CN1902314A

CN1902314A - NcSAG4基因用于诊断和预防新孢子虫病和作为分析发病机理的标志的用途

Info

Publication number: CN1902314A
Application number: CNA2004800399923A
Authority: CN
Inventors: L·M·奥尔特加莫拉; A·费尔南德斯加西亚
Original assignee: Universidad Complutense de Madrid
Current assignee: Universidad Complutense de Madrid
Priority date: 2003-12-04
Filing date: 2004-11-26
Publication date: 2007-01-24
Also published as: EP1710309A2; ES2263317A1; BRPI0417237A; WO2005053505A8; US20070275018A1; WO2005053505A2; CA2548582A1; US7579438B2; NZ547735A; AU2004294741A1; EP1710309B1; ES2263317B2; JP2007516705A; ES2390775T3; AU2004294741B2; WO2005053505A3; MXPA06006381A; RU2006123551A

Abstract

本发明涉及为了新孢子虫病的诊断和预防其的接种的目的的NcSAG4基因、所述基因的信使RNA、基于其核苷酸序列或其任何片段设计的寡核苷酸、和由此编码的NcSAG4蛋白、或其任何重组形式、含有其的表达载体和宿主细胞。本发明还涉及其作为犬新孢子虫慢殖子阶段特异性标志、用于分析发病机理或抗中间宿主中慢性感染确立的疫苗有效性的用途。

Description

NcSAG4基因用于诊断和预防新孢子虫病和作为分析发病机理的标志的用途

技术领域

本发明立足于动物健康及其相关领域，如这个描述性报道的标题所表示，涉及由原虫寄生虫犬新孢子虫(Neospora caninum)引起的疾病的诊断、发病机理分析和预防。更具体而言，本发明涉及对应于犬新孢子虫NcSAG4基因的多核苷酸分子、其信使RNA和由其编码的抗原NcSAG4，它是慢殖子阶段的一种特异性蛋白质，以及寡核苷酸、重组载体、转化的宿主细胞和重组表达的蛋白、它作为该疾病诊断试剂的用途、除了其生产疫苗的价值之外，它在用于研究该疾病发病机理的分子技术发展中的应用。

背景技术

新孢子虫病(Neosporosis)

犬新孢子虫是属于顶复(Apicomplexa)门的一种原虫寄生虫，顶复门包括其它值得注意的寄生虫病原体如与它密切相关的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)。自1989年以来犬新孢子虫已被描述为引起牛流产和新生仔畜死亡的媒介(Thilsted and Dubey.1989.J.Vet.Diagn.Invest.1，205-209)，尽管它可以感染各种各样的哺乳动物物种(Buxton等人2002，Trends Parasitol.18，546-552)。

牛新孢子虫病被认为是一种全世界分布的寄生虫病且是研究它的各个国家中繁殖失败的最常见原因之一(Trees等人1999.Int.J.Parasitol.29，1195-1200；Anderson等人2000，Anim，Reprod.Sci.60-61，417-431)，包括西班牙(González等人1999.Vet.Rec.144，145-150；Pereira-Bueno等人2003.Vet.Parasitol.111，143-152)。妊娠雌性中感染的最重要临床表现是流产，通常发生在妊娠第三和第九个月之间，且最常见大约在5-6个月。出生活着的受侵袭小牛会表现出神经肌肉问题，第一个临床征兆出现在分娩后4-5天，尽管它们可以延迟直至两周。然而最常见，尽管受到慢性感染，但仍生出健康小牛(Dubey and Lindsay，1999.Vet.Parasitol.67，1-59)。此外，新孢子虫病可以侵袭犬，它们的终宿主，在那里它引起多肌炎、脑炎、麻痹并可以引起死亡(Lindsay and Dubey，1989.J.Parasitol.75，163-165；Buxton等人2002.Trends Parasitol.18，546-552)。

如同刚地弓形虫一样，犬新孢子虫的生活史包括三个阶段。通过卵囊摄取感染中间宿主的子孢子被终宿主除去。另一方面，速殖子-快速复制型负责感染急性期，具有通过宿主组织传播的作用。当宿主产生免疫时，这个过程结束，然后确立慢性期，寄生虫缓慢增殖，内部含有慢殖子的组织囊肿形成，这在自然和实验感染的几个物种的神经组织(Dubey等人，1988，J.Am.Vet.Med.Assoc.193，1259-1263；Dubey等人1990.J.Am.Vet.Med.Assoc.197：1043-1044；Barr等人1992.J.Vet Diagn.Invest.4，365-367；Kobayashi等人2001.J.Parasitol.87：434-436)和自然感染的犬和母牛的骨骼肌组织(Peters等人2001.Int.J.Parasitol.31，1144-1148)中已经观察到。这些慢殖子潜伏在组织囊肿中直至再活化(Antony and Williamson.2001.New Zeal.Vet.J.49，42-47；Buxton等人2002.Trends Parasitol.18，546-552)。迄今未知顶复门寄生虫，如刚地弓形虫或犬新孢子虫中速殖子转变为慢殖子和反过来的机制基础，但是已经提示免疫反应可以影响慢性感染动物中感染的潜伏期和再活化(Lyons，等人，2002，Trends Parasitol.18，198-201)。

关于该疾病的传播，大多数近来研究提示出生后传播的重要性相对低并提到先天性感染的持久性贯穿一生(Davison等人1999.Int.J.Parasitol.29，1683-1689；Hietala and Thurmond.1999.Int.J.Parasitol.29.1669-1676)。先天性传播起着50％至95％的重要作用(Wouda等人1998.Theriogenology 49，1311-1316；Pereira-Bueno等人2000.in：Hemphill and Gottstein(Eds.)Int.J.Parasitol.30，906-909)并且看来在该疾病的传播和维持中起着非常重要的作用(Bjrkman等人1996.J.Am.Vet.Med.Assoc.208，1441-1444；Paré等人1996 Can.J.Vet.Res.60，133-139；Anderson等人1997.J.Am.Vet.Med.Assoc.210，1169-1172；Schares等人1998.Vet.Parasitol.80，87-98)。

犬新孢子虫抗原

关于在犬新孢子虫速殖子与慢殖子之间的抗原组成比较，迄今可以得到的信息非常有限，因为仅进行了一项研究，鉴定了速殖子或两个阶段共有的特异性抗原(Fuchs等人1998.J.Parasitol.84，753-78)，它与在刚地弓形虫中进行的研究形成对照，其中鉴定和表征了几个特异性阶段抗原。犬新孢子虫抗原包括两种表面蛋白，NcSAG1(Hemphill等人1997，Parasitology，115，371-380)-速殖子特异性的，其基因已经被Howe等人克隆(1998.Infect.Immun，66，5322-5328)和NcSRS2(Hemphill等人1996，Parasitol.Res.82，497-504)-在速殖子和慢殖子中共同表达。犬新孢子虫的两种表面蛋白最近在鼠模型中作为亚单位疫苗被试验(Canna s等人2003a.Parasitology 126(Pt.4)，303-312)。近来已鉴定了在该寄生虫两个阶段中都表达的两种微丝蛋白-NcMIC3(Sonda等人2000.Mol.Biochem.Parasitol 108，39-51)和NcMIC1(Keller等人2002.Infect.Immun.70，3187-3198)。此外，称作NcMIC10和NcMIC11的新孢子虫的两个序列已经包括在基因库中，可能编码微丝的两种蛋白，因为它们的序列分别与编码刚地弓形虫TgMIC10和TgMIC11的蛋白的序列具有高度可比性。已经被克隆的其它基因是NcGRA6和NcGRA7，它们编码犬新孢子虫速殖子的致密颗粒的蛋白，基于此开发了ELISA用于该疾病的诊断(Lally等人1996.Clin.Diagn.Lab.Immunol.3，275-279)。除了这些蛋白之外，已经鉴定和表征了来自致密颗粒的29和67kDa的分别被称作NcNTP酶-I(Asai等人1998Exp.Parasitol.90，277-285)和NcGRA2(Ellis等人2000.Parasitology 120(Pt 4)，383-390)的其它蛋白。另一方面，位于细胞内速殖子的微丝(Naguleswaran等人2001.Infect.Immun.69，6483-6494)中的其基因已被克隆的蛋白NcMIC3被表达为重组蛋白用于接种目的(Cannas等人2003b.J.Parasitol.89(pt.1)44-50)。

最后，NcSUB1是犬新孢子虫唯一克隆的基因，它表达一种酶。NcSUB1是65kDa的丝氨酸蛋白酶(Louie and Conrad.1999.Mol.Biochem.Parasitol.103，211-223；Louie等人2002.J.Parasitol.88，1113-1119)，位于速殖子的微丝中，与称作TgSUB1的刚地弓形虫蛋白显示出高度氨基酸同一性。

关于新孢子虫慢殖子的特异性抗原，由于体外和体内获得具有慢殖子的囊肿的困难，迄今为止没有一种得到鉴定。然而，已经描述了刚地弓形虫特异性慢殖子抗原，包括针对18kDa蛋白的单克隆抗体(T83B1)所识别的表面抗原(SAG4/p18)(Tomavo等人1991.Infect.Immun.59，3750-3753)。编码刚地弓形虫中这种蛋白的TgSAG4基因已经被dberg-Ferragut等克隆和表征(1996，Mol.Biochem.Parasitol.83，237-244)。

刚地弓形虫抗原TgSAG4是被磷脂酰肌醇聚糖(PI-G)锚定的一种膜蛋白。如Cultrera等人(2002，Mol.Cell.Probes 16，31-39)近来所表明的与刚地弓形虫慢性感染相关的缓慢生长阶段的这个特异性抗原的检测具有重要的诊断价值。这些作者发展了用于检测刚地弓形虫感染的RT-PCR，基于AIDS患者脑脊液中TgSAG4基因的mRNA检测，在AIDS患者中刚地弓形虫可以引起致命脑病。

新孢子虫病的诊断和预防

因此，由于在开发中，该疾病的垂直传播似乎持续是该疾病确立的最好方法和因为新孢子虫病是牛流产和新生仔畜死亡的主要原因之一，并伴随经济损失，所以控制必须主要针对减少农场中感染的流行，建立挑选和替换的选择性措施以减少感染动物的数量。

牛流产的病因诊断是复杂和艰苦的。在做到病因诊断的病例中，90％以上对应于目前犬新孢子虫起主要作用的传染性和寄生虫媒介。关于犬新孢子虫感染的诊断，进行实验室诊断以证实流产的病因学是必不可少的，其中血清学诊断技术起主要作用并提供关于问题重要性的初始信息。在成体中，通过检测特异性血清抗体进行实验室诊断，这对建立控制感染的有效措施非常有用，因为这类研究提供了关于农场中感染的分布和频率(畜群血清阳性率)和由于疫群中新孢子虫病引起的流产危险(畜群内血清阳性率)的很有价值信息(Thurmond andHietala.1995.Parasitol.81，364-367；Paré等人1996.Can.J.Vet.Res.60，133-139)。

因此，改进诊断对准确确立动物的健康情况极其重要。鉴于这种考虑，为了验证目前使用的血清学技术，澄清一些争端，如基于动物年龄和使用的技术的分界点选择，已经进行了很多研究(Alvarez-García等人2003.Vet.Res.34，341-352)。

几种诊断技术目前用于犬新孢子虫(Ferre等人2003.Res.Adv.Microbiol.3，157-167)，但是它们中无一能够区分近期感染与慢性感染，因此分别鉴定特异性速殖子和慢殖子抗原使提供关于在流产方面农场的未来的更多信息和加强对该疾病的控制的诊断技术得到发展。这些抗原作为重组蛋白的表达和它们用于新孢子虫病血清学诊断的用途提供了很有价值的新工具。鉴于这种考虑，已经发展了诊断方法，如ELISA，基于在不同类型异源表达系统中产生的几种犬新孢子虫蛋白(Lally等人1996.Clin.Diagn.Lab.Immunol.3，275-279；Louis等人1997.Clin.Diagn.Lab.Immunol.4(6)，692-699)，但是迄今为止无一基于特异性慢殖子抗原。此外，抗阶段特异性抗原的单克隆抗体和单特异性多克隆血清的开发是通过竞争性ELISA的发展进行诊断的可选择方法，如相对于犬新孢子虫速殖子65kDA蛋白所进行的诊断(Baszler等人1996.J.Clin.Microbiol.34(6)，1423-1428)。

另一方面，牛新孢子虫病的药物控制目前不可行，没有药物治疗牛的该疾病的经验且可得到的数据不鼓舞人心。然而，可能的治疗的高成本、可能的抗药性的出现和肉或奶中的残余物限制化疗作为控制措施。因此，免疫预防应该增至管理畜群的措施。

鉴于这种考虑，最近进行的制备抗犬新孢子虫疫苗的研究已包括具有可变效果的死疫苗的评估、在鼠模型(Liddell等人，1999，J.Parasitol.85：1072-1075)而不是牛模型(Andrianarivo等人1999，Int.J.Parasitol.30：985-990)中发现了对于垂直传播的某种防护作用。为了刺激抗犬新孢子虫致死感染的保护性免疫反应的目的，在小鼠接种试验中也已经使用了用基于毒力较小分离株(Atkinson等人1999.Parasitology 118：363-370)或温度敏感突变体(Lindsay等人1999.J.Parasitol.85：64-67)的活疫苗进行的免疫，由于起源于持续感染动物的问题，获得了令人鼓舞的但不是确定的效果。另一方面，亚单位疫苗显示出很多优于传统疫苗的优点(Jenkins，2001.Vet.Parasitol.101，291-310)，包括与活寄生虫相比重组蛋白的安全性和相对稳定性、仅包括诱导保护性免疫反应抗原的灵活性，和建立大规模生产的能力。基于犬新孢子虫抗原的、用于预防感染、流产或感染的垂直传播的亚单位疫苗的开发提供了控制所述问题的新工具。目前，在这件事情上进行的研究还很少。仅仅使用了速殖子抗原或两个阶段共有的抗原，如由原核生物系统表达和纯化的重组蛋白，包括NcMIC3，它在鼠模型中诱导抗脑新孢子虫病的保护性免疫(Cannas等人2003.J.Parasitol.89(1)，44-50)，以及NcSAG1和NcSRS2，速殖子的两种表面蛋白，接种在相同模型中，组合作为重组抗原和DNA疫苗(Cannas等人2003.Parasitology 126，303-312)，获得了好的效果。表达NcGRA7蛋白或NcsHSP33蛋白的质粒最近已在鼠模型中用作DNA疫苗，获得了抗感染的先天性传播的部分保护作用(Liddell等人2003.J.Parasitol.89(3)，496-500)。然而，迄今为止这些疫苗的开发尚未基于慢殖子阶段的特异性抗原，因为犬新孢子虫中描述的第一个抗原是由如本报道的发明说明书中所示的NcSAG4基因产生的抗原。

如背景中所述，在每个阶段特异性表达的基因的分离都与这种疾病的研究和确定慢性感染确立和感染再活化的分子机制，从而增加对该疾病的了解和控制非常相关。鉴于这种考虑，编码刚地弓形虫中慢殖子阶段特异性蛋白的TgSAG4基因同源物犬新孢子虫中NcSAG4基因的分离、它的克隆和阶段特异性抗原NcSAG4作为重组蛋白的表达，如在此发明的说明书中所述，为新孢子虫病的诊断和该疾病发病机理的分析提供了很有价值的解决方法，并且它作为疫苗的用途是控制该疾病的可选择方案。

发明内容

NcSAG4基因用于诊断和预防新孢子虫病和作为分析发病机理的标志的用途。

本发明的目的是提供用于诊断和抗犬新孢子虫的接种目的的有用试剂。此外，它提供了分析新孢子虫病发病机理的标志，主要用于感染慢性期确立和感染再活化的研究。因此，描述了分子技术，它已用于犬新孢子虫NcSAG4基因-这种寄生虫中描述的慢殖子阶段的第一个特异性基因的鉴定、分离和表征。为此，通过PCR扩增NcSAG4基因的几个DNA片段，所述PCR使用基于刚地弓形虫TgSAG4蛋白的氨基酸序列设计的四种简并寡核苷酸的组合，其中一种(SEQ ID NO：1)由dberg-Ferragut等人(1996，Mol.Biochem.Parasitol.82，237-244)描述。设计的其它三种寡核苷酸称作SAG4-2、SAG4-3和SAG4-4，且在序列表中分别标识为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。由获得的序列，设计另四种寡核苷酸以通过基因组步查技术完成该基因的序列。因此，寡核苷酸1R5SAG4(SEQ ID NO：5)和2R5SAG4(SEQID NO：6)用于以5′方向完成该基因。寡核苷酸1F3SAG4(SEQ ID NO：7)和2F3SAG4(SEQ ID NO：8)用于以3′方向完成该基因。

本发明描述了通过PCR扩增来克隆NcSAG4基因的方法，所述PCR使用专门为它设计的寡核苷酸并用限制性内切酶随后消化它们。为分别在原核生物和真核生物系统中表达，在两种类型质粒pRSET和pcDNA3.1/His(都是Invitrogen的)中进行这种克隆。一部分NcSAG4基因插入质粒pRSET，编码第29至148位氨基酸(包括第29和148位氨基酸二者)，对应于成熟蛋白NcSAG4序列，不包括该蛋白氨基末端的信号肽区域和其羧基末端可能的信号肽区域。为此，从犬新孢子虫基因组DNA PCR扩增NcSAG4基因的相应区域，所述PCR使用为它设计的寡核苷酸，称作F85NcSAG4(SEQ ID NO：13)和Re444NcSAG4(SEQID NO：14)。在这个系统中，重组蛋白pRNcSAG4在噬菌体T7的RNA聚合酶启动子控制下作为融合蛋白表达，它的氨基末端结合于允许用亲和色谱法纯化的组氨酸标记。为生产重组蛋白pRNcSAG4，使用在诱导基础上表达噬菌体T7RNA聚合酶的来自大肠杆菌的rosetta(DE3)pLysS细胞株(Novagen)，通过向培养基中添加IPTG，允许重组蛋白表达。这种重组蛋白在新孢子虫病血清学诊断中的应用为鉴别诊断不同阶段-感染的急性和慢性阶段提供了很有价值的新工具，通过ELISA、放射免疫测定法(RIA)或基于这些多肽抗原性的任何其它方法，如本发明的展开中所示，通过所述的Western印迹技术进行鉴别诊断。因此，可以检测被犬新孢子虫自然先天感染的胎畜和小牛的血清在15％丙烯酰胺-DATD凝胶中在变性条件下通过电泳分离的抗pRNcSAG4蛋白的抗体。这从犬新孢子虫急性和慢性感染的鉴别诊断和从这种蛋白作为疫苗的应用来预防这两个视点来看，提示了这种蛋白的价值。

随着抗重组蛋白pRNcSAG4的单克隆抗体和多克隆单特异性血清的开发，通过基于它们开发竞争性ELISA进行诊断是可选择方案。此外，这些抗在此描述多肽的单克隆抗体或特异性多克隆血清用于通过免疫组织化学、免疫荧光或基于通过所述血清检测该寄生虫的任何其它方法来诊断动物组织中犬新孢子虫的慢性感染。

本发明的一个目的是提供抗新孢子虫病、慢性感染的垂直传播和确立的疫苗。原核生物中异源基因的表达系统提供了大规模生产重组抗原、使用它作为亚单位疫苗的优点。这些疫苗具有另一个优点，即它们用作标记疫苗和它们产生的免疫反应可以容易地与感染动物中由该寄生虫引起的免疫反应区分开来，这在根除疾病的程序中具有决定性。此外，这些疫苗是安全的，它提供了优于基于重组载体如病毒载体的疫苗的优点。然而，后者提供了复制优点，其可用于以低剂量免疫。

然而，用作亚单位疫苗的这些类型的重组蛋白诱导主要是体液类型的免疫反应。因此，为了使免疫反应也成为基于细胞的反应，也使用针对这种反应的佐剂。另一方面，为引导基于细胞的反应和确保适当的蛋白折叠，使用DNA疫苗。

本发明描述了基于NcSAG4蛋白的DNA疫苗，它使用上述原核生物系统中产生的重组蛋白pRNcSAG4或不与它联合。为此，通过使用为那个目的设计的寡核苷酸，称作FNcSAG4(SEQ ID NO：11)和ReNcSAG4(SEQ ID NO：12)，PCR扩增NcSAG4基因的完整编码区，并在Bam HI和Eco RI限制性位点插入用于哺乳动物细胞的表达载体，质粒pcDNA 3.1/His，获得称作pCDA10的重组质粒，其用作DNA疫苗。

另一方面，本发明描述了NcSAG4基因作为与慢性感染相关的犬新孢子虫慢殖子期的标志的用途。使用在此描述的核苷酸分子，这个基因被用作诊断犬新孢子虫慢性感染的标志，通过PCR或RT-PCR、使用DNA探针的原位杂交或基于来自感染动物组织或流体的该寄生虫核酸的任何其它检测方法进行诊断。详述了通过RT-PCR检测NcSAG4基因在寄生虫中表达的方法，所述RT-PCR基于为分离基因设计的寡核苷酸，称作1F3SAG4(SEQ ID NO：7)和1R5SAG4(SEQ ID NO：5)。这种RT-PCR允许NcSAG4基因用作中间宿主中犬新孢子虫阶段转变的标志，并且是分析持续感染动物中确定慢性感染的确立和感染的再活化中所涉及的机制，和影响这些情况的因素，以及依据抗慢性感染确立和再活化的保护作用，确立抗犬新孢子虫疫苗产品的功效所需的工具。此外，使用NcSAG4基因启动子在转染的犬新孢子虫细胞中表达异源基因，由于用上述启动子构建的基因构建体，所以允许在体外和体内表达系统、细胞培养物和实验动物中分析确定速殖子至慢殖子阶段和反过来的转变的分子机制。

附图说明

为补充描述和为了帮助更好地理解本发明的特征，在例证和非限制性基础上给此描述性报道附上一组附图作为其不可分割的一部分：

图1

它代表犬新孢子虫基因组的Nc175和Nc312序列的扩增，如本报道实施例1所解释。

图2

它表示基因组步查图，如本报道的实施例1所解释。

图3

它表示NcSAG4基因插入表达质粒。图片A：PcDNA3.1/His。图片B：pRSET，如本报道实施例2所解释，和重组蛋白pRNcSAG4的图解(图片C)，如本报道实施例2所解释。

图4

该图显示了通过用限制性内切酶消化选择重组质粒，如本报道实施例2所解释。

其中WM是“分子量标准，低范围(Bio-rad)”。

图5

重组蛋白pRNcSAG4在大肠杆菌中的表达，如本报道实施例2所解释。

图6

重组蛋白pRNcSAG4免疫原性的表征，如本报道实施例3所解释。

图7

通过RT-PCR检测犬新孢子虫慢殖子阶段NcSAG4基因的转录，如本报道实施例4所解释。

具体实施方式

通过下列实施例另外说明本发明，本发明的范围不限于实施例，而是仅由所附权利要求的记载限定。

实施例1：NcSAG4基因的分离和表征

对于犬新孢子虫NcSAG4基因的分离，使用称作基因组步查的方法，它允许PCR扩增未知序列的DNA片段，但其侧接已知的DNA区域。

为扩增已知序列，使用对克隆刚地弓形虫TgSAG4基因(dberg-Ferragut等人，Mol.Biochem.Parasitol.82(1996)237-244)所描述而改进的四个简并寡核苷酸。使用的正向寡核苷酸之一是这些作者描述的oligo la(SEQ ID NO 1)，而其它三个是基于由存在于下列株系数据库中的刚地弓形虫TgSAG4基因编码的氨基酸序列设计的：RH(AF340224.1)、PLK(Z69373.1)、Prugniaud(AF340225.1)和CEP(AF340226.1)。因此，设计了正向寡核苷酸，称作SAG4-2(SEQID NO：2)和两个反向寡核苷酸，称作SAG-3(SEQ ID NO：3)和SAG4-4(SEQ ID NO：4)。

为进行PCR，使用0.4μg分离自犬新孢子虫速殖子的基因组DNA。对于基因组DNA的分离，按照使用指导(GenomicPrep细胞和组织DNA分离试剂盒，Amersham Biosciences)，使用商品试剂盒。使用的阳性对照是用相同方法分离的刚地弓形虫基因组DNA。使用的DNA聚合酶是Eco Taq酶(Ecogen)，每一反应2.5U，在相应缓冲液中，在Cl₂Mg(4mM)、dNTPs(200μM)和40pmol每种简并寡核苷酸存在下。PCR条件是：94℃变性5分钟，随后是40个循环的94℃1分钟，实施43℃至56℃温度梯度的退火1分钟(图1，泳道4-9)，72℃1分钟，每个循环增加延伸1秒钟，和最后在72℃延伸10分钟。使用的阴性对照是无DNA的反应混合物(图1，泳道1)或来自非感染MARC-145细胞的基因组DNA(图1，泳道2和3)。

作为PCR结果，当使用56℃解链温度时，扩增了几个片段，它们通过在2％琼脂糖凝胶中以1×TBE电泳(图1)，从犬新孢子虫(图1，泳道9)和刚地弓形虫(图1，泳道12)的基因组DNA中分离。这些片段中，两个相当于寡核苷酸1a和SAG4-3组合的175pb(Nc175)和1a与SAG4-4组合的312pb(Nc312)的预期大小。这些DNA片段是按照制造商的指导，使用商品试剂盒(GenomeGENECLEANTurbo核酸纯化试剂盒，Q-BIOgene)从2％琼脂糖凝胶在1×TBS缓冲液中纯化的并且用寡核苷酸1a测序(“Alberto Sols”生物医学研究院测序服务，CSIC-UAM)。所得核苷酸序列与数据库(BLASTN-nr，http://www.ncbi.nlm.nih.gob/blast)中现存序列比较，与三个株系的刚地弓形虫TgSAG4基因序列在64bp片段中具有82％相似性。此外，当将Nc 175序列转变为不同可能的开放读框，并将其与刚地弓形虫数据库(TgGI：TIGR刚地弓形虫基因索引，www.tigr.org/tdb/tgi/tggi)比较时，证明与描述为表面蛋白(TC2754)的一组序列具有68％的相似性，该表面蛋白与由上述株系(RH，PKL，Prugniaud和CEP)的TgSAG4基因序列编码的蛋白和株系ME49(刚地弓形虫v3，寄生虫共有EST数据库)的慢殖子基因文库描述的EST相一致。最后，Nc175序列与犬新孢子虫数据库(NcGI：TIGR犬新孢子虫基因索引，www.tigr.org/tdb/tgi)比较，与迄今为止描述的序列没有相似性。

一旦分离了Nc175序列，就使用以5′和3′方向的基因组步查方法从来自犬新孢子虫基因组DNA的Nc175序列鉴定NcSAG4基因，所述基因组步查方法使用商品化试剂盒(Universal Genome Walker试剂盒，BD Biosciences Clontech)。进行这个技术的第一步是用产生平端的四种不同的限制性内切酶：EcoRB(1)、DraI(2)、PvuII(3)和StuI(4)消化基因组DNA(图2，步骤1)和随后与接头结合(图2，步骤2)，按照制造商的指导进行。然后，用由此获得的每个基因文库，使用与接头结合的寡核苷酸(AP1和AP2)和基于已知基因组序列设计的该基因的特异性寡核苷酸进行两个PCR(图2、步骤3)。由Nc175序列设计的用于以5′方向进行基因组步查的寡核苷酸被称为1R5SAG4(SEQID NO：5)和2R5SAG4(SEQ ID NO：6)，而设计用于以3′方向进行基因组步查的寡核苷酸被称为1F3SAG3(SEQ ID NO：7)和2F3SAG4(SEQ ID NO：8)。用每个基因组DNA基因文库，使用分别以5′或3′方向进行基因组步查的寡核苷酸AP1和1R5SAG4或1F3SAG4，按照制造商的指导，使用长距离耐热DNA聚合酶(Advantage基因组PCR试剂盒，BD Biosciences Clontech)进行第一个PCR。该PCR的条件是7个循环的94°25秒和68℃3分钟，随后是32个循环的94℃25秒和64℃3分钟，在64℃最后延伸7分钟。第二个PCR从第一个PCR产物的1：50稀释物进行，和使用分别以5’或3’方向进行基因组步查的寡核苷酸AP2和2R5SAG4或2F3SAG4进行。第二个PCR的条件是5个循环的94℃25秒和68℃6分钟，随后是20个循环的94℃25秒和64℃6分钟，64℃最后延伸10分钟。如上所述纯化通过基因组步查获得的DNA片段并测序(图2，步骤4)。

因此，以不同扩增片段的序列比较方式，可以建立601个核苷酸的序列(SEQ ID NO：9)。由于这个序列与刚地弓形虫TgSAG4基因序列的同源性，它被称为Nc SAG4，编码慢殖子阶段的特异性蛋白。此外，证实了522pb的开放读框(ORF)的存在，大小类似于刚地弓形虫中的其同源物，编码173个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：10)。当将编码这个ORF的氨基酸序列与数据库(BLASTx，www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中现存序列比较时，发现与不同刚地弓形虫株的TgSAG4蛋白序列具有69％的相似性。

实施例2：NcSAG4抗原作为重组蛋白的表达

一旦鉴定了NcSAG4基因，就将编码区插入表达载体，在异源系统中产生作为重组蛋白的NcSAG4抗原。对于真核生物系统，选择表达质粒pcDNA3.1/His-C(Invitrogen)(图3，图片A)而对于原核生物系统，选择表达质粒pRSET-C(Invitrogen)(图3，图片B)。在质粒pcDNA3.1/His-C中，NcSAG4基因的完整编码区插入BamHI和EcoRI位点。为此，从犬新孢子虫基因组DNA，使用为其设计的寡核苷酸(OligoANALYZER 1.0.2.)进行PCR。正向寡核苷酸称为FNcSAG4(SEQID NO：11)，包括在其5’端的BamHI的特异性识别位点，随后是NcoI位点，在Nc SAG4基因ORF 5’端等同序列之前。反向寡核苷酸称为ReNcSAG4(SEQ ID NO：12)，包括在其5′端的EcoRI的特异性识别位点，随后是与NcSAG4基因ORF 3’端互补的反向序列。

对于原核生物中的表达，一部分NcSAG4基因插入质粒pRSET-C的BamHI和EcoRI位点，它编码该蛋白的截短形式，从第29至148位氨基酸，包括第29和148位氨基酸二者。为此，使用软件(OligoANALYZER 1.0.2.)设计两个寡核苷酸。正向寡核苷酸称为F85NcSAG4(SEQ ID NO：13)，包括其5’端的BamHI的特异性识别位点，随后是NcSAG4基因ORF第83至100位核苷酸的等同序列。反向核苷酸称为Re444NcSAG4(SEQ ID NO：14)，在其5’端插入EcoRI的特异性识别位点，随后是终止密码子(TAA)，然后是NcSAG4基因ORF第328至444位核苷酸的互补反向序列。

对于在两种情况下进行PCR，反应使用分离自犬新孢子虫速殖子的0.1μg基因组DNA。使用的DNA聚合酶是EcoStart(Ecogen)，每一反应1.25U，以25μl终体积在相应的缓冲液中，在2.5mM MgCl₂、dNTPs(200μM)和40pmol每种寡核苷酸存在下进行。PCR条件是95℃变性7分钟，随后是40个循环的95℃30秒，53℃1分钟，72℃4分钟，每个循环增加延伸一秒，和最后在72℃延伸10分钟。在1.5％琼脂糖凝胶和1xTAE缓冲液中，用溴化乙锭(BrEt)染色观察PCR产物，观察到542pb的大小，相当于对NcSAG4基因ORF预期的，和对截短基因的385pb。然后，纯化和用限制性内切酶BamHI(5U)和EcoRI(6U)在适当的缓冲液(缓冲液B，Roche)中以50μl终体积消化这些DNA片段，在37℃水浴中四小时。在相同时间和相同条件下，消化每个质粒载体。在用2U虾碱性磷酸酶(SAP)消化结尾在相同消化反应中37℃处理这些质粒30分钟。然后，在EDTA 10mM存在下，65℃灭活SAP酶20分钟。一旦完成消化，质粒DNA和PCR产物都在低熔点1.5％琼脂糖凝胶中在lxTAE缓冲液中用BrEt染色进行观察，然后从中进行纯化。

对于质粒的操作，基本上按照Sambrook等人(1989)描述的方法进行。一旦纯化了每个消化的DNA片段，就将其与50ng相应载体连接，对于NcSAG4基因的完整ORF与pCDNA3.1/His-C(Invitrogen)连接，而对于截短基因与质粒pRSET-C连接，以载体-插入物1∶3的比例，在1U的T4DNA连接酶存在下，在适当的缓冲液中和以15μl终体积进行。连接在0.5mL管(Multi^TM，Sorenson Bioscience)中在热循环仪中12℃进行18小时，随后在-20℃保存直至使用。

一旦进行连接，就用它来通过电穿孔转化冰冻感受态大肠杆菌DH5α菌株。对于通过电穿孔转化细菌，基本上按照电穿孔仪(GenePulser ^TM，Bio-rad)制造商的指导进行。使用预先在冰上冷却的两毫米电穿孔托盘(Equibio)。解冻感受态细菌并保持在冰上直至添加5μL连接液。在冰上一分钟后，它们经受2.5kV、25μFD和200Ohm的脉冲4-5秒。将转化的细菌立即悬浮于500μL SOC培养基(MgSO₄10mM，MgCl₂ 10mM和葡萄糖20mM添加至SOB培养基：细菌用胰蛋白胨2％，酵母提取物0.5％，NaCl 10mM和KCl 2.5mM)并在37℃生长1小时，然后将200μL细胞悬液铺在LB-琼脂培养基(1.5％纯净琼脂)上，在100μg/mL氨苄青霉素存在下，所用质粒对氨苄青霉素有抗药性。在适当培养基的噬菌斑中37℃生长18小时后，选择用该质粒转化的细菌。每个选择10个克隆并在含100μg氨苄青霉素的3mL LB液体培养基中37℃生长过夜，用于随后质粒DNA的分离。用碱裂解法获得这个DNA，随后在0.8％琼脂糖凝胶和1xTAE缓冲液中观察，选择具有预期大小质粒的克隆。相关质粒称作pCDA，根据克隆对通过NcSAG4基因的完整ORF插入质粒pcDNA3.1/His/-C构建的预期大小为6,028pb的质粒从1至10编号。通过NcSAG4基因第83至444位核苷酸的截短形式插入pRSET-C(3,235pb)获得的质粒称作pRC，根据克隆，从1至10。根据观察到的大小，选择来自每种的四个克隆通过限制性内切酶表征(图4)。因此，用限制性内切酶BamHI(5U)和EcoRI(6U)在适当缓冲液(缓冲液B，Roche)中，以20μL终体积在37℃水浴中消化获得的质粒。消化的质粒DNA在0.8％琼脂糖凝胶和0.5％TBE缓冲液中分离，观察到每个质粒构建体中适当大小片段的释放。因此，质粒pCDA5、pCDA6、pCDA9和pCDA10释放528pb的片段(图4，图片A，分别是泳道1至4)，和质粒pRC6、pRC7、pRC9和pRC10中的371pb的片段(图4，图片B，分别是泳道3至6)，此外，切割载体pcDNA3.1/His-C(图4，图片A，泳道5和6)和pRSET-C(图4，图片B，泳道1)并用作消化对照。在琼脂糖凝胶中，未消化质粒pRSET-C(图4，图片B，泳道2)也上样。使用商品化寡核苷酸T7对质粒pCDA10和pRC10测序，证实表达载体中片段适当的插入。

重组蛋白pRNcSAG4(SEQ ID NO：15)覆盖由这里描述的NcSAG4基因ORF编码的第29至148位氨基酸，并对应于缺乏氨基末端的信号肽和羧基末端可能的信号肽的可能的NcSAG4成熟蛋白的氨基酸序列，遵照Gerber等人(1992.JBC 267.12168-12173)修订的标准，氨基末端与包括允许通过亲和层析纯化的6个组氨酸的氨基酸标记、肽T7-标记和肠激酶识别域结合。图3，图片C，显示了重组蛋白pRNcSAG4的图解。

为在原核生物系统中表达重组蛋白，按照制造商的指示，用质粒pRC10转化大肠杆菌的Rosetta(DE3)pLysS细胞株(Novagen)。将用质粒pRC10转化的细胞铺在含氨苄青霉素(100μg/mL)和氯霉素(34μg/mL)的LB-琼脂培养基上并在37℃生长过夜。第二天选择噬菌斑的六个菌落并在3mL相同选择液体培养基中37℃生长过夜。次日在相同生长培养基中1∶10稀释培养物并保持在相同条件下直到A₆₀₀达到0.9OD。然后在1mM IPTG存在下，在250转/分搅拌和37℃下，诱导重组蛋白表达4小时。最后，以3,500xg离心15分钟收集细胞。一旦除去上清液，就将沉淀物保存在-80℃直至使用。

对于重组蛋白表达的表征，预先收集的细胞沉淀物在称为在BugBuster(Novagen)的商品化裂解溶液1x中在Tris 20mM pH 7.98中，以5mL/g细胞沉淀物的浓度裂解。它们在温和搅拌和室温下，在Benzonase酶(Novagen，IU/mL 1x Bugbuster)存在下孵育40分钟。然后通过以20,000xg离心15分钟，使可溶部分与存在内含体的沉淀物分离，确定相关蛋白的位置。然后根据制造商的指示洗涤内含体。最后，通过在15％丙烯酰胺/DADT凝胶中在变性条件下电泳(图5)分离蛋白，溶于上样缓冲液Laemmli lx(Laemmli 1970.Nature 227，680-685)，以50μL/mL初始培养物的百分比。从诱导前(图5，泳道1)和诱导后(图5，泳道2)收集的细菌总提取物和上清液(图5，泳道3)和预先收集的沉淀物(图5，泳道4)以及洗涤后的内含体(图5，泳道5)中分离蛋白。因此，证实了重组蛋白pRNcSAG4在大肠杆菌的Rosetta(DE3)pLysS(Novagen)中的表达，预期17.2kDa的表观分子量和它在内含体中的位置。

实施例3：蛋白pRNcSAG4免疫原性的测定

通过Western印迹(图6)，使用来源于天然感染了犬新孢子虫的动物的牛血清测定重组蛋白pRNcSAG4的免疫原性。这些血清的感染已经预先通过ELISA技术和间接免疫荧光(IFAT)确诊，具有高特异性抗体效价。使用0.1x BugBuster溶液，按照制造商的指导对存在pRNcSAG4蛋白的内含体进行三次洗涤。然后在15％丙烯酰胺-DATD凝胶中通过在变性条件下电泳分离蛋白，和最后向0.2μm硝酸纤维膜(Bio.rad)上，以400mA进行电转移，在预先冷却的转移缓冲液(Tris 25mM，甘氨酸192mM pH 8.5和20％甲醇)中沉浸一小时。使用的牛血清来自不同的来源。在那个方面，血清来自于很可能正在确立慢性感染的动物，在那里慢殖子发育，如来自出生就具有先天性感染的动物的血清，其显示出前初乳血清阳性，或来自妊娠最后一段时间内流产的胎畜的体液。另一方面，使用来自流产母牛的血清，表明犬新孢子虫感染可能再活化，其导致流产。此外，使用三头小牛的前初乳血清(图6，图片A和B，泳道1、2和3)，通过IFAT测定具有抗犬新孢子虫的高效价。此外，使用通过IFAT测定具有抗犬新孢子虫高抗体效价的腹液，来自第二个(图6、图片A和B、泳道4)和第三个四分之一妊娠期(图6、图片A和B、泳道5和6)流产的胎畜、来自已流产的、对犬新孢子虫血清反应阳性的母牛(图6，图片A和B，泳道7和8)。最后，使用来自已流产的两头其它母牛的血清(图6，图片A和B，泳道9和10)，通过IFAT测定对犬新孢子虫血清反应阳性，具有高抗体效价。

作为该技术的对照，用相同血清并行进行Western印迹，在转移了体外产生的犬新孢子虫速殖子可溶提取物的膜中，使用相同血清进行。为产生可溶提取物和对于进行Western印迹，基本上按照上面提及的方案(

等人2002.Vet.Parasitol.107，17-27)。用含0.05％Tween-20的TBS(TBS-T)中的3％BSA封闭该膜，在室温下搅拌一小时。然后该膜与用含0.3％BSA的TBS-T以1∶20稀释的牛来源血清在搅拌下37℃孵育2小时。在用TBS-T快速洗涤三次，随后是一次15分钟和两次5分钟后，该膜与缀合了过氧化物酶(Hipra)的抗牛IgG的小鼠单克隆抗体在搅拌下37℃孵育，用含0.3％BSA的TBS-T以1∶200稀释抗体。在上述条件下的另一系列洗涤后，用使用之前立刻制备的底物溶液(60mg 4-氯-1-萘酚溶于20mL甲醇、100mL TBS和0.060mL过氧化氢中)在室温下在黑暗中和搅拌下显影15分钟。

通过Western印迹，在来自先天感染了犬新孢子虫的小牛前初乳血清(图6、图片A、泳道1、2和3)和在最后三分之一妊娠期流产的胎畜腹液(图6、图片A、泳道6)中检测到抗重组蛋白的清晰反应。这些动物对速殖子阶段的免疫决定簇抗原具有清晰的反应(图6、图片B、泳道1-3和6)，除了两头流产的胎畜(图6、图片B、泳道4和5)。然而，在已流产的母牛中没有检测到清晰的反应(图6、图片A、泳道7-10)，但是其中却有抗速殖子阶段免疫决定簇抗原的清晰反应(图6、图片B、泳道7-10)。

这些结果证实了在可能正在确立慢性形式感染，也就是说发生从速殖子至慢殖子转变的那些情况下，天然感染的动物中抗NcSAG4蛋白反应的存在，证实了该寄生虫这个缓慢生长阶段NcSAG4蛋白的特异性，如同刚地弓形虫中它的同源物(TgSAG4)一样。在速殖子阶段是特征性的，然而显示出抗速殖子提取物的清晰反应的急性感染动物中抗pRNcSAG4反应的缺乏再次证实了慢殖子阶段NcSAG4蛋白的特异性。

实施例4：通过RT-PCR测定NcSAG4基因在犬新孢子虫慢殖子阶段的转录

为确立犬新孢子虫NcSAG4基因转录的阶段特异性，发展了对从体外培养的慢殖子提取的总RNA进行的RT-PCR。对于细胞培养物中慢殖子的产生，按照Risco-Castillo等人(2003)(J.Parasitol，提交供发表)描述的方法。为此，使用犬新孢子虫的速殖子(Barber等人1995.Parasitol.111，563-568)以宿主-寄生虫2∶1的比例感染MARC-145细胞单层(Kim等人1993.Arch.Virol.133，477-483)。感染的细胞培养物保持在补充了10％胎牛血清，有Hepes(pH 7.2)15mM、谷氨酰胺(2mM)、青霉素(10U/mL)、链霉素(10μg/mL)、两性霉素B(25ng/mL)存在的DMEM中，37℃、5％CO₂中培养。

为诱导阶段转变，感染后，感染的培养物用硝普酸钠(SNP)以在培养基中70μM的浓度处理7天，并每隔一天更换。作为阴性对照，维持未经SNP处理的感染的培养物进行速殖子的产生。通过刮取感染的细胞单层并用SNP处理，以1350xg在4℃离心15分钟收集速殖子和慢殖子的混合物。用相同步骤收集未经SNP处理的感染的培养物中产生的速殖子。相同条件下在PBS中洗涤两次后，使用25G针再悬浮殖子并使用SephadexTM柱(PD-10，Amersham Biosciences)纯化以除去细胞碎片。为此，用5mL PBS平衡柱后，允许殖子悬液在5mL PBS中重力自流。用相同体积PBS洗涤两次后，以1350xg在4℃离心15分钟收集殖子。收集的殖子冷冻保存在-80℃直至使用。

对于总RNA的提取，使用如上述产生的107个速殖子或速殖子和慢殖子的混合物的沉淀物。为此，使用商品化试剂盒NucleoSpin RNAII(BD Biosciences Clontech)，按照制造商的指导。通过在0.8％琼脂糖凝胶和TAE1x缓冲液中电泳分离获得的总RNA，检查它的质量。

为在单管中进行RT-PCR，使用速殖子或慢殖子每一来源的100ng总RNA，和使用称作“Quiagen一步RT-PCR试剂盒”的商品化试剂盒(Qiagen)，按照制造商的指导(图7)。为此，使用称为IR5SAG4(SEQ IDNO：5)和1F3SAG4(SEQ ID NO：7)的寡核苷酸。RT在50℃进行30分钟。PCR条件是95℃变性25分钟，随后是40个循环的94℃30秒、61℃1分钟、72℃1分钟，和最后在72℃延伸10分钟。PCR产物在用溴化乙锭(BrEt)染色的3％高分辨率琼脂糖凝胶和0.5xTBE缓冲液中观察。作为RT-PCR的结果，证实了速殖子中不存在NcSAG4信使RNA(mRNA)的转录(图7，泳道2)而慢殖子中有上述mRNA的存在(图7，泳道3)。作为PCR的阳性对照，使用从犬新孢子虫速殖子获得的100ng基因组DNA(图7，泳道4)而作为PCR的阴性对照，使用超纯水代替样品(图7，泳道1)。这证实犬新孢子虫慢殖子阶段NcSAG4基因转录的特异性，如同刚地弓形虫中它的同源物TgSAG4一样。

序列表

<110>Madrid Complutense University

<120>NcSAG4基因用于诊断和预防新孢子虫病和作为分析发病机理的标志的用途

<160>15

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<220>

<221>修饰的碱基

<222>6

<223>i

<400>1

tggacntayg ayttyaaraa rgc 23

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<220>

<221>修饰的碱基

<222>12

<223>i

<220>

<221>修饰的碱基

<222>15

<223>i

<220>

<221>修饰的碱基

<222>18

<223>i

<220>

<221>修饰的碱基

<222>21

<223>i

<400>2

aaraargara tnatnacncc ngg 23

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<220>

<221>修饰的碱基

<222>3

<223>i

<400>3

acnggytcrt cyttrcartg rtc 23

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<220>

<221>修饰的碱基

<222>22

<223>i

<400>4

rtcyttnacy ttraarcara angg 24

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<400>5

ccgacgaagc cctgagaact 20

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<400>6

tgtcgcctgt tgggttgta 19

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<400>7

gaaacaagaa aagagactat ctca 24

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<400>8

ccaggtgaga gtgtttcgat 20

<210>9

<211>601

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<400>9

1

ggcaacacgt cgcagcgtac tctcatcttt ttcgtgggtt tgcagcc atg gag aaa 56

Met Glu Lys

1

agc gcc ttc ttt ccc agg gtg gtg ctc tgt ttc gtc gta gtt ttg tcc 104

Ser Ala Phe Phe Pro Arg Val Val Leu Cys Phe Val Val Val Leu Ser

5 10 15

gcg tgc tcg gcg tgg cga gtg gaa ggg aag aac tgg tcg tac gat ttc 152

Ala Cys Ser Ala Trp Arg Val Glu Gly Lys Asn Trp Ser Tyr Asp Phe

20 25 30 35

aag aag ccg ctg gac agc gat gaa aca aga aaa gag act atc tca cca 200

Lys Lys Pro Leu Asp Ser Asp Glu Thr Arg Lys Glu Thr Ile Ser Pro

40 45 50

ggt gag agt gtt tcg ata caa aat tct ggg agc att acg ctg gcg tac 248

Gly Glu Ser Val Ser Ile Gln Asn Ser Gly Ser Ile Thr Leu Ala Tyr

55 60 65

aac cca aca ggc gac aca caa gtt ctc agg gct tcg tcg gga gac agc 296

Asn Pro Thr Gly Asp Thr Gln Val Leu Arg Ala Ser Ser Gly Asp Ser

70 75 80

tgc agg gat gag cca atc gaa ctt gcg act tta ttc cca gca gcc acg 344 Cys Arg Asp Glu

Pro Ile Glu Leu Ala Thr Leu Phe Pro Ala Ala Thr

85 90 95

ccg gcg ccc acg tgg atg caa act ggt agc acg aga acc tta gcg ttt 392

Pro Ala Pro Thr Trp Met Gln Thr Gly Ser Thr Arg Thr Leu Ala Phe

100 105 110 115

cct acc aac gca gta ccc gcg aag cag acc acg ccg ttc tgt ttt aaa 440

Pro Thr Asn Ala Val Pro Ala Lys Gln Thr Thr Pro Phe Cys Phe Lys

120 125 130

gtc acg gat acg cag aag aac aaa act ctg aca gcg ata atc aag gtc 488

Val Thr Asp Thr Gln Lys Asn Lys Thr Leu Thr Ala Ile Ile Lys Val

135 140 145

gcc ggt gcc caa ggc ttg tct gct gct ctg ggg gtc tcc att gga ata 536

Ala Gly Ala Gln Gly Leu Ser Ala Ala Leu Gly Val Ser Ile Gly Ile

150 155 160

cca gct ctt gct ttt gca ctg agt tcg ata taa gggcatgcaa acgaataaat 589

Pro Ala Leu Ala Phe Ala Leu Ser Ser Ile Ter

165 170

gaggcgactg at 601

<210>10

<211>173

<212>蛋白质

<213>犬新孢子虫

<400>10

Met Glu Lys Ser Ala Phe Phe Pro Arg Val Val Leu Cys Phe Val Val

1 5 10 15

Val Leu Ser Ala Cys Ser Ala Trp Arg Val Glu Gly Lys Asn Trp Ser

20 25 30

Tyr Asp Phe Lys Lys Pro Leu Asp Ser Asp Glu Thr Arg Lys Glu Thr

35 40 45

Ile Ser Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Gln Asn Ser Gly Ser Ile Thr

50 55 60

Leu Ala Tyr Asn Pro Thr Gly Asp Thr Gln Val Leu Arg Ala Ser Ser

65 70 75 80

Gly Asp Ser Cys Arg Asp Glu Pro Ile Glu Leu Ala Thr Leu Phe Pro

85 90 95

Ala Ala Thr Pro Ala Pro Thr Trp Met Gln Thr Gly Ser Thr Arg Thr

100 105 110

Leu Ala Phe Pro Thr Asn Ala Val Pro Ala Lys Gln Thr Thr Pro Phe

115 120 125

Cys Phe Lys Val Thr Asp Thr Gln Lys Asn Lys Thr Leu Thr Ala Ile

130 135 140

Ile Lys Val Ala Gly Ala Gln Gly Leu Ser Ala Ala Leu Gly Val Ser

145 150 155 160

Ile Gly Ile Pro Ala Leu Ala Phe Ala Leu Ser Ser Ile

165 170

<210>11

<211>26

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<400>11

gccaggatcc atggagaaaa gcgcct 26

<210>12

<211>31

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<400>12

ttcgaattcc ttatatcgaa ctcagtgcaa a 31

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<400>13

ttatggatcc ggaagaactg gtcgtacg 28

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>犬新孢子虫

<400>14

tttgaattcc ttaggcgacc ttgattatcg 30

<210>15

<211>156

<212>蛋白质

<213>犬新孢子虫

<400>15

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr

1 5 10 15

Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp Asp Asp Asp Lys Asp

20 25 30

Arg Trp Ile Arg Lys Asn Trp Ser Tyr Asp Phe Lys Lys Pro Leu Asp

35 40 45

Ser Asp Glu Thr Arg Lys Glu Thr Ile Ser Pro Gly Glu Ser Val Ser

50 55 60

Ile Gln Asn Ser Gly Ser Ile Thr Leu Ala Tyr Asn Pro Thr Gly Asp

65 70 75 80

Thr Gln Val Leu Arg Ala Ser Ser Gly Asp Ser Cys Arg Asp Glu Pro

85 90 95

Ile Glu Leu Ala Thr Leu Phe Pro Ala Ala Thr Pro Ala Pro Thr Trp

100 105 110

Met Gln Thr Gly Ser Thr Arg Thr Leu Ala phe Pro Thr Asn Ala Val

115 120 125

Pro Ala Lys Gln Thr Thr Pro Phe Cys Phe Lys Val Thr Asp Thr Gln

130 135 140

Lys Asn Lys Thr Leu Thr Ala Ile Ile Lys Val Ala

145 150

Claims

1.分离自犬新孢子虫(Neaspora caninum)且以SEQ ID NO：9表征的601个核苷酸的多核苷酸分子，相应于NcSAG4基因，包含编码173个氨基酸和以SEQ ID NO：10表征的NcSAG4抗原性蛋白的522个核苷酸的ORF。

2.多核苷酸分子，包含根据权利要求1的NcSAG4基因ORF的序列，包括在表达载体中，并优选质粒pcDNA3.1-His-C(Invitrogen)，通过插入由PCR扩增的该多核苷酸分子，所述PCR使用分别以SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12表征的寡核苷酸FNcSAG4和ReNcSAG4。

3.多核苷酸分子，包含权利要求1所述的NcSAG4基因ORF的第83至444位核苷酸的序列，包括在表达载体中，并优选质粒pRSET-C，通过插入由PCR扩增的该多核苷酸分子，所述PCR使用分别以SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14表征的寡核苷酸F85NcSAG4和Re444NcSAG4。

4.多核苷酸分子，包含包括权利要求1所述基因的任何片段的序列，或通过任何化学、物理、酶或任何其它修饰使得这个序列改变而获得的序列，且包括在任何重组载体中。

5.以SEQ ID NO：2、3、4、5、6、7、8、11、12、13和14表征的寡核苷酸：SAG4-2、SAG4-3、SAG4-4、1R5SAG4、2R5SAG4、1F3SAG4和2F3SAG4、FNcSAG4、ReNcSAG4、F85NcSAG4、Re444NcSAG4的用途，用于用作DNA探针通过PCR或RT-PCR检测犬新孢子虫或用于权利要求1所述序列的任何片段的PCR扩增。

6.包含以根据权利要求1-4的SEQ ID NO：9表征的核苷酸序列的重组载体。

7.用权利要求6的重组载体转染的真核生物宿主细胞。

8.用权利要求6的重组载体转化的原核生物宿主细胞。

9.一种基本上纯化或分离的多肽，选自(a)犬新孢子虫的NcSAG4抗原性蛋白，以根据权利要求1的SEQ ID NO：10表征；(b)它的化学或酶改变；(c)一种由大部分的犬新孢子虫NcSAG4蛋白组成的多肽或其化学或酶修饰的多肽；(d)包括(a)、(b)或(c)的蛋白或多肽的重组蛋白。

10.NcSAG4基因启动子在用上述启动子制备的基因构建体转染的犬新孢子虫细胞中表达异源基因的用途。

11.权利要求1至5所述的多核苷酸分子的用途，用于诊断来自感染动物的组织或流体的犬新孢子虫慢性感染，通过PCR或RT-PCR、使用DNA探针的原位杂交或基于该寄生虫核酸的任何其它检测方法进行诊断。

12.权利要求9所述的多肽用于通过酶免疫测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、免疫印迹或基于这些多肽的抗原性的任何其它方法来血清学诊断犬新孢子虫慢性感染的用途。

13.抗权利要求9所述多肽的单克隆抗体或特异性多克隆血清用于通过竞争性ELISA诊断犬新孢子虫慢性感染的用途。

14.抗权利要求9所述多肽的单克隆抗体或特异性多克隆血清的用途，用于通过免疫组织化学、免疫荧光或基于上述血清检测寄生虫的任何其它方法诊断来自动物的组织中犬新孢子虫慢性感染。

15.一种免疫原性组合物，包含a)权利要求9所述的多肽；(b)根据权利要求1至4的多核苷酸分子；(c)权利要求6所述的重组载体；(d)根据权利要求7转染的宿主细胞；或(e)根据权利要求8转化的宿主细胞，被配制作为抗新孢子虫病的疫苗。

16.根据权利要求15的免疫原性组合物，包含佐剂或一种或几种细胞因子。

17.一种免疫原性组合物的制备方法，包括被配制作为抗新孢子虫病的疫苗的组合：(a)根据权利要求9的多肽；(b)含有编码权利要求9的多肽的序列的多核苷酸分子；(c)如权利要求6所述的重组载体；(d)根据权利要求7转染的宿主细胞；(e)根据权利要求8转化的宿主细胞。

18.一种抗哺乳动物新孢子虫病的接种药盒，包含包括根据权利要求15、16和17被配制作为疫苗的免疫原性组合物的容器。