CN1899315A - 一种中药复方二次新药开发的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药复方二次新药的开发方法，其包括以下步骤：(1)选择中医长期使用的古方或验方，根据其中药物的性味，结合长期临床应用的经验和疾病治疗情况，进行药物成分和配伍分析，并结合疾病的中医理论，对药材进行合并和拆减，实现在整体药材层次上对复方的再认识；(2)对各药材进行化学物质基础分析，并利用指纹图谱综合分析药材以及药材组合物中物质成分，将复方组成物质群进行组分鉴别和归类；(3)通过步骤(2)的指纹图谱分析结果，以及不同药材及其组合物的药理实验结果，结合现代中医用药理论，在对原方增效或减毒的基础上提出新的药味配伍组合；(4)对新药复方进行指纹图谱分析和化学成分鉴定，并确定新药复方的生产工艺；(5)运用均匀设计方案设计组方配比，分别进行相关药效药理实验，比较各组方的实验结果，最终确定新药复方组方的最佳配比。

Description

一种中药复方二次新药开发的方法

技术领域

本发明涉及一种中药新药开发的方法，特别关于一种在现代中医药理论指导下，通过对中药复方配伍的研究，进行二次新药开发的方法。

背景技术

中药复方是中医用药的精髓，随看天然药物提取物广泛运用于疾病药物治疗的替代治疗，中药特别是中药复方受到了药物研究人员的普遍重视，其治疗效果也获得了广泛认同，但是由于长期整体用药和宏观治疗理念的影响，中药治疗并不能很好的融入现代药物治疗体系，也不能完善地从组分的角度说明药物作用的确切物质基础，这使得中药的发展以及国际化受到了干扰，阻碍了中药的进一步发展。由于中药学是新药学的基础，中药复方的相关内容又是中药学的灵魂和中医用药的最重要的方式，因此完全有可能，在未来新的药学研究体系中，其药物配合使用的规律，将会以中药复方的研究为基础和核心。同时中药复方在中医药学理论体系中，是医和药的重要联结点，即既能体现中药学相关理论和内容，又能体现中医学的相关理论和内容。故中药复方的现代研究，不仅是中药学现代化的重要组成部分，更能促进中医学的现代化。

中药复方，在中医药学理论体系中，是临床使用的最基本、最重要的形式；独特的组方规律，体现着中医药理论的特色；致病因素的多样性和机体的复杂性，也只有以多种药物的配合使用，才能更有效的防治疾病。随着科学发展和社会进步，人们知识和认识水平的提高，对中药复方提出新的要求并进行了一定程度的研究，中药复方的现状，已与古代不完全相同，对中药复方的研究现在主要是从以下三个方面进行的：1、按传统的方法所做的研究，亦即按照古代的科学知识和技能所做的研究，主要是结合临床应用，对已有复方进行加减化裁或者组成新的复方。这种研究方法适应了临床的要求，但总的来看，对中药复方的相关内容，如组方规律，已有复方组合的合理性等，没有较大的进展。这使得在中药复方的数量上有很大的增加，但是质量上没有什么太大的提高，这样带来的直接问题是使得现代根据复方生产中成药的工作缺少规范性。不过，近些年，这种研究状况有所改观，研究人员渐渐将重点放在组方规律、疗效确认、优劣对比等方面，这样使得可以去劣存优，精练了组方的严密性。2、按中医药学理论所做的现代科学研究，这方面的研究所做面较广，但深入不多。这个方面的研究主要是生物活性方面研究较多，化学成分研究较少；确证复方中药的整体性研究较多，而将复方作为一个整体而给予现代科学阐述的研究较少；对中药复方进行拆方研究多，对中药复方的组方规律研究少；另外对中药复方肯定性的研究多，否定性的研究少。由于对中药复方的系统研究刚刚开始，所以到现在对中药复方的很多重要方面，缺乏现代科学阐述。如到底中药复方中哪些化合物真正起到作用(包括主要治疗作用和配合作用)，至今能说明这一点的中药复方，尚未见报道；方中各药，如何从现代科学角度阐述君臣佐使关系，即将组方规律给以现代科学阐述，研究结果也很少，因此这一方面研究有待深入。3、按西医药学理论所做的现代科学研究，这主要集中在植物化学分离和成分活性筛选等方面，近来出现的高通量药物筛选也属于这方面的研究。这种研究方式，通常是将中药复方作为一种分离分析原料，通过现代生物活性指标的筛选，针对相应的生物活性，研究其全方或全方中部分成分乃至单体化合物，从而寻找新的药物。现在有治疗感冒、气管炎、降低血压等多方面疾病的药物，有不少来自复方，这里不再举例。但是这种研究方式，脱离了中医药学理论体系，在使用时不再考虑组方规律，机体的综合情况-证候等，所以这方面的研究是复方研究的一个很好的借鉴，但需要与中医药理论相结合。

从以上中药复方研究的现状看，第2种方式提出了较全面，完整的复方研究体系，但仍然还处于起步阶段，中药有效治疗及成分的化学分析工作亟待开展。另外，由于技术原因，中药的基础研究多集中于单味药，很难对由几味，甚至十几味药组成的方剂进行深入研究，难以阐明中药的治疗机理，严重制约了中药的研究和发展。

目前中药复方研究的方向可以有以下十条：1、复方的拆方研究，主要是研究复方中起主要作用的药物和成分，它是通过研究单味药药理和成分的方法来研究复方，这种方式忽略了复方的整体性。2、复方的整体性研究与方内药物的协同作用研究，利用全方作用和方中药对的组合阐明复方作用机理的整体综合，这方面的研究也越来越受到人们的重视。3、复方配伍关系的研究，复方是两种或两种以上的药物，按一定的法度加以组合，并按一定的分量比例制定的，通过复方的药理学和组合成分研究，可以了解配伍的实质。4、研究复方来精简药物，改进剂型，提高临床疗效，通过复方中药味的精简和再配比，提取，可以减少药味，利于改进药物形式，便于质量控制。5、改革原方，组成新方，通过对复方的成分和药效研究，可以发现新的作用靶位，新的作用环节，提示改变原有复方组成，达到新的组方。6、发现复方的新用途，扩大主治范围，结合复方成分提取分离，达到发现新药物的目的。7、阐明复方的作用机理，方剂学中有许多方义、方解非常笼统，在复方研究中可以与具体西医理论相结合，对其中模糊之处，可以有一个现代的解释。8、对复方毒副作用的阐述，复方结合单味药的成分及药理学研究，可以解释复方增效减毒，药材炮制过程中毒性成分的变化，有利于发现药物新的配伍法度。9、复方研究中的辨证用药与辨病用药的结合性研究，有利于分解复方的作用靶点靶向，促进药效学研究。10、结合中医药理论的复方研究，从中医用药理论出发，结合现代用药理念，发掘其中药物作用规律和方式，从而推动中医药的现代发展。

纵观其中，每一个研究方向中，均与复方的物质基础相联系，复方的化学物质基础以及对它最终的阐释方式，是复方研究的根本，只有阐明复方的物质基础，物质形式才能对复方用药的精髓有所把握。但是，长期以来复方的研究由于物质基础的表达、作用机理的阐释以及配伍规律现代解释等种种制约因素的影响，尚不能形成一条完整合理的研究途径。

发明内容

本发明的目的是结合已有的研究方向，提出一种综合整体的中药复方二次新药开发的方法，利用本方法可以结合现代化学和药效学研究结果，结合中药指纹图谱这一有效途径，对可靠稳定的数据结果进行分析，对中药复方进行再评价和解释，从疾病和复方中对应活性组分相关性的角度，看待复方组合及治疗的针对性，从而对中药复方进行再次配伍或者组合，发展出疗效明确，作用明显的复方新药。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种中药复方二次新药的开发方法，其包括以下步骤：(1)选择中医长期使用的古方或验方，根据其中药物的性味，结合长期临床应用的经验和疾病治疗情况，进行药物成分和配伍分析，并结合疾病的中医理论，对药材进行合并和拆减，实现在整体药材层次上对复方的再认识；(2)对各药材进行化学物质基础分析，并利用指纹图谱综合分析药材以及药材组合物中物质成分，将复方组成物质群进行组分鉴别和归类；(3)通过步骤(2)的指纹图谱分析结果，以及不同药材及其组合物的药理实验结果，结合现代中医用药理论，在对原方增效或减毒的基础上提出新的药味配伍组合；(4)对新药复方进行指纹图谱分析和化学成分鉴定，并确定新药复方的生产工艺；(5)运用均匀设计方案设计组方配比，分别进行相关药效药理实验，比较各组方的实验结果，最终确定新药复方组方的最佳配比。

步骤(1)中的对药材进行合并和拆减，包括对复方各药材根据性味和临床药用功能的不同进行分类，把性味或临床药用性质相同或相近相近的药材归并为一类，并在中医理论指导下，针对某些来源稀少或价格昂贵的药味进行拆减，或使用替代品。

步骤(2)中的化学物质基础分析，包括使用现代化学分离和分析手段，对各味药材中的化学成分进行鉴定，并按照化学性质和药理药效性质进行分类，从化学层次上阐释复方的组成物质群。

步骤(2)中的利用指纹图谱综合分析药材以及药材组合物中物质成分，包括用中药指纹图谱技术定性或定量分析药材、药材组合物、复方中的物质成分，对复方中源于不同药材的各成分的来源进行分析，并按照各物质成分化学结构和药理药效性质的不同进行分类，得到具备不同化学结构和药理药效性质的化学组分群。

步骤(3)中的新的药味配伍组合，包括根据不同药味的主要化学成分及药理药效性质，在中医理论指导下，以增效或减毒为原则，进行重新组合或者加减味、拆方，形成新的药味配伍组合。

步骤(4)中的确定新药复方的生产工艺，包括对复方进行指纹图谱分析和化学成分鉴定，确定其中的主要有效成分，以主要有效成分的含量为指标调整相关工艺参数，确定新药复方的最佳工艺。

步骤(5)中的均匀设计方案，包括根据均匀设计方案，设计含有不同相对比例的各味药材的新药组方，从中筛选除最优组方方案。

步骤(5)中的各组方的实验结果，包括按照不同新药组方制备新药，进行相关药理药效实验，根据不同实验结果综合考察各组方新药的临床药效，确定出新药组方的最佳配比。

本发明由于采取以上技术方案，其具有以下优点：1、本发明选取有独特疗效的中药名方为新药开发对象，其药效已经千百年来的临床实践所证实，很大程度上避免了普通新药开发过程中的部分活性研究和活性筛选的复杂过程，大大缩短中药新药开发周期，降低新药开发成本和风险。2、本发明把中药指纹图谱技术首次应用于新药开发上，克服了传统的中药研究方法仅仅着眼于药材和药对，通过指纹图谱技术从化学层面上反应出中药复杂体系的整体特征和个性特征，从而特别符合中药特点。与其他新药开发手段比较，本发明有明显的优势。3、本发明兼顾传统中医药理论和现代化技术手段，在传统用药理论指导下，通过长期临床应用经验和中药配伍研究结果，确保中药的整体疗效，而现代化技术手段基本阐释了中药复方的药效物质基础和作用机理，通过有效的再配伍过程，可以在原方临床药效的基础上，进一步达到增效、减毒的目的。4、本发明针对中药复方中部分药材来源稀少或价格昂贵等特点，在中医用药理论指导下，结合现代化学分析技术和中药指纹图谱技术，在保证中药有效性和安全性的基础上，使用替代品重新组方，是一种“绿色中药”，符合时代发展的潮流。5、本发明提供了一种对中药传统方剂进行现代化新剂型转化的新方法新思路。传统中药复方多为丸、散、膏、丹等剂型，服用不便、起效慢、技术含量低，本发明结合使用中医药传统理论和现代技术手段，把传统中药开发成为有效的现代化制剂，提高了产品的技术含量和附加值，从而使祖国传统医学焕发出新的活力。6、本发明通过药味再配伍研究，根据各药味的药效大小进行加减拆方，不仅实现了增效、减毒，而且可以使新药适应症的针对性更强，即针对某些病症，容易开发出的新药有着更佳的疗效，从而开发出有明确适应症的独具市场前景的中药新药。

附图说明

图1为板蓝根药材指纹图谱(254nm)

图2为珍珠母和水牛角水解液指纹图谱(254nm)

图3为金银花药材指纹图谱(254nm)

图4为栀子药材指纹图谱(254nm)

图5为黄芩药材指纹图谱(254nm)

图6为胆酸药材指纹图谱

图7为清开灵全方HPLC/ELSD指纹图谱

图8为水牛角和珍珠母药对有效组分指纹图谱

图9为黄芩和栀子药对有效组分指纹图谱

图10为板蓝根和金银花药对有效组部分指纹图谱

图11为胆酸和猪去氧胆酸药对指纹图谱

图12为板蓝根加栀子指纹图谱

图13为珍珠母水解液指纹图指纹图谱

图14为清开灵一级质谱指纹图谱

图15为清开灵二级质谱指纹图谱

图16为水牛角有效部分的指纹图谱(CE)

图17为珍珠母有效组分的指纹图谱(ICP/MS)

图18为栀子提取物(主峰为栀子苷按色谱归一化计算栀子苷占总固体物75％)

图19为黄芩提取物指纹图谱(黄芩苷含量93％)

图20为珍珠母水解液和栀子提取物混合液指纹图谱

图21为小方注射液指纹图谱(9号为栀子苷，12号为黄芩苷)

图22为栀子部分指纹图谱

图23为黄芩药材指纹图谱(254nm)

图24为胆酸药材指纹图谱

图25为小方注射液指纹图谱

图26为小方与清开灵原方指纹图谱对比

图27为小方生产工艺流程图

图28为不同配比组方对缺血脑组织TNF-α含量的影响

图29为不同配比组方对缺血脑组织IL-1β含量的影响

图30为不同配比组方对脑缺血大鼠血浆vWF含量的影响

图31为不同配比组方对脑缺血大鼠血清NSE含量的影响

图32为不同配比组方对缺血脑组织iNOS活性的影响

图33为不同配比组方对缺血脑组织MDA含量的影响

具体实施方式

下面结合附图，并以清开灵注射液的二次新药开发为例，对本发明方法进行详细的说明，但本发明的保护范围不应限于此实施例，根据本发明的方法，可以对各种中药复方进行二次新药的开发。

一、清开灵注射液基本方剂分析

1、清开灵注射液源于古方安宫牛黄丸

清开灵注射液是70年代由北京中医学院(现北京中医药大学)主持研发的中药新制剂，它是由古方安宫牛黄丸方通过拆方改制而成。安宫牛黄丸为传统名贵中成药，具有清热解毒、镇静安神、避秽开窍的功能，药效显著，故和“紫雪丹”，“局方至宝丹”通称“温病三宝”，但由于原方药材稀缺，价格较贵，直接影响安宫牛黄丸的生产，且对昏厥等病人不能产生急救作用，因此对原方需进行改造。

安宫牛黄丸方：牛黄、郁金、犀角、黄连、朱砂、冰片、麝香、珍珠、山栀、雄黄、黄芩

上述药材细粉制成蜜丸，金箔为衣，蜡护，其中脉虚者人参汤服下，脉实者银花、薄荷汤服下。

以上药材分为四大类药物：

(1)牛黄、犀角和珍珠为主药(君)，主要成分为胆酸类和氨基酸类；

(2)冰片、郁金、麝香、雄黄为辅药(臣)，大多为挥发性成分，其中冰片及郁金油为有效物质；

(3)黄连、黄芩和栀子与1类物质配伍相合(佐)，主要有黄芩素、小檗碱、栀子苷及藏红花素类；

(4)朱砂、金箔、人参、银花和薄荷等(使)，其中银花与(3)类物质相合，薄荷与(2)类物质相合(使)；

以上四类药材按功用及所含成分理化性质分类可有两大类物质成分：

第一类为具有清热解毒，镇静安神类，有牛黄、犀角、珍珠、黄连、黄芩、银花、栀子等药材，含胆酸类、氨基酸类、黄芩素、小檗碱、栀子苷、绿原酸及藏红花素等，可溶于水，均为治疗温病之本的物质成分；

第二类是芳香开浊，避秽开窍类，有冰片、郁金、麝香、薄荷、雄黄等，大多为芳香挥发物质，可溶于醇及有机溶剂，为治疗温病之标的物质成分。

因此从安宫牛黄丸方可拆为两个方剂，即清开灵1号和2号，其中清开灵1号为现在的清开灵注射液。

清开灵注射液的配方如下：

胆  酸3.25g     猪去氧胆酸3.75g     水牛角25.0g

黄芩苷5.0g      珍珠母50.0g         栀子25.0g

板蓝根200.0g    金银花提取液5.0g    注射用水 适量

使成全量为1000mL

清开灵注射液方证如下：

牛黄  改为胆酸、猪去氧胆酸为主药，具有清热镇惊，开窍的作用，主要成分为胆酸与猪去氧胆酸；

水牛角与珍珠母  水牛角为犀角的代用品，二者均含角蛋白，其中氨基酸种类和含量相似，药理实验说明对动物强心、镇静、解毒等作用相似，水牛角原粉或水解液组成的单方或复方制剂，功用与犀角相似；珍珠母为养殖的马氏珍珠贝的贝壳珍珠层，其与珍珠所含的氨基酸基本相同，有清热解毒，安神养明功效；水牛角与珍珠母混合水解液含14种以上氨基酸，其与胆酸类成分构成方剂的主药；

黄芩与金银花  注射液以黄芩和金银花的有效部位入药，黄芩中主要有黄芩苷；金银花中主要为绿原酸，与黄芩可以组成银黄注射液，二者具有清热除湿，消炎解毒，可辅助胆酸与混合氨基酸起到清热解毒的功能；

栀子  安宫牛黄丸中，栀子与黄芩，黄连合用，可协助泻心及三焦火，其中所含栀子苷、藏红花素类成分有消炎利胆的功能，清热解毒，泻火除烦。但清开灵注射液中只用栀子一味泻火解毒，由于栀子提取物的收率不稳定，在处方中以饮片入药；

板蓝根  该药材是根据中医药理论，除去黄连后，加入板蓝根，用于保证处方清热解毒的作用，其中成分主要为靛苷及氨基酸类成分，处方中起到佐使的作用，用量为板蓝根注射液的2/5量。

作为一个有一定临床使用经验的中药新型制剂，清开灵注射液有着稳定的临床应用面，特别是脑部栓塞性疾病的急救，临床医生广为使用。清开灵注射液是一个脱胎于古方的现代中药制剂，有着完备的中医药配伍规律，同时具备现代化学物质成分基础，现代应用中临床针对性较强，它的质量控制研究、成分与临床效应相关性研究、物质成分阐释、现代有效部位配伍规律研究都将为中药的现代研究提供思路和方法。

2、清开灵注射液基本配伍关系和药性特征

清开灵注射液由八味药材或提取物组成，有三大类成分组成，包括无机离子、有机小分子和生物大分子，“清开灵”注射液八味药材和提取物的基本成分组成情况如下：

珍珠母和水牛角：无机离子和多肽，氨基酸；

胆酸和猪去氧胆酸：胆酸、去氧胆酸、异去氧胆酸；

黄芩：黄芩苷及其类似物，其中80％以上为黄芩苷；

栀子：环烯醚萜苷、有机酸和色素；

板蓝根：靛苷和氨基酸，其中经测定靛苷含量极少；

金银花：绿原酸、异绿原酸等有机酸；

药物通过一定的配伍组成方剂，既可以发挥出药物整体综合的作用，又能够调和药物之间的偏胜，发挥出药物应有的治疗功能。

从复方的配伍情况看，君臣佐使的配伍原则一般为二味以上药物的配合，而两种药物或少量药物间常从七情合和的角度去看待药物配合关系。实际上，在一个大的复方中，药物可以按照药物的功效和性味划分一定的组合，从而复方可以看作由不同的相须药物的组合组成的复合关系。在清开灵注射液中，具有如下的君臣佐使关系(如表1所示)：

表1  清开灵注射液药物配伍关系

	金银花(主含绿原酸)	性甘寒，起清热解毒功能
			栀子(主含藏红花素，栀子苷)	性苦寒，可泻三焦之火，有刺激胆汁分泌之功效，解毒清热利湿，凉血散痰，利胆去黄
	板蓝根(主含靛苷及数种氨基酸)	清热解毒，凉血(抗病毒)功效
			使	珍珠母(主含角蛋白)	定惊安神
结语：全方以苦寒、咸寒、甘寒并用，达到清热解毒、化痰通络、醒神开窍、镇静安神之功效。

根据药物性味和功效，药物可以划为黄芩/栀子、金银花/板蓝根、水牛角/珍珠母、胆酸/猪去氧胆酸四个组合，从七情合和的角度看，均为相须使用的药物，各个组合又通过相互间的配合组成了全方。

各味药材的药性如下：

栀子：泻火除烦，清热利湿，凉血止血。本品苦寒降泄，轻清上行，表里有热时可起双解之效。能泻心、肺、胃火而除烦止呕，且能去肌肤之热，清泄三焦湿热。取其解毒利尿效能，可治黄疸；以其凉血解毒作用，可治血淋疮疡。

胆酸和猪去氧胆酸：在清开灵注射液中，原作为人工牛黄的替代。一般来说作用是，清热解毒，息风止痉，化痰开窍。本品味苦性凉，其气芬芳，走肝经，有凉肝息风定惊之效。入心经，有清心开窍豁痰之功，且有良好的凉血解毒功能，常用于热病神昏谵语、中风痰迷昏厥、及惊风抽搐、惊厥等。

黄芩：清热燥湿，止血，安胎。本品苦能燥湿，寒能清热，为清热燥湿之品，能清肺、大小肠、脾、胆诸经之湿热，而尤长于泄肺火，行肌表，清大肠之热。常用于热病烦热不退，或肺热咳嗽，或湿热泄痢，以及黄疸、目赤、胎热不安等症。凡上、中二焦湿热邪火之症，最为常用。

板蓝根：清热凉血解毒。本品苦寒，清热凉血能力较强，长于清利咽喉。为清热解毒之要品，是治疗咽喉肿痛，头面丹毒、发颐、热病发斑的常用药。现临床常用于治疗病毒性传染病。板蓝根较偏于降。

金银花：清热解表，凉血止痢。本品甘寒轻扬，气味芳香。甘寒解毒，既可清气分邪热，又可解血中热毒。轻扬宣散，既能疏解表邪，又能透热外出，为温热并初起及热毒疮痈的要药。

水牛角：清热解毒，凉血定惊。本品苦寒。归心，肝经。用于温病高热，神昏谵语，发斑发疹，吐血，惊风，癫狂。

珍珠母：平肝潜阳，清肝明目。本品咸寒质重，归心、肝经，既能清心肝二经之热，又能平肝阳，镇心神。故凡心肝热盛，阳浮于上的眩晕耳鸣、心悸失眠、癫狂惊悸及肝虚目暗、肝热目赤之症均可用之。

黄芩/栀子药对：黄芩苦寒，其治在肺，偏于清泻上中二焦火热，酒炒偏于入气分，清降肺中之热，治上焦湿热。栀子苦寒，其治在三焦，善清三焦火热，祛湿解毒，清血分郁热又能止血。二药相须为用，降泄同施，气血并治。且黄芩得栀子的帮助清肺之伏火之力增加，栀芩合用，能清三焦，肺热，止血热妄行。

板蓝根/金银花药对：板蓝根苦寒，能清热解毒，凉血利咽。金银花性味甘寒，气味芳香，功能清热解毒，性平稳而功效显著。二者配伍为相须之中又兼调和之义。

胆酸/猪去氧胆酸药对、珍珠目/水牛角药对：可以加强清热解毒、定惊息风、豁痰开窍的功力。

二、清开灵注射液的化学成分分析

1、清开灵注射液药材成分分析

在对清开灵全方的药材成分研究中，对药材按工艺提取物进行了一系列的物质成分分析，其中：

板蓝根：含有一定量腺苷类成分和一些氨基酸(具强烈的茚三酮反应)。常见的靛蓝、靛玉红等色素类成分在清开灵注射液中未检出。

金银花：通过提取分离，可以确定其中含有喹尼酸、木樨草素、咖啡酸、绿原酸、异绿原酸等成分。

水牛角：水解液中含有氨基酸(工艺不同会含有少量杂蛋白)以及处于游离和结合态的微量元素。

珍珠母：含有95％碳酸钙，经过水解及沉淀，除去大量的钙，仍存留少量钙，和其它微量元素，主要以螯合物形式存在，其中角蛋白经过水解过程大部分变为氨基酸，不排除尚存有少量的杂蛋白及多肽物质存在。

胆酸：含胆酸90％以上。

猪去氧胆酸：含猪去氧胆酸90％以上。

黄芩苷：含黄芩苷90％以上。

栀子：经过对栀子指纹图谱的研究和相应成分分类，大致将栀子提取物的成分为栀子苷类(含京尼平苷，异羟栀子苷等)、有机酸类(绿原酸，熊果酸等)、色素类(藏红花素、栀子黄、栀子蓝、栀子红等)、多糖类，在分离提取中，运用大孔树脂进行分段分离收集，得到栀子苷部分和多糖类，上两类成分中混杂有色素及有机酸。

2、清开灵注射液中间品成分分析

对清开灵注射液中间品的分析，包括各药材提取物、各中间品混配液和成品等十几个样品。通过HPLC/DAD/MS，确定了各中间品有关成分的分子量，进而对清开灵注射剂物质成分及其变化规律做出分析。如图1～6所示，是板蓝根、水解液、金银花、栀子、黄芩、胆酸的HPLC/UV指纹图谱，如图7所示，是清开灵全方的HPLC/ELSD指纹图谱；如图8～11所示，是水牛角/珍珠母、黄芩/栀子、板蓝根/金银花、胆酸/猪去氧胆酸四种药对的指纹图谱，如图12、图13所示，是板蓝根+栀子药材组合物指纹图谱和珍珠母水解液指纹图谱；如图14、图15所示，是清开灵一级质谱指纹图谱和二级质谱指纹图谱。

实施例中分析的中间品样品编号、名称及规格：

401：牛胆酸                    3.25mg/mL

402：胆酸                      3.75mg/mL

403：黄芩提取物                5.00mg/mL

404：栀子提取物                25.00mg/mL

405：金银花提取物              5.00mg/mL

406：板蓝根提取物              200.00mg/mL

407：珍珠母+水牛角水解液       珍珠母50.00mg/mL+水牛角25mg/mL

408：407+板蓝根提取物+栀子提取物

409：408+胆酸液；

410：清开灵；

411：注射用水。

11个样品均进行HPLC/DAD/MS分析，紫外检测波长为254nm，质谱使用正负离子两种扫描方式。

清开灵成品的HPLC/UV指纹图谱，本发明根据极性大小，把整个谱图分为极性区、中等极性区和弱极性区三个部分。

为适应质谱检测，清开灵指纹图谱(UV)的获取条件是A：乙腈，B：0.01％氨水溶液，0～90分钟线性梯度，流速1ml/min，色谱柱为ODS-C18。

获取HPLC/UV图谱后，再通过HPLC/UV/MS联用分析各峰的分子量信息，分析结果与上述中间品质谱分析结果进行对照，可以发现UV指纹图谱各峰的来源以及清开灵各中间品成分之间的相互作用等规律。

通过上述分析结果的综合比较分析，我们得出如下结论：

从以上数据可以看出，410即清开灵样品由几部分组成：1、2、3、4、5、6号峰由406(板蓝根)而来；8、9、10由407(珍珠母+水牛角水解液)而来；11、12、21、22、23由405(金银花)而来；13、14、17、19、21由404(栀子)而来；24、25由403(黄芩)而来；胆酸区同409及402样品；其余的峰7、15、16、18、20、26、27为新产生的物质峰。从410谱图可以看出胆酸的峰形(TIC)与409及402有所差别，说明胆酸与其他物质产生了作用。

由物质来源可以看出，清开灵的物质基础依赖于其每一味药材的贡献，不能具体的排除某一味药物的存在，但是，由具体物质分布可以看出，药材提供的物质均较为集中于全方的某一部分，有利于下一步的纯化。

值得注意的是来自板蓝根的物质，主要集中在极性区，可以单独分出，比较其剩余部分与全方的药效差异；另外栀子部分集中在中等极性区前半部分，黄芩部分在后半部分，与金银花、栀子部分界限分明，金银花则交叉分布于中等极性区；胆酸则在弱极性区。

由于珍珠母的主要成分为碳酸钙(＞90％)、角蛋白(3％左右)和其它一些微量元素，故对珍珠母水解液的分析除了角蛋白的水解产物以外，还必须对无机元素进行分析。现代药理学研究发现，钙是脑出血、脑水肿等疾病症状恶化的主要诱因之一，由于钙离子向细胞内大量内流，激活兴奋性谷氨酸，导致症状恶化，而清开灵注射液可以拮抗，阻止钙离子大量内流，减轻症状，其中组成药味珍珠母是其主要离子来源(如钙、镁等)，因此有必要对清开灵注射液、珍珠母水解液中钙含量进行测定，并通过测定中钙的形态进行对比。

本发明通过建立确定钙的形态的方法，即用原子光谱法测定样品中的总钙含量，再用离子色谱法测定游离态的钙含量，由此可以得到钙在清开灵注射液中的形态，对清开灵作用于脑水肿的作用机理起到一定的积极作用。采用原子光谱法测定钙元素，受到的干扰较多，需要采用一些技术消除干扰。本发明采取消除干扰的方法有两种：1、加入适量的Sr，用来消除；2、将样品消解，尽量消除由于部分钙不能原子化造成的干扰。

同时，为了测定水解液中其它的无机元素，将样品做适当处理后，进行ICP-MS实验，得到了水解液中微量元素的信息，结论如下：

珍珠母水解液中总钙平均含有230PPM左右，而其中以游离状态存在的钙离子平均在50PPM左右，二者存在较大的差异，说明钙在水解液中主要以结合状态的钙存在。除了钙以外，水解液中还存在Mg、Si、K、Ti等其他微量无机元素。

3、清开灵注射液成分分析

通过以上关于清开灵药材、中间品和成品的成分分析，包括有机成分和无机成分的分析，并按照提取工艺制备所得样品的分离以及结合相关对照品的比对，进而通过相关仪器分析方法的确证，基本可以总结清开灵注射液的主要成分如下：

(1)胆汁酸类成分：去氧胆酸、异去氧胆酸和牛胆酸(来自胆酸)。

(2)氨基酸类成分：组氨酸、赖氨酸、天门冬氨酸、精氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、颉氨酸、亮氨酸等(来自水牛角、珍珠母和板蓝根)。

(3)无机元素：Mg、Si、K、Ti、Mn、Fe、Ni、Cu、Zn、Se、Sr等，另外主要含有的无机元素为Ca，包括无机游离和有机螯合两种状态。

(4)黄酮类成分：黄芩苷、黄芩苷元、去甲黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷、木樨草素、二氢黄芩苷、查尔酮、三羟基黄酮醇以及黄酮醇等；

(5)有机酸类成分：绿原酸、异绿原酸、奎尼酸以及栀子酸和藏红花酸等；

(6)核苷类成分：腺苷等(主要来自板蓝根)

(7)环烯醚萜苷类成分：异栀子苷、栀子苷、去羟栀子苷和栀子酮苷等(主要来自栀子)

(8)色素类成分：藏红花素、栀子素等

(9)挥发性成分：芳樟醇、棕榈酸和蒎烯等。

三、清开灵注射液有效组分的指纹图谱分析

1、清开灵注射液指纹图谱测定方法

为了全面表征清开灵注射液指纹图谱，本发明主要建立了以反相高效液相指纹图谱来表达黄芩、栀子、板蓝根和金银花的指纹特性，以HPLC/ELSD检测表达和定量测定其中胆酸的量，通过ICP/MS表达其中的无机离子，CE表达其中的多肽类物质。但经过对比研究发现，其主要成分均可以用反相色谱利用紫外进行检测，所以其指纹图谱获取的主要部分仍然为色谱指纹图谱。

清开灵指纹图谱方法的优化步骤，首先从确定的流动相体系进行全方紫外扫描，扫描结果可以看出，主要检测波长不明确。其中波长分为四个区带，主要最大吸收峰为220、240、270、315nm，但实际分离中发现，以上波长针对的是方中个别有效成分的最大吸收波长，而大部分成分的响应被掩盖在这些吸收中，随着分离的过程，不同成分响应波长也会脱离基质混合的影响而得以分辨。结果证明主要响应波长为254nm，个别的针对性响应特征波长可以作为个别成分监测的最佳波长。这一情况也说明，复杂样品指纹图谱测定波长的选择需要在分离后进行综合考虑，在清开灵指纹图谱测定中选用通常针对未知体系的测定波长254nm，同时选取240、280、330nm作为监测波长；选用线性洗脱梯度，70分钟内，有机相比例从0线性增加到100％。

在传统的复方研究方法中，首先涉及复方的分离，即采取液相萃取、柱层析、固相萃取等多种分离手段进行初步分离，然后在中医药理论的指导下，对有效成分进行进一步分离和活性跟踪，以解释有效部分的来源及归属，但是，在分离过程中发现，具体分离到单个或者较纯的组分群时，有些可能会失去原有的药效，并且由于物质成分及其相互作用的复杂性，很难从大量零散的成分信息中得出整体的作用性质，而且增添了研究的困难。从成分研究结果可以看出，清开灵是由非常复杂的成分组成，从单一类别的成分并不能推断出复方整体的作用，并且通过单一提取物的相关药效结果可以看到，复方作用的结果是药材提取物相互组合协同的结果，这也为复方的研究提供了另外一条途径，就是必须从物质组合，即有效组分出发进行物质基础研究，因此在获得一定成分研究结果的基础上，转而利用性质相近物质成分归类所得的有效组分配伍，研究复方的配伍规律，结合物质成分的来源、归属、变化和有效组分类别性质等，采取指纹图谱的方式，将有效组分的成分信息转化为综合的定性、定量指标，阐释复方的量效配伍、功能配伍等在物质成分上的含义，为中医药中关于药材配伍的规律得出一定的相对准确的物质定位。同时，发现单味药材起到了复方的部分作用，在对整个证的治疗中，均分别利用相应的途径作用于相应的靶点，而并不由单味药对整个病证有所作用，充分印证了中药治疗的多途径、多靶点协同整合的治疗理念。

2、清开灵注射液及其药材有效组分的指纹图谱

按照清开灵所含物质成分，将清开灵指纹图谱定义为三种：

一种是有机成分指纹图谱。采取的研究方式是利用HPLC/DAD/MS/MS的方法，对其中有机成分进行分离分析，比较全方与单味药和中间产物的指纹图谱，对于每一个物质按照响应值分类，并归纳物质的归属。如图1、图3～6，板蓝根、金银花、栀子、黄芩苷单味植物药材和胆酸/猪去氧胆酸的指纹图谱，如图7，清开灵注射液HPLC/ELSD指纹图谱，可以看到来自板蓝根的物质主要集中在极性区，可以单独分出，比较其剩余部分与全方的药效差异；另外栀子部分集中在中等极性区前半部分，黄芩部分在后半部分，与金银花、栀子部分界限分明，金银花则交叉分布于中等极性区；胆酸则在弱极性区。

第二种指纹图谱是多肽分析，采取的是CE(毛细管电泳)方法，其肽谱如图16所示，是水牛角有效部分指纹图谱

第三种指纹图谱是针对其中无机离子，分析的是无机离子形态及与其它物质体系的作用，利用的方式是ICP/MS及原子吸收光谱等方法。如图17所示，是珍珠母有效组分ICP/MS指纹图谱。

清开灵注射液中的四个药对：黄芩与栀子、金银花与板蓝根、珍珠母与水牛角、胆酸与猪去氧胆酸。药对是中医药理论中药物运用的基础，它是根据药物的性味和功用，通过七情合和，运用组合的，因此也必然在药物的化学物质基础上有所显示。如图8～11可见，各个药对在全方的谱图中均有所显示，可以认为全方的物质基础来源于不同药对的贡献，同时对比前单味药的指纹图谱，发现药对图谱大致可以看作单味药物质的相加得到了药对谱，而全方谱并不单纯为药对之间谱峰的相加，因此，这为我们揭示药物之间相互作用，协同产生药效的物质根源提供了线索。

方剂配伍规律的分析是中药基础性研究的重点，而对配伍规律的阐释，有两个基础，一是其物质基础，二是其药效特性。那么作为物质基础研究的瓶颈在于对其内含物质的描述。指纹图谱作为一种剖析复杂体系的方式，是在物质成分还没有充分清楚的情况下，解决分析方法论的另外一条捷径，并且在整体性上，具有先天的优势，能够很好地通过整体综合显示描述中药的特征，进行定性和定量。

四、清开灵小方的开发

1、清开灵小方的确定

在研究分析指纹图谱和药理学的基础上，对于清开灵注射液的配伍规律有了进一步认识，发现组成药味中去氧胆酸、胆酸、黄芩、栀子、珍珠母在其中有重要的作用，黄芩与栀子配伍应用后对于SOD、LPO、vWF等的良性效应获得了显著提高，开窍醒神作用的珍珠母对于抗损伤能力(SOD、Na⁺-K⁺-ATP酶)的提高具有显著的特异性，而板蓝根、金银花和水牛角则作用较前药材作用不显著，但板兰根、金银花等清热解毒可发挥一定减轻损害(vWF、LPO、MDA)的作用，并有提高抗损害能力的作用。

胆酸、黄芩苷能够降低模型动物死亡率，栀子、金银花、板兰根、珍珠母和水牛角等单个有效组分对模型动物死亡率的影响不显著或有加重趋势。

金银花、板兰根、珍珠母和水牛角能够显著提高模型动物脑组织的SOD水平，而胆酸、黄芩苷、栀子对模型动物脑组织SOD水平无改善作用。配伍作用显示，黄芩苷与栀子配合产生了显著的提高模型动物脑组织SOD水平的作用，说明二者可能存在着协同作用，而金银花与板兰根配合则无协同作用。

栀子、板兰根、珍珠母和水牛角能够显著降低模型动物脑组织中钠-钾-ATP酶的水平，黄芩苷的作用相反，而胆酸、金银花无显著作用。配伍作用显示，将胆酸加入珍珠母和水牛角后以及将黄芩苷加入栀子后，均可使后者降低模型动物脑组织钠-钾-ATP酶水平的作用显著减弱，提示此两组配伍对钠-钾-ATP酶活性均可能存在着拮抗作用，金银花与板兰根配伍未呈现明显的协同作用。

珍珠母和水牛角对脑能荷有显著的改善趋势，胆酸、黄芩苷、栀子无显著作用，金银花、板兰根有一定改善趋势，配伍作用表明，珍珠母和水牛角配伍胆酸后仍保持了原有效应，而黄芩苷与栀子、金银花与板兰根配伍后对脑能荷变化仍无显著影响，珍珠母和水牛角中配入黄芩、栀子、金银花和板兰根则对其原有效应产生了消极影响。

板兰根能够显著降低模型动物血浆中vWF的水平，而胆酸、黄芩苷、栀子、金银花、珍珠母和水牛角对模型动物vWF水平无显著改善作用，胆酸甚至会产生消极的影响。配伍作用显示，胆酸与珍珠母和水牛角配合以及黄芩与栀子配合均产生了显著的降低模型动物血浆vWF水平的作用，说明此两组配伍均可能存在着协同作用，而金银花与板兰根配合则未显现出显著的协同作用。

清开灵全方的各组成药物多数无显著效果，而全方的效果较显著。胆酸、黄芩苷能够显著降低模型动物脑组织的NOS水平，而栀子、金银花、板兰根、珍珠母和水牛角对模型动物脑组织NOS水平无改善作用。配伍作用显示，黄芩苷与栀子配伍后作用被显著地削弱，而金银花与板兰根配合则无明显的协同作用，胆酸与珍珠母和水牛角配合也未见明显的协同作用。

综合以上动物实验结果，说明在配伍过程中，板蓝根金银花配合入复方在各个环节作用并不显著，结合指纹图谱分析结果，板蓝根和金银花配伍后与单味药材提取物比较，指纹图谱有较大的变化，成分峰差别显著，证明在物质成分上在配伍前后有变异，配伍后存在一定的消极影响，同时考虑珍珠母和水牛角的成分，水解后均为无机离子和角蛋白水解产物，而珍珠母中存在一定的钙离子和脑水肿的成因有一定关系。因此认为保留去氧胆酸、胆酸、黄芩、栀子、珍珠母组成小方，将可能在减毒增效或减毒保效的基础上获得新的配伍组合。

按照中医用药理论，牛黄与珍珠、黄芩与栀子均为相须药对。其中黄芩栀子药对二者相须为用，降泄同施，气血并治，栀子得黄芩之助加强了其清三焦火热，祛湿解毒的功效；而黄芩得栀子之助清肺之伏火之力增加，栀芩合用，能清三焦、肺热、止血热妄行。牛黄珍珠药对：牛黄苦寒，清热解毒力甚，有清心定惊，豁痰开窍之功。珍珠甘咸而寒，除镇心定惊外，还有良好的清热、坠痰、解毒的作用。二药合用，加强清热解毒，定惊息风，豁痰开窍之力。胆酸是牛黄的代用品，具有相似的功效。四味药配合，加强了清热解毒、醒神开窍的作用。

2、小方的指纹图谱分析

针对小方，我们进行了系列指纹图谱的测定和分析，如图18～21所示，是栀子提取物、黄芩提取物、珍珠母水解液与栀子提取物组合物和小方注射液指纹图谱)。

指纹图谱测定采用的流动相体系如下：水相为0.1％甲酸溶液，有机相为乙腈和甲醇(比例为3∶2)。色谱柱为Luna C₁₈，5μ，4.6×250mm，检测波长为238、254和280nm，测定波长为254nm，柱温为35℃。方法的精密度、重复性以及样品的稳定性均可以满足指纹图谱测定的要求，测定中，发现来源于同一药材指纹峰的总响应值是一个显示药材配伍关系的关键，是总方的特征值，这是建立在总体指纹图谱可以分化为各药材有效部位指纹部分的结果。

如图22所示，是栀子部分指纹图谱(240、220、440nm)，其中1是栀子酸；2是异栀子苷；3是京尼平龙胆二糖苷；4是栀子苷；5是绿原酸；6是藏红花素1；7是藏红花素2；8是藏红花素3；9是藏红花酸。

清开灵小方注射液的指纹图谱对成分的显示包括栀子，黄芩苷和胆酸的对应成分，珍珠母则通过总氮和钙的测定进行指标确认；具体栀子指纹图谱的测定是针对栀子的三个有效部位进行的，可以从不同侧面反映出栀子药材的药效特性。测定的药效成分也基本概括了栀子的主要药效组成，包括环烯醚萜类成分：异栀子苷、京尼平龙胆二糖苷、栀子苷，有机酸类成分：栀子酸、绿原酸、藏红花酸和色素类成分：藏红花素1、藏红花素2、藏红花素3。

黄芩苷部分指纹图谱测定的是黄芩苷及其同系物(如图23所示)，其中1是黄芩苷；2是汉黄芩苷；3是野黄芩苷。胆酸和猪去氧胆酸部分指纹图谱(如图24所示)，是胆酸药材指纹图谱，其中1是异去氧胆酸；2是去氧胆酸；3是胆酸。

如图25所示，是小方注射液指纹图谱，其中8号是异栀子苷，9号是栀子苷，10号是绿原酸，12号是黄芩苷，14号是野黄芩苷。小方指纹图谱主要测定的是254nm液相图谱，其中可以确定的指标为栀子苷和黄芩苷，

从指纹图谱可以看出，小方的配制过程不引起每种药材入药部位明显的变化，其中除胆酸无法显示外，珍珠母、栀子提取物和黄芩提取物三者依次有明显的显示，0～25分钟为珍珠母水解液指纹部分；25～45分钟为栀子提取物指纹部分；45～60分钟为黄芩提取物指纹部分。在色谱图中显示出药材有效部位的归属，可以较好的利用指纹图谱各部位的显示表征出药材有效部位的入药情况，这在复方指纹图谱的测定中，为有效组分与最终药效结果的相关提供了有效的分析方向，并最终为阐释复方配伍规律提供了一定的佐证。

在相同测定条件下，将小方指纹图谱与清开灵原方指纹图谱进行对比(如图26所示)，可以看到二者有较高的相似程度(相似度为98％，去除峰值最高的黄芩苷主峰后，相似度仍高达87.5％)。从小方和全方指纹图谱比较看，小方在物质成分上更加明确，清开灵全方中的主要有效成分得到保留。

分析显示，清开灵阻抑脑缺血级连反应的多环节作用，突出表现在胆酸、黄芩苷、栀子提取物、珍珠母水解液的配伍当中。这些药物配伍在抑制脂质过氧化反应对脑微血管内皮细胞和神经元的损伤方面具有较好的作用，同时，在调控神经生长因子产生而保护神经元抵抗损伤方面也显示了作用优势。为进一步对四个部分的配伍效应与组分分离的深度的相关性进行确定，进行了以下的实验工作。

3、清开灵小方的活性分析

以Waster大鼠制作MCAT(Middle Cerebral Artery Thrombosis MCAT)脑梗塞模型，比较前述四部分不同配伍的生物效应，测定脑组织SOD、MDA、NOS含量。以清开灵全方为对照，共观察了A、B、C三种配方，其中三个方剂的配比仍然按照原方药材量进行，A方是按照原有注射液制备工艺制备；B方改变了珍珠母水解的方法，方法改变如下：

按处方量称取珍珠母，置耐酸容器中，加入3～4倍量8M硫酸溶液，加热水解。开始注意，有大量二氧化碳放出，产生气泡，勿使药液溢出，然后继续加热水解10～12小时，待珍珠母粉末由灰色转为黄色沉淀，停止加热，放冷至45～50℃，过滤，滤渣用少量热水洗涤3次，洗液与滤液合并，放冷后又有白色针状结晶析出，再过滤除去，得淡黄色透明溶液。

C方保留珍珠母水解方法，改变了栀子的提取工艺，改变如下：

按处方量称取栀子，加6倍量水煮沸1小时，滤取煎汁，药渣再加4倍量水，再煮提半小时，滤取煎汁，合并两次煎汁。加热蒸发浓缩至原料重量相当的体积，放冷后在搅拌下加入浓乙醇，使含醇量达70％，冷藏2～3天，抽滤，取澄清滤液，沉淀用70％冷乙醇洗涤，合并洗液和滤液，减压回收乙醇；冷藏24小时后，过滤得澄清栀子提取液，提取液浓缩，上AB-8大孔树脂柱，以30％乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液至薄层显示无栀子苷，洗脱液回收乙醇，浓缩，过滤，供配液使用。

三种制备方法分别测试了小方中需要调整的工艺步骤，从表观制备情况观察，C方颜色最浅，而且其总固体物量较少。实验测定结果如下(如表2所示)：

           表2  清开灵小方的活性指标测定结果

组别	动物数	SOD	MDA	NOS
					正常组模型组清开灵组A方组B方组C方组	101010101010	136.4±23.11110.2±28.74*113.8±23.55*123.8±15.81124.9±19.61131.5±28.04	0.94±0.3651.51±0.532**1.32±0.553*1.14±0.368△1.03±0.379△0.95±0.286△△☆	1.53±0.3151.88±0.526*1.11±0.513*△△1.08±0.752*△△1.43±0.9391.34±0.701△

与正常组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组比较^△P＜0.05，^△△P＜0.01.

上述结果显示，A、B、C三方对于脑组织MDA含量均具有显著的降低作用，C方组的作用最为突出；对NOS的影响上，清开灵组、A方组、C方组均有显著作用，以前两者最为突出。但是，从微血管调节功能出发，NO即是一种导致神经元损伤的介质，也是一种重要的微血管调节物质，在缺血性病理过程的一定阶段有其积极的生理学意义。可以认为，对于缺血损伤特别是脂质过氧化反应过程这一重要环节来说，C方组意义更大。初步的药效实验结果表明，针对脑水肿的治疗，小方在一些指标上与原方基本接近，在一些配比下某些方面还优于原方，这说明了中药复方本身具有一定的发展潜力，在通过对其组成物质基础信息的分析—指纹图谱分析，结合中医药理论指导和药效实验，可以对中药复方进行简化和在配伍，这为中药新药的研究提供了一种新的方式。

4、清开灵小方的工艺路线确定

(1)工艺路线

按照前期研究结果制定如下小方工艺路线(如图27所示)：

按照清开灵注射液生产工艺制备珍珠母水解液；栀子药材用水煎煮，大孔树脂分离得到栀子苷提取物，溶解；把珍珠母水解液和栀子提取液混合，加入胆酸和猪脱氧(比例1∶1)，混合均匀，再加入黄芩苷，溶解，过滤，添加注射用水至1000毫升，调节PH值为6.8～7.2。

(2)工艺说明

因珍珠母水解液是直接加入的，故珍珠母的水解工艺可直接按照清开灵全方的工艺进行水解；胆酸与黄芩苷是提纯物溶解投料，用稀HCl或NaOH溶液调节适当的pH值使其完全溶解即可，故亦可按照原标准进行配置；唯栀子的提取工艺为了满足更高的质量标准要求，采用有效部位入药取代了原来的药材入药。因此，栀子药材有效部位的提取是小方工艺优化的核心和重点。以栀子苷含量为指标，从提取溶剂、提取方式等方面全面考察了栀子有效部位的提取工艺，最终确定栀子的最优提取工艺为，栀子药材经水提纯沉后，经大孔树脂柱洗脱。

采用HPLC-DAD法测定所得栀子药效部分中栀子苷及藏红花素类物质占总固体物的含量，结果如下(如表3所示)：

表3  HPLC-DAD法测定所得栀子药效部分固体物的含量

	栀子苷	藏红花素类	总含量
				含量(％)	70.83	16.67	87.5

五、清开灵小方的组方配比优化

1、均匀设计方案

(1)均匀设计表

小方共五味药材，涉及四个影响因素(胆酸与猪去氧胆酸等比例入药)；每味药材设三个量级，即三个水平。故采用4因素3水平混合因素均匀设计法，取U9(3×3×3×3)表(如表4所示)：

           表4  U9(3×3×3×3)均匀设计表

No.	X1	X2	X3	X4
					1	1(1)	1(2)	2(4)	3(8)
2	1(2)	2(4)	3(8)	3(7)
					3	1(3)	2(6)	1(3)	2(6)
4	2(4)	3(8)	3(7)	2(5)
					5	2(5)	1(1)	1(2)	2(4)
6	2(6)	1(3)	2(6)	1(3)
					7	3(7)	2(5)	1(1)	1(2)
8	3(8)	3(7)	2(5)	1(1)
					9	3(9)	3(9)	3(9)	3(9)

注：X_n(n＝1～4)为四味药材

配方用均匀设计法设计，第10组为清开灵同比例方，第11组为清开灵原方。

(2)组方试验设计表

按照上述均匀设计表进行组方，得到如下组方配伍表(如表5所示)：

          表5  组方配伍表(单位：g)

编号	胆酸+猪胆酸	黄芩苷	栀子	珍珠母
					1	3.5	2.5	31.25	100
2	3.5	6.25	50	100
					3	3.5	6.25	12.5	62.5
4	8.75	10	50	62.5
					5	8.75	2.5	12.5	62.5
6	8.75	2.5	31.25	25.0
					7	14	6.25	12.5	25.0
8	14	10	31.25	25.0
					9	14	10	50	100
10	7	5	25.0	50.0

2、实验材料与方法

(1)实验动物与分组

健康雄性清洁级SD大鼠，体重330±20克，由北京维通利华实验动物公司提供。取造模成功的大鼠156只随机分成缺血24h模型组、药1、药2、药3、药4、药5、药6、药7、药8、药9、药10、药11组(每组n＝12)。另设正常组(n＝12)。药11为清开灵注射液全方。

(2)动物模型制备

用10％的水合氯醛(0.35mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠。颈部正中切口，手术显微镜下暴露左侧颈外动脉。沿颈外动脉依次分离其分支：枕动脉、甲状腺上动脉，使用电刀凝闭。结扎颈外动脉远心端，使颈外动脉残端游离。在其残端起始部做楔形切口，由此插入钓鱼线(直径0.25mm，头端加热呈直径约0.3mm的圆球形)，使之由颈外动脉通过分叉部进入颈内动脉，至大脑中动脉的起点，阻断了大脑中动脉的血液供应。用缝合线扎闭颈外动脉残端，剪断多余钓鱼线，逐层缝合颈部切口。正常组不插入钓鱼线，其它步骤同手术组。选取模型成功(模型成功的标志：大鼠苏醒后出现同侧Horner征和对侧以前肢为重的偏瘫)的动物按不同缺血时间取材。

(3)给药方式及途径

采取腹腔注射的方式给药。除正常组与模型组外，其余各组造模前1h均预防性给药一次。不同配比组方组分别给药0.3ml/100g。上述给药均用生理盐水稀释至0.9ml/100g以减轻对大鼠腹腔粘膜的刺激，间隔4h第二次给药。各给药组与第二次给药时间间隔12h再给药一次。模型组腹腔注射生理盐水0.9ml/100g。

(4)取材处理

各组动物按不同缺血时间点麻醉，颈动脉插管取血，用少量肝素钠粉末抗凝，3500g/min离心15min，取血浆置-20℃冰箱中保存备测vWF。腹腔切口暴露下腔静脉，用注射器缓慢抽取静脉血3ml并注入到试管中，室温静置10min，3500rpm离心10min，取血清分装后-20℃冰箱中保存备测NSE。断头处死动物，在冰盘上迅速取出缺血侧(左侧)大脑的纹状体和皮层组织，称重后加入冰生理盐水(0.25ml/100mg)于冰浴中匀浆，4℃离心机中3500rpm离心15min，取上清液分装后置-20℃冰箱中保存待测TNF-α、IL-1β、MDA、iNOS。

(5)主要试剂

实验中常用试剂为分析纯，购自北京化学试剂总公司；vWF ELISA试剂盒，购自上海太阳生物技术公司；NSE RIA Kit，购自北京北方生物技术研究所；大鼠TNF-αRIA Kit，购自北京东亚免疫技术所；大鼠IL-1β RIA Kit，购自北京东亚免疫技术所；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒、iNOS试剂盒和MDA试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。

(6)主要仪器

微量移液器；电动匀浆器；电子分析天平；手术显微镜；高频小电刀1411型(上海医疗器械技术公司)；低温离心机DDL-5型(上海安亭科学仪器厂)；台式离心机TDL-40B型(上海安亭科学仪器厂)；旋涡混合器MVS-1型(北京北德科学器材有限公司)；放射免疫γ计数器SN-682型(上海核福光电仪器有限公司)；小型三用水箱(北京医疗设备总厂)；酶标比色仪SPECOTRAL型(产地奥地利)；电热恒温培养箱型号78-1(湖北省黄石市医疗器械厂)；旋涡混合器MVS-1型(北京北德科学器材有限公司)；721分光光度计(上海光学仪器厂)。

3、观察指标

在确定小方药味的基础上，采用与多环节阻抑脑缺血级联反应密切相关的6个药效指标作为评价指标，综合比较了各个组方的药理作用强度，并据此数值通过总分制对组方进行寻优。

(1)TNF-α蛋白及IL-1β蛋白含量

放射性免疫方法蛋白含量检测脑组织匀浆上清液TNF-α、IL-1β蛋白含量。

(2)vWF蛋白及NSE蛋白含量

采用酶联免疫吸附双抗体夹心法原理，测定血浆中vWF水平。采用双抗体夹心法，NSE与包被球上NSE抗体结合，再与¹²⁵I一抗NSE结合，形成免疫复合物，测定包被球的放射性计数(CPM)值，检测样品血清中NSE浓度。

(3)iNOS活性和MDA含量

使用比色法检测样品脑组织匀浆上清中iNOS活性和MDA含量。

4、结果

(1)不同配比组方对缺血脑组织TNF-α蛋白含量的影响

脑缺血24h，模型组脑组织TNF-α蛋白含量升高(与正常组比较P＜0.05)。缺血24h，除药6组外，各给药组脑组织TNF-α蛋白含量都显著低于模型组(与模型组比较P＜0.01)(如表6、图28所示)

表6  不同配比组方对缺血脑组织TNF-α含量和IL-1β含量的影响( x±s)

组别	动物数(n)TNF-α(ng/ml)		动物数(n)IL-1β(ng/ml)
					正常组	7	76.159±18.069	10	58.432±14.654
模型组	8	93.929±11.734△	10	71.750±8.853△
					药1组	7	59.514±17.138★★	10	78.796±11.455
药2组	8	64.081±16.747★★	7	86.050±23.750★
					药3组	9	63.300±5.877★★	8	76.860±20.251
药4组	8	59.523±9.532★★	7	53.764±29.636★
					药5组	9	59.381±9.469★★	9	78.852±22.857
药6组	8	95.723±18.671	7	95.709±23.668★★
					药7组	8	63.995±15.008★★	7	107.04±30.376★★
药8组	9	58.622±12.759★★	7	87.177±17.283★
					药9组	9	71.960±11.218★★	9	91.100±15.825★★
药10组	8	66.551±17.368★★	8	78.638±18.225
					药11组	9	57.499±11.268★★	8	94.112±9.659★★

注：与正常组比较：^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与模型组比较：^★P＜0.05，^★★P＜0.01

(2)不同配比组方对缺血脑组织IL-1β蛋白含量的影响

脑缺血24h，脑组织IL-1β蛋白含量升高(与正常组比较P＜0.05)。缺血24h，药4组与模型组比较IL-1β蛋白含量降低(P＜0.05)，药2、6、7、8、9、11组与模型组比较IL-1β蛋白含量有所升高(P＜0.05或P＜0.01)(如表6、图29所示)。

(3)不同配比组方对缺血大鼠血浆vWF蛋白含量的影响

与缺血24h正常组比较，大鼠脑缺血24h后血浆vWF蛋白含量明显升高(P＜0.01)。与模型组比较，药1、3、4、9、10、11血浆vWF蛋白含量有所降低(P＜0.05或P＜0.01)(如表7、图30所示)。

表7  不同配比组方对脑缺血大鼠血浆vWF和血清NSE含量的影响( x±s)

组别	动物数      vWF(％)		动物数      NSE(ng/ml)
					正常组	10	13.159±3.844	12	1.091±0.452
模型组	10	44.211±17.929△△	10	7.480±2.871△△
					药1组	6	9.399±6.653★★	12	5.302±2.141★
药2组	9	36.135±14.101	7	11.110±1.170★★
					药3组	8	27.851±17.054★	7	6.821±2.313
药4组	8	25.298±12.048★	7	9.319±2.829
					药5组	9	44.460±10.385	8	7.241±2.982
药6组	8	49.446±19.584	7	6.194±2.715
					药7组	10	39.416±17.417	10	7.085±1.828
药8组	10	43.145±18.000	9	7.253±2.780
					药9组	8	29.487±10.355★	8	7.734±2.820
药10组	10	24.827±10.062★★	9	6.703±2.902
					药11组	9	25.845±11.023★★	7	4.473±2.475★

注：与正常组比较：^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与模型组比较：^★P＜0.05，^★★P＜0.01

(4)不同配比组方对缺血大鼠血清NSE蛋白含量的影响

与缺血24h正常组比较，大鼠脑缺血24h后血清NSE蛋白含量明显升高(P＜0.01)。与模型组比较，药1、11组血清NSE蛋白含量有所降低(P＜0.05或P＜0.01)，药2组血清NSE含量显著高于模型组(P＜0.01)(如表7、图31所示)。

(5)不同配比组方对缺血脑组织iNOS活性的影响

与缺血24h正常组比较，大鼠脑缺血24h后脑组织iNOS活性含量明显降低(P＜0.01)。除药7组值低于模型组(P＜0.01)外，各给药组与模型组数值无显著差异(如表8、图32所示)。

表8  不同配比组方对缺血脑组织iNOS活性和MDA含量的影响( x±s)

组别	动物数   iNOS(NU/mg蛋白)		动物数   MDA(nmol/mg蛋白)
					正常组	10	18.019±2.249	9	64.484±6.119
模型组	10	8.632±1.985△△	8	77.945±19.976△
					药1组	9	7.506±1.092	8	51.265±19.843★★
药2组	9	9.284±3.896	8	50.626±12.512★★

药3组	11	8.393±2.119	10	53.437±20.004★★
					药4组	10	7.441±2.376	8	61.779±19.190
药5组	11	7.676±2.418	10	73.344±20.215
					药6组	10	9.017±4.159	10	62.512±22.845
药7组	10	6.066±2.077★★	9	60.803±15.427★
					药8组	10	8.089±2.031	9	82.184±15.120
药9组	9	8.814±3.079	9	65.123±21.120
					药10组	10	9.236±1.910	9	69.794±26.010
药11组	8	10.059±1.791	10	77.229±15.936

注：与正常组比较：^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与模型组比较：^★P＜0.05，^★★P＜0.0

(6)不同配比组方对脑缺血24h脑组织MDA含量的影响

脑缺血24h，脑组织MDA含量升高(与正常组比较P＜0.05)。缺血24h，药1、2、3、7组与模型组比较脑组织MDA含量降低(P＜0.01或P＜0.05)(如表8、图33所示)。

(7)总分制数据处理结果

生物指标按照总分制进行处理，结果如下：

A、不同组方NSE值的统计处理

数据如下(如表9、表10所示)：

            表9  组NSE试验数据结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													0.57	3.79	4.69	12.37	8.23	10.87	4.29	9.63	8.34	7.33	6.1	8.1	6.13
1.67	8.04	8.76	9.82	4.53	9.46	11.37	4.62	8.32	5.59	10.88	7	2.03
													0.59	6.5	6.63	11.12	8.3	1.53	10.15	8.54	4.61	2.57	8.72	7.16	6.7
1.24	5.19	1.17	10.49	6.12	1.52	9.75	8.67	5.71	10.09	6.08	3.62	1.04
													0.76	8.02	8.64	12.32	7.79	10.52	4.37	5.36	5.41	10.55	10.7	3.17	8.11
0.71	11.93	2.47	16.11	3.16	11.77	20.05	15.63	8.72	5.84	8.87	4.78	0.67
													1.61	4.06	2.55	12.04	0.33	17.97	4.39	3.78	7.78	10.63	8.18	10.18	1.98
1.69	11.93	7.15	9.61	9.62	4.79	5.23	2.76	7.83	7.59	2.34	4.76	2.79
													1.48	6.58	7.15	0	13.76	5.97	8.38	0	9.56	5.09	0	11.56	3.57
1.18	8.76	4.44	0	1.61	11.85	0	0	4.57	2.32	0	0	0
													0.52	0	8.49	0	11.09	0	0	0	0	0	0	0	0

1.07	0	4.76	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
													0	0	4.82	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0	0	7.92	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
													0	0	2.55	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

注：N为正常对照组；M为模型组；1～9为均匀设计组；10为清开灵等比组(四味药)；11为清开灵原方组(七味药)；0为无数据。

     表10  13组NSE试验数据(去除奇异点)结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													0.57	3.79	4.69	12.37	8.23	10.87	4.29	9.63	8.34	7.33	6.1	8.1	6.13
1.67	8.04	8.76	9.82	4.53	9.46	11.37	4.62	8.32	5.59	10.88	7	2.03
													0.59	6.5	6.63	11.12	8.3	0	10.15	8.54	4.61	2.57	8.72	7.16	6.7
1.24	5.19	1.17	10.49	6.12	0	9.75	8.67	5.71	10.09	6.08	3.62	1.04
													0.76	8.02	8.64	12.32	7.79	10.52	4.37	5.36	5.41	10.55	10.7	3.17	8.11
0.71	11.93	2.47	0	3.16	11.77	0	0	8.72	5.84	8.87	4.78	0
													1.61	4.06	2.55	12.04	0	0	4.39	3.78	7.78	10.63	8.18	10.18	1.98
1.69	11.93	7.15	9.61	9.62	4.79	5.23	2.76	7.83	7.59	2.34	4.76	2.79
													1.48	6.58	7.15	0	0	5.97	8.38	0	9.56	5.09	0	11.56	3.57
1.18	8.76	4.44	0	0	11.85	0	0	4.57	0	0	0	0
													0.52	0	8.49	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
1.07	0	4.76	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
													0	0	4.82	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
0	0	7.92	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

注：N为正常对照组；M为模型组；1～9为均匀设计组；10为清开灵等比组(四味药)；11为清开灵原方组(七味药)；0为去除奇异点和/或无数据。

B、不同组方Il-1β值的统计处理

如表11、表12、表13、表14所示，Il-1β值分两次试验，分为Il-1β(1)和Il-1β(2)组，分别设置各自的空白对照组和模型组。

                  表11  13组Il-1β(1)试验数据结果

N	M	1	2	3	4	5		6		7		8		9	10	11
																	121.032	37.8564	0	7.38607	101.824	152.923	67.0161		145.325		0		0		0	0	0
30.8382	69.0310	0	53.4274	97.7835	26.8327		89.7057		122.043		0		0	0	0	0
																	71.0463	18.8352	0	26.3323	75.0781	106.371		50.4108		84.1552		0		0	0	0	0
54.9362	119.515	0	185.369	54.9362	49.9082		164.578		104.855		0		0	0	0	0
																	113.953	74.0700	0	109.909	0	63.9945		22.3317		82.6418		0		0	0	0	0
76.0863	102.329	0	93.7440	84.6597	18.3361		60.4707		150.390		0		0	0	0	0
																	125.079	88.1917	0	116.481	219.378	41.3690		66.0088		50.9135		0		0	0	0	0
76.0863	161.030	0	93.2392	53.9303	69.5348		58.9609		70.5424		0		0	0	0	0
																	119.515	76.0863	0	62.9876	126.090	167.113		99.8038		130.644		0		0	0	0	0
0	96.7736	0	72.5580	54.4332	120.5266		108.392		75.0781		0		0	0	0	0

注：Il-1β(1)为Il-1β第一组试验数据(未有均匀设计第1，7～11组)N为正常对照组；M为模型组；2～6为均匀设计组；0为无数据。

              表12  13组Il-1β(2)试验数据结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													46.3587	67.415	77.8310	0	0	0	0	0	113.228	83.7196	97.2168	61.7987	94.01991
42.8970	66.0683	64.9952	0	0	0	0	0	67.1450	89.6974	98.6774	105.454	107.5363
													34.7383	55.511	66.0683	0	0	0	0	0	162.47	99.5560	75.8886	106.345	83.1549
37.3377	63.3927	85.9865	0	0	0	0	0	159.872	77.2749	85.4186	57.0692	58.63683
													51.9102	71.2153	95.7608	0	0	0	0	0	122.035	97.8005	73.1320	94.3096	85.70248
114.435	59.1613	81.4656	0	0	0	0	0	238.871	174.595	73.9567	81.7466	101.3181
													80.9041	131.600	95.4702	0	0	0	0	0	102.496	134.718	90.8458	95.7608	98.38497
73.9567	56.0292	69.3095	0	0	0	0	0	106.940	106.940	39.4936	63.9259	114.4352
													53.7	82.8728	82.3093	0	0	0	0	0	77.5529	40.9449	104.565	69.0382	101.3181
0	95.7608	68.7670	0	0	0	0	0	48.1106	55.2518	120.201	37.3377	81.46562

注：Il-1β(2)为Il-1β第二组试验数据(未有均匀设计第2～6组)；N为正常对照组；M为模型组；1，7～11为均匀设计组；0为无数据。

         表13  13组Il-1β(1)试验数据(去除奇异点)结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													30.8382	0	0	0	101.824	0	67.0161	0	0	0	0	0	0
71.0463	0	0	53.4274	97.7835	0	89.7057	122.0439	0	0	0	0	0
													54.9362	119.515	0	0	75.0781	106.371	50.4108	84.15523	0	0	0	0	0
113.953	74.0700	0	0	54.9362	49.9082	0	104.8556	0	0	0	0	0
													76.0863	102.329	0	109.909	0	63.9945	0	82.64188	0	0	0	0	0
0	88.1917	0	93.7440	84.6597	0	60.4707	0	0	0	0	0	0
													76.0863	161.030	0	116.481	0	41.3690	66.0084	50.91355	0	0	0	0	0
0	76.0863	0	93.2392	53.9303	69.5348	58.9609	70.54247	0	0	0	0	0
													0	96.7736	0	62.9876	0	0	99.8038	0	0	0	0	0	0
0	0	0	72.5580	54.4332	0	108.392	75.07816	0	0	0	0	0

注：Il-1β(1)为Il-1β第一组试验去除奇异点数据(未有均匀设计第1，7～11组)；N为正常对照组；M为模型组；2～6为均匀设计组；0为去除奇异点和/或无数据。

              表14  13组Il-1β(2)试验数据(去除奇异点)结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													46.35878	67.415	77.83102	0	0	0	0	0	113.2289	83.71961	97.21686	61.7987	94.01991
42.89707	66.0683	64.99525	0	0	0	0	0	67.14506	89.6974	98.67746	0	0
													34.73837	55.511	66.0683	0	0	0	0	0	0	99.55604	75.88863	0	83.1549
37.33779	63.3927	85.98654	0	0	0	0	0	0	77.27499	85.41861	57.06923	58.63683
													51.91029	71.21535	95.76089	0	0	0	0	0	122.0353	97.80055	73.13201	94.3096	85.70248
0	59.16136	81.46562	0	0	0	0	0	0	0	73.95672	81.74666	0
													80.90417	0	95.47026	0	0	0	0	0	102.4965	0	90.84584	95.76089	98.38497
73.95672	56.0292	69.30956	0	0	0	0	0	106.9407	0	39.49363	63.92594	0
													53.7	82.87284	82.30934	0	0	0	0	0	77.5529	40.94494	0	69.03821	0
0	95.76089	68.76707	0	0	0	0	0	48.11068	55.25185	0	37.33779	81.46562

注：Il-1β(2)为Il-1β第二组试验去除奇异点数据(未有均匀设计第2～6组)；N为正常对照组；M为模型组；1，7～11为均匀设计组；0为去除奇异点和/或无数据。

C、不同组方iNOS值的统计处理数据如下(如表15、表16所示)：

                   表15  13组iNOS值测定试验数据结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													18.56095	9.285438	7.161507	6.865751	10.11512	7.332019	5.181452	10.20158	7.679652	9.472893	11.28801	11.33404	10.67516
16.72898	12.67696	8.083641	12.1253	6.132177	7.435761	11.45841	12.04055	8.363351	8.621397	7.330676	8.928388	10.27181
													16.91984	7.496894	9.260569	14.97038	6.757785	8.344529	10.42018	18.90722	2.152365	9.024663	6.519579	10.94941	12.03288
14.69712	6.527415	8.344529	11.97787	10.80215	8.100788	9.441788	8.216705	4.119451	9.216869	0	8.187398	9.460113
													16.92396	9.715223	6.563705	7.666112	10.28952	13.02856	7.753943	8.161261	6.670031	6.552618	8.882489	6.01893	9.04814
15.67149	7.06602	7.282888	3.236839	7.94997	7.039088	6.529009	4.796648	4.753213	6.766778	4.427813	6.917834	9.494422
													21.00709	7.700545	8.199406	13.00966	8.346745	5.611629	6.181063	4.73318	7.202665	12.25555	9.371118	8.278086	24.43718
18.82191	7.538428	5.58151	8.090317	4.465792	6.711331	7.857765	9.427588	8.059246	6.573061	5.817471	11.30288	6.89364
													19.116	7.329028	7.07874	5.616868	10.54676	3.675894	8.425302	7.084824	4.348719	7.177914	12.04535	9.371118	12.59373
21.74029	10.98856	0	0	8.525603	7.125878	3.515985	6.600884	7.309548	5.227377	13.64097	11.06953	0
													0	0	0	0	4.002332	0	4.670548	0	0	0	0	0	0

注：N为正常对照组；M为模型组；1～9为均匀设计组；10为清开灵等比组(四味药)；11为清开灵原方组(七味药)；0为无数据。

      表16  13组iNOS值测定试验数据(去除奇异点)结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													18.56095	9.285438	7.161507	6.865751	10.11512	7.332019	5.181452	10.20158	7.679652	9.472893	11.28801	11.33404	10.67516
16.72898	12.67696	8.083641	12.1253	6.132177	7.435761	11.45841	12.04055	8.363351	8.621397	7.330676	8.928388	10.27181
													16.91984	7.496894	9.260569	14.97038	6.757795	8.344529	10.42018	18.90722	2.152365	9.024663	6.519579	10.94941	12.03288
14.69712	6.527415	8.344529	11.97787	10.80215	8.100788	9.441788	8.216705	4.119451	9.216869	0	8.187398	9.460113
													16.92396	9.715223	6.563705	7.666112	10.28952	13.02856	7.753943	8.161261	6.670031	6.552618	8.882489	6.01893	9.04814
15.67149	7.06602	7.282888	3.236839	7.94997	7.039088	6.529009	4.796648	4.753213	6.766778	4.427813	6.917834	9.494422
													21.00709	7.700545	8.199406	13.00966	8.34745	5.611629	6.181063	4.73318	7.20665	12.25555	9.371118	8.78086	0
18.82191	7.538428	5.58151	8.090317	4.465792	6.711331	7.857765	9.427588	8.059246	6.573061	5.817471	11.30288	6.89364
													19.116	7.329028	7.07874	5.616868	10.54676	3.675894	8.425302	7.084824	4.348719	7.177914	12.04535	9.371118	12.59373
21.74029	10.98856	0	0	8.525603	7.125878	3.515985	6.600884	7.309548	5.227377	13.64097	11.06953	0
													0	0	0	0	4.002332	0	4.670548	0	0	0	0	0	0

注：N为正常对照组；M为模型组；1～9为均匀设计组；10为清开灵等比组(四味药)；11为清开灵原方组(七味药)；0为去除奇异点和/或无数据。

D、不同组方MDA值的统计处理(如表17、表18所示)：

              表17  13组MDA值测定试验数据结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													67.67	97.62	80.42	60.66	30.72	64.49	100.17	66.4	68.31	68.31	38.36	105.26	79.78
67.03	53.02	42.19	74.68	48.56	51.11	72.13	43.46	53.65	75.32	60.03	40.91	49.19
													67.67	56.2	64.49	47.28	43.46	84.24	84.88	34.54	61.94	67.03	49.19	105.9	83.6
63.21	140.95	51.74	51.74	51.74	59.39	79.78	68.31	44.73	78.5	94.43	61.3	104.63
													58.75	71.49	70.22	42.82	38.36	58.75	88.7	50.47	77.87	77.87	53.02	41.55	86.15
58.75	105.9	24.98	35.81	50.47	40.91	88.7	40.27	46.01	82.33	53.02	58.11	72.13
													89.34	91.88	49.19	39.64	61.94	40.91	79.14	46.65	40.27	98.89	74.68	62.57	56.2
56.84	45.37	26.89	52.38	38.1	94.43	52.38	90.61	82.96	130.75	61.94	97.62	74.68
													63.85	98.89	0	0	72.13	0	50.47	86.79	71.49	77.23	101.44	54.93	76.59
76.59	95.07	0	0	98.89	0	35.81	97.62	0	114.18	0	0	89.34
													0	59.39	0	0	0	0	37.09	0	0	0	0	0	0

注：N为正常对照组；M为模型组；1～9为均匀设计组；10为清开灵等比组(四味药)；11为清开灵原方组(七味药)；0为无数据。

         表18  13组MDA值测定试验数据(去除奇异点)结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													67.67	97.62	80.42	60.66	30.72	64.49	100.17	66.4	68.31	68.31	38.36	105.26	79.78
67.03	53.02	42.19	74.68	48.56	51.11	72.13	43.46	53.65	75.32	60.03	40.91	49.19
													67.67	56.2	64.49	47.28	43.46	84.24	84.88	34.54	61.94	67.03	49.19	105.9	83.6
63.21	0	51.74	51.74	51.74	59.39	79.78	68.31	44.73	78.5	94.43	61.3	104.63
													58.75	71.49	70.22	42.82	38.36	58.75	88.7	50.47	77.87	77.87	53.02	41.55	86.15
58.75	0	24.98	35.81	50.47	40.91	88.7	40.27	46.01	82.33	53.02	58.11	72.13
													0	91.88	49.19	39.64	61.94	40.91	79.14	46.65	40.27	98.89	74.68	62.57	56.2
56.84	0	26.89	52.38	38.1	94.43	52.38	90.61	82.96	0	61.94	97.62	74.68
													63.85	98.89	0	0	72.13	0	50.47	86.79	71.49	77.23	101.44	54.93	76.59
76.59	95.07	0	0	98.89	0	0	97.62	0	114.18	0	0	89.34
													0	59.39	0	0	0	0	37.09	0	0	0	0	0	0

注：N为正常对照组；M为模型组；1～9为均匀设计组；10为清开灵等比组(四味药)；11为清开灵原方组(七味药)；0为去除奇异点和/或无数据。

E、不同组方TNF-α值的统计处理

数据如下(如表19、表20、表21、表22所示)，其中TNF-α值分两次测定，分为TNF-α(1)和TNF-α(2)组，分别设置各自的空白对照组和模型组。

              表19  13组TNF-α(1)值测定试验数据结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													92.10238	93.75221	71.84494	0	0	0	0	0	59.81537	56.46375	63.25219	57.79414	61.17991
63.94973	98.77926	139.1407	0	0	0	0	0	51.27982	60.49594	71.11043	50.01842	59.81537
													142.1132	88.84165	79.37293	0	0	0	0	0	57.12723	74.06848	91.28232	93.75221	51.27982
68.92696	115.459	39.29716	0	0	0	0	0	137.1745	42.74376	73.32397	111.852	41.00444
													88.84165	76.32194	41.58067	0	0	0	0	0	87.23081	59.13821	76.32194	88.84165	42.16044
63.25219	61.86727	33.83966	0	0	0	0	0	52.55508	51.27982	77.07973	67.48807	61.17991
													53.84419	101.3363	48.77095	0	0	0	0	0	82.4767	85.63302	68.92696	177.7255	64.65065
121.8927	57.79414	78.60523	0	0	0	0	0	102.195	43.92104	50.01842	72.58279	77.07973
													102.195	84.83902	57.12723	0	0	0	0	0	48.15244	57.79414	45.71341	50.01842	59.13821
0	92.10238	149.1568	0	0	0	0	0	73.32397	81.69583	76.32194	51.91572	80.91824

注：TNF-α(1)为TNF-α第一组试验数据(未有均匀设计第2～6组)；N为正常对照组；M为模型组；1，7～9为均匀设计组；10为清开灵等比组(四味药)；11为清开灵原方组(七味药)；0为无数据。

          表20  13组TNF-α(2)值测定试验数据结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													0.222372	0.050976	0	0.066007	0.065501	0.054249	0.051903	0.078563	0	0	0	0	0
0.074821	0.050514	0	0.078563	0.059048	0.046427	0.064996	0.128267	0	0	0	0	0
													0.042031	0.062493	0	0.135395	0.065501	0.063991	0.151417	0.055673	0	0	0	0	0
0.080731	0.082919	0	0.064996	0.060516	0.066007	0.068046	0.481164	0	0	0	0	0
													0.106515	0.052369	0	0.09532	0.042031	0.059048	0.052837	0.087918	0	0	0	0	0
0.049138	0.098808	0	0.062493	0.061502	0.053777	0.050514	0.075352	0	0	0	0	0
													0.067024	0.145335	0	0.051903	0.067534	0.03452	0.05663	0.081822	0	0	0	0	0
0.082919	0.063991	0	0.199403	0.073238	0.091308	0.079103	0.102339	0	0	0	0	0
													0.061997	0.085683	0	0.049595	0.064493	0.077488	0.040317	0.115044	0	0	0	0	0
0	0.071145	0	0.043771	0.052369	0.055197	0.054249	0.096478	0	0	0	0	0

注：TNF-α(2)为TNF-α值测定第二组试验数据(未有均匀设计第1，7～11组)；N为正常对照组；M为模型组；2～6为均匀设计组；0为无数据。

              表21  13组TNF-α(1)值测定试验数据(去除奇异点)结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													92.10238	93.75221	71.84494	0	0	0	0	0	59.81537	56.46375	63.25219	57.79414	61.17991
63.94973	98.77926	0	0	0	0	0	0	51.27982	60.49594	71.11043	50.01842	59.81537
													0	88.84165	79.37293	0	0	0	0	0	57.12723	74.06848	91.28232	93.75221	51.27982
68.92696	0	39.29716	0	0	0	0	0	0	0	73.32397	0	0
													88.84165	76.32194	41.58067	0	0	0	0	0	87.23081	59.13821	76.32194	88.84165	0
63.25219	0	0	0	0	0	0	0	52.55508	51.27982	77.07973	67.48807	61.17991
													53.84419	0	48.77095	0	0	0	0	0	82.4767	85.63302	68.92696	0	64.65065
0	0	78.60523	0	0	0	0	0	0	43.92104	50.01842	72.58279	77.07973
													0	84.83902	57.12723	0	0	0	0	0	48.15244	57.79414	45.71341	50.01842	59.13821
0	92.10238	0	0	0	0	0	0	73.32397	81.69583	76.32194	51.91572	80.91824
													0	0	0	0	0.102932	0	0.056151	0	0	0	0	0	0

注：TNF-α(1)为TNF-α第一组试验数据(未有均匀设计第2～6组)；N为正常对照组；M为模型组；1，7～9为均匀设计组，10为清开灵等比组(四味药)；11为清开灵原方组(七味药)；0为去除奇异点和/或无数据。

       表22  13组TNF-α(2)值测定试验数据(去除奇异点)结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													0	50.97553	0	66.0074	65.50124	54.24854	51.90328	78.56338	0	0	0	0	0
74.82131	50.51388	0	78.56338	59.04839	46.42681	64.99646	128.267	0	0	0	0	0
													42.03123	62.49347	0	135.3954	65.50124	63.99108	151.4173	55.6733	0	0	0	0	0
80.73069	82.91888	0	64.99646	60.51635	66.0074	68.04585	481.1641	0	0	0	0	0
													106.5154	52.36939	0	95.32001	42.03123	59.04839	52.83697	87.91779	0	0	0	0	0
49.13793	98.80758	0	62.49347	61.50209	53.77655	50.51388	75.35191	0	0	0	0	0
													67.02387	145.3346	0	51.90328	67.53417	34.51968	56.6304	81.82219	0	0	0	0	0
82.91888	63.99108	0	199.4031	73.23751	91.30777	79.10324	102.3395	0	0	0	0	0
													61.99708	85.68322	0	49.59508	64.49307	77.4876	40.31687	115.0435	0	0	0	0	0
0	71.14459	0	43.77081	52.36939	55.19692	54.24854	96.47758	0	0	0	0	0
													0	0	0	0	102.9324	0	56.15112	0	0	0	0	0	0

注：TNF-α(2)为TNF-α值测定第二组试验数据(未有均匀设计第1，7～11组)；N为正常对照组；M为模型组；2～6为均匀设计组；0为去除奇异点和/或无数据。

F、不同组方wVF值的统计处理

如表23、表24、表25、表26所示，wVF值分两次试验，分为wVF(1)和wVF(2)组，分别设置各自空白对照组和模型组。

            表23  13组vWF(1)试验数据结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													0.623316	0.376768	0.104683	0.430427	0.166312	0.590881	0.33475	0.382699	0	0	0	0	0
0.373805	0.210245	0.052418	0.721483	0.550937	0.596276	0.554767	0.5586	0	0	0	0	0
													0.161488	0.520381	0.044978	0.092814	0.555534	0.194103	0.388638	0.689404	0	0	0	0	0
0.431927	0.468042	0.00037	0.506681	0.86533	0.099393	0.100052	0.69878	0	0	0	0	0
													0.232882	0.175303	0.018187	0.331085	0.100713	0.122705	0.561667	0.701125	0	0	0	0	0
0.180856	0.701907	0.00169	0.397561	0.3099	0.422938	0.515811	0.438679	0	0	0	0	0
													0.157364	0.213063	0.005631	0.458989	0.173917	0.35018	0.435677	0.247129	0	0	0	0	0
0.337684	0.944485	0	0.471818	0.517334	0.267914	0.26073	0.124049	0	0	0	0	0
													0.387895	0.21871	0.17461	0.39161	0.255712	0.376027	0.521905	0.239284	0	0	0	0	0
0.21871	0.654344	0.169074	0171148	0.153248	0.190609	0.42743	0.831936	0	0	0	0	0

注：vWF(1)为vWF第一组试验数据(未有均匀设计第7-11组)；N为正常对照组；M为模型组；1～6为均匀设计组；0为无数据。

            表24  13组vWF(2)试验数据结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													0.051246	0.388658	0	0	0	0	0	0	0.2392852	0.3694931	0.4441931	0.4146732	0.3012075
0.07671	0.206471	0	0	0	0	0	0	0.5403	0.1279571	0.2348943	0.4169398	0.1268975
													0.107914	0.644362	0	0	0	0	0	0	0.2801085	0.7646361	0.4407812	0.1728738	0.2502821
0.127957	0.635071	0	0	0	0	0	0	0.549507	0.5127332	0.1631859	0.2173784	0.1492503
													0.146045	0.264619	0	0	0	0	0	0	0.3706189	0.4601353	0.2173784	0.1815112	0.3616177
0.241482	0.76229	0	0	0	0	0	0	0.4578559	0.5207651	0.314577	0.1815112	0.3078882
													0.17611	0.127957	0	0	0	0	0	0	0.5265064	0.4180734	0.2327007	0.2228438	0.2305082
0.420341	0.63391	0	0	0	0	0	0	0.6455244	0.4681182	0.3112316	0.1621115	0.142843
													0.080835	0.20974	0	0	0	0	0	0	0.142843	0.1793496	0	0.1815112	0.4555771

0.10058

0.711946

0

0

0

0

0

0

0.1890883

0.4932574

0

0.3313343

0

注：vWF(2)为vWF第一组试验数据(未有均匀设计第1～6组)；N为正常对照组；M为模型组；7～9为均匀设计组；10为清开灵比例组(四味药)；11为清开灵原方组(七味药)；0为无数据。

           表25  13组vWF(1)试验数据(去除奇异点)结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													0	0.376768	0.104683	0.430427	0.166312	0.590881	0.33475	0.382699	0	0	0	0	0
0.373805	0.210245	0.052418	0.721483	0.550937	0.596276	0.554767	0.5586	0	0	0	0	0
													0.161488	0.520381	0.044978	0.092814	0.555534	0.194103	0.388638	0.689404	0	0	0	0	0
0.431927	0.468042	0.00037	0.506681	0.86533	0.099393	0.100052	0.69878	0	0	0	0	0
													0.232882	0	0.018187	0.331085	0.100713	0.122705	0.561667	0.701125	0	0	0	0	0
0.180856	0.701907	0.00169	0.397561	0.3099	0.422938	0.515811	0.438679	0	0	0	0	0
													0.157364	0.213063	0.005631	0.458989	0.173917	0.35018	0.435677	0.247129	0	0	0	0	0
0.337684	0.944485	0	0.471818	0.517334	0.267914	0.26073	0.124049	0	0	0	0	0
													0.387895	0.21871	0.17461	0.39161	0.255712	0.376027	0.521905	0.239284	0	0	0	0	0
0.21871	0.654344	0.169074	0.171148	0.153248	0.190609	0.42743	0.831936	0	0	0	0	0

注：vWF(1)为vWF第一组试验数据(未有均匀设计第7～11组)；N为正常对照组；M为模型组；1～6为均匀设计组；0为去除奇异点和/或无数据。

            表26  13组vWF(2)试验数据(去除奇异点)结果

N	M	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
													0.051246	0.388658	0	0	0	0	0	0	0.239285	0.369493	0.444193	0.414673	0.301208
0.07671	0.206471	0	0	0	0	0	0	0.5403	0.127957	0.234894	0.41694	0.126897
													0.107914	0.644362	0	0	0	0	0	0	0.280109	0.764636	0.440781	0.172874	0.250282
0.127957	0.635071	0	0	0	0	0	0	0.549507	0.512733	0.163186	0.217378	0.14925
													0.146045	0.264619	0	0	0	0	0	0	0.370619	0.460135	0.217378	0.181511	0.361618
0.241482	0.76229	0	0	0	0	0	0	0.457856	0.520765	0.314577	0.181511	0.307888
													0.17611	0.127957	0	0	0	0	0	0	0.526506	0.418073	0.232701	0.222844	0.230508
0.420341	0.63391	0	0	0	0	0	0	0.645524	0.468118	0.311232	0.162111	0.142843
													0.080835	0.20974	0	0	0	0	0	0	0.142843	0.17935	0	0.181511	0.455577
0.10058	0.711946	0	0	0	0	0	0	0.189088	0.493257	0	0.331334	0

注：vWF(2)为vWF第一组试验数据(未有均匀设计第1～6组)；N为正常对照组；M为模型组；7～9为均匀设计组；10为清开灵比例组(四味药)；11为清开灵原方组(八味药)；0为去除奇异点和/或无数据。

5、结论：

(1)不同配比组方对大鼠缺血脑组织TNF-α蛋白含量的影响

实验证明，脑缺血/再灌注损伤后血浆及脑组织匀浆中TNF-α表达增加，含量升高。脑缺血早期主要由缺血区神经元和小胶质细胞表达TNF-α，发挥损害作用：TNF-α在不同时期不同部位能诱导敏感细胞发生以细胞肿胀、溶解为特征的坏死和以细胞核破裂成DNA片断、细胞器皱缩为特征的凋亡。本实验结果显示：以线栓法复制大鼠MCAO模型，在缺血24h，模型组脑组织TNF-α蛋白含量显著高于正常组。分析药物对TNF-α蛋白含量的影响，可以发现在对TNF-α的干预这一环节上，除药6组不能阻抑脑缺血24h脑组织TNF-α蛋白含量的增加外，各给药组都可以显著阻抑脑缺血24h脑组织TNF-α蛋白含量的增加。

(2)不同配比组方对缺血脑组织IL-1β蛋白含量的影响

脑缺血可诱导脑内IL-1βmRNA合成和蛋白表达增加，使IL-1β含量明显增高。脑缺血状态下过多持续的IL-1β的产生致使其浓度病理性急剧增高，通过促炎反应、促进自由基释放、增强兴奋性氨基酸毒性作用等机制参与了神经组织损伤。

本实验表明，在脑缺血24h，脑组织IL-1β蛋白含量显著升高，缺血24h，药4阻抑了缺血后脑组织IL-1β蛋白含量的增加，除药4组外，其余各给药组均未表现出阻抑IL-1β蛋白含量增加的趋势，而且药2、6、7、8、9、11组表现出了促进IL-1β表达的趋势。

(3)不同配比组方对脑缺血大鼠血浆vWF蛋白含量的影响

内皮细胞凝血因子VIII相关抗原(血管性血友病因子)(vWF)主要由血管内皮细胞合成，凡是有血管内皮细胞损害的病变，如脑缺血及动脉硬化等，均可导致血浆中vWF水平增高，血浆vWF的水平可作为脑血管病变血管内皮细胞损害严重程度及判断预后的重要指标。

与正常组比较，大鼠脑缺血24h后血浆vWF蛋白含量明显升高。而药1、3、4、9、10、11可以阻抑血浆vWF蛋白含量的增加，具有良好的保护血管内皮细胞的作用。

(4)不同配比组方对脑缺血大鼠血清NSE蛋白含量的影响

局灶性脑缺血后，血和脑脊液中NSE含量升高，持续2～5天，其含量水平与梗塞体积大小呈线型关系。而本实验显示，大鼠脑缺血24h后血清NSE蛋白含量明显升高。药1、11阻抑了血清NSE蛋白含量的增加，显示一定的神经元保护作用，而药2表现出了促进NSE含量升高的趋势，可能在此环节上具有一定的副作用。

(5)不同配比组方对缺血脑组织iNOS活性的影响

本实验发现，与缺血24h正常组比较，大鼠脑缺血24h后脑组织iNOS活性含量明显降低，考虑与缺血损伤后iNOS过度消耗有关。除药7组与模型组比较有阻抑iNOS增加的趋势外，各给药组与模型组变化趋势无显著差异。

(6)不同配比组方对缺血脑组织MDA含量的影响

MDA是氧自由基引发的生物膜不饱和脂肪酸过氧化反应的代谢产物，氧自由基介导的自由基连锁反应是急性脑缺血神经元损伤的重要因素，抗自由基治疗可减少脑缺血的损伤，改善神经功能。

本实验结果显示，脑缺血24h，脑组织MDA含量升高。而药1、2、3、7阻抑了缺血脑组织MDA含量的升高。

根据前述的讨论，药1、药3、药4表现出了良好的神经保护作用，其余用药组或效果不明显，或虽然在某些指标上有改善作用但同时在另外指标上有比较明显的加重损伤的作用。

(7)总分排队评判结果

将同一组方下，各药效指标值进行平均；再将同一组方的各个平均药效指标值求和，和数为该组方总药理效应值；对不同组方的总药理效应值按照从小到大顺序排序。因为，各种药效指标基本是抑制型指标，故总药理效应值越小，组方越优。结果如下(如表27所示)

             表27  各组方药效指标排序表

组方	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
												NSE	-2.148	-3.491	-3.906	7.278	-7.003	-10.965	-1.060	-1.823	0.687	-0.756	-1.853
Il-1β	1.567	-4.552	-8.463	-15.870	-12.11	-5.603	3.857	2.505	2.188	1.391	2.607
												TNF-α	-1.050	-0.866	-0.971	-1.082	-1.069	-0.919	-1.178	-1.009	-0.981	-0.853	-0.792
iNOS	-0.517	0.856	-0.777	0.366	-0.475	0.672	-0.270	-0.667	0.355	0.325	0.779
												MDA	-0.751	-1.684	-0.941	-1.350	-1.010	-0.932	-1.043	0.854	-1.067	-0.865	-0.303
vWF	-1.989	-1.050	-0.344	-0.074	-1.260	2.216	-0.770	-0.872	-0.356	-0.213	-0.368
												SUM	-4.888	-10.78	-15.402	-10.732	-22.93	-15.531	-0.464	-1.012	0.826	-0.971	0.07
SORT	6	4	3	5	1	2	9	7	11	8	10

注：Sum为同一组方下总药理效应值，Sort根据总药理效应着从小到大的顺序号。

组方3、5和6为优组，其中组方5最优，其次为组方6，组方3；大部分的小方配伍组优于清开灵全方组，提示在小方较全方具有减毒作用的同时，增效作用亦比较明显；清开灵四味药配伍组的总药理效应值低于清开灵全方，但二者分值差距较小，提示在该比例下，小方所舍弃的药味对总药理效应是有贡献的，但贡献较小。

(8)最优配比的对比评价

药效指标效应值组间比较的综合优势分析显示，组方1、3、4表现出了良好的神经保护作用，其余用药组或效果不明显，或虽然在某些指标上有改善作用，但同时在另外指标上有比较明显的加重损伤的作用。总分排队评判结果采用将同一组方下，各药效指标值进行平均；再将同一组方的各个平均药效指标值求和，和数为该组方总药理效应值；对不同组方的总药理效应值按照从小到大顺序排序的方法。因为各种药效指标基本是抑制型指标，故总药理效应值越小，组方越优。结果显示，组方3、5和6为优组，其中组方5最优，其次为组方6，组方3；大部分的小方配伍组优于清开灵全方组，提示在小方较全方具有减毒作用的同时，增效作用亦比较明显；清开灵四味药配伍组的总药理效应值低于清开灵全方，但二者分值差距较小，提示在该比例下，小方所舍弃的药味对总药理效应是有贡献的，但贡献较小。

综合两种分析所得结果，确定组方3为最优配伍，其配伍为1000毫升药液含猪胆酸1.75g、胆酸1.75g、黄芩苷6.25g、栀子12.5g、珍珠母62.5g。

Claims (8)

1、一种中药复方二次新药的开发方法，其包括以下步骤：

(1)选择中医长期使用的古方或验方，根据其中药物的性味，结合长期临床应用的经验和疾病治疗情况，进行药物成分和配伍分析，并结合疾病的中医理论，对药材进行合并和拆减，实现在整体药材层次上对复方的再认识；

(2)对各药材进行化学物质基础分析，并利用指纹图谱综合分析药材以及药材组合物中物质成分，将复方组成物质群进行组分鉴别和归类；

(3)通过步骤(2)的指纹图谱分析结果，以及不同药材及其组合物的药理实验结果，结合现代中医用药理论，在对原方增效或减毒的基础上提出新的药味配伍组合；

(4)对新药复方进行指纹图谱分析和化学成分鉴定，并确定新药复方的生产工艺；

(5)运用均匀设计方案设计组方配比，分别进行相关药效药理实验，比较各组方的实验结果，最终确定新药复方组方的最佳配比。

2、如权利要求1所述的一种中药复方二次新药的开发方法，其特征在于步骤(1)中的对药材进行合并和拆减，包括对复方各药材根据性味和临床药用功能的不同进行分类，把性味或临床药用性质相同或相近相近的药材归并为一类，并在中医理论指导下，针对某些来源稀少或价格昂贵的药味进行拆减，或使用替代品。

3、如权利要求1所述的一种中药复方二次新药的开发方法，其特征在于步骤(2)中的化学物质基础分析，包括使用现代化学分离和分析手段，对各味药材中的化学成分进行鉴定，并按照化学性质和药理药效性质进行分类，从化学层次上阐释复方的组成物质群。

4、如权利要求1所述的一种中药复方二次新药的开发方法，其特征在于步骤(2)中的利用指纹图谱综合分析药材以及药材组合物中物质成分，包括用中药指纹图谱技术定性或定量分析药材、药材组合物、复方中的物质成分，对复方中源于不同药材的各成分的来源进行分析，并按照各物质成分化学结构和药理药效性质的不同进行分类，得到具备不同化学结构和药理药效性质的化学组分群。

5、如权利要求1所述的一种中药复方二次新药的开发方法，其特征在于步骤(3)中的新的药味配伍组合，包括根据不同药味的主要化学成分及药理药效性质，在中医理论指导下，以增效或减毒为原则，进行重新组合或者加减味、拆方，形成新的药味配伍组合。

6、如权利要求1所述的一种中药复方二次新药的开发方法，其特征在于步骤(4)中的确定新药复方的生产工艺，包括对复方进行指纹图谱分析和化学成分鉴定，确定其中的主要有效成分，以主要有效成分的含量为指标调整相关工艺参数，确定新药复方的最佳工艺。

7、如权利要求1所述的一种中药复方二次新药的开发方法，其特征在于步骤(5)中的均匀设计方案，包括根据均匀设计方案，设计含有不同相对比例的各味药材的新药组方，从中筛选除最优组方方案。

8、如权利要求1所述的一种中药复方二次新药的开发方法，其特征在于步骤(5)中的各组方的实验结果，包括按照不同新药组方制备新药，进行相关药理药效实验，根据不同实验结果综合考察各组方新药的临床药效，确定出新药组方的最佳配比。

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