CN1911258A - 桑寄生提取物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，提供一种对人和动物的细胞增殖性疾病有治疗作用的桑寄生提取物及该提取物的制备方法。
Description
技术领域：
本发明属医药技术领域，具体涉及一种桑寄生类植物的提取物，该提取物对动物和人的细胞增殖性疾病有治疗作用。此外，本发明还涉及这些提取物的制备方法。
背景技术：
桑寄生是一味常用的中药，具补肝肾、祛风湿、降血压、安血养胎等功效，主治风湿、关节痛、高血压、坐骨神经痛、腰痛、产后乳少等症。未见其有抗肿瘤效果的报道。桑寄生科的同科数种植物，例如桑寄生(Taxillus chinensis)、红花桑寄生(Scurrula parasitica L.)、四川寄生(Taxillus sutchuenensis Danser)等常作为中药材桑寄生入药。
恶性肿瘤是严重危害人类健康与生命的疾病。流行病学调查表明，我国每年新增癌症病人约有160万人，每年死于癌症的约有130万人。由于人口老龄化和环境的恶化，近些年来这些数字还在不断上升。从植物中寻找天然抗肿瘤活性物质是研究抗肿瘤药物的一个重要途径，紫杉醇、喜树碱、长春新碱等植物药是目前效果较好的临床常用抗肿瘤药物。
发明内容：
本发明的目的是提供一种寄主为夹竹桃科植物的桑寄生的提取物。
本发明的另一个目的是提供从寄主为夹竹桃科植物的桑寄生中制备这些提取物的方法。
本发明的再一个目的是提供该提取物在治疗人和动物细胞增殖性疾病中的应用。
本发明一方面涉及用于治疗动物和人的细胞增殖性疾病的寄主为夹竹桃科植物的桑寄生提取物。
本发明再一方面涉及与其它抗肿瘤药物联用时，作为增敏剂或减毒剂用于治疗动物和人的细胞增殖性疾病的寄主为夹竹桃科植物的桑寄生提取物。
本发明再一方面涉及用于治疗动物和人的细胞增殖性疾病的药物组合物，包括寄主为夹竹桃科植物的桑寄生提取物与其它药物、药物载体或赋形剂的组合抗动物和人细胞增殖性疾病的作用。通常本发明药物组合物含有0.1～99.9％重量的桑寄生提取物，药物组合可以根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将桑寄生提取物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当形式或剂量形式。给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔黏膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等，可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成上述各种剂型，可以广泛使用本领域公知的各种载体。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
本发明还涉及用于治疗动物和人的细胞增殖性疾病的桑寄生提取物的制备方法。
本发明所指的桑寄生指来源于桑寄生科(Loranthaceae)钝果寄生属(Taxillus Van Tiehg.)、梨果寄生属(Scurrula Linn.)或桑寄生属(Loranthus Jacq)的任一种植物，优选的是梨果寄生属的任一植物，最优选的是梨果寄生属的红花桑寄生(Scurrula parasitica L.)，它们共有的最根本的特征是其寄主是夹竹桃科植物，优选的是夹竹桃(Nerium indicum)和黄花夹竹桃(Thevetiaperuviana)。有关桑寄生科(Loranthaceae)、钝果寄生属(Taxillus Van Tiehg.)、梨果寄生属(Scurrula Linn.)或桑寄生属(Loranthus Jacq)和夹竹桃科的科学定义和范畴，参见《中国高等植物科属词典》(修订版)(候宽昭编，北京：科学出版社，1984，12)及《中国植物志》第24卷(北京：科学出版社，1986)。所用药材部位，一般为其叶、枝、茎，也包括花和果。
该寄主为夹竹桃科植物上的桑寄生的提取物的制备方法是：
(1)采摘寄主为夹竹桃科植物上的桑寄生药材洗净凉干或烘干后粉碎，用极性或非极性溶剂加热或常温提取，优选的提取溶剂为60～80％的乙醇或同样浓度的其它醇类溶剂，优选的提取温度在60～80℃范围内；提取1～10遍，优选的提取遍数为3～5遍，每遍提取时间加热提取是一般1～4小时或更长，常温提取时间一般每遍1天或更长。也可以将药材先用有机溶剂(如石油醚、苯、甲苯或乙烷等)提取，过滤，弃去滤液保留滤渣以去除色素等脂溶性物质，滤渣再用上述方法提取。
(2)滤液调整至含醇约50～70％，放4℃冰箱过夜或更长时间，以使色素和油脂析出；过滤除去色素和油脂；也可再用石油醚萃取进一步除去色素和油脂。滤液回收溶剂，浓缩得浸膏。
(3)浸膏用聚酰胺粉或硅胶粉拌成糊状，干燥去除水分后研磨成细粉，过聚酰胺柱(优选的聚酰胺颗粒大小为100～200目)纯化，用水、10％～90％的梯度醇液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂浓缩得到浸膏，此浸膏经进一步干燥去除水分，得所需提取物。
(4)步骤(2)中浓缩时也可仅浓缩成较浓的水溶液，这时的浓缩液也可直接过聚酰胺柱纯化。
经成分分析，30～90％醇洗脱物中主要含黄酮类物质(含黄酮50％以上)，强心甙和生物碱等化学成分；水和10％醇洗脱物中含多糖(含糖56％以上)，糖蛋白和多肽等化学成分。
本发明得到的提取物的成分特征是其中含有强心甙类成分，而寄生于其它寄主(例如桑树、龙眼、桂树等)的桑寄生提取物不含强心甙成分。此类强心甙成分与寄主夹竹桃科植物所含的强心甙成分同，因为采用Agilent公司1100型高效液相色谱-离子阱质谱联用仪(LC-MSD Trap)检测分析发现，从红花桑寄生叶中提取的强心甙与从其寄主夹竹桃叶中提取的强心甙物质分子量不同。
用上述方法制备的寄生于夹竹桃科植物上的桑寄生提取物经体内外药效学实验发现为一种广谱的高效低毒抗肿瘤成分。体外对多种肿瘤细胞(例如白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌、宫颈癌、鼻咽癌等)有强烈的细胞毒活性，IC50一般在0.1～1μg/ml；但对正常人体细胞即使在50μg/ml的浓度也无细胞毒活性。体内抑制多种肿瘤的生长，并且对其它临床使用的抗肿瘤药物(例如阿霉素)有强大的增敏作用和减毒作用。
附图说明：
图1不同浓度红花桑寄生提取物对NB4细胞株的抑制率。
图2不同浓度红花桑寄生提取物对Jurtet细胞株的抑制率。
图3不同浓度红花桑寄生提取物对U266细胞株的抑制率。
图4不同浓度红花桑寄生提取物对HL-60细胞株的抑制率。
图5不同浓度红花桑寄生提取物对K562细胞株的抑制率。
图6不同浓度红花桑寄生提取物对NCI-H446细胞株的抑制率。
图7不同浓度红花桑寄生提取物对慢粒原代细胞的抑制率。
图8不同浓度红花桑寄生提取物对Hela细胞株的抑制率。
图9不同浓度红花桑寄生提取物对CNE细胞株的抑制率。
图10不同浓度红花桑寄生提取物对293T细胞株的抑制率。
图11不同浓度红花桑寄生提取物处理293T细胞株后的的光吸收值(OD值)变化。
图12不同浓度红花桑寄生提取物处理NCI-446细胞株后的光吸收值(OD值)变化。
图13不同浓度红花桑寄生提取物处理HL-60细胞株24h后的DNA ladder图谱
图13中：1-阴性对照；2-1μg/mL组；3-0.5μg/mL组；4-0.25μg/mL组
具体实施方式：
下面的实施例及生物活性实验用来进一步阐述本发明。
实施例1：采用加热回流提取法制备寄生于夹竹桃(Nerium indicum)上的红花桑寄生(Scurrula parasitica L.)枝叶提取物
(1)采摘寄生于夹竹桃上的红花桑寄生的叶和嫩枝，洗净凉(或烘)干后粉碎，过60目筛。取1000克粗粉加15倍的80％乙醇分三次回流提取，每次4小时，提取温度65℃。加水至含醇约70％，冰箱(4℃)内放置过夜，过滤去沉淀，滤液再用石油醚萃取一遍进一步去除色素和油脂。取乙醇液减压回收乙醇，浓缩至浸膏。
(2)浸膏用聚酰胺粉按约1∶1的比例拌匀，60℃烘干，碾磨成粉，过聚酰胺柱(100～200目)，以蒸馏水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇分步梯度洗脱，每种梯度的洗脱剂洗脱至基本无颜色时换下一梯度。分别减压浓缩。蒸馏水和10％乙醇洗脱物为粘性大的胶状物质，经成分检测主要含多糖(约56％)，也含有糖蛋白、多肽、氨基酸及其它物质；而30％、50％、70％和90％乙醇洗脱物中主要含黄酮类物质(约54％)，也含有强心甙、生物碱及其它物质。将上述洗脱物以不同比例混合或单独应用，均为本发明所指的桑寄生提取物。
实施例二：采用加热回流提取法制备寄生于夹竹桃(Nerium indicum)上的红花桑寄生(Scurrula parasitica L.)枝叶提取物
(1)采摘寄生于夹竹桃上的红花寄生的叶和嫩枝，洗净凉(或烘)干后粉碎，过60目筛。取1000克粗粉加15倍的80％乙醇分三次回流，每次4小时，提取温度65℃。加水至含醇约70％，冰箱(4℃)内放置过夜，过滤去沉淀，滤液再用石油醚萃取一遍进一步去色素和油脂。取乙醇液减压回收乙醇，此过程中随着浓缩液中乙醇浓度的逐渐降低，不断有沉淀析出，将沉淀分离取出；继续浓缩至浸膏。
(2)浸膏用聚酰胺粉按约1∶1的比例拌匀，60℃烘干，碾磨成粉，过聚酰胺柱(100～200目)，以蒸馏水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇分步梯度洗脱，每种洗脱剂洗脱至基本无颜色时换下一梯度。分别减压浓缩。蒸馏水和10％乙醇洗脱物为粘性大的胶状物质，经检测主要含多糖(约56％)，也含有糖蛋白、多肽、氨基酸及其它物质；而30％、50％、70％和90％乙醇洗脱物中主要含黄酮类物质(约54％)，也含有强心甙、生物碱及其它物质。将上述洗脱物以不同比例混合或单独应用，均为本发明所指的桑寄生提取物。
实施例三：采用渗漉提取法制备寄生于夹竹桃(Nerium indicum)上的红花桑寄生(Scurrulaparasitica L.)枝叶提取物
(1)采摘寄生于夹竹桃上的红花寄生的叶和嫩枝，洗净凉(或烘)干后粉碎，过60目筛。取3000克粗粉，装于渗漉筒中，加80％乙醇浸泡10天后，以每分钟约1mL的速度放出渗漉液，随时添加80％乙醇以保持药材被全部浸泡于乙醇液中，至渗漉液基本无色时认为提取完成。提取液减压回收部分乙醇后调节含醇量至约70％。其它步骤同实施例2。
实施例四：红花寄生提取物与阿霉素联用抗人急性白血病移植瘤的药效学研究
1.实验材料：
瘤株：高致瘤人早幼粒白血病细胞株HL-60来自福建省协和医院血液病研究所，裸鼠：BALB/c，nu/nu，鼠龄6～8w，体重18～22g，购自中国科学院上海实验动物中心，饲养于恒温(25-270C)，恒湿(45％-50％)SPF级的空气层流柜中，雌雄分开饲养。自由摄取食物和水，饮用水、饲料、垫料以及其他裸鼠接触物品均由高压灭菌处理。阿霉素(ADR)，上海华联制药有限公司产品，批号04-04-30。
2.实验方法：
(1)取处于对数生长期的HL-60细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×107ml-1，每只裸鼠接种0.2ml于右后肢背侧皮下。接种第5天，瘤长到约绿豆大小时即给药治疗。裸鼠称重，测量瘤径，随机分组，实验共设5组，每组动物5只。每日观察并记录裸鼠的饮食及活动状况及移植瘤生长情况，每2天用精密电子天平测量裸鼠体质量，进行药物毒性初步评价，即末体质量(FBW)/初体质量(IBW)≥0.8为无毒性反应，＜0.8为有毒性反应.每周量肿瘤体积，用游标卡尺测量肿瘤长径(a)，短径(b)，依据公式V＝ab2/2计算肿瘤体积，绘制肿瘤体积增长曲线。治疗结束后第二天断颈处死裸鼠，取瘤称重，计算抑瘤率。抑瘤率(IR)＝(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。药物相互作用指数(CDI)的计算公式为：CDI＝AB/(A×B)，在本实验中，AB为两联用组与对照组瘤重的比值，A或B是各药单独用药组与对照组瘤重的比值。当CDI＜1时，两药有协同作用，当CDI＜0.75时，协同作用非常显著。
分组：①生理盐水组：腹腔注射含1％DMSO的生理盐水；②ADR组：1.5mg/ml阿霉素；③提取物腹腔组：腹腔注射1mg/ml红花桑寄生提取物；④提取物瘤周组：瘤周注射1mg/ml红花桑寄生提取物⑤提取物+ADR组：腹腔注射1mg/ml红花桑寄生提取物，尾静脉注射1.5mg/ml阿霉素。注射剂量均为0.1ml/10g体重。阿霉素尾静脉一次性注射给药，红花桑寄生提取物及生理盐水每日腹腔注射给药，每天一次，共14天。
(2)病理检查：实验结束时解剖动物，肉眼观察内脏病变情况；取出心、肝、肾、脾，生理盐水冲洗后置于10％甲醛溶液中固定24小时，做病理学检查。
3.实验结果：
(1)药物治疗后，各组FBW/IBW值均＞0.8，可见无毒性反应.(表1)
表1药物毒性评价表
| 药物毒性评价 | 生理盐水组 | ADR组 | 提取物腹腔组 | 提取物瘤周组 | 提取物+ADR组 |
| 初体质量(IBW) | 22.3±1.7 | 22.6±1.2 | 23.1±1.5 | 19.7±1.1 | 20.2±0.6 |
| 末体质量(FBW) | 30.1±4.8 | 25.7±2.1 | 28.9±2.4 | 24.8±3.2 | 20.8±0.7 |
| FBW/IBW | 1.35 | 1.13 | 1.24 | 1.25 | 1.02 |
(2)HL-60裸鼠皮下移植瘤体积变化情况(表2)：
表2 HL-60裸鼠皮下移植瘤体积变化情况(单位：cm3)
| 组别 | 0天 | 7天 | 14天 |
| 对照组 | 0.025±0.026 | 1.267±0.776 | 8.939±2.942 |
| ADR组 | 0.028±0.025 | 0.197±0.111 | 3.527±1.822 |
| 提取物腹腔组 | 0.024±0.033 | 0.889±0.517 | 7.041±3.964 |
| 提取物瘤周组 | 0.035±0.017 | 0.237±0.144 | 5.085±3.094 |
| 提取物+ADM组 | 0.037±0.018 | 0.026±0.016 | 0.767±0.539 |
注：0天表示开始给药的时间
可以看出，提取物各处理组在第七天时均显著抑制瘤体生长，但腹腔注射组对瘤体生长后期抑制作用不佳；而瘤周注射对瘤体后期生长也有一定的抑制作用。提取物与阿霉素联用可以非常显著抑制瘤体生长。
(3)HL-60裸鼠皮下移植瘤重量变化情况(表3)：
表3 HL-60裸鼠皮下移植瘤重量变化情况
| 组别 | 动物数(只) | 除瘤体重变化 | 瘤重 | 抑瘤率 | P | CDI |
| 始/末 | (g) | (x±s，g) | (％) | |||
| 阴性对照组 | 5/5 | +1.394 | 7.52±1.36 | |||
| ADR组 | 5/5 | +0.532 | 2.57±1.38 | 65.8 | 0.001＜0.01* | |
| 提取物腹腔组 | 5/5 | +0.360 | 5.48±2.46 | 27.1 | 0.184＞0.05* | |
| 提取物瘤周组 | 5/5 | +1.510 | 3.55±2.29 | 52.8 | 0.019＜0.05* | |
| 提取物+ADR组 | 5/4 | +0.145 | 0.46±0.23 | 93.9 | 0.002＜0.01*0.026＜0.05**0.009＜0.01*** | 0.24 |
注：*实验组与对照组(生理盐水组)比较，**实验组与阿霉素单用组比较，***实验组与腹腔注射组比较.
红花桑寄生提取物10mg/kg腹腔注射抑瘤率为27.1％(与对照组比较P＞0.05)，与对照组差异均不显著。然而此剂量瘤周注射抑瘤作用显著，抑瘤率为52.8％(与对照组比较P＜0.05)。此剂量与阿霉素联用可显著增强阿霉素的抑瘤作用，实验中，ADR15mg/kg单独用药组的肿瘤抑制率为65.8％(与对照组比较P＜0.05)，两药联用组的抑制率为93.8％，与生理盐水组和腹腔注射组比较P＜0.01，差异均达到极显著的水平；与阿霉素组比较也有显著差异，P＜0.05，两药协同作用显著CDI＝0.24＜0.75。
(4)肉眼检查各处理组脏器均无明显改变；病理切片显示，阿霉素单独处理组心脏组织存在病变，心肌细胞肿大，细胞排列紊乱，而与桑寄生联用组心肌细胞正常。
实施例五：红花寄生提取物体内抗小鼠肉瘤S180的研究
1.实验材料：
小鼠肉瘤S180腹水型来自由福建省医科大学药学院，昆明种小白鼠购自福建实验动物中心，体重18～22g，，6～8周龄，雌雄兼用，购自福建医大实验动物中心。阿霉素(ADR)，上海华联制药有限公司产品，批号04-04-30。
2.实验方法：
2.1药物配制：30％酒精洗脱物粉末，50％酒精洗脱物粉末，70％酒精洗脱物粉末各100mg按1∶1∶1的比例混合，用生理盐水稀释成10.0mg/ml的储备液。称取红花桑寄生蒸馏水洗脱物粉末5g溶解于200ml生理盐水配置成25.0mg/ml蒸馏水洗脱物组。
阴性对照组(A)：生理盐水；
阳性对照组(B)：1.5mg/ml阿霉素，一次性腹腔注射；
乙醇洗脱物组(C)：用生理盐水将储备液稀释到1.0mg/ml；
乙醇洗脱物+蒸馏水洗脱物组(D)：用蒸馏水洗脱物稀释储备液到每毫升含(乙醇洗脱物1.0mg+蒸馏水洗脱物25.0mg)；
蒸馏水洗脱物组(E)：25.0mg/ml蒸馏水洗脱物。
2.2实验方法：取传代7天的腹水型肉瘤SI80腹水，用无菌生理盐水按1∶3比例稀释成肿瘤细胞悬液，接种于小鼠腹腔，每只鼠0.2ml。接种次日，随机分为A、B、C、D、E、5个组，每组10只，按10g体重0.1ml的给药体积腹腔注射给药，每天1次，连续给药14天，统计小鼠存活天数(超出28天按28天算)，计算各组的平均生存时间，求出生命延长率。
2.3实验结果：见表4。
从结果可以看出，阳性对照组、乙醇洗脱物组、蒸馏水洗脱物组、乙醇洗脱物+蒸馏水洗脱物组、对荷S180小鼠的生命延长率分别为25.5％、24.0％、23.0％h和43％。蒸馏水洗脱物组具有提高小鼠生命延长的作用，蒸馏水洗脱物和酒精洗脱物的混合使用对小鼠生命延长作用达到极显著，比二者单用具有更强的体内抗小鼠S180肉瘤效果。
表4红花桑寄生提取物对荷瘤小鼠生命延长率的影响
| 分组 | 动物只数 | 存活时间(d) | 生命延长率(％) |
| ABCDE | 1010101010 | 16.5±1.220.7±4.7*20.5±3.6*23.6±4.0**20.3±4.6* | -25.524.043.023.0 |
注：与对照组比较，*p＜0.05，**p＜0.01
实施例六：红花桑寄生提取物对NB4、Jurkat细胞集落形成率的影响
肿瘤系由不同的比例的、增殖及分化能力不同的瘤细胞群构成。其中仅小部分具有自我更新能力，即所谓的干细胞，约为整个细胞群的1％。干细胞为放射治疗及抗癌药物治疗的靶细胞，与肿瘤的治愈、复发或转移关系密切。一般认为只有干细胞才具有分化、形成集落的能力。故集落法可作为体外检测抗癌药物敏感性方法之一。
1.实验材料：甲基纤维素购自sigma，其它同实施例6。
2.实验方法：
(1)制备细胞悬液，培养液为含20％胎牛血清的RPMI1640培养液。计数，稀释为0.45ml含约300个细胞。
(2)接种细胞：于24孔板每孔加0.45ml1.6％甲基纤维素(用1640配制)，赶去气泡；然后将步骤一制备的NB4、Jurkat的细胞悬液加入，每孔0.45ml，约300个细胞。
(3)加药：悬浮细胞每孔加药物0.1ml，6个药物浓度，设两个重复孔另设无药物平行对照组。
(4)置于37℃，5％CO2，饱和湿度的培养箱中培养7天，计CFU细胞数(≥30个为一集落)。根据公式计算集落抑制率，即：集落抑制率＝(1-T/C)×100％。
3.实验结果：
表5红花桑寄生提取物对肿瘤细胞集落形成抑制率
| 组别 | 加药组集落数(个) | 对照组集落数(个) | 集落形成抑制率 |
| NB4细胞5μg/ml2.5μg/ml1μg/m0.5μg/ml0.25μg/ml0.1μg/ml | 0011926 | 484745752987 | 100％100％97.78％98.67％68.97％70.12％ |
| Jurkqat细胞5μg/ml2.5μg/ml1μg/m0.5μg/ml0.25μg/ml0.1μg/m | 0112423 | 323845564238 | 100％97.37％97.78％96.43％91.00％39.47％ |
与MTT实验比较，同样浓度的药物对集落形成抑制率更高，说明红花桑寄生提取物对肿瘤细胞中的增殖细胞作用更敏感。
实施例七：红花桑寄生提取物体外抑制各种人源肿瘤细胞的研究
1.实验材料：人源肿瘤细胞株：NB4(人急性早幼粒白血病细胞株M3)、Jurket(人T淋巴细胞白血病)、U266(人骨髓瘤细胞株)、HL-60(人急性早幼粒白血病细胞株M2)、K562(人慢性粒细胞白血病细胞株)、NCI-H446(人肺癌细胞株)Hela(人宫颈癌细胞株)、CNE(人鼻咽癌细胞株)，来自福建省血液病研究所；原代培养的慢性粒细胞白血病细胞取自慢粒病人骨髓；RPMI1640培养液(GIBCO)，胎牛血清(杭州四季青)，MTT(sigma)，红花桑寄生提取物。
2.实验方法：MTT法，取培养的对数生长期的细胞调整密度到每180μl含1×104～2×104个活细胞密度，接种于96孔培养板(每组3个复孔，重复3次，取平均值)，悬浮细胞接种完即可加药，贴壁细胞则培养一天，待细胞贴壁后再加药，每孔均加20μl药物，并设置无药对照组和空白对照组，然后置于37℃，5％CO2，饱和湿度的的CO2培养箱中分别孵育24h、48h、72h、96h和120h后，加20μl MTT，培养4h去掉上清液，加150μlDMSO，在酶标仪(StatFax-2100)上振荡3-4分钟，用双波长492nm和630nm测OD值，计算抑制率。抑制率＝(1-实验组OD值/未处理组OD值)×100％。
3.实验结果：如图1～9所示，红花桑寄生提取物对人肿瘤细胞株还是原代培养的慢性粒细胞白血病细胞均有强烈的抑制增殖的作用和杀伤作用，对各种肿瘤细胞株都有良好的效果，是一种广谱抗肿瘤药物。显微观察发现大部分细胞体积增大，胞浆内可见大量空泡。一些细胞体积缩小细胞呈出芽状改变，核浓缩，细胞形态完整。采用DNA梯带检测发现红花桑寄生提取物对肿瘤细胞的杀伤作用为诱导细胞凋亡(图13)。
实施例八：红花桑寄生提取物体外对人源正常细胞的作用研究
1.实验材料：正常人胚肾成纤维细胞株293T，来源于福建师范大学生命科学学院；其他同
实施例6。
2.实验方法：同实施例6。
3.实验结果：红花桑寄生提取物在体外对正常人胚肾成纤维细胞株293T的增殖也具有抑制作用(图10)，但是并无杀伤作用，细胞活性正常，只是无法贴壁。即使用高达50μg/ml的药物浓度处理后的光吸收值基本不变(图11)，可见细胞基本上无死亡也无增殖，而肿瘤细胞例如肺癌细胞株NCI-446即使用2.5μg/ml的药物浓度处理，其光吸收值也是下降的(图12)，说明有杀伤作用。以上结果说明红花桑寄生提取物对正常细胞的影响较小，细胞毒性低。
Claims (14)
1.一种桑寄生提取物，其特征在于其中含有强心甙类成分，桑寄生植物的寄主为夹竹桃科植物。
2.如权利要求1的桑寄生提取物，其特征在于其中所说的桑寄生是指桑寄生科植物。
3.如权利要求1的桑寄生提取物，其特征在于其中所说的夹竹桃科植物是指夹竹桃(Nerium indicum)和黄花夹竹桃(Thevetia peruviana)。
4.如权利要求1的桑寄生提取物，其特征在于该提取物的化学成分中含有黄酮类化合物。
5.如权利要求1的桑寄生提取物，其特征在于该提取物的化学成分中含有多糖类化合物。
6.如权利要求2的桑寄生提取物，其特征在于其中所说的桑寄生科植物是指红花桑寄生(Scurrula parasitica L.)、桑寄生(Taxillus chinensis)和指四川寄生(Taxillussutchuenensis Danser)。
7.制备权利要求1所述的桑寄生提取物的方法，其特征是该方法包括有以下步骤：
(1)药材洗净干燥后粉碎，用溶剂提取1～10遍，过滤取滤液；可以将药材先用有机溶剂提取，过滤，弃去滤液保留滤渣以去除色素等脂溶性物质，滤渣再用上述方法提取；
(2)滤液调整至含醇约50～70％，放冰箱冷藏一小时以上，以使色素和油脂析出，过滤除去色素和油脂；可再用石油醚萃取进一步除去色素和油脂；取滤液回收溶剂，浓缩；
(3)浓缩液过聚酰胺柱纯化，用水、10％～90％的梯度醇液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂浓缩，此浓缩液经进一步干燥去除水分，得桑寄生提取物。
8.如权利要求7的制备桑寄生提取物的方法，其特征在于其中所说的溶剂是指1％～99％的醇类溶剂。
9.如权利要求8的制备桑寄生提取物的方法，其特征在于其中所说的醇类溶剂是指1～99％的乙醇。
10.如权利要求7的制备桑寄生提取物的方法，其特征在于其中所说的溶剂是指水。
11.如权利要求7的制备桑寄生提取物的方法，其特征在于其中所说的干燥方法是指冷冻干燥、喷雾干燥、蒸发干燥。
12.如权利要求1的桑寄生提取物的用途，其特征在于其对人和动物的细胞增殖性疾病有治疗作用。
13.如权利要求12的桑寄生提取物的用途，其特征在于其中所说的治疗作用是指单独使用该药物时的治疗作用、用做增敏剂增敏其他药物的抗肿瘤效果时的治疗作用、作为有效成分与其它药物、药物载体或赋形剂的组合物的治疗作用。
14.如权利要求12的桑寄生提取物的用途，其特征在于其中所说的治疗作用是指与其他抗肿瘤药物联用时可以降低其他抗肿瘤药物的毒性作用。
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