CN1900274A - 重组恶性疟原虫次黄嘌呤－鸟嘌呤－黄嘌呤磷酸核糖转移酶及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了恶性疟原虫次黄嘌呤－鸟嘌呤－黄嘌呤磷酸核糖转移酶的重组蛋白(HGXPRT)，编码该重组蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该重组蛋白的方法，以及该重组蛋白的用途。本发明的HGXPRT重组蛋白具有优异的免疫原性和酶动力学特性，可在免疫个体中引发有效的抗疟原虫的免疫应答，而且产生高效的酶学活性。
Description
技术领域
本发明涉及DNA重组技术和基因工程疫苗领域。更具体地，本发明涉及一种含恶性疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine-guanine-xanthine phosphoribosyltransferase，HGXPRT)重组蛋白，编码该重组蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该重组蛋白的方法，以及该重组蛋白在作为药物靶蛋白以及发展疟疾疫苗方面的应用。
背景技术
疟疾是人类最古老的传染病之一，目前仍严重影响人类的健康。据世界卫生组织(WHO)的最新调查，约世界人口的40％仍处在疟疾威胁之中，分布于100多个国家。目前世界上每年有3至5亿人罹患疟疾，其中约300万人死亡。更为严重的是，由于疟原虫及蚊媒抗药性的产生和迅速扩散，疟疾不仅没有得到有效控制，反而有卷土重来之势。因此，开展全球遏制疟疾计划已成为WHO在新世纪两个重点研究领域之一。
人们在疟疾防治中依靠或期望获得突破的主要有三个途径：抗疟药、疟疾疫苗和蚊媒防制。但抗疟药及蚊媒防制面临着巨大的困难和挑战，这是因为疟原虫及蚊虫抗药性的产生和扩散。尽管目前尚未有应用价值的疟疾疫苗问世，但普遍认为发展疟疾疫苗是人类控制乃至消灭疟疾的重要途径。
大量研究表明，疟疾是可以通过研制有效的疫苗而实现预防的。如用灭活子孢子免疫的志愿者能完全保护后来的攻击感染。再如用鼠疟原虫的重组抗原免疫小鼠，亦能完全保护后来同种疟原虫的攻击感染。此外，疟疾流行病学研究也显示，死于疟疾的主要是无疟疾免疫力的人群，如：在疟区的儿童和非疟区人群进入疟区，而在疟区的成人很少因疟疾而死亡。如给这些无免疫力的人群接种有效的疫苗，使其达到与疟区成人同样的免疫力，这样就能实现预防疟疾和降低疟疾死亡率的目标。因此，疟疾疫苗研制已成为当今世界性热点课题。
在疟疾疫苗研究中，有两个候选疫苗的研究曾受到广泛关注，一是抗子孢子疫苗。该疫苗能抑制子孢子入侵肝细胞。但在后来的临床试验中效果不佳。据分析，其主要原因是该疫苗只产生抗子孢子免疫力，这样即使有极个别子孢子逃避该疫苗免疫攻击而幸存下来，就能入侵并在肝细胞生长繁殖，产生足够的裂殖子引起宿主致病。另一个是SPf.66多价合成肽疫苗。该疫苗是一个只有3个10肽表位通过疏水氨基酸相隔连接而成45肽的多聚物[Patarroyo，M.E.，et al，induction of protective immunity against experimental infection with malaria suingSynthetic peptides，Nature，328：629，1987]。该疫苗在夜猴攻击试验中曾取得了较好的免疫保护效果，但后来在非洲、东南亚及南美洲的现场试验中未能取得理想的临床效果，没有应用价值。该疫苗失败的原因可能是SPf.66只有45肽，而在如此短肽序列中，可能不会有足够的T细胞表位能与多数个体MHC分子结合，导致抗原提呈受阻。
疟原虫的整个机体虽仅由一个细胞构成，但却能够完成生命活动的全部功能。然而在自然界中包括疟原虫在内的近65000余种原虫都具有独特的代谢特征，即都不能通过从头合成嘌呤核糖核苷酸的途径合成自身的嘌呤核苷酸。为了生存，疟原虫必须通过嘌呤补救途径，利用自身的嘌呤补救酶催化宿主细胞内成型的嘌呤碱基和核苷酸合成嘌呤核苷酸。目前已知，次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanine-guanine-xanine-phosphoribosyltransferaseHGXPRT)是疟原虫体内补救嘌呤酶的初级酶和关键酶。然而，出于某种未知原因，目前尚没有成功地表达的HGXPRT的报道。因此，人们一直认为HGXPRT无法作为抗疟疾的有效免疫原。
综上所述，尽管以生物技术为基础的疟疾疫苗研究已进行了近20年，但至今尚无有应用价值的疫苗问世。
因此，本领域迫切需要开发抗疟疾的有效免疫原和相关疫苗。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种新的可用于疟疾疫苗的免疫原。所述免疫原是含恶性疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGXPRT)的重组蛋白。
本发明的一个目的是提供该免疫原的制法、用途以及含该免疫原的疫苗组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种重组蛋白，它包含恶性疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGXPRT的氨基酸序列，并且具有核糖基转移功能。更佳地，所述的重组蛋白具有SEQ ID NO：2中1-231位或1-237位所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本发明的上述重组蛋白。更佳地，所述的DNA分子选自下组：(a)具有SEQ ID NO：1中25-735位所示的核苷酸序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-757位所示的核苷酸序列。
在本发明第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体，以及含所述载体的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种产生本发明的重组蛋白的方法，它包括步骤：
在适合表达所述重组蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的重组蛋白；和分离所述的重组蛋白。
在本发明的第五方面，提供了一种组合物，它含有本发明所述的重组蛋白或其编码DNA分子和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的组合物是疫苗组合物。
在本发明的第六方面，提供了一种抗体，它特异性地结合于本发明的重组蛋白。
在本发明的第七方面，提供了一种本发明重组蛋白或恶性疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGXPRT)的用途，它被用于制备预防疟疾疫苗。
附图说明
图1是重组蛋白基因Pfhgxprt的合成策略示意图。
Pfhgxprt基因的合成：757bpPfhgxprt基因分成8个寡核苷酸片段，用不对称PCR法分步进行基因拼接。基因5’和3’分别加上XhoI和EcoRI位点用于基因片段的克隆。合成片段克隆在pBluscript载体进行序列分析。
图2是全长Pfhgxprt基因的琼脂糖凝胶电泳图。
用XhoI和EcoRI酶切后，电泳显示Pfhgxprt合成基因条带(泳道1)。
图3是SDS-PAGE测定PfHGXPRT的表达。
在诱导前Ohr(泳道2)及诱导后24(泳道3)、48(泳道4)和72小时(泳道5)取培养上清10μl进行SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色。在26KD处出现一条目的蛋白。
图4是纯化的PfHGXPRT重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。
表达上清分离后，用Ni-NTA柱、分子筛、阳离子柱三步纯化，经SPS-PAGE测定获得目的蛋白纯度大于90％。重组蛋白经Lowry法检测蛋白浓度。泳道1∶14μg；泳道2∶28μg；泳道3∶42μg；泳道4∶56μg；泳道5∶80μg；
图5显示了用ELISA法测定免疫鼠血清PfHGXPRT特异IgG的水平。
为ISA720佐剂+PfHGXPRT组，佐剂及空白对照组抗体滴度均＜1∶50。
图6显示了用IFA法测定免疫鼠血清PfHGXPRT特异IgG的水平。
两组分别为：PfHGXPRT免疫实验组小鼠血清(A)；阴性对照组小鼠血清(B)
图7PfHGXPRT免疫小鼠攻击感染后原虫密度的变化
攻击感染后5天，即小鼠出现死亡之前，再按每日检查的红细胞感染数与所检查鼠数之比，求出其平均感染率。用平均感染率制成图。其中第I组为ISA720+PfHGXPRT；第II组为福氏佐剂+PfHGXPRT；第III组为ISA720佐剂对照组；第IV组为福氏佐剂对照组；第V组为空白对照组。
具体实施方式
本发明人经过深入而广泛的研究，通过对HGXPRT密码子的改造以及对表达系统的优化，首次成功地在酵母系统中制得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGXPRT的重组蛋白。测试表明，该重组蛋白可有效地引起免疫应答，具有核糖基转移的酶活性，在构象上与HGXPRT的天然构象相似。在此基础上完成了本发明。
HGXPRT是一种嘌呤补救酶，在疟原虫嘌呤合成代谢的补救途径中发挥重要的作用。HGXPRT的分子量是26Kda。
如本文所用，术语“次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶”、“次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGXPRT”或“HGXPRT”、“PfHGXPRT”可互换使用，都指次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶。HGXPRT的序列是已知的，例如GenBank登录号P20035。另外，次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶有时也被称为“次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶”。
如本文所用，术语“次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶的重组蛋白”、“HGXPRT重组蛋白”等可互换使用，都是指由恶性疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGXPRT的氨基酸序列构成的蛋白。此外，次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶的重组蛋白包括含有或不含有信号肽，以及含有或不含有起始甲硫氨酸的重组蛋白。
如本文所用，术语重组蛋白中“疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGXPRT的氨基酸序列”指在本发明重组蛋白中的氨基酸序列，该序列与天然的或变异的疟原虫HGXPRT具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然疟原虫HGXPRT基本上相同的抗原活性及核糖基转移功能等生物学活性。优选的疟原虫HGXPRT氨基酸序列包括(但并不限于)：天然的PfHGXPRT的氨基酸序列，及其消除了糖基化位点的该氨基酸序列。
此外，在HGXPRT重组蛋白的N端或C末端还可添加其他不影响HGXPRT免疫原性和红细胞结合功能等生物学特性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6xHis序列、酿酒酵母α-因子信号肽切割位点(Glu-Lys-Arg))，或可促进HGXPRT重组蛋白的免疫原性(例如IL-2、GM-CSF等细胞因子的序列)。
编码本发明重组蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得HGXPRT的编码DNA序列，形成编码本发明重组蛋白的DNA序列。
为了提高宿主细胞的表达量，可以对HGXPRT重组蛋白编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。在本发明的一个实施例中，就采用酵母偏好的密码子，对HGXPRT重组蛋白基因进行检测，排除在基因中不利于基因转录及翻译的序列，包括内含子剪切位点，转录终止序列等，从而获得了利于在酵母中表达的编码序列。
在获得了编码本发明重组蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的重组蛋白。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新重组蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是酵母细胞。
在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明重组蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出重组蛋白。然后再分离出表达的重组蛋白。
另一方面，本发明还包括对HGXPRT重组蛋白或其编码DNA具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于HGXPRT重组蛋白或片段。较佳地，指那些能与HGXPRT重组蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的HGXPRT重组蛋白结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的HGXPRT重组蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达HGXPRT重组蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，
Nature 256；495，1975；Kohler等人，
Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人，
Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
多克隆抗体的生产可用HGXPRT重组蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于福氏佐剂等。
在本发明的另一方面，提供了含有本发明重组蛋白作为免疫原的组合物，尤其是疫苗组合物，所述的组合物含有0.001-99.9wt％所述的重组蛋白，(b)药学上可接受的载体和(c)任选的佐剂，其中各组分之和为100wt％。本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即在感染后治疗疾病)。
这些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脱氧核糖核酸)，通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。
增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)ISA720佐剂；(3)福氏佐剂等。
疫苗组合物(包括抗原，药学上可接受的载体和/或佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。此外，包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物可含有在药学上可接受载体中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。
更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。
常规方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。适合其它给药方式的其它配方包括口服、栓剂和透皮应用等。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。
一种疫苗方式是DNA疫苗，即含有编码本发明重组蛋白的编码序列的DNA疫苗。
在本发明的一个实例中，全合成了恶性疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因，并在毕氏酵母中分泌表达该抗原，经分析其构象非常接近天然构象。该抗原的免疫血清能有效抑制疟原虫生长，且具有核糖基转移功能等生物学特性。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明的HGXPRT重组蛋白，其构象非常接近天然蛋白构象，并具有核糖基转移功能。
(2)HGXPRT重组蛋白的表达产物能分泌到胞外，并进入无蛋白培养上清，便于分离纯化，纯度可达90％以上。
(3)HGXPRT重组蛋白的表达水平高。摇瓶表达量为80mg/L，而15L发酵表达产量可达1000mg/L。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989或中国专利申请CN01105292.9)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
Pfhgxprt基因的合成
1.1.Pfhgxprt全合成基因的设计
重组HGXPRT蛋白的序列来自恶性疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGXPRT的氨基酸序列。选用毕氏酵母密码子使用频率，将该序列进行重新设计。采用计算机软件“DNA Star”、Omiga等分析并排除在该基因序列中存在的可能不利于基因转录及翻译的任何序列，如转录终止序列、内含子剪接位点序列、长的反向重复序列等。此外，在新设计的hgxprt基因的5′和3′端分别增设XhoI和EcoRI酶切位点，以便能与表达载体连接。鉴定出该抗原序列中一个潜在糖基化位点，并通过将糖基化位点氨基酸Asn转为Gln(见SEQ IDNO：2)，从而排除这一个糖基化位点。
MPIPNNPGAG ENAFDPVFVK DDDGYDLDSF MIPAHYKKYL TKVLVPNGVI 50
KNRIEKLAYD IKKVYNNEEF HILCLLKGSR GFFTALLKHL SRIHQYSAVE 100
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YSLDYNEIFR DLDHCCLVND EGKKKYKATS LHHHHHH 237
(SEQ ID NO：2)
同时在该基因的5′端加上酿酒酵母α-因子信号肽前导序列的部分序列，包括信号肽切割识别氨基酸Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala的密码子序列(核苷酸序列为aaa aga gag gct gaa gct)，使之能分泌表达，并在3′端增设编码6个组氨酸的序列，以便使用Ni-NTA柱纯化。由此产生的DNA序列由757bp组成，并定名为hgxprt。这样，HGXPRT重组蛋白由237个氨基酸组成。
1.2.Pfhgxprt全合成基因的的合成
参见图1。将Pfhgxprt合成基因序列分成8条寡核苷酸链，从5′到3′依次命名为Pfhgxprt-1至Pfhgxprt-8，相邻两个寡核苷酸链之间有约16至20碱基的重叠部分。采用基因软件Oligo 4.0分析相邻寡核苷酸链间重叠部分序列，以排除不利于寡核苷酸链拼接的序列，如发夹结构等。
用PCR方法将8条链拼接成双链DNA分子。PCR扩增条件为：95℃ 10秒(变性)、55℃ 30秒(退火)和72℃ 1分30秒(延伸)，每次25个循环，产生757bp全长Pfhgxprt合成基因(图2)。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶分离，并用QIAGEN DNA回收试剂盒分离目的基因。用XhoI和EcoRI双酶酶切目的基因片段，酶切条件为：在20μl反应体系中含有2μg目的基因片段，1×酶切缓冲液，XhoI及EcoRI酶各5单位，37℃反应1小时。酶切片段与经同样酶切的pBluscript载体连接，并转化感受态DH5α大肠杆菌。抽提氨卞青霉素抗性菌落的质粒DNA，经双酶切鉴定为正确插入后进行DNA序列分析。以排除合成时的错误碱基。
将含全长无错误的合成基因的质粒转入大肠杆菌DH5α，经反复接种培养后，回收该质粒并进行序列分析，结果在Pfhgxprt基因中无发现碱基突变。表明该合成基因能稳定存在大肠杆菌中。
为使Pfhgxprt基因能在毕氏酵母中分泌表达，将该基因5′端进行修饰，即在该基因的5′端加上酿酒酵母α-因子信号肽前导序列的部分序列，包括信号肽切割识别氨基酸Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala的密码子序列。在Pfhgxprt基因的5′及3′端分别含有XhoI及EcoRI位点用于该基因克隆入表达载体。
实施例2.
Pfhgxprt基因在毕氏酵母中分泌表达
2.1：表达载体的构建
Pfhgxprt基因通过XhoI和EcoRI位点插入到pPIC9酵母表达质粒(购于lnvitrogen公司)。这样，PfHGXPRT的N端与该载体上酿酒酵母α-因子信号肽C末端融合。由于PfHGXPRT分子N端含有该信号肽切点三个特异氨基酸Glu-lys-Arg序列。故分泌表达释放的目的蛋白不含信号肽序列。
pPIC9K载体的基本元件与pPIC9相同，但它带有卡那霉素抗性基因，可用G418进行高拷贝插入子的筛选。这样，用BamHI和SalI将含Pfhgxprt片段切出并插入pPIC9K表达质粒(购于lnvitrogen公司)的相应位点中，构建成pPIC9K/Pfhgxprt重组质粒。
2.2：转化毕氏酵母SMD1168
用SalI将pPIC9K/Pfhgxprt质粒线性化，10μg线性化表达质粒电转化SMD1168毕氏酵母。转化菌先用组氨酸缺陷平板筛选His+转化子，然后用不同浓度G418平板筛选多拷贝插入的转化子。抽提不同转化子的基因组DNA，用一对目的基因内部引物PCR加以鉴定，表明表达质粒插入酵母染色体。经鉴定有插入的转化子进行以下表达研究。
2.3：PfHGXPRT的表达
转化子先接种在以甘油为碳源的培养基中，生长24小时后，转接到以甲醇为碳源的培养基中。进行诱导表达。每24小时取样、检测表达产物上清和细胞沉淀。SDS-PAGE和考马斯亮蓝检测结果显示：在26kD处有明显的PfHGXPRT表达条带，该表达带只在甲醇诱导后出现，并随表达时间延长，其表达产物明显增加(图3)。
实施例3
PfHGXPRT发酵与纯化
经对表达条件的优化研究，摇瓶表达水平可达80mg/L。用15L罐进行发酵表达。在整个发酵周期中，前期的细胞呈指数生长上升，细胞密度达OD600＝110。到甘油添加生长期，细胞生长呈直线上升，细胞密度达到OD600＝580。但到了甲醇诱导表达阶段，细胞总密度基本保持不变，而目的蛋白表达是在甲醇加入后3-7hr开始，并随时间延长，表达产率迅速提高，并不断分泌到发酵液中，最高表达量可达1000mg/L。
PfHGXPRT表达产物的纯化分三步进行：第一步是用Ni-NTA柱纯化。由于PfHGXPRT C末端含有6×His序列，故表达产物可结合到Ni-NTA亲和柱上，并用250mM咪唑洗脱目的蛋白。第二步是用凝胶过滤液相法纯化。第三步是用阳离子柱进行纯化。经三步纯化的蛋白纯度可达90％以上(图4)。
实施例4
PfHGXPRT免疫小鼠
在该实施例中，用纯化的PfHGXPRT为抗原，分别用ISA720和福氏佐剂为免疫佐剂免疫小鼠，实验分为5组，每组7只小鼠，第一组为ISA720+PfHGXPRT；第二组为福氏佐剂+PfHGXPRT；第三组为ISA720佐剂对照组；第四组为福氏佐剂对照组；第五组为空白对照组。免疫分3次进行，每次免疫间隔三周进行。免疫前及每次免疫后两周左右经尾静脉取血测定特异抗体水平。具体方法如下：
PfHGXPRT抗原用PBS稀释，与ISA720佐剂按3∶7混合，用注射器抽吸乳化至均匀；福氏佐剂则按1∶1与抗原混合后，乳化至乳液滴入水中不散开。免疫剂量为每只小鼠50μg，为200μl体积。采用皮下多点注射。三次免疫注射时间分别在W0、W3、W6。在首次免疫后W2和W4、W6取血测定抗体ELISA及IFA滴度。
ELISA按以下程序进行：采用表达PfHGXPRT或恶性疟原虫全虫蛋白为抗原，每孔包被量为0.1μg，加入不同稀释度的抗血清100μl，每份稀释血清样本重复三孔，经37℃反应1hr和洗涤后，加入酶标二抗，用TMB底物显色，并读取450nm OD值。用免疫前血清确定阳性阈值，大于该值的稀释度为阳性抗血清最终的抗体滴度。
ELISA结果显示，佐剂及空白对照组没有产生特异性抗体，其余2组均产生明显的特异性抗体(图5)。最高抗体滴度为1∶111，080。
上述结果表明，该重组蛋白在小鼠免疫实验中显示出极高免疫原性。
实施例5
免疫血清间接免疫荧光实验
免疫血清间接免疫荧光实验(IFA)按以下程序进行：将培养的恶性疟原虫(FCC1/HN株)血膜抗原片，晾干备用或-20℃保存；抗原片用蜡笔分隔；免疫鼠血清用含3％脱脂奶粉的10mmol/L PBS(pH7.4)系列倍比稀释。每张抗原片分割区域中间滴加10μl稀释血清(实施例4中制备的鼠抗血清)，同时设阴性对照。阴性对照为免疫前血清1∶200稀释。37℃湿盒1h；PBS冲洗三次；在滴加免疫血清的部分加入含3％脱脂奶粉的PBS稀释的浓度为0.01mg/ml的FITC标记羊抗鼠IgG，37℃湿盒1h；PBS洗三次，晾干后暗处荧光显微镜观察。
IFA结果如图6所示。免疫实验组小鼠血清中能产生识别恶性疟原虫天然蛋白的抗体，IFA结果为阳性；而对照组及空白组IFA结果却为阴性，小鼠血清最高IFA抗体滴度为1∶640。
实施例6
PfHGXPRT免疫小鼠后抗攻击感染的免疫保护作用
本实施例使用五组小鼠，其中第I组为ISA720+PfHGXPRT；第II组为福氏佐剂+PfHGXPRT；第III组为ISA720佐剂对照组；第IV组为福氏佐剂对照组；第V组为空白对照组。
五组小鼠在第三次免疫后第十天同时腹腔注射105个血传3代的约氏疟原虫(P.y)致死株。接种105个约氏疟原虫的新鲜血液的配制方法为：
每只小鼠接种的新鲜血液量＝105/(小鼠每μl红细胞数×原虫感染率)
再用生理盐水适当稀释接种的新鲜血液量，腹腔注射。接种后24小时起，每日定时尾静脉采血制成薄血片，姬氏液染色，油镜观察。记12个视野红细胞内疟原虫感染数。
五组小鼠在鼠约氏疟原虫攻击感染后每隔24小时连续镜检8天，有原虫血症者定为阳性。
攻击感染后5天，即小鼠出现死亡之前，再按每日检查的红细胞感染数与所检查鼠数之比，求出其平均感染率。用平均感染率制成图。
免疫攻击试验的结果如表1和图7所示。
表1约氏疟原虫(P.y)攻击小鼠后的每日存活情况
| 组别 | 检查鼠数 | 第一天 | 第二天 | 第三天 | 第四天 | 第五天 | 第六天 | 第七天 | 第八天 | ||||||||
| ※阳性数 | *死亡数 | ※阳性数 | *死亡数 | ※阳性数 | *死亡数 | ※阳性数 | *死亡数 | ※阳性数 | *死亡数 | ※阳性数 | *死亡数 | ※阳性数 | *死亡数 | ※阳性数 | *死亡数 | ||
| I组II组III组IV组V组 | 77777 | 46667 | 00000 | 66777 | 00000 | 77777 | 00000 | 77777 | 00000 | 77675 | 00102 | 44111 | 33666 | 33110 | 44667 | 00000 | 77777 |
结果表明：用约氏疟原虫致死株攻击感染后第四天各组平均原虫率有显著差异(F检验，P＜0.01)，I组攻击感染24小时后4只小鼠出现原虫血症，原虫密度缓慢上升，攻击感染后第三天、第四天、第五天与III组、V组相比红细胞感染率有显著差异(T检验，P＜0.05)，并且小鼠全部死亡的时间推迟一天。II组攻击感染24小时后6只小鼠出现原虫血症，与IV组相比在同一时间段小鼠全部死亡，但原虫密度上升缓慢，攻击感染后第三天、第四天、第五天与IV组、V组相比，红细胞感染率有显著差异(T检验，P＜0.05)，小鼠全部死亡时间与V组相比推迟一天。佐剂对照组感染动力学与空白组相似。
上述结果证明了，本发明的PfHGXPRT免疫小鼠后，可提供一定的抗攻击感染的免疫保护作用。
实施例7
重组PfHGXPRT的核糖基转移功能
HGPRT活性和动力学常数测定的方法如下：反应总体系0.5ml，在100μmol/L嘌呤(测定鸟嘌呤时，浓度为50μmol/L)，1mmoL/L PRPP，100mmol/LTris-HCl pH7.4、12mmol/L MgCl2缓冲液中，加入HGPRT，37℃下，对于次黄嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、腺嘌呤分别在245、257、255、260nm于PharmaciaBiotech Ultrospec2000分光光度计上测定光吸收增加。相应Δε分别为1900(mol/L)-1·cm-1(次黄嘌呤-IMP)，5900(mol/L)-1·cm-1(鸟嘌呤.GMP)，3794(mol/L)-1·cm-1(黄嘌呤一XMP)，1600(mol/L)-1·cm-1(腺嘌呤一AMP)。在固定1mmol/L PRPP，改变嘌呤底物浓度范围为5-100μmol/L的条件下，测定反应的初速度，并计算获得相应的动力学常数Km和Kcat。
酶动力学研究和酶活性分析结果表明，重组HGXPRT具有催化5-磷酸核糖焦磷酸(PRPP)与次黄嘌呤或鸟嘌呤产生嘌呤核苷及无机焦磷酸的反应。这表明，重组HGXPRT具有与天然蛋白相同的核糖基转移功能的生物学特性。
讨论
疟疾目前仍然严重威胁着人类的健康，疟原虫抗药性的产生和迅速扩散及抗杀虫剂蚊媒的出现和蔓延，使得疟疾的药物防治陷入了困境，故研制有效的疟疾疫苗以控制疟疾流行已成为当务之急。疟原虫生活史复杂，抗原具有种、株、期特异性，且存在严重的抗原变异，这给疫苗研制带来困难，因而疟疾疫苗研制的难度比人们当初想象的要高得多。
在疟原虫生活史中，只有红内期原虫使人致病甚至致命，因此研制有效的红内期疟疾疫苗可降低疟疾的发病率和病死率，对疟疾的防治具有重要意义。对于红内期的免疫保护机制普遍认为特异性抗体是关键性的因素，但细胞免疫的功能也正引起广泛的关注，其中研究最多的是CD4+T细胞。目前关于CD4+T细胞的功能的观点认为：它除了作为Th细胞辅助B细胞产生抗体外，甚至可以直接作为效应细胞。
研究结果表明，恶性疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(PfHGXPRT)可做为保护性CD4+T细胞的靶抗原，这些T细胞可以将抵抗疟原虫入侵的能力传递给严重免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)，且这种作用是非抗体依赖的。尽管这些疟原虫特异的、能抑制疟原虫生长的CD4+T细胞的作用机制目前尚未阐明，但大量实验证据显示这些CD4+T细胞确实具有抑制疟原虫生长的功能。因此，做为红内期疟疾疫苗研制的必要补充，对于像PfHGXPRT这样能够激发有效细胞免疫的疟疾疫苗候选抗原的研究是十分重要的。
自然界中包括疟原虫在内的近65000余种原虫都具有独特的代谢特征，即都不能通过从头合成嘌呤核糖核苷酸的途径合成自身的嘌呤核苷酸。为了生存，疟原虫必须通过嘌呤补救途径。次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGXPRT)作为疟原虫体内补救嘌呤酶的初级酶和关键酶，在疟原虫嘌呤合成代谢的补救途径中发挥重要的作用。利用HGXPRT的反应机制和生物学特性可以在防治寄生虫病中发挥以下二个方面的重要作用：把HGXPRT的表达产物作为标记物；HGXPRT可做为参与药物设计的合理药靶。
恶性疟原虫的HGXPRT是二聚体或四聚体，从递交到NCBI数据库中的GenBank上的氨基酸序列可知，恶性疟原虫HGXPRT蛋白具有高度保守的氨基酸序列，但恶性疟原虫的HGXPRT和人类的HGPRT在底物的特异性上有很大的区别。以往对恶性原虫的HGXPRT的反应机制的研究，是从混合电位电子/分子机制的角度来进行的。利用自由酶模拟物和杂化电位QM/MM来描述恶性疟原虫体内HGXPRT反应机理，前一步反应途径是随着糖基转移比率的增加，限制一个快质子从次黄嘌呤转移到蛋白质中，这是一个逐步变化的过程，后一步反应途径是DNA过渡阶段，在这个阶段中，焦磷酸从集团分离后被紧紧结合住，而不是攻击次黄嘌呤的亲核基团，并且通过试验已经观察了这个酶的屏障值。
在提纯恶性疟原虫的HGXPRT过程中，它与人类的HGPRT之间的特异性的差别也被检测出来，这有助于进行合理的药物设计。天然的恶性疟原虫HGXPRT的提纯条件的要求非常严格，因此通过纯化天然PfHGXPRT来进行包括疫苗研制在内的进一步研究是极不现实的。
做为疟原虫体内补救嘌呤酶的初级酶和关键酶的次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶，应是疟原虫生命代谢活动中的限速酶，就应该是疟原虫生活史的关键环节。为此，本发明人经过广泛而深入的研究，从DNA水平全合成恶性疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因及表达该重组蛋白。结果发现，该重组蛋白可有效地引起免疫应答，且具有优异的酶动力学特性。动物实验也证明，重组HGXPRT蛋白免疫动物后可起到一定的保护性作用，故HGXPRT重组蛋白可作为重要的候选疫苗分子。
疟疾疫苗另一个实际问题是人体MHC分子多态性。由于人体MHC分子的多态性，使得一些抗原不能与某些机体MHC分子结合，导致抗原递呈受阻，出现免疫个体无反应现象。为确保疫苗在绝大多数个体中得到有效递呈，需在现有疟原虫抗原中鉴定出能识别多数人MHC分子的多反应表位，并掺入疫苗，或将多个抗原掺入组成一个重组抗原以克服单抗原中缺乏足够与MHC分子结合的T细胞表位。
已有的研究还表明，疟原虫生活史复杂，抗原有期特异性。另外，疟原虫存在严重抗原变异。因此，单价疫苗很难达到100％的有效率。基于这些特点，一个有效并能持续应用的疟疾疫苗应包含多个疟原虫保护性抗原，由此产生的免疫力能实行多方面攻击。这样，既使有少数疟原虫由于抗原变异等原因而逃避了第一道防线的免疫攻击而幸存下来，这些原虫还会受到以后各道防线的攻击，直至所有原虫被消灭。本发明中涉及到的HGXPRT与已进入I期临床试验的疟疾疫苗候选抗原PfCP-2.9进行联合免疫所获得的良好的实验结果，为开发多价疫苗带来曙光。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>中国人民解放军第二军医大学
<120>重组恶性疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶及其制法和用途
<130>054502
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>757
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(757)
<223>HGXPRT重组蛋白的编码序列
<220>
<221>CDS
<222>(25)..(735)
<223>
<400>1
cgcggatcca agctcgagaa aaga atg cca att cct aac aat cct ggt gct 51
Met Pro Ile Pro Asn Asn Pro Gly Ala
1 5
gga gaa aac gca ttt gat cct gtc ttc gtt aag gat gac gat gga tac 99
Gly Glu Asn Ala Phe Asp Pro Val Phe Val Lys Asp Asp Asp Gly Tyr
10 15 20 25
gac ttg gat tcc ttc atg ata cca gct cat tat aag aaa tac ctg act 147
Asp Leu Asp Ser Phe Met Ile Pro Ala His Tyr Lys Lys Tyr Leu Thr
30 35 40
aag gtt ctt gtt cct aat ggt gtc atc aag aac aga atc gag aaa ctg 195
Lys Val Leu Val Pro Asn Gly Val Ile Lys Asn Arg Ile Glu Lys Leu
45 50 55
gcc tat gac atc aag aaa gtc tac aac aat gaa gag ttt cac atc ttg 243
Ala Tyr Asp Ile Lys Lys Val Tyr Asn Asn Glu Glu Phe His Ile Leu
60 65 70
tgc ttg tta aag ggt tct cgt gga ttc ttc aca gct ctg ttg aaa cat 291
Cys Leu Leu Lys Gly Ser Arg Gly Phe Phe Thr Ala Leu Leu Lys His
75 80 85
ttg tct aga atc cac caa tat tca gcc gtt gaa atg tct aag cca ttg 339
Leu Ser Arg Ile His Gln Tyr Ser Ala Val Glu Met Ser Lys Pro Leu
90 95 100 105
ttt ggt gaa cat tac gtt agg gtc aag tca tat tgt aat gat caa tct 387
Phe Gly Glu His Tyr Val Arg Val Lys Ser Tyr Cys Asn Asp Gln Ser
110 115 120
act gga acc tta gag att gtt tcc gaa gac ctt tct tgt ttg aaa ggt 435
Thr Gly Thr Leu Glu Ile Val Ser Glu Asp Leu Ser Cys Leu Lys Gly
125 130 135
aag cac gtt ctg ata gtt gaa gac atc att gat act gga aag aca ttg 483
Lys His Val Leu Ile Val Glu Asp Ile Ile Asp Thr Gly Lys Thr Leu
140 145 150
gtc aag ttc tgc gaa tac ttg aag aag ttt gag atc aag act gtt gca 531
Val Lys Phe Cys Glu Tyr Leu Lys Lys Phe Glu Ile Lys Thr Val Ala
155 160 165
ata gct tgt ctg ttc atc aag aga acc cct ttg tgg aac ggt ttc aag 579
Ile Ala Cys Leu Phe Ile Lys Arg Thr Pro Leu Trp Asn Gly Phe Lys
170 175 180 185
gct gac ttt gtt gga ttc tct att cca gat cac ttt gtt gtc ggt tat 627
Ala Asp Phe Val Gly Phe Ser Ile Pro Asp His Phe Val Val Gly Tyr
190 195 200
tct ctt gat tac aat gag ata ttt aga gat ttg gat cat tgt tgc tta 675
Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Ile Phe Arg Asp Leu Asp His Cys Cys Leu
205 210 215
gtc aac gac gaa ggt aag aag aag tac aag gcc act tct ctg cat cac 723
Val Asn Asp Glu Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Ala Thr Ser Leu His His
220 225 230
cac cat cat cac taataggaat tcatatcgat gg 757
His His His His
235
<210>2
<211>237
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(757)
<223>HGXPRT重组蛋白的编码序列
<400>2
Met Pro Ile Pro Asn Asn Pro Gly Ala Gly Glu Asn Ala Phe Asp Pro
1 5 10 15
Val Phe Val Lys Asp Asp Asp Gly Tyr Asp Leu Asp Ser Phe Met Ile
20 25 30
Pro Ala His Tyr Lys Lys Tyr Leu Thr Lys Val Leu Val Pro Asn Gly
35 40 45
Val Ile Lys Asn Arg Ile Glu Lys Leu Ala Tyr Asp Ile Lys Lys Val
50 55 60
Tyr Asn Asn Glu Glu Phe His Ile Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ser Arg
65 70 75 80
Gly Phe Phe Thr Ala Leu Leu Lys His Leu Ser Arg Ile His Gln Tyr
85 90 95
Ser Ala Val Glu Met Ser Lys Pro Leu Phe Gly Glu His Tyr Val Arg
100 105 110
Val Lys Ser Tyr Cys Asn Asp Gln Ser Thr Gly Thr Leu Glu Ile Val
115 120 125
Ser Glu Asp Leu Ser Cys Leu Lys Gly Lys His Val Leu Ile Val Glu
130 135 140
Asp Ile Ile Asp Thr Gly Lys Thr Leu Val Lys Phe Cys Glu Tyr Leu
145 150 155 160
Lys Lys Phe Glu Ile Lys Thr Val Ala Ile Ala Cys Leu Phe Ile Lys
165 170 175
Arg Thr Pro Leu Trp Asn Gly Phe Lys Ala Asp Phe Val Gly Phe Ser
180 185 190
Ile Pro Asp His Phe Val Val Gly Tyr Ser Leu Asp Tyr Asn Glu Ile
195 200 205
Phe Arg Asp Leu Asp His Cys Cys Leu Val Asn Asp Glu Gly Lys Lys
210 215 220
Lys Tyr Lys Ala Thr Ser Leu His His His His His His
225 230 235
Claims (10)
1.一种重组蛋白，其特征在于，它包含恶性疟原虫次黄嘌呤-鸟嘌呤-黄嘌呤磷酸核糖转移酶HGXPRT的氨基酸序列，并且具有核糖基转移功能。
2.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有SEQ IDNO：2中1-231位或1-237位所示的氨基酸序列。
3.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的重组蛋白。
4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，它选自下组：
(a)具有SEQ ID NO：1中25-735位所示的核苷酸序列；
(b)具有SEQ ID NO：1中1-757位所示的核苷酸序列。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的DNA分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。
7.一种产生权利要求1所述的重组蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：
在适合表达所述重组蛋白的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，从而表达出所述的重组蛋白；
分离所述的重组蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的重组蛋白具有SEQ ID NO：2中1-231位或1-237位所示的氨基酸序列。
9.一种组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的重组蛋白或权利要求3所述的DNA分子和药学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是疫苗组合物。
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