA(SEQ ID NO.：10)接 头、氨基酸1-9具有GAGA(SEQ ID NO.：10)接头以及氨基酸1-7具有GAGA(SEQ ID NO.：10)接头)，约8.0-10.0mg肽溶于无菌蒸馏水至约20mg/ml的浓度。肽以1∶1的比率(w/w)缓慢添加至冷的活化的CRM197并且添加20-36μl的1N NaOH将pH调节为约7.0-7.2。得到的材料在4℃暗处温和混合过夜，随后在暗处用更换两次1LpH7.2的PBS进行透渗析。对于接着的四种Aβ肽(氨基酸1-5无接头、氨基酸1-9无接头、氨基酸1-12无接头以及氨基酸1-5具有接头)，与Ellman′s试剂的反应用于验证游离的-SH基团。如之前所述，溴乙酰化、纯化CRM197并且与TNBSA反应。每种肽的pH通过添加所溶解肽2.2x体积的0.1M NaPO4(pH8.5)而调节至7.0。肽以1∶1的比率缓慢加至冷活化的CRM197并且在4℃暗处反应过夜。透析所得到的材料。最终的对照肽(相反方向的1-12mer)根据下列改进如上所述偶联至CRM197。不是调节肽的pH至7.0，将活化的CRM197的pH通过添加20％(v/v)0.5M NaPO4(pH8.0)的调节至约7.5。每种偶联物在透渗析后转移入无菌的15mL聚丙烯试管中，包裹在铝箔中，并且在4℃储存。随后利用质谱法验证载体上的反应性氨基残基的活化。
Figure S04841798920060825D000411
实施例2
Aβ肽-CRM197偶联物的制备以及通过超滤进行纯化
CRM197的溴乙酰化
0.01M磷酸钠缓冲液，0.9％NaCl，pH7.0中的CRM197(100mg)与溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(在DMSO中溶解至20mg/mL)以1∶1的重量比在氩氛下反应。如需要，滴定反应以维持pH为7.0。在室温下暗处搅拌混合物1.5小时。反应混合物经1.2μm的过滤而进入UF/DF系统(Millipore Labscale TFF，Billerica，MA)的滞留物储存器。利用10K或30K UF薄膜通过用0.01M磷酸钠缓冲液/0.9％NaCl，pH7.0的渗滤(30倍)而完成纯化。溴乙酰化的CRM197通过流过0.2μm的过滤器而进行过滤。溴乙酰化程度通过将活化的CRM197与半胱氨酸反应，随后为对得到的羧甲基半胱氨酸(CMC)进行氨基酸分析和定量而进行确定。
Aβ肽和溴乙酰化CRM197的偶联以及用N-乙酰半胱胺加帽
将溴乙酰化的CRM197(50mg)转入反应器。将1M碳酸钠/碳酸氢钠添加至维持在2-8℃的搅拌溶液中。在氩气氛下进行滴定以达到9.0的目的pH。单独地，称出50mg Aβ肽并溶于注射用水(WFI)中至20mg/mL。将1M碳酸钠/碳酸氢钠添加至该溶液中直至达到pH9.0。将肽溶液加至溴乙酰化的CRM197溶液中，并且在2-8℃搅拌混合物14-18小时。用20倍摩尔的过量N-乙酰半胱胺在2-8℃对残留的溴乙酰基加帽3-6小时。
将反应混合物滤过1.2μm过滤器而进入UF/DF系统(MilliporeXL)的滞留物储存器，并且在室温下通过对0.01M磷酸钠缓冲液/0.9％NaCl，pH7.0的透滤而在10K或30K MWCO薄膜(Millipore)上进行30倍的渗滤而纯化偶联物。收集滞留物并且经0.2μm过滤以及通过SDS-PAGE、通过氨基酸分析而对蛋白质含量(Lowry或Micro-BCA比色测定法)以及小鼠的免疫原性进行分析。
实施例3
通过对未反应的溴乙酰基加帽而转化为氨基乙酰基
将如上述实施例2中制备的溴乙酰化CRM197(50mg)转入反应器中。将1M碳酸钠/碳酸氢钠添加至维持在2-8℃的搅拌的溶液中。在氩气氛下进行滴定以达到9.0的目的pH。单独地，称出50mg Aβ肽并且溶于WFI中至浓度20mg/mL。将1M碳酸钠/碳酸氢钠添加至该溶液中直至达到pH9.0。将肽溶液加至溴乙酰化的CRM197溶液中，并且在2-8℃搅拌混合物14-18小时。利用8％的碳酸氢铵溶液在2-8℃对残留的溴乙酰基团加帽4小时。
反应混合物经过1.2μm过滤而滤入UF/DF系统(Millipore XL)的滞留物储存器，并且在室温下通过对0.01M磷酸钠缓冲液/0.9％NaCl，pH7.0的透滤而在10K或30K MWCO薄膜(Millipore)上进行30倍的渗滤而纯化偶联物。收集滞留物并且经0.2μm的过滤以及通过SDS-PAGE、通过氨基酸分析而对蛋白质含量(Lowry或Micro-BCA比色测定法)以及小鼠的免疫原性进行分析。
实施例4
作为肽免疫原-蛋白质/多肽偶联物偶联和加帽程度评估的S-羧甲基半胱氨酸和S-羧甲基半胱胺的定量测定
利用溴乙酰化活化化学过程产生的蛋白质-肽偶联物的酸水解导致来自偶联位点半胱氨酸的酸稳定的S-羧甲基半胱氨酸(CMC)的形成以及来自加帽位点半胱胺的酸稳定的S-羧甲基半胱胺(CMCA)的形成(图2)。所有偶联和加帽的赖氨酸转化回赖氨酸并且照此检测。除了色氨酸和半胱氨酸，其由水解条件破坏，所有其他的氨基酸均水解回游离的氨基酸。天冬酰胺和谷氨酰胺分别转化为天冬氨酸和谷氨酸。
用去离子水稀释偶联样品使总蛋白浓度小于1mg/mL。干燥两份10微克等份的每种偶联物并重悬于100μL的6N HCl[Pierce]、5μL熔化的苯酚[Sigma-Aldrich]和1μ的2-巯基乙醇[Sigma-Aldrich]中。随后在110℃真空下(100mT)温育样品22小时。干燥所得的水解产物， 重悬于250μL的Beckman Na-S柠檬酸钠样品稀释缓冲液(pH2.2)中[Beckman Instruments，Inc.，Fullerton，CA]，并且利用Whatman 0.2μm尼龙注射顶端过滤器和1mL的注射器进行过滤。
然后将每种样品随后上样在Beckman 6300氨基酸分析器样品环管中并置于分析器中。每种水解的样品和对照的氨基酸利用离子交换层析进行分离，随后与Beckman茚三酮NinRX溶液在135℃进行反应。随后在570nm和440nm可见区内检测衍生的氨基酸(参见表1)。含有500皮摩尔的每种氨基酸的氨基酸标准组[Pierce Amino AcidStandard H]与样品和对照一起跑样而用于每组的分析。将S-羧甲基半胱氨酸[Sigma-Aldrich]加至标准组。
表1
在Beckman6300氨基酸分析器上利用梯度程序1的氨基酸的保留时间
  保留时间(分钟)   氨基酸     用于检测的波长
  8.3   羧甲基半胱氨酸   CMC   570
  9.6   天冬氨酸/天冬酰胺   Asx   570
  11.3   苏氨酸   Thr   570
  12.2   丝氨酸   Ser   570
  15.8   谷氨酸&谷氨酰胺   Glx   570
  18.5   脯氨酸   Pro   570
  21.8   甘氨酸   Gly   570
  23.3   丙氨酸   Ala   570
  29.0   缬氨酸   Val   570
  32.8   甲硫氨酸   Met   570
  35.5   异亮氨酸   Ile   570
  36.8   亮氨酸   Leu   570
  40.5   酪氨酸   Tyr   570
  42.3   苯丙氨酸   Phe   570
  45.4   羧甲基半胱胺   CMCA   570
  48.8   组氨酸   His   570
  53.6   赖氨酸   Lys   570
  70.8   精氨酸   Arg   570
每一标准峰的面积用作用于每种样品进行成比例评估的定量等 值。在440nm测定脯氨酸并且利用最相近的谷氨酸转换为570nm的等值。
利用赖氨酸的皮摩尔与蛋白质中理论上的赖氨酸值的比较将这些皮摩尔值中的每一个转换为氨基酸残基的摩尔比。以赖氨酸共价附着于半胱氨酸和半胱胺以及预期的类似的水解为基础，选择赖氨酸用于这项评估。然后将所得的氨基酸的摩尔数与蛋白质的氨基酸组成比较并且与CMC和CMCA的值一起记录。CMC值直接用于偶联程度的评估，并且CMCA值直接用于加帽程度的评估。
实施例5
Aβ-CRM197肽偶联物的表征和优化
为了验证偶联，通过氨基酸分析和基质-辅助的激光解吸电离-飞行时间(MALDI-TOF)质谱法分析所有肽-CRM197偶联物。对于每种偶联物，通过氨基酸分析(S-羧甲基半胱氨酸残基的数目)和MALDI-TOF质谱法确定偶联至每摩尔CRM197的肽的摩尔数。由每种方法测定的值通常是一致的。
I.尺寸排阻色谱法：
从贮藏室取出批量的浓缩样品并且加温至室温。温和混合Aβ肽偶联物样品以确保均相制备。Aβ肽偶联物样品在Eppendorf微量离心管中离心以除去所有微粒。取出上清用于TosoHaas TSK-Gel G3000SW层析(TosoHaas，Stuttgart，Germany)。TosoHaas TSK-Gel G3000SW柱连接HPLC系统并且压力范围设置为1.4MPa。柱用至少30mL的PBS(10mM磷酸钠、150mM NaCl，pH7.2±0.1)以0.75mL/min的流速平衡。将Aβ肽偶联物样品上样于采用下列参数的TosoHaas TSK-GelG3000SW柱上：
Aβ肽偶联物样品的浓度：1.5±1.0mg/mL
流速：0.75mL/分钟
样品体积：0.1mL
运行时间：30分钟
在280nm和210nm监测吸光度。用于长期储存，用至少50mL的20％的乙醇以0.5-1.0mL/min的流速平衡TosoHaas TSK-Gel G3000SW柱。
II.PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)：
通过使用具有中性pH的NuPAGE双-Tris电泳(Novex，Frankfurt，Germany)，预-制的聚丙烯酰胺微凝胶系统和NuPAGE MES SDS电泳缓冲液进行SDS-凝胶检验活化的(溴乙酰化的)CRM197和Aβ肽-CRM197偶联物。每种活化的CRM或偶联物的8μg等分试样与还原样品缓冲液混合并且在100℃加热5分钟。偶联物和分子量(MW)标准(Invitrogen，Carlsbad，CA)上样于基于双-Tris-HCl缓冲系统的10％(w/v，丙烯酰胺)NuPage凝胶(Novex)上并在MES SDS电泳缓冲液-PAGE(Laemmli)中电泳。SDS-PAGE后，用Pierce Gel Code蓝(Pierce，Rockford，IL)对凝胶染色。Aβ肽-CRM197偶联物由约66kD的主带表示，在天然CRM的条带和约120kD的二聚物条带之上，连同少量多聚体条带(数据没有显示)。
III.肽-CRM197-偶联物的MALDI-TOF质谱分析： 
质谱用于偶联程度的直接近似值法。通过使用3，5-二甲氧基-4-羟基-肉桂酸(芥子酸)作为基质的MALDI-TOF质谱法分析活化的CRM197 和偶联物样品的合适的等分试样。通过MALDI-TOF质谱法(FinniganMAT Lasermat 2000质谱仪，Ringoes，NY)测定的CRM197的分子量发现集中于60.5kD而对于偶联物，取决于偶联程度在65kD至74kD的范围(数据没有显示)内改变。发现CRM197中多达22个赖氨酸(约50％)被修饰，比率为1∶1。
IV.优化实验：
活化和偶联程度为试剂：蛋白质比率、反应温度和反应缓冲液的pH的函数。以下给出一些实例以举例说明进行用于确定最适pH条件 的最佳偶联条件，以便拥有用于偶联反应的可重复的方法控制参数。结果(图3)显示Aβ5mer(DAEFRC)(SEQ ID NO：1)以及Aβ7mer(DAEFRHDC)(SEQ ID NO：2)的偶联反应为pH依赖的并且当反应条件的pH提高时产生更高程度的修饰/偶联。利用5mer和7mer肽的TFA盐，在pH9.0时用不同上样量的肽评估偶联程度(图4)。从这些结果明显看出每个CRM分子具有既定数目肽拷贝的肽偶联物可通过在偶联过程期间改变肽/活化的CRM的比率而产生。类似的实验利用Aβ7mer肽的乙酸盐完成。
对于Aβ1-7/CRM偶联，通过每个CRM的CMCA的摩尔数与每个CRM的CMC的摩尔数的比较而评估加帽过程。由于对于所检验的每种肽：CRM比率的CMC和CMCA的总数是恒定的，加帽过程推定为完全的(图5)。偶联物中修饰总数保持在19和21之间(图5)，与溴乙酰化的赖氨酸数目相当。这些实验用TFA作为肽的平衡离子而完成。利用肽的乙酸盐而不是TFA盐重复Aβ1-7/CRM的偶联，并且这些数据显示在图5和6中。在每一点CMC和CMCA的总数停留在20和22之间时，加帽过程似乎是完全的。在pH9.0时已优化了用于Aβ-CRM偶联反应的条件，偶联程度通过反应中肽与CRM的比率得以控制。通过将该比率从0.1改变至1.5，可改变偶联程度(图6)。
活化和偶联程度为试剂：蛋白质比率、反应温度和反应缓冲液的pH的函数。通过从每一偶联物的质量值减去活化的CRM197的质量值并且除以用于制备偶联物的肽的质量计算每一偶联物的修饰程度(偶联)。所有偶联物的修饰程度(偶联)描述在表2中。
偶联程度还与通过每摩尔CRM197形成的S-羧甲基半胱氨酸残基的估算量所确定的值相比较(也显示在表2中)。
表2
修饰程度：MALDI-TOF和AAA数据的比较
  样品   Da  (来自质谱)   偶联程度  (来自质谱)   偶联程度  (来自CMC-氨基酸分析)
  CRM197   58,408   ---   ---
  BrAc-CRM   60,752   19   ---
  Aβ1-7/CRM   74,463   14   15
  Aβ1-7/CRM   72,375   12   14
  Aβ1-5/CRM   75,425   20   21
  Aβ1-5/CRM   71,690   15   18
实施例6
Aβ肽偶联物的免疫原性研究
每种偶联至CRM197的如下肽：跨越Aβ的N-末端残基1-5、1-7、1-9和1-12的肽(有和无接头序列GAGAC)和对应于Aβ的N-末端反向序列氨基酸12至氨基酸1的肽(1-12mer反向序列)，在具有STIMULONTM QS-21的制剂中和未结合的Aβ1-12mer肽一起用于免疫小鼠。在研究开始时(第0周)和随后在第3和6周，用30μg或5μg剂量，用20μg佐剂STIMULONTM QS-21配制的一种样品皮下免疫每组小鼠。该研究方案描述在表3中。
如表3所示，偶联至CRM197的如下肽：跨越AβN-末端残基1-5、1-7、1-9和1-12的肽(有和无接头序列GAGAC)和对应于AβN-末端反向序列的氨基酸12至氨基酸1的肽(1-12mer反向)在具有QS-21的制剂中和未结合的Aβ1-12mer肽一起用于免疫小鼠。在研究开始时(第0周)和随后在第3和6周，用30μg或5μg剂量，用20μg佐剂QS-21配制的一种样品皮下接种每组小鼠。Swiss Webster小鼠每组5只用于整个研究。注射体积＝100μl；B＝采血；V＝接种；E＝放血。
如下所述，通过Aβ和CRM197的ELISA测定抗-Aβ效价。简言 之，在室温下用无菌碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.6中的2μg/mL的Aβ1-42对Costar96孔板(#3591)包被过夜。用200μl/孔0.05％BSA的1XPBS/0.05％Tween20溶液在室温下对板排空并封闭两小时。排空封闭的板并且用含有TBS，0.1％Brij-35(无叠氮化物)洗涤缓冲液的板洗涤机洗涤。所有一抗血清用含有0.05％Tween20/0.02％叠氮化物的1XPBS中的0.05％BSA连续稀释并随后将100μl的每种稀释液转入合适的平板孔并且在室温下温育2小时。随后如上所述排空/洗涤平板。用来自Southern Biotech(city，state)的碱性磷酸酶偶联的山羊抗-小鼠IgG二抗用含有0.05％Tween20/0.02％叠氮化物的PBS中0.05％BSA以1∶1000比率稀释并且每孔添加100μl且在室温下温育1小时。随后如上所述排空/洗涤平板并最后用100μL/孔在二乙醇胺/MgCl2，pH9.8中制备的1mg/mL对硝基苯基磷酸盐底物溶液室温下温育1小时。通过添加50μl/孔的3N的NaOH终止显色。在405nM对平板读数，690nM作为参比。在0.1AU的O.D.计算终点效价。
表3小鼠免疫研究方案
  组编号   描述  剂量(μg)   第0周   第3周   第6周  第8周   第13周   第16周
  AE488   CRM/1-7w/o接头  30   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE489   具有接头的  CRM/1-12  30   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE490   具有接头的CRM/1-9  30   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE491   具有接头的CRM/1-7  30   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE492   CRM/1-5w/o接头  30   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE493   CRM/1-9w/o接头  30   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE494   CRM/1-12w/o接头  30   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE495   具有接头的CRM/1-5  30   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE496   CRM/1-7w/o接头  5   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE497   具有接头的  CRM/1-12  5   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE498   具有接头的CRM/1-9  5   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE499   具有接头的CRM/1-7  5   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE500   CRM/1-5w/o接头  5   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE501   CRM/1-9w/o接头  5   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE502   CRM/1-12w/o接头  5   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE503   具有接头的CRM/1-5  5   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE504   CRM197C1-6151  30   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE505   CRM197C1-6151  5   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE506   CRM/12-1聚体  30   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE507   CRM/12-1聚体  5   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE508   1-12聚体肽  30   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE509   1-12聚体肽  5   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE510   Ab  30   B，V   B，V   B，V  B   B   E
  AE511   Ab  5   B，V   B，V   B，V  B   B   E
CRM197ELISA
Creiner 96孔平板(#650011)用5.0μg/mL(100μl/孔)CRM197 的无菌碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液，pH9.6在37℃包被90分钟。排空平板并且用含有1XTBS，0.1％Brij-35洗涤缓冲液的平板洗涤机洗涤。所有一抗血清用含有0.3％Tween20/EDTA的1XPBS连续稀释并且将每种稀释液的100μl随后转入合适的平板孔并且在37℃温育1小时。平板随后如上所述排空/洗涤。来自Southern Biotech的碱性磷酸酶偶联的山羊抗-小鼠IgG二抗用含有0.05％Tween20/0.02％叠氮化物的1XPBS 1∶1000稀释，并且每孔添加100μl且在37℃温育1小时。平板随后如上所述排空/洗涤并且最后用100μL/孔的在二乙醇胺/MgCl2，pH9.8中制备的1mg/mL对硝基苯磷酸盐底物溶液在室温下温育1小时。显色通过添加50μl/孔3N的NaOH而终止。在405nM对平板读数，690nM的读数作为参照。在0.1AU的O.D.计算终点效价。
表4-6说明了针对Aβ的终点ELISA效价。初次免疫之后，所有的八种偶联物(阴性对照除外)均诱导了可检测的抗-AβIgG免疫应答。然而，在初次免疫的第3周，Aβ30μg的剂量，而不是5μg的剂量产生阳性应答。所有偶联物当中，无接头偶联的Aβ1-7肽物看来引起与其他所研究的偶联物同样好或更好的应答。在5μg剂量，Aβ1-5C在8-16周效果更好。Aβ1-7C在30μg剂量时最佳。用5或30μg剂量的第二和第三次免疫后抗体效价的分析显示大部分偶联物对Aβ的最大免疫应答在第二次免疫后观察到。至少在小鼠中，第三次免疫看来未增强免疫应答。然而，Aβ肽需要用30μg剂量的三次免疫以达到针对该肽的最大免疫应答(表5)。因为抗体在延长的一段时期内衰解，用偶联物免疫的组的抗体水平相比组内的最高水平降低了2至3倍。分析来自第6周和8周的单个样品以计算每组针对Aβ的GMT(表6)而观察是否任何偶联物组都大体好于其他组。来自Aβ1-5C、Aβ1-7C和Aβ1-9C偶联物6周效价的统计分析显示Aβ1-7偶联物诱导明显更高的效价。从该实验很明显看出，接头序列GAGAC并不有助于提高针对肽的免疫应答。
Figure S04841798920060825D000521
表4.利用来自5μg剂量跨越不同的淀粉样Aβ肽N-末端长度的肽偶联物的抗血清针对Aβ在第0、3、6、8、13和16周的ELISA终点效价。参照：Elan超免疫多克隆#592＝3,073,307。0.1AU.O.D.的终点。Swiss Webster小鼠用5μg的用20μg STIMULONTM QS-21配制的上述抗原在第0、3和6周SC-N免疫。
Figure S04841798920060825D000531
表5.利用来自30μg剂量跨越不同的淀粉样Aβ肽N-末端长度的肽偶联物的抗血清针对Aβ在第0、3、6、8、13和16周的ELISA终 点效价。参照：Elan超免疫多克隆#592＝3,073,307。0.1AU.O.D.的终点。Swiss Webster小鼠用30μg的用20μg STIMULONTM QS-21配制的上述抗原在第0、3和6周SC-N免疫。
表6
  组   第6周   第8周
  1-5C  1-7C  1-9C  1-12C  1-5LC  1-7LC  1-9LC  1-12LC  1-42   237,668a   1,866,702a   963,323a   940,260  395,553  516,921  826,773  544,768  365   161,671b   881,146b   595,414b   955,470  141,084  394,521  562,458  376,952  4,565
表6.利用来自30μg剂量跨越不同的淀粉样-Aβde N-末端长度的肽偶联物的抗血清针对Aβ在第6和8周的ELISA终点GMT。参照：Elan超免疫多克隆#592＝3,073,307。0.1AU.O.D.的终点。Swiss Webster小鼠用30μg的用20μg STIMULONTM QS-21配制的上述抗原在第0、3和6周SC-N免疫。
a.来自1-5C、1-7C和1-9C第6周的效价利用Tukey-Kramer的统计分析仅在1-5C对1-7C之间显示统计学差异，而利用Student′s T-检验的分析在1-5C对17C和1-5C对1-9C之间显示统计学差异。
b.来自1-5C、1-7C和1-9C第8周的效价的统计分析在三组中并不显示统计学差异，而在1-5C对1-7C之间有趋势可能显示差异。
PDAPP小鼠脑组织染色
PDAPP脑组织染色分析提供了Aβ肽偶联物和/或Aβ1-42抗血清功能性的指示。分别分析来自单个小鼠组血清样品对含有淀粉样肽的 PDAPP小鼠脑组织斑的识别能力。结果显示在表7A和7B中。除Aβ5聚体偶联物抗血清外，在识别斑中存在剂量-相关的应答。与接头无关，30μg偶联物-诱导的抗血清相比5μ1g偶联物抗血清具有更好的反应图谱。然而，对于Aβ5具体偶联物抗血清，似乎5μg组具有类似的或更好的反应。比较所有这些结果，推断从Aβ1-5聚体至Aβ1-9聚体制备的偶联物足以在小鼠中引发斑点识别的免疫应答并且接头的存在并不是必要的。可从该研究得到下列结论：(a)所有的肽偶联物诱导针对载体蛋白CRM197相比对未结合的CRM197对照(未显示)相等或稍高水平的高效价抗血清。(b)具有GAGAC接头的偶联物相比无接头的偶联物并不增强免疫原性或功能性。(c)免疫原性数据和PDAPP脑组织染色(功能性抗体的初步指示)表明Aβ1-5聚体和Aβ1-7聚体偶联物看来为用于进一步开发的优选免疫原。
表7A.PDAPP小鼠脑组织染色。
Figure S04841798920060825D000561
所有抗血清1∶1000稀释用于染色方法。
表7B.PDAPP小鼠脑组织染色
Figure S04841798920060825D000571
所有抗血清1∶1000稀释用于染色方法。
实施例7
猴的免疫原性研究
6组猴在第0、29和58天接受30μg的具有STIMULONTM QS-21、明矾或RC529SE制剂为佐剂的7聚体偶联物(全部偶联物)。所包括的另外的组为具有明矾(Al(OH)3)或RC529SE的30μg 5聚体偶联物，具有STIMULONTM QS-21的75和300μg的Aβ作为阳性对照。阳性对照每两周免疫。在第36和64天测定抗-Aβ抗体效价(图7-9)。在第36天，具有STIMULONTM QS-21、明矾和RC529SE的7聚体/CRM偶联物分别引发10110、13330和17090的GMT效价(图7)。相比之下，Aβ1-42加STIMULONTM QS-21在75和300μg剂量水平分别引发223和1734的GMT。Aβ5聚体偶联物含有明矾时引发2134的效价并且在含有RC529SE时引发15980的效价。在第64天，即具有STIMULONTMQS21或者RC-529SE的偶联物3次剂量后诱导比第二次剂量后显著高的效价(针对7聚体/RC-529SE的GMT 69910；针对Aβ5聚体/RC-529SE的21640和针对Aβ7聚体/STIMULONTM QS-21的30310)(图8)。具有明矾的偶联物相比第二次免疫后在第三次免疫后引起降低的效价。看来Aβ7聚体偶联物引发比Aβ5聚体偶联物更好的应答。在猴体内，以RC-529SE或STIMULONTM QS-21为佐剂的Aβ7聚体偶联物引发最高水平的应答(图9)。对具有明矾的Aβ7聚体偶联物的应答为中等的并且类似于具有STIMULONTM QS-21的300μg Aβ1-42。
从当前的实施例可得到一些结论。第一，偶联物在灵长类中具有很好的免疫原性。第二，免疫制剂中佐剂的存在显著影响免疫应答。第三，至少高达三个剂量的每次免疫剂量后，除了铝佐剂，RC-529SE和STIMULONTM QS-21增强免疫应答(图9)。总的说来，Aβ7聚体偶联物在529存在时诱导更高水平的抗体应答，其后为STIMULONTM QS-21(参见图9)。
实施例8
多抗原肽(MAP)偶联物的制备及其免疫原性研究
一些方法可用于在载体上产生多个抗原位点。在上述实施例中，每个抗原位点通过规定的偶联和加帽化学过程分别与载体偶联。在本实施例中，多个抗原位点通过Aβ1-7聚体串联重复体的固相合成而构建。或者，这些串联重复体可在有或无通过如在别处所述的赖氨酸核心的连接而与T-细胞表位连接。合成这些多抗原肽而具有用于与载体蛋白偶联的另外的半胱氨酰残基。合成在其羧基端具有另外的半胱氨酰残基的含有一个重复单元(1-7)、三个重复单元(1-7)3和五个重复单元(1-7)5的肽。这些肽通过其C-末端半胱氨酸残基共价附着于溴乙酰化的CRM而过夜。该反应在pH9.0-9.2、以表8中所述的肽：CRM比率添加而进行。不与肽反应的溴乙酰组用N-乙酰半胱胺加帽。这些批量分别表示含有偶联至CRM的Aβ1-7肽一个单拷贝、三个串联拷贝和五个串联拷贝的偶联物。表8简要概述了样品的性质。
表8
多抗原肽(MAP)偶联物样品 
如通过氨基酸分析所测定的，肽负荷量(每一载体的Aβ1-7肽平均数)和加帽数目(表9)为每一载体独特氨基酸(CMC或CMCA)的数目。CMC和CMCA值参照赖氨酸。
表9
每一偶联物的偶联和加帽程度
Figure S04841798920060825D000592
Swiss-Webster小鼠(每组10只)用1或0.1/μg Aβ/CRM偶联的肽皮下免疫。一半小鼠用100μg佐剂Al(OH)3配制的组合物免疫，并且一半无佐剂免疫。免疫定于第0周和第3周。采血定于第0、3和6周。分析血清样品针对Aβ1-42聚体肽的抗体应答。结果显示在表10中。
表10
对多抗原肽(MAP)偶联物的抗-Aβ终点效价 
初次免疫后所有偶联物诱导抗。Aβ1-42抗体效价，并且所述水平在加强剂量后显著提高。在缺乏铝佐剂时，第3周和第6周采血时剂量应答的差异明显。较高的剂量引发高-效价的抗体应答。相比无佐剂组，铝佐剂在两种剂量水平(0.1和1μg)在第3周时引发显著更高水平的抗体应答。第二次免疫后，以1μg剂量施用的偶联物引起抗体水 平5至10倍的提高。在该剂量水平，具有3和5个重复体的肽偶联物比含有单个重复体的偶联物诱导更高水平的抗体应答。还测定了针对CRM载体的效价，并且列于表11中。
表11
多抗原肽(MAP)偶联物的抗-CRM终点效价
Figure S04841798920060825D000611
在第0周和第3周免疫动物并且在第0、3和6周采血。佐剂：100μgAl(OH)3或无。ND＝未测定。
表11中的数据显示无佐剂组甚至在两次免疫后在1μg以及0.1μg剂量水平仍然诱导极低的抗-CRM抗体应答水平。然而，具有氢氧化铝佐剂的偶联物在1μg剂量诱导显著的抗-CRM抗体应答水平并且在0.1μg剂量诱导低得多的应答。佐剂存在时，CRM效价对单个重复偶联物最高、对三个重复偶联物中等并且对五个重复偶联物最低。此 和预料的一样，因为每一肽剂量的CRM剂量对于Aβ(1-7)5/CRM最低，而对于Aβ(1-7)1/CRM最高。对于0.1μg的剂量，差异仅在第6周时是统计上显著的。
本发明目的是针对抗原性半抗原而不必针对载体蛋白引发高效价的免疫原性应答。在某种情况下，期望针对半抗原抗原决定簇引发最佳的免疫应答而针对载体蛋白最小限度地引起或不引起免疫应答。对于所述应用，无佐剂的具有多抗原决定簇串联重复体的偶联物将满足所述需要。
实施例9
具有不同载体蛋白的Aβ-肽偶联物的制备及其免疫原性。
该实施例利用六个不同的载体蛋白比较了偶联物的免疫原性。Aβ1-7的乙酸盐在pH9时以1∶1的重量比添加至溴乙酰化的载体中。所有偶联物除了Aβ1-7/rC5ap用N-乙酰半胱胺加帽。所有可选择的载体均为重组细菌蛋白质，包括CRM(白喉类毒素)、重组C5a肽酶(rC5ap；克隆自无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，包括D130A  和S512A突变)、ORF1224、1664、2452(所有克隆自化脓链球菌)和T367、T858(每种克隆自肺炎衣原体)。所用载体的概要列于表12中。每种Aβ1-7偶联物至这些载体的偶联和加帽程度列于表13中。
该研究表明重组C5a肽酶偶联物比所检验的大多数其他载体，包括CRM诱导针对Aβ更高水平的效价。该差异对于接受氢氧化铝的组第6周时的效价是统计学上显著的。此外，在缺乏佐剂时，Aβ1-7/T858偶联物比大多数其他的偶联物明显更具免疫原性。相对于CRM对照偶联物唯一表现得较差的偶联物为Aβ1-7/T367，通过蛋白质印迹显示不与Aβ特异性单克隆抗体反应的偶联物。该研究证实许多其他的载体可成功地用于针对Aβ肽的免疫。
表12
载体和偶联物性质的列表
Figure S04841798920060825D000631
表13
每种偶联物的偶联和加帽程度
Figure S04841798920060825D000632
偶联结果：如通过氨基酸分析所测定的，肽负荷量(每-载体的Aβ1-7肽平均数)和加帽数目(表9)为每一载体独特氨基酸(CMC或CMCA)的数目。CMC和CMCA值参照赖氨酸。
免疫结果
该研究中每组的几何平均数列于表14中。在第3周，不考虑存在佐剂与否，Aβ1-7/rC5ap比用化脓链球菌ORFl224、1664、2452制备的或用肺炎衣原体ORF T367和T858制备的相应偶联物诱导显著更高水平的抗-Aβ效价。在第3周缺乏佐剂时，Aβ1-7/rC5ap也比除Aβ 1-7/T858外所有其他的偶联物更具免疫原性。无Al(OH)3的T858偶联物比无佐剂的ORFl224、ORFl664、ORF2452和CRM偶联物诱导更高水平的效价。唯一比Aβ1-7/CRM具有明显较低免疫原性的偶联物为Aβ1-7/T367(p＜0.00002)。在第3周和第6周有或无佐剂时T367载体均表现很差。在第6周，具有氢氧化铝的rC5ap偶联物比除Aβ1-7/ORF2452外的所有其他偶联物更具免疫原性(p＜0.04)。缺乏佐剂时，Aβ1-7/rC5ap和Aβ1-7/T858比ORFl224、ORFl664或T367偶联物诱导显著高水平的效价。无氢氧化铝的Aβ1-7/CRM比Aβ1-7/ORFl664或Aβ1-7/T367诱导更高水平的效价。
表14
抗-Aβ1-42终点效价。
Figure S04841798920060825D000641
动物在第0周和第3周免疫并且在第0、3和6周采血。剂量以偶联物的总量为基础。佐剂：100μg Al(OH)3或无。
实施例10
另外的Aβ肽一蛋白质偶联物的制备
I.活化
将融解的CRM197(8mL，59.84mg，7.48mg/mL)溶于0.1M硼酸 盐缓冲液(pH9，3.968mL)中达到5mg/mL的浓度。溶液在冰浴中冷却至0-5℃。溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺(59.9mg)(Aldrich-Sigma)溶于DMF(100μl)(Aldrich-Sigma)中并且逐滴添加至CRM197溶液中。添加溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺后观察到沉淀。检验pH时，降低至pH6。反应混合物的pH通过添加更多的0.1M硼酸盐缓冲液而回至pH9。反应混合物随后在4℃温和涡流搅拌1h。纯化混合物并且利用YM-10centriprep离心浓缩作用浓缩并且利用10mM硼酸盐作为洗脱液在Sephadex G-25上重提纯。合并对Bradford试剂阳性的组分并且利用centriprep YM-10浓缩。溴乙酰化的程度通过Bradford测定法测定(线性)。浓度为5.36mg/mL(产生30mg)。随后调节终浓度为5mg/mL并且在冷冻机中5％蔗糖中存储直至进一步使用。
II.偶联
对于每一偶联，使用融解的溴乙酰化CRM197。将肽溶于硼酸盐缓冲液(2.5mg的125ml的0.1M硼酸盐缓冲液)。观察到Aβ肽KLVFFAEDC(SEQ ID NO：45)、CLVFFAEDV(SEQ ID NO：47)、CKLVFFAED(SEQ ID NO：48)和LVFFAEDC(SEQ ID NO：50)少量的不溶。溴乙酰化的CRM197(5mg/mL)用肽溶液/悬浮液处理。混合物中肽和蛋白质的比率为1∶2。具有肽KLVFFAEDC(SEQ ID NO：45)、CLVFFAEDV(SEQ ID NO：47)、CKLVFFAED(SEQ ID NO：48)和KLVFFAEDC(SEQ ID NO：45)的偶联物混合物中观察到混浊。随后检验混合物的pH(pH9)并且缓慢涡流振荡，在4℃温育过夜。温育前使得混合物的终浓度达到3mg/mL。具有肽CLVFFAEDV(SEQ IDNO：47)和LVFFAEDC(SEQ ID NO：50)的偶联混合物的混浊在温育后消失。然而，KLVFFAEDC(SEQ ID NO：45)和CKLVFFAED(SEQID NO：48)仍然是微混浊的。还用半胱胺以1∶1(w/w)的比率制备可溶的模拟蛋白质偶联物。合成肽获自BIOSOURCE，具有约95％的纯度。
八聚物：
LVFFAEDVC(SEQ ID NO：44)
KLVFFAEDC(SEQ ID NO：45)
VFFAEDVGC(SEQ ID NO：43)
CLVFFAEDV(SEQ ID NO：47)
CKLVFFAED(SEQ ID NO：48)
CVFFAEDVG(SEQ ID NO：46)
七聚物：
VFFAEDVC(SEQ ID NO：49)
LVFFAEDC(SEQ ID NO：50)
III.对蛋白质上未反应的赖氨酸基团加帽：
未反应的赖氨酸用N-乙酰半胱胺(CMCA；Aldrich-Sigma)以1/1(w/w)的比率在4℃加帽4hr，同时在暗处涡流振荡。未反应的肽和加帽试剂通过利用Slide-A-Lyzer盒(Mw截留分子量10,000)(Pierce)对PBS缓冲液(2L)过夜(13hr)透析而从偶联物除去。进行两次缓冲液更换和透析(2×14h)。具有肽KLVFFAEDC(SEQ ID NO：45)和CKLVFFAED(SEQ ID NO：48)的偶联物中观察到少量的不溶。所有偶联物随后4℃在防腐剂中保存于冰箱中。
IV.蛋白质载体的表征：
MALDI-TOF MS用于测定溴乙酰化CRM197的质量和模拟偶联物N-乙酰半胱胺-CRM197的质量。
根据CRM197和溴乙酰化CRM197的质量，对11个赖氨酸残基进行修饰。
(59941.46-58590.29)/122＝11
其中；CRM197的Mw为58624.29
溴乙酰化CRM197的Mw为59941.46
溴乙酸盐的Mw为122。
溴乙酰化程度超过28％。(CRM197中赖氨酸的总数为39)。这11个修饰的赖氨酸残基，10个与半胱胺结合。偶联率为90％。
(61143-59941)/119＝10
其中；溴乙酰化CRM197的Mw为59941.46
模拟偶联物的Mw为61143
N-乙酰半胱胺的Mw为119
(10/11)x100＝90。
V.肽-蛋白质偶联物通过用Tris-Tricine预制凝胶的SDS-PAGE蛋白质印迹分析的表征：
蛋白质-肽偶联物通过蛋白质印迹分析。泳道为：标记(泳道1)；L-2837524/01(泳道2)；L-2837524/02(泳道3)；L-2837524/03(泳道4)；L-2837524/04(泳道5)；L-2837524/05(泳道6)；L-2837524/06(泳道7)；L-2837524/07(泳道8)；L-2837524/08(泳道9)；L-2837524/09(模拟物)(泳道10)和BrAcCRM197(泳道11)。来自小鼠的肽特异性单克隆抗体(248-6H9-806Aβ17-28)用作一抗(抗血清)(发现1∶3000稀释最好)。山羊-抗小鼠IgG(H+L)-HPR为二抗(1∶1000稀释)。除了模拟偶联物和活化的CRM197，观察到所有偶联物均被一抗识别。(参见图10.)
蛋白质浓度
偶联物样品的蛋白质浓度通过Pierce BCA分析法测定。(参见表15)
氨基酸分析
进行氨基酸分析以确定偶联程度。T偶联程度根据偶联物中发现的CMCA(羟甲基半胱胺)残基计算。CMCA用于与肽偶联后对未反应的活化位点进行加帽。(参见表15.)
表15
肽与BrAcCRM197的偶联程度
  偶联物编号   肽序列  (SEQ ID NO：)   终浓度(mg/mL)   偶联程度(基于CMCA)
  L-28375 24/01   LVFFAEDV-C  (SEQ ID NO：44)   1.67   8/10
  L-28375 24/02   KLVFFAED-C  (SEQ ID NO：45)   0.82   5/10
  L-28375 24/03   VFFAEDVG-C  (SEQ ID NO：43)   1.43   8/10
  L-28375 24/04   C-LVFFAEDV  (SEQ ID NO：47)   1.04   9/10
  L-28375 24/05   C-KLVFFAED  (SEQ ID NO：48)   0.78   1/10
  L-28375 24/06   C-VFFAEDVG  (SEQ ID NO：46)   0.97   9/10
  L-28375 24/07   VFFAEDV-C  (SEQ ID NO：49)   1.00   7/10
  L-28375 24/08   LVFFAED-C  (SEQ ID NO：50)   0.99   8/10
  L-28375 24/09  (模拟物)     1.89   10/11
所有比色测定法利用微量培养板分光光度计和SOFTmax Pro进行。
实施例11
Swiss Webster小鼠的Aβ肽偶联物的免疫原性研究
杂种Swiss Webster小鼠用每种偶联至CRM197的VFFAEDVG-C (SEQ ID NO：43)、LVFFAEDV-C(SEQ ID NO：44)、KLVFFAED-C(SEQ ID NO：45)、C-VFFAEDVG(SEQ ID NO：46)、C-LVFFAEDV(SEQ ID NO：47)、C-KLVFFAED(SEQ ID NO：48)、VFFAEDV-C(SEQ ID NO：49)、LVFFAED-C(SEQ ID NO：50)，或用Aβ1-7CRM197 免疫，所有的与佐剂RC529 SE配制。每组10只动物的九组用一种Aβ肽偶联物在研究开始时(第O周)和随后在第4周皮下免疫。之前，但在免疫当天收集血清。
自交Balb/c小鼠的Aβ肽偶联物的免疫原性研究
自交Balb/c小鼠如之前段落所述而免疫，但是还在第12周用偶联物和佐剂加强免疫。
结果
收集来自两个研究的血清而用于Aβ13-28肽-特异性IgG抗体效价的分析。还在第12周加强免疫之前的一天以及其后的一周收集来自BaIb/c小鼠的血清用于分析。对用于实施例11的来自动物的脾脏细胞评估其体外对跨越Aβ1-42肽、全长Aβ1-42、CRM197或多克隆活化剂混合库的刺激应答的潜力。分析包括对白介素4和5以及干扰素-γ的Elispot读数。在完成后，Aβ肽偶联物如上所述以及如实施例6中所述进行评估。
实施例12
PSAPP小鼠的Aβ肽偶联物的免疫原性研究
PSAPP小鼠用VFFAEDVG-C(SEQ ID NO：43)、LVFFAEDV-C(SEQ ID NO：44)、KLVFFAED-C(SEQ ID NO：45)、C-VFFAEDVG(SEQ ID NO：46)、C-LVFFAEDV(SEQ ID NO：47)、C-KLVFFAED(SEQ ID NO：48)、VFFAEDV-C(SEQ ID NO：49)、LVFFAED-C(SEQ ID NO：50)免疫。PSAPP小鼠，双转基因小鼠(PSAPP)过表达突变体APP和PS1转基因，在Holcomb，等，(1998)Nature Medicine4：97-11中描述。
PDAPP小鼠Aβ肽偶联物的免疫原性研究
PDAPP小鼠用VFFAEDVG-C(SEQ ID NO：43)、LVFFAEDV-C(SEQ ID NO：44)、KLVFFAED-C(SEQ ID NO：45)、C-VFFAEDVG(SEQ ID NO：46)、C-LVFFAEDV(SEQ ID NO：47)、C-KLVFFAED(SEQ ID NO：48)、VFFAEDV-C(SEQ ID NO：49)、LVFFAED-C(SEQ ID NO：50)免疫。PDAPP小鼠表达人APP的突变体形式(AppV71F)并且在幼年发展阿尔茨海默氏病(Bard，等.(2000)NatureMedicine 6：916-919；Masliah E，等.(1996)J Neurosci.15；16(18)：5795-811)。
结果
收集来自两个研究的血清而用于Aβ13-28肽-特异性IgG抗体效价的分析。在完成后，Aβ肽偶联物如上所述以及如实施例6和11中所述，以及在关联条件恐惧(contextual fear conditioning)(CFC)测定法中进行评估。
关联条件恐惧为学习的常见形式，其在大多数动物，例如哺乳动物中尤其可靠并可快速获得。试验动物在中性的刺激和/或环境之前学会恐惧是由于其与厌恶经历相关。(参见，例如Fanselow，Anim.Learn.Behav.18：264-270(1990)；Wehner等.，Nature Genet.17：331-334.(1997)；Caldarone等.，Nature Genet.17：335-337(1997))。
关联条件恐惧尤其可用于测定认知功能或功能失调，例如，作为疾病或病症，如神经退行性疾病或病症、Aβ-相关的疾病或病症、致淀粉样疾病或病症的结果，不利的遗传改变的存在影响认知功能(例如，遗传突变、基因破坏或不想要的基因型)，和/或药剂，例如Aβ偶联物剂对认知能力的效力。因此，CFC测定法提供了用于独立检验和/或验证药剂用于预防或治疗认知疾病或病症，并且尤其是影响脑一个或多个区域，例如海马、下脚、扣带皮层、额叶前皮层、鼻周皮层、 感觉皮层和中间颞叶的疾病或病症的治疗效果的方法。
通常，CFC测定法利用标准动物房和包括配合听觉(例如，一段时期85分贝的白噪声)、嗅觉的(例如，杏仁或柠檬香精)、触觉(例如，笼的地面纹理)和/或视觉信号(闪光)的轻微电击(例如，0.35mA足电击)的条件训练的使用。对厌恶经历(电击)的应答通常为僵硬的一种(除了呼吸不运动)但也可能包括眨眼，或瞬膜反射的变化，取决于所选的测试动物。厌恶应答通常在训练的第一天表征以确定根据对连续测试时期的厌恶应答结果而用于无条件恐惧的基线，例如，关联和/或暗示存在时但厌恶经历缺乏时的僵硬分别表征为关联和暗示条件性恐惧。为了提高可靠性，试验动物通常通过独立的技术人员分别检验并且根据时间的延长进行记录。另外的实验设计细节可在本领域中找到，例如Crawley，JN，What＇s Wrong with my Mouse；BehavioralPhenotyping of Transgenic and Knockout Mice，Wiley-Liss，NY(2000)。
典型的试验动物(例如，模型动物)包括表现出以致淀粉样病症如阿尔茨海默氏病为特征的明显病征或病状的哺乳动物(例如啮齿类或非-人灵长类动物)。模型动物可通过用于所需的选择性自交而产生或可利用本领域熟知的转基因技术遗传改造，以得到与痴呆病症有关的基因中的靶遗传改变(例如遗传突变、基因破坏)，导致靶基因的异常表达或异常功能。例如，可获得一些转基因小鼠品系，其过表达APP并且发展淀粉样斑病状和/或发展以阿尔茨海默氏病为特征的认知缺陷(参见例如，Games等.，上述，Johnson-Wood等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：1550(1997)；Masliah E和Rockenstein E.(2000)J Neuraltransm Suppl.；59：175-83)。
或者，模型动物可利用化合物(例如神经毒素、麻醉药)或外科技术(例如三维立体手术定位摘除、轴索切断、横切、吸引术)产生，其除去或换言之妨碍与致淀粉样病症的特有症状或病理表现有关的解剖学上脑区域(例如海马、扁桃体、鼻周皮层、中间隔核、蓝斑(locus coeruleus)、乳头体(mammalary bodies))或特定神经元(例如血清素能、胆碱能或多巴胺能的神经元)的正常功能。在某些优选的实施方案中，动物模型表现出除了与致淀粉样病症有关的神经变性病状外与学习或记忆有关的明显认知缺陷。更优选，认知缺陷随着年龄增长而逐渐恶化，使得模型动物的疾病发展与患有致淀粉样病症的受试者疾病发展相似。
用以检验在此所述的偶联物功能性的关联条件恐惧和其他体内测定法可利用野生型小鼠或具有导致记忆损害的某种遗传改变的小鼠或神经退行性疾病例如阿尔茨海默氏病的小鼠模型，包括在脑脊液(CSF)或血浆中呈现可溶的Aβ提高水平的小鼠模型而进行。例如，用于阿尔茨海默氏病的动物模型包括过表达人淀粉样前体蛋白″Swedish″突变体(hAPPswe；Tg2576)的转基因小鼠，其呈现年龄-依赖的记忆缺陷和斑(Hsiao等.(1996)Science 274：99-102)。此处所述偶联物的体内功能性还可利用Duff，等.(1996)Nature 383，710-713所述的PS-1突变体小鼠检验。阿尔茨海默氏病的其他遗传改变的转基因模型描述在Masliah E和Rockenstein E.(2000)J Neural Transm Suppl.59：175-83中。
在各个方面，本发明的方法包括能改善受试者认知的Aβ偶联物的施用，其中Aβ偶联物已利用适于受试者免疫治疗效力预示的测定法而鉴定。在典型的实施方案中，该测定法为模型动物测定法，其至少部分地以比较如从关联条件恐惧研究所测定的，在检测免疫试剂给药至该动物后与合适的对照相比的认知为基础。CFC测定法评估了用潜在的治疗化合物治疗后动物(通常为小鼠或大鼠)认知的变化。在某些实施方案中，所评估的认知变化为记忆损伤状态的改善或记忆缺陷的反转。因此，CFC测定法提供了测定用于预防或治疗认知疾病，并且尤其是影响脑一个或多个区域，例如海马、下脚、扣带皮层、额叶前皮层、鼻周皮层、感觉皮层和中间颞叶的疾病或病症的药剂治疗效果的直接方法。所述CFC测定法在2004年12月15日提交的题为 ″Contextual Fear Conditioning for Predicting IrnmunotherapeuticEfficacy″(代理人案卷No.ELN-058-1)的共同未决美国专利申请60/XXX,XXX和题为″Contextual Fear Conditioning for PredictingImmunotherapeutic Efficacy″(代理人案卷No.ELN-058-2)的美国专利申请60/XXX,XXX中详述，其全部内容在此作为参考引入。
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序列表
<110>艾兰制药公司(Elan Pharmaceuticals Inc.)
     惠氏公司(Wyeth)
<120>Aβ免疫原性肽载体-偶联物及其生产方法(AβImmunogenic Peptide Carrier
Conjugates And Methods of Producing Same)
<130>SCT062640-66
<140>
<141>
<150>WO PCT/US2004/044093
<151>2004-12-173
<150>US 60/530,481
<151>2003-12-17
<160>54
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>6
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>1
Asp Ala Glu Phe Arg Cys
1               5
<210>2
<211>8
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>2
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Cys
1               5
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>3
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1               5                   10
<210>4
<211>13
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>4
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1               5                   10
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>5
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1               5                   10
<210>6
<211>12
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>6
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<210>7
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>7
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1               5                   10
<210>8
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<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>8
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1               5                   10                  15
Cys
<210>9
<211>13
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>9
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1               5                   10
<210>10
<211>4
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>10
Gly Ala Gly Ala
1
<210>11
<211>13
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>11
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr
1               5                   10
<210>12
<211>13
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400>12
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala
1               5                   10
<210>13
<211>16
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>13
Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser Val Phe Asn Val
1               5                   10                  15
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>14
Phe Glu Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
1               5                   10
<210>15
<211>19
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>15
Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly
1               5                   10                  15
Asn Glu Gly
<210>16
<211>14
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>16
Gln Val His Phe Gln Pro Leu Pro Pro Ala Val Val Lys Leu
1               5                   10
<210>17
<211>15
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>17
Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu
1               5                   10                  15
<210>18
<211>21
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>18
Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys Val Ser
1               5                   10                  15
Ala Ser His Leu Glu
            20
<210>19
<211>15
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>19
Lys Gln Ile Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala Met Tyr
1               5                   10                  15
<210>20
<211>51
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>20
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
1               5                   10                  15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp
            20                  25                  30
Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe
        35                  40                  45
Arg His Asp
    50
<210>21
<211>42
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>21
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
        35                  40
<210>22
<211>22
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>22
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
1               5                   10                  15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu
            20
<210>23
<211>28
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>23
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp
1               5                   10                  15
Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu
            20                  25
<210>24
<211>43
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>24
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
1               5                   10                  15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu
            20                  25                  30
Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu
        35                  40
<210>25
<211>22
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>25
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
1               5                   10                  15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu
            20
<210>26
<211>20
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400>26
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu
1               5                   10                  15
Phe Arg His Asp
            20
<210>27
<211>34
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>misc_feature
<222>(24)..(24)
<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400>27
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala
1               5                   10                  15
Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala
            20                  25                  30
Ala Ala
<210>28
<211>34
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400>28
Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Asp Ala Glu
1               5                   10                  15
Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg
            20                  25                  30
His Asp
<210>29
<211>20
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400>29
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ala Lys Xaa Val Ala Ala Trp Thr Leu
1               5                   10                  15
Lys Ala Ala Ala
            20
<210>30
<211>24
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>30
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His
1               5                   10                  15
Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg
            20
<210>31
<211>24
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>31
Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His
1               5                   10                  15
Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg
            20
<210>32
<211>24
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>32
Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His
1               5                   10                  15
Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg
            20
<210>33
<211>34
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>33
Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu
1               5                   10                  15
Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg
            20                  25                  30
His Asp
<210>34
<211>27
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>34
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu
1               5                   10                  15
Lys Leu Ala Thr Asp Ala Glu Phe Arg His Asp
            20                  25
<210>35
<211>34
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>35
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala
1               5                   10                  15
Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu
            20                  25                  30
Ala Thr
<210>36
<211>27
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>36
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys
1               5                   10                  15
Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr
            20                  25
<210>37
<211>79
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>37
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Pro Lys Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu
1               5                  10                  15
Lys Leu Ala Thr Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala Ser Ser
            20                  25                  30
Val Phe Asn Val Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile
        35                  40                  45
Thr Glu Leu Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro
    50                  55                  60
Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp
65                  70                  75
<210>38
<211>58
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>38
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Asp Ala
1               5                   10                  15
Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly
            20                  25                  30
Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg
        35                  40                  45
Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu
    50                  55
<210>39
<211>44
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>39
Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe
1               5                   10                  15
Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp
            20                  25                  30
Leu Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu
        35                  40
<210>40
<211>535
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>40
Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn
1               5                   10                  15
Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln
            20                  25                  30
Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp
        35                  40                  45
Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly
    50                  55                  60
Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val
65                  70                  75                  80
Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val
                85                  90                  95
Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu
            100                 105                110
Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly
        115                 120                 125
Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser
    130                 135                 140
Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser
145                 150                 155                 160
Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp
                165                 170                 175
Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg
            180                 185                 190
Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val
        195                 200                 205
Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly
    210                 215                 220
Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu
225                 230                 235                 240
Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu
                245                 250                 255
His Pro Glu Leu Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val
            260                 265                 270
Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val
        275                 280                 285
Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu
    290                 295                 300
Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala
305                 310                 315                 320
Val His His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser
                325                 330                 335
Ser Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp
            340                 345                 350
Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe
        355                 360                 365
Gln Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His
    370                 375                 380
Lys Thr Gln Pro Phe Leu His Asp Gly Tyr Ala Val Ser Trp Asn Thr
385                 390                 395                 400
Val Glu Asp Ser Ile Ile Arg Thr Gly Phe Gln Gly Glu Ser Gly His
                405                 410                 415
Asp Ile Lys Ile Thr Ala Glu Asn Thr Pro Leu Pro Ile Ala Gly Val
            420                 425                 430
Leu Leu Pro Thr Ile Pro Gly Lys Leu Asp Val Asn Lys Ser Lys Thr
        435                 440                 445
His Ile Ser Val Asn Gly Arg Lys Ile Arg Met Arg Cys Arg Ala Ile
    450                 455                 460
Asp Gly Asp Val Thr Phe Cys Arg Pro Lys Ser Pro Val Tyr Val Gly
465                 470                 475                 480
Asn Gly Val His Ala Asn Leu His Val Ala Phe His Arg Ser Ser Ser
                485                 490                 495
Glu Lys Ile His Ser Asn Glu Ile Ser Ser Asp Ser Ile Gly Val Leu
            500                 505                 510
Gly Tyr Gln Lys Thr Val Asp His Thr Lys Val Asn Ser Lys Leu Ser
        515                 520                 525
Leu Phe Phe Glu Ile Lys Ser
    530                 535
<210>41
<211>17
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>41
Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly
1               5                   10                  15
Arg
<210>42
<211>42
<212>PRT
<213>Mus musculus
<400>42
Asp Ala Glu Phe Gly His Asp Ser Gly Phe Glu Val Arg His Gln Lys
1               5                   10                  15
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile
            20                  25                  30
Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala
        35                  40
<210>43
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>A-beta 18-25+C
<400>43
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Cys
1               5
<210>44
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>A-beta 17-24+C
<400>44
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Cys
1               5
<210>45
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>A-beta 16-23+C
<400>45
Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Cys
1               5
<210>46
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>A-beta 18-25+C
<400>46
Cys Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly
1               5
<210>47
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>C+A-beta 18-25
<400>47
Cys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val
1               5
<210>48
<211>9
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>C+A-beta 16-23
<400>48
Cys Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp
1               5
<210>49
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>A-beta 18-24+C
<400>49
Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Cys
1               5
<210>50
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>A-beta 17-23+C
<400>50
Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Cys
1               5
<210>51
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>A-beta 16-22+C
<220>
<221>misc_feature
<222>(8)..(8)
<223>CRM 197 added via terminal cysteine
<400>51
Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Cys
1               5
<210>52
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>C+A-beta 18-24
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>CRM 197 added via N-terminal cysteine
<400>52
Cys Val Phe Phe Ala Glu Asp Val
1               5
<210>53
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>C+A-beta 17-23
<400>53
Cys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp
1               5
<210>54
<211>8
<212>PRT
<213>Artificial
<220>
<223>C+A-beta 16-22+C
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>CRM 197 added via N-terminal cysteine
<400>54
Cys Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu
1               5

Claims (12)

1.由以下成分组成的免疫原性偶联物：
CRM197载体蛋白，
所述CRM197载体蛋白含有2至39个被衍生的赖氨酸残基，每个被衍生的赖氨酸残基具有乙酰基化氨基，
一个或者多个肽免疫原，由选自SEQ ID NO：21所示的Aβ的残基1-5、1-7、1-9和1-12的Aβ片段，和在Aβ片段的羧基末端的半胱氨酸残基组成，所述半胱氨酸残基经半胱氨酸残基的半胱氨酰巯基与载体蛋白的一个或者多个被衍生的赖氨酸残基的乙酰基化氨基共价连接，以及
一个或者多个加帽分子，由与载体蛋白的一个或者多个被衍生的赖氨酸残基的乙酰基化氨基共价连接的N-乙酰半胱胺基组成，由此维持载体蛋白的官能性，使其保留其针对肽免疫原引发没有载体时不会出现的所需免疫反应的能力。
2.权利要求1的免疫原性偶联物，其中肽免疫原为DAEFR-C。
3.权利要求1的免疫原性偶联物，其中肽免疫原为DAEFRHDSG-C。
4.权利要求1的免疫原性偶联物，其中肽免疫原为DAEFRHDSGYEV-C。
5.免疫原性偶联物，其由以下成分组成：
CRM197载体蛋白，所述CRM197载体蛋白含有2至39个被衍生的赖氨酸残基，每个被衍生的赖氨酸残基具有乙酰基化氨基，
一个或者多个肽免疫原，由经末端半胱氨酸残基的半胱氨酰巯基与CRM197载体蛋白的一个或者多个被衍生的赖氨酸残基的乙酰基化氨基共价连接的DAEFRHD-C组成，
一个或者多个加帽分子，由与CRM197载体蛋白的一个或者多个被衍生的赖氨酸残基的乙酰基化氨基共价连接的N-乙酰半胱胺基组成，由此使免疫原性偶联物保留其针对肽免疫原引发没有载体时不会出现的所需免疫反应的能力。
6.权利要求5的免疫原性偶联物，其包含由S-羧甲基半胱氨酸测定确定的14个肽免疫原。
7.权利要求5的免疫原性偶联物，其包含由S-羧甲基半胱氨酸测定确定的15个肽免疫原。
8.权利要求5的免疫原性偶联物，其包含由质谱分析确定的12个肽免疫原。
9.权利要求5的免疫原性偶联物，其包含由质谱分析确定的14个肽免疫原。
10.权利要求5的免疫原性偶联物，其中一个或者多个肽免疫原的每个与CRM197载体蛋白的一个或者多个被衍生的赖氨酸残基的乙酰基化氨基共价连接以形成以下结构：
Figure FFW0000010263100000021
以及
一个或者多个加帽分子的每个与CRM197载体蛋白的一个或者多个被衍生的赖氨酸残基的乙酰基化氨基共价连接以形成以下结构：
Figure FFW0000010263100000022
11.免疫原性组合物，其包括权利要求1-10中任一项的免疫原性偶联物，连同一种或多种药用赋形剂和/或佐剂。
12.权利要求11的免疫原性组合物，其中一种或多种佐剂选自GM-CSF、529 SE、IL-12、磷酸铝、氢氧化铝、结核分枝杆菌、百日咳杆菌、细菌脂多糖、氨基烷基葡糖胺磷酸盐化合物、3-O-去酰化单磷酰脂类A、Quil A、QS-21、百日咳毒素、大肠杆菌热不稳定毒素、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、G-CSF、TNF-α和TNF-β。
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