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CN1886145A - 含槐角提取物为有效成分的更年期疾病的预防及治疗用组合物 - Google Patents

含槐角提取物为有效成分的更年期疾病的预防及治疗用组合物 Download PDF

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CN1886145A
CN1886145A CNA2004800348141A CN200480034814A CN1886145A CN 1886145 A CN1886145 A CN 1886145A CN A2004800348141 A CNA2004800348141 A CN A2004800348141A CN 200480034814 A CN200480034814 A CN 200480034814A CN 1886145 A CN1886145 A CN 1886145A
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bone
sophorae extract
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李承桓
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李承熙
李民远
李都翼
崔永郁
朱成洙
元泰准
姜熙哲
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RexGene Biotech Co Ltd
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Abstract

本发明涉及含槐角提取物作为有效成分的更年期疾病的预防及治疗用组合物。具体地说，本发明涉及具有更年期疾病的预防及治疗效果的槐角提取物，含该槐角提取物的组合物及通过投药上述组合物，来预防及治疗更年期疾病的方法。本发明的槐角提取物具有促进造骨细胞增殖的活性，具有骨－吸收细胞活素的分泌抑制活性、骨再形成相关的成长因子的分泌促进活性、造骨细胞的氧化氮的生成促进活性及破骨细胞的分化抑制活性，具有使骨吸收指标的浓度减少，抑制骨的钙浓度减少，抑制骨密度减少的活性，故对包括骨多孔症在内的更年期疾病的预防或治疗中极有用。

Description

含槐角提取物为有效成分的更年期疾病的预防及治疗用组合物
技术领域
本发明涉及含有槐角提取物作为有效成分的更年期疾病的预防及治疗用组合物。具体地说，本发明涉及具有更年期疾病的疾病的预防及治疗效果的槐角提取物、含该槐角提取物的组合物及通过给药该组合物来预防及治疗更年期疾病的方法。
背景技术
更年期疾病意指因男性激素或女性激素的分泌减少而诱发的疾病。特别是对女性来说，因卵巢的老化，引起雌激素的分泌减少，由此在闭经前后约2～10年出现的疾病，将诱发高热、出汗、失眠症、抑郁症、尿失禁、痛症、骨多孔症、心肌梗塞、脑中风及高血压等症状。
上述更年期疾病内最具代表性的骨多孔症意指因破骨细胞活性大于造骨细胞而引起的骨总量(total bone mass)减少的症状。当发生骨多孔症时，皮质骨(cortical bone)的宽度减少，骨髓的空洞(cavity)扩大，网状组织的骨柱降低，骨继续变成多孔质。随着骨多孔症的发展，骨的物理强度降低，诱发腰痛与关节痛，稍有冲击，骨就容易破碎。
此前，为了预防及治疗这种更年期疾病，开发有激素替代疗法、非甾类制剂以及用于治疗骨多孔症的药物治疗法等。其中，目前激素替代疗法作为最有效的方法而被使用着。然而，当长期投药上述药物时，其缺点是产生致癌危险性、头痛、体重增加等副作用等。因此，殷切希望开发更安全、有效的治疗剂。
最近，正在积极开发研究一种即使长期给药药物时也无上述副作用，且具有可替代雌激素的程度的优良药效的新型药物。目前，作为雌激素的替代物质，成为关心焦点的一种物质是大豆等中含有的植物雌激素(phytoestrogen)。所述植物雌激素与人激素的结构类似，在人体内，通过激素或抗激素的作用，对与激素相关的疾病产生影响，另外，有人一直研究着作为替代激素替代疗法(hormone replacement therapy)的饵料补充剂的利用。作为此前已知的代表性的植物激素，可以举出黄豆苷元(daidzein)、金雀异黄素(genistein)、芒柄花黄素(formononetin)、鹰嘴豆芽素A(biochanin A)等异黄酮(isoflavone)类化合物，拟雌内酯(coumestrol)等拟雌烷(coumestan)类化合物，肠内酯(enterolactone)等木酚素(lignan)类化合物及肠二醇(entradiol)等酚(phenol)类化合物等。
韩国专利No.348148公开了含大量植物雌激素，具有骨多孔症预防及治疗效果的葛根提取物，报告有含有大量作为植物雌激素的一种的黄豆苷元的葛根提取物的骨多孔症改善效果(Kim C.S.et al.，Korean J.Food Sci.Technol.，34(4)，710-718，2002)。另外，还有人报告大豆粉末的骨多孔症改善效果(杨松范等，大韩骨代谢学会志，6(1)，11～17，1999)。
另一方面，槐角(Sophorae Fructus)是槐树的果实(学名：SophorajaponicaLinne)。所述槐树是属于豆科的落叶乔木，分布在韩国、日本及中国等，取决于其部位，含有各种不同的成分，呈现各种不同的药理作用。
作为槐树花的槐花(Sophorae Flos)的药理作用，已知有抗炎作用、抗溃疡作用、降低血压作用以及对动脉硬化症的预防及治疗效果。(金长民等，中药大辞典第1卷，图书出版，496-509，1998)。
槐树粘液(树脂)称作槐胶，可用作治疗破伤风，有人报告有槐树的叶子(槐叶)、枝、树皮及根皮具有抗菌活性(Yook C.S.et al.，K.H.Pharma.Sci.，17，75～87，1989)。
已知作为槐树的果实的槐角具有血糖上升作用及抗菌作用，可用于痔疾、女性子宫出血、尿血的治疗、吐血、喀血及肚脱的治疗等(金长民等，中药大辞典第1卷，图书出版，496-509，1998)。
发明内容
本发明人等为了寻找具有更年期疾病的预防及治疗效果、且无副作用的新型治疗剂而在悉心研究中确认，作为槐树果实的槐角提取物，具有极其有效地预防及治疗包括骨多孔症在内的更年期疾病的活性，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种含有槐角提取物作为有效成分的更年期疾病的预防及治疗用药物组合物。
本发明的又一目的是提供一种含有槐角提取物作为有效成分的更年期疾病的预防及改善用食品组合物。
本发明的另一目的是提供一种，通过把含槐角提取物的药物组合物给药给个体，来预防及治疗更年期疾病的方法。
本发明的另一目的是提供一种，通过把含槐角提取物的药物组合物投药给个体，来抑制体重增加的方法。
本发明的另一目的是提供一种槐角提取物在制造预防及治疗更年期疾病的药剂中的应用。
附图说明
图1是用MTT法分析本发明的槐角提取物对造骨细胞的增殖的影响的结果(R-G：实施例1的槐角提取物处理组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物处理组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物处理组；S-S：大豆提取物粉末处理组：E：17-β雌二醇(estradiol)；对照组：细胞培养用培养基处理组；LPS：脂多糖类(lipopolysacchar)处理组)。
图2A是用ELISA分析本发明的槐角提取物的IL-1β分泌抑制效果的结果(R-G：实施例1的槐角提取物处理组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物处理组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物处理组；S-S：大豆提取物粉末处理组：E：17-β雌二醇(estradiol)对照组；对照组：细胞培养用培养基处理组)。
图2B是用ELISA分析本发明的槐角提取物的IL-6分泌抑制效果的结果(R-G：实施例1的槐角提取物处理组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物处理组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物处理组；S-S：大豆提取物粉末处理组：E：17-β雌二醇(estradiol)处理组；对照组：细胞培养用培养基处理组)。
图3是用RT-PCR分析本发明的槐角提取物处理的IL-1β及IL-6的出现程度的结果(R-G：实施例1的槐角提取物处理组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物处理组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物处理组；S-S：大豆提取物粉末处理组：E：17-β雌二醇(estradiol)处理组)。
图4A是用ELISA分析本发明的槐角提取物的IGF-1的分泌促进效果的结果(R-G：实施例1的槐角提取物处理组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物处理组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物处理组；S-S：大豆提取物粉末处理组：E：17-β雌二醇(estradiol)处理组；对照组：细胞培养用培养基处理组)。
图4B用ELISA分析本发明的槐角提取物的TGF-β的分泌促进效果的结果(R-G：实施例1的槐角提取物处理组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物处理组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物处理组；S-S：大豆提取物粉末处理组：E：17-β雌二醇(estradiol)处理组；对照组：细胞培养用培养基处理组)。
图5是用RT-PCR分析本发明的槐角提取物处理的IGF-1及TGF-β的出现程度的结果(R-G：实施例1的槐角提取物处理组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物处理组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物处理组；S-S：大豆提取物粉末处理组：E：17-β雌二醇(estradiol)处理组)。
图6是用ELISA分析本发明的槐角提取物的氧化氮生成促进效果的结果(R-G：实施例1的槐角提取物处理组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物处理组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物处理组；S-S：大豆提取物粉末处理组：E：17-β雌二醇处理组；对照组：细胞培养用培养基处理组)。
图7是用RT-PCR分析本发明的槐角提取物的处理中氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase；ecNOS)的出现程度的结果。用GAPDH作为加载的对照组(R-G：实施例1的槐角提取物处理组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物处理组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物处理组；S-S：大豆提取物粉末处理组：E：17-β雌二醇处理组；*：R-P、E vs S-S，当p＜0.05时，存在有意义的差)。
图8是为了测定本发明的槐角提取物的破骨细胞分化抑制能力，TRAP染色后用光学显微镜进行观察，来计数显示阳性的破骨细胞数的结果(R-G：实施例1的槐角提取物处理组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物处理组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物处理组；E：17-β雌二醇(estradiol)处理组；S-S：大豆提取物粉末处理组)。
图9是将本发明的槐角提取物的破骨细胞分化抑制能力，TRAP染色后测定吸光度并进行分析的结果(对照组：细胞培养用培养基处理组；R-G：实施例1的槐角提取物处理组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物处理组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物处理组；S-S：大豆提取物粉末处理组；E：17-β雌二醇(estradiol)处理组)。
图10是显示供给了本发明的槐角提取物的摘除了卵巢的白鼠的体重变化图(E：17-β雌二醇投药组；R-G：实施例1的槐角提取物给药组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物给药组；S-S：大豆提取物粉末给药组)。
图11是为了测定供给了本发明的槐角提取物的摘除了卵巢的白鼠的血浆内Dpd(Deoxypyridinoline：脱氧吡啶啉)浓度，而确定了Dpd浓度与吸光度的相关关系的标准曲线(Y＝-0.1128X+1.6102，R＝0.9902)。
图12是在供给本发明的槐角提取物中摘除了卵巢的白鼠的血浆内Dpd浓度的变化图(E：17-β雌二醇给药组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物投药组；R-G：实施例1的槐角提取物投药组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物投药组；S-S：大豆提取物粉末投药组)。
图13是在供给本发明的槐角提取物中摘除了卵巢的白鼠的实验前后的血浆内Dpd浓度差的图(对照组：卵巢摘除后饮水投药组；E：17-β雌二醇投药组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物投药组；R-G：实施例1的槐角提取物投药组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物投药组；S-S：大豆提取物粉末投药组)。
图14是本发明的槐角提取物的Dpd增加的抑制效果的比较图(E：17-β雌二醇投药组；R-G：实施例1的槐角提取物投药组；S-S：大豆提取物粉末投药组；R-P：含实施例3的槐角的酶分解提取物的食品组合物投药组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物投药组；*：p＜0.05，无意义；**：p＜0.05，有意义)。
图15是在供给槐角提取物中摘除了卵巢的白鼠的血浆内钙的浓度变化图(E：17-β雌二醇投药组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物投药组；R-G：实施例1的槐角提取物投药组；R-P：含实施例3的槐角酶分解提取物的食品组合物投药组；S-S：大豆提取物粉末投药组)。
图16A是用光学显微镜观察供给了本发明的槐角提取物的卵巢被摘除的白鼠的胫骨的照片(倍率×16，A：正常组(卵巢未摘除组)；B：对照组1(假手术组)；C：对照组2(卵巢摘出组)；D：17-β雌二醇投药组；E：实施例1的槐角提取物投药组；F：实施例2的槐角酶分解提取物投药组；G：含实施例3的槐角酶分解提取物的食品组合物投药组；H：大豆提取物粉末投药组)。
图16B是供给了本发明的槐角提取物的卵巢被摘除的白鼠的胫骨的小柱骨面积的测定结果(E：17-β雌二醇投药组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物投药组；R-G：实施例1的槐角提取物投药组；R-P：含实施例3的槐角酶分解提取物的食品组合物投药组；S-S：大豆提取物粉末投药组；*p＜0.05时，存在有意义的差)。
图17A是用光学显微镜观察了供给了本发明的槐角提取物的卵巢被摘除的白鼠的腰椎骨的照片(倍率×16，A：正常组(卵巢未摘除组)；B：对照组1(假手术组)；C：对照组2(卵巢摘除组)；D：17-β雌二醇投药组；E：实施例1的槐角提取物投药组；F：实施例2的槐角酶分解提取物投药组；G：含实施例3的槐角酶分解提取物的食品组合物投药组；H：大豆提取物粉末投药组)。
图17B是供给了本发明的槐角提取物的卵巢被摘除的白鼠的腰椎骨的小柱面积的测定结果(E：17-β雌二醇投药组；R-A：实施例2的槐角的酶分解提取物投药组；R-G：实施例1的槐角提取物投药组；R-P：含实施例3的槐角酶分解提取物的食品组合物投药组；S-S：大豆提取物粉末投药组；*p＜0.05时，存在有意义的差)。
具体实施方式
为了达到上述本发明的目的，本发明提供一种含槐角提取物作为有效成分的更年期疾病的预防或治疗用药物组合物。
本发明还提供一种含槐角提取物作为有效成分的更年期疾病的预防或改善用食品组合物。
本发明还提供一种通过把含有槐角提取物的药物组合物投药给个体，来预防或改善更年期疾病的方法。
本发明还提供一种通过把含有槐角提取物的药物组合物投药给个体，来抑制体重增加的方法。
本发明还提供一种槐角提取物在制造更年期疾病的预防或治疗用药剂中的应用。
本发明中，所谓槐角(Sophorae Fructus)是指豆科植物槐树的果实。优选的所述槐角是指槐树的完全成熟的果实。
用于制造本发明槐角提取物的槐角，优选的是完全成熟的具有固有的色泽及香味，无异味、异臭的槐角。另外，槐皮为绿褐色至褐色而果实为黑色至黑褐色的槐角是优选的。
本发明的槐角提取物不限于此，采用热水提取方法制造的槐角提取物是优选的。对热水提取时的槐角与水的比例未作特别限定，在槐角粉末中加水3倍～20倍(重量基准)。优选的是，为了增加提取效率，可以对槐角粉末加水5倍～10倍(重量基准)。
提取时的温度，在常压下室温中进行是优选的，提取时间因提取温度而异，提取1小时至6小时，优选2小时至4小时。另外，提取时用搅拌器(shaker)进行搅拌时，更加增大提取效率。
用于提取的槐角在收获后加以洗涤，直接使用或干燥后使用。作为干燥方法，可以采用晒干、阴干、热风干燥及自然干燥的所有方法。还有，为了增大提取效率，可把槐角或其干体用粉碎机进行粉碎后使用。
优选的是，本发明的槐角提取物是把槐角粉碎至20～40筛目大小，往该槐角粉末中添加饮用水3～20倍，优选5～10倍；100～130℃，优选120～125℃热水提取1小时～3小时。离心分离上述热水提取液去除沉淀物，回收上清液，来制成槐角提取物。
另外，对采用上述方法得到的本发明的槐角的热水提取物，再进行酶处理，由此可以得到槐角的酶分解提取物。即，对采用上述方法得到的热水提取液，进行酶处理，使得酶相对提取液之比达到0.01～1％(v/v)，使反应4～24小时进行浓缩后，冷冻干燥来加以制造。作为该酶，可以采用α-及β-淀粉酶、果胶酶。
另一方面，本发明的槐角提取物具有更年期疾病的预防与治疗效果。上述“更年期疾病”意指因缺乏激素而诱发的疾病，特别是女性因卵巢功能停止，导致雌性激素缺乏而诱发的疾病。代表性的更年期疾病，可以举出包括骨多孔症、腰痛、风湿性关节炎、退行性关节炎、佝偻病、骨软化症及Paget骨病(Paget’s disease of bone：变形性骨炎)的骨代谢性疾病，包括心绞痛及动脉硬化症的心血管疾病，以及包括帕金森病的退行性神经疾病等。所谓骨代谢性疾病是生物体内的破骨细胞与造骨细胞的平衡被破坏而产生的疾病，骨多孔症(osteoporosis)是最具代表的疾病。优选的是，本发明的槐角提取物对骨多孔症的预防或治疗具有极佳的效果。
上述本发明的槐角提取物的更年期疾病的预防或治疗效果，通过生物体外(in vitro)及生物体内(in vivo)实验来确认。
在本发明的槐角提取物的生物体外实验中，确认了本发明的槐角提取物具有促进造骨细胞的增殖(参见图1)，抑制骨-吸收细胞活素IL-1β与IL-6的分泌的活性(参见图2A、图2B及图3)。另外，本发明的槐角提取物具有促进与骨的再形成有关的成长因子IGF-1和TGF-β出现的活性(参见图4A、图4B及图5)，具有促进氧化氮的生成(图6及图7)、有效抑制破骨细胞的分化的活性(图8及图9)。另外，上述活性在本发明的槐角提取物浓度低时也显示出优良。
本发明的槐角提取物的生物体内实验，利用摘除了卵巢的白鼠进行。向上述摘除了卵巢的不分泌雌性激素的白鼠，供给本发明的槐角提取物，并测定伴随着此供给的白鼠的体重变化、作为血清内骨的交替率指标的通过破骨细胞分解骨的基体时增加的Dpd及造骨细胞活性化而增加的钙浓度。结果可以确认，本发明的槐角提取物作为雌性激素的替代物质发挥作用，具有抑制体重的增加(参见图10)、抑制Dpd增加的能力(参见图12～14)，具有使血中的钙浓度增加的活性(参见图15)。另外，本发明的槐角提取物，通过摘除了卵巢的白鼠已经确认了具有抑制作为骨密度指标的胫骨与腰椎骨的小柱骨面积的减少的活性(参见图16及图17)。
因此，本发明提供一种含有槐角提取物作为有效成分的更年期疾病的预防与治疗用药物组合物。上述更年期疾病包括因缺乏激素而诱发的全部疾病，特别包括女性因缺乏雌性激素而诱发的疾病。例如，可以举出包括骨多孔症、腰痛、风湿性关节炎、退行性关节炎、佝偻病、骨软化症及Paget骨病(Paget’s di sease of bone)的骨代谢性疾病，心绞痛及动脉硬化症的心血管疾病，以及帕金森病等退行性神经疾病等。最优选的是，上述更年期疾病包括骨多孔症。
本发明的药物组合物，可以单独含有药物学有效量的槐角提取物，或含一种以上药物学允许的载体、赋形剂或稀释剂。所谓上述“药物学有效量”是指预防或治疗疾病的充分的提取物量。
作为本发明的槐角提取物的药物学有效量为1～600mg/天/体重kg，优选1～100mg/天/体重kg。然而，上述药物学有效量也可根据疾病及其重症程度、患者的年龄、体重、健康状态、性别、投药路线及治疗时间等加以适当变化。
上述“药物学允许量”意指生理学上允许的量，当对人投药时，通常不引起胃肠不适、头脑晕眩等变应反应或类似反应的组合物量。作为上述载体、赋形剂及稀释剂的例子，可以举出乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油。
上述药物组合物，可以添加、含有填充剂、抗凝缩剂、润滑剂、香料、乳化剂及防腐剂等。另外，为使本发明的药物组合物在投药给哺乳动物后，活性成分迅速、慢速或延迟释放，可采用制药界公知的方法加以剂形化。剂形可以是粉末、颗粒、片剂、乳液、糖浆、气溶胶、软质或硬质胶囊、灭菌注射用液、灭菌粉末形态。本发明涉及的药物组合物可经口、经皮、皮下、静脉或肌肉等多个路线投药。活性成分的投药量可通过投药路线、患者年龄、性别、体重及重症度等种种因子加以适当选择。
本发明的药物组合物，可与预防或治疗更年期疾病有效的公知的化合物并用投药。作为该化合物的例子，可以举出天然维生素D3、雌性激素、阿仑膦酸盐(alendronate)及雷洛西芬(raloxifene)等。
另外，本发明的槐角提取物，也可以添加至用于预防或治疗更年期疾病的食品中。因此，本发明提供一种含有槐角提取物作为有效成分的食品组合物。本发明的食品组合物包括功能性食品(functional food)、营养助剂(nuteitionalsupplement)、健康食品(health food)及食品添加剂(food additives)等全部形态。上述类型的食品组合物，可采用该业界公知的一般方法，以多种形态制造。
例如，作为健康食品，是把本发明的槐角提取物本身，制成茶、果汁及饮料状，供给饮用，或加以颗粒化、胶囊化及粉末化后进行摄取。另外，本发明的槐角提取物，可与其他具有更年期疾病的改善及预防效果的已知活性成分一起混合，能够以组合物的形态制造。
另外，作为功能性食品，可在饮料(包括酒精性饮料)、果实及其加工食品(例如，罐装果物、瓶装食物、果酱、桔子果酱等)，鱼、肉类及其加工食品(例如，火腿、腊肠、腌牛肉)，面包类，以及面类(例如，厚的小麦面、荠麦面、方便面、意大利面、空心面等)，果汁，各种饮料，饼干，小麦-面筋，牛奶制品(例如，黄油、乳酪等)，食用植物油，人造黄油，植物蛋白质，干馏食品(retortfood)，冷冻食品及各种调味品(例如，大酱，酱油，调味料)等中添加本发明的槐角提取物而制成。
另外，为使本发明的槐角提取物以食品添加剂的形态使用，可以制成粉末或浓缩液状后使用。
本发明的食品组合物内，作为本发明的槐角提取物的优选含量，每100g食品达到约30～50g。
优选的是，含本发明的槐角提取物作为有效成分的食品组合物，特别是与对骨多孔症有效同时可以促进钙的生物体吸收的公知的活性成分一起混合，以健康食品的形态制造。
最优选的是，含本发明的槐角提取物作为有效成分的食品组合物，其构成是：槐角提取物30～50重量％、海藻钙粉末30～50重量％、结晶纤维素1～10重量％、乳蛋白水解物0.1～2重量％、绿茶提取物粉末0.1～2重量％、鲨鱼软骨提取物粉末0.1～2重量％、壳低聚糖0.1～2重量％、维生素C0.1～2重量％、骨胶原肽0.1～2重量％、葡萄果实提取物粉末0.1～2重量％、淀粉酶(amylase)、蛋白酶(protease)、纤维素酶(cellulase)、脂酶(1ipase)及乳糖酶混合物0.1～2重量％、维生素D3粉末0.1～0.3重量％、及硬脂酸镁0.1～2重量％。
上述海藻钙，因从海苔类、石化菜类及海萝类等红藻类提取，故不仅富含骨成长必要的钙，还含有丰富的镁、锌、铁、氟、锰、碘、硒。在本发明的槐角提取物中，上述海藻钙粉末作为钙供给源添加30～50重量％，可以呈现本发明的槐角提取物的骨多孔症的预防及改善效果的相乘作用。
结晶纤维素，作为赋形剂，可在1～10重量％含量范围内添加。
乳蛋白水解物是把乳蛋白用酶或酸进行水解，加工成适于食用的产物，在该乳蛋白水解物中含有促进钙的体内吸收的酪蛋白磷酸肽(CPP)。因此，在本发明的组合物中添加该乳蛋白水解物在0.1～2重量％范围内，可以呈现本发明的槐角提取物的骨多孔症的预防及改善效果的相乘作用。优选的是，该乳蛋白水解物采用酪蛋白磷酸肽(CPP)为12％以上的物质。
在绿茶提取物粉末及葡萄果实提取物粉末中，可以大量含有防止氧化、抑制炎症，防止骨消失的多元酚成分。在本发明的组合物中，分别添加上述绿茶提取物粉末及葡萄果实提取物粉末0.1～2重量％，由此可以呈现本发明的槐角提取物的骨多孔症的预防及改善效果的相乘作用。
鲨鱼软骨提取物粉末，含有作为软骨构成成分的软骨素，对骨多孔症的预防极有用。因此，在本发明的组合物中上述鲨鱼软骨提取物粉末添加0.1～2重量％，可以呈现本发明的槐角提取物的骨多孔症的预防及改善效果的相乘作用。
壳低聚糖是从蟹、虾、甲壳类的壳得到的壳质、壳聚糖分解而提高了生物体利用率的天然低分子多糖类。由于上述壳低聚糖具有高的水溶性，故体内吸收率优良，故是增强免疫及复活作用、抗癌作用、抗菌作用、血糖值上升抑制作用、钙吸收促进作用等广泛的高性能生理活性物质。在本发明中，上述壳低聚糖在本发明的组合物中添加0.1～2重量％，可以促进钙的吸收。上述壳低聚糖含量在70％以上是优选的。
已知维生素C与维生素D3，可促进钙的吸收，在本发明的组合物中，该维生素C与维生素D3分别添加0.1～2重量％及0.1～0.3重量％，由此可以促进钙的吸收。
胶原肽具有有益于胶原蛋白质的骨骼形成与成长的效果，在本发明的组合物中添加0.1～2重量％。
淀粉酶(amylase)、蛋白酶(protease)、纤维素酶(cellulase)、脂酶(lipase)及乳糖酶的混合物，可以采用市场销售的商品名为ェネルジメ-P(Enerzyme-P)的复合酶制剂。该ェネルジメ-P可用作促进体内消化吸收、能量效率与新陈代谢的生物食品的核心原料。本发明的食品组合物内通过添加0.1～2重量％的上述酶的混合物，本发明的组合物可容易地在体内消化吸收。
已知硬脂酸镁作为粘多糖与胶原、钙的供给源，在关节中为有用的成分。在本发明的食品组合物中上述硬脂酸镁添加0.1～2重量％，可以呈现本发明的槐角提取物的骨多孔症的预防及改善效果的相乘作用。
本发明的槐角提取物与上述钙供给源及促进钙生物体吸收的成分等一起混合的食品组合物，对更年期疾病，特别是骨多孔症的预防及治疗有相乘效果。
另外，本发明提供一种把含上述槐角提取物的药物学组合物以有效量供药给个体，来预防及治疗更年期疾病的方法。
在本发明中所谓个体，意指包括人的哺乳动物。在本发明中，所谓“有效量”意指治疗或预防疾病的充分量，优选的有效量范围为1～600mg/天/体重kg，更优选1～100mg/天/体重kg。但是，上述药物学上的有效量也取决于疾病及其病重程度、患者的年龄、体重、健康状态、性别、投药路线及治疗时间等而适当变化。另外，作为向个体投药上述药物学组合物的方法，未作特别限定，可以采用该领域内公知的方法。另外，作为更年期疾病，包括上述记载的疾病。优选的是包括骨代谢疾病。
上述骨代谢疾病，通过把含本发明的槐角提取物的药物组合物以有效量投投药个体，促进造骨细胞的增殖、骨再形成相关成长因子及氧化氮的生成，使预防或治疗成为可能。
上述造骨细胞具有合成骨的基质并分泌，调节钙与磷的浓度，来形成骨骼的活性。在本发明的一实施例中，已经确认槐角提取物具有促进造骨细胞的增殖的效果。上述骨再形成相关成长因子包括造骨细胞的IGF-1(insulin likeGrowth Factor-1：胰岛素样生长因子)及TGF-β(transforming growthfactor-beta：转化生长因子β)。已知上述IGF-1及TGF-β刺激造骨细胞的复制(replication)，提高骨胶原及基质合成。特别是已知，TGF-β抑制破骨细胞的功能，促进破骨细胞的细胞死灭(apotopsis)，随着TGF-β增加，减少骨的再吸收(Spelsberg，T.C.et al.，J.Mol.Endocrinol，13，819-828，1999)。在本发明的一实施例中，已经确认槐角提取物具有促进IGF-1及TGF-β分泌的活性。
有报告认为，从上述造骨细胞分泌的氧化氮抑制破骨细胞的活性，抑制骨的再吸收。在本发明的一实施例中，已经确认槐角提取物具有促进氧化氮的生成活性。
另外，上述骨代谢性疾病，通过对个体投药含有效量的本发明槐角提取物的药物组合物，可以抑制骨-吸收细胞活素的分泌或破骨细胞的分化，使预防或治疗成为可能。
上述骨-吸收细胞活素中含有IL-1β与IL-6。上述骨-吸收细胞活素从造骨细胞中分泌出来，促进作为破骨细胞分化因子的(OPG-L(osteoprotegrinligand：护骨素配体))的出现，因此，具有促进破骨细胞分化的活性(Spelsberg，T.C.，et al.，Mol.Endocrinol，13，819-828，1999)。在本发明的一实施例中，已经确认槐角提取物具有抑制上述骨-吸收细胞活素的IL-1beta与IL-6分泌的活性。上述破骨细胞附着在骨的表面上，分泌酸与分解酶，借此除去构成骨的磷灰石结晶及胶原质等骨基质(bone matrix)，具有破坏骨的活性。在本发明的一实施例中，已经确认槐角提取物具有破骨细胞的分化抑制效果。
另外，本发明的槐角提取物，因摘除了卵巢，不分泌雌性激素，故具有抑制体重增加的效果。因此，本发明提供一种向个体投药有效量的含槐角提取物的药物学组合物，来抑制体重增加的方法。
另外，本发明提供一种把槐角提取物用于更年期疾病的预防或治疗的药剂的制造的用途。
下面举出实施例，详细说明本发明的具体方法，本发明的权利要求范围不受这些实施例的限定。
实施例1
槐角提取物的制造
把槐角(Jesung药业社，首尔京东市场内)20kg用干式粉碎机粉碎至30目大小。往该粉碎物中加饮用水，稀释至10倍后(粉碎物∶饮用水＝9∶1)，于100℃加热4小时。然后，冷却至50℃，用100目滤布过滤后，再用200目滤布过滤，去除沉淀物，取得滤液。用浓缩器把该上清液浓缩达到1/5体积，来制造槐角提取物。另外，用喷雾干燥机喷雾干燥该浓缩液，制成粉末后用于实验。
实施例2
槐角的酶分解提取物的制造
把按照上述实施例1的方法制造的槐角热水提取物用滤布进行过滤，往得到的滤液中添加淀粉酶使其达到0.5％(v/v)的浓度，于50℃进行酶反应16小时。用浓缩机浓缩上述反应液使其体积达到1/5，由此制成槐角的酶分解提取物。另外，用喷雾干燥机喷雾干燥该浓缩液，制成粉末后用于实验。
实施例3
含槐角提取物的食品组合物的制造
制造含上述实施例2制造的槐角酶分解提取物的食品组合物。上述实施例2的方法制造的槐角酶分解提取物235g、非塑性海藻钙粉末200g(大德药业，韩国京畿道)、结晶纤维素27.5g(大德药业，韩国京畿道)、乳蛋白水解物5g(Dynenatural，韩国首尔)、绿茶提取物粉末5g(明食品，韩国京畿道)、鲨鱼软骨提取物粉末5g(信一商社，韩国首尔)、壳低聚糖4g(YoungDeokChitosan Co.Ltd.，韩国首尔)，维生素C5g(Roche Vitamin Co.，韩国首尔)、胶原肽(collagen peptide)2.5g(Dynenatural，韩国首尔)、葡萄的果实提取物粉末2.5g(大德药业，韩国京畿道)、enerzyme-P2.5g(成志物产，韩国京畿道)，维生素D3粉末1g(Roche Vitamin Co.，韩国首尔)以及硬脂酸镁5g(Dynenatural，韩国首尔)混合在一起，由此制成含槐角提取物的食品组合物。
实施例4
通过生物体外(in vitro)实验的槐角提取物的骨多孔症的预防或治疗效果调查
为了调查槐角提取物的骨多孔症的预防或治疗效果，分配得到人体造骨细胞来使用，从白鼠取得骨髓细胞，从该骨髓细胞分化破骨细胞及造骨细胞后使用。
另外，调查了本发明的槐角组合物对人体造骨细胞的影响、骨-吸收细胞活素的IL-1β及IL-6的分泌抑制活性、骨再形成有关的成长因子IGF-1与TGF-β的分泌促进活性、对造骨细胞的氧化氮生成量的影响及破骨细胞的分化抑制活性等。所有实验组的比较，利用ANOVA实验，特定实验组间的比较，利用研究者T-实验(student T-test)，在统计处理后，当可靠性区间(p值)小于0.05(p＜0.05)时，具有统计上的意义。
4-1)人体造骨细胞的培养
从汉城大学医科大学的韩国细胞株银行分配得到MG-63人体造骨细胞-类似细胞，继代培养后使用。上述冷冻MG-63人体造骨细胞-类似细胞，于37℃水浴解冻约1分钟，以1300rpm离心分离5分钟，除去上清液。把得到的颗粒在添加了10％FBS的DMEM培养基中再悬浮后，在25cm3培养瓶内分株进行培养。为使细胞稳定，放置约2周的培养期间，使细胞稳定，用显微镜确认是否形成了单层(monolayer)后供于实验。
4-2)破骨细胞(osteoclast cell)及造骨细胞(osteoblast cell)的培养
使12周龄的SD类鼠(翰林实验动物研究所，韩国京畿道)吸入过量乙醚来将其麻醉。每个鼠直接脱取2个大腿骨(femur)，用洗涤用培养基(15％FBS α-MEM培养基)洗涤数次，用破骨细胞培养基(含0.28mM L-抗坏血酸-2磷酸的15％FBS α-MEM培养基)进行最终洗涤，除去大腿骨两端部位(epiphyses)，用25号注射针取得约10ml的骨髓细胞。
往上述取得的骨髓细胞内添加10ml破骨细胞培养基，在75cm3培养瓶内分株，于24小时37℃、5％CO2及100％湿度下进行培养。培养后，移至新鲜的培养基中，在10天内再供给2次培养基来进行培养后，供于实验。
造骨细胞，采用与上述破骨细胞同样的方法采取的10ml骨髓细胞，用100μm细胞过滤器(cell strainer)过滤，进行离心分离，去除上清液，在1次培养用培养基(含0.28mM L-抗坏血酸-2磷酸与10nm地塞米松的15％FBSα-MEM培养基)中再悬浮，使每个大腿骨达到5ml。把悬浮的骨髓细胞放入75cm3培养瓶内，再添加1次培养用培养基，使每个大腿骨达到20ml，于37℃、5％CO2及100％湿度下进行培养后，在培养第2天及第4天，更换相同的培养基。在培养第6天用胰朊酶处理后，用造骨细胞培养用培养基(含0.28mM L-抗坏血酸-2-磷酸与10nM地塞米松的15％FBS α-MEM培养基)更换培养基来进行培养。
上述造骨细胞及破骨细胞的培养状态在实验前用显微镜确认，用台盼蓝染色排除法(trypan blue dye exclusion method)确认细胞生存能力后供作试验。
4-3)槐角提取物处理后的造骨细胞的增殖速度
为了调查槐角提取物处理后的造骨细胞增殖速度，用实施例1的槐角提取物粉末(R-G)、实施例2的槐角酶分解提取物粉末(R-A)及含实施例3的槐角提取物的食品组合物(R-P)处理上述实施例4-1)的MG-63人体造骨细胞-类似细胞，培养3天后，用MTT法调查上述提取物对细胞增殖的影响。作为比较例，用大豆提取物粉末(新东邦公司)、作为骨多孔症治疗剂的17-β雌二醇(estradiol，sigma))及脂多糖(lipopolysaccharide，sigma)分别对上述MG-63造骨细胞-类似细胞进行处理后，比较调查对增殖细胞的影响，作为对照组，采用细胞培养用培养基替代上述各试样来进行处理。各试样用细胞培养用培养基稀释，调节处理浓度使其达到10-4～10-12％的范围。上述添加的LPS的浓度为10μg/ml。
与线粒体(mitochondria)活性成比例的MTT分析，采用下法进行。把上述1×104以上的MG-63的造骨细胞-类似细胞，在96井组织培养板(96wellflat-bottomed tissue culture plate)上，每井100μl进行分株后，各试样用10-4、10-6、10-8、10-10、及10-12％浓度处理，使反应72小时。反应终止后，添加10μl MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑鎓溴化物)储备溶液后加以混合，于37℃培养4小时。培养终止后，把10μl异丙醇/HCl(isopropanol/HCI)添加至各井，在完全混合后确认色相变化，并在1小时内，用ELISA板读数器于570nm测定吸光度。
实验结果是，在处理了用实施例1的槐角提取物(R-G组)、实施例2的槐角的酶分解提取物(R-A组)、含实施例3的槐角提取物的食品组合物(R-P组)及大豆提取物粉末(S-S组)时，在全部的处理浓度范围内显示类似的增殖效果。另外，上述增殖效果显示比对照组高的效果。显示比雌二醇处理组(E组)低。然而，在雌二醇处理组的情况下，细胞增殖效果取决于浓度，在用雌二醇以10-10、及10-12％的低浓度处理时，增殖效果下降。反之，增殖效果细微，但在R-G组、R-A组、R-S组及S-S组的情况下，低浓度(10-10％)比高浓度显示高的增殖效果。因此，巳经证实本发明的槐角提取物可以促进造骨细胞的增殖而与浓度无关(图1)。
从上述实验结果可知，本发明的槐角提取物的造骨细胞增殖效果，比雌二醇处理组低，即使在低浓度(10-6～10-12％)也有造骨细胞增殖效果。
4-4)槐角提取物对造骨细胞的IL-1β及IL-6分泌活性的影响
调查本发明的槐角提取物是否抑制由造骨细胞分泌出来的IL-1β(interleukin-1)及IL-6(interleukin-6)的生成。从上述骨-吸收细胞活素IL-1β及IL-6从造骨细胞分泌出来，促进破骨细胞分化因子OPG-L(osteoprotegrinligand)的出现，由此，促进破骨细胞的分化(Spelsberg，T.C.，et al.，Mol.Endocrinol，13，819-828，1999)，因此，上述槐角提取物对造骨细胞产生影响，如骨-吸收细胞活素IL-1β及IL-6的生成被抑制，则通过抑制OPG-L的出现可以抑制破骨细胞的分化。
为了确认本发明的槐角提取物是否具有抑制由造骨细胞分泌的IL-1β及IL-6的生成效果，用细胞培养用培养基稀释实施例1的槐角提取物(R-G组)、实施例2的槐角的酶分解提取物(R-A组)、含实施例3的槐角提取物的食品组合物(R-P组)，在10-4～10-10％的浓度范围内处理上述实施例4-1的MG-63的人体造骨细胞-类似细胞，经过72小时后，用ELISA与RT-PCR，测定IL-1β与IL-6的出现程度。此时，作为比较组，采用同样的方法处理大豆提取物粉末(S-S组)及雌二醇，向对照组添加细胞培养用培养基。
用于测定IL-1β与IL-6的出现程度的ELISA采用ELISA成套设备(Titerzyme ELISA kit，Assay designs)，用提供的本胶原(protocol)实施，于450nm测定吸光度后，通过标准曲线(standard curve)计算各浓度。
另外，为了测定IL-1β与IL-6的mRNA出现程度，用下列方法实施RT-PCR。从用10-8％的浓度处理了上述各试样的MG-63人体造骨细胞-类似细胞，用三溶胶法(TRIZOL法)提取总RNA。把上述总RNA 2μl进行逆转录反应，来制造各种辅助DNA。往DEPC蒸馏水12.85μl分别添加总RNA 5μl、10pM引物(primer)各1μl后，于72℃改性l0分钟，往其中添加反复印酶(5U)0.15μl，于42℃进行反应10分钟，来制成辅助DNA。
把上述辅助DNA作为样板，进行聚合酶链反应。此时，为了实验的再现性及一致性，采用单步RT-PCR预混合(Accupower Bioneer)。用PCR体系(Dual-bay DyadTM thermal cycler system，MJ Research)，以于95℃反应5分钟、于95℃反应30秒、于60℃反应60秒、于72℃反应60秒为1次循环，对上述反应液实施总计35次循环。采用GAPDH作为标准对照组。用凝胶分析器(gel documentation system)定量被放大了的PCR产物，出现程度用相对于对照组的相对％表示。上述RT-PCR中使用的各种引物如下所示。
IL-1β的上游引物(序列号1)：
5′-AGG CAC AAC AGG CTG CTC TG-3′
IL-1β的下游引物(序列号2)：
5′-TGG ACC AGA CAT CAC CAA GC-3′
IL-1β的上游引物(序列号3)：
5′-AGC GCC TTC GGT CCA GTT GC-3′
IL-1β的下游引物(序列号4)：
5′-ACT CAT CTG CAC AGC TCT GG-3′
ELISA分析结果表明，实施例1的槐角提取物处理组(R-G组)、实施例2的槐角的酶分解提取物处理组(R-A组)及含实施例3的槐角提取物的食品组合物处理组(R-P组)，与对照组相比，可以抑制IL-1β及IL-6的分泌。
当各试样用最高浓度10-4％处理时，R-P组的IL-1β的分泌抑制能力显示最佳，而R-G组及R-A组与大豆提取物粉末处理组(S-S组)及雌二醇处理组相比，也显示出了更优良的IL-1β的分泌抑制能力。另外，本发明的槐角提取物处理组用最低浓度10-10％处理时，也可以抑制IL-1β的分泌，与大豆提取物粉末处理组(S-S组)及雌二醇处理组相比，即使在更低的浓度，也可有效抑制IL-1β的分泌。特别是，在R-P组的全部处理浓度，显示了一定量的IL-1β(60pg/ml)的分泌(图2A)。
当各试样用最高浓度10-4％处理时，实施例1的槐角提取物处理组(R-G组)显示出最佳的IL-6的分泌抑制能力，而用最低浓度10-10％处理时，R-G组显示出最佳的IL-1β的分泌抑制能力。特别是在R-P组的全部处理浓度，显示了一定浓度的IL-6(110pg/ml)的分泌，因此，本发明的槐角提取物与S-S组及雌二醇处理组相比，在更低的浓度，也具有效抑制IL-6的活性(图2B)。
RT-PCR结果，也可用与上述ELISA结果类似的图案表示。IL-1β的出现抑制效果，在含槐角提取物的食品组合物组(R-P组)中，显示最佳，而实施例1的槐角提取物处理组(R-G组)及实施例2的槐角的酶分解提取物处理组(R-A组)显示出与雌二醇处理组(E组)类似的程度。雌二醇处理组的IL-6的出现抑制效果最佳。另一方面，在R-P组的情况，IL-6的出现抑制效果也显示优良，比S-S组其效果更优良(图3)。
因此，本发明的槐角提取物可以抑制IL-1β与IL-6的分泌，可以抑制破骨细胞的分化，并且其活性与现有的骨多孔症治疗用食品组合物或药剂相比，即使在更低浓度也可以呈现抑制活性。
4-5)槐角提取物对造骨细胞的IGF-1以及TGF-β的分泌活性的影响
调查本发明的槐角提取物是否对造骨细胞的IGF-1(Insulin like GrowthFactor-1)及TGF-β(transforming growth factor-β)的分泌有促进作用。已知骨再形成有关的成长因子IGF-1及TGF-β，刺激造骨细胞的复制(replication)，提高胶原及基体合成。特别是TGF-β具有抑制破骨细胞的功能，促进破骨细胞的细胞死亡(apotopsis)，随着TGF-β的增殖，骨的再吸收减少(Spelsberg，T.C.et al.，J.Mol.Endocrinol，13，819-828，1999).。
为了调查本发明的槐角提取物是否促进造骨细胞中的IGF-1及TGF-β的分泌，采用与上述实施例4-4同样的方法，将各试样在MG-63人体造骨细胞-类似细胞中进行处理，实施ELISA及RT-PCR，测定IGF-1及TGF-β的分泌量及出现量。IGF-1及TGF-β的出现程度用相对于对照组的相对％表示。
ELISA测定，采用ELISA成套设备(Quantikine，R&D system)按照产品使用说明书中记载的规范实施。然后，采用与上述实施例4-4)同样的方法测定吸光度进行定量。RT-PCR采用与上述实施例4-4)同样的方法实施，采用下列引物。
TGF-β的上游引物(序列号5)：
5′-CGC CCT GTT CGC TCT GGG TAT-3′
TGF-β的下游引物(序列号6)：
5′-AGG AGG TCC GCA TGC TCA CAG-3′
IGF-1的上游引物(序列号7)：
5′-ATG CTC TTC AGT TCG TGT GT-3′
IGF-1的下游引物(序列号8)：
5′-AGC TGA CTT GGC AGG CTT GT-3′
ELISA的分析结果表示：与对照组相比，全部实验组的IFG-1浓度高。各试样用10-4％的高浓度处理时，IFG-1浓度在雌二醇处理组(E组)中最高，而处理浓度在10-6％时，实施例1的槐角提取物处理组(R-A组)最高。另外，处理浓度在10-12％的低浓度时，与雌二醇处理组相比实施例1的槐角提取物处理组(R-G组)、实施例2的槐角的酶分解提取物处理组(R-A组)及含实施例3的槐角提取物的食品组合物处理组(R-P组)高(图4)。
各试样在10-4～10-10％范围处理时，TGF-β浓度在雌二醇处理组中呈现均匀的高浓度，可知TGF-β促进活性高，而用10-12％浓度处理雌二醇时，TGF-β浓度减少，保持类似对照组的水平。反之，在为处理了本发明的槐角提取物的处理组R-G及R-A组的情况下，用最低浓度10-12％处理时，也呈现促进TGF-β分泌的高活性(图4B)。
因此，在上述雌二醇处理组的情况下，处理浓度愈低，对IGF-1及TGF-β的分泌的药物学影响愈低，在本发明的槐角提取物处理组(R-G、R-A及R-P组)的情况下，即使在低浓度也有效果。特别是，含实施例3的槐角提取物的食品组合物处理组(R-P组)的情况下，在所有的处理浓度中均促进IGF-1及TGF-β的分泌。
另外，从以10-8％处理的细胞提取RNA并进行RT-PCR分析的结果表明，与雌二醇处理组(E组)相比，IGF-1的出现在实施例1的槐角提取物处理组(R-G组)及含实施例3的槐角提取物的食品组合物处理组(R-P组)中也达到最高。当为TGF-β时，与雌二醇处理组(E组)相比，R-P组、R-A组及R-G组呈现极高(图5)。
因此，本发明的槐角提取物具有促进IGF-1及TGF-β出现的效果，该效果不取决于浓度。即，本发明的槐角提取物即使在低浓度，仍可以促进IGF-1及TGF-β的出现、具有抑制破骨细胞的功能。
4-6)槐角提取物对造骨细胞的氧化氮生成的影响
调查槐角提取物处理对氧化氮(NO，nitric oxide)的生成的影响。已知该氧化氮再吸收(resorption)骨至血液中，即，对骨损失的调节具有重要的作用。即，有报告提出，由造骨细胞分泌的氧化氮抑制破骨细胞的活性，抑制骨的再吸收(Ralston S.H.Et al.，Endocrinology，1994；Vant Hof R.J.et al.，Immunol.，103，255-261，2001)。
因此，为了调查槐角提取物处理对氧化氮生成的影响，测定了氧化氮生成量及氧化氮合酶ecNOS(endothelial nitric oxide synthase)的出现程度。ecNOS的出现程度，用相对于对照组的相对％表示。
采用与上述实施例4-4)同样的方法，用10-4％～10-12％浓度的MG-63人体造骨细胞-类似细胞对各试样进行处理后，通过ELISA分析，测定生成的氧化氮量，从以10-8％浓度处理的细胞，采用与上述实施例4-4同样的方法提取RNA，通过RT-PCR分析，测定生成的ecNOS量。RT-PCR中使用的引物如下述。
ecNOS的上游引物(序列号9)：
5′-AAG CCG CAT ACG CAC CCA GAG-3′
ecNOS的下游引物(序列号10)：
5′-TGG GGT ACC GCT GCT GGG AGG-3′
ELISA的分析结果表明，用10-4％的高浓度处理各试样的情况下，当为大豆提取物粉末处理组(S-S组)时，氧化氮的生成量最高。但是，在用10-6～10-10％浓度处理的情况下，含实施例3的槐角提取物的食品组合物处理组(R-P组)与上述S-S组相比，氧化氮的生成量明显高。另外，用10-10～10-12％低浓度处理各试样的情况下，本发明的槐角提取物(R-G组及R-A组)及含实施例3的槐角提取物的食品组合物处理组(R-P组)，与雌二醇处理组(E组)相比，氧化氮的生成量高(图6)。
另外，RT-PCR结果表明、R-P组的ecNOS出现程度最高(图7)。
因此，本发明的槐角提取物及含上述槐角提取物的食品组合物，促进氧化氮的生成，具有促进ecNOS出现的活性，即使在低浓度也可以呈现上述活性。另外，该活性达到与雌二醇的类似或比它高的水平。
4-7)槐角提取物处理后的破骨细胞分化抑制效果
调查本发明的槐角提取物处理是否抑制破骨细胞的分化。所以，在上述实施例4-2)中，把分离及培养的破骨细胞与造骨细胞加以共培养(co-culture)。在24井(multiwellTM24 well，Becton Dickinson)细胞培养皿上，在各井的破骨细胞分别为＞1.5×105地进行分株，使各井的造骨细胞达到1×103个。在上述各井中与各试样一起处理分化促进因子M-CSF 50ng/ml，培养5天。上述各试样是将实施例1的槐角提取物(R-G组)、实施例2的槐角酶分解提取物(R-A组)及含实施例3的槐角提取物的食品组合物(R-P组)稀释成10-3、10-6、10-8、10-10及10-12％而制成的。培养完成后，用TRAP染色法(tartrate-resistant acidphosphatase)测定破骨细胞的分化程度。TRAP染色采用酸性磷酸水解酶组件(acid phosphatase kit，Sigma)，在光学显微镜下计数TRAP呈阳性的细胞核。
实验结果是，本发明的槐角提取物的破骨细胞的分化抑制效果比雌二醇低。但是，各试样用10-4及10-6％的高浓度处理时，与大豆提取物粉末(S-S组)处理组相比，实施例1的槐角提取物处理组(R-G组)及含实施例3的槐角提取物的食品组合物处理组(R-P组)的破骨细胞的分化抑制能力优良。特别是以10-8％～10-12％的低浓度处理时，本发明的槐角提取物处理组(R-G、R-A及R-P组)比大豆提取物粉末(S-S组)处理组高。另外，R-P组的破骨细胞的分化抑制效果在全部浓度范围内达到一定(图8)。因此，本发明的槐角提取物及含上述槐角提取物的食品组合物，具有抑制破骨细胞的分化的活性
实施例5
通过生物体内(in vivo)实验的槐角提取物的骨多孔症预防或治疗效果调查
通过动物实验调查槐角提取物的骨多孔症预防或治疗效果。摘除实验用白鼠的卵巢，诱发骨多孔症，给该白鼠边供给本发明的槐角提取物边测定伴随着供给的体重、成长率、血浆内骨交替率指标Dpd(Deoxyphridinoline)及Ca(钙)的浓度变化。另外，测定伴随着本发明的槐角提取物供给的白鼠的胫骨与腰椎骨的小柱面积变化。全部实验组间的比较用ANOVA实验，特定组间的比较，用研究者-T实验(student-T test)进行统计处理，可靠性区间(p值)小于0.05时，具有统计意义。
5-1)实验动物的卵巢摘除
作为实验动物，从翰林实验动物园(韩国京畿道)购买230～250g的雌白鼠(Sprague-Dawley)来使用。把上述实验动物于温度23±1℃、湿度40～60％及明暗周期12小时的条件下饲养，基本饲料(固体饲料，翰林实验动物研究所)与饮水无限制地供给。但在采血前一天只供给饮水。
卵巢摘除手术是，使12周龄白鼠吸入乙醚进行麻醉，用剃刀除去背中部的毛，用70％乙醇消毒手术部位，来进行无菌手术。沿一侧的侧背部下端部位脊椎线，切开皮肤组织约2～3cm左右，把卵巢位置的肌肉及腹膜切开1.5cm，使卵巢露出。用丝线结扎卵管，切除卵巢，用丝线缝合腹膜、肌肉及皮肤。相对侧也采用相同的方法摘除卵巢。作为对照组，仅对腹膜实施同样手术，不摘除卵巢直接再次缝合而实施假手术(sham operation)。手术后具有1周恢复期。
5-2)试样给与及方法
实验动物分为正常组(卵巢未摘除组)、对照组1(假手术组)及卵巢摘除组，卵巢摘除组再分成试样未投药组的对照组2、17-β雌二醇投药组(E组)、实施例1的槐角提取物投药组(R-G组)、实施例2的槐角酶分解提取物投药组(R-A组)、含实施例3槐角提取物的食品组合物投药组(R-P组)及大豆提取物粉末投药组(S-S组)各10只(表1)。向上述各实验组按下述投药量投药试样，试样投药期间是，采用卵巢摘除手术后经过1周的13周龄白鼠，投药至22周龄，投药期间达到9周。
表1试样投药量及投药方法
  组   试样投药量及给要方法
  正常组(卵巢未摘除组)   不投药试样
  对照组(假手术组)   饮水1ml/天，经口投药
  对照组2(卵巢摘除组)   饮水1ml/天，经口投药
  E组   1μg/kg/天，腹腔内注射
  R-G组   0.556g/kg/天，经口投药
  R-A组   0.556g/kg/天，经口投药
  R-P组   0.556g/kg/天，经口投药
  S-S组   0.556g/kg/天，经口投药
5-3)体重及成长率测定
把上述实施例5-2)的各组用电子秤测定每周体重，从测定的体重按下式计算1日的体重增加率。
1日体重增加率＝(最终体重-初始体重)/实验天数×100
实验结果表明，卵巢摘除手术前的体重，各组间无统计差。投药9周试样后的体重，各组间略有统计差。另一方面，卵巢摘除后给予饮用水的对照组2，体重剧增，未摘除卵巢的正常组、进行假手术的对照组1及投药槐角提取物或雌二醇组的体重增加速度缓慢(图10及表2)。这是由于卵巢被摘除的白鼠，卵巢摘除后不分泌雌性激素，使脂肪细胞增加，体重剧增，在卵巢摘除后投药槐角提取物及雌二醇时，通过上述显示增强效果的活性成分等的作用，可抑制脂肪细胞的增加，从而体重增加缓慢。
表2各组的1日体重增加率
  组   体重(g)   体重增加率(g/天)
  初始体重(12周龄)   最终体重(22周龄)
  正常组(卵巢未摘除组)   231.4±12.3031)   294.2±21.869   0.9968±0.1*2)
  对照组(假手术组)   242.1±17.520   280.8±14.336   0.6142±0.2
  对照组2(卵巢摘除组)   236±8.5147   335.6±34.112   1.5809±0.2
  雌二醇投药组   238.8±16.742   302.4±29.885   1.0095±0.1*
  R-G组   241.2±7.159   306.9±11.662   1.0428±0.1*
  R-A组   244.3±8.355   319.6±23.697   1.1952±0.1
  R-P组   243.2±12.903   307.2±25.772   1.0158±0.1*
  S-S组   245.6±9.341   322.1±19.548   1.2142±0.2
1)意指平均±标准偏差
2)*：在p＜0.05有统计意义差
5-4)伴随着供给槐角提取物的血浆内Dpd浓度变化
测定伴随着供给槐角提取物的血浆内Dpd(deoxypyridinoline)浓度变化。该Dpd在骨的基体(matrix)内形成交叉结合(crosslike)，借此具有使第1型胶原链(type 1 collagen chain)稳定化的作用(Seyedin SM.et al.，Curr.Opin.CellBiol.2，914-919，1990；Delmas PD.Biochemical markers for the assessmentof bone turnover.In Riggs BL，MeltonL J，Osteoporosis；etiology，diagnosis，andmanagenent.Philadelphia；Lippincott-Raven Publishers，319-333，1995)，当破骨细胞使骨基体分解时，Dpd通过血液作为尿排出(Eastell R.et al.，J.BoneMiner.Res.12，59-65，1997)。因此，Dpd的增加被抑制意指具有预防或治疗骨代谢疾病的活性(Riggs BL.，West.J.Med.154，63-77，1991；Hesley RP.et al.，Osteoporosis int.8，159-164，1998)。
为了测定通过供给槐角提取物，血浆内Dpd的增加是否被抑制，从上述实施例5-2)的实验动物采得血浆。从卵巢摘除手术前(12周龄，实验第0周)，至2周间隔，使白鼠吸乙醚，从眼窝静脉采血1.7～1.8ml。再投给试样9周后，在屠杀前(22周龄，实验第10周)，通过腹部静脉采血，立即进行离心分离，得到血浆。
上述得到的血浆中的Dpd浓度，采用含有抗-Dpd抗体的Dpd浓度测定用成套仪器(Pyrilinks-D，Quidel Corporation，USA)，采用竞争酶免疫分析法(competitive enzyme immunoassay)进行测定。即，在微量测试孔条(microtiterstrip wells)上涂布抗-Dpd抗体，血浆内的Dpd与结合了Dpd的竟争者(Dpd-alkaline phosphatease conjugate)发生竞争反应，在其中添加作为基质的对-硝基苯基磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，pNPP)使其反应，在405nm测定吸光度，利用确定了Dpd浓度与吸光度的相关关系的标准曲线，计算Dpd浓度(图11)。
实验结果表明，正常组(卵巢未摘除组)及对照组1(假手术组)的血浆内Dpd浓度，在10周间几乎无变化。卵巢摘除后给予饮用水的对照组2的血浆内Dpd浓度继续剧增，与卵巢未摘除的正常组相比，增加约60％。可以认为该结果是由于卵巢摘除后减少雌性激素分泌使骨多孔症加重所致。在雌二醇投药组(E组)、实施例1的槐角提取物投药组(R-G组)、实施例2的槐角酶分解提取物投药组(R-A组)、含实施例3槐角提取物的食品组合物投药组(R-P组)及大豆提取物粉末投药组(S-S组)的情况，卵巢摘除后投药各试样前的实验1周，Dpd浓度增加，但开始投药各试样9周后(实验第10周)，该值减少。特别是R-G组及雌二醇投药组(E组)的Dpd浓度急剧减少(图12)。
因此，本发明的槐角提取物具有抑制Dpd浓度增加的活性。
5-5)槐角提取物的Dpd浓度增加抑制功能的确认
基于上述实施例5-4)的结果，通过下式定量各试样投药9周后的Dpd值的变化。ΔDpd值如是阴性，意指Dpd浓度减少，如为阳性，意指Dpd浓度增加。
ΔDpd＝各个动物的ΔDpd之和/n
上式中的各个动物的ΔDpd意指给实验动物投绐试样前的Dpd与投给9周试样后的Dpd之差，n表示实验动物数。
计算ΔDpd值的结果表明，摘除卵巢后只给饮用水的对照组2的ΔDpd值显示高阳性值，骨多孔症明显恶化。反之，本发明的槐角提取物投药组的R-G组及R-A组、含槐角提取物的食品组合物投药组(R-P组)、雌二醇投药组(E组)及大豆提取物粉末投药组(S-S组)全部显示阴性值，可知具有Dpd抑制功能。其中，雌二醇投药组(E组)显示最大的Dpd抑制功能，当雌二醇投药组的Dpd减少量达到100％时，显示R-G组为60％、S-S组为14.5％、R-P组为1.2％及R-A组为0.7％的减少量(图13)。因此，R-G组与S-S组相比，Dpd减少功能更加优良。
另外，为了确认本发明的槐角提取物的功能，依下式计算相对于骨多孔症实质上进行的对照组2(卵巢摘除组)的Dpd量的本发明的槐角提取物的处理组Dpd量。
槐角提取物的功能＝(ΔDpd对照组2-ΔDpd实验组)/ΔDpd对照组2
在上式中，ΔDpd对照组意指对照组2的试样投药前Dpd浓度与最终Dpd浓度差。
ΔDpd实验组意指处理了各试样的实验组的试样投药前Dpd浓度与最终Dpd浓度差。
另外，当本发明的槐角提取物的功能值大于1时，可以判断具有Dpd抑制能力，该值愈大，功能愈优良。在p＝0.05时，通过ANOVA实验验证了计算的值的意义。
结果表明，R-G组具有与雌二醇几乎类似的功能，而其余各组显示比雌二醇低的功能(图14)。
5-6)伴随着槐角提取物供给的血浆内钙浓度变化
一般情况下，作为骨形成指标的钙浓度增加意指可以形成骨。因此，伴随着槐角提取物供给的血浆内钙浓度变化利用螯合物染色法(OCPC法)进行测定(J.P.Riley，Analytica Chimica Acta，21，317-323，1959)。实验动物的血浆采用与上述实施例5-4)同样的方法得到。血浆内的钙在碱性条件下与OCPC结合而呈紫红色。因此，通过测定该紫红色的吸光度，可以定量试样中的钙浓度。在本实施例中，采用0.88mol/l单一醇胺缓冲液(pH11.0)作为缓冲液，采用OCPC0.1mmol/l与8-羟基喹啉1lmmol/l作为发色剂。
实验结果表明，正常组(卵巢未摘除组)及对照组1(假手术组)，伴随着时间推移，钙浓度显示逐渐减小的倾向。这可以认为是伴随着实验动物的成长的结果。卵巢摘除后仅投药饮用水的对照组2，显示持续的钙浓度减少，实施例1的槐角提取物投药组(R-G组)、实施例2的槐角酶分解提取物投药组(R-A组)、含实施例3槐角提取物的食品组合物投药组(R-P组)、雌二醇投药组(E组)及大豆提取物粉末投药组(S-S组)的情况，卵巢摘除后投药各试样前，钙浓度减少(实验第1周)、从投给各试样后，钙浓度有持续增加的倾向。特别是雌二醇投药组(E组)与R-G组，钙浓度急剧增加(图15及表3)。
表3伴随着槐角提取物供给的钙浓度变化
  组   0周   1周   10周
  正常组(卵巢未摘除组)   10.333±0.10031)   10.01±0.1391   11.386±0.571
  对照组(假手术组)   10.064±0.0678   9.322±0.177   10.94±0.853
  对照组2(卵巢摘除组)   10.2±0.1011   9.188±0.222   9.65±0.677
  雌二醇投药组   10.217±0.1211   8.48±0.344   17.96±1.334
  R-G   9.892±0.0753   8.656±0.389   16.386±0.743
  R-A   10±0.1106   8.12±0.384   13.463±1.210
  R-P   9.967±0.1003   8.11±0.339   14.125±0.872
  S-S   10.483±0.3619   8.6±0.219   11.233±1.1938
1)平均±标准偏差
5-7)伴随着槐角提取物供给的胫骨及腰椎骨的小柱骨面积测定
为了调查槐角提取物对骨的骨密度影响，测定胫骨及腰椎骨的小柱骨面积。上述小柱骨(trabecular bone)是骨代谢作用最活跃的地方，因外部作用效果骨的生成及骨吸收作用最迅速反应的场所。因此，通过测定小柱骨面积，通过其增减与否可以判断骨多孔症及骨多孔症诱发抑制效果(Faugere MC.etal.，American Physiological Society，E35-E38，1986)。
为了测定伴随着槐角提取物供给的胫骨及腰椎骨的小柱骨面积，从上述实施例5-2)的各实验组的白鼠上采取胫骨及腰椎骨，用10％福尔马林溶液固定。在福尔马林酸(formic acid，甲酸)内用手术刀切断在进行脱骨化作用的骨组织中观察的部位。用70％～100％乙醇与丙酮分步进行脱水后，用二甲苯洗涤，用石蜡实施包埋。把包埋的骨组织，用切片机切成5微米，实施苏木素伊红(Hematoxyline eosin，H&E)染色，用光学显微镜(Olympus BH-2)进行观察，从定量及形态计测学方面测定腰椎骨与胫骨的骨端部。
计测方法是采用宝丽莱数字照相机的(polaroid digital camera)通过光学显微镜(Olympus BH-2)的1X物镜得到映像后，在计算机上使用只要描绘各小柱骨的轮廓线就会自动计算的程序，全部测定处于骨的骨端部的内成长板正下部的2次骨化部内的小柱骨。自动计算由计算机算出的面积，用图像分析系统(Optimas ver 6.2，Media Cybernetics.Inc.)分析面积。统计处理这些数值的平均，用％定量从测定部位的全部面积开始小柱骨所占的面积，并进行分析。
实验结果表明，从胫骨考虑，与投药饮用水的对照组2(卵巢摘除组)相比，实施例1的槐角提取物投药组(R-G组)、实施例2的槐角酶分解提取物投药组(R-A组)、含实施例3槐角提取物的食品组合物投药组(R-P组)的小柱骨面积减少程度小，显示出与雌二醇投药组(E组)类似或维持比它更高的骨密度。特别是在R-P组中小柱骨面积减少程度小，骨多孔症诱发抑制效果优良(图16A及图16B)。另外，从腰椎骨考虑，与对照组相比，本发明的槐角提取物(R-A组及R-P组)投药组，小柱骨面积减少程度小(图17A及图17B)。
工业上利用可能性
如上述实施例所述，本发明的槐角提取物具有促进造骨细胞增殖的活性，具有抑制骨-吸收细胞活素(cytokines)分泌的活性、促进骨再形成涉及的成长因子分泌的活性、促进造骨细胞的氧化氮生成的活性及破骨细胞分化抑制活性，具有使骨吸收指标的浓度减少，抑制骨的钙浓度减少，抑制骨密度减少的活性，具有包括骨多孔症在内的更年期疾病的预防或治疗效果。
序列表
<110>雷克斯基因生物科技有限公司
<120>含槐角提取物为有效成分的更年期疾病的预防及治疗用组合物
<160>10
<210>1
<211>20
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<223>引物
<400>10
tggggtaccg ctgctgggag g                  21

Claims (15)

1.一种更年期疾病的预防及治疗用药物组合物，其特征在于，含有槐角提取物作为有效成分。
2.按照权利要求1中记载的药物组合物，其特征在于，上述槐角提取物通过下列步骤制造：
(a)向槐角粉末添加相对于槐角粉末总量3倍～20倍的水的步骤；以及
(b)加热1小时～6小时上述(a)步骤的组合物，来提取上述槐角提取物的步骤。
3.按照权利要求1中记载的药物组合物，其特征在于，上述槐角提取物通过下列步骤制造：
(a)向槐角粉末添加相对于槐角粉末总量3倍～20倍的水的步骤；以及
(b)加热1小时～6小时上述(a)步骤的组合物，来提取槐角提取物而制造的更年期疾病的预防或治疗用药物组合物；以及
(c)在上述(b)步骤的组合物中以0.01～1％(v/v)添加淀粉酶或果胶酶，使其反应4～24小时。
4.按照权利要求1中记载的药物组合物，其特征在于，上述更年期疾病选自由包括骨多孔症、腰痛、风湿性关节炎、退行性关节炎、佝偻病、骨软化症及骨的变形性骨炎的骨代谢性疾病，包括心绞痛及动脉硬化症的心血管疾病，以及包括帕金森病的退行性神经疾病组成的群组。
5.一种更年期疾病的预防及改善用食品组合物，其特征在于，含有权利要求1的槐角提取物作为有效成分。
6.按照权利要求5中记载的食品组合物，其特征在于，上述更年期疾病选自由包括骨多孔症、腰痛、风湿性关节炎、退行性关节炎、佝偻病、骨软化症及变形性骨炎的骨代谢性疾病，包括心绞痛及动脉硬化症的心血管疾病，以及包括帕金森病的退行性神经疾病组成的群组。
7.一种更年期疾病的预防或治疗方法，其特征在于，把含槐角提取物的药物组合物投药给个体。
8.按照权利要求7中记载的方法，其特征在于，上述更年期疾病选自由包括骨多孔症、腰痛、风湿性关节炎、退行性关节炎、佝偻病、骨软化症及变形性骨炎的骨代谢性疾病，包括心绞痛及动脉硬化症的心血管疾病，以及包括帕金森病的退行性神经疾病组成的群组。
9.按照权利要求8中记载的方法，其特征在于，上述更年期疾病为骨代谢性疾病。
10.按照权利要求9中记载的方法，其特征在于，通过把有效量的含槐角提取物的药物组合物投药给个体，促进造骨细胞的增殖、骨再形成相关的成长因子的分泌及造骨细胞的氧化氮的生成，来预防或治疗骨代谢性疾病。
11.按照权利要求10中记载的方法，其特征在于，上述骨再形成相关的成长因子是IGF-1或TGF-β。
12.按照权利要求9中记载的方法，其特征在于，通过把有效量的含槐角提取物的药物组合物投药给个体，来抑制骨-吸收细胞活素的分泌或破骨细胞的分化，由此预防或治疗骨代谢性疾病。
13.按照权利要求12中记载的方法，其特征在于，上述骨-吸收细胞活素是IL-1β或IL-6。
14.一种抑制体重增加的方法，其特征在于，将有效量的含槐角提取物的药物组合物投药给个体。
15.槐角提取物在制造更年期疾病的预防或治疗用药剂中的应用。
CNA2004800348141A 2003-11-26 2004-02-09 含槐角提取物为有效成分的更年期疾病的预防及治疗用组合物 Pending CN1886145A (zh)

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