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CN1867588A - 包含c4bp核心蛋白质和单体抗原的产品及其用途 - Google Patents

包含c4bp核心蛋白质和单体抗原的产品及其用途 Download PDF

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CN1867588A
CN1867588A CNA2004800299249A CN200480029924A CN1867588A CN 1867588 A CN1867588 A CN 1867588A CN A2004800299249 A CNA2004800299249 A CN A2004800299249A CN 200480029924 A CN200480029924 A CN 200480029924A CN 1867588 A CN1867588 A CN 1867588A
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Avidis SA
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Abstract

本发明提供了包含C4bp核心蛋白质和单体抗原的产品，理想地该产品为融合蛋白的形式。单体抗原包括疟疾和流感抗原。C4bp核心蛋白质提供单体抗原的多聚复合体，或其混合物的装配。所述复合体用作疫苗。

Description

包含C4BP核心蛋白质和单体抗原的产品及其用途
本申请要求PCT/EP2003/008926的优先权，其内容引入本文作为参考。
技术领域
本发明涉及大分子装配体，例如融合蛋白，其包含佐剂和抗原，与单独使用该抗原相比，这种装配体能引起针对该抗原的增强的免疫应答。
背景技术
佐剂提高针对抗原的免疫应答，因此在疫苗中可用。但是只有有限几种佐剂被许可用于人体，并且因为作用更强的佐剂是从动物研究中获知的，因此对于可安全使用于人体、具有更强作用的免疫佐剂的需要是非常明显的。最近的几篇综述，请见“疫苗佐剂进展”(“Advances in vaccine adjuvants”)(Nature Biotechnology，1999年第17卷，1075-1081页)和“疫苗佐剂的发现和传递的最新进展”(“Recent Advances in the discovery and delivery ofvaccine adjuvants”)(Nature Reviews in Drug Discovery，2003年第2卷，727-735页)。
补体系统由一系列血清蛋白组成，这些蛋白质在针对外来抗原的免疫系统的应答中具有重要作用。补体系统在其中的主要组分被切割时被活化，并且产物单独或与其它蛋白质一起激活其它的补体蛋白质造成蛋白质水解级联反应。补体系统的活化会带来多种应答，包括血管通透性增强、吞噬细胞的趋化性、炎症细胞的活化、对外来颗粒的调理作用、以及对细胞的直接杀伤作用和组织损伤。补体系统的活化可能是由抗原-抗体复合物所引发的(经典途径)，或者正常缓慢的活化可能在例如细菌和病毒等入侵生物细胞壁的存在下被放大(旁路途径)。补体系统与细胞免疫系统通过涉及C3的特异性途径来相互作用，C3是在经典途径和旁路途径的关键蛋白质。C3的蛋白质水解活化会产生大的片段(C3b)，并暴露出可与外来的亲核物质(例如入侵生物或外来细胞的细胞表面蛋白)共价相互作用的化学反应性的内在硫酯键。其结果是潜在的抗原用C3b“标记”并保持与该蛋白相结合一直到C3b被进一步水解为iC3b和C3d，g。所述后者片段分别是补体受体CR3和CR2的配体(CR2也被称为CD21)。这样用C3b标记抗原成为了靶向带有这些受体的免疫系统的细胞的机制。
这种靶向机制对于免疫应答的增强是重要的，这首先被以下实验证明，其中小鼠的循环C3耗尽并用抗原(绵羊红细胞)免疫，C3的去除减弱了抗体对这种抗原的应答(M.B.Pepys，J.Exp.Med.，140，126-145，1974)。通过在遗传上缺失C3或缺失产生C3的补体级联反应的上游组分(即C2和C4)的动物进行的研究证明了C3的作用(J.M.Ahearn和D.T.Fearon，Adv.Immunol.，46，183-219，1989)。最近表明，与未经修饰的抗原对照相比，模型抗原与两个以上拷贝的鼠C3d片段序列的线性结合造成小鼠抗体应答的显著增强(1000-10000倍)(P.W.Dempsey等，Science，271，348-350，1996；WO96/17625，PCT/GB95/02851)。这种增强效应在不使用传统佐剂例如弗氏完全佐剂的情况下也可以发生，而这种佐剂具有毒性而不适于人类使用。已证明这种显著效应的机制是多价的C3d构建体与B细胞上的CR2高亲和力结合，之后CR2与另一种B细胞膜蛋白质CD19以及膜结合免疫球蛋白共连接，来产生对B细胞细胞核的信号。
然而，经证明产生大量含有三个C3d拷贝的同源重组蛋白质是非常困难的。主要问题在于：
1)含有(三个)重复序列的构建体的遗传不稳定性；
2)来自在大肠杆菌中形成的包涵体的重组蛋白质的折叠(或溶解和再折叠)。
使含有C3d基因的重复拷贝的构建体的遗传不稳定性最小化的一个方法在WO99/35260和WO01/77324中有描述。这些申请中描述的技术是使用编码C3d重复片段的DNA的不同序列。
使用补体4结合蛋白(C4bp)的多聚化系统在WO 91/11461有描述。人C4b结合蛋白(C4BP)是具有高分子量(570kDa)的血浆糖蛋白，它具有由7条相同的α链和1条β链组成的蜘蛛形结构。C4bpα链具有负责该分子装配成多聚体的C末端核心区域。根据标准模型，在一个C4bp单体+498位的半胱氨酸与另一单体+510位的半胱氨酸形成二硫键。仅含7条α链的次要形式也已在人血浆中发现。这种血浆糖蛋白的天然功能是抑制补体活化的经典途径。
C4bpα链的大部分由长度大约60个氨基酸的8个串联排列的结构域组成，称为补体控制蛋白(CCP)重复序列。WO91/11461提出C4bp蛋白质进行多聚化的能力可以用来制备包含全部和部分C4bp和目的生物蛋白质的融合蛋白。在WO91/11461中描述的融合蛋白中优选包括一个或多个CCP重复序列(也称为SCR)。
WO91/11461还建议将该融合蛋白用作疫苗。现已制出一些具体蛋白质，其包含与乙肝e抗原片段融合的至少一个C4bp SCR区域。所使用的e抗原片段是能够形成多聚体结构的核心抗原片段。
Libyh M.T.等(1997，Blood，90，3978-3983)提出，所有的CCP都能被耗尽(仅余下C末端57个氨基酸)而不阻止多聚化。C4bp的这段C末端区域在这里被称为C4bp核心。
Shinya等(1999，Biomed & Pharmacother，Vol.53：471)也阐述了具有自体装配的多聚体可溶性CD4-C4bp融合蛋白，其中该融合蛋白是在人293细胞系中表达的。
在Oudin等(2000，Journal of Immunology，Vol.164：1505)中也描述了C4bp的用途。
Christiansen等(2000，Journal of Virology，Vol.74：4672)讨论了CD46-C4bp融合蛋白的治疗用途。
WO2004/020639提供了在原核宿主中获得重组融合蛋白的方法，其包含C4bpα链的C末端核心蛋白质任选与异源多肽融合的支架，所述重组融合蛋白能够在原核宿主细胞中形成可溶性形式的多聚体。
发明概述
本发明是基于有关C4bp融合蛋白的具体种类的新发现。上面讨论的一些现有技术提出，在C4bp部分基本上是惰性载体的基础上，C4bp融合蛋白运载目的治疗性蛋白质的用途。
前文所述WO91/11461例举了包含可形成多聚体的抗原的融合蛋白。
与之相比，本发明是基于能自然形成多聚体的抗原不适于与C4bp核心融合，因为这种抗原事实上可能干扰C4bp核心装配成多聚体。另外，已有证明，令人惊讶的是，C4bp核心与单体抗原的融合会导致针对该抗原强烈的免疫应答。在随后的例子中显示包含单体抗原的融合蛋白引起高滴度、抑制性抗体应答，与之相比，当抗原与弗氏佐剂共同注射时会引起低滴度、非抑制性的抗体应答。
因此，本发明提供了通过将单体抗原与C4bp核心蛋白质在复合物中结合提高单体抗原免疫原性的方法。在优选方法中，所述单体抗原与C4bp核心蛋白质共价结合。在更优选的方法中，所述单体抗原与C4bp核心蛋白遗传性融合。
本发明还提供了诱导针对抗原的抗体高滴度的方法，以及高滴度抗血清的用途，所述抗血清是通过在通过被动免疫的感染性或恶性疾病预防和/或治疗中使用所述方法来产生的。在优选方法中，通过分离超免疫血浆或血清中的免疫球蛋白级分而部分纯化针对所述抗原的高滴度抗体，在最佳方法中，所述超免疫血浆或血清的免疫球蛋白级分是从将用所述抗血清来预防或治疗感染性或恶性疾病的同一物种个体中分离出来的。
因此本发明提供了产品，其包含了：
C4bp核心蛋白质；和
单体抗原。
此第一和第二组分可以是融合蛋白的形式。或者，它们可以通过化学偶联，所述偶联通过第一组分的任一个氨基酸侧链，或通过特异性加到第一组分上的氨基酸的侧链来化学偶联所述第二组分。
所述第一或第二组分可被紧密但非共价结合。例如，所述第一组分的氨基酸侧链可被修饰以具有附加的生物素基团，并且该生物素可用来与链霉抗生物素蛋白组合(链霉抗生物素蛋白作为第二组分)，或者与链霉抗生物素蛋白融合的抗原可通过该生物素与第一组分组合。在另外的可能性中，生物素化的抗原和生物素化的第一组分可以通过加入链霉抗生物素蛋白质并纯化所得的复合物而紧密但非共价地结合在一起。
为避免疑问，命名“第一”和“第二”组分并不暗示或表示在该两种组分的产物中的具体线性顺序。这两种组分可以任何顺序连接。
因此当两种组分都是多肽并且所述产物被制成融合蛋白，这两种组分的N末端和C末端顺序可以任意交换。
本发明还提供了编码所述第一和第二组分的融合蛋白的核酸。本发明还提供了包含所述核酸的载体和携带所述载体的宿主细胞。
在另一项具体实施方案中，本发明提供了制备产品的方法，所述产品包含：
C4bp核心蛋白质；和
多肽单体抗原，
该方法包括表达编码以融合蛋白形式的这两种组分的核酸，以及回收所述产品。
在另一项具体实施方案中，本发明提供了制备产品的方法，所述产品包含：
C4bp核心蛋白质；和
非-多肽单体抗原，
该方法包括表达编码C4bp核心蛋白质的核酸，将所述核心蛋白质与所述抗原连接，以及回收所述产品。
制备所述产品的方法可在真核或原核细胞中进行。
本发明还提供了诱导对抗原的免疫应答的方法，这种方法包含将有效量的根据本发明的产品给予受试者。
本发明还提供了本发明的产品在治疗人体或动物体的方法，特别是诱导免疫应答的方法中的用途。
本发明还提供了药物组合物，其包含本发明的产品与药学可接受的载体或稀释剂的联合。
本发明还提供了制备在针对感染性物质的被动免疫中使用的保护性免疫血清的方法，该方法包含用本发明的产品接种动物，从该动物回收抗血清。然后该抗血清可用于对人受试者的被动免疫方法。该人受试者可以是感染、或有感染该感染性物质风险的受试者。
附图简述
图1给出C4bp核心蛋白质的比对。
图2给出在大肠杆菌中表达蛋白质的结果。
图3给出在还原和非还原条件的凝胶上电泳的本发明蛋白质的对比。
发明内容
C4bpα链的核心蛋白质
这里指“C4bp核心蛋白质”或“核心蛋白质”，或“C4bp支架”。这些术语可以互换。这一蛋白质可以是哺乳动物的C4bp核心蛋白质，或是其能够形成多聚体并发挥佐剂作用的片段，或是其能够形成多聚体并能够发挥佐剂作用合成的或嵌合的变体。
本发明中，C4bp核心蛋白质或包含所述核心蛋白质的C4bpα链片段(请见下文详述)用作佐剂。SEQ ID NO：1的人C4bp核心蛋白质对应于本领域已知可形成多聚体的全长C4bp蛋白质序列的氨基酸+493到+549。
本发明进一步包括了所述C4bp核心的衍生物在提高抗原免疫原性中的用途。这些衍生物包括其突变体，其可能包含氨基酸缺失、添加特别是半胱氨酸残基的添加或取代、由C4bp家族的不同成员的部分的融合而形成的杂合或嵌合分子和/或环状排列的蛋白质支架，都可用于保持上述的佐剂性质。
本发明还可以使用基于不同物种C4bp核心序列比对得到的人工共有C4bp序列。在很多可能性中的这类嵌合分子的一个例子在下文给出(SEQID：20，图1)。
因此佐剂可能是C4bp核心以及可选的与所述核心融合的一个或多个SCR。
在一个最优选的具体实施方案中，本发明产品的C4bp组分是C4bpα链的核心蛋白质，即这里限定的不与任何C4bp SCR序列相连的核心蛋白质。在这项具体实施方案中，所述C4bp核心理想地由SEQ ID NO：1的残基1-57或其同系物的对应残基组成，或由SEQ ID NO：1或其同系物的至少47个氨基酸的片段组成。
本发明产品的C4bp核心可另外包含N端或C端的延伸部分如灵活接头。通常这种接头长度是几个氨基酸，如长度是1至20个，例如2至10个氨基酸。一种这样的接头是(Glym-Ser)n接头，其中m和n相互独立为1到4。这些在本领域用来使蛋白质结构域彼此连接。因此所述第一组分可与所述第二组分通过这样的接头相连。
优选当第一组分是C4bp核心时，它位于产品的C末端。
本领域存在许多哺乳动物C4bp蛋白质的序列。这些包括人C4bp核心蛋白质(SEQ ID NO：1)。本领域还有许多人C4bp核心蛋白质的同系物。有两类同系物：直向同系物(orthologue)和侧向同系物(paralogue)。直向同系物的定义为不同生物体中的同源性基因，即这些基因具有共同祖先，这一共同祖先与产生这些基因的物种形成事件同时发生。侧向同系物的定义为相同生物体内衍生有基因、染色体或基因组复制的同源基因，即基因的共同祖先从最后一次物种形成事件起出现。
例如，搜索GenBank、原始基因组痕迹(raw genomic trace)以及EST(表达的序列标签)数据库显示了在包括黑猩猩、猕猴、兔、大鼠、狗、马、小鼠、豚鼠、猪和牛内的物种的哺乳动物C4bp核心SEQ ID NO：1同系物蛋白。C4bp SEQ ID NO：1的侧向同系物和直向同系物已经包括在图1中的比对中。
总之，SEQ ID NOs：1-19的比对如图1所示。可以看出，所有19个序列具有高度相似性，尽管在C末端有较大程度的变异。并且，用如BLAST的常用搜索程序，可通过搜索DNA或蛋白质序列的数据库鉴定出C4bp核心蛋白质。
如果在数据库中没有所需的哺乳动物源的C4bp蛋白质，可使用本领域已经有的常规克隆方法得到它。基本上，这项技术包含用编码现有的C4bp核心蛋白质之一的核酸作为探针回收并确定其它目的物种中的C4bp核心蛋白质的序列。对此存在多种技术，例如用合适的基因组DNA或mRNA来源(例如从胚胎中或活跃分裂的分化细胞或肿瘤细胞中)PCR扩增并克隆该基因，或使用包括从哺乳动物获得cDNA文库(例如来自上述来源之一的cDNA文库)的方法，在中度到高度严格度条件(例如0.03M氯化钠和0.03M柠檬酸钠，大约50℃至60℃)用已知的C4bp核酸探测所述文库，并回收编码那种哺乳动物的全部或部分C4bp蛋白质的cDNA。当得到了部分cDNA后，全长编码序列可通过引物延伸技术来确定。
能够形成多聚体的C4bp核心蛋白质的片段可包含至少47个氨基酸，优选至少50个氨基酸。该片段形成多聚体的能力可通过以下方法检测：根据本发明在原核宿主细胞中表达该片段，在可多聚化全部57个氨基酸C4bp核心的条件回收所述C4bp片段，并确定该片段是否也形成多聚体。理想地，C4bp核心的片段包含有SEQ ID NO：1的至少残基6-52或其同系物的对应残基。
也可以使用C4bp核心的变体和能够形成多聚体的片段，所述变体类似保留了形成多聚体的能力(对于片段可如上述测定)。所述变体优选与野生型哺乳动物C4bp核心或其多聚体形成片段有至少70％，更优选至少80％，甚更优选至少90％，例如至少95％或最优选至少98％的序列同一性。
一方面，C4bp核心应该是包含SEQ ID No：1的出现在位置12的甘氨酸、出现在位置28的丙氨酸、出现在位置29、34、36和41的亮氨酸、出现在位置32的酪氨酸、出现在位置33的赖氨酸、以及优选出现在位置6和18的两个半胱氨酸残基的核心。理想地，该变体将会保留在这些残基之间的相对空间距离。
上述指定的同一性程度是相对于SEQ ID NOs：1-20中任一或其可形成多聚体的片段。
最优选所述指定的同一性程度是相对于SEQ ID NO：1或其可形成多聚体的片段。
序列同一性程度可以通过GAP算法确定，该算法是在本领域广泛使用的算法“Wisconsin程序包”的一部分，可从Accelrys(原为Genetics ComputerGroup，Madison，WI)获得。GAP使用Needlema和Wunsch算法以最大化匹配数目和最小化缺口数目的方式来比对两条完整的序列。GAP可用来比对具有相似长度的短的紧密相关序列，因此适合于确定某一序列是否达到上述的同一性水平。GAP可以在默认参数的条件下使用。
哺乳细胞C4bp核心蛋白质的合成变体包含具有在C末端或N末端的一个或更多个氨基酸取代、缺失、插入或添加的变体。取代是最有可能的。取代包括保守取代。保守取代的例子包括对于通常称为Dayhoff组的相似氨基酸的组的那些取代。如下所示：
  第1组   D，E，N，Q
  第2组   I，L，V，M
  第3组   F，Y，W
  第4组   K，R，H
  第5组   S，P，T，A，G
  第6组   C
可以制备并检测其形成多聚体并用作佐剂的能力的C4bp核心蛋白质的片段和变体包括SEQ ID NOs：37到44，如表1所示：
表1：
A B C
  37   ----GCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIEQLELQRDSARQS------   100
  38   ETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIEQLELQRDSARQS------   100
  39   ----GSEQVLTGKRLMQSLPNPEDVKMALEVYKLSLEIEQLELQRDSARQSTLDKEL   96
  40   ETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEIYKLTLEIEQLELQRDSARQSTLDKEL   96
  41   ETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEIYKLSLEIKQLELQRDSARQSTLDKEL   96
  42   ---EGCEQILTGKRLMQCLPDPEDVKMALEIYKLSLEIKQLELQRDRARQSTL----   91
  43   ETPEGCEQVLTGKRLMQCLPNPEDVKMALEVYKLSLEIKQLELQRDRARQSTLDKEL   96
  44   ---EGCEQILTGKRLMQCLPNPEDVKMALEIYKLSLEIEQLELQRDRARQSTLDK--   95
A＝SEQ ID NO，B＝序列，C＝％同一性，参比具有相同长度的SEQ IDNO：1的片段计算。
如果使序列缺失，除了N末端或C末端的截短，优选将缺失限制在不超过1个、2个或3个可以是连续的或不连续的缺失。
如果作插入，或者核心蛋白质序列的N端或C端延伸，理想地数目也应该受限制，以保证核心蛋白质的长度不超过野生型序列长度20个氨基酸以上，优选不超过15个氨基酸，更优选不超过10个氨基酸。因此在SEQ IDNO：1的情况中，经过插入或延长修饰的核心蛋白质，理想地在长度上不超过77个氨基酸。
抗原
抗原是能够被抗体或T细胞受体识别的任何分子。然而，并非所有的抗原都是免疫原。免疫原是引起免疫应答的任何物质。一方面，本发明使不是免疫原的抗原变成免疫原，并使作为弱的免疫原的抗原变成较好的免疫原。
本发明一个重要特征是当将抗原通过与C4bp核心遗传融合而产生时，单体抗原是极优选的，因为它们不会阻碍C4bp核心蛋白质装配成寡聚的因而具有功能的形式。
但是另一方面，当抗原通过化学方法或非共价偶联到C4bp核心蛋白质时，所述抗原可以是非单体的。
因此单体抗原可分为两个主要组：
1)抗原可以是自然状态下是多聚的(二聚的或更高级别的多聚体)的亲本蛋白质的片段或衍生物，但该抗原自身在亲本蛋白质形成多聚体的条件下并不形成多聚体；和
2)自然状态是单体的抗原。
这两种抗原的例子将在下文详细讨论。
单体抗原具有相同点在于，它们可以在单条DNA上编码，并且当这条DNA与编码C4bp核心蛋白质的DNA融合并随后翻译成蛋白质时，该抗原通过抗原上的唯一点与单条C4bp核心蛋白质链相连。这种抗原的简单例子是来自鸡蛋白的溶菌酶。编码全长溶菌酶开放阅读框架的cDNA可以不妨碍所得融合蛋白的C4bp部分的装配的方式与C4bp核心开放阅读框架融合。。
生物合成之后，与C4bp核心融合的单条多肽链将，例如通过蛋白酶，被加工从而在多肽链内部产生新的N末端和C末端。如果通过蛋白水解切割产生的两条或更多条链通过例如二硫键来相互连接，那么C4bp融合蛋白质在加工结束时会与通常不认为是单体的蛋白质相连接。然而，为本发明的目的，这种类型的蛋白质被认为是单体的，因为它们被编码为单个开放阅读架中的单个融合蛋白。这种类型的一个例子是胰岛素原，它在生物合成后被加工成具有称为A和B的两条链，这两条链通过二硫键相连。胰岛素原的片段，称为C肽链，在融合蛋白前体的蛋白水解加工后去除。
所述单体抗原可以来源于在其自然状态下并非必须是单体的蛋白质。因此许多自然中处于多聚体状态的抗原可以被修饰，例如通过蛋白质改造技术，从而它们变成单体的。有三个例子。作为这种抗原的例子是一种来源于流感病毒血凝素蛋白质的抗原。已知该抗原在其自然状态下形成复合的三聚体结构(Wilson等，Nature 289，366-373，1981)。但是，有可能通过去除使该分子三聚体化的卷曲螺旋来得到单体片段。Jeon和Arnon的工作提供一个具体例子(Viral Immunology 15，165-176，2002)。这些作者只使用了血凝素的残基96-261，以得到只包含所述血凝素球状区域的片段。
另一个例子是疟原虫子孢子表面蛋白质1(MSP1)。这个巨大(约200kDa)的蛋白质装饰了造成疟疾感染的血液阶段的子孢子的表面。该蛋白质一般通过C末端GPI锚(其中GPI是糖基化磷脂酰肌醇)固定在子孢子表面。这种GPI锚之前是氨基酸的疏水段。由于这种锚，在自然中发现全长MSP1和称为MSP1.19的C末端片段(即使当子孢子入侵红细胞的时候其仍是膜结合的)都不呈单体状态。具有单个疏水跨膜区域的许多膜蛋白都有同样的情况。本发明最好通过删除所述疏水段来进行。关于MSP1.19蛋白质与C4bp核心蛋白质的融合请见下面的例子描述。
在本发明的一个优选方面，本发明的产品是疟原虫MSP1单体的抗原性片段与C4bp核心蛋白质的融合。所述疟原虫MSP1抗原性片段可包含由约50到约200个，优选约50到约150个氨基酸。所述抗原性片段可以来自任何疟原虫物种，如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、或间日疟原虫(Plasmodium vivax)、或卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、或三日疟原虫(Plasmodium malariae)(这些都能导致人的疾病)或约氏疟原虫。
尽管缺失是获得单体或寡聚体蛋白质的最简单的方法，有些时候突变一个或多个氨基酸就足够了。一个这样的例子是Cpn10，与呈主要同种型的C4bp核心相似，Cpn10蛋白质在它的天然状态是七聚体蛋白质。Cpn10的单个氨基酸的突变使它转变成单体突变体，这使其适合与C4bp核心蛋白质融合(Guidry等，BMC Biochemistry 4，14-26，2003)。另一种使此蛋白质单体化的方法是缺失N末端或C末端的氨基酸，(Llorca等，Biochem.Biophysica Acta1337，47-56，1997；Seale和Horowitz，J.Biol.Chem.270，30268-30270，1995)，从而缺失负责亚基之间的相互作用的区域。
总体来讲，对于那些具有装配成寡聚体结构(例如病毒衣壳蛋白)的强烈倾后，从而破坏与它们融合的C4bp核心蛋白质的装配的蛋白来讲，缺失负责蛋白质蛋白质相互作用的区域或者突变界面的残基的原理可用于得到单体蛋白质。
抗原可以被分为两类，这两类都适用于本发明。第一类是外源抗原，并且包括在传染性生物体中的所有分子。细菌免疫原、寄生虫免疫原以及病毒免疫原都可以用作多肽部分来制备用作疫苗的多聚体或者异多聚体C4bp融合蛋白。
这些免疫原的细菌来源包括引起细菌性肺炎、脑膜炎、霍乱、白喉、百日咳、破伤风、肺结核和麻风病的那些。
寄生虫来源包括疟疾寄生虫，如疟原虫、锥形虫和利什曼原虫种。
病毒来源包括痘病毒，例如天花病毒，牛痘病毒和orf病毒；疱疹病毒，如I型和II型单纯疱疹病毒，B-病毒，水痘-带状疱疹病毒，巨细胞病毒，以及Epstein-Barr病毒；腺病毒，如乳腺腺病毒(mastadenovirus)；乳多空病毒(papovavirus)，如乳头瘤病毒(papillomavirus)如HPV16，以及多瘤病毒(polyomavirus)如BK和JC病毒；微小病毒(parvovirus)，如腺伴随病毒；呼肠孤病毒(reovirus)，如1、2、3型呼肠孤病毒；环状病毒(orbivirus)，如科洛拉多蜱传热；轮状病毒(rotavirus)，如人类轮状病毒；甲病毒属，如东部脑炎病毒以及委内瑞拉脑炎病毒；风疹病毒(rubivirus)，如风疹(rubella)；黄病毒(flavivirus)，如黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，蜱传性(Tick-borne)脑炎病毒，和丙型肝炎病毒；冠形病毒，如人冠形病毒；副粘病毒，例如1，2，3，4型副流感病毒以及腮腺炎；麻疹病毒(morbillivirus)，如麻疹病毒(measles virus)；肺病毒，如呼吸道合胞病毒；水泡性病毒，如水泡性口炎病毒；狂犬病毒(lyssavirus)，如狂犬病毒(rabi virus)；正粘病毒，如A和B型流感；布尼亚病毒(bunyavirus)，如长曲棍球病毒(laCrosse virus)；白蛉病毒(phlebovirus)，如山谷热病毒(Rift Valley fever virus)；纳伊罗病毒(nairovirus)，如刚果出血热病毒；噬肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，如乙型肝炎；沙粒病毒(arenavirus)，如1cm病毒，套锁病毒(lasso virus)以及胡宁病毒(Juninvirus)；逆转录病毒，例如HTLV I，HTLV II，HIV-1和HIV-2；肠道病毒，如1、2、3型脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，艾柯病毒，人类肠道病毒，甲型肝炎病毒，戊型肝炎病毒，诺瓦克病毒(Norwalk-virus)；鼻病毒，如人类鼻病毒；以及纤丝病毒科(filoviridae)，如马尔堡病毒(Marburg virus)及埃博拉病毒(Ebola virus)。
来自这些细菌、病毒以及寄生虫来源的抗原可以用来制备用作疫苗的多聚体蛋白质。所述多聚体可包含带有不同抗原的单体的混合物。
来自这些细菌、病毒以及寄生虫来源的抗原可以被认为是外源性抗原，因为它们一般不存在于宿主中，并且在宿主基因组中是不被编码的。相反，内源性抗原一般存在于宿主中或者在宿主基因组中被编码，或者两者皆有。产生对内源性抗原的免疫应答的能力在治疗携带所述抗原的肿瘤，或者中和针对肿瘤的生长因子中是有用的。第一类同源性抗原的例子就是HER2，其为称为Herceptin的单克隆抗体的靶。第二类生长因子类的内源性抗原的例子是促性腺激素释放激素(称为GnRH)，它对前列腺的一些癌症有营养作用。
用本发明制备的免疫原可用于研究或者治疗目的。例如，研究应用包括产生抗血清来预测在基因组序列数据中的基因产物。此需求应用于原核生物(如细菌)和真核生物(包括真菌和哺乳动物)的基因产物。抗原可以是本领域对于疫苗常用的任何长度，从短肽到很大的蛋白质。
非多肽型免疫原可能是例如糖或者核酸。奈瑟氏种和肺炎链球菌种的多糖外壳是可用于本发明目的的多糖的例子。
当非多肽免疫原是本发明的部分产品时，所述免疫原可以通过常规的合成方法共价连接到所述产品的第一组分。通常，所述免疫原可能连接到包含所述第一组分的C4bp核心蛋白质的N-或C-末端，或者连接到氨基酸侧链基团(例如赖氨酸的ε-氨基或者半胱氨酸的巯基)，或它们的组合。每个融合蛋白可加入一个以上的免疫原。为了辅助偶联，可将半胱氨酸残基加到所述C4bp核心蛋白质，例如作为N-或C-末端。
本发明在产生免疫应答上有很多优势。例如，使用多聚体可以允许若干抗原同时呈递到免疫系统。从而可以制备能引起针对一个以上抗原决定簇的免疫应答的多价疫苗，所述抗原决定簇可在单个或若干不同生物体中存在。
因此，在另一方面，所述单体抗原可能是包含两个不同抗原决定簇的合成抗原，所述抗原决定簇来自两个不同生物体或者来自同一生物体的两种不同蛋白质。后者的例子是子孢子抗原序列的融合物，例如与MSP1序列连接的环子孢子蛋白的两个或更多NANP重复序列。后者的第二个例子是由Neirynck等描述的((Nature Medicine 5，1157-1163，1999))与单体的流感血凝素片段融合的M2e序列。
所以，根据本发明形成的疫苗可以用于针对一种以上疾病的同时接种，或者同时靶向于在已知病原体上的多个抗原决定簇。这些决定簇可能存在于单个的单体单元中或者在组合起来提供异源多聚体的不同的单体单元上。
C4bp核心融合蛋白特别在免疫中是有用的，因为所述核心蛋白质在正常情况下存在于接受免疫者的血清或者血浆中，并且所述核心蛋白质并不引起针对其本身的免疫应答。已知C4bp蛋白质在很多哺乳动物物种中都存在，并且对于哺乳动物物种合适的同系物可以通过标准的基因克隆技术由本领域技术人员发现。
核酸
本发明的产品可以通过用编码所述蛋白质的核酸构建体，在原核生物或真核生物的宿主细胞中表达融合蛋白来制备。如果抗原是多肽，从核酸序列中表达融合蛋白将可以被用来生产本发明的产品。
所以本发明提供编码本发明产品的核酸构建体，通常是DNA或RNA。
所述构建体通常为可复制载体的形式，其中编码所述蛋白质的序列可操作地与适于在理想的宿主细胞中表达所述蛋白的启动子可操作地连接。
可能会给所述载体提供复制起点及可选地启动子的调节物。所述载体可能含有一个或者更多个选择性标记基因。本领域已知有很多这样的真核生物和原核生物的表达载体，并且本发明可以根据本领域技术人员的个人偏好利用任何的载体。
多种原核生物宿主细胞可以用于本发明的方法。这些宿主可包括埃希氏菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、乳杆菌属、嗜热菌属、沙门氏菌属、肠细菌属或链霉菌属的菌株。例如，如果来自埃希氏菌属的大肠杆菌在本发明方法中使用，所用的此细菌的优选菌株包括BL21(DE3)的衍生物，包括C41(DE3)，C43(DE3)或者CO214(DE3)(如WO98/02559所述并且可得)。
甚更优选，缺乏原噬菌体DE3的这些菌株的衍生物在启动子不是T7启动子时可用。
原核生物载体包括载体细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒包括ColEI、pCR1、pBR322、pMB9以及它们的衍生物；更宽的宿主范围的质粒例如RP4；噬菌体DNA，例如λ噬菌体的各种衍生物，例如NM989；以及其它DNA噬菌体，例如M13和丝状的单链DNA噬菌体。可以用标准的重组DNA方法来操纵这些以及其它载体，来引入与启动子可操作连接的本发明的核酸。
所述启动子可能是诱导型启动子。合适的启动子包括T7启动子、tac启动子、trp启动子、λ启动子PL或PR、及其它本领域技术人员公知的启动子。
也可使用多种真核生物宿主细胞，包括例如酵母、昆虫和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞包括CHO和小鼠细胞、非洲绿猴细胞如COS-1、和人细胞。
已知适合表达蛋白质的很多真核生物载体。这些载体可以被设计为通过染色体掺入真核生物细胞基因组或者保留在基因组以外，或只短暂保留在真核细胞中。这些核酸可以可操作地连接到合适的启动子，如有力的病毒启动子(包括CMV启动子)，和SV40 T-抗原启动子或逆转录病毒LTR。
为了得到本发明的产品，携带本发明载体的宿主细胞可在适于表达所述蛋白质的环境中培养，并且从所述培养基的细胞回收所述蛋白质。
细胞培养
编码根据本发明的融合蛋白的质粒可以用常用的转化技术引入宿主细胞中，并在有助于产生所述融合蛋白的条件下培养所述细胞。如果使用诱导型启动子，一开始在缺无所述诱导物时培养所述细胞，然后一旦所述细胞生长到较高密度就加入所述诱导物从而获得最大的蛋白质回收。
细胞培养条件在本领域公知，所述条件可根据同样已知的方法来使用。
尽管WO91/11461认为原核生物宿主细胞可用于制备基于C4bp的蛋白质，但对于此制备没有试验证据。
最近，已经发现和在原核生物表达系统中制备的C4bp核心融合的蛋白质依然保持它们的功能活性。这在WO2004/020639中公开，其内容引入文本作为参考。这些方法可以在本发明融合蛋白的制备中使用。
从培养物中回收蛋白质
一旦所述细胞已生长到可以产生所述蛋白，就可以从所述细胞中回收所述蛋白质。因为我们惊奇地发现，所述蛋白质保持可溶，所述细胞通常被离心沉淀下来并通过超声处理而裂解。例如在更高速(如一小时15,000rpm)的离心后蛋白质级分保持可溶并且此级分依然存留在上清中。
在所述上清蛋白质级分中的融合蛋白可以用标准的蛋白质层析技术的任何合适组合来进一步纯化。我们已经使用离子交换层析然后凝胶过滤层析。其它层析技术如亲和层析也可用。
在一个具体实施方案中，我们发现在裂解物离心后或在任何的其它纯化步骤之后加热上清样品都会有助于回收蛋白质。所述样品可以被加热到约70-80℃约10-30分钟。
根据所述蛋白质的意向用途，所述蛋白质可以用更多的纯化步骤(例如透析)或者浓缩步骤(例如冻干)来处理。
组合物及其用途
根据本发明的产品可以以药物组合物的形式来制备。所述产品会与一或多种药学可接受的载体或者稀释剂一起存在。所述组合物将根据意向用途和产品的给予途径来制备。因此本发明提供了包含多聚体形式的本发明产品以及一或多种药学可接受载体或稀释剂的组合物，以及所述组合物在治疗或预防人或动物受试者的免疫治疗方法中的用途。
药物可接受的载体或者稀释剂包括在适合经口、直肠、经鼻、局部(包括颊和舌下)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内、真皮内，鞘内、硬膜外)给予的配制剂中使用的那些。这些配制剂可方便地以单位剂量形式(dosage form)存在并且可以用在药学领域内公知的任何方法来制备。
液体的药学可给予组合物可以通过，例如通过溶解、分散等本发明融合蛋白及载体中的可选药学佐剂(例如，水、生理盐水葡萄糖溶液、甘油、乙醇以及类似物质)来制备，从而形成溶液或悬液。如果需要的话，要给予的所述组合物也可能包含辅助物质如pH缓冲剂及类似的物质。制备这种剂量形式的实际方法对于本领域技术人员是已知或将是显而易见的。例如见Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，19th Edition，1995。
根据本发明的组合物可另外包含一或多种佐剂，例如矿物质盐类如氢氧化铝或磷酸钙，或者细胞因子如自介素-12或GM-CSF。合适的佐剂的更完整的清单在Singh and O’Hagan，Nature Biotechnology，17，1075-1081，1999的表1中已经给出，其内容引入本文作为参考。
根据本发明的产品，理想地以组合物或配制剂的形式，可通过给予人或动物受试者本产品或其组合物，来用于本文所述的治疗方法。减轻接受治疗的受试者的症状的有效量将由医生根据病人及所治疗的情况来决定。可制备包含范围在0.25-95％的活性成分以及来自无毒载体的配平组成(balancemake up)的剂量形式或者组合物。
肠胃外给药一般是以皮下、肌肉内或者静脉内注射为特征。可注射剂(injectable)可以常用形式来制备，所述常用形式为液体溶液或悬液、适合在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式、或者乳状液。适当的赋形剂是，例如水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或类似物质。一个最近设计的肠胃外给药的途径是植入缓释或者持续释放系统，这样就保持了恒定的剂量水平。见例如美国专利No.3,710,795。
所述产品的剂量将由所述抗原的性质决定，并且可由在常用疫苗配制剂中给予所述抗原的实际操作来决定。
被动免疫
在另一方面，本发明提供了用包含抗体的免疫血清被动免疫受试者的方法，所述免疫血清是通过给宿主受试者接种本发明的产品而获得的。所述宿主受试者可以是人或非人的哺乳动物。所以在另一方面中，本发明提供了通过这种方法获得的免疫血清，以及这种免疫血清在治疗人体或动物体的方法中的用途。
DNA疫苗
在另一方面，本发明提供了包含编码本发明重组融合蛋白产品的核酸序列的真核生物表达载体，该载体用于人体或动物的治疗。
这种治疗可通过引入编码引发免疫应答的抗原的核酸序列来达到其治疗效果。核酸的运输可以用质粒载体(以“裸露的”或配制的形式)或重组表达载体来实现。DNA接种的综述，见Ada G.和Ramshaw I，in Expert Opinionin Emerging Drugs 8，27-35，2003。
很多可以用于基因传递的病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或RNA病毒如逆转录病毒。逆转录病毒载体可以是鼠的或鸟的逆转录病毒的衍生物。可以插入单个外源基因的逆转录病毒的逆转录病毒载体的例子包括但不局限于：Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(MuMTV)、鼠乳腺癌病毒(MuMTV)、和Rous肉瘤病毒(RSV)。当受试者是人的时候，可以使用如长臂猿白血病病毒(gibbon ape leukaemia virus，GaLV)的载体。
所述载体会包含转录调控序列，具体为足以指导RNA合成启动的启动子区域。合适的真核生物启动子包括小鼠的金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer等，1982，J.Molec.Appl.Genet.1：273)；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，1982，Cell 31：355)；SV40早期启动子(Benoist等，1981，Nature290：304)；Rous肉瘤病毒启动子(Gorman等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：6777)；和巨细胞病毒启动子(Foecking等，1980，Gene 45：101)。
将本发明此方面的载体作为质粒载体或者作为病毒载体的一部分给予受试者，可能被很多不同途径影响。质粒DNA可以是裸露的或者用阳离子以及中性的脂类(脂质体)配制或者被微包囊化来作直接或间接的运输。DNA序列也可以被包含在病毒(如腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、痘病毒)载体中，这些载体可以用于直接或间接的运输。运输途径包括但并不局限于经口、肌肉内、真皮内(Sato，Y.et al.，1996，Science 273：352-354)、静脉内、动脉内、鞘内、肝内、吸入、阴道内滴注(Bagarazzi等，1997，J Med.Primatol.26：27)、直肠内、肿瘤内、或腹膜内。
所以，本发明包括作为药学组合物的本文所述载体，其可用于用所述DNA载体转染一些细胞，这样就会表达治疗性多肽并且具有治疗作用，也就是诱导对抗原的免疫应答。根据本发明的药学组合物是通过使根据本发明的构建体成为适于给予受试者的形式(用溶剂、载体、运输系统、赋形剂、和添加剂或辅助剂)来制备的。经常使用的溶剂包括灭菌的水和生理盐水(缓冲的或非缓冲的)。一种载体包括金颗粒，它可以通过生命系统(biolistically)传递(如在气压下)。其它经常使用的载体或运输系统包括阳离子脂质体、螺旋形(cochleate)和微胶囊，这些可以以液体溶液给予、密闭在运输胶囊中、或者掺入食物。
给予基因运输载体的另一种配制剂涉及脂质体。将脂质体包裹提供了给予多核苷酸以及表达载体的另一种配制剂。脂质体是由一个或多个脂质双层环绕的水性区室(compartment)组成的显微囊泡。通常见Bakker-Woudenberg等，1993，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1)：S61，和Kim，1993，Drugs 46：618。脂质体与细胞膜的组成相似，所以结果脂质体可以被安全给予并可生物降解。根据制备方法，脂质体可能是单层的或多层的，并且脂质体可在直径从0.02μM到大于10μM的尺寸变化。见例如Machy等，1987，LIPOSOMES IN CELL BIOLOGY AND PHARMACOLOGY(John Libbey)，和Ostro等，1989，American J.Hosp.Phann.46：1576.中所述。
表达载体可以通过标准技术被包裹在脂质体中。各种各样不同的脂质体组合物以及合成方法是本领域技术人员公知的。见例如US-A-4,844,904，US-A-5,000,959，US-A-4,863,740，US-A-5,589,466，US-A-5,580,859，和US-A-4,975,282，这些都引入本文作为参考。
通常，脂质体包裹的载体的给予剂量将随病人的年龄、体重、身高、性别、一般医疗状态以及之前的医疗历史等因素而变化。具体配制剂的剂量范围可以通过使用合适的动物模型来确定。
本发明可以通过以下的实施例来阐明。
实施例1-恶性疟原虫MSP1.19-兔C4bp的融合蛋白。
这个实施例阐明了单体抗原(包含恶性疟原虫MSP1的氨基酸1567-1661)与兔核心C4bp蛋白质的融合。这个融合蛋白叫做AVD174，在细菌株C41(DE3)中表达并从中纯化。所述融合蛋白本身可不需要添加任何佐剂单独免疫兔子。
克隆
编码MSP1蛋白质残基1567-1661的合成的294bp DNA片段，用NdeI和BamHI消化，并且连接到已经用NdeI和BamHI消化的pAVD181。这样就形成编码95个氨基酸的MSP1.19蛋白片段的开放阅读框架与在T7晚期启动子下游的兔C4bpα链的C末端57个残基融合。通过DNA测序来检查这个称为pAVD174的构建物。
编码AVD174融合蛋白的核苷酸序列是：
atgttaaacatttcccagcaccagtgcgttaagaaacagtgcccgcagaa
ctctggttgtttccgtcatctggacgagcgtgaagagtgcaaatgtctgc
tgaactacaaacaggaaggtgataaatgtgttgagaacccaaacccgacc
tgtaacgaaaacaacggcggttgtgacgctgatgctaaatgcaccgagga
agacagcggttctaacggtaagaaaatcacctgcgagtgtactaaaccgg
actcctacccgctgttcgacggtatcttttgctccGGATCCGAGGTCCCG
GAAGGCTGTGAGCAGGTGCAAGCGGGTCGCCGTCTCATGCAGTGTCTCGC
AGACCCATACGAAGTGAAAATGGCCCTGGAGGTCTACAAGCTGTCTCTGG
AGATTGAACTCCTGGAACTGCAGCGCGATAAGGCACGTAAAAGCTCTGTG
CTGCGCCAGCTGTAA(SEQ ID NO：21)
这个构建体编码的融合蛋白AVD174的氨基酸序列如下：
MLNISQHQCV KKQCPQNSGC FRHLDEREEC KCLLNYKQEG DKCVENPNPT
CNENNGGCDA DAKCTEEDSG SNGKKITCEC TKPDSYPLFD GIFCSGSEVP
EGCEQVQAGR RLMQCLADPY EVKMALEVYK LSLEIELLEL QRDKARKSSV
LRQL(SEQ ID NO：22)
SEQ ID NO：22的残基1-95对应于恶性疟原虫MSP1(单体抗原)的残基1567-1661，并且SEQ ID NO：22的残基98-154对应于兔C4bp核心蛋白质的57个残基。GS接头序列出现在这两个组分之间。
所述蛋白质的大约分子量为17,319道尔顿，理论pI为5.05。
表达
使编码恶性疟原虫-兔C4bp核心蛋白质的质粒pAVD174在大肠杆菌菌株C41(DE3)中表达。转化的细胞在LB培养基中于37℃生长到OD600大约为0.6，然后加入IPTG至终浓度0.5mM诱导表达，并使所述培养物在37℃再生长三个小时，然后通过离心来收获所述细胞。
AVD174融合蛋白的纯化
从1升的C41(DE3)细胞中纯化蛋白质AVD174。在含有20mM的MESpH6.5以及5mM EDTA的缓冲液中通过超声处理来裂解细胞后，所有的融合蛋白都发现在可溶级分中。离心后的上清上样于HitrapS柱子。
阳离子柱(HiTrap S)
在20mM MES pH6.5，20mM EDTA缓冲液(缓冲液A)中平衡柱子。所述蛋白质用10个柱体积的梯度从缓冲液A到缓冲液B(缓冲液A加0.5MNaCl)来洗脱。AVD174在大约200mM NaCl的浓度被洗脱。
包含AVD174的HiTrapS级分用Millipore浓缩器(截断值30K)浓缩，然后上样到凝胶过滤柱。
凝胶过滤柱(Superdex 200 26/60 prep grade)
用20mM pH8.0的Tris缓冲液，150mM NaCl平衡Superdex 200 26/60柱子，然后上样来自HiTrapS级分的浓缩的AVD174蛋白质。
所述蛋白质在两个峰被洗脱。正确折叠并且装配的蛋白质在156mls被洗脱，而在120mls洗脱的较早的次要的峰并不是正确装配或折叠的。
生物物理性质
含有二硫键((存在于除了鼠之外在所有的核心蛋白质除了鼠源的核心蛋白，见图1))的C4bp融合蛋白的寡聚体状态可以简单地通过比较存在或不存在还原剂β巯基乙醇((BME))的SDS-PAGE凝胶中所述蛋白质的行为来检查。在不存在BME的情况下AVD177蛋白的表观大小约为140KDa，然而在BME存在的情况下它被还原了，分析其表观分子量刚超过20KDa。
质谱
AVD147蛋白质在被β巯基乙醇还原并用N-乙基马来酰亚胺(NEM)烷基化后通过电子喷射质谱进行检测。结果显示将14个NEM分子加入((每个125Da))分子量被确定为19,072Da蛋白质。
内毒素水平
纯化蛋白质中的内毒素水平用LAL((鲎变形细胞裂解物))试剂盒形式Biowhittaker测定为每微克蛋白质21EU。
实施例2-恶性疟原虫falciparumMSP1.19蛋白与-人C4bp蛋白的融合蛋白。
这个实施例阐明了单体抗原(包含疟原虫falciparum恶性疟原虫MSP1的氨基酸1567-1661)与人C4bp核心蛋白核心蛋白质的融合。这种融合蛋白在细菌株C41(DE3)中表达并从中纯化。所述融合蛋白本身可不需要添加任何佐剂单独免疫人。
克隆
编码MSP1蛋白质残基1567-1661的一个合成的的294个碱基对bp的DNA片段，编码MSP1的1567-1661段氨基酸被用NdeI和BamHI消化酶切，并且连接到已经用NdeI和BamHI消化被这两个酶切好的pAVD181质粒。这样就形成的开放的可读框编码95个氨基酸的MSP1.19蛋白片段的开放阅读框架融合到与在T7晚期启动子下游的人子的C4bp的α链的碳C末端的57个残基融合，在T7晚期启动字的下游。通过DNA测序来检查这个称为pAVD177的构建体被叫做PAVD174，通过DNA测序证明其可靠性。
编码AVD177融合蛋白的核算核苷酸序列是：
atgttaaacatttcccagcaccagtgcgttaagaaacagtgcccgcagaa
ctctggttgtttccgtcatctggacgagcgtgaagagtgcaaatgtctgc
tgaactacaaacaggaaggtgataaatgtgttgagaacccaaacccgacc
tgtaacgaaaacaacggcggttgtgacgctgatgctaaatgcaccgagga
agacagcggttctaacggtaagaaaatcacctgcgagtgtactaaaccgg
actcctacccgctgttcgacggtatcttttgctccGGATCCgagaccccc
gaaggctgtgaacaagtgctcacaggcaaaagactcatgcagtgtctccc
aaacccagaggatgtgaaaatggccctggaggtatataagctgtctctgg
aaattgaacaactggaactacagagagacagcgcaagacaatccactttg
gataaagaactataa(SEQ ID NO：23)
这个构建体编码的融合蛋白AVD177的氨基酸序列如下：
MLNISQHQCV KKQCPQNSGC FRHLDEREEC KCLLNYKQEG DKCVENPNPT
CNENNGGCDA DAKCTEEDSG SNGKKITCEC TKPDSYPLFD GIFCSGSETP
EGCEQVLTGK RLMQCLPNPE DVKMALEVYK LSLEIEQLEL QRDSARQSTL
DKEL(SEQ ID NO：24)
SEQ ID NO：24的残基1-95对应于疟原虫falciparum恶性疟原虫MSP1(单体抗原)的残基1567-1661，并且SEQ ID NO：序列号24的残基98-154对应号氨基酸残基与于人子的C4bp核心蛋白核心蛋白质相的57个残基对应。一个GS连接头序列出现在这两个成分组分之间。
这个所述蛋白质的大约分子量为17,261道尔顿，理论等电点pI为4.72。
表达
蛋白质的表达如图2所示。该图中显示了AVD77蛋白质在未诱导(U)或者在37℃或30℃诱导后在三种不同的细菌株C41(DE3)，BL21(DE3)和C43(DE3)中表达的SDS-PAGE凝胶。所述凝胶上的泳道如下：
泳道1：分子量标记(由上到下66，60，46，36，28，20，14，12，6KDa)
泳道2：C41(DE3)诱导前
泳道3：C41(DE3)37℃诱导后三小时
泳道4：C41(DE3)30℃诱导后三小时
泳道5：BL21(DE3)诱导前
泳道6：BL21(DE3)37℃诱导后三小时
泳道7：BL21(DE3)30℃诱导后三小时
泳道8：C43(DE3)诱导前
泳道9：C43(DE3)37℃诱导后三小时
泳道10：C43(DE3)30℃诱导后三小时
可以看出，在C41(DE3)和菌株C41(DE3)中获得了好的表达。相反，在被测条件下，在菌株BL21(DE3)中没有发现表达(见图2)。在30℃和37℃在LB培养基中生长培养物到光密度(OD600)约为0.6，然后加入IPTG至终浓度0.5mM的来诱导表达。
AVD177融合蛋白的纯化
从在37℃诱导后生长3小时的1升C41(DE3)细胞中纯化蛋白质AVD177。在细菌沉淀裂解后，所有的融合蛋白都存在于可溶级分中。在包含20mM MES pH6.5和5mM EDTA的缓冲液中，通过超声处理来裂解细胞。离心后的上清上样至MonoS柱。
阳离子柱(Mono S HR 10/10)
在20mM MES pH 6.5，20mM EDTA缓冲液(缓冲液A)中平衡柱子。所述蛋白质用从缓冲液A到缓冲液B的10个柱体积的梯度来洗脱，缓冲液B是缓冲液A加0.5M NaCl。AVD177在大约200mM NaCl的浓度被洗脱。
含有AVD177的MonoS级分用Millipore浓缩器(截断30K)浓缩，然后上样至凝胶过滤柱。
凝胶过滤柱(Superdex 200 26/60 prep grade)
用20mM pH 8.0的Tris缓冲液(pH8.0)，150mM氯化钠NaCl平衡Superdex 200 26/60柱子，然浓缩后上样的通过来自MonoS级分的浓缩的AVD177蛋白质。
所述蛋白质洗脱有在两个峰被洗脱。正确折叠并且聚集装配的蛋白质在150mls时被洗脱，而在115mls洗脱的较早的次要的峰不是正确装配或折叠的。
生物物理性质
含有二硫键(存在于除了鼠之外所有的核心蛋白质，见图1)的C4bp融合蛋白的寡聚体状态可以简单地通过比较存在或不存在还原剂β巯基乙醇(BME)的SDS-PAGE凝胶中所述蛋白质的行为来检查。在不存在BME的情况下AVD177蛋白的表观大小约为140KDa，然而在BME存在的情况下它被还原了，分析其表观分子量刚超过20KDa。
质谱
AVD147蛋白质在被β巯基乙醇还原并用N-乙基马来酰亚胺(NEM)烷基化后通过电子喷射质谱进行检测。结果显示将14个NEM分子加入(每个125Da)分子量被确定为19,072Da蛋白质。
内毒素水平
纯化蛋白质中的内毒素水平用LAL(鲎变形细胞裂解物)试剂盒形式Biowhittaker测定为每微克蛋白质21EU。
实施例2-恶性疟原虫MSP1.19-人C4bp的融合蛋白。
这个实施例阐明了单体抗原(包含恶性疟原虫MSP1的氨基酸1567-1661)与人C4bp核心蛋白质的融合。这种融合蛋白在细菌株C41(DE3)中表达并从中纯化。所述融合蛋白本身可不需要添加任何佐剂单独免疫人。
克隆
编码MSP1蛋白质残基1567-1661的合成的294bp DNA片段，用NdeI和BamHI消化，并且连接到已经用NdeI和BamHI消化的pAVD181。这样就形成编码95个氨基酸的MSP1.19蛋白片段的开放阅读框架与在T7晚期启动子下游的人C4bpα链的C末端57个残基融合。通过DNA测序来检查这个称为pAVD177的构建体。
编码AVD177融合蛋白的核苷酸序列是：
atgttaaacatttcccagcaccagtgcgttaagaaacagtgcccgcagaa
ctctggttgtttccgtcatctggacgagcgtgaagagtgcaaatgtctgc
tgaactacaaacaggaaggtgataaatgtgttgagaacccaaacccgacc
tgtaacgaaaacaacggcggttgtgacgctgatgctaaatgcaccgagga
agacagcggttctaacggtaagaaaatcacctgcgagtgtactaaaccgg
actcctacccgctgttcgacggtatcttttgctccGGATCCgagaccccc
gaaggctgtgaacaagtgctcacaggcaaaagactcatgcagtgtctccc
aaacccagaggatgtgaaaatggccctggaggtatataagctgtctctgg
aaattgaacaactggaactacagagagacagcgcaagacaatccactttg
gataaagaactataa(SEQ ID NO：23)
这个构建体编码的融合蛋白AVD177的氨基酸序列如下：
MLNISQHQCV KKQCPQNSGC FRHLDEREEC KCLLNYKQEG DKCVENPNPT
CNENNGGCDA DAKCTEEDSG SNGKKITCEC TKPDSYPLFD GIFCSGSETP
EGCEQVLTGK RLMQCLPNPE DVKMALEVYK LSLEIEQLEL QRDSARQSTL
DKEL(SEQID NO：24)
SEQ ID NO：24的残基1-95对应于恶性疟原虫MSP1(单体抗原)的残基1567-1661，并且SEQ ID NO：24的残基98-154对应于人C4bp核心蛋白质的57个残基。GS接头序列出现在这两个组分之间。
所述蛋白质的大约分子量为17,261道尔顿，理论pI为4.72。
表达
蛋白质的表达如图2所示。该图中显示了AVD77蛋白质在未诱导(U)或者在37℃或30℃诱导后在三种不同的细菌株C41(DE3)，BL21(DE3)和C43(DE3)中表达的SDS-PAGE凝胶。所述凝胶上的泳道如下：
泳道1：分子量标记(由上到下66，60，46，36，28，20，14，12，6KDa)
泳道2：C41(DE3)诱导前
泳道3：C41(DE3)37℃诱导后三小时
泳道4：C41(DE3)30℃诱导后三小时
泳道5：BL21(DE3)诱导前
泳道6：BL21(DE3)37℃诱导后三小时
泳道7：BL21(DE3)30℃诱导后三小时
泳道8：C43(DE3)诱导前
泳道9：C43(DE3)37℃诱导后三小时
泳道10：C43(DE3)30℃诱导后三小时
可以看出，在C41(DE3)和菌株C41(DE3)中获得了好的表达。相反，在被测条件下，在菌株BL21(DE3)中没有发现表达(见图2)。在30℃和37℃在LB培养基中生长培养物到光密度(OD600)约为0.6，然后加入IPTG至终浓度0.5mM的来诱导表达。
AVD177融合蛋白的纯化
从在37℃诱导后生长3小时的1升C41(DE3)细胞中纯化蛋白质AVD177。在细菌沉淀裂解后，所有的融合蛋白都存在于可溶级分中。在包含20mM MES pH6.5和5mM EDTA的缓冲液中，通过超声处理来裂解细胞。离心后的上清上样至MonoS柱。
阳离子柱(Mono S HR 10/10)
在20mM MES pH 6.5，20mM EDTA缓冲液(缓冲液A)中平衡柱子。所述蛋白质用从缓冲液A到缓冲液B的10个柱体积的梯度来洗脱，缓冲液B是缓冲液A加0.5M NaCl。AVD177在大约200mM NaCl的浓度被洗脱。
含有AVD177的MonoS级分用Millipore浓缩器(截断30K)浓缩，然后上样至凝胶过滤柱。
凝胶过滤柱(Superdex 200 26/60 prep grade)
用20mM pH 8.0的Tris缓冲液，150mM NaCl平衡Superdex 200 26/60柱子，然后上样来自MonoS级分的浓缩的AVD177蛋白质。
所述蛋白质在两个峰被洗脱。正确折叠并且装配的蛋白质在150mls时被洗脱，而在115mls洗脱的较早的次要的峰不是正确装配或折叠的。
生物物理性质
包含二硫键(存在于除鼠之外所有的核心蛋白质，见图1)的C4bp融合蛋白的寡聚体状态可以容易地通过比较在存在或不存在还原剂β巯基乙醇(BME)的SDS-PAGE凝胶中所述蛋白质的行为来检查。结果见图3所示，其中显示了SDS-PAGE凝胶，其显示了在还原条件下(左，+BME)和非还原条件下(右，-BME)分析的AVD177蛋白通过分子量标记来区分(从上至下依次为：66，60，46，36，28，20，14，12，6kDa)。从图3可见，在不存在BME情况下，AVD177蛋白质的表观大小约为140kDa，而在BME存在的情况下它被还原了，分析其表观分子量刚超过20KDa。
质谱
AVD177蛋白被BME还原并经N-乙基马来酰胺(NEM)烷基化后，通过电子喷射质谱来检查。结果显示，将14个NEM分子(每个125Da)加入其分子量被确定为19,015Da的蛋白质。
内毒素水平
纯化蛋白质的内毒素水平用Biowhittaker的LAL(鲎变形细胞裂解物)检测试剂盒确定为每毫克蛋白质38EU。
实施例3-突变的恶性疟原虫MSP1.19-兔C4bp融合蛋白
通过例子，这里描述了第二个恶性疟原虫MSP1.19-兔C4bp蛋白质。它的主要区别在于与pAVD174和pAVD177对于单体抗原基因的具密码子利用不同，并且也包含三个氨基酸改变(见Uthaipibull等，J Mol Biol.307，1381-1394，2001的描述)。这种融合蛋白被称作AVD178。
编码AVD178融合蛋白的核苷酸序列为：
atgctgaatatttcccagcaccagtgcgtaaagaaacagtgtcctcagaa
ctctggttgcttccgccatctggacgaacgcgaatattgcaaatgccgtc
tgaactacaaacaggaaggtgacaagtgcgttctgaacccgaacccaact
tgtaacgagaacaacggtggctgcgatgctgatgctaaatgcactgaaga
agacagcggttctaacggcaaaaaaatcacctgcgagtgcaccaaaccgg
acagctatccgctgttcgacggcattttttgttctggatccGAGGTCCCG
GAAGGCTGTGAGCAGGTGCAAGCGGGTCGCCGTCTCATGCAGTGTCTCGCAGACCCATACGAA
GTGAAAATGGCCCTGGAGGTCTACAAGCTGTCTCTGGAGATTGAACTCCTGGAACTGCAGCGC
GATAAGGCACGTAAAAGCTCTGTGCTGCGCCAGCTGTAA(SEQ ID NO：25)
此构建体编码的融合蛋白AVD178的氨基酸序列如下：
MLNISQHQCVKKQCPQNSGCFRHLDEREYCKCRLNYKQEGDKCVLNPNPTCNENNGGCDADAK
CTEEDSGSNGKKITCECTKPDSYPLFDGIFCSGSEVPEGCEQVQAGRRLMQCLADPYEVKMAL
EVYKLSLEIELLELQRDKARKSSVLRQL(SEQ ID NO：26)
三个突变的氨基酸为粗体并划了下划线。
SEQ ID NO：25的残基1-95对应于带三个突变的恶性疟原虫MSP1(单体抗原)的残基1567-1661，并且SEQ ID NO：24的残基98-154对应于兔C4bp核心蛋白质的57个残基。GS接头序列出现在这两个组分之间。
AVD178的表达，纯化和表在
此过程基本上与AVD174和AVD177蛋白所描述的。从HiTrapS柱洗脱是在大约200mM。在凝胶过滤中，所述寡聚体蛋白质在159mls体积时被洗脱。质谱中，每个单体上带14个NEM残基时分子量为19,133Da。内毒素水平被测量为每毫克蛋白质58EU。
实施例4-约氏疟原虫MSP1.19-鼠C4bp融合蛋白
克隆
如下制备AVD108蛋白：编码MSP1.19的合成DNA片段和来自约氏疟原虫的部分MSP1.33，作为NdeI-BamHI片段被克隆到鼠C4bpα链的C末端54个氨基酸的上游。
编码融合蛋白AVD108的核苷酸序列如下：
ATGAGATCTCACATTGCCTCTATTGCTTTGAACAACTTGAACAAGTCTGG
TTTGGTAGGAGAAGGTGAGTCTAAGAAGATTTTGGCTAAGATGCTGAACA
TGGACGGTATGGACTTGTTGGGTGTTGACCCTAAGCATGTTTGTGTTGAC
ACTAGAGACATTCCTAAGAACGCTGGATGTTTCAGAGACGACAACGGTAC
TGAAGAGTGGAGATGTTTGTTGGGTTACAAGAAGGGTGAGGGTAACACCT
GCGTTGAGAACAACAACCCTACTTGCGACATCAACAACGGTGGATGTGAC
CCAACCGCCTCTTGTCAAAACGCTGAATCTACCGAAAACTCCAAGAAGAT
TATTTGCACCTGTAAGGAACCAACCCCTAACGCCTACTACGAGGGTGTTT
TCTGTTCTTCTTCCGGATCCGAGGCCTCTGAAGACCTTAAGCCTGCGCTT
ACAGGCAACAAGACCATGCAGTATGTGCCAAATTCACACGATGTGAAAAT
GGCTCTGGAGATCTACAAGCTGACTCTGGAGGTTGAACTACTACAGCTCC
AGATACAAAAGGAGAAACACACTGAAGCACACTAA(SEQ ID NO：27)
蛋白质AVD108的氨基酸序列如下：
MRSHIASIAL NNLNKSGLVG EGESKKILAK MLNMDGMDLL GVDPKHVCVD TRDIPKNAGC
FRDDNGTEEW RCLLGYKKGE GNTCVENNNP TCDINNGGCD PTASCQNAES TENSKKIICT
CKEPTPNAYY EGVFCSSSGS EASEDLKPAL TGNKTMQYVP NSHDVKMALE IYKLTLEVEL
LQLQIQKEKH TEAH(SEQ ID NO：28)
SEQ ID NO：28的残基3-138对应于约氏疟原虫MSP1(单体抗原)的残基1619-1753，并且SEQ ID NO：28的残基141-194对应于兔C4bp核心蛋白质的54个残基。GS接头序列出现在这两个组分之间，短的编码限制性位点的序列位于第一组分之前。
AVD108的表达
在大肠杆菌菌株C41(DE3)中表达AVD108蛋白质。在37℃于LB培养基中生长三升培养物至光密度(OD600)约为0.6，然后加入IPTG至终浓度为0.7mM的来诱导表达。诱导后四小时，离心收获所述细胞。在缓冲液A(50mMTris pH 9，5mM EDTA)中裂解所述细胞，通过离心除去细胞碎片。
AVD108的纯化和表征
用四个柱层析步骤来纯化AVD108蛋白。在第一步阴离子交换层析步骤中使用DEAE HR16/10柱。将所述蛋白质加到缓冲液A中，并在缓冲液B(缓冲液A加1M NaCl)的梯度中被洗脱。AVD108在180-300mM NaCl之间的宽的峰中被洗脱。
在第二步疏水相互作用层析步骤中，将包含来自DEAE柱的AVD108的集中级分上样至Macro-Prep苯基琼脂糖柱，在1M到0M NaCl的下降的盐梯度中被洗脱。在最后两步层析步骤中，AVD108蛋白质在Superdex S20026/60柱通过凝胶过滤纯化。首先，通过加入终浓度为8M的尿素来变性所述蛋白质，在4℃温育过夜。单体在203mls体积处从此柱洗脱。通过在4℃相对于缓冲液H(20mM Tris pH 7.5，150mM NaCl)透析过夜来复性后，在上样到相同柱之前，在缓冲液H中平衡。现在在164mls体积处洗脱寡聚体。通过质谱，确定质量为21,257Da。通过Biowhittaker的LAL检测试剂盒测得的内毒素水平为每毫克蛋白质4EU。
实施例5-用恶性疟原虫MSP1.19-兔C4bp融合蛋白来免疫
免疫
用如实施例1中所述制备的AVD174蛋白质来免疫三只新西兰白兔(NZW)。免疫方案如下：每只兔子以两周的间隔接受四次注射(也就是说，在第0，14，28和42天)。每次注射是皮下的，其包含在缓冲的等渗盐水溶液中的345微克(或20毫微摩尔)蛋白质，而不加入任何已知佐剂。
平行地，用弗氏佐剂中的212微克(或20毫微摩尔)的AVD172蛋白质来免疫三只NZW兔。AVD172与AVD174相同，但缺少兔C4bp的C末端57个氨基酸。AVD172具有如下氨基酸序列：
MLNISQHQCV KKQCPQNSGC FRHLDEREEC KCLLNYKQEG DKCVENPNPT CNENNGGCDA
DAKCTEEDSG SNGKKITCEC TKPDSYPLFD GIFCS(SEQ ID NO：29)。
免疫方案如下：每只兔子以两周的间隔接受四次注射(也就是说，在第0，14，28和42天)。对每只兔子的第一次注射用完全弗氏佐剂通过真皮内给予，而随后的三次用不完全弗氏佐剂中通过皮下给予。
抗体滴度
在最后一次注射后一周(即第63天)抗恶性疟原虫子孢子表面MSP1的抗体滴度，用在丙酮固定的恶性疟原虫感染的红细胞涂片上的间接免疫荧光来测定(如Ling等，Vaccine 15，1562-1567，1997对于约氏疟原虫所述)。
在用AVD174蛋白质免疫的兔子中的两个最高滴度为1/81,920。在用弗氏佐剂中的AVD172蛋白质免疫的兔子中，两个最高滴度为1/20,480。
这证明将单体抗原与C4bp核心融合比给予弗氏佐剂中的相同的单体抗原能诱导更高的免疫滴度。
产生抗体的表征
抗体的高滴度并不足以预防或治疗感染，众所周知抗原免疫产生的抗体的特异性至关重要。Guevara Patino等，(J.Exp.Med.186，1689-1699，1997)已经详细介绍了检测针对MSP1.19的封闭型和抑制型抗体的方法。这些方法用于检测是否有抑制型抗体的存在(所述抗体十分有用，因为它们能阻断MSP1.42加工为MSP1.33和MSP1.19从而预防红细胞被感染)。
抑制型抗体仅仅在AVD174蛋白质诱导的抗体中被发现。它们无一在用AVD172蛋白质免疫的兔子的抗血清中被发现。相反，弗氏佐剂中的AVD172蛋白质，正如人的天然疟疾感染一样，能诱导封闭型抗体并且是有害的(见Guevara Patino等，如上所述)。
实施例6-用约氏疟原虫MSP1.19-鼠C4bp融合蛋白来免疫
免疫小鼠
用如实施例5所述制备的AVD108蛋白质来免疫六只BALB/c小鼠。不使用佐剂，所述蛋白质在缓冲的等渗盐溶液中。每次注射使用40微克(1.9毫微摩尔)蛋白质。以4周的间隔(也就是说，在第0，28和56天)皮下注射每只小鼠三次。平行地，用23微克(也是1.9毫微摩尔)AVD183蛋白质免疫六只BALB/c小鼠，这种蛋白质与AVD108相同，但缺少鼠C4bp的C末端的54个氨基酸(即它仅是约氏疟原虫MSP1.19蛋白质)。每次注射使用23微克此蛋白质(与AVD108使用相同的缓冲等渗盐水溶液)。在第0，28和56天皮下注射每只小鼠三次。
抗体滴度
在最后一次注射后两周(即第70天)抗约氏疟原虫子孢子表面MSP1的抗体滴度，通过在丙酮固定的约氏疟原虫感染的红细胞涂片上的间接免疫荧光来测定(描述如Ling等，Vaccine 15，1562-1567，1997)。
结果显示，六只免疫AVD108蛋白的小鼠中有5只抗体滴度为1/40,960，第六只小鼠滴度为1/10,240。与此相反，以1/80稀释免疫AVD183蛋白的小鼠中没有一只检测到针对MSP1的抗体。这证明将单体MSP1.19抗原融合至C4bp核心会使所获得的抗原的滴度增高最高达500倍。
寄生虫攻击
用致死剂量的5,000个约氏疟原虫感染的红细胞来攻击如上所述免疫的两组各六只小鼠。此项检测已被Ling等(如上所述)描述过。所述六只用AVD183蛋白质免疫过的小鼠在寄生虫攻击后7天内全部死亡。另一方面，六只用AVD108免疫过的小鼠中的五只存活，并且其血液中没有寄生虫存在(如显微镜检的薄血涂片的吉姆萨染色所评估)。第六只小鼠，在第70天具有滴度1/10,240，它在攻击后19天死亡；在第19天通过吉姆萨染色可见此小鼠超过70％的红细胞被感染。
总之，攻击实验证明，用在不存在任何已知佐剂时与C4bp核心蛋白质融合的单体抗原来免疫，能保护不被致死性的疟原虫感染。目前已相信，这是第一例用单个蛋白而无任何已知佐剂伴随来对抗疟原虫感染的成功接种。
实施例7-流感血凝素-C4bp融合蛋白
这个实施例证明了单体抗原(包含流感病毒A的HA1血凝素蛋白质的残基91-261)与人、兔和鼠的核心C4bp蛋白质的融合。正常情况下，全长HA1在病毒体细胞表面装配成三聚体，因此只用此肽片段就能有效地将其转变为单体抗原。这些称为AVD272到AVD274的融合蛋白在细菌菌株C41(DE3)中表达并从其纯化。这些融合蛋白单独被用于免疫小鼠和兔而不添加任何佐剂。
AVD272中，HA1片断(如Jeon和Arnon，Viral Immunology，15，165-176，2002所述)与鼠C4bp支架融合。
AVD272的氨基酸序列如下：
kafsncypyd vpdyaslrsl vassgtlefi tegftwtgvt qnggsnackr
gpgsgffsrl nwltksgsty pvlnvtmpnn dnfdklyiwg ihhpstnqeq
tslyvqasgr vtvstrrsqq tiipnigsrp wvrglssris iywtivkpgd
vlvinsngnl iaprgyfkmr GSEASEDLKP ALTGNKTMQY VPNSHDVKMA
LEIYKLTLEV ELLQLQIQKE KHTEAH(SEQ ID NO：30)
AVD273中，HA1片段与兔C4bp支架融合。
AVD273的氨基酸序列如下：
kafsncypyd vpdyaslrsl vassgtlefi tegftwtgvt qnggsnackr
gpgsgffsrl nwltksgsty pvlnvtmpnn dnfdklyiwg ihhpstnqeq
tslyvqasgr vtvstrrsqq tiipnigsrp wvrglssris iywtivkpgd
vlvinsngnl iaprgyfkmr GSEVPEGCEQ VQAGRRLMQC LADPYEVKMA
LEVYKLSLEI ELLELQRDKA RKSSVLRQL(SEQ ID NO：31)
AVD274中，HA1片段与人C4bp支架融合。
AVD274的氨基酸序列如下：
kafsncypyd vpdyaslrsl vassgtlefi tegftwtgvt qnggsnackr
gpgsgffsrl nwltksgsty pvlnvtmpnn dnfdklyiwg ihhpstnqeq
tslyvqasgr vtvstrrsqq tiipnigsrp wvrglssris iywtivkpgd
vlvinsngnl iaprgyfkmr GSETPEGCEQ VLTGKRLMQC LPNPEDVKMA
LEVYKLSLEI EQLELQRDSA RQSTLDKEL(SEQ ID NO：32)
用不加入任何佐剂的AVD272蛋白质(2毫微摩尔)以两周的间隔(即在第0，14和28天)皮下免疫小鼠三次，显示了可观的抗体滴度(如Jeon等上述确定)，以及针对5LD50剂量的小鼠适应性A/PR/8/34菌株的致命攻击的明显保护作用。
实施例8-流感M2肽-C4bp融合蛋白
这个实施例阐明单体抗原(包含流感病毒A的M2蛋白质的残基2-24，胞外部分)到人、兔和鼠的核心C4bp蛋白质的融合。正常情况下，全长M2被装配成在病毒体和被感染的细胞内的四聚体，因此只用此肽片段会有效地将其转变为单体抗原。这些命名为AVD275到AVD278的融合蛋白在菌株C41(DE3)中表达并从其纯化。这些融合蛋白自身被用于免疫小鼠和兔而不加任何佐剂。
AVD275中，胞外M2肽(如Neirynck等Nature Medicine 5，1157-1163，1999所述)与鼠C4bp支架融合。
AVD275的氨基酸序列如下：
SLLTEVETPI RNEWGCRCND SSDGSEASED LKPALTGNKT MQYVPNSHDV KMALEIYKLT
LEVELLQLQI QKEKHTEAH(SEQ ID NO：33)
AVD276中，胞外M2肽与兔C4bp支架融合。
AVD276的氨基酸序列如下：
SLLTEVETPI RNEWGCRCND SSDGSEVPEG CEQVQAGRRL MQCLADPYEV KMALEVYKLS
LEIELLELQR DKARKSSVLR QL(SEQ ID NO：34)
AVD277中，胞外M2肽与人C4bp支架融合。
AVID277的氨基酸序列如下：
SLLTEVETPI RNEWGCRCND SSDGSETPEG CEQVLTGKRL MQCLPNPEDV KMALEVYKLS
LEIEQLELQR DSARQSTLDK EL(SEQ ID NO：35)
AVD278中，其中两个半胱氨酸被丝氨酸残基取代的胞外M2肽的变体与人C4bp支架融合。
AVD278的氨基酸序列如下：
SLLTEVETPI RNEWGSRSND SSDGSETPEG CEQVLTGKRL MQCLPNPEDV KMALEVYKLS
LEIEQLELQR DSARQSTLDK EL(SEQ ID NO：36)
用不加入任何佐剂的AVD275蛋白质(2毫微摩尔)以两周的间隔(即第0，14和28天)皮下免疫小鼠三次，显示了可观的抗体滴度(基本如Neirynck等上述确定)，以及针对5LD50剂量的小鼠适应性A/PR/8/34菌株的致命攻击的明显保护作用。

Claims (38)

1.一种产品，其包含：
C4bp核心蛋白质；和
单体抗原。
2.根据权利要求1的产品，其中所述C4bp核心由SEQ ID NO：1的残基1-57或其同系物的对应残基，或者SEQ ID NO：1或其同系物的至少47个氨基酸的片段组成。
3.根据权利要求2的产品，其中所述同系物是SEQ ID NO：2-20中的任意一种。
4.根据权利要求2或3的产品，其中所述同系物是与SEQ ID NO：1-20中任意一种具有至少70％氨基酸同一性的变体。
5.根据上述权利要求中任一项的产品，其中所述单体抗原融合到所述C4bp核心蛋白质N-或C-末端。
6.根据权利要求5的产品，其中所述融合是通过灵活的接头。
7.根据权利要求1-6中任一项的产品，其中所述单体抗原是疟原虫裂殖体表面蛋白质1的单体抗原片段。
8.根据权利要求1-6中任一项的产品，其中所述单体抗原是流感病毒血凝素蛋白质或流感M2e肽的单体抗原片段。
9.一种组合物，其包含权利要求1-8中任一项的产品及药学上可接受稀释剂、载体或佐剂。
10.根据权利要求1-8中任一项的产品或权利要求9的组合物，其用于人体或动物体的治疗方法。
11.免疫治疗疟疾的方法，包括给予个体有效量的根据权利要求7的产品。
12.根据权利要求11的方法，其中所述个体被疟疾寄生虫感染。
13.根据权利要求11的方法，其用于预防性接种。
14.根据权利要求7的产品，其用于疟疾的治疗或预防。
15.根据权利要求7的产品在制备治疗或预防疟疾的药物中的用途。
16.制备抗疟原虫寄生虫的抗体的办法，所述办法包括将根据权利要求7的产品引入非人哺乳动物，并从这种哺乳动物中回收免疫血清。
17.针对受试者疾病的进行被动免疫的方法，所述办法包括给予所述受试者包含抗体的免疫血清，所述包含抗体的血清是通过用根据权利要求1-5任一项所述的产品来接种宿主受试者得到的。
18.被动免疫治疗人类受试者的疟疾的方法，所述方法包括给予所述人有效量的根据权利要求16产生的免疫血清。
19.通过权利要求16的方法得到的免疫血清，其用于人受试者的疟疾的免疫治疗的方法。
20.免疫治疗流感的方法，包括给予个体有效量的根据权利要求8的产品。
21.权利要求20的方法，其中所述个体被流感病毒感染。
22.权利要求20的方法，其用于预防性接种。
23.根据权利要求8的产品，其用于治疗或预防流感。
24.根据权利要求8的产品在制备用于治疗或预防流感的药物中的用途。
25.产生抗流感抗体的办法，所述办法包括将根据权利要求8的产品引入非人哺乳动物，并从所述哺乳动物中回收免疫血清。
26.人受试者的流感的被动免疫治疗方法，所述办法包括给予所述人有效量的根据权利要求25产生的免疫血清。
27.通过权利要求25的方法得到的免疫血清，其用于人受试者的流感的免疫治疗方法。
28.制备产品的方法，其包括：
C4bp核心蛋白质；和
非多肽单体抗原，
所述方法包括表达编码第一组分的核酸，将所述融合蛋白连接到第二组分上，并回收所述产品。
29.制备产品的方法，所述产品包括
C4bp核心蛋白质；和
多肽单体抗原的融合物，
所述方法包括表达编码所述融合物的核酸，并回收所述产品。
30.权利要求28或29的方法，其中所述核酸在原核宿主细胞中表达。
31.根据权利要求30的方法，其中所述融合蛋白以多聚体形式回收。
32.提高单体抗原的免疫原性的方法，所述方法包括将所述抗原连接到C4bp核心蛋白质上。
33.表达载体，其包括编码C4bp核心蛋白质和多肽单体抗原的融合蛋白的核酸序列，所述核酸序列与宿主细胞中的功能性启动子可操作地连接。
34.权利要求33的表达载体，其中所述C4bp核心蛋白质如权利要求2至5中任一项所限定。
35.权利要求33或34的表达载体，其中所述单体抗原如权利要求7或8所限定。
36.用权利要求33至35中任一项的表达载体转化的细菌宿主细胞。
37.用权利要求33至35中任一项的载体转化的真核宿主细胞。
38.权利要求33至35中任一项的表达载体在治疗人体或动物体的方法中的用途。
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