CN1928074A - 一种降解木质纤维素的微生物菌剂及利用其降解木质纤维素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种降解木质纤维素的微生物菌剂及利用其降解木质纤维素的方法。它是由Pseudomanas sp.、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis组成。本发明的特点是对巨尾桉、加拿大杨和长白落叶松三种常用造纸用木材在28℃、固体发酵60天，其降解率分别为7.58％、17.15％和26.75％。对软木的降解效果明显优于已知的木材腐朽菌。扫描电镜、元素分析、固相核磁扫描、红外扫描等手段对降解前后的样品进行分析，进一步证实了木质纤维素发生了明显的降解。降解后样品结构变疏松，纤维素、半纤维素和木质素结构都被不同程度的降解，且木质素被降解的程度最高。PAGE活性染色结果显示，固体发酵条件下，产生高的木素过氧化物酶活性。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，特别涉及一种用于降解木质纤维素的微生物菌剂及利用其降解木质纤维素的方法。
背景技术
根据生物学家估算，地球上每年生长的生物能总量约1400-1800亿吨(干重)，中国是个农业大国，在农业生产中产生大量的农作物废弃物，这些废弃物在中国能源历史上，在农村能源领域扮演了十分重要的角色。据统计，2001年全国粮食产量为4.5264亿吨，而农作物秸秆产量为7.074亿吨，稻壳、玉米秸秆和麦秸占农作物废弃物总量的70.6％，其他生物质废弃物约占29.4％。
然而这些农作物废弃物的利用亦不相同，1998年，大约仅有800万吨农作物废弃物(约占10％)用作牲畜饲料；1.5亿吨(约占20％)用作工业原料；4亿吨(约占52％)用作燃料，作为农村地区的主要能源；1.4亿吨(约占18％)在田里直接烧掉或废弃。
造纸业也是工业固体生物质废弃物的一个较大的来源。2000年我国纸产量为2487万吨，总量为320万吨。其中，大约102万吨产生于木纸浆的生产过程，而且，这部分资源几乎没有被作为能源利用。
中国是世界上最大的木材和木制品生产国和消耗国之一。但同其他发达国家相比，人均占有森林量却很低。据专家估算，全国木材年需求量超过3亿立方米，但是国内供给量仅为1.5亿立方米，这就意味着短缺50％。而且预计今后木材需求量还要增加。预计到2015年，废弃物产量可达到1.4亿立方米。
生物质燃料中可燃部分主要是纤维素、半纤维素、木质素。按质量计算，纤维素占生物质的40-50％，半纤维素占生物质的20-40％，木质素占生物质的10-25％。
木质素的降解是陆地生态系统中碳素循环的关键步骤，以前的研究认为在木质素微生物中，只有白腐菌能彻底分解木质素，降解成CO2和水。而其它的腐生细菌和放线菌一般只能部分改变木质素分子结构。20世纪50～60年代证实木材腐朽与细菌相关，到80～90年代的研究工作表明细菌可以代谢杨木二氧己烷木质素、低分子量的磺化木质素及Kraft木质素片断。细菌能在一定程度上使木质素结构发生改性，成为水溶性的聚合产物，很少矿化木质素产生CO2。另外，细菌在木质素降解过程中主要起着间接的作用，即细菌与软腐真菌协作使木质素易于受到真菌的攻击，且可去除对腐朽真菌有毒性的物质，通常非丝状细菌木质素降解率＜10％，只能降解木质素低分子量部分和木质素的降解产物。因此，它们可能在木质素降解的最后阶段起作用。
目前国内外未见有利用细菌对木质纤维素进行直接降解的报道，研究主要集中在白腐真菌的木质纤维素降解转化方面，在木质素的降解微生物中，研究得最为深入的白腐菌是黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)和Sporotrichumpulverulentum，在P.chrysosporium中，已发现多种胞外酶与木素降解有关：木素过氧化物酶(lignin peroxidases，LiPs)，锰过氧化物酶(manganese peroxidases，MnPs)，多功能过氧化物酶(漆酶(laccase)，己二醛氧化酶(glyoxal oxidase，GLOX)和纤维二糖脱氢酶(cellobiose dehydrogenase，CDH)。利用本源原核微生物进行木质纤维素的降解及其木素过氧化物酶的生产具有微生物易于培养，产酶时间短，易于控制，易于实现工业化大规模生产等一系列优越性。
技术内容
本发明的目的在于克服目前白腐真菌降解木质纤维素的不足之处，而提供一种新型的降解木质纤维素的微生物菌剂以及利用上述菌剂降解木质纤维素的方法。
本发明目的可以通过如下方式来实现：
一种降解木质纤维素的微生物菌剂，是由Pseudomanas sp.(假单孢菌)、Bacillusamyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)、Bacillus subtilis(枯草芽孢杆菌)组成。
其中Pseudomanas sp.∶Bacillus amyloliquefaciens∶Bacillus subtilis＝4∶1∶1。
本申请还提供了一种利用微生物菌剂降解木质纤维素的方法，包括以下步骤：
(1)将木材粉碎成木屑，在121℃下灭菌1h，冷却后加入无菌的无机盐营养液，使木屑充分湿润；所述无机盐营养液为每1L溶液中含有如下重量克数的无机盐：K2HPO4 1，NaH2PO4 1，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4 0.2，CaCl2 0.1，FeSO4 0.05，MnSO4 0.02；
(2)将微生物活化至斜面，28℃培养24h，将活化后的菌种转接至液体培养基，28℃，300r/min培养24h，4000转离心20min，冷却干燥48h，得到各微生物干粉，然后按比例配比得微生物菌剂；
(3)接种，接种量为106个/g木屑，28℃恒温培养，每隔6天定时定量补充无机盐营养液，使其湿度维持在80％，培养60天后取出培养物，用无菌水充分洗涤后测定失重率。
本发明所述的细菌源微生物菌剂中的Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis均购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(购买证明见附件)。
附图说明
图1为微生物复合菌剂降解木质纤维素的流程图
图2为固体发酵条件下的木素过氧化物酶定性检测结果
图3为三种常用造纸用木材巨尾桉(A)、加拿大杨(Y)和长白落叶松(S)降解前后的电镜扫描图
图4为巨尾桉、加拿大杨和长白落叶松降解前后红外分析图
表1为巨尾桉、加拿大杨和长白落叶松降解前后元素分析结果
表2为巨尾桉、加拿大杨和长白落叶松降解前后13C-NMR图
具体实施方式
实施例1
将Pseudomanas sp.、Bacillus amyloliquefaciens与Bacillus subtilis活化至斜面，28℃培养24h，将活化后的各菌种转接至液体培养基，28℃，200r/min培养24h，4000转离心20min，冷冻干燥48h得到各微生物干粉，各种微生物之间的生物量(g/L)配比为Pseudomanas sp.∶Bacillus amyloliquefaciens∶Bacillus subtilis＝4∶1∶1；得微生物菌剂。
实施例2
将微生物菌剂接种接种木屑，接种量为106个/g木屑，28℃恒温培养，每隔6天定时定量补充无机盐营养液(K2HPO4 1；NaH2PO4 1；(NH4)2SO4 0.5；MgSO4 0.2；CaCl2 0.1；FeSO4 0.05；MnSO4 0.02[g/L])，使其湿度维持在80％，培养60天后取出培养物，用无菌水充分洗涤。
实施例3
方法同上，采用失重法测定巨尾桉、加拿大杨和长白落叶松三种常用造纸的降解率分别为7.58％、17.15％和26.75％。并进一步采用扫描电镜、元素分析、固相核磁扫描、红外扫描等手段对降解前后的样品进行分析，证实了木质纤维素的降解。
表1
| 样品编号 | N(％) | C(％) | H(％) | O(％) | 化学式 | C∶O(原子个数比) | C∶H(原子个数比) |
| SS(DE)YY(DE)AA(DE) | 0000.1200.20 | 48.6448.0648.8647.3948.5448.24 | 6.216.006.246.096.226.19 | 45.1645.9444.9146.4145.2445.37 | C100H152.5N0O69.4C100H149.4N0O71.6C100H152.1N0O68.8C100H153.8N0O73.3C100H153.0N0O69.9C100H152.6N0O70.7 | 100∶69.4100∶71.6100∶68.8100∶73.3100∶69.9100∶70.7 | 100∶152.5100∶149.4100∶152.1100∶153.8100∶153.0100∶152.6 |
表2
| 积分范围(ppm) | 积分结果(％) | 官能团/物质 | 代号 | |||||
| A | A(DE) | Y | Y(DE) | S | S(DE) | |||
| 177-167158-141141-129129-112111-10095-8282-6766-4727-14 | 2.169.066.142.2514.0811.5939.8514.290.58 | 2.328.855.872.0614.3612.6739.6713.540.67 | 1.136.634.152.3313.1511.1143.9215.562.03 | 1.616.954.251.8213.2511.1044.3115.141.58 | 0.058.253.785.8913.1111.5245.8011.460.15 | 0.4510.005.195.9112.8011.9541.0112.690.00 | 羰基紫丁香基C3，C5；氧替代苯环中的C-3，C-4；愈创木基C4；愈创木基C3紫丁香基C4；紫丁香基C1；愈创木基C1；羟苯基C3，C5；对羟基苯基C2，C6愈创木基alpha-羰基；对羟基苯基C3，C5；愈创木基C5；愈创木基C2紫丁香基C2，C6；纤维素上的C1；木聚糖C1晶型纤维素的C4；β-C；木聚糖C4C-α；多聚糖C-2:C-3:C-5；苯甲醚；苯甲基苯基醚；晶型纤维素上的C-6；C-γ；苯氧基乙烷；半纤维素上的C-6的背景等木质素的芳基甲氧基醋酸甲氧基 | ABCDEFGHI |
本发明与现有技术相比具有如下优点：采用细菌源微生物菌剂代替传统的白腐真菌进行固体发酵，微生物生长迅速，易于培养，产酶时间短，对软木的降解效果由于目前已知的报道，易于扩大化生产。具体如下：
1、微生物易于培养，液体发酵24h即可获得大量的菌体，缩短了种子的发酵周期。
2、固体发酵过程中，对我国南北方常用造纸用木材都有一定的降解效果，尤其对软木的降解率明显优于目前已知的报道，且对木质素的降解效果由于对纤维素、半纤维素的降解效果。
3、发酵条件简单，制得的细菌源微生物菌剂在工业生产应用过程中，操作方便，成本低廉。
Claims (3)
1、一种降解木质纤维素的微生物菌剂，其特征在于是由Pseudomanas sp.、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus subtilis组成。
2、根据权利要求1所述的降解木质纤维素的微生物菌剂，其特征在于Pseudomanas sp.∶Bacillus amyloliquefaciens∶Bacillus subtilis＝4∶1∶1。
3、一种利用权利要求1或2的微生物菌剂降解木质纤维素的方法，其特征在于：
(1)将木材粉碎成木屑，在121℃下灭菌1h，冷却后加入无菌的无机盐营养液，使木屑充分湿润；所述无机盐营养液为每1L溶液中含有如下重量克数的无机盐：K2HPO4 1，NaH2PO4 1，(NH4)2SO4 0.5，MgSO4 0.2，CaCl2 0.1，FeSO4 0.05，MnSO40.02；
(2)将微生物活化至斜面，28℃培养24h，将活化后的菌种转接至液体培养基，28℃，300r/min培养24h，4000转离心20min，冷却干燥48h，得到各微生物干粉，然后按比例配比得微生物菌剂；
(3)接种，接种量为106个/g木屑，28℃恒温培养，每隔6天定时定量补充无机盐营养液，使其湿度维持在80％，培养60天后取出培养物，用无菌水充分洗涤烘干后测定失重率。
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