CN1849390A - 在绿色植物和微生物中高水平生产对苯二酚葡糖苷 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在遗传修饰过的绿色植物和微生物中生产氢醌葡糖苷的方法和材料。

Description

在绿色植物和微生物中高水平生产对苯二酚葡糖苷

                    发明领域

本发明涉及植物基因表达，分子生物学，和微生物学领域。提供了用于在遗传修饰过的绿色植物和微生物中以及体外生产氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)的方法和材料。

                    发明背景

对苯二酚葡糖苷(氢醌葡糖苷)及其糖苷配基氢醌是被用作皮肤增白剂的化合物。皮肤色素沉着主要是通过由黑素细胞产生的黑色素的数量决定的。导致黑色素形成的生物合成途径始于通过酪氨酸酶进行的酪氨酸向二羟基苯丙氨酸(DOPA)的转化(EC 1.14.18.1)。抑制酪氨酸酶，减少了通过黑素细胞产生的黑色素的数量，导致皮肤的脱色。业已证实了对苯二酚葡糖苷和对苯二酚葡糖苷的单酯衍生物能通过抑制酪氨酸酶减少由黑素细胞产生的黑色素的数量(US6306376)。

氢醌和氢醌衍生物，如氢醌醚，也被用作脱色剂。不过，业已报道了使用这种化合物产生的不利的副作用。这些化合物具有很高的刺激性，并且对黑素细胞有毒(US 6306376)。将对苯二酚葡糖苷用作脱色剂比使用氢醌更优选，因为与糖苷配基相比，对苯二酚葡糖苷具有较低的毒性。

业已报道了对苯二酚葡糖苷可以用作抗氧化剂，抗微生物剂，抗炎剂，并且可能用作致癌作用(黑素瘤)的抑制剂。不过，对苯二酚葡糖苷的商业化应用由于它的高成本而受到限制。还没有用于生产这种化合物的低成本的商业化生产方法。现有用于生产的方法包括化学合成(US 3201385；US 6388103；和JP 62-226974A)；从天然产生对苯二酚葡糖苷的植物中提取；使用微生物宿主或植物细胞培养物，种子或幼苗进行生物转化，这些材料适合表达葡糖基转移酶，让它们接触氢醌和UDP-葡萄糖(Arend等，Phytochemistry，53：187-193(2000)；Arend等，Biotech.Bioeng.，76(2)：126-131(2001)；Hefner等，Bioorg.Med.Chem.，10：1731-1741(2002)；和JP07224083A)，或通过类似的方法，其中，将葡萄糖和氢醌的混合物与β-葡糖苷酶接触(JP 05176785A)。

化学合成不是生产对苯二酚葡糖苷的节省成本的方法。化学合成方法通常需要昂贵的原材料，各种昂贵并且有毒的溶剂和催化剂，大量的能量投入，以及随后用于去掉杂质的纯化步骤。对不可再生的资源的投入是昂贵的并且是对环境有害的。

很多高等植物能天然产生对苯二酚葡糖苷。业已报道了杜鹃花科，蔷薇科，和虎耳草科的成员能以最高达20％干重量(叶片)的量产生对苯二酚葡糖苷。不过，这些植物具有差的农艺性状(Arend等，Phytochemistry，53：187-193(2000))。在植物中进行对苯二酚葡糖苷的节省成本的生产，需要具有好的农艺性状并且具有完善的加工内别构造的作物品种。

尽管存在多种生产对苯二酚葡糖苷的途径，将具有优良农艺性状的绿色植物用于化学物质的商业化生产的可能性正成为越来越吸引人的替代方案。与有机合成相反，绿色植物构成了可再生的能源。因为它们的独特的光合能力，在绿色植物中生产碳基化合物的唯一的原材料是二氧化碳，水和土壤，由阳光提供最终的能源。与现有的局限于尺寸的发酵设施相比，绿色植物构成了巨大的可利用的生物物质，它们能够轻易地实现化合物的大规模生产，即使它们需要大的体积，仍然是低成本的应用。

尽管体内植物生产提供了较大潜力的生物物质，与昂贵的，需要消耗大量能源的，和对环境有害的化学合成相比，微生物生产同样是诱人的替代方案。可以对工业微生物进行遗传修饰，以便生产需要的遗传学终产物。Hefner等(Bioorg.Med.Chem.，10：1731-1741(2002))通过向能表达内源氢醌葡糖基转移酶(HQ GT)的蛇根木(Rauvolfia serpentina)的细胞悬浮培养物或向能表达相同的酶的重组大肠杆菌细胞中外源补充氢醌-一种有毒的和昂贵的底物来生产对苯二酚葡糖苷。不过，目前还没有被修饰成可以商业化生产有用含量的对苯二酚葡糖苷的合适的重组微生物。

Ran等(J.Am.Chem.Soc.，123：10927-10934(2001))披露了使用微生物催化剂将葡萄糖转化成中间产物奎尼酸而生产氢醌的方法。然后分离奎尼酸，并且将它化学转化成氢醌。Ran等(同上)假设在理论上可以通过pHBA中间产物利用近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)的pHBA 1-羟化酶活性将葡萄糖转化成氢醌。不过，Ran等没有披露分离pHBA 1-羟化酶基因，该基因的序列，也没有披露在植物和微生物中生产对苯二酚葡糖苷的方法。

因此，要解决的问题是缺少在转基因植物，或在微生物中，或在体外以商业上有用的水平生产对苯二酚葡糖苷(氢醌葡糖苷)的方法和材料。

                        发明概述

本发明的实施方案包括表达功能性CPL(参见SEQ ID NO：30)(靶定叶绿体，用于在绿色植物中生产，或不靶定叶绿体，用于细胞质微生物表达)和/或HCHL(参见SEQ ID NO：38)(细胞质)，用于提高pHBA的产量。在绿色植物或在微生物中生产的优选实施方案中，CPL和HCHL是共同表达的，以便使pHBA的产量最大化。所生产的pHBA可以作为新的酶pHBA 1-羟化酶(参见SEQ ID NO：23)(脱羧基)的底物，其中，它被转化成氢醌。对于宿主细胞来说是内源的或者是通过重组而工程化以进入宿主细胞的UDP-葡糖基转移酶(参见SEQ IDNO：42)能对氢醌进行葡糖基化，以便形成氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)。在优选实施方案中，在本发明中使用的UDP-葡糖基转移酶，与pHBA或其他苯酚代谢物相比优先对进行氢醌葡糖基化。

申请人的在绿色植物中生产的优选方法所产生的回收的氢醌葡糖苷超过10％/干重量的植物叶片生物物质(biomass)；更优选的方法生产的回收的氢醌葡糖苷的量超过15％/干重量的植物叶片生物物质；最优选的方法生产的回收的氢醌葡糖苷的量超过20％/干重量的植物叶片生物物质。

本发明的优选实施方案是用携带有合成操纵子的质粒转化过的微生物细胞，它能够表达CPL，pHBA 1-羟化酶，和拟南芥属氢醌葡糖基转移酶(图6)并且补充了合适的碳源。在缺少CPL的条件下可以将pHBA补充给具有重组pHBA 1-羟化酶的微生物。另外，在缺少CPL和pHBA 1-羟化酶的条件下可以将氢醌补充给具有重组氢醌葡糖基转移酶。另外，可以用具有含有上述成分的重组氢醌-生产微生物和的氢醌葡糖苷-生产微生物的混合的微生物培养物生产氢醌葡糖苷，每一种重组微生物的细胞密度为大约1×10⁶-大约2×10¹⁰细胞/mL，并且，氢醌-生产微生物的数量超过氢醌葡糖苷-生产微生物的数量，其细胞比例超过1∶1-大约1∶20，以便产生氢醌葡糖苷。所述方法可以顺序使用所述微生物，或者在单一培养基中使用。

本发明的优选实施方案对于pHBA来说，是来自近平滑假丝酵母的pHBA 1-羟化酶，它的Km为＜1μM，而Kcat至少为约9.5/秒，而对于氢醌来说是来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的葡糖基转移酶(UGT72B1)它的Km为＜1μM，而Kcat至少为42/sec。

本发明包括在序列表中示出的核酸和氨基酸，表达盒，和包括所述成分的转基因绿色植物和微生物。

附图，序列描述，和生物学保藏物的简要说明

通过以下一起构成本申请的序列表，附图，生物学保藏物和详细说明，可以更全面地理解本发明。

图1表示在转基因植物中由pHBA生产对苯二酚葡糖苷的酶途径。修饰过的CPL能在叶绿体中将分支酸转化成pHBA，而所表达的HCHL能在细胞质中将4-香豆酰-CoA转化成pHBA。所述真菌酶pHBA 1-羟化酶能够将pHBA转化成氢醌。UDP-葡糖基转移酶能够对氢醌进行葡糖基化，以便产生氢醌葡糖苷。所述氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)随后在植物液泡中储存和积累。

图2表示用pHBA作底物对纯化的重组pHBA 1-羟化酶蛋白进行的动力学分析。用产物形成的起始速度对底物浓度作图。

图3表示被用于酶表征的纯化蛋白的考马斯蓝-染色的14％SDS-PAGE凝胶(泳道C)。其他的泳道(A，B)表示处在纯化方法的各个阶段的重组pHBA 1-羟化酶蛋白，所述方法描述于实施例3。

图4表示表达单独的或与pHBA 1-羟化酶组合的CPL酶的拟南芥属或烟草植物组织的HPLC分析的结果。

图5表示用氢醌作底物对纯化的重组UGT72B1蛋白进行的动力学分析。用产物形成的起始速度对底物浓度作图。

图6表示用于制备携带合成的操纵子的质粒载体的克隆方法，所述操纵子使得能够在T7启动子的控制下表达分支酸丙酮酸-裂解酶，pHBA 1-羟化酶，和氢醌葡糖基转移酶。这三种基因的共同表达，使得能够在诸如大肠杆菌的微生物中生产对苯二酚葡糖苷。

图7表示表达CPL，pHBA 1-羟化酶，和氢醌-特异性葡糖基转移酶的大肠杆菌培养物的培养基的HPLC分析的结果。

以下序列描述以及所附带的序列表符合在37C.F.R.§1.821-1.825中所规定的专利申请中有关核苷酸和/或氨基酸序列说明的规则。包括核苷酸序列符号的一字母代码和氨基酸的三字母代码的序列描述符合在以下文献中披露的IUPAC-IYUB标准：Nucleic AcidsResearch 13：3021-3030(1985)，以及Biochemical Journal 219(No.2)：345-373(1984)，上述文献被收作本文参考。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37 C.F.R.§1.822的规定。

SEQ ID NO：1是pHBA 1-羟化酶的前24个氨基酸(不包括起始的甲硫氨酸)的序列，它是通过从来自近平滑假丝酵母(ATCC 7336)中纯化的酶的Edman降解确定的。

SEQ ID NO：2是肽4的氨基酸序列，它是通过对纯化的pHBA 1-羟化酶进行胰蛋白酶消化产生的片段。

SEQ ID NO：3是肽5的氨基酸序列，它是通过对纯化的pHBA 1-羟化酶进行胰蛋白酶消化产生的片段。

SEQ ID NO：4是肽6的氨基酸序列，它是通过对纯化的pHBA 1-羟化酶进行胰蛋白酶消化产生的片段。

SEQ ID NO：5是用于RT-PCR实验的5’引物的核苷酸序列，所述引物用于扩增来自在pHBA为唯一碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母细胞的cDNA的pHBA 1-羟化酶转录物的518bp的片段。

SEQ ID NO：6是3’引物的核苷酸序列，可用于RT-PCR实验，用于扩增来自在pHBA为唯一碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母细胞的cDNA的pHBA 1-羟化酶转录物的518bp的片段。

SEQ ID NO：7是pHBA 1-羟化酶蛋白的氨基酸序列，它被反向翻译成5’引物，用于扩增来自在pHBA为唯一碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母细胞的cDNA的pHBA 1-羟化酶转录物的518bp的片段。

SEQ ID NO：8是pHBA 1-羟化酶蛋白的氨基酸序列，它被反向翻译成3’引物，用于扩增来自在pHBA为唯一碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母细胞的cDNA的pHBA 1-羟化酶转录物的518bp的片段。

SEQ ID NO：9是pHBA 1-羟化酶转录物的DNA片段的共有核苷酸序列，可以扩增自使用引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物从在以pHBA为唯一碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母细胞的cDNA。

SEQ ID NO：10是pHBA 1-羟化酶转录物的DNA片段的推定的氨基酸序列，可以扩增自使用引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的引物从在以pHBA为唯一碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母细胞的cDNA。

SEQ ID NO：11是用于3’RACE实验的引物，用于从在以pHBA为唯一碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母细胞的RNA合成cDNA。

SEQ ID NO：12是用于5’RACE实验的5’引物，用于从在以pHBA为唯一碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母细胞的RNA合成cDNA。

SEQ ID NO：13是用于3’RACE实验的3’引物，用于扩增来自在以pHBA为唯一碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母细胞的cDNA的pHBA1-羟化酶转录物的1159bp DNA片段。

SEQ ID NO：14是通过比对SEQ ID NO：9与一种DNA序列所获得的共有核苷酸序列，所述DNA序列可以用来自在以pHBA为唯一碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母细胞的cDNA的引物SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13进行扩增。

SEQ ID NO：15是SEQ ID NO：14上的1440bp的开放读框的核苷酸序列，代表pHBA 1-羟化酶开放读框的变体。

SEQ ID NO：16是SEQ ID NO：14上的1440bp的开放读框的推定的氨基酸序列，代表pHBA 1-羟化酶开放读框的变体。

SEQ ID NO：17是用于5’RACE实验的引物，用于合成来自在以pHBA为唯一碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母细胞的RNA的cDNA。

SEQ ID NO：18是用于5’RACE实验的5’引物，用于扩增代表pHBA1-羟化酶转录物的5’末端的264bp的片段。

SEQ ID NO：19是用于5’RACE实验的3’引物，用于扩增代表pHBA1-化酶转录物的5’末端的264bp的片段。

SEQ ID NO：20是通过5′RACE获得的264bp的DNA片段的核苷酸序列，表示pHBA1-羟化酶转录物的5’末端。

SEQ ID NO：21是通过比对在RT-PCR，3’RACE和5’RACE实验中获得的DNA序列而获得的HBA1-羟化酶转录物的共有核苷酸序列。

SEQ ID NO：22是通过比对在RT-PCR，3’RACE和5’RACE实验中获得的DNA序列而获得的编码存在于转录物上的pHBA 1-羟化酶的共有核苷酸序列。

SEQ ID NO：23是通过比对在RT-PCR，3’RACE和5’RACE实验中获得的DNA序列而获得的存在于转录物上的pHBA 1-羟化酶的推定的氨基酸序列。

SEQ ID NO：24是用于将pHBA 1-羟化酶基因的ORF导入大肠杆菌表达载体pET-29a(+)的3’引物。

SEQ ID NO：25是用于将pHBA 1-羟化酶基因的ORF导入大肠杆菌表达载体pET-29a(+)的5’引物。

SEQ ID NO：26是大肠杆菌表达载体pET-29a(+)中的编码pHBA1-羟化酶的核苷酸序列。

SEQ ID NO：27是用于扩增大肠杆菌ubiC基因的核苷酸序列(GenBank登录号M96268)的5’引物，该扩增中使用来自大肠杆菌菌株W3110的基因组DNA，并且将它插入大肠杆菌表达载体pET-24a(+)。

SEQ ID NO：28是用于扩增大肠杆菌ubiC基因的核苷酸序列的3’引物，该扩增中使用来自大肠杆菌菌株W3110的基因组DNA，并且将它插入大肠杆菌表达载体pET24a(+)。

SEQ ID NO：29是大肠杆菌表达载体pET-24a(+)中的PCR-扩增的CPL的ORF的核苷酸序列。

SEQ ID NO：30是大肠杆菌表达载体pET-24a(+)中的PCR-扩增的CPL的ORF的推定的一级氨基酸序列。

SEQ ID NO：31是用于扩增编码来自质粒pTSS1-91(#2)-IBI的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)小亚基前体的转运肽的核苷酸序列的5’引物，并且将它插入表达载体pET-24a-CPL。

SEQ ID NO：32是用于扩增编码来自质粒pTSS1-91(#2)-IBI的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基前体的转运肽的核苷酸序列的3’引物，并且将它插入表达载体pET-24a-CPL。

SEQ ID NO：33是大肠杆菌表达载体pET24a-TP-CPL中的PCR-扩增的TP-CPL的ORF的核苷酸序列。

SEQ ID NO：34是大肠杆菌表达载体pET24a-TP-CPL中的PCR-扩增的TP-CPL的ORF的推定的一级氨基酸序列。

SEQ ID NO：35是用于扩增来自质粒pMH40的缩短的3′NOS终止序列的5’引物，并且将它插入质粒pML3，得到了质粒pML63。

SEQ ID NO：36是用于扩增来自质粒pMH40的缩短的3′NOS终止序列的3’引物，并且将它插入质粒pML3，得到了质粒pML63。

SEQ ID NO：37是来自恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(DSM12585)(Muheim和Lerch，Appl.Microbiol.Biotechnol.，51(4)：456-461(1999))的HCHL基因的核苷酸序列，可用于在转基因植物中生产pHBA。

SEQ ID NO：38是恶臭假单胞菌(Muheim和Lerch，同上)的HCHL蛋白的推定的氨基酸序列，可用于在转基因植物中生产pHBA。

SEQ ID NO：39是用于使用来自UGT72B1基因的全长cDNA克隆的质粒DNA，扩增拟南芥UGT72B1基因的核苷酸序列的5’引物，并且将它插入大肠杆菌表达载体pET-28a(+)。

SEQ ID NO：40是用于使用来自UGT72B1基因的全长cDNA克隆的质粒DNA，扩增拟南芥UGT72B1基因的核苷酸序列的3’引物，并且将它插入大肠杆菌表达载体pET-28a(+)。

SEQ ID NO：41是编码拟南芥UGT72B1 UDP-葡糖基转移酶的核苷酸序列。

SEQ ID NO：42是根据拟南芥UGT72B1基因的核苷酸序列推定的拟南芥UGT72B1酶的氨基酸序列。

SEQ ID NO：43是用于使用包括pHBA1-羟化酶基因(SEQ ID NO：26)的pET29a(+)质粒的质粒DNA，扩增来自近平滑假丝酵母的pHBA1-羟化酶基因的核苷酸序列的5’引物，并且将它插入大肠杆菌表达载体pET24a(+)。

SEQ ID NO：44是用于使用包括pHBA1-羟化酶基因(SEQ ID NO：26)的pET29a(+)质粒的质粒DNA，扩增来自近平滑假丝酵母的pHBA1-羟化酶基因的核苷酸序列的3’引物，并且将它插入大肠杆菌表达载体pET24a(+)。

SEQ ID NO：45是用于使用包括拟南芥UGT72B1基因的pET28a(+)质粒的质粒DNA，扩增编码拟南芥UGT72B1酶的核苷酸序列的5’引物，并且将它插入大肠杆菌表达载体pET24a(+)。

SEQ ID NO：46是用于使用包括拟南芥UGT72B1基因的pET28a(+)质粒的质粒DNA，扩增编码拟南芥UGT72B1酶的核苷酸序列的3’引物，并且将它插入大肠杆菌表达载体pET24a(+)。

SEQ ID NO：47是大肠杆菌表达载体pET24a(+)中的编码CPL，pHBA1-羟化酶，和UGT72B1酶的核酸片段的核苷酸序列。

SEQ ID NO：48是用于使用包括pHBA 1-羟化酶基因(SEQ ID NO：26)的pET29a(+)质粒的质粒DNA，扩增编码来自近平滑假丝酵母的pHBA1-羟化酶的核苷酸序列的5’引物，并且将它插入大肠杆菌表达载体pMPMT3。

SEQ ID NO：49是用于使用包括pHBA 1-羟化酶基因(SEQ ID NO：26)的pET29a(+)质粒的质粒DNA，扩增编码来自近平滑假丝酵母的pHBA 1-羟化酶的核苷酸序列的3’引物，并且将它插入大肠杆菌表达载体pMPMT3。

SEQ ID NO：50是用于使用包括拟南芥UGT72B1基因的pET28a(+)质粒的质粒DNA，扩增编码拟南芥UGT72B1酶的核苷酸序列的5’引物，并且将它插入大肠杆菌表达载体pCL1920。

SEQ ID NO：51是用于使用包括拟南芥UGT72B1基因的pET28a(+)质粒的质粒DNA，扩增编码拟南芥UGT72B1酶的核苷酸序列的3’引物，并且将它插入大肠杆菌表达载体pCL1920。

SEQ ID NO：52是用于使用大肠杆菌的基因组DNA，扩增编码大肠杆菌CPL酶的核苷酸序列的5’引物，并且将它插入大肠杆菌表达载体pET29a(+)。

SEQ ID NO：53是用于使用大肠杆菌的基因组DNA，扩增编码大肠杆菌CPL酶的核苷酸序列的3’引物，并且将它插入大肠杆菌表达载体pET29a(+)。

SEQ ID NO：54是大肠杆菌表达载体pET29a(+)中的编码CPL和pHBA 1-羟化酶的核酸片段的核苷酸序列。

                生物学保藏物的简要说明

申请人业已按照布达佩斯条约有关用于专利程序的微生物保藏的国际认可的规定进行了以下生物学保藏：

保藏人鉴别参考	国际保藏号	保藏日
			质粒pZBL1	ATCC 209128	1997年6月24日

在本文中，″ATCC″表示美国典型培养物保藏中心，位于10801University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209，U.S.A。″ATCCNo.″是由ATCC为保藏的培养物确定的保藏号。

所列出的保藏物应当在指明的国际保藏机构保藏至少30年，并且在披露它的专利获得授权之后可以公众可以得到。所述保藏物的可获得性并不构成许可以损害通过政府行为授予的专利权的形式来实施本发明。

                        发明详述

本申请人通过提供能产生商业上可利用水平的对苯二酚葡糖苷(4-羟苯基-β-D-吡喃葡糖苷；CAS487-76-7)的转基因植物和微生物解决了上述问题。体内方法取决于转基因植物，它能产生水平升高的起始底物-对羟基苯甲酸(pHBA)，在新的生物合成途径中，通过工程改造产生对苯二酚葡糖苷。大部分植物都能通过知之甚少的途径天然产生很低水平的pHBA。可以通过遗传工程改造使植物产生高水平的pHBA，这是通过细菌蛋白分支酸丙酮酸裂解酶(chorismatepyruvate lyase(CPL))的功能性表达，或通过4-羟基肉桂酰-CoA水合酶/裂解酶(HCHL)，或这两种表达的组合。使用新的真菌蛋白，即从近平滑假丝酵母(ATCC 7336)中分离的pHBA 1-羟化酶将pHBA转化成氢醌。所产生的氢醌被内源植物UDP-葡糖基转移酶迅速葡糖基化。任选将外源UDP-葡糖基转移酶(例如，拟南芥属UGT72B1)导入转化过的植物细胞。所述氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)随后汇集在植物液泡中。

将转基因植物(烟草和拟南芥属)修饰成能功能性表达编码修饰形式的分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)的基因。CPL能催化将1mol的分支酸直接转化成1mol的丙酮酸和1mol的pHBA。还可将转基因植物修饰成能功能性表达编码4-羟基肉桂酰-CoA水合酶/裂解酶(HCHL)的基因，这种酶能够催化将4-香豆酰-CoA转化成pHBA。将所披露的转基因植物工程改造成能共同表达CPL和HCHL，或任何其他的酶或这些酶的组合，所述酶适合高水平生产pHBA前体，所述前体随后被转化成氢醌，并最终转化成对苯二酚葡糖苷。

通过编码pHBA 1-羟化酶的基因的功能性表达将转基因植物中所产生的pHBA转化成氢醌。所述方法的最后一个步骤取决于功能性表达的UDP-葡糖基转移酶基因。所述UDP-葡糖基转移酶对所述植物来说可以是内源的，或者是通过重组方法导入所述植物的。这种酶能将所产生的氢醌转化成氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)。

无论所使用的酶的具体组合如何，申请人优选的方法产生的回收的氢醌葡糖苷超过10％/干重量的植物叶片生物物质。申请人更优选的方法产生的回收的氢醌葡糖苷超过15％/干重量的植物叶片生物物质。申请最优选的方法产生的回收的氢醌葡糖苷超过20％/干重量的植物叶片生物物质。

申请人使用来自拟南芥属的UDP-葡糖基转移酶(UGT72B1；GenBank116337.1)，它表现出针对氢醌的显著活性(转换数为42/sec)。该转换数显著高于报道过的用氢醌作底物的其他UDP-葡糖基转移酶的转换数(Hefner等，Biorg.Med.Chem.，10：1731-1741(2002)；Arend等，Phytochemistry，53：187-193(2000))。

所述酶用于缀合氢醌的独特用途是通过催化效力示例的，所述催化效率表示为140的kcat(s^-1)/Km(μM)(参见实施例7)。它明显超出了以前所披露的具有对氢醌的活性的任何其他葡糖基转移酶的效力。对pHBA 1-羟化酶和氢醌葡糖基转移酶基因的分子识别，使得能够在诸如大肠杆菌的微生物系统中生产对苯二酚葡糖苷。为此，pHBA1-羟化酶基因是与分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)基因和合适的葡糖基转移酶基因(实施例6)一起在大肠杆菌细胞中表达的。在大肠杆菌中表达这三种酶，提供了通过建立从分支酸到对苯二酚葡糖苷的三个步骤的途径(图1)从廉价的可发酵的碳源(如葡萄糖)生产对苯二酚葡糖苷的途径。

因此，优选的多肽是这样的活性蛋白，它与本文所鉴定的氨基酸序列具有至少80％同一性。更优选的氨基酸序列与本文所鉴定的氨基酸序列具有至少90％同一性。最优选的氨基酸序列与本文所报道的氨基酸序列具有至少95％同一性。类似地，相当于本发明ORF的优选的核酸序列是那些编码活性蛋白的序列，并且它们与本文所鉴定的核酸序列具有至少80％同一性。更优选的核酸序列与本文所鉴定的核酸序列具有至少90％同一性。最优选的是与本文所报道的核酸序列具有至少95％同一性的核酸序列。

本申请人还提供了用简单的碳源在微生物中生产对苯二酚葡糖苷的方法。被遗传修饰成能产生水平升高的pHBA底物的微生物(大肠杆菌)随后被工程改造成能产生重组形式的pHBA 1-羟化酶，所述酶能将pHBA转化成氢醌。同样在相同的微生物菌株中表达的UDP-葡糖基转移酶(拟南芥属UGT72B1)能将氢醌迅速葡糖基化，以便产生对苯二酚葡糖苷(参见以全文形式收作本文参考的US 10/359369)。

这种菌株产生氢醌，这是通过将分支酸的内源库转化成pHBA，它随后又被pHBA 1-羟化酶转化成氢醌。在这种情况下，由葡萄糖产生对苯二酚葡糖苷是通过共同培养实施例6描述的能分别表达CPL和pHBA 1-羟化酶和氢醌-特异性葡糖基转移酶的两种大肠杆菌菌株而实现的。

由葡萄糖生成对苯二酚葡糖苷的发酵途径的可行性利用了由来自大肠杆菌的CPL提供的途径，由来自近平滑假丝酵母的pHBA 1-羟化酶提供的途径，和由来自拟南芥的葡糖基转移酶提供的途径。前两种酶在大肠杆菌中的表达，导致了氢醌的形成，它扩散或活跃地分泌到培养基中，并且被能表达氢醌-特异性葡糖基转移酶的细胞摄取。在大肠杆菌细胞中合成之后，所述氢醌葡糖苷再次扩散或活跃地分泌到培养基中。

上述途径所需要的所有辅因子，辅酶和辅底物(如FAD，NADH，O₂，和UDPG)都存在于大肠杆菌细胞质中。业已披露了由于碳向莽草酸途径的流入增加而导致的分支酸水平升高的大肠杆菌菌株(Berry等，Trends Biotech，14(7)：250-256(1996)；Bongaerts等，MetabolicEngineering，3(4)：289-300(2001)；Tatarko和Romeo T.，Curr.Microbiol.，43(1)：26-32(2001)；US 6210937 B1；US5776736 A；和WO 73484A1)，并且可用于采用下面所披露的分子工具由葡萄糖生产对苯二酚葡糖苷。

在本说明书中，使用了多种术语和缩略语。提供了以下定义。

″聚合酶链反应″被缩写成″PCR″。

″对羟基苯甲酸″或″p-羟基苯甲酸″被缩写成″pHBA″。

″分支酸丙酮酸裂解酶″被缩写成″CPL″，并且表示编码能催化将分支酸转化成丙酮酸和pHBA的基因。分支酸丙酮酸裂解酶表达盒具有以下结构：P-T-C-D-CPL，其中，P是适合驱动分支酸丙酮酸裂解酶基因表达的启动子；T是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽的核酸分子；C是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽裂解位点的核酸分子；而D是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽供体多肽的N-末端部分的四个连续氨基酸的核酸分子；CPL是编码具有SEQ ID NO：30所示氨基酸序列的分支酸丙酮酸裂解酶的核酸分子；而P，T，C，D，和CPL是彼此可操作地连接的。

″4-羟基肉桂酰-CoA水合酶/裂解酶″被缩写成″HCHL″，并且表示能催化羟基肉桂酰CoA硫酯的双键水合的酶，该水合随后进行反向醇醛裂解反应，它能产生苯甲酰醛和乙酰CoA。

术语″对羟基苯甲酸1-羟化酶″，″对-羟基苯甲酸1-羟化酶(脱羧基)″，″对-羟基苯甲酸盐/酯1-羟化酶″，和″pHBA 1-羟化酶″可以交换使用，并且表示从近平滑假丝酵母(ATCC 7336)中分离的编码能催化将pHBA转化成氢醌的酶的核酸片段(Eppink等，J.Bacteriol.，179(2)：6680-6687(1997))。

术语″氢醌葡糖苷″和″对苯二酚葡糖苷″表示包括氢醌和葡萄糖分子的缀合物。

术语″p-羟基苯甲酸葡糖苷″和″pHBA葡糖苷″表示包括pHBA和葡萄糖分子的缀合物。

术语″UDP-葡糖基转移酶″和″葡糖基转移酶″被缩写成″GT″，并且表示参与葡萄糖缀合分子形成的酶。所述蛋白能催化UDP-葡萄糖和受体分子之间的反应，以便形成UDP和葡糖基化受体分子。在大多数场合下，β-D-葡萄糖的C1上的羟基通过1-O-β-D-键连接在受体分子上。对作为底物的氢醌表现出显著活性的UDP-葡糖基转移酶被称为″氢醌葡糖基转移酶″，缩写成″HG-GT″。

术语″糖苷配基″表示本发明的缺少葡萄糖部分的底物(即，氢醌和pHBA)。

术语″pHBA衍生物″表示pHBA的缀合物，它可通过CPL酶的催化活性在植物体内形成。

术语″转运肽″或″叶绿体转运肽″(缩写成″TP″)表示叶绿体前体蛋白的N-末端部分，它能引导叶绿体前体蛋白进入叶绿体，并且随后通过叶绿体加工蛋白酶切除。

术语″叶绿体导向序列″表示连接在外源蛋白的N-末端的任何多肽延伸部分，用于转运到叶绿体内。对于天然存在的叶绿体前体蛋白来说，转运肽被认为是叶绿体导向序列，不过最佳的摄取和蛋白加工可能在某种程度上取决于″成熟的″叶绿体蛋白的部分。

术语″转运肽供体序列″表示叶绿体导向序列的一部分，它来自叶绿体前体蛋白的N-末端部分的前若干个(最多大约20个)氨基酸。转运肽供体序列总是位于转运肽裂解位点的下游并且紧靠该位点，该裂解位点将转运肽与成熟的叶绿体蛋白分开。

术语″叶绿体加工蛋白酶″表示能够裂解所述转运肽和成熟的叶绿体蛋白之间的容易断裂的键的蛋白酶。

术语″转运肽裂解位点″表示位于叶绿体导向序列上的两个氨基酸之间的位点，叶绿体加工蛋白酶作用于该位点。

在本文中，″分离的核酸片段″是单链或双链RNA或DNA聚合物，它任选包括合成的，非天然的，或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的分离的核酸片段可以由一个cDNA，基因组DNA或合成的DNA的片段组成。

″基因″表示能表达特定蛋白的核酸片段，包括位于编码序列前面(5′非编码序列)和后面(3′非编码序列)的调控序列。″天然基因″表示天然存在的与它自身的调控序列在一起的基因。″嵌合基因″表示不是天然基因的任何基因，包括天然状态下不与它一起存在的调控和编码序列。因此，嵌合基因可以包括来自不同来源的调控序列和编码序列，或来自相同来源的调控序列和编码序列，但是，所述序列是以与天然状态不同的方式排列的。″内源基因″表示存在于生物体基因组中的天然位置上的天然基因。″外源″基因表示正常情况下不存在于宿主生物中的基因，不过，它是通过基因转移导入所述宿主生物的。″外源″还可用于描述在野生型宿主中不存在的核酸序列，该序列被导入所述宿主。外源基因可以包括插入非天然生物的天然基因，或嵌合基因。″转基因″是业已通过转化方法导入所述基因组的基因。

″合成基因″可以采用本领域技术人员所公知的方法用化学合成的寡核苷酸基本单位组装而成。连接这些基本单位并且退火，以便形成基因片段，然后酶促组装这些片段，以便构建完整的基因。″化学合成的″在用于DNA序列时，表示组成核苷酸是在体外组装的。DNA的手工化学合成可以通过业已完善的方法完成，或使用多种商业化仪器中的一种进行自动化化学合成。因此，可以对所述基因进行修饰，以便根据体现宿主细胞的密码子偏依的核苷酸序列的优化，优化基因表达。如果密码子选择偏向所述宿主偏好的密码子，技术人员可以理解成功的基因表达的可能性。优选密码子的确定可以根据对来自其序列信息已知的宿主细胞的基因的调查。

″编码序列″表示编码特定氨基酸序列的DNA序列。″合适的调控序列″表示位于编码序列上游(5′非编码序列)，内部，或下游(3′非编码序列)的核苷酸序列，并且它能影响相关编码序列的转录，RNA加工或稳定性，或翻译。调控序列可以包括启动子，翻译前导序列，内含子，聚腺苷酸化识别序列，RNA加工位点，效应物结合位点，和茎-环结构。

″启动子″表示能够控制编码序列或功能性RNA表达的核苷酸序列。一般，编码序列位于启动子序列的3′。启动子序列由近端和更远的上游元件组成，后一种元件通常被称作增强子。因此，“增强子”是可以刺激启动子活性的核苷酸序列，并且可以是所述启动子的天然元件，或者被插入以增强启动子的水平或组织特异性的外源元件。启动子可以整个来自天然基因，或者是由来自天然存在的不同的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的核苷酸片段。本领域技术人员可以理解的是，不同的启动子能够指导基因在不同的组织或细胞类型中，或在发育的不同阶段，或根据不同的环境条件进行表达。能够导致核酸片段在大多数细胞类型中在大部分时间表达的启动子通常被称作″组成型启动子″。可用于植物细胞的各种类型的新的启动子正在不断地被发现。多种例子由Okamuro和Goldberg编辑在以下文献中：TheBiochemistry of Plants，Vol.15，由Academic Press，Burlington，MA出版，pages 1-82，(1989)。还可以理解的是，由于在大多数场合下，调控序列的确定边界尚未完全确定，具有不同长度的核酸片段可能具有相同的启动子活性。

″3′非编码序列″表示位于编码序列下游的DNA序列，并且包括能够影响mRNA加工或基因表达的聚腺苷酸化识别序列(通常局限于真核mRNA)和编码调控信号的其他序列。真核聚腺苷酸化信号通常以影响多聚腺苷酸尾在mRNA前体的3′末端的添加为特征。

术语″可操作地连接的″表示核酸序列缔合在单个核酸片段上，以便其中一个的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，所述编码序列受所述启动子的转录控制)时，它就是与编码序列可操作地连接的。编码序列能够沿有义或反义方向与调控序列可操作地连接。

在本文中，术语″表达″，表示来自本发明的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定的积累。表达还可以表示mRNA翻译成多肽。

″成熟的″蛋白表示翻译后加工过的多肽(即，存在于一级翻译产物上的任何前或原肽业已被去掉的多肽)。″前体″蛋白表示mRNA的一级翻译产物；即，仍然存在前肽和原肽。前肽和原肽可以是，但不局限于细胞内定位信号。

″转化″表示将核酸片段转入宿主生物的基因组，导致遗传学上稳定的遗传。包括转化的核酸片段的宿主生物被称作″转基因″，″重组的″，或″转化的″生物。

术语″质粒″，″载体″，和″盒″表示染色体外元件，通常携带不是细胞的中央代谢的一部分的基因，并且通常是环状双链DNA分子形式的。所述元件可以是自主复制的序列，基因组整合序列，噬菌体或核苷酸序列，线性或环状单链或双链DNA或RNA，可来自任何来源，其中，多个核苷酸序列业已结合或重组为独特的构造，它能够将启动子片段和编码选定基因产物的DNA序列与合适的3′非翻译序列一起导入细胞。″转化盒″表示包括外源基因并且具有除了外源基因以外的能促进特定宿主细胞转化的元件的特定载体。″表达盒″表示包括外源基因并且具有除了外源基因之外能够增强基因在外源宿主中表达的元件的特定载体。

本发明所采用的标准重组和分子克隆技术为本领域所熟知，并且披露于以下文献中：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)(以下简称为″Maniatis″)；和Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.，和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，ColdSpring Harbor Laboratory Cold Press Spring Harbor，NY(1984)(以下简称为″Silhavy″)；和Ausubel，F.M.等，Current Protocolsin MolecularBioloav，published by Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience(1987)(以下简称为″Ausubel″)。

在转基因植物中用CPL和HCHL生产pHBA

pHBA是在几乎所有植物，动物和微生物是天然存在的，不过其存在数量很小。很多细菌通过分支酸途径产生pHBA，该途径是合成多种芳香化合物时的中间产物的重要分支点，所述化合物包括苯丙氨酸，酪氨酸，p-氨基苯甲酸，和泛醌。在大肠杆菌中，分支酸发生五种不同的酶促反应，以便产生五种不同的产物。最终决定pHBA合成的酶是分支酸丙酮酸裂解酶，它被称作CPL。后者是大肠杆菌ubiC基因的产物，该基因是由两个不同的组独立克隆的(Siebert等，FEBS Lett307：347-350(1992)；Nichols等，J.Bacteriol.174：5309-5316(1992))。所述酶是19kDa的单体蛋白，没有已知的辅因子或能量需求。通过消除它的唯一底物的C₃烯醇丙酮酰侧链，CPL能催化1mol的分支酸直接转化成1mol的丙酮酸和1mol的pHBA。重组CPL业已在大肠杆菌中超量表达，纯化至同质，并且进行了生物化学和动物学的部分表征(Siebert等，Microbiology，140：897-904(1994)；Nichols等，J Bacteriol.，174：5309-5316(1992))。另外，业已提出了CPL酶反应的详细机制(Walsh等，Chem.Rev.，90：1105-1129(1990))。

在植物中，业已发现pHBA存在于胡萝卜组织(Schnitzler等，Planta，188：594(1992))，多种牧草和作物(Lydon等，J.Agric.Food.Chem.，36：813(1988))，白杨树的木质素(Terashima等，Phytochemistry，14：1991(1972))，以及多种其他植物组织(Billek等，Oesterr.Chem.，67：401(1966))中。植物具有合成pHBA所必需的所有酶促机制这一事实，暗示了植物可以用作生产这种单体的平台。例如，与用于生产所述单体的石化或微生物方法相比，作为可再生资源的植物平台需要少得多的能量和材料消耗。类似地，植物平台表示代表了比微生物系统大得多的用于单体生产的可利用的生物量。最后，pHBA在植物中的天然存在，暗示了宿主毒性(化合物超量表达的结果)可能不是问题。然而，尽管在将植物用作生产pHBA方面存在显著优点，所述单体的高水平生产一直是难以琢磨的。

分支酸在植物中的代谢命运提出了困难的问题。实际上，由分支酸产生pHBA在高等植物中比在微生物中复杂得多，因为前者缺少在功能上与CPL相当的酶。例如，在梓木草(Lithospermumerythrorhizon)中导致pHBA的生物合成途径被认为包括最多达10个连续的反应(Loscher和Heide，Plant Physiol.，106：271-279(1992))，每一个反应被推定是由不同的酶催化的。另外，催化这些反应的酶大部分尚未鉴定，也没有克隆它们的基因。有关pHBA在其他植物物种中如何合成的可利用的信息甚至更少。更为复杂的是，已知这些酶参与植物pHBA生产，横跨两种不同的途径，这两种途径是不同调控的，并且位于不同的细胞区室。具体地讲，分支酸是莽草酸途径的中间产物，它主要局限于叶绿体和其他类型的质体中(Siebert等，Plant Physio，112：811-819(1996)；Sommer等，Plant cellPhysiol.，39(11)：1240-1244(1998))，而所有位于苯基丙氨酸下游的中间产物属于phenylpropanoid途径，它是在细胞质和内质网中进行的。

业已披露了能比野生型植物积累明显更高水平的pHBA的转基因植物。例如，Kazufumi Yazaki(Baiosaiensu to Indasutori，56(9)：621-622(1998))讨论了将CPL编码基因导入烟草，用于以足以产生昆虫抗性的量生产pHBA。类似地，Siebert等(Plant Physiol.，112：811-819(1996))业已证实用组成型表达的叶绿体-导向形式的大肠杆菌CPL(被称作″TP-UbiC″)转化过的烟草植物(Nicotianatabacum)具有水平升高的pHBA，它的水平至少比野生型植物高出三个数量级(WO 96/00788)。遗传修饰过的烟草植物只包含微量的游离的，未缀合的pHBA。几乎所有化合物(约98％)被转化成两种葡萄糖缀合物，苯酚葡糖苷和酯葡糖苷，它们的存在比例为大约3∶1(Siebert等，Plant Physio.，112：811-819(1996)；Li等，Plantcell Physiol.，38(7)：844-850(1997))。两种葡萄糖缀合物都是1-β-D-葡糖苷，具有与pHBA的羟基或羧基共价连接的单个葡萄糖残基。在本研究中业已确定的最佳的转基因植物的总的pHBA葡糖苷含量为大约0.52％干重量(植物叶片组织)。对相关葡萄糖残基进行校正，在转基因烟草植物中生产的pHBA的实际量仅大约为该值的一半。

在更近一些的研究中，使用组成型启动子在转化过的烟草细胞培养物中表达了相同的人工融合蛋白(Sommer等，Plant cellPhysiol.，39(11)：1240-1244(1998))和诱导型启动子(Sommer等，Plant cell Reports，17：891-896(1998))。尽管pHBA葡糖苷的积累略高于用完整植株进行的初步研究，但是在任何场合下其水平都没有超过0.7％干重量。相反，当在梓木草的毛状根培养物中检测TP-UbiC时(Sommer等，Plant Molecular Biology，39：683-693(1999))，pHBA葡糖苷的含量达到了高达0.8％干重量的水平，该水平是校正未转化过的对照培养物的内源水平之后得出的。

尽管上述研究证实了利用遗传工程在高等植物中提高pHBA含量的可行性，上述TP-UbiC人工融合蛋白不能够以商业上有用的量制备所述化合物。获得这种数量，需要将农艺上合适的植物的pHBA含量提高到比以前报道过的水平高10-20倍。因此，需要对所述已知系统进行一种或多种修饰，以便达到这种水平。由于CPL的底物分支酸是在质体中合成的，用于改良的一个潜在部位可能存在于更好的叶绿体导向序列设计中，以便在感兴趣的细胞区室中获得更高水平的酶活性。在CPL酶活性和pHBA葡糖苷的积累之间存在正相关性，这种正相关性在上述若干研究中是显而易见的(Siebert等，Plant Physiol.，112：811-819(1996)；Sommer等，Plant cell Physiol.，39(11)：1240-1244(1998)；Sommer等，Plant cell Reports，17：891-896(1998))。另外，在上述研究中，没有一项提供了暗示所述系统是利用TP-UbiC人工融合蛋白，用CPL酶活性饱和的证据。

大部分天然存在的叶绿体蛋白是细胞核编码的，并且作为较大分子量的前体合成，其具有可裂解的N-末端多肽延伸部分，被称作转运肽。普遍认可的是，后者包括转运到叶绿体中所必需的所有信息。尽管有关蛋白输入的机制细节尚有待说明，业已出现了若干重要事实：(a)翻译后发生的前体摄取(Chua和Schmidt，Proc.Natl.Acad.Sci.，75：6110-6114(1978)；Highfield和Ellis，Nature，271：420-424(1978))并且是通过存在于叶绿体外被膜中的蛋白性受体介导的(Cline等，J.Biol.Chem.，260：3691-3696(1985)))；(b)ATP-水解是转运的唯一的驱动力(Grossman等，Nature，285：625-628(1980)；Cline等，同上)；(c)转运肽与外源蛋白的融合是偶然进行的，而不是一定进行的，足以在体内((Van den Broeck等，Nature，313：358-362(1985))；Schreier等，EMBO J.，4：25-32(1985))和体外(Wasmann等，Mol.Gen.Genet.，205：446-453(1986))诱导摄取到叶绿体中；最后，(d)在叶绿体输入之后，所述转运肽通过蛋白水解从所述前体蛋白上去掉，以便产生″成熟的″多肽。尽管目前已知数千种转运肽的完整序列，对这些序列进行操作，以便实现外源蛋白在植物叶绿体区室中的最佳导向和表达仍然是需要反复实验并且出现错误的问题。将转运肽简单地连接在外源蛋白上，不一定能确保它能够被叶绿体有效地摄取或者正确地加工。即使相同的导向序列与不同的蛋白融合时，所述结果是完全不可预测的(Lubben等，The植物细胞，1：1223-1230(1989))，并且，不同的乘客蛋白是以不同的效率运输的。造成这种现象的原因尚不清楚。不过，业已表明，叶绿体摄取和转运肽的切除是有些关联的，并且，某些人工融合蛋白是不能加工的，或者是不能有效加工的。例如，业已证实，在核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基前体的天然裂解位点附近发生的非常微小的变化都可能导致异常的加工(Robinson和Ellis，Eur.J.Biochem.，142：342-346(1984)；Robinson和Ellis，Eur.J.Biochem.，152：67-73(1985))，和减弱了的叶绿体摄取(Wasmann等，J.Biol.Chem.，263：617-619(1988))。

通过在叶绿体导向序列上不仅包括转运肽和容易断裂的键，而且还包括转运肽供体的成熟的N-末端的一小部分，业已在该领域获得了某种程度的改进。实际上，这种方法业已在体内和体外((Van denBroeck等，同上；Schreier等，同上；Wasmann等，同上；EP 0189707；US 5728925；和US 5717084))用于另一种细菌蛋白，即新霉素磷酸转移酶II(NPT-II)的改进。因此，由核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基前体的转运肽加上与NPT-II的N-末端融合的成熟的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的前22个残基组成的嵌合蛋白与仅包括转运肽和容易断裂的键的类似构建体相比能够更好地被叶绿体摄取。不过，这种方法不是十分确定的，因为它仍然与高度的不可预测性相关，这种不可预测性与所述乘客蛋白具有解不开的联系。这在试图将CPL导向叶绿体的文献中看得最清楚。例如，Sommer等(Plant CellPhysiol.，39(11)：1240-1244(1998))披露了类似的人工融合蛋白，它包括CPL基因产物，它的N-末端与所述转运肽和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基的前21个氨基酸残基融合(例如，″TP21UbiC″)。进行这种修饰是为了改善叶绿体摄取和加工，不过，包括原始构建体TP-UbiC的细胞出乎意料地具有更高水平的CPL酶活性和pHBA葡糖苷。因此，Wasmann等(同上)的申请披露了在应用于不同的蛋白时具有有害作用。

专利申请(US SN 09/855341；收作本文参考)披露了可用于在植物中生产pHBA的分支酸丙酮酸表达盒(SEQ ID NO：33，编码具有SEQID NO：34所述氨基酸序列的多肽)。所述多肽能够有效地转运到细胞叶绿体中，在这里它随后被蛋白水解加工成活性的叶绿体-导向的CPL。叶绿体-导向的CPL使得能够在植物中产生对-羟基苯甲酸。

从荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)AN 103中分离的4-羟基肉桂酰-CoA水合酶/裂解酶(HCHL)是另一种细菌酶，当它在转基因烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthi XHFD8)中表达时，导致了pHBA葡糖苷的大量积累(Mayer等，Plant Cell.，13：1669-1682(2001))。HCHL在转基因植物的细胞质中的表达使碳流量的方向从phenylpropanoid途径转向pHBA葡糖苷的生产。HCHL能催化将4-香豆酰-CoA转化成pHBA，其中，内源UDP-葡糖基转移酶对pHBA进行葡糖基化。

用于提高pHBA产量的功能性CPL(导向于叶绿体，用于在绿色植物中生产或者非导向于叶绿体，用于细胞质微生物表达)或HCHL(细胞质)都可以表达。在优选实施方案中，CPL和HCHL是共同表达的，以便使pHBA的产量最大化。所产生的pHBA可以用作新的酶，即pHBA1-羟化酶(脱羧基的)的底物，其中，它被转化成氢醌。无论是宿主细胞的内源或者是以重组工程方式进入宿主细胞的UDP-葡糖基转移酶，都能对氢醌进行葡糖基化，以便形成氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)。在优选实施方案中，与pHBA或其他苯酚代谢物相比，在本发明中使用的UDP-葡糖基转移酶优选对氢醌进行葡糖基化。

CPL表达盒

本发明提供了可用于表达完全具有完整活性的，修饰过的形式的分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)的表达盒，并且将多肽导向宿主植物的叶绿体。通常，所述表达盒包括(1)克隆的CPL基因，该基因受5’和3’调控序列的转录控制，和(2)显性选择标记。本发明的表达盒还可以包括启动子调控区(例如，赋予诱导型或组成型，环境-或发育调控的，或细胞或组织-特异性/选择性表达的调控区)，转录起始位点，核糖体结合位点，RNA加工信号，转录终止位点，和/或聚腺苷酸化信号(通常局限于真核生物)。在优选实施方案中，所述盒还包括使得能够将pHBA1-羟化酶有效导向于质体的序列。这些成分包括转运肽以及编码转运肽供体的一部分的序列，所述部分包括转运肽裂解位点，该位点可以由宿主植物细胞叶绿体加工蛋白酶进行加工。所述盒还可任选包括一个或多个内含子，以便促进表达。在另一种优选实施方案中，所述CPL基因被整合到叶绿体基因组中，并且在允许在该细胞器有效翻译和转录的DNA序列元件的控制下表达。在本发明中具有特殊用途的分支酸丙酮酸裂解酶表达盒具有以下结构：

                       P-T-C-D-CPL

其中，P是适合驱动分支酸丙酮酸裂解酶基因表达的启动子；T是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽的核酸分子；C是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽裂解位点的核酸分子；而D是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽供体多肽的N-末端部分的四个连续氨基酸的核酸分子；CPL是编码具有SEQ ID NO：30所示氨基酸序列的分支酸丙酮酸裂解酶的核酸分子；而P，T，C，D，和CPL任选是彼此可操作地连接的；

HCHL表达盒

PHBA生产还可以通过在植物细胞的细胞质中表达来源于细菌的4-羟基肉桂酰-CoA水合酶/裂解酶(HCHL)而实现(Mayer等，Plantcell，13(7)：1669-1682(2001)；Mitra等，PLANTA，215(1)：79-89(2002)；和WO9735999 A2)。用于在植物中生产pHBA的表达盒由编码具有完整活性形式的HCHL的基因组成。通常，所述表达盒包括(1)克隆的HCHL编码序列，它受5’和3’调控序列的转录控制，和(2)显性选择标记。本发明的表达盒还可以包括启动子调控区(例如，赋予诱导型或组成型，环境-或发育调控的，或细胞或组织-特异性/选择性表达的调控区)，转录起始位点，核糖体结合位点，RNA加工信号，转录终止位点，和/或聚腺苷酸化信号。所述盒还可以任选包括一个或多个内含子，以便促进HCHL表达。

所述HCHL基因编码的酶能够将1mol的pHCACoA转化成1mol的乙酰CoA和1mol的p-羟基苯甲醛。p-羟基苯甲醛随后通过存在于细胞质中的内源植物酶的作用转化成pHBA。业已从荧光假单胞菌(AN103)(GenBank登录号Y13067.1)中分离了表征得最清楚的HCHL基因。来自恶臭假单胞菌的HCHL基因的DNA序列(Muheim和Learch，App.Micro.Biotech.，51(4)：456-461(1999))和这种生物的HCHL蛋白的推定的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示。本申请人业已分离了该基因，并且还将它用于在转基因植物中生产pHBA。

用来自近平滑假丝酵母的pHBA 1-羟化酶(脱羧基的)将pHBA转化成氢醌

本发明的方法利用从子囊酵母近平滑假丝酵母(ATCC 7336)中分离的新酶，即pHBA 1-羟化酶(脱羧基的)，将pHBA酶促转化成氢醌(1，4-二羟基苯)。以前业已报道了用于纯化这种酶的六个步骤的方法(Eppink等，J.Bacteriol.，179(21)：6680-6687(1997))。不过，必须强调的是，在所述文献中所披露的最终制剂尽管高度富集了pHBA 1-羟化酶活性，但是它是由蛋白的复杂的混合物组成的。部分纯化的酶制剂中的主要类型是52kDa的多肽，正如通过考马斯-染色的凝胶判断的，并且因此假设它是感兴趣的蛋白。不过，除了它在最终制剂中的相对丰度之外，还没有得出52kDa的多肽决定pHBA 1-羟化酶活性的有说服力的理由。也没有对52kDa多肽的任何分子表征使得人们可以克隆所述基因以便验证这一假说。

在本发明中，申请人业已将来自近平滑假丝酵母的pHBA 1-羟化酶纯化到同质，并且获得了足够的氨基酸序列信息，以便克隆所述基因。测定了全长基因的完整的DNA序列(SEQ ID NO：22)，并且，后者是在大肠杆菌中表达的。为了提供所述克隆的基因确实编码pHBA 1-羟化酶的确切证据，将所得到的重组蛋白(SEQ ID NO：23)纯化到同质，并且证实能催化将pHBA酶促转化成氢醌(实施例1-3；图3-4)。

使用BLASTP分析(默认设置)获得的GenBank与pHBA-1-羟化酶氨基酸序列(SEQ ID NO：23)的最密切的匹配，鉴定了来自Burkholderia fungorum的假设蛋白(GI：22988817；32％同一性；50％相似性；E-值＝6e^-45)。所观察到的低的百分同一性，以及赋予这些序列的未知功能和与SEQ ID NO：23的最高同一性，使得人们不能确定或赋予所述pHBA 1羟化酶基因的功能。另外，SEQ ID NO：23与能催化6-羟基烟酸的氧化脱羧的假单胞属TN5的6-羟基烟酸3-羟化酶具有30.081％的同一性和39.295％的相似性(GAP比对，空位权重：8，长度权重：2)(Nakano等，Eur.J.Biochem.，260(1)：120-126(1999))。这是一种与pHBA的氧化脱羧密切相关的反应，该氧化脱羧是由SEQ ID NO 23所示的酶催化的。不过，这种酶和SEQID NO：23之间的低水平的序列相似性不能提供利用分子生物学的杂交或基于PCR-的技术分离pHBA 1-h羟化酶的手段。

pHBA 1-羟化酶是黄素蛋白单加氧酶。这种酶需要辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和紧密结合的辅因子-黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，用于将pHBA或4-羟基苯甲酸氧化脱羧成氢醌，参见公式1。

公式1.

申请人业已分离了所述基因，并且在两种不同的转基因植物，烟草和拟南芥属(实施例5)中表达了功能性酶。业已说明了在能够超量产生pHBA的转基因植物中表达所述酶的能力。对叶片组织进行的分析表明，表达诸如CPL的pHBA-生产酶和pHBA 1-羟化酶这两者的转基因植物能够产生氢醌，正如通过氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)的出现而测量的，而氢醌葡糖苷在缺少pHBA 1-羟化酶基因的植物(实施例5；图4)中是检测不到的。当所产生的大部分氢醌被内源UDP-葡糖基转移酶迅速葡糖基化时，测量葡糖苷的产生。申请人业已在两种不相关的植物物种中结论性地进行了验证，以便在转基因植物中实现高水平的对苯二酚葡糖苷生产(通过pHBA-生产酶和pHBA 1-羟化酶的共同表达)，没有必要用氢醌-特异性葡糖基转移酶转化所述植物。具有内源葡糖基转移酶活性的植物能有效介导对苯二酚葡糖苷合成。

pHBA 1-羟化酶表达盒

对苯二酚葡糖苷生产可以通过在pHBA-生产植物细胞的细胞质中表达来自酵母的pHBA 1-羟化酶而实现。PHBA可以通过来自植物，真菌，或微生物的合适的pHBA-生产酶表达。可用于将pHBA转化成氢醌的表达盒包括具有完整活性形式的pHBA 1-羟化酶。通常，所述表达盒包括(1)克隆的pHBA 1-羟化酶编码序列，它受5’和3’调控序列的转录控制，和(2)如实施例5所述的显性选择标记。本发明的表达盒还可以包括启动子调控区(例如，赋予诱导型或组成型，环境-或发育调控的，或细胞或组织-特异性/选择性表达的调控区)，转录起始位点，核糖体结合位点，RNA加工信号，转录终止位点，和/或聚腺苷酸化信号。所述盒还可任选包括一个或多个内含子，以便促进pHBA 1-羟化酶表达。在优选实施方案中，所述盒还包括使得能够将pHBA 1-羟化酶有效导向于质体的序列。这些成分包括转运肽以及编码转运肽供体的一部分的序列，所述部分包括转运肽裂解位点，该位点可以由宿主植物细胞叶绿体加工蛋白酶进行加工。在另一种优选实施方案中，pHBA 1-羟化酶基因被直接整合到叶绿体基因组中，并且在使得能够在该细胞器中有效翻译和转录的DNA序列元件的控制下表达。这种生产对苯二酚葡糖苷的方法在pHBA生产酶(即，CPL)同样存在于质体中时是特别有用的。

pHBA 1-羟化酶基因编码能够将1mol的pHBA转化成1mol的CO₂和1mol的氢醌的酶。pHBA 1-羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。

植物基因表达

在本发明中使用的用于驱动基因的启动子(CPL，HCHL，pHBA 1-羟化酶，和UDP-葡糖基转移酶)是多种多样的，并且为本领域所熟知。合适的启动子是能够在植物中操作，并且通常来自存在所述表达盒的植物宿主的启动子。能够诱导所述基因表达的任何启动子和任何终止子的任何组合都可以在本发明中使用。启动子和终止子的某些合适的例子包括35S启动子和来自胭脂碱合酶(nos)，章鱼碱合酶(ocs)，和花椰菜花叶病毒(CaMV)基因的启动子。这些启动子与本发明的遗传序列可操作地连接，能够促进本发明基因产物的表达。可以在本发明中使用的高水平植物启动子包括来自大豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶的小亚基(ss)的启动子(Berry-Lowe等，J.Mol.App.Gen.，1：483-498(1982))，和叶绿素a/b结合蛋白的启动子。已知这两种启动子在植物细胞中是光诱导的(例如，参见Genetic Engineeringof Plants，an Agricultural Perspective，A.Cashmore，Plenum，New York(1983)，pages 29-38；Coruzzi，G.等，J.Bio.Chem.，258：1399(1983)；和Dunsmuir等，J.Mol.App.Gen.，2：285(1983))。

在需要多肽表达时，在本发明中，通常需要在每一个基因的编码区的3′-末端包括聚腺苷酸化区。聚腺苷酸化区可以来自多种植物基因或来自T-DNA。例如，要添加的3′末端序列可以来自胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因，或者来自其他植物基因，或稍不优选的是来自任何其他真核基因。

可以将内含子序列添加到5′非翻译区或部分编码序列的编码序列，以便增加在细胞质中积累的成熟的信息的数量。业已证实在植物和动物表达构建体的转录单位上诱导可剪接的内含子，能够在mRNA和蛋白质水平上将基因表达提高最多1000倍(Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.，8：4395-4405(1988)；Callis等，GenesDev.，1：1183-1200(1987))。基因表达的这种内含子增强作用在位于靠近转录单位的5′末端时通常是最大的。使用玉米内含子Adh1-S内含子1，2，和6，Bronze-1内含子在本领域中是公知的(一般参见TheMaize Handbook，Chapter 116，Freeling and Walbot，Eds.，Springer，New York(1994))。

将CPL蛋白导向叶绿体和其他质体是有用的。通常，这一目的是通过导入叶绿体转运肽实现的，这种肽能够将所表达的蛋白导向质体，并且还有利于将它转入细胞器。有多种已知的叶绿体转运肽，并且可以在本发明中用于将CPL蛋白导向叶绿体，这些转运肽包括，但不局限于来自以下植物的转运肽：Pisum(JP 1986224990；GenBank登录号E00977)，胡萝卜(Luo等，Plant Mol.Biol.，33(4)：709-722(1997)；GenBank登录号Z33383)，烟草属(EP0359617；GenBank登录号A09029)，水稻(bePater等，Plant Mol.Biol.，15(3)：399-406)；GenBank登录号X51911)，以及合成序列(EP0189707；US5728925；US5717084(GenBank登录号A10396和A10398))。优选的是从任何植物中分离的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶)小亚基前体蛋白的叶绿体转运肽。业已对来自多种植物的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基进行了充分的表征，并且来自它们的任何转运肽都适合在本发明中使用。例如，参见与以下植物相关的说明：Physcomitrella(GenBank登录号AW599738)；莲属(GenBank登录号AW428760)；西瓜属(GenBank登录号AI563240)；428760)，烟草属(Appleby等，Heredity，79(6)：557-563(1997))；苜蓿(Khoudi等，Gene 197(1/2)：343-351(1997))；马铃薯和番茄(Fritz等，Gene 137(2)：271-4(1983))；小麦(Galili等，Theor，Appl.Genet.81(1)：98-104(1994))；和稻(Xie等，Sci.Sin.，Ser.B(Engl.Ed.)，30(7)：706-19(1987))。例如，转运肽可以来自从以下植物中分离的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基，这些植物包括，但不局限于大豆，油菜籽，向日葵，棉花，玉米，烟草，苜蓿，小麦，大麦，燕麦，高粱，稻，拟南芥属，甜菜，甘蔗，canola，粟，菜豆，豌豆，黑麦，亚麻，和饲用牧草。优选在本发明中使用的是番茄核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基前体蛋白。

叶绿体导向序列不仅能将需要的蛋白导向叶绿体，而且还能促进将它转运到细胞器中。这一目的是通过利用叶绿体天然拥有的叶绿体加工蛋白酶在合适的转运肽裂解位点上将转运肽从成熟的多肽或蛋白上裂解下来而实现。因此，叶绿体导向序列包括合适的裂解位点，用于将前蛋白正确加工成叶绿体中所包含的活性成熟的多肽。在本发明中优选的是番茄核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基前体蛋白的叶绿体导向序列，所述前体蛋白具有位于天然存在的Cys和Met残基之间的裂解位点，该位点将转运肽与成熟的多肽分开。

用所述功能性CPL表达盒转化合适的植物宿主，以便在叶绿体中表达CPL，并且生产pHBA。实际上，能够支持所述基因表达的任何植物宿主在本发明中都是合适的；不过，优选使用作物，这是因为它们便于收获和具有大的生物量。合适的植物宿主包括，但不局限于，单子叶植物和双子叶植物，如大豆，油菜籽(Brassica napus，B.campestris)，向日葵(向日葵)，棉花(陆地棉)，玉米，烟草(Nicotiana tabacum)，苜蓿(Medicago sativa)，小麦(Triticumsp)，大麦(Hordeum vulgare)，燕麦(Avena sativa，L)，高粱(Sorghum bicolor)，稻(Oryza sativa)，拟南芥属，甜菜，甘蔗，canola，粟，菜豆，豌豆，黑麦，亚麻，和饲用牧草。优选的植物宿主是烟草，拟南芥属，甘蔗，和甜菜。

植物转化

有多种可利用的将构建体导入植物细胞宿主的技术，并且为本领域技术人员所公知。这些技术包括采用根癌土壤杆菌或发根病土壤杆菌作为转化剂用DNA转化，电穿孔，和粒子加速(EP 295959和EP138341)。一种合适的方法涉及使用土壤杆菌种的Ti和Ri质粒的二元型的载体。Ti-衍生的载体能够转化多种高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物，如大豆，棉花，油菜，烟草，和稻(Pacciotti等，Bio/Technology，3：241(1985)；Byrne等，Plant cell，Tissueand Organ Culture，8：3(1987)；Sukhapinda等，Plant Mol.Biol.，8：209-216(1987)；Lorz等，Mol，Gen.Genet.，199：178(1985)；Potrykus等，Mol.Gen.Genet.，199：183(1985)；Park等，J.Plant Biol.，38(4)：365-71(1995)；和Hiei等，Plant J.，6：271-282(1994))。将T-DNA用于转化植物细胞，业已进行了深入的研究，并且进行了充分的说明(EP 120516；Hoekema，In：TheBina Plant Vector system，Offset-drukkerij  Kanters B.V.；Alblasserdam(1985)，Chapter V；Knauf等，Genetic AnalysisofHost Range Expression by Agrobacterium In：Molecular Geneticsof the Bacteria-Plant Interaction，Puhler，A.ed.，Springer-Verlag，New York，1983，p.245；和An等，EMBO J.，4：277-284(1985))。为了导入植物，可以将所述嵌合基因插入二元载体，正如在实施例中所披露的。

其他转化方法为本领域技术人员所公知。其例子包括直接摄入外源DNA构建体(EP 295959)，电穿孔技术(Fromm等，Nature(London)，319：791(1986))，和用由核酸构建体包被的金属颗粒进行高速弹道轰击(Kline等，Nature(London)，327：70(1987)；和US 4945050)。一旦转化，所述细胞可以由本领域技术人员再生。特别相关的是最近披露的用于将外源基因转入商业上重要的作物中的方法，所述作物如油菜籽(De Block等，Plant Physiol.，91：694-701(1989))，向日葵(Everett等，Biol Technology，5：1201(1987))，大豆(McCabe等，Biol Technology，6：923(1988)；Hinchee等，Bio/Technology 6：915(1988)；Chee等，Plant Physiol.91：1212-1218(1989)；Christou等，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，86：7500-7504(1989)；EP 301749)，稻(Hiei等，同上)，和玉米(Gordon-Kamm等，Plant cell，2：603-618(1990)；和Fromm等，Biotechnology，8：833-839(1990))。

将转基因植物细胞细胞放入合适的培养基，以便选择转基因细胞，然后将它生长成愈伤组织。由愈伤组织生长成芽，并且通过在生根培养基上生长由所述芽生长出小植株。通常，各种构建体与标记结合，用于在植物细胞中选择。通常，所述标记可以是对杀生物剂(特别是抗生素，如卡那霉素，G418，博来霉素，潮霉素，氯霉素，或除草剂等)的抗性。与缺少业已导入的DNA的细胞相比，所使用的所述特定标记能选择转化过的细胞。包括转录盒的DNA构建体的成分可以用对宿主来说天然的(内源)或外来的(外源)的序列制备。异源构建体包括对产生所述转录起始区的基因来说不是天然的至少一个区。为了验证转基因在转基因细胞和植物中的存在，可以用本领域技术人员所公知的方法进行Southern印迹分析。

将CPL转运到叶绿体内，并且随后进行加工

本发明对叶绿体导向序列进行操作，以便实现将CPL基因产物转入叶绿体，使它具有足够的酶活性，以便产生合适数量的pHBA底物。申请人业已发现，不仅包括转运肽，而且还包括天然存在的叶绿体裂解位点和转运肽供体的成熟N-末端的一小部分，能够改善叶绿体摄取，和对所述外源蛋白的加工，以便获得将分支酸转化成pHBA的更高转化率。不过，在摄取到所述细胞器中之后，通过叶绿体-加工酶将所述转运肽通过蛋白水解去除，以便产生CPL变体，它具有连接在它的N-末端的小的多肽延伸部分。出乎意料地是，这些额外的氨基酸残基不会干扰CPL酶活性。能表达本发明的嵌合蛋白的转化植物能积累比以前报道过的更大量的pHBA衍生物。对于pHBA生产来说，对这种类型的特异性的需要在现有技术中没有报道过。

唯一报道过的试图在活植物的叶绿体中表达CPL的例子是在Siebert等的文件中披露的(Plant Physiol.112：811-819(1996))。不过，本发明的嵌合蛋白(例如，TP-CPL；SEQ ID NO：34)与Siebert等(同上，1996)中披露的叶绿体-导向形式的大肠杆菌CPL(例如，TP-UbiC)在很多重要方面有过不同，参见US SN 09/855341。例如，本发明的嵌合体包括具有用于有效去除转运肽的明确的裂解位点的叶绿体导向序列。另外，在该特定位点上去除所述转运肽，导致了在成熟的CPL多肽的N-末端区增加了5个额外的氨基酸。相反，在Siebert等(同上1996)的文献中披露的TP-UbiC缺少明确的裂解位点，并且包括插入在大肠杆菌CPL的推定的转运肽裂解位点和起始甲硫氨酸残基之间的由9个氨基酸组成的片段。

所述TP-CPL蛋白由番茄核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基前体的叶绿体转运肽和与大肠杆菌CPL的起始Met残基融合的″成熟的″核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的前四个氨基酸残基组成。因此，TP-CPL不仅包括完整的转运肽，而且还包括高度保守的裂解位点，在这里，转运肽通常会被去除(例如，位于用箭头标出的Cys和Met残基之间)。假设TP-CPL在叶绿体中同样是在该位置上裂解的，所得到的蛋白将会是在它的N-末端具有五个额外氨基酸残基的CPL变体。TP-CPL的预测的叶绿体裂解产物是在大肠杆菌中表达的，并且证实了它在酶活性方面具有完整的功能(SEQ ID NO：34)。

在微生物中由pHBA生产对苯二酚葡糖苷

业已在微生物系统中生产了pHBA。例如，JP 06078780披露了通过在存在苯甲酸的条件下培养能将苯甲酸氧化成pHBA的微生物(优选曲霉属)生产pHBA。另外，业已从土壤中分离了能够将p-甲酚转化成pHBA的肠杆菌菌株(JP 05328981)。另外，JP 05336980和JP05336979披露了恶臭假单胞菌的分离的菌株能够由p-甲酚生产pHBA。类似地，共同拥有的WO 9856920披露了利用缺少表达对-羟基苯甲酸羟化酶(pHBH)的门多萨假单孢菌突变体由甲苯生产pHBA的方法。最后，US 6030819披露了在能表达分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)基因的遗传工程大肠杆菌中生产pHBA。

以前业已披露了用于由氢醌生产对苯二酚葡糖苷的生物转化方法(Arend等，Phytochemistry，53：187-193(2000)；Arend等，Biotech.Bioeng.，76(2)：126-131(2001)；Hefner等，Bioorg.Med.Chem.，10：1731-1741(2002)；和JP 07224083A)。这些方法通常涉及给能表达合适的葡糖基转移酶的植物细胞培养物，组织，或幼苗外源补充氢醌。由Arend等提出的一种类似方法(Biotech.Bioeng.，76(2)：126-131(2001))利用能表达UDP-葡糖基转移酶的重组大肠杆菌菌株将氢醌(昂贵的和有毒的化合物)和UDP-葡萄糖转化成对苯二酚葡糖苷。这些生物转化方法依赖于使用外源供应的氢醌。相反，本发明提供了利用诸如葡萄糖的廉价的，无毒的，可发酵的碳源生产对苯二酚葡糖苷的方法。

由申请人所披露的pHBA 1-羟化酶基因的分子鉴定和分离还使得可以在诸如大肠杆菌的微生物系统中生产对苯二酚葡糖苷(详细参见实施例7和8)。pHBA 1-羟化酶基因在大肠杆菌细胞中与分支酸丙酮酸-裂解酶基因和合适的葡糖基转移酶基因组合表达(实施例6和8)。这三种酶在大肠杆菌中的表达，提供了由诸如葡萄糖的廉价的，可发酵的碳源生产对苯二酚葡糖苷的途径，这是通过建立由分支酸到对苯二酚葡糖苷的三个步骤的途径(图1)。技术人员可以理解的是，该途径所需要的所有辅因子，辅酶和辅底物，如FAD，NADH，O₂，和UDP-葡萄糖(UDPG)都存在于大肠杆菌细胞质中。另外，业已披露了通过增加碳流入莽草酸途径而具有水平升高的分支酸的大肠杆菌菌株(Berry等，Trends Biotech.，14(7)：250-256(1996)；Bongaerts等，Metabolic Engineering，3(4)：289-300(2001)；Tatarko和Romeo，Current Microbiology，43(1)：26-32(2001)；US 6210937；US 5776736；和WO 73484A1)，并且可用于利用下文所披露的方法由葡萄糖生产对苯二酚葡糖苷。

UDP-葡糖基转移酶

对苯二酚葡糖苷与氢醌相比是更有价值的产物。因此，优选将CPL和pHBA 1-羟化酶与合适的葡糖基转移酶组合，用于在诸如大肠杆菌的微生物中通过CPL和pHBA 1-羟化酶的共同表达产生对苯二酚葡糖苷，而不是产生氢醌。生产氢醌葡糖苷，导致了所述分子从细胞释放到生长培养基中，在这里，它能够方便地收获和纯化(Arend等，Biotech.and Bioeng.，76(2)：126-131(2001))。在大肠杆菌中生产对苯二酚葡糖苷，需要编码能够对氢醌进行有效的葡糖基化的酶的葡糖基转移酶基因。业已披露了具有这种特性的酶(Arend等，Phytochemistry，53：187-193(2000)和WO 0107631 A2)。

申请人业已表征了来自拟南芥属的酶，它与印度萝芙木的对苯二酚葡糖苷合酶在氨基酸序列水平上拥有62％的同一性(Gi：28380078；62％同一性；78％相似性；E值＝e^-174)。申请人披露了出乎意料的发现，拟南芥属的酶对氢醌具有极高的催化效力(Km 0.3μM，Kcat42/sec)(实施例6)。本发明的优选实施方案是用携带合成操纵子的质粒转化过的微生物细胞，使得能够表达CPL，pHBA 1-羟化酶，和拟南芥属氢醌葡糖基转移酶(图6)。通常，表达盒依次包括三个编码序列和核糖体结合位点，它们受合适启动子的控制。另外，可以将启动子调控区用于赋予诱导型，组成型，或环境调控的表达。它可以包括转录起始位点，核糖体结合位点，和转录终止位点。在另一种优选实施方案中，上述三个基因被导入分开的质粒上，所述质粒具有能够在大肠杆菌中共存的复制起点。每一个质粒上的表达盒由CPL或pHBA 1-羟化酶基因或拟南芥属葡糖基转移酶基因以及合适的启动子-调控区组成，所述调控区赋予诱导型，组成型，或环境调控的表达。另外，每一个质粒包括转录起始位点，核糖体结合位点，和转录终止位点。

可以用体外方法对pHBA进行氧化脱羧，以便形成氢醌，并且用于随后使用酶催化剂转化成氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)，所述酶催化剂具有1)pHBA 1-羟化酶活性，和2)UDP-葡糖基转移酶活性，它是完整微生物细胞，透化的微生物细胞，微生物细胞提取物的一种或多种成分，部分纯化的酶，或纯化的酶的形式的。优选的是，所述酶催化剂的形式是完整的微生物细胞或部分纯化的或纯化的酶。可以将不同形式的酶催化剂固定在可溶性或不可溶性支持物上或支持物内。

微生物表达

可以将本发明的基因和基因产物导入微生物宿主细胞。用于本发明基因和核酸分子的优选的宿主细胞是微生物宿主，这些宿主可以存在于真菌或细菌家族，并且能够在大范围的温度，pH值，和溶剂耐受性条件下生长。无论用于产生细胞生物物质的碳源如何，功能性基因都能够表达。大规模的微生物生长和功能性基因表达可以使用多种简单的或复杂的碳水化合物，有机酸和醇，并且对于光合或化学自养宿主来说还可以使用诸如甲烷或二氧化碳的饱和烃。不过，所述功能性基因可以通过特殊的生长条件调控，包括氮，磷，硫，氧，碳或任何微量微营养成分(包括小的无机离子)的形式和数量。另外，功能性基因的调控可以通过特殊调控分子的存在或缺乏实现，所述分子被添加到培养物中，并且通常不被认为是养分或能源。生长速度可能同样是基因表达的重要调控因子。合适的宿主菌株的例子包括，但不局限于真菌或酵母物种，如曲霉属，木霉属，糖酵母属，毕赤酵母属，假丝酵母属，汉逊酵母属，或细菌物种，如沙门氏菌属，芽孢杆菌属，不动杆菌属，红球菌属，链霉菌属，埃希氏菌属，假单胞菌属，甲基单胞菌属，甲基细菌属，产碱杆菌属，集胞蓝细菌属，鱼腥蓝细菌属，硫杆菌属，甲烷杆菌属，克氏杆菌属，伯克霍尔德氏菌属，鞘氨醇单胞菌属，副球菌属，Pandoraea，Delftia，和丛毛单胞菌属。

包括能指导外源蛋白高水平表达的调控序列的微生物表达系统和表达载体为本领域技术人员所熟知。可以将任何这样的系统和载体用于构建嵌合基因，以便生产本发明序列的任何基因产物。然后可以通过转化将所述嵌合基因导入合适的微生物，以便提供所述酶的高水平表达。

可用于转化合适的宿主细胞的载体或盒为本领域所熟知。通常，所述载体或框包括指导相关基因转录或翻译的序列，选择标记，使得能够自主复制或染色体整合的序列。合适的载体包括位于所述基因5′的区，它具有转录起始控制，以及位于DNA片段的3′的区，由它控制转录终止。当这两个控制区来自与转化过的宿主细胞同源的基因时是最优选的，不过，可以理解的是，这些控制区不一定来自被选择用作生产宿主的特定物种的天然基因。

用于驱动本发明的ORF在需要的宿主细胞中表达的起始控制区或启动子是多种多样的，并且为本领域技术人员所熟知。实际上，能够驱动所述基因的任何启动子都是适用于本发明的，包括，但不局限于CYC1，HIS3，GAL1，GAL10，ADH1，PGK，PHO5，GAPDH，ADC1，TRP1，URA3，LEU2，ENO，TPI(用于在糖酵母属中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母属中表达)；和lac，ara，tet，trp，IP_L，IP_R，T7，tac，和trc(用于在大肠杆菌中表达)以及amy，apr，npr启动子和各种噬菌体启动子可用于在芽孢杆菌属中表达。

终止控制区还可以来自所述优选宿主的各种天然基因。终止位点可能是不必要的。不过，最优选的是包括这样的位点。

一旦构建了包括本发明的一种或多种基因的合适的表达盒，就可将它用于转化合适的宿主。所述宿主可用于优先催化氢醌或氢醌葡糖苷的形成。

培养系统

典型的分批培养方法是封闭的系统，其中，培养基的组成是在培养开始时设定的，并且在培养过程中不进行人为改变。因此，在培养过程开始时，用需要的生物接种所述培养基，并且在不向该系统中添加任何物质的前提下进行生长或代谢活动。不过，通常，″分批″培养是针对碳源的添加而言的批次，并且尝试控制因子，如pH和氧气浓度。在分批系统中，所述系统的代谢物和生物物质组成恒定地改变，直到所述培养终止。在分批培养中，细胞通过静止停滞期发展到快速生长的对数期，并最终达到静止期，此时，生长速度降低或停止。如果不处理，处在静止期的细胞会最终死亡。处在对数期的细胞通常决定最终产物的总产量或在某些系统中决定中间产物。在其他系统中，可以获得稳定期或指数后期生产。

标准分批系统的一种变化形式是补料-分批系统。补料-分批培养过程同样适用于本发明，并且包括典型的分批系统，所不同的是，底物是随着培养的进行以增量的形式添加的。当代谢物抑制倾向于抑制细胞的代谢作用，并且希望在培养基中具有有限数量的底物时，补料-分批系统是有用的。测定补料-分批系统中的实际底物浓度是困难的，因此，是根据可检测的因素，如pH，溶解的氧，以及诸如二氧化碳的废气的分压的变化估算的。分批和补料-分批培养方法是常见的，并且为本领域所熟知，其例子可以参见以下文献：Thomas D.Brock，InBiotechnology：A Textbook of Industrial Microbiologv，SecondEdition(1989)Sinauer Associates，Inc.，Sunderland，MA.(以下简称为″Brock″)，或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.，36：227(1992)，以上文献被收作本文参考。

商业化生产还可以通过连续培养实现。连续培养是一种开放系统，其中，将确定的培养基连续添加到生物反应器中，同时将等量的条件培养基排出用于处理。连续培养通常能将细胞保持在恒定的高液相密度状态下，其中，细胞主要处在对数期生长。另外，连续培养可以用固定化的细胞进行，其中，连续地添加碳和氮，并且将有价值的产物，副产物或废弃物连续地从细胞团中排出。细胞固定化可以通过使用由天然和/或合成材料的多种固体支持物进行。

连续或半连续培养允许对影响细胞生长或最终产物浓度的一种因素或多种因素中的任一种因素进行调控。例如，一种方法能将限制性的营养诸如碳源和氮水平保持在固定的比例上，并且可以对所有其他的参数进行调控。在其他系统中，能影响生长的多种因素可以连续地改变，同时，通过培养基浊度衡量的细胞浓度保持恒定。连续系统致力于保持稳态生长条件，因此，由于排出培养基而导致的细胞减少必须与培养物中细胞生长速度平衡。在连续培养过程中用于调控养分和生长因子的方法以及用于加快产物形成速度的技术为工业微生物学领域所熟知，并且多种方法披露于Brock的文献中，同上。

酶动力学

催化效率通常表达为Kcat/Km。酶-催化的反应的重要参数包括：

1)转换数(turnover number)(Kcat)，单体酶催化剂的催化能力单位，表示为每秒钟每μmol的酶形成的产物的μmol数，和

2)Km，酶对特定底物的亲和力单位，表示为获得最大速度的50％时的底物浓度。

本发明的优选实施方案是来自近平滑假丝酵母的pHBA 1-羟化酶，对于pHBA来说，它的Km为＜1μM，而Kcat至少为约9.5/sec，而对于氢醌来说，来自拟南芥(UGT72B1)的葡糖基转移酶的Km为＜1μM，而Kcat至少为42/sec。

                        实施例

在以下实施例中对本发明做进一步的说明。应当理解的是，这些实施例尽管表明了本发明的优选实施方案，但是仅仅是以举例形式提供的。

一般方法

用于实施例中的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且披露于以下文献中：Maniatis，Silhavy，和Ausubel(同上)。

适合保持和生长细菌培养物的材料和方法为本领域所熟知。适用于以下实施例中的技术可以在以下文献中查阅到：Manual of Methodsfor General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg，and G.Briggs Philips，eds)，American Society forMicrobiology，Washington，DC(1994))或Brock(同上)。用于生长和维持细菌细胞的所有试剂，限制酶和材料都是从以下公司获得的，除非另有说明：Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，DIFCOLaboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)。

遗传序列的操作是使用可以从Genetics Computer Group Inc.获得的程序组(Wisconsin Package Version 9.0，Genetics ComputerGroup(GCG)，Madison，WI)完成的。GCG程序″Pileup″采用的空位产生默认值为12，空位延伸默认值为4。CGC″Gap″或″Bestfit″程序使用的默认空位产生罚分为50，默认空位延伸罚分为3。在任何场合下，当GCG程序参数在上述或任何其他GCG程序中没有提到时，当使用默认值。

缩略语的含义如下：″h″表示小时，″min″表示分钟，″sec″表示秒，″d″表示天，″mL″表示毫升，″L″表示升，″μL″表示微升，″g″表示克，″mg″表示毫克，″μg″表示微克，″M″表示摩尔，″mM″表示毫摩尔，而″μM″表示微摩尔。

                        实施例1

近平滑假丝酵母ATCC 7336的生长和pHBA 1-羟化酶活性的分析

在YM培养基平板上建立酵母培养物(配制为每升：3g酵母提取物，3g麦芽提取物，5g蛋白胨，10g葡萄糖，和15g琼脂)，所述培养物来自冷冻干燥的ATCC培养物原液。让所述酵母细胞在30℃下在无菌条件下在含有二倍浓度的Reader’s培养基的液体培养基或琼脂平板上生长(配制为每升：3g(NH₄)₂SO₄，1.4g MgSO₄·7H₂O，1gNaCl，0.4gCaCl₂·2H₂O，2g KH₂PO₄，0.2g K₂HPO₄，0.4mg H₃BO₃，0.4mg MnCl₂，0.4mg Na₂MoO₄，0.4mg ZnSO₄，0.2mg KI，0.2mgCoCl₂，0.08mg Cu SO₄，0.1mg FeCl₃，0.4mg泛酸盐，0.4mg烟酸，0.4mg吡哆醇，0.4mg对-氨基苯甲酸，0.8mg肌醇，和0.0025mg生物素)。所述碳源是100mM葡萄糖或1mM，10mM，或100mMpHBA。申请人确定了近平滑假丝酵母(ATCC 7336)能够在以pHBA作为唯一的碳源的条件下生长。在固化培养基上的最佳生长是在10mMpHBA的浓度下观察到的。将含有100mM葡萄糖或下文所披露的浓度的pHBA的浓缩Reader’s培养基的培养物(500mL)中接种从10mM pHBA平板上获得的酵母细胞的单菌落。

包括pHBA作为唯一碳源的培养物的生长是按以下方法进行的。接种包括1mM pHBA的浓缩的Reader’s培养基(250mL)，并且让它在30℃下生长24小时。然后将该培养物的最终pHBA浓度调整到5mMpHBA，使浓缩的Reader’s培养基含有50mM pHBA。再经过24小时之后，将pHBA浓度调整到最终浓度为10mM。让细胞再生长24小时，然后再添加pHBA，使相应于最终浓度为10mM。再经过24小时之后，通过离心(5000xg，10分钟)收获细胞。将存在葡萄糖或pHBA作为唯一的碳源的条件下生长的细胞重新悬浮在10mL包括20mM Tris/H₂SO₄(pH 7.8)，0.5mM DTT，0.5mM EDTA，0.5mM PMSF，和10μM FAD的溶液中。通过让细胞两次通过弗氏压碎器制备无细胞提取物，然后在4℃下以30000xg的速度离心20分钟。使用Bradford试剂(Bio-Rad，Hercules，CA)测定蛋白浓度。

按以下方法测定pHBA1-羟化酶活性。将相当于200μg总蛋白的无细胞提取物在37℃下在100μl的最终体积中，在存在50mM KPO₄(pH 7.6)，1mM pHBA，和2mM NADH的条件下培养。通过添加等体积的含有12％(v/v)乙酸的甲醇(MeOH)终止所述反应。通过离心(13000xg，10分钟)澄清所述反应产物，并且按以下方法通过HPLC进行分析。将反应产物(10μL)注入Nova Pak C18柱(3.9×150mM，60，4μm)(Waters，MA，USA)。所述柱是1mL/分钟的流速在以下条件下洗脱的：溶剂A(H₂O，/1.5％HPO₄)，溶剂B(48％乙腈/H₂O/1.5％H PO₄)；0-5min 0％B，5-20min 0-100％B(线性梯度)，20-21min 100-0％B，21-25min 0％B。在254nm的波长下检测pHBA的吸收，并且在288nm的波长下检测氢醌的吸收。根据与真正的pHBA和氢醌标准物不可区分的驻留时间和UV吸收光谱鉴定酶反应产物中的相当于pHBA和氢醌的化合物。HPLC分析发现，以pHBA作为唯一的碳源生长的细胞的蛋白提取物包括能够在存在NADH的条件下将pHBA转化成氢醌的酶活性。在20分钟之后，在酶测定中氢醌浓度为260μM，表明起始pHBA的26％业已转化成氢醌。当在存在葡萄糖的条件下生长的细胞的蛋白提取物在相同的条件下检测时没有检测到氢醌形成。

pHBA 1-羟化酶活性的测定

按以下方法测定pHBA 1-羟化酶比活性：将100μg的近平滑假丝酵母蛋白(ATCC 7336)添加到500μL的反应培养基中，该培养基含有0.1mM pHBA，0.2mM NADH，10μM FAD，和50mM KPO₄(pH 7.6)。通过在340nm波长下监测吸收，测定NADH氧化速度。与pHBA 1-羟化酶活性无关的在近平滑假丝酵母蛋白提取物中的NADH氧化酶活性是在没有pHBA的条件下在相同的条件下测定的。pHBA 1-羟化酶比活性是用6250M^-1作为NADH的吸收系数计算的，并且发现对于pHBA作为唯一的碳源生长的近平滑假丝酵母细胞来说，其活性为0.14U/mg蛋白。申请人业已在近平滑假丝酵母(ATCC 7336)中证实，pHBA 1-羟化酶表达在细胞在pHBA作为唯一的碳源的条件下生长时被高度诱导。

                    实施例2

纯化pHBA 1-羟化酶，测定纯化蛋白的部分氨基酸序列，并且对编码pHBA 1-羟化酶蛋白的cDNA进行克隆和测序。

用以10mM pHBA作为唯一的碳源的平板上生长的近平滑假丝酵母(ATCC 7336)的菌落接种两个5L的烧瓶，每一个烧瓶装有1L的二倍浓度的Reader’s培养基(Karasevich和Ivoilov，Mikrobiologiya，46(5)：846-56(1977))，该培养基含有1mM的pHBA。每一种培养物都以24小时的间隔连续地添加含有50mM的pHBA的100，300，和600mL的二倍浓度的Reader’s培养基。在最后一次添加pHBA之后24小时收获细胞。因此，4L的酵母培养物是在以下条件下生长的，其中在96小时的时间间隔内，将pHBA的浓度从1mM逐渐提高到最终浓度为26mM。

通过离心(5000xg，10分钟)收获细胞，并且重新悬浮在35mL的20mM Tris/H₂SO₄(pH 7.8)，0.5mM DTT，0.5mM EDTA，0.5mM PMSF，和10μM FAD中。让细胞悬浮液两次通过弗氏压碎器，并且通过离心澄清(30000xg，20分钟，4℃)。以7％(v/v)的最终浓度添加甘油。该提取物在-80℃下保存，而又不丧失pHBA 1-羟化酶活性。蛋白浓度为16.25mg/mL，比活性为0.129U/mg蛋白。所述培养物提供了40mL的蛋白提取物，相当于总共650mg的蛋白含有84个单位的pHBA 1-羟化酶活性。

将二十毫升的粗制提取物在PD-10柱上的2.5mL的等份样品中(Pharmacia Biotech，Milwaukee，WI)进行缓冲液交换，将它交换到10mM Tris/H₂SO₄(pH 7.8)，0.5mM DTT，0.5mM EDTA，和10μM FAD中；该步骤之后的最终体积为28mL，并且回收了85％的原始酶活性。将十四毫升的该材料加样到MonoQ HR 10/10柱(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ.)上，该柱在25C℃下用缓冲液Q(10mM Tris/H₂SO₄(pH 7.8)，0.5mM DTT，0.5mM EDTA，和10μM FAD)预平衡。在前12分钟用缓冲液Q以4mL/分钟的速度洗脱该柱。然后用0-100mM Na₂SO₄的线性梯度(80mL)(在缓冲液Q中)洗脱。从所述梯度的开始收集级份(8mL)，并且保持在冰上，以便随后测定酶活性。然后用1M Na₂SO₄(在缓冲液Q中)充分洗涤所述柱，并且重建初始条件。

用相同的方式处理其余14mL的PD-10洗脱液，并且通过分光光度测定法测定来自两个MonoQ柱的级份的pHBA 1-羟化酶活性。合并活性最高的级份(来自第一个柱的3号级份和来自第二个柱的3号和4号级份)，并且补充50mM Na₂SO₄和7％(v/v)甘油；回收了26单位的pHBA 1-羟化酶活性。用Centriprep-10(Millipore Corp.，Bedford，MA)将合并的级份浓缩到2.3mL，并且通过0.2μM Acrodisc过滤器(Gelman-Pall Life Sciences：Cat.No.4192)过滤。然后在21×600mM TSK-GelG3000SW凝胶过滤柱上分离二十毫升的该材料(Tosoh Biosep LLC.，Montgomeryville，PA)。用100mM磷酸钾(pH 7.7)，0.5mM EDTA，0.5mM DTT，和15μM FAD(25℃)以4mL/分钟的速度洗脱所述柱，并且收集2mL的级份。通过分光光度测定分析后者的pHBA1-羟化酶活性，并且合并四种活性最高的级份。从所述柱上回收的酶活性为55％(12.5U)。

将合并的级份浓缩到5mL，并且使用两个PD-10柱(Pharmacia)缓冲液交换到10mM磷酸钠(pH 6.8)，10μM CaCl₂，1mM DTT，和20μM FAD(缓冲液W)。然后将所有7-mL样品加样到7.8×100mMBio-Gel HPHT羟磷灰石柱(Bio-Rad，Hercules，CA)上，该柱是在25℃用缓冲液W预平衡的。用缓冲液W以0.5mL/分钟的速度洗脱所述柱14分钟，然后用存在于缓冲液W中10-350mM磷酸钠的线性梯度(30mL)(pH 6.8)洗脱；收集1mL级份。根据分光光度测定，合并在40-50分钟之间洗脱的pHBA 1-羟化酶，并且合并具有最大活性的两个级份。合并的材料包括4.9单位的酶活性。然后用50mM Na₂SO₄和7％(v/v)甘油补充所述样品，并且在-80℃下保存以便进一步操作。

在考马斯染色的凝胶上对所述羟磷灰石合并物进行的肉眼检查，发现了存在两条带，这两条带的表观分子量为49和52kDa。为了确定哪一种多肽是pHBA 1-羟化酶，使用PD-10柱将1mL的羟磷灰石合并物的等份样品缓冲液交换到缓冲液Z(10mM Tris/H₂SO₄(pH 7.5)，1mM DTT，和0.5mM EDTA)中。最终体积为3.5mL，并且根据分光光度测定所述样品包含1.28个单位的酶活性。然后将整个样品加样到MonoQ HR 5/5柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上，所述柱是在25℃下用缓冲液Z预平衡的。前5分钟用缓冲液Z以1mL/分钟的速度洗脱所述柱，然后通过0-100mM Na₂SO₄的线性梯度(20mL)(在缓冲液Z中)洗脱。

在所述柱上出现了两个主要的280nm-的吸收峰，并且收集这两个峰。较大的峰是在8.1-8.9min之间洗脱的，根据考马斯染色的凝胶判断它只包括52kDa的多肽。该峰还包括1.14个单位的pHBA 1-羟化酶活性，该活性大约为加样到所述MonoQ柱上总活性的大约90％。较小的峰是在8.9-10.2分钟之间洗脱的，它包括48kDa的多肽和多种次要污染物。不过，重要的是，该峰只包括0.02个单位的pHBA 1-羟化酶活性，该活性不到加样到所述柱上的原始酶活性的2％。根据以上观察得出的结论是，MonoQ柱上的第一个峰的52kDa的多肽是近平滑假丝酵母(ATCC 7336)的pHBA 1-羟化酶。在所述柱级份中补充100mM Na₂SO₄和7％(v/v)甘油，并且在-80℃下保存。最终体积为1.0mL，并且所述样品包括大约50μg的纯化酶。如下文所述，将该材料的等份样品用于胰蛋白酶消化，以便制备用于氨基酸序列分析的肽片段。根据粗制提取物原材料的比活性(0.129U/mg蛋白)和纯化的蛋白的最终制剂(22.8U/mg)，采用上述方法将pHBA 1-羟化酶纯化了大约180倍。

氨基酸序列测定

为了测定完整的pHBA 1-羟化酶的N-末端氨基酸序列，将含有部分纯化的蛋白的800μl的羟磷灰石合并物干燥，并且悬浮在SDS样品缓冲液中。将所述样品加样到预先铸造的Novex SDS-PAGE凝胶(Invitrogen，USA)上，并且按照生产商的说明进行电泳。将分离的蛋白电吸印到聚偏二氟乙烯膜上(Novex，CA，USA)，然后用去离子水洗涤所述膜，并且用0.1％考马斯蓝G250(Invitrogen，USA)染色。使用Beckman-Coulter LF3000气相蛋白测试仪对相当于pHBA 1-羟化酶的染色的52kDa的带进行自动Edman降解。通过前24轮Edman降解，获得了以下氨基酸序列：

SEQ ID NO：1 Ala-Val-Gln-Ala-Pro-Ser-Lys-Thr-Tyr-Gly-Phe-Gln-Lys-Ala-Pro-lle-Gln-Leu-Thr-Phe-Val-Val-Val-Gly

其他氨基酸序列信息是通过以下方法获得的：对纯化的蛋白进行蛋白水解降解，然后进行HPLC分离，并且对所得到的肽片段进行Edman降解。用Centricon-10(Millipore Corp.，Bedford，MA)将纯化的pHBA 1-羟化酶浓缩到每毫升大约0.33mg蛋白。在实验即将开始之前制备胰蛋白酶母液，并且在冰上保存待用。后者包括20μg的TPCK处理的，测序级胰蛋白酶(Promega)，将所述酶溶解在266μl的冰醋酸中。所述胰蛋白酶消化反应组装在冰上的1.5mL聚丙烯微离心管中。完整的反应系统包括以下成分：(a)20μL的纯化的pHBA 1-羟化酶(6.6μg蛋白)，(b)20μL的胰蛋白酶反应缓冲液(100mM Tris-HCl(pH 8)，0.3M NaCl，2mM CaCl₂，2H₂O)，和(c)4μL的胰蛋白酶母液。然后将所述组装的反应混合物转移到37℃的水浴中。在经过90分钟的温育时间之后用4.8μL的溶解在异丙醇中的新制备的10mM PMSF苯甲烷磺酰氟(Sigma)终止反应。终止的反应物在-20℃下保存，以便随后按以下方法进行HPLC分析。

所述消化过的蛋白样品补充50μL的溶解在水中的0.1％(v/v)TFA，并且将80μL在RP 8 SymmetryShield^TM柱(Waters，MA，USA)上分离，柱的尺寸为2.1×150mM(100，5μm)，流速为0.4mL/分钟，采用以下条件：溶剂A：H₂O，0.1％(v/v)TFA，溶剂B：乙腈，0.1％(v/v)TFA；0-2min 2％B，2-5min 2-10％B，5-55min10-35％B，55-85min 35-85％B，85-86min 85-100％B，86-90min 100％B，90-91min 100-2％B，100min 2％B。在210nm波长下监测肽的洗脱，并且手工收集级份。小心控制的实验确定，采集到的用于N-末端序列分析的多肽峰来自胰蛋白酶对pHBA 1-羟化酶的消化。换句话说，如果在消化反应混合物中消除胰蛋白酶或pHBA 1-羟化酶，就不会出现所述峰。在Sequelon AA膜(芳基-氨基衍生化的PVDF，Millipore，USA)上对包括蛋白水解片段的三种级份进行干燥，并且使用Beckman-Coulter LF3000气相蛋白测序仪，进行自动化Edman降解。肽4得到的序列为Asn-Pro-Thr-Tyr-Thr-Tyr-Pro(SEQID NO：2)。肽5得到的序列为Gln-Tyr-Val-Gly-Asp-Val-lle-Val-Gly-Tyr-Asp-Gly-Val-Arg)(SEQ ID NO：3)。肽6得到的序列为Ala-Leu-Leu-Thr-Gly-Asp-Ser-Ser-Gly-Ala-Tyr-Asp-Thr(SEQ ID NO：4)。

如上文所述，在存在25mM pHBA作为唯一的碳源的条件下，让6升的近平滑假丝酵母培养物(ATCC 7336)生长96小时。收获培养物(200mL)，并且通过测定无细胞提取物中pHBA 1-羟化酶的比活性确定pHBA 1-羟化酶活性的诱导。测定的pHBA 1-羟化酶活性为0.13U/mg。通过离心收获其余的培养物，并且用去离子水洗涤。

通过用热的酸性苯酚提取而分离总RNA。简单地讲，将细胞沉淀物重新悬浮在5mL的10mM Tris/HCl(pH 7.5)，10mM EDTA，0.5％(w/v)SDS中，并且加入等体积的液化的、水饱和的苯酚。剧烈混合酵母/苯酚悬浮液，并且在65℃下温育45分钟，偶尔进行混合。对细胞裂解液进行离心(10000xg，20min)，并且用苯酚和氯仿对水相进行连续的萃取。用乙酸钠(pH 5.3)补充所述水相，使最终浓度达到0.3M。通过添加二倍体积(10mL)的乙醇使核酸沉淀，然后进行离心。用70％乙醇洗涤RNA，重新悬浮在水中，通过在变性琼脂糖凝胶上电泳观察，并且通过分光光度法定量。可以从6L酵母培养物中分离大约4mg的总RNA。还可以用类似方法从在存在100mM葡萄糖的条件生长的1L的近平滑假丝酵母培养物中分离总RNA。

按照生产商的说明，使用从MBI Fermentas(Amherst，NY)购买的第一条链cDNA合成试剂盒，使用在存在葡萄糖或pHBA作为唯一的碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母培养物中分离的5μg总RNA制备互补的DNA(cDNA)。按照由纯化的pHBA 1-羟化酶蛋白的部分氨基酸序列提供的序列信息合成两种简并的寡核苷酸(引物1和引物2)。

引物1-(SEQ ID NO：5)

5′-ATGGCNGTNCARGCNCCNWSNAARACNTAYGG-3′

引物2-(SEQ ID NO：6)

5′-CCRTCRTANCCNACDATNACRTCNCCNACRTA-3′

R表示A/G，W表示A/T，S表示C/G，D表示A/G/T，而N表示肌苷核苷酸被掺入合成的寡核苷酸的位置(MWG Biotech，High Point，NC)。引物1是由纯化的pHBA 1-羟化酶蛋白的N-末端前11个氨基酸的序列逆翻译而来的，包括起始甲硫氨酸(它不能通过Edman降解检测，因为它通常在翻译之后去除)。该序列(Met-Ala-Val-Gln-Ala-Pro-Ser-Lys-Thr-Tyr-Gly)如SEQ ID NO：7所示。引物2是从肽5的11个氨基酸的序列逆翻译而来的DNA序列的反向互补序列。所述11个氨基酸的序列(Tyr-Val-Gly-Asp-Val-Ile-Val-Gly-Tyr-Asp-Gly)如SEQ ID NO：8所示。

制备含有2.5mM MgCl₂，2mM dNTPs，10mM Tris/HCl(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％ Nonidet P40，1μM的引物1和引物2，10UTaq聚合酶(MBI Fermentas)，和2μL的cDNA模板的PCR反应混合物(400μL)。将所述PCR混合物分成八个50μL的等分样品，并且进行每一个PCR反应，其中，退火温度(增量为两度)为40℃-54℃。进行40轮扩增，每一轮包括94℃下45秒，在相应的退火温度下45秒，和72℃下1分钟。500bp的DNA片段可以在所有退火温度下扩增。该片段对于来自pHBA作为唯一的碳源生长的近平滑假丝酵母细胞的cDNA模板来说是特异的。对所述PCR片段进行凝胶纯化，并且克隆到pCR2.1载体(Invitrogen，USA)上，所述克隆使用TOPO T/A克隆试剂盒(Invitrogen，USA)，按照生产商的说明进行。从十个独立衍生的大肠杆菌克隆中分离质粒DNA，并且进行DNA测序。使用Lasergene软件包(DNASTAR，Madison，WI)的SeqMan程序对DNA序列进行比对，产生了如SEQ ID NO：9所示的具有518个核苷酸的共有DNA序列。该DNA序列可以翻译成具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列的蛋白片段。推定的氨基酸序列包括N-末端的14个氨基酸，它是通过对纯化的pHBA 1-羟化酶蛋白进行Edman降解测定的。由于该氨基酸序列没有用于核苷酸设计，申请人得出的结论是，纯化了编码pHBAl-羟化酶的前173个氨基酸残基的PCR片段。有趣的是，蛋白片段包括与黄素结合基序(Gly-x-Gly-x-x-Gly)匹配的Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly(SEQ ID NO：10，25-30号位置)序列，所述基序是原核和真核来源的黄素决定型单加氧酶的统一的特征。

通过以下的3′RACE(Invitrogen)分离pHBA 1-羟化酶的其余部分。按照生产商的说明，使用来自MBI Fermentas的第一链cDNA合成试剂盒和引物3，使用从在存在葡萄糖或pHBA作为唯一的碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母培养物中分离的5μg总RNA制备互补DNA(cDNA)。

引物3-(SEQ ID NO：11)

5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTTTTTTT-3′

制备PCR反应混合物(400μl)，它包括2.5mM MgCl₂，2mM dNTPs，10mM Tris/HCl(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40，1μM的引物4和引物5，10UTaq聚合酶(MBI Fermentas)和2μl的cDNA模板。将所述PCR混合物分成四个100μl的等份样品，并且分别进行每一种PCR反应，其中退火温度范围为(增量温度为两度)54℃-60℃。进进行40轮扩增，每一轮包括94℃下45秒，在相应的退火温度下45秒，和72℃下1分钟。

引物4-(SEQ ID NO：12)

5′-GGTTGATAGAGCCGAAGAATTGGGGGTTGAAATCC-3′

引物5-(SEQ ID NO：13)

5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′

引物4相当于以前分离的pHBA 1-羟化酶cDNA的PCR片段的384-418号核苷酸，并且引物5的3′末端与用引物3制备的每一种cDNA退火。在所有退火温度下都可以扩增1100bp的DNA片段，该片段在对pHBA为唯一碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母细胞的cDNA模板特异。对所述DNA片段进行凝胶纯化。制备PCR反应混合物(1mL)，它包括2.5mM MgCl₂，2mM dNTPs，10mM Tris/HCL(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40，1μM的引物4和引物5，和20UTaq聚合酶，并且分成100μL的等份。所述等份接受1-10μL的凝胶纯化的PCR产物的1∶100的稀释液。进行40轮扩增，每一轮包括94℃下45秒，60℃下45秒，和72℃下1分钟。对重新扩增的PCR产物进行凝胶纯化，并且按照生产商的说明，使用TOPO T/A克隆试剂盒克隆到pCR2.1载体上。

从四种独立产生的大肠杆菌克隆中分离质粒DNA，并且进行DNA测序。使用Lasergene软件包(DNASTAR)的SeqMan程序对新的DNA序列和pHBA 1-羟化酶cDNA的预先克隆的片段的DNA序列(SEQ ID NO：9)进行比对，由此产生了如SEQ ID NO：14所示的具有1526个核苷酸的共有DNA序列。该序列包括具有1440个核苷酸的开放读框(ORF)(SEQ ID NO：15)，它能翻译成具有480个氨基酸的蛋白(SEQ ID NO：16)。该蛋白的氨基酸序列包括由纯化的pHBA 1-羟化酶蛋白(参见SEQ ID Nos：1-4)产生的所有序列信息，只有两个氨基酸残基例外。SEQ ID NO：16的7号残基是色氨酸，而对pHBA 1-羟化酶蛋白(SEQ IDNO：1)的N-末端进行的序列分析发现在该位置是丝氨酸。对所有十个PCR产生的克隆(参见上文)的序列比对进行仔细检查，发现引物1(SEQID NO：5)的序列WSN业已转变成TGG(它编码Trp)，在十个克隆中有六个是这种情况。在其他四个克隆中，测定了序列TCG(它编码Ser)。因此，实验测定的pHBA 1-羟化酶的序列和PCR-产生的cDNA的推定的氨基酸序列之间的差异是实验假象，它可能是由于使用简并寡核苷酸引物所造成的。

所述蛋白的部分氨基酸序列和PCR-产生的cDNA的推定的氨基酸序列之间的第二种差异涉及肽5的第三个氨基酸(缬氨酸)，它在SEQID NO：16上是丝氨酸。仔细检查来自肽5的Edman降解结果发现，在第三轮降解中，检测到了相当于丝氨酸的第二个峰，并且该峰几乎与缬氨酸一样丰富。

进行5’RACE实验，以便确定pHBA 1-羟化酶转录物的5′区的确切序列。简单地讲，按照生产商的说明，使用来自MBI Fermentas的第一链cDNA合成试剂盒和引物6，用从在存在pHBA作为唯一的碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母培养物中分离的5μg总RNA制备互补DNA(cDNA)。该引物相当于pHBA1-羟化酶开放读框(SEQ ID NO：15)的384-418号核苷酸的序列的反向互补序列。

引物6-(SEQ ID NO：17)

5′-GGATTTCAACCCCCAATTCTTCGGCTCTATCAACC-3′

在逆转录酶反应结束之后，按照生产商的说明用RNAseH(Stratagene，LaYolla，CA)消化RNA。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，MD)净化cDNA，并且按照生产商的说明，用重组生产的小牛胸腺末端转移酶(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)进行C-加尾。

合并PCR反应混合物(100μL)，它包括2.5mM MgCl₂，2mM dNTPs，10mM Tris/HCl(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40，1μM的引物7和引物8，10U Taq聚合酶，和2μL的C-加尾的cDNA模板。将PCR混合物分成两个100-μL的等份，并且分别在50℃和52℃的退火温度下进行两次PCR反应，进行40轮扩增，每一轮包括94℃下45秒，在相应的退火温度下45秒，和72℃下1分钟。引物7与所述cDNA的C-尾退火。引物8表示pHBA1-羟化酶开放读框(SEQ ID NO：15)的175-204号核苷酸的序列的反向互补序列。

引物7-(SEQ ID NO：18)

5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGNNGGGNNGGGNNG-3′

引物8-(SEQ ID NO：19)

5′-CTTGGTTGATGGTGGTGGAATTTGAATACC-3′

″N ″表示肌苷核苷酸掺入到合成寡核苷酸上的位置。对200-400bp的PCR产物进行凝胶纯化。凝胶纯化的DNA以1∶1000的比例稀释，并且将10μL用于PCR反应混合物(1mL)，它包括2.5mMMgCl2，2mM dNTPs，10mM Tris/HCl(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％ Nonidet P40，1μM的引物7和引物8，和20U Taq聚合酶。将PCR混合物分成十个100μL的等份，并且进行40轮PCR，每一轮包括94℃下45秒，52℃下45秒，和72℃下1分钟。对再次扩增的PCR产物进行凝胶纯化，并且按照生产商的说明，使用TOPOT/A克隆试剂盒克隆到pCR2.1载体上。质粒DNA是从两个独立衍生的大肠杆菌克隆中分离的，并且进行DNA测序。发现这两种克隆包括具有264bp的相同的DNA片段，它包括pHBA 1-羟化酶开放读框的前204个核苷酸，和具有新序列的60个核苷酸，它相当于pHBA1-羟化酶转录物的5′非翻译区。5′RACE产物的核苷酸序列如SEQ IDNO：20所示。

来自RT-PCR实验，3’RACE实验(通过SEQ ID NO：14的共有序列表示)，和5’RACE实验(通过SEQ ID NO：20的共有序列表示)的DNA序列使用Lasergene软件包(DNASTAR)的SeqMan进行比对，由此产生了如SEQ ID NO：21所示的具有1586个核苷酸的共有DNA序列。该序列是pHBA 1-羟化酶转录物的确切序列，包括具有60个核苷酸的5′非翻译区，具有1440个核苷酸的编码区，具有66个核苷酸的3′非翻译区，以及具有20个核苷酸的聚腺苷酸尾。编码pHBA 1-羟化酶蛋白的开放读框如SEQ ID NO：22所示。该序列向pHBA 1-羟化酶蛋白的一级氨基酸序列的概念性翻译如SEQ ID NO：23所示。

                    实施例3

在大肠杆菌中表达pHBA 1-羟化酶基因，并且对重组产生的

              pHBA1-羟化酶进行生化表征。

本研究是在了解pHBA 1-羟化酶转录物(SEQ ID NO：21)的确切序列之前开始的。按照生产商的说明，使用购自MBI Fermentas的第一链cDNA合成试剂盒，使用在存在pHBA作为唯一的碳源的条件下生长的近平滑假丝酵母(ATCC 7336)培养物中分离的5μg总RNA制备互补DNA(cDNA)。合成了新的引物(引物9)。

引物9-(SEQ ID NO：24)

5′- CCCGCACATaagctt AGCCTGATGCACTTAATGG-3′引物9的加下划线的核苷酸序列与pHBA1-羟化酶的3′末端退火。用小写字母表示的核苷酸仅随终止密码子之后导入了HindIII限制位点。

合并PCR反应混合物(100μL)，它包括2.5mM MgCl₂，2mM dNTPs，10mM Tris/HCl(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40，1μM的引物1(SEQ ID NO：5)和引物9，10U Taq聚合酶，和2μL的cDNA模板。进行30轮PCR，每一轮包括94℃下45秒，54℃下45秒，和72℃下1分钟。对PCR产物进行凝胶纯化，并且按照生产商的说明，使用TOPO T/A克隆试剂盒克隆到pCR2.1载体上。

质粒DNA是从六个独立产生的大肠杆菌克隆中分离的，并且进行DNA测序。将所述DNA序列与SEQ ID NO：14进行比较发现，这两种克隆的核苷酸序列都没有PCR诱导的突变。不过，由于上述原因，这两种克隆携带有T GG密码子(编码色氨酸残基)，位于pHBA 1-羟化酶蛋白的7号位置上，而不是通过对纯化的pHBA 1-羟化酶蛋白的N-末端进行Edman降解确定的T CG密码子(编码丝氨酸残基)。因此，所述克隆的DNA插入片段不能直接用于pHBA 1-羟化酶基因的异源表达。相反，合成了新的引物(引物10，SEQ ID NO：25)。

引物10-(SEQ ID NO：25)

5′- GAATTCGCCcat ATGGCGGTGCAGGCGCCGTCGAAGACG-3′引物10的加下划线的核苷酸与pHBA 1-羟化酶转录物在5′末端退火。用小写字母表示的核苷酸在起始密码子上导入了Nde I限制位点。用粗体表示的核苷酸将用引物1制备的PCR产物的TGG密码子改变成了编码丝氨酸的TCG密码子。斜体加下划线的核苷酸与用于克隆代表pHBA 1-羟化酶蛋白的编码区的PCR产物的pCR2.1载体上的序列退火。

将上述PCR无错误克隆的质粒DNA和引物9和10用于扩增适合克隆到pET29A载体上的PCR片段。制备PCR反应混合物(100μL)，它包括2.5mM MgCl₂，2mM dNTPs，10mM Tris/HCl(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40，1μM的引物10和引物9，10U taq聚合酶，和10ng的质粒DNA。进行25轮PCR，每一轮包括94℃下45秒，60℃下45秒，和72℃下1分钟。用Nde I和Hind III消化PCR产物，进行凝胶纯化，并且连接到业已用相同的酶消化过的pET29ADNA上。

回收三种重组克隆。分离质粒DNA并且进行测序。没有发现PCR-诱导的突变。克隆到pET29a载体上的插入片段的DNA序列如SEQ IDNO：26所示。它编码具有与SEQ ID NO：23相同的氨基酸序列的酶。将具有pHBA 1-羟化酶插入片段的pET29a构建体的质粒DNA电穿孔到大肠杆菌BL21 DE3细胞(Novagen，Madison，WI)中。将重组克隆用于接种100mL的LB培养基，该培养基含有50μg/mL卡那霉素。让所述培养物在37℃下生长，直到细胞达到OD_λ＝600nm为0.6的密度。随后，在冰上将所述培养物冷却到室温，添加IPTG至最终浓度为0.2mM，并且让所述培养物在23℃下生长24小时。

通过离心收获培养物(1.5mL)。用10mM Tris/H₂SO₄(pH 7.8)，0.5mM DTT，0.5mM EDTA，10μM FAD洗涤细胞，并最终重新悬浮在150μL相同的缓冲液中。将甲苯(15μL)添加到所述细胞悬浮液中，并且在37℃下温育细胞10分钟。合并25μL反应混合物，它含有1mMpHBA，2mM NADH，10μM FAD，和10mM KPO₄(pH 7.6)，并且该反应混合物接受15μL的自近平滑假丝酵母中纯化的pHBA 1-羟化酶(1.14U/mL)或15μL的甲苯-处理过的大肠杆菌细胞悬浮液。在30℃下温育酶反应物30分钟。通过添加等体积的含有12％(v/v)乙酸的MeOH终止该反应。

通过离心澄清所述反应产物(13000xg，10分钟)并且按以下方法通过HPLC进行分析。将反应产物(10μL)注入Nova Pak C18柱(3.9×150mM，60，4μm)(Waters，MA，USA)。所述柱是以1mL/分钟的流速在以下条件下洗脱的：溶剂A(H₂O，/1.5％HPO₄)，溶剂B(48％乙腈/H₂O/1.5％HPO₄)；0-5min 0％B，5-20min 0-100％B，20-21min 100-0％B，21-25min 0％B。在254nm波长下检测pHBA，并且在288nm波长下检测氢醌。根据驻留时间和UV吸收光谱确定相当于pHBA和氢醌的化合物，它是无法与真实的pHBA和氢醌标准物区分的。HPLC分析发现，甲苯-处理过的具有pET29a pHBA 1-羟化酶质粒的大肠杆菌细胞包括一种酶活性，它能够在存在NADH的条件下将pHBA转化成氢醌。这种活性在包括空的pET29a载体(对照)的大肠杆菌细胞没有出现。这是所述分离的cDNA编码具有pHBA 1-羟化酶活性的多肽的确凿证据。

将重组生产的pHBA 1-羟化酶蛋白纯化至同质，以便获得足够的材料用于分析所述酶的动力学特性。简单地讲，用含有pET29A pHBA 1-羟化酶构建体的大肠杆菌BL21细胞接种四个5升的烧瓶，烧瓶中装有1L添加了50μg/mL卡那霉素的LB培养基。让所述培养物在26℃下生长，直到细胞密度(OD_λ-600nm)达到0.6。然后添加IPTG到最终浓度为0.4mM，然后在26℃继续培养36小时。通过离心(5000xg，10分钟)收获细胞，并且重新悬浮在30mL的20mMTris/H₂SO₄(pH 7.8)，0.5mM DTT，0.5mM EDTA，0.5mM PMSF，和10μM FAD中。让所述细胞从弗氏压碎器中通过两次，并且通过离心(30000xg，20min，4℃)澄清。以7％(v/v)的最终浓度添加甘油。该提取物在-80℃下保存不会丧失pHBA 1-羟化酶活性。蛋白浓度为35mg/mL，而比活性为0.52U/mg蛋白。因此，该培养物提供了30mL的蛋白提取物，相当于1044mg的蛋白含有547U的pHBA 1-羟化酶活性。

所述酶提取物(15mL)以2.5mL的等份量在PD10柱上缓冲液-交换到10mM Tris/H₂SO₄(pH7.8)，0.5mM DTT，0.5mM EDTA，和10μM FAD中。合并缓冲液-交换的蛋白，以便得到21mL的总体积。缓冲液-交换的蛋白由216mg的蛋白组成，代表123U的pHBA 1-羟化酶活性。缓冲液-交换的提取物(7mL)加样到Q-sepharose柱(15mL凝胶床体积)上。所述柱以2mL/分钟的流速，在4℃下按以下方法洗脱：溶剂A(10mM Tris/H₂SO₄(pH 7.8)，0.5mM DTT，0.5mMEDTA，和10μM FAD)，溶剂B(10mM Tris/H₂SO₄(pH 7.8)，0.5mM DTT，0.5mM EDTA，10μM FAD，和1M NaSO₄)；0-9min 0％B，9-44min(线性梯度)0-20％B，44-54min(线性梯度)20-60％B，54-55min 60-0％B，55-65min 0％B。收集级份(4mL)，并且使用分光光度测定按照上述方法监测级份中的pHBA 1-羟化酶活性。其余的14mL的缓冲液-交换的蛋白在相同的条件下用两次额外的柱层析处理进行加工。可以从所有层析处理中的八个4-mL的级份中总共回收124U的pHBA 1-羟化酶，相当于所述柱的加载量的大约87％。合并所述级份，并且使用Centriprep离心浓缩器浓缩到最终体积为2.5mL。

用10mM NaPO₄(pH6.8)，10μM CaCl₂，1mM DTT，和10μMFAD在PD10柱上对所述蛋白进行脱盐。脱盐的样品相当于22.89mg的蛋白，它包括72U的pHBA 1-羟化酶，用1体积的(3.5mL)的脱盐缓冲液进行稀释，并且注入118×15mm Bio-Scale CHT20-1羟磷灰石柱(Bio-Rad，Hercules，CA)，所述柱用10mM磷酸钠(pH6.8)，10μM CaCl₂，1mM DTT，和10μM FAD预先平衡。所述柱是以2mL/分钟的速度洗脱的(4℃)，使用10-350mM磷酸钠的线性梯度(25mL)(pH 6.8；含有0.01mM CaCl₂，1mM DTT，和10μM FAD)。收集级份(8mL)，并且通过分光光度计监测层析级份中的pHBA 1-羟化酶活性。从单个8-mL的级份中回收到了含有63U的pHBA 1-羟化酶的蛋白(7mg)。通过SDS-PAGE对该级份的20μL的等份样品进行分析。肉眼检查考马斯蓝染色发现，pHBA 1-羟化酶蛋白的纯度＞95％。

用Centricon-10(Millipore Corp.)将蛋白(2mL)浓缩到最终体积为400μL。纯化的重组pHBA 1-羟化酶蛋白的最终浓度为5.033mg/mL，该浓度相当于单体浓度为95.763μM。使用71，270M^-1的消光系数在280nm波长下计算蛋白浓度，这是使用在SEQ ID NO：23中提供的氨基酸组成通过GCG Peptidesort程序测定的。

用50mM KPO₄(pH 6.8)和10μM FAD将所述蛋白稀释10倍。将稀释过的酶(2μL)用于在存在50mM KPO₄(pH 6.8)，0.1mM pHBA，0.2mM NADH，和10μM FAD的条件下在500μL的最终体积中通过分光光度法测定pHBA 1-羟化酶活性。通过四次重复测定活性。在25℃下测定了以下pHBA 1-羟化酶速度：23.776，20.416，23.552，和22.256μM/分钟。根据该信息以及pHBA 1-羟化酶的分子量为52559.44Da，可以计算出pHBA 1-羟化酶的Kcat为9.77±0.69s^-1。

在类似条件下测定所述酶的K_m。将五微升的0.903μM pHBA 1-羟化酶用于上述标准500μl的测定中。在从0.2-400μM的各种pHBA的浓度下在340nm波长下用15秒的间隔测定起始速度；将所得到的结果代入Michaelis-Menten公式。在上述条件下，表观K_m和V_max值分别为0.31μM和6.4μmol/min/mg(图2)。

                   实施例4

制备能超量产生pHBA PCR-克隆的大肠杆菌CPL的转基因植物

将两种PCR引物用于扩增来自基因组DNA的大肠杆菌ubiC基因，同时将独特的限制位点添加到它的侧翼区，用于随后连接到高拷贝数量的质粒上。该基因编码分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)。用于该目的的引物是基于以下的公开的大肠杆菌ubiC基因的DNA序列(GenBank登录号M96268)：

引物11-(SEQ ID NO：27)：

5′-CTACTCATTTcat atgTCACACCCCGCGTTAA-3′

引物12-(SEQ ID：28)：

5′-CATCTTACTagatct TTAGTACAACGGTGACGCC-3′

加下划线的碱基能与靶基因杂交，而小写字母表示添加在PCR引物的末端的限制位点(NdeI或BglII)。

大肠杆菌ubiC基因的扩增是使用引物11(SEQ ID NO：27)和12(SEQ ID NO：28)以及来自大肠杆菌菌株W3110(Campbe11等，Proc.Natl.Acad.Sci.，75：2276-2284(1978))的基因组DNA进行的。引物11与该基因的起始部分杂交，并且在该蛋白的起始密码子上导入NdeI位点，而引物12与相反的末端杂交，并且在仅随终止密码子之后提供BglII位点。100μL PCR反应物含有大约100ng的基因组DNA，和最终浓度为0.5μM的两种引物。其他反应成分是按照生产商的说明从GeneAmpPCR Reagent试剂盒(Perkin Elmer，Boston，MA)中获得的。扩增是在DNA Thermocycler 480(Perkin Elmer)中进行22轮，每一轮包括94℃下1分钟，55℃下1分钟，和72℃下1分钟。在最后一轮之后，在72℃下进行7分钟的延伸。

用NdeI和BglII切割PCR产物，并且将所得到的片段连接到业已用NdeI和BamHI消化过的大肠杆菌表达载体，pET-24a(+)(Novagen)上。将连接反应混合物用于按照生产商的说明，使用BTXTransfector 100(Biotechnologies and ExperimentalResearchInc.，San Diego，CA)转化大肠杆菌DH10B电感受态细胞(GibcoBRL-Life Technologies，Rockville，MD)；选择在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基上生长。使用引物11(SEQ ID NO：27)和12(SEQ ID NO：28)，以及各自的重新悬浮的菌落作为模板的来源，通过PCR反应鉴定包括具有CPL插入片段的质粒的转化体；从这里开始该技术被简单地称作″菌落PCR″。

从能产生正确大小的PCR产物的典型的菌落中分离质粒DNA。对相当于CPL的完整的插入片段进行全面测序，以便检查PCR错误；没有发现错误。选择用于进一步操作的质粒在下文被称作″pET24a-CPL″。pET24a大肠杆菌表达构建体中的CPL的ORF的核苷酸序列及其预测的一级氨基酸序列分别如SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示。

构建叶绿体-导向形式的CPL：TP-CPL

分支酸位于叶绿体和其他类型的质体中(Siebert等，PlantPhysio，112：811-819(1996))，因此重要的是提供具有N-末端叶绿体导向序列的CPL，所述导向序列能将外源蛋白有效地导向叶绿体，这里是分支酸产生的场所。这一目的是通过构建嵌合蛋白实现的，它包括与CPL的起始Met残基融合的来自番茄核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基前体的叶绿体导向序列；所得到的融合蛋白在下文被称作″TP-CPL″。通过PCR制备相当于核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基的转运肽和″成熟的″核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的前四个氨基酸残基的DNA片段。用于扩增的目标是质粒pTSS1-91-(#2)-IBI(Siebert等，Plant Physiol.，112：811-819(1996))，它包括rbcS2的番茄核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基前体的全长cDNA克隆(Sugita等，Mol Gen Genet.，209：247-256(1987)；Siebert等，PlantPhysiol.，112：811-819(1996))。将以下引物用于该反应：

引物13-(SEO ID NO：31)：

5′-CTACTCACTTAGATCTcc atggCTTCCTCTGTCATTTCT-3

引物14-(SEQ ID NO：32)：

5′-CATCTTACTcatat gCCACACCTGCATGCA GC-3′引物13(SEQ ID NO：31)的加下划线的部分能与核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基前体的前21个核苷酸杂交，并且在叶绿体导向序列开始部分的起始Met残基上导入NcoI位点(小写字母)。正如所示出的，该引物还包括位于它的5′末端的BglII位点(粗体字母)，它就在NcoI位点的上游。引物14(SEQ ID NO：32)能在叶绿体导向序列另一端与核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基前体的ORF的167-184号核苷酸杂交。

将独特的NdeI位点通过工程方法引入到该引物(小写字母)，以便将包括叶绿体导向序列的PCR片段连接在pET-24a表达构建体中的位于CPL的起始密码子上的NdeI位点。100-μL的PCR反应物包括大约75ng的pTSS1-91-(#2)-IBI和引物13(SEQ ID NO：31)和14(SEQ ID NO：32)，这两者的最终浓度为大约0.9μM。在DNAThermocycler 480(Perkin Elmer)上进行25轮扩增，每一轮包括94℃下1分钟，55℃下1分钟，和72℃下1分钟；最后一轮后，在72℃下进行7分钟的延伸。用BglII和NdeI消化PCR产物，并且连接到业已用相同的限制酶裂解以便去掉仅含有载体序列，包括T7启动子的小的DNA片段(106bp)的pET24a-CPL上。通过电穿孔将连接反应混合物导入大肠杆菌DH10B细胞，并且在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基上选择生长。使用引物12(SEQ ID NO：28)和13(SEQ ID NO：31)通过菌落PCR鉴定携带具有叶绿体导向序列的质粒的转化体。选择产生正确大小的PCR产物的代表性质粒进行进一步的操作；该质粒在下文被称作″pET24a-TP-CPL″。为了验证PCR错误的缺乏，使用定制设计的引物，对相当于扩增的叶绿体导向序列的质粒区域进行全面测序。TP-CPL的ORF的核苷酸序列及其预测的一级氨基酸序列分别如SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示。

构建用于拟南芥属和烟草转化的表达质粒

为了制备可用于在拟南芥属和烟草中进行组成型表达的构建体，将相当于全长TP-CPL融合蛋白的DNA片段亚克隆到修饰形式的质粒pML63上。后者来自pML40，它包括以下遗传元件：CaMV 35S启动子，cab前导序列，uidA编码区，和NOS聚腺苷酸化信号序列。所述CaMV35S启动子是1.3kb的DNA片段，它超过转录起始位点延伸8个碱基对(Odell等，Nature，303：810-812(1985))。与它的3′末端可操作地连接的是cab前导序列，它是从叶绿素a/b结合蛋白基因22L上获得的60bp的非翻译双链DNA片段(Harpster等，Mol.Gen.Genet.，212：182-190(1988))。与cab前导序列的3′末端融合的是uidA基因(Jefferson等，EMBO J.，6：3901(1987))，它编码蛋白β-葡糖醛酸酶(例如，″GUS″)。最后，与GUS基因的3′末端连接的是800bp DNA片段，它包括来自胭脂碱合酶(例如，″NOS″)基因的聚腺苷酸化信号序列(Depicker等，J.Mol.Appl.Genet.，1：561-564(1982))。这些DNA片段一起包括35S-GUS嵌合基因，通过标准克隆技术将其插入载体pGEM9Zf(-)(Promega，Madison，WI)，以便得到质粒pMH40。

按以下方法制备质粒pML63(它基本上与pMH40相同，不过具有截短形式的3′NOS终止序列)。首先，用SalI消化pMH40，并且将所得到的两个4.03kb和2.9kb的DNA片段重新连接，以便得到质粒pML3，其具有沿相反方向的35S启动子/cab22前导序列/GUS基因/3′NOS终止子盒。然后用Asp718 I和Hind III消化pML3，以便释放包括3′NOS终止子序列的770bp的片段。弃去后者，用使用pMH40作模板，并且使用引物15(SEQ ID NO：35)和16(SEQ ID NO：36)

通过PCR制备的更短的形式代替。

引物15-(SEQ ID NO：35)：

5′-CCCGGGGGTACCTAAAGAAGGAGTGCGTCGAAG-3′

引物16-(SEQ ID NO：36)：

5′-GATATCAAGCTTTCTAGAGTCGACATCGATCTAGTAACATAGATG A-3′

用HindIII和Asp718 I消化PCR产物，以便得到包括3′NOS终止序列的279bp的298bp的片段，始于1277号核苷酸(TAA终止密码子)并且止于公开序列(Depicker等，J.Mol.Appl.Genet.，1：561-574(1982))的1556号核苷酸。将该PCR片段连接到pML3的其余部分，得到了质粒pML63。

如上文所述，pML63包括GUS编码区，受35S启动子和截短形式的3′NOS终止子的控制。因此，它包括GUS在植物中进行组成型表达所必需的所有转录信息。为了制备TP-CPL的类似的构建体，用Nco I和Eco RI消化质粒pML63。这种操作只会释放出GUS基因插入片段，留下调控旁侧序列，所述载体的其余部分不变。另外用NcoI和EcoRI处理质粒pet24a-TP-CPL，释放TP-CPL融合蛋白的完整的编码区。通过琼脂糖凝胶电泳纯化相当于后者的小的DNA片段(693bp)，并且用大的载体片段(4.63bp)进行标准连接反应，所述片段是通过用Nco I和Eco RI切割pML63获得的。通过电穿孔将连接反应混合物导入大肠杆菌DH10B，并且在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB培养基上选择生长。通过使用引物12(SEQ ID NO：28)和13(SEQ ID NO：31)菌落PCR鉴定获得了具有插入的TP-CPL编码序列的质粒的转化体。选择能产生正确大小的PCR产物的代表性的质粒进行进一步的操作，并且该构建体在下文被称作″TP-CPL-pML63″。

用于对烟草进行土壤杆菌属介导的，叶片转化的二元载体是质粒pZBL1(ATCC 209128)。pZBL1包括来自pBR322的复制起点，细菌nptl卡那霉素抗性基因，绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)质粒pVS1的复制和稳定性区(Itoh等，质粒，11(3)：206-220(1984))，由van denElzen等披露的T-DNA边界(Plant Mol.Biol.，5(3)：149-154(1985))，其中，去掉了作为右侧边界片段一部分的OCS启动子(从OCS启动子的-320号位置延伸到-116位置(Greve等，J.Mol..Appl.Genet.，1：499-511(1983))，和NOS/P-nptII-OCS 3’基因，它用作卡那霉素抗性植物选择标记。

为了表达TP-CPL，用SalI消化质粒pZBL1，SalI切割位于右侧和左侧边界之间的独特位点，该位点理想地适合插入外源基因，并且稳定地整合到植物基因组中。为了减少没有插入片段的情况下重新连接的可能性，使用小牛肠碱性磷酸酶(GibcoBRL-Life Technologies)按照生产商的说明对所述切割载体进行脱磷酸化。为了获得能够插入二元载体的片段，同样用SalI消化质粒TP-CPL-pML63。这种处理能够以2.4kb DNA片段形式释放TP-CPL融合基因的完整的转录单位(例如，35S启动子/cab22前导序列/TP-CPL/3′NOS终止子)。通过琼脂糖凝胶电泳纯化后者，并且用从如上文所述的pZBL1获得的脱磷酸化的11.0kb片段进行标准连接反应。通过电穿孔将连接反应混合物导入大肠杆菌DH10B，并且在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基上选择生长。使用引物12(SEQ ID NO：28)和13(SEQ ID NO：31)通过菌落PCR鉴定获得了具有TP-CPL融合基因的质粒的转化体，并且通过用KpnI进行限制消化分析确定插入片段的方向。被选择用于进一步操作的质粒被称作″TP-CPL-pZBL1″。正如下面更详细地披露的，该表达构建体被用于转化烟草和拟南芥属，以便生产超量pHBA。

制备能表达TP-CPL的转基因烟草

利用冻-融转化方法(Holsters等，Mol.Gen.Genet.，163：181-187(1978))将质粒TP-CPL-pZBL1导入根癌土壤杆菌菌株LBA4404(Hoekema等，Nature，303：179-180(1983))。在28℃下将所述细胞铺平板到YEP培养基(每升含有10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，和5g NaCl)上，所述培养基还含有卡那霉素(1000μg/mL)和利福平(20μg/mL)。通过PCR使用合适的引物鉴定携带二元构建体的菌落。

用于叶片感染的盆栽的烟草植物(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)是在生长箱中生长的，保持14h，21℃白天/10h，18℃夜晚周期，具有大约80％的相对湿度，在混合的冷白色荧光灯和白炽灯的照射下生长。土壤杆菌属介导的叶片转化基本上按照De Blaere等(Meth.Enzymol，153：277-292(1987))披露的方法进行的，进行以下改进。用无菌的纸张打孔器和4-6周龄的植物制备直径为8mm的叶片。通过将叶片浸泡在获得了TP-CPL-pZBL1的土壤杆菌的浓缩溶液中30分钟对叶片进行接种，将土壤杆菌以OD_λ＝600nm＝0.8的密度重新悬浮在Murashige′s基本有机培养基中。将接种的叶片直接放置在培养基上，该培养基含有(每升体积)30g的蔗糖，1mg的6-苄基氨基嘌呤(BAP)，0.1mg的萘乙酸，8g的琼脂，和1包Murashige′s基本有机培养基。这种培养基是从GibcoBRL-Life Technologies获得的(cat.#23118-029)。在28℃在光照条件下温育3天之后，将叶片转移到相同配方的新的培养基上，该培养基同样含有卡那霉素(300μg/mL)和头孢噻肟(500μg/mL)，以便选择转化过的烟草细胞的生长，并且消除残余的土壤杆菌。叶片在上述生长条件下温育3周，然后以3周的间隔转移到具有相同配方的新的培养基上，直到获得最佳芽尺寸用于根诱导。让芽在含有(每升)1包Murashige′s基本有机培养基，8g琼脂，和10g蔗糖的培养基上长根。大约4周之后，将所述植物移栽到土壤中，并且让它在生长箱中在上述条件下生长到成熟。

制备烟草叶样品，并且对pHBA葡萄糖缀合物进行HPLC分析。

将健康的叶组织(50-100mg鲜重)迅速从叶远端的1/3部分取出，并且放入Biopulverizer^TM h试管(cat.#6570-201或6540-401)中，该试管装有陶瓷珠；后两者都是从Qbiogen(Carlsbad，CA)购买的。在添加1mL的50％甲醇(v/v)之后，将所述试管用盖子盖上，并且使用Fast PrepFP120(QBiogen)组织破碎装置在室温下机械搅拌40秒，该装置是以5m/sec的速度工作的。然后将所述试管放置在旋转摇床上，并且在室温下以400rpm的速度剧烈搅拌1小时。通过使用常规台式离心机离心机(10,000xg，10分钟)将提取物澄清，并且将含有pHBA葡萄糖缀合物(苯酚和酯葡糖苷)的上清液小心取出放入空试管。在下一个步骤中，将50-μL的甲醇提取物的等份样品转移到新的微量离心管中，并且在真空条件下在Speed-Vac(Thermo Savant，Holbrook，NY)中采用任选的加热装置使所述样品完全干燥。将干燥的残余物溶解在100μL的5mM Tris-HCl(pH 8)中，并且让所述样品通过0.22μm的乙酸纤维素滤膜，以便除去小颗粒；将Spin-X离心管过滤器(Costar-Corning Inc.LifeSciences，Acton，MA；cat.#8160)用于这一目的。

将过滤的样品的等份样品(10-80μL)加到Vydac 218TP54蛋白和肽C18柱(Grace Vydac，Hesperia，CA)上，该柱是以1mL/min的速度以90％缓冲液A(溶解在水中的0.1％甲酸)和10％缓冲液B(甲醇)预平衡。在注入样品之后，所述柱以1mL/min的速度用10-50％缓冲液B的线性梯度，用20分钟时间洗脱。在254nm波长下通过分光光度法监测pHBA葡萄糖缀合物的洗脱。将化学合成的pHBA苯酚和酯葡糖苷标准物用于校正HPLC处理的驻留时间，并且在所采用的条件下精确测定两种化合物的消光系数。使用由HewlettPa ckardChemstation提供的软件包集成峰面积，并且将用以知量的化合物标准获得的值用于对每次注入的pHBA葡糖苷的微克数进行定量。在对注入所述柱上的原始甲醇提取物的级份进行计量之后，对所述数字进行校正，以便体现来自提取的整个叶样品的回收率。它与分析的叶组织的干重量的各个测定相关(例如，从相同的叶，相同的植株，在分析的同一天获得)，能够以总的干重量的百分比的形式对pHBA-葡糖苷进行定量。为了计算与葡萄糖连接的pHBA的总量，并且将该数字表达为总的干重量的百分比(即，″pHBA(％干重量)″)，将苯酚和酯葡糖苷加在一起，并且乘以0.46。这种操作校正了相关葡萄糖部分的质量，两种葡萄糖缀合物总量的54％。

表达TP-CPL的转基因烟草植物的分析

如上文所述，通过土壤杆菌属介导的叶片转化，将TP-CPL导入烟草(Nicotiana tabacum)，以便确定它对pHBA葡糖苷的积累的影响。所述分析是在叶组织上进行的，叶组织是从15个烟草植物(一级转化体)上获得的，这些转化体来自不同的转化事件。在土壤中生长5周之后，所述植物表现出各种水平的pHBA葡糖苷，占总的干重量的0-2.3％。在似乎所有的植物转化实验中通常都观察到表型变异，并且可能体现了由所谓的“位置”效应(例如，性状基因在基因组不同位点的稳定的整合)和转基因拷贝数量导致的基因表达的不同水平。在本研究中同样出现的类似现象得到了用针对纯化的重组大肠杆菌CPL的抗血清对烟草转化体进行的Western印迹分析的支持。例如，尽管大部分植物(15个中的14个)具有免疫学上可检测水平的外源蛋白，但是在表达水平方面存在显著差异。不过，一般来说，在Western信号强度和pHBA葡糖苷的积累之间存在正相关，这与以前的观察一致(Siebert等，Plant Physio，112：811-819(1996))；Sommer等，PlantCellPhysiol.，39(11)：1240-1244(1998)；Sommer等，Plant cellReports，17：891-896(1998))。所述Western印迹同样证实了叶绿体导向序列在烟草中被有效地切除。

5周龄的烟草植物的平均pHBA葡糖苷含量(SEM)为干重量的1.12％±0.186％。不过，最佳的植物之一(34号转化体)的pHBA葡糖苷含量为干重量的2.3％。与所有表达TP-CPL的其他转基因烟草植物类似，pHBA葡糖苷在34号转化体中的积累随着植物的成熟持续增加。实际上，在土壤中生长13周之后，在这种特定植物中的叶pHBA葡糖苷含量达到了干重量的大约8％。后一种值相当于在校正相关葡糖苷分子的质量之后的pHBA总含量为干重量的大约3.7％。正如下面更详细地说明的，让34号一级转化体(CPL 34)自交，并且将得到的T1种子用于制备能超量产生pHBA的烟草植物，用于采用pHBA 1-羟化酶进行性状堆积实验。显然，根据观察到的来自自交植物的T1种子的分离方式(卡那霉素抗性)，CPL 34来自单一位点整合事件。

表达TP-CPL的转基因拟南芥属植物的制备和分析

将人工融合蛋白TP-CPL导入拟南芥，并且测定pHBA葡糖苷水平。通过电穿孔，使用现有的方法(Meyer等，Science，264：1452-1455(1994))，将携带CaMV35S-CPL表达盒的二元载体(例如，TP-CPL-pZBL1)转化入根癌土壤杆菌菌株C58 C1 Rif(又被称作菌株GV3101)，它携带有无毒的Ti(毒力)质粒pMP90(Koncz和Schell，Mol.Gen.Genet.，204：383-396(1986))。使用公开的真空渗透方法技术的方法(Clough和Bent，Plant J.，16(6)：735-43(1998))，将携带有具有CPL表达构建体的二元载体的MP90菌株用于转化具有野生型，fah1-2(Chapple等，Plant cell，4：1413-1424(1992))，sng1-1(Lorenzen等，Plant Physiology，112：1625-1630(1996))遗传背景的哥伦比亚生态型的拟南芥植物。转基因幼苗是在无菌条件下在标准植物生长培养基上鉴定的，将卡那霉素(50μg/mL)用于选择。将卡那霉素抗性幼苗移植到土壤中，并且在12小时光照/12小时黑暗的光周期下，在100μE m^-2s^-1的光照强度，18℃(黑暗)和21℃(光照)的条件下在土壤/珍珠岩混合物中栽培。该方法制备了来自独立转化事件的具有301个一级转化体的群体。在移植到土壤中六周之后，采用下面所披露的反相HPLC分析转基因拟南芥植物的pHBA葡糖苷。

pHBA葡糖苷的分析

在50％MeOH(5μL/mg湿重量)对新切碎的叶材料进行匀浆，并且通过低速离心使所得到的提取物澄清。然后使用含有1.5％磷酸的乙腈(6％-48％)梯度，将所述叶提取物的等份样品加样到Nova-PakC18柱(60孔度，4μm粒度)上。通过在254nm波长下的UV吸收检测pHBA苯酚和酯葡糖苷，并且利用从真实的化学物质标准物获得的消光系数定量。在分析过的272个各转基因拟南芥植物中，239(或大约88％)包括可检测水平的两种葡萄糖缀合物，并且它们是以大约相同的量存在的。最佳生产植株的总的pHBA葡糖苷含量为干重量的10.73％，这与用相同的构建体转化烟草所获得的最高水平非常接近。转基因拟南芥植物的整个群体的平均值为3.35％(+/-0.13％)；括号中的数字是平均值的标准误。确定转基因拟南芥品系(41号)是这种大群体的转基因品系。在发芽六周之后进行分析时，该转化体的T1植株对于CPL转基因来说是半纯合的，包括7.5％DW pHBA缀合物，它相当于3.42％的无DW的pHBA。该品系的T2后代的卡那霉素抗性基因以3∶1的比例分离，表明该转基因品系具有插入单个基因座的T-DNA。从各个T2后代收获种子。鉴定了对T-DNA插入为纯合的来自T2植物的T3种子批次。所述T3种子批次在含有卡那霉素抗性基因的培养基上发芽时不再分离出卡那霉素敏感后代。该转基因品系的纯合后代在上述受控制的条件下生长八周时在叶组织中含有2.6％pHBA DW。

                 实施例5

将pHBA 1-羟化酶基因用于在转基因植物中生产氢醌葡糖苷。在拟南芥属中生产氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)

为了制备用于在植物中进行pHBA 1-羟化酶的组成型表达的构建体，将包括全长pHBA 1-羟化酶ORF(SEQ ID NO：26)和紧靠起始密码子上游的42bp的5′非翻译DNA(来自pET29A载体)的1482bpXbaI/HindIII DNA片段从用于重组酶生产的pET29a构建体上切除，并且克隆到具有XbaI和HpaI位点的二元载体pBE856(SCP1-FlpM)上。用于连接反应的插入DNA是通过用HindIII消化质粒DNA制备的。纯化线性化的质粒DNA，并且用T4DNA聚合酶(New EnglandBiolabs，MA，USA)按照生产商的说明将突出的DNA末端补平。用XbaI消化平端质粒DNA，并且连接到XbaI HpaI消化过的pBE856 DNA上。这导致了pBE856中的FlpM重组酶ORF被pHBA 1-羟化酶ORF所取代，它位于马铃薯蛋白酶抑制剂II(PIN II)基因的组成型SCP1启动子和3′非翻译区之间。将所得到的二元载体pHBA1-羟化酶表达构建体(″pBE856(SCP1-pHBA 1H)″)用于按下文所述方法进行植物转化。

质粒pBE856(SCP-FlpM)是事先通过以下方法构建的：用XbaI和EcoRI裂解二元载体pBE673(参见下文)，然后将包括嵌合SCP1：FlpM：3′Pin基因的2172 bp的XbaI-EcoRI片段克隆到所述载体的多克隆位点上。所述SCP1：FlpM：Pin基因包括合成的35S启动子(SCP1)(Bowen等，美国申请号60/72050(2000-06-06)，已经放弃的美国申请流水号661,601的部分后续申请)，在该启动子的3′末端与FlpM重组酶的ORF融合，在所述ORF的3′末端与来自马铃薯蛋白酶抑制剂II基因(GenBankE登录号L37519)的3′PIN区融合。质粒pBE673来自pBin 19(GenBank登录号U09365)，这是通过用949bp Bsu61-Cla I片段置换包括胭脂碱合酶(nos)启动子的3′末端，npt 11(卡那霉素resistance)ORF，和3′nos区的pBin19的1836bp的Bsu36a-ClaI片段而得到的，所述Bsu361-Cla片段包括(5′→3′)：包括nos启动子的3′末端(在GenBank登录号V00087和J01541中所披露的468-574号核苷酸；还可参见Bevan等，Nucleic Acids Res.，11(2)，369-385(1983))的106bp的片段，5bp GATCC序列，551bp的片段(相当于吸湿链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)膦丝菌素乙酰转移酶(basta抗性)ORF(GenBank登录号X17220)，所不同的是，终止密码子从TGA变成了TAG)，8bpTCCGTACC序列，和279bp 3′nos区(上文所述GenBank登录号V00087和J01541的1824-2102号核苷酸)。

通过电穿孔将pBE856 SCP1-pHBA1 H质粒导入根癌土壤杆菌C58MP90。简单地讲，在冰上将1μg质粒DNA与100μL的电感受态细胞混合。将细胞悬浮液转移到100μL电穿孔样品池(间隙宽度1mm中)，并且用BIORAD电穿孔仪进行电穿孔，电穿孔仪设定为1kV，400Ω和25μF。将细胞转移到1mL LB培养基上，并且在30℃下温育2小时。将细胞铺平板到含50μg/mL卡那霉素和10μg/mL利福平的LB培养基上。在30℃下温育所述平板60小时。重组土壤杆菌培养物(500mLLB，50μg/mL卡那霉素和10μg/mL利福平)是用转化的土壤杆菌属细胞的单集落接种的，并且在30℃下生长60小时。通过离心(5000xg，10min)收获细胞，并且重新悬浮在1L含有0.05％(V/V)Silwet的5％(W/V)蔗糖中。

CaMV 35S CPL转基因的纯合(参见上文)拟南芥植物(41号品系)在土壤中生长，密度为每100cm²的种植盆30个植株，在metromix 360土壤混合物中生长4周时间(22℃，16小时光照/8小时黑暗，100μEm^-2s^-1)。将植物重复地浸入土壤杆菌属悬浮液，并且保持在黑暗，高湿度环境中24小时。让植物在上述标准植物生长条件下生长3-4周，并且收获植物材料，并且在环境温度下在纸袋中干燥1周时间。使用0.425mm网状黄铜筛收获种子。通过以下方法对净化的拟南芥种子(1.5g，相当于75000粒种子)进行消毒：用45mL的80％乙醇，0.01％triton X-100洗涤，然后用45mL的30％(V/V)溶解于水的家用漂白剂，0.01％tritonX-100洗涤，最后用无菌水重复漂洗。将7500粒种子的等份样品转移到直径为13mm的陪替氏培养皿上，培养皿中装有无菌植物生长培养基，该培养基包括0.5x MS盐，1.5％(W/V)蔗糖，0.05MES/KOH(pH 5.8)，200μg/mL timentin，和10μg/mL膦丝菌素，用10g/L琼脂固化。通过将种子的水悬浮液与等体积溶化的植物生长培养基混合将种子均匀分散在培养基上。在标准生长条件下温育平板10天。将膦丝菌素-抗性幼苗转移到不含膦丝菌素的植物生长培养基上，并且生长18天。

测定转基因拟南芥植物中对苯二酚葡糖苷的含量

切下叶组织(4-15mg)并且转移到1.5mL带螺帽的试管中(Sarstedt Inc.，Newton，NC)。向每一个叶样品中添加水(200μL)，并且通过在100℃下温育1小时提取小分子。通过离心(13000xg，10min)使叶提取物澄清，并且按以下方法进行HPLC分析。将反应产物(10μL)注入到Nova Pak C8柱(3.9×150mM，60，4μM)上。所述柱是以1mL/min流速在以下条件下洗脱的：溶剂A(H₂O，/1.5％HPO₄)，溶剂B(100％MeOH/H₂O/1.5％HPO₄)；0-5min 0％B，5-20min 0-100％B，20-21min 100-0％B，21-25min 0％B。在λ＝282nm的波长下检测氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)，并且在λ＝288nm波长下检测氢醌。对苯二酚葡糖苷是在共表达CPL和pHBA 1-羟化酶基因的植物的水提取物中根据驻留时间和UV吸收光谱检测到的，这些参数无法与从Sigma公司获得的化学合成的，真实的对苯二酚葡糖苷(氢醌β-D-吡喃葡糖苷)区分。在表达CPL和pHBA 1-羟化酶基因(图4)的植物的提取物中检测不到游离的氢醌。

通过液相层析结合质谱分析(LC/MS)检测上选植物提取物中对苯二酚葡糖苷的性质。简单地讲，将40μL植物提取物注入到ZORBAXEclipseXDB-C18柱(2.1×150mm，80，3.5μM)(Agilent，CA，USA)上。所述柱是在以下条件下洗脱的：溶剂A(H₂O/0.1％(v/v)甲酸)，溶剂B(100％乙腈)；0-25min 0％-60％B(0.3mL/min)，25-25.5min 60-100％B(0.4mL/min)，25.5-30min 100％B(0.4mL/min)，30-31min 100％-0％B(0.3mL/min)，31-40min 0％B(0.3mL/min)。将装配有电喷射界面的Hewlett-Packard质谱仪MSD1100(Agilent，Wilmington，DE)用于检测分析物。数据是以阳离子模式获取的，毛细管电压为3kV。解溶剂化气体流为12L/分钟的氮气。所述解溶剂化和来源阻断温度为350℃。调节所述仪器进行单位分辨。通过在1秒钟内扫描MS实验中的80-600道尔顿的范围收集数据。能表达CPL和pHBA 1-羟化酶的转基因拟南芥植物的水性提取物包括新的化合物，在通过质谱分析方法分析，以电喷射阳离子化模式产生了分子离子时，表现出质量与电荷的比例(m/z+)为310.9和290.0。这种分子离子的特性分别与氢醌葡糖苷(MW 272.25)的钾加合物(MW 311.35)和铵加合物(MW 290.29)的预期m/z+非常吻合。另外，所述化合物都能产生m/z+＝180的片段，该片段与葡萄糖(MW＝180.16)的预期的m/z+非常吻合。

通过HPLC分析，使用用具有已知浓度的化学合成的对苯二酚葡糖苷(Sigma)的标准物建立的校正曲线测定能表达CPL和pHBA 1-羟化酶基因的植物组织中的对苯二酚葡糖苷浓度。表1表示在能表达不同水平pHBA 1-羟化酶的T1植物群体中的对苯二酚葡糖苷浓度。表中表示，通过CPL和pHBA 1羟化酶基因在拟南芥植物组织中的共同表达，在仅仅经过28天的植物生长之后，就可以获得最高达5.28mg/g鲜重的对苯二酚葡糖苷产量水平。

                        表1

共表达CPL和pHBA1-羟化酶基因的拟南芥植物的

        叶组织中对苯二酚葡糖苷浓度

植物品系	对苯二酚葡糖苷(mg/g FW)
		66	5.28
16	3.62
		53	3.14
76	2.62
		31	2.59

植物品系	对苯二酚葡糖苷(mg/g FW)
		33	1.12
20	1.06
		91	1.02
68	1.00
		48	1.00

植物品系	对苯二酚葡糖苷(mg/g FW)
		70	2.57
88	2.44
		32	2.35
8	2.33
		14	2.31
4	2.27
		6	2.10
34	2.07
		40	1.91
1	1.85
		37	1.82
93	1.72
		72	1.68
45	1.67
		18	1.66
15	1.63
		13	1.63
63	1.58
		47	1.55
56	1.52
		41	1.52
85	1.52
		86	1.49
61	1.48
		83	1.48
80	1.47
		26	1.44
78	1.41
		50	1.39
87	1.37
		23	1.37
27	1.36
		74	1.36
30	1.30
		79	1.29
22	1.29

植物品系	对苯二酚葡糖苷(mg/g FW)
		82	1.00
12	0.99
		25	0.97
64	0.96
		11	0.94
84	0.94
		42	0.93
19	0.92
		29	0.87
46	0.87
		35	0.86
62	0.83
		36	0.82
73	0.80
		52	0.79
9	0.78
		55	0.77
67	0.76
		71	0.76
39	0.75
		89	0.75
24	0.73
		58	0.73
28	0.72
		17	0.70
65	0.66
		21	0.64
57	0.63
		3	0.63
54	0.62
		5	0.58
60	0.55
		10	0.53
51	0.44
		38	0.37
44	0.37

植物品系	对苯二酚葡糖苷(mg/g FW)
		2	1.22
49	1.20
		81	1.17
92	1.17
		43	1.14

植物品系	对苯二酚葡糖苷(mg/g FW)
		59	0.30
7	0.00
		69	0.00
75	0.00
		77	0.00

将能产生高水平氢醌葡糖苷的转基因拟南芥品系(品系号#32，31，16，14)和对照品系#69(没有表现出氢醌葡糖苷的积累)转移到土壤中，并且在21℃，60％相对湿度，和14小时光照/10小时黑暗循环的条件下生长8周。测定叶组织中的氢醌和pHBA水平。将一片叶转移到1.5mL带螺帽的聚丙烯试管中，并且补充500μl的1M HCl。通过在设定为100℃的加热板中将密封的聚丙烯试管温育1小时而水解所述组织。在组织水解物中补充100μL的1M磷酸钾缓冲液(pH6.5)，并且添加430μL的1.1N NaOH。通过pH试纸确定中和的组织水解物的中性pH。通过离心使叶匀浆物澄清。使用从1.5％磷酸(溶剂A)到50％MeOH，1.5％磷酸(溶剂B)的线性梯度在Nova-Pak′C18柱(60孔度，4μM粒度)(Waters，USA)上通过HPLC对10μL澄清的组织水解物进行分析，并且在254nm波长下进行UV检测，以检测pHBA，在289nm的波长下检测氢醌。使用以下溶剂梯度：0-5min100％溶剂A；20min 100％溶剂B；21-25min 100％溶剂A。氢醌和pHBA是利用使用通过商业渠道获得的pHBA和氢醌(Sigma)制备的标准曲线定量的。

表2归纳了表达CPL和pHBA 1-羟化酶的拟南芥品系中的pHBA和氢醌水平。数据表明，表达CPL和pHBA 1-羟化酶的拟南芥植物在移植到土壤中之后能持续地由pHBA合成氢醌。在某些拟南芥品系中，由CPL产生的超过60％的pHBA被转化成氢醌。考虑到氢醌(110.1)和对苯二酚葡糖苷(272.1)之间的分子量的差异，土壤生长的能表达CPL和pHBA 1-羟化酶的拟南芥植物中的对苯二酚葡糖苷水平达到了4％干重量(DW)。

                                     表2

品系	pHBA(μmol/g FW)	氢醌(μmol/g FW)	总pHBA(μmol/g FW)	％转化pHBA→HQ	氢醌％DW
						32	8.25	14.8	23.05	64.2	1.62
31	15.82	12.72	28.54	44.6	1.4
						16	8.37	8.31	16.68	49.8	0.92
14	17.47	5.88	23.35	25.2	0.65
						69	18.23	0	18.23	0	0

在烟草中生产氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)

对来自获得了TP-CPL表达构建体的转基因烟草34号品系(CPL34)的T1种子进行表面消毒，发芽，并且在无菌条件下在含有卡那霉素(0.2mg/mL)的MS培养基上生长。将由包括两个营养结的茎外植体再生的植株放在含有卡那霉素(0.05mg/mL)和Timentin ^TM(0.1mg/mL)(GlaxoSmithKline，Research Triangle Part，NC)的MS培养基上在Magenta盒中生长。让所述植物在温度和光照受调控的箱中生长4周，设定为16小时，白天23℃/8小时，夜间21℃的周期。

让获得了pBE856(SCP1：：pHBA 1H)的根癌土壤杆菌菌株的50-mL培养物在30℃下，在LB培养基中生长36小时。通过离心(7000xg)收获细胞，用50mL无菌MS培养基洗涤两次，并最终悬浮在40mL的相同的溶液中。在无菌条件下收获上述再生的TP-CPL烟草植物之一的叶，切成大约1.5cm²的片，并且在室温下在土壤杆菌悬浮液中温育30分钟。将叶外植体以近轴一侧向下的方式放置在芽诱导平板上(Murashige′s基本有机培养基，3％蔗糖，1mg/L苄基氨基嘌呤，0.1mg/L萘乙酸，和0.8％琼脂)，并且在室温下温育3天。将叶外植体转移到5mg/L glufosinate-铵(Fluka/Sigma Aldrich，St.Louis，MO)，25mg/L卡那霉素，和100mg/L Timentin^TM(GlaxoSmithKline)的芽诱导培养基上，并且每隔三周在新的培养基上继代培养。将平板放入培养箱中，设定为16小时，23℃白天/8小时，21℃夜间的周期。将可切除的芽转移到根诱导培养基(Murashige′s基本有机培养基，1％蔗糖，和0.8％琼脂)上。最终将长根的芽转移到土壤中，并且让所得到的植株在室温中生长。

测定转基因烟草植物中的对苯二酚葡糖苷含量

将叶组织(10-50mg)从在无菌条件下在根诱导培养基上生长21天的小植株上切除。将组织转移到1.5mL带螺帽的试管(SarstedtInc.，Newton，NC)中。将水(400μL)添加到每一个叶样品中，并且通过在100℃下温育1小时提取小分子。通过离心(13000xg，10min)使叶片提取物澄清，并且按以下方法通过HPLC进行分析。将反应产物(10μL)注入到Nova Pak C8柱(3.9×150mm，60，4μm)上。所述柱是以1mL/min的流速在以下条件下洗脱的：溶剂A(H₂O，/1-5％HPO₄)，溶剂B(100％MeOH/H₂O/1.5％H PO₄)；0-5min0％B，5-20min 0-100％B，20-21min 100％B-0％B，和21-25min 0％B。在λ＝282nm的波长下检测氢醌葡糖苷(对苯二酚葡糖苷)，并且在λ＝288nm的波长下检测氢醌。

对苯二酚葡糖苷是根据驻留时间和UV吸收光谱在共同表达CPL和pHBA1-羟化酶基因的植物的水提取物中检测的，上述特征无法与从Sigma公司购买的化学合成的真实的对苯二酚葡糖苷的特征区分(图4)。另外，通过液相层析结合质谱分析(LC/MS)证实在上述植物提取物中检测到的对苯二酚葡糖苷的性质。将40μL植物提取物注入到ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(2.1×150mm，80，3.5μm)(Bio-RAD，USA)上。所述柱是在以下条件下洗脱的：溶剂A(H₂O/0.1％(v/v)甲酸)，溶剂B(100％乙腈)；0-25min 0％-60％B(0.3mL/min)，25-25.5min 60-100％B(0.4mL/min)，25.5-30min 100％B(0.4mL/min)，30-31min 100％-0％B(0.3mL/min)，和31-40min 0％B(0.3mL/min)。将装有电喷射界面的Hewlett-Packard质谱仪MSD1100用于检测分析物。数据是以阳离子模式获得的，使用的毛细管电压为3kV。解溶剂化气体流是12L/min的氮气。解溶剂化和来源阻断温度是350℃。调整所述仪器进行单位分辨。数据是通过MS实验用1秒钟时间扫描80-600道尔顿的范围获得的。

表达CPL和pHBA 1-羟化酶的转基因拟南芥植物的水提取物包括新的化合物。在通过质谱方法分析时，在电喷射阳离子化模式中产生了分子离子，表现出的质量与电荷的比例(m/z+)为311.0和290.0。这些分子离子的特性分别与氢醌葡糖苷(MW 272.25)的钾加合物(MW311.35)和铵加合物(MW 290.29)的预期的m/z+非常接近。另外，所述化合物都能产生m/z+＝180.0的片段，它与葡萄糖(MW＝180.16)的预期的m/z+非常接近。

使用用具有已知浓度的化学合成的对苯二酚葡糖苷的标准物建立的校正曲线，通过HPLC分析测定能表达CPL和pHBA1-羟化酶基因的植物组织中的对苯二酚葡糖苷浓度。表3表示能表达不同水平的pHBA1-羟化酶的T1植物群体中的对苯二酚葡糖苷浓度。该表显示CPL和pHBA 1-羟化酶基因在烟草植物组织中的共同表达，在植物仅仅生长21天之后能产生的对苯二酚葡糖苷的水平高达5.29mg/g鲜重(图4)。

                         表3

共表达CPL和pHBA1-羟化酶基因的烟草植物的

     叶组织中的对苯二酚葡糖苷浓度

植物品系号	对苯二酚葡糖苷(mg/g FW)
		13	5.29
11	4.66
		42	4.38
8	4.26
		24	4.18
45	4.17
		20	4.10
19	4.03
		10	3.25
27	3.07
		44	2.93
6	2.77
		43	2.62
35	2.59
		9	2.50
14	2.37

植物品系号	对苯二酚葡糖苷(mg/g FW)
		26	2.32
33	2.27
		34	2.25
32	2.22
		29	2.20
25	2.13
		1	2.04
30	2.02
		4	1.90
31	1.71
		22	1.71
40	1.69
		37	1.62
17	1.59
		2	1.39
36	1.37
		41	1.34
16	1.32
		21	1.28
18	1.21
		3	0.96
5	0.85
		28	0.79
38	0.59
		7	0.00
12	0.00
		15	0.00
23	0.00
		39	0.00

将能产生高水平氢醌葡糖苷(品系号#13，11，42，8，24，45，19，10，27，44，6，43，35，9，和14)的转基因烟草品系和对照品系34(CPL 34，缺少pHBA 1-羟化酶基因)转移到土壤中，并且在温室条件下生长77天。按以下方法测定在土壤中生长的烟草品系的叶组织中氢醌和pHBA含量。使用常规木塞打孔器从每一个转基因品系的成熟的叶上收获四个叶片(直径1cm)，在收获之后马上测定三个叶片的重量，并且在65℃下对组织样品进行24小时的干燥之后再次测定。将第四个叶片转移到1.5mL带螺帽的聚丙烯试管中，并且补充500μl的1M HCl。通过在设定为100℃的加热板上在密封的聚丙烯试管中温育1小时而水解所述组织。向组织水解物中添加100μL的1M磷酸钾缓冲液(pH 6.5)和430μL的1.1N NaOH。用pH试纸(VWR，USA)证实中和的组织水解物的中性pH。通过离心将叶片匀浆物澄清，并且用水稀释5倍。使用从1.5％磷酸(溶剂A)到50％MeOH，1.5％磷酸(溶剂B)的线性梯度，通过HPLC在Nova-PakC18柱(60孔度，4μM粒度)上对10μL的稀释的组织水解物进行分析，并且进行UV检测，在254nm的波长下检测pHBA，在289nm的波长下检测氢醌。用以下溶剂梯度：0-5min 100％溶剂A；20min 100％溶剂B；21-25min 100％溶剂A。使用用通过商业获得的pHBA和氢醌制备的标准曲线对氢醌和pHBA进行定量。

表4归纳了在表达CPL和pHBA 1-羟化酶的烟草品系中pHBA和氢醌的水平。该表证实了表达CPL和pHBA 1-羟化酶的烟草植物在移栽到土壤中之后能够继续由pHBA合成氢醌。在某些烟草品系中，通过CPL产生的超过95％的pHBA被转化成氢醌。考虑到氢醌(110.1)和对苯二酚葡糖苷(272.251)之间的分子量差异以及在通过HPLC分析未处理过的转基因品系的组织提取物时没有检测到游离的非缀合的氢醌这一事实，在温室条件下生长77天之后，土壤上生长的能表达CPL和pHBA1-羟化酶的烟草植物中的对苯二酚葡糖苷的水平达到了24.9％DW。

                                      表4

品系	pHBA(μmol g-1FW)	氢醌(μmol g-1FW)	总pHBA(μmol g-1FW)	％转化pHBA→HQ	氢醌％DW
						13	7.16	80.82	87.97	91.9	5.31
11	6.35	128.16	134.51	95.3	5.45
						42	12.58	105.78	118.36	89.4	7.44
8	25.70	18.59	44.30	42.0	1.70
						24	9.87	99.27	109.15	91.0	8.25
45	10.22	85.45	95.66	89.3	6.28
						19	4.49	87.00	91.49	95.1	5.85
10	13.59	71.09	84.67	84.0	5.97
						27	11.29	100.89	112.18	89.9	10.06
44	28.75	11.25	40.00	28.1	1.26
						6	7.05	105.66	112.71	93.7	8.08
43	6.89	82.84	89.73	92.3	7.02
						35	3.86	57.92	61.78	93.8	5.67
9	17.13	17.20	34.33	50.1	2.13
						14	20.74	27.62	48.36	57.1	2.90
Cont34	46.72	0.00	46.72	0.0	0.00

                                实施例6

            能将氢醌有效地葡糖基化形成对苯二酚葡糖苷的

               萄糖基转移酶的表达克隆和生物化学表征

对申请人的拟南芥表达序列标志(ESTs)的数据库进行分析发现，这种植物能组成型地表达葡糖基转移酶基因(UGT72B1)，所述基因编码的多肽与印度萝芙木的对苯二酚葡糖苷合酶蛋白具有62％的序列同一性(Arend等，Phytochemistry，53：187-193(2000)：Hefner等，Bioorg.Med.Chem.，10：1731-1741(2002))。所述酶业已事先在大肠杆菌中重组生长，并且业已披露了其对苯甲酸衍生物的活性(Lim等，J.Biol.Chem.，277(1)：586-592(2002)：WO 02/103022A2)。在本研究中分析过的苯甲酸衍生物中，UGT72B1酶表现出对2，5-二羟基苯甲酸具有最高的比活性。所述酶对这种底物的比活性(11.72pkat/μ蛋白)在30℃下能翻译成大约0.6/sec的转换数。在该文献(Hefner等，同上)之前，该蛋白的生物化学功能是未知的(特别是对其他底物的活性)。使用UGT72B1酶(GenBank登录号116337.1)的公开序列，将TBLASTN算法用于检索拟南芥属EST序列的申请人数据库。鉴定了包括相当于UGT72B1转录物的5′末端的EST克隆。

拟南芥GT72B1的表达克隆

通过PCR修饰UGT72B1的ORF的侧翼区，以便插入高水平的大肠杆菌表达载体，pET28a(+)(Novagen)。该插入是通过使用引物17和18而实现的，并且使用来自原始cDNA克隆的纯化的质粒DNA作为

扩增的目标。

引物17-(SEQ ID NO：39)

5′- GAATATTTGCATccatgg AGGAATCC-3′

引物18-(SEQ ID NO：40)

5′- GAACATCgtcgac TTAGTGGTTGC-3′加下划线的碱基能与靶基因杂交，而小写字母表示添加在PCR引物末端的限制位点(NcoI或SalI)。引物17能与该基因的起始部分杂交，并且在起始密码子上导入NcoI位点，而引物18能与相反的一端杂交，并且提供仅随终止密码子之后的SalI位点；这两种引物都不会改变UGT72B1基因的ORF的推定的氨基酸序列。PCR反应物包括50mMKCl，10mM Tris-HCl(pH 9)，0.1％TritonX-100，2.5mM MgCl₂，0.2mM每一种dNTP，5个单位的Taq聚合酶(MBI Fermentas)，10ng的cDNA质粒模板，和最终浓度为0.2μM的两种PCR引物。进行25轮扩增，每一轮包括94℃下1.5分钟，55℃下1.5分钟，和72℃下5分钟。用NcoI和SalI消化所述PCR产物，凝胶纯化，并且将所得到的片段连接到大肠杆菌表达载体，pET-28a(+)(Novagen)上，所述载体是用相同的限制酶消化过的。将连接反应混合物用于转化大肠杆菌DH10B，并且对来自相应菌落的质粒DNA进行全面测序，以便检查PCR错误；没有发现错误。被选择用于进一步操作的质粒在下面被称作″pET28a/UGT72B1″。UGT72B1开放读框的序列以及所述酶的推定氨基酸序列分别如SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示。

通过电穿孔将pET28a/UGT72B1导入大肠杆菌BL21DE3细胞。重组克隆在存在50mg 1^-1卡那霉素的条件下在LB培养基上生长。

在大肠杆菌重组生产UGT72B1

用10L发酵罐(Braun Instruments，BiostatC 15L fermentor，Allentown，PA)进行发酵处理，以便产生足够的大肠杆菌细胞团，用于纯化重组生产的UGT72B1蛋白。用获得了pET28a/UGT72B1构建体的大肠杆菌BL21 DE3细胞的种子培养物(500mL LB 50mg/L卡那霉素)接种具有以下组成的9.5L大肠杆菌生长培养基。让所述种子培养物在35℃下生长大约10小时，使OD_550nm为3。

发酵灌培养基组成(每升)：

NaH2PO₄·2H₂O 0.9g

柠檬酸钠·2H₂O 0.05g

MgSO₄ 0.45g

K₂HPO₄ 1.95g

NH₄SO₄ 0.3g

酪蛋白氨基酸20g

硫胺素HCl 0.06mg

FeSO₄·7H₂O 0.03g

微量元素IL2 1mL

IL2微量元素母液的组成(每升)：

ZnSO₄·7H₂O 8g

CuSO₄·5H₂O 3g

MnSO₄·H₂O 2.5g

H₃BO₃ 0.15g

钼酸铵·4H₂O 0.1g

CoCl₂·6H₂O 0.06g

聚丙二醇0.83mL

在对所述培养基进行消毒之后，添加来自无菌母液的以下成分，达到标明的最终浓度：

生物素 0.005g/L

CaCl₂·2H₂O 0.026g/L

葡萄糖 20g/L

卡那霉素 0.050g/L

在发酵处理期间使用以下设定值。

搅拌：375rpm

气流：6slpm(每分钟标准升)

温度：17℃

CO₂：10％，串联搅拌器，然后气流

压力：0.5bar

pH：6.8

让培养物生长大约25小时，使OD_600nm达到15。然后添加来自无菌母液的IPTG，使最终浓度为0.4mM，并且继续发酵24小时。收获细胞糊并且在-80℃下保存。

重组生产的UGT72B1酶的大规模纯化

将如上文所述获得的细胞糊(50g湿重量)重新悬浮在95mL冰冷的100mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM MgSO₄，1mM二硫苏糖醇，0.03mg/mLDNAse I，和0.5mM苯甲烷磺酰氟中，并且两次从弗氏细胞压碎器中通过，压力为20,000psi。除非另有说明，随后的步骤是在0-4℃下进行的。通过离心(43,000xg，90min)除去细胞碎片，然后在每毫升含有大约40mg的蛋白的所得到的无细胞提取物(大约110mL)中添加甘油(5％)，并且在-80℃下保存用于随后的纯化。

纯化UGT72B1的第一个步骤是阴离子交换层析。粗制提取物(12.5mL)以2.5mL的等份样品在PD-10柱上进行缓冲液交换，交换到Q缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.7)，10mM亚硫酸钠，和1mM EDTA)中，并且通过0.2μm Acrodisc过滤器(Gelman-Pall Life Sciences)过滤。然后将所有样品(17.5mL)加样到Mono Q HR 16/10柱(AmershamBiosciences)上，该柱是在25℃下用缓冲液Q预平衡的。在前20分钟所述柱以4mL/min的速度用缓冲液Q洗脱，随后通过0-250mM NaCl(在缓冲液Q中)的线性梯度(140mL)洗脱。从所述梯度的开始收集级份(8mL)。用p-硝基酚(pNP)(Sigma)作底物，检测每一个柱级份的等份样品(10μL)的UDP-葡糖基转移酶活性。该测定的基础是当葡萄糖与pNP的苯酚羟基结合时黄色的消失。在室温下进行的100-μL的反应体积包括40mM Tris-HCl(pH 7.5)，240mM NaCl，0.8mM MgCl₂，10mM UDP-葡萄糖，和148μM pNP。根据观测分析，几乎所有的重组蛋白都是在级份8中检测到的。

在所述梯度结束时，用1M NaCl(在缓冲液Q中)对所述柱进行充分洗涤，并且重建起始条件。在活性级份中添加100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.34)，10mM二硫苏糖醇，和5％甘油，并且保持在冰上，同时对无细胞提取物的另外五个12.5-mL的等份样品进行相同的处理。合并来自所有六个处理的活性级份，并且在-80℃下保存，随后处理。

在下一个步骤中，对合并的级份(总体积为60mL)进行大小排阻层析。用四个Centripep-30装置(Millipore Corp.)将所有样品浓缩到最终体积为6mL，通过0.2μm Acrodisc过滤器过滤，然后以2-mL的等份样品在TSK-Gel G3000SW凝胶过滤柱(21×600mm)(Tosoh Biosep LLC.，Montgomeryville，PA)上分离。所述柱以4mL/min的速度用50mM Tris-HCl(pH 7.2)，330mM NaCl，1mM二硫苏糖醇，0.5mM EDTA洗脱(25℃)。收集在32.5-34.4分钟期间洗脱的材料(相当于以pNP作底物的UDP-葡糖基转移酶活性的峰值)，并且补充5.8％甘油。再重复该过程两次，将所有样品用完。合并来自所有三个凝胶过滤柱的活性级份并且添加另外的4.85mM二硫苏糖醇，用于进一步处理。

通过在羟磷灰石上层析而进一步纯化UGT72B1酶。简单地讲，用Centripep-30将上述材料浓缩到3mL体积，并且通过0.2μm Acrodisc过滤器过滤。1/4的浓缩材料(0.75mL)用10mL的缓冲液h(10mM磷酸钠(pH 6.34)，0.5mM DTT，和0.01mM CaCl₂)稀释。将所有样品注入到100×7.8mm的Bio-Gel HPHT羟磷灰石柱上，该柱用缓冲液H预平衡。所述柱是以1mL/min的速度洗脱的(25℃)，前12分钟使用缓冲液h，随后使用10-350mM磷酸钠(在缓冲液H中)的线性梯度(25mL)。合并在大约109至160mM磷酸钠之间洗脱的级份，添加6.52％甘油和10mM二硫苏糖醇，并且在干冰上冷冻，同时以相同的方式通过三次相同的处理对所述样品的其余部分进行处理，将所有样品用完。合并来自所有四次处理的合并级份，以便得到14mL的总体积，并且在-80℃下冷冻该材料。在进行下面所述的酶测定之前，对UGT72B1酶作进一步的浓缩。使用三个PD-10柱对七毫升上述合并的羟磷灰石材料进行缓冲液交换，交换到50mM Tris HCl(pH 7.0)和lmM DTT中。合并所述PD洗脱液，并且使用Centripep-30装置浓缩到1.1mL。浓缩样品中UGT72B1蛋白的最终蛋白浓度为14.64mg/mL。蛋白浓度是通过分光光度法测定的，在280nm的波长下使用的消光系数为50，250M^-1(正如使用SEQ ID NO：42通过GCG的Peptidesort程序计算的)。对过量加载的考马斯染色的凝胶进行目测检查发现，纯化的重组UGT72B1蛋白的纯度至少为95％。

分析UGT72B1与氢醌的动力学特性

测定UGT72B1与底物氢醌的动力学特性。用50mM Tris HCl(pH7.5)，1mM MgCl₂和2mM DTT将酶稀释到最终浓度为0.115ng/μL。在37℃下使用5μL(0.57ng)的UGT72B1，在25μL的最终体积中，在存在50mM Tris HCl，1mM MgCl₂，1mM DTT，20mM UDPG，和4mM-7.8μM的氢醌的条件下用5分钟时间测定氢醌UDP-葡糖基转移酶(HQ-GT)活性。通过HPLC分析，按以下方法定量对苯二酚葡糖苷的形成：使用从2％乙腈，1.5％磷酸(溶剂A)到48％乙腈，1.5％磷酸(溶剂B)的梯度，在Nova-PakC18柱(60孔度，4μm粒度)上分离10μL的分析物。使用以下溶剂梯度：0-5min 100％溶剂A；5-20min 0-100％溶剂B的线性梯度；21-25min 100％溶剂A。在221nm吸收波长下检测对苯二酚葡糖苷，并且通过用通过商业渠道获得的对苯二酚葡糖苷的标准物制备的校正曲线进行定量。

将所述数据代入Michaelis-Menten公式。在上述条件下，表观Km和Vmax值分别为大约0.3μM和大约796pmol/sec/μg。使用在7.8，15.6，31.25，和62.5μM的氢醌浓度下测定的速度，通过用速度/底物浓度对速度进行作图，使用Hofstee图测定所述参数(图5)。在该曲线中，提供估算的Km作为曲线的斜率，通过上述点和由回归曲线在y轴的截距表示的Vmax表示线性回归曲线。图5表示酶测定数据的Michaelis-Menten曲线。该图表示当氢醌的浓度超过100μM时，所述酶受到了显著的底物抑制作用。

UGT72B1酶与氢醌的Vmax显著(大约68倍)高于用UGT72B1酶和苯甲酸底物测定的Vmax值(Lim等，J.Bio.Chem.，277(1)：586-592(2002))。UGT72B1酶对氢醌的Vmax表示在37℃下的转换数为42/sec。该转换数是使用UGT72B1酶的53，015.33Da的分子量计算的，该分子量是使用GCG的PEPIDESORT软件包计算的。该转换数明显高于印度萝芙木对苯二酚葡糖苷合酶的转换数，据报道，后者在50℃下在存在1mM氢醌时的Vmax为26.32pkat/μg(Arend等，Phytochemistry，53：187-193(2000))。用51，793.01Da作为对苯二酚葡糖苷合酶蛋白的分子量，可以将该Vmax转化成在50℃下的转换数为大约1.4/sec，所述分子量使用GenBank登录号AJ310148.1，并且使用GCG的PEPIDESORT软件包计算。

申请人披露了UGT72B1酶用于缀合氢醌的出乎意料的和独特的用途。这种酶的独特性是通过表达为140的kcat(s^-1)/Km(1M)的催化效率体现的，该效率明显超出了任何其他以前披露的具有对氢醌的活性的葡糖基转移酶的活性。

                        实施例7

        构建用于在大肠杆菌表达CPL，pHBA 1-H和

                拟南芥HQ-GT的合成操纵子。

构建表达多顺反子转录物的质粒，使得在大肠杆菌中由单一的转录单位产生对苯二酚葡糖苷所需要的所有三种酶都能翻译。用于实现这一目的的克隆方法如图6所示。通过用SalI和XhoI进行限制性消化，将获得了大肠杆菌的CPL基因(SEQ ID NO：29)的pET24a构建体的质粒DNA线性化。将线性化的质粒DNA与两种限制片段组合，它们各自分别包括pHBA 1-羟化酶和拟南芥葡糖基转移酶基因的核糖体结合位点和开放读框。按以下方法制备这两个基因的限制片段：

使用引物19(SEQ ID NO：43)和20(SEQ ID NO：44)，将实施例3所述用于重组生产pHBA 1-羟化酶蛋白的pET29A构建体的质粒DNA用于PCR反应。

引物19-(SEQ ID NO：43)：

5′-gtcgac AAGGAGATATACATATGGCGGTGCAGGC-3′

引物20-(SEQ ID NO：44)：

5′-gtcgac AAGCTTAGCCTGATGCACTTAATGG-3′

加下划线的大写字母的核苷酸相当于用于重组表达pHBA 1-羟化酶的pET29A构建体的序列。小写字母的核苷酸在PCR产物的5’和3’末端分别导入了SalI限制位点。用粗体表示的序列相当于用于在大肠杆菌中有效翻译的核糖体识别位点。

合并包括2.5mM MgCl₂，2mM dNTPs，10mM Tris/HCl(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40的PCR反应混合物(100μL)，1μM的引物19和引物20，10U Taq聚合酶和100ng的pET29A-pHBA 1-HDNA模板。进行25轮PCR，每一轮包括94℃下45秒，58℃下45秒，和72℃下2分钟。对PCR产物进行凝胶纯化，并且按照生产商的说明，使用TOPO T/A克隆试剂盒进行克隆到pCR2.1载体上。重组克隆在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上生长。分离质粒DNA，并且进行DNA测序。用SalI消化缺少PCR-诱导的突变的质粒DNA。对代表pHBA 1-羟化酶基因的1.4kb SalI限制片段凝进行胶纯化。

使用引物21(SEQ ID NO：45)和22(SEQ ID NO：46)，将用于重组生产实施例6所述拟南芥属的氢醌葡糖基转移酶蛋白的pET28A构建体的质粒DNA用于PCR反应。

引物21-(SEQ ID NO：45)：

5′-gtcgac AAGGAGATATACCATGGAGGAATCC-3′

引物22-(SEQ ID NO：46)：

5′-ctcgag TTAGTGGTTGCCATTTTGCTCTAACTC-3′

加下划线的核苷酸相当于用于重组表达前面所述的来自拟南芥属的氢醌葡糖基转移酶蛋白的pET28A构建体的序列。小写字母表示的核苷酸分别在PCR产物的5′和3′末端导入SalI和XhoI限制位点。用粗体表示的序列相当于用于在大肠杆菌中有效翻译的核糖体识别位点。

合并包括2.5mM MgCl₂，2mM dNTPs，10mM Tris/HCl(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40的PCR反应混合物，1μM的引物21和引物22，10UTaq聚合酶和100ng的pET28A-HQ GT DNA模板(100μL)。进行25轮PCR，每一轮包括94℃下45秒，58℃下45秒，和72℃下2分钟。对PCR产物进行凝胶纯化，并且按照生产商的说明，使用TOPO T/A克隆试剂盒克隆到pCR2.1载体上。重组克隆是在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上生长的。分离质粒DNA，并且进行DNA测序。随后用SalI和XhoI消化缺少PCR-诱导的突变的质粒DNA。对代表HQ GT酶的1.4kb SalI/XhoI限制片段进行凝胶纯化。

在5μL的最终体积中组装连接反应物，它包括100ng SalI XhoI线性化的凝胶纯化的pET24a-CPL DNA，和SalI pHBA 1-羟化酶和SalI/XhoI氢醌GT片段各50ng。按照生产商的说明，将连接产物导入电感受态DH10B细胞(Invitrogen，USA)。在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上回收重组克隆，并且在选择条件下在液体LB培养基上生长。分离质粒DNA，并且用XbaI进行诊断性限制性消化。将包括所有三个沿图6所示方向的三个基因的质粒克隆用于生产5kb的pET24a载体片段，和3.2kb的片段，该3.2kb片段包括CPL，pHBA1-H，和1.2kb的HQ-GT基因。用于共同表达CPL，pHBA 1-H，和HQ-葡糖基转移酶蛋白的pET24a载体构建体的DNA插入片段的序列如SEQID NO：47所示。

为了通过在大肠杆菌中共同表达CPL，pHBA 1-H，和HQ-葡糖基转移酶促进对苯二酚葡糖苷的生产，将上述pET24a质粒构建体导入受诱导型启动子的控制的能表达T7 RNA聚合酶的大肠杆菌宿主。具有这种特性的合适的宿主是大肠杆菌BL21 DE3(Novagen，W1，USA)。在该菌株中，T7聚合酶的表达受lacUV5启动子的控制。通过电穿孔将所述质粒导入所述表达宿主。在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上选择转化体。

为了用葡萄糖生产对苯二酚葡糖苷，将获得了对苯二酚葡糖苷生产质粒的单一菌落的BL21DE3宿主用于接种100mL的含有50mg/L卡那霉素的无菌M9培养基(每升：6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，2g葡萄糖，1gNH₄Cl，1mM MgSO₄，1mM硫胺素，和0.1mM CaCl₂)。细胞是在连续振荡(250rpm)的条件下，在25℃下生长到OD_600nm为0.6，并且通过添加IPTG至最终浓度为0.25mM而诱导对苯二酚葡糖苷的生产。24小时之后，按以下方法测定培养基和大肠杆菌细胞中对苯二酚葡糖苷浓度。通过离心收获培养物(1mL)。按以下方法对培养物上清液进行HPLC分析。将细胞沉淀重新悬浮在50μL水中。通过向所述细胞水性悬浮液中添加等体积的100％MeOH提取细胞成分。通过离心使细胞悬浮液澄清，并且按以下方法对培养基和甲醇细胞提取物进行HPLC分析：使用从2％乙腈，1.5％磷酸(溶剂A)至48％乙腈，1.5％磷酸(溶剂B)的梯度，在Nova-PakC18柱(60孔度，4μm粒度)上分离10μL的分析物，并且在282nm波长下进行UV检测。采用以下溶剂梯度：0-5min 100％溶剂A；0-100％5-20min溶剂B的线性梯度；21-25min 100％溶剂A。在282nm吸收波长下检测对苯二酚葡糖苷，并且通过用商业渠道获得的对苯二酚葡糖苷(Sigma)标准物制备的校正曲线进行定量。

制备适合最高对苯二酚葡糖苷产率的能够共同表达CPL，pHBA 1-羟化酶，和氢醌葡糖基转移酶的质粒载体。

上述能表达由单一质粒生产对苯二酚葡糖苷所需要的所有三个基因的DNA构建体受相同的，非常强的T7启动子的控制。在对苯二酚葡糖苷生产领域的其他发展，导致了对苯二酚葡糖苷产率的提高，并且滴度需要考虑生产对苯二酚葡糖苷所需要的酶的催化效率的差异。例如，将分支酸转化为对苯二酚葡糖苷所需要的三种酶的催化效率(表达为Kcat(s^-1)/Km(μM))对CPL，pHBA 1-H，和拟南芥属HQ GT酶来说分别为0.083，32，和140。因此，对苯二酚葡糖苷合成途径的后两种酶能够以明显低于CPL的水平表达，而又不影响流量，从而减轻与蛋白高水平表达相关的有害作用。这种基本原理没有考虑在大肠杆菌细胞质中这三种酶的稳定性方面可能存在的差异。在任何场合下，对用于改善在大肠杆菌中的产物信息的酶的表达水平的微调，需要独立地调控用于对苯二酚葡糖苷途径的三种酶的表达水平的能力。异源基因在大肠杆菌中的表达水平是通过质粒的拷贝数量和启动子的强度控制的。

申请人披露了两种相容质粒pMPMT3 pHBA 1-H和pCL1920 HQ GT的构建，其中，pHBA 1-H基因和HQ GT基因的表达受lac启动子的控制。该启动子比T7启动子弱。另外，pMPMT3的p15a ori(10-12个拷贝/细胞)(Mayer等，Gene，163：41-46(1995))和pCL1920的pSC101 ori(5个拷贝/细胞)(Lerner和Inouye，NAR，18(15)：4631(1990))导致了每个细胞的拷贝数量明显低于上面所使用的pET24载体的拷贝数量。所述新的表达质粒的启动子强度和质粒拷贝数量会导致pHBA 1-H和HQ-GT基因的表达明显低于pET24a载体上的CPL基因的表达，因此，考虑了推荐的对苯二酚葡糖苷途径的这三种催化剂的效率方面的显著差异。

制备pMPMT3-衍生的质粒，它能表达受lac启动子控制的pHBA 1-H基因。使用引物23(SEQ ID NO：48)和24(SEQ ID NO：49)，将实施例3中所述用于重组生产pHBA 1-羟化酶蛋白的pET29A构建体的质粒DNA用于PCR反应。

引物23-(SEQ ID NO：48)：

5′-ggtaccGTGA AAGGAGATATACATATGGCGGTGCAGGC-3′

引物24-(SEQ ID NO：49)：

5′-gagctc AAGCTTAGCCTGATGCACTTAATGG-3′

加下划线的大写字母的核苷酸相当于用于重组表达pHBA 1-羟化酶的pET29A构建体的序列。用小写字母表示的核苷酸在PCR产物的5’和3’末端分别导入了KpnI和SacI限制位点。用粗体表示的序列相当于有效启动在大肠杆菌中的翻译的核糖体识别位点。粗体斜体字是终止密码子，它能终止从pMPMT3载体的β-半乳糖苷酶α-片段基因的起始甲硫氨酸开始的翻译。

合并包括2.5mM MgCl₂，2mM dNTPs，10mM Tris/HCl(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40的PCR反应混合物(100μL)，1μM的引物23和引物24，10U Taq聚合酶和100ng的pET29A-pHBA 1-HDNA模板。进行25轮PCR，每一轮包括94℃下45秒，58℃下45秒，和72℃下2分钟。对PCR产物进行凝胶纯化，按照生产商的说明，使用TOPO T/A克隆试剂盒克隆到pCR2.1载体上。在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上生长重组克隆。分离质粒DNA，并且进行DNA测序。用KpnI和SacI消化缺少PCR-诱导的突变的质粒DNA。对代表pHBA 1-羟化酶基因的1.4kb的限制片段进行凝胶纯化，并且连接到业已用KpnI和SacI限制酶消化过的pMPMT3载体上。将连接产物转化入电感受态DH10B细胞(Invitrogen)，并且在含有10g/L 四环素的LB培养基上选择转化体。用标准方法分离质粒DNA。

制备pCL1920-衍生的质粒，它能表达受lac启动子控制的拟南芥属HQ-GT基因。使用25(SEQ ID NO：50)和26(SEQ ID NO：51)，将实施例6所述用于重组生产葡糖基转移酶(UGT72B1)蛋白的pET28A构建体的质粒DNA用于PCR反应。

引物25-(SEQ ID NO：50)：

5′-ggatccGTGA AAGGAGATATACCATGGAGGAATCC-3′

引物26-(SEO ID NO：51)：

5′-aagctt TTAGTGGTTGCCATTTTGCTCTAACTC-3′

加下划线的用大写字母表示的核苷酸相当于用于重组表达UGT72B1葡糖基转移酶的pET28A构建体的序列。用小写字母表示的核苷酸将BamHI和HindIII限制位点分别导入PCR产物的5’和3’末端。用粗体表示的序列相当于用来有效启动在大肠杆菌中的翻译的核糖体识别位点。用粗体斜体表示的序列是终止密码子，它能终止从pCL1920载体的β-半乳糖苷酶α-片段基因的起始甲硫氨酸开始的翻译。

合并包括2.5mM MgCl₂，2mM dNTPs，10mM Tris/HCl(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40的PCR反应混合物(100μL)，1μM的引物25和引物26，10UTaq聚合酶，和100ng的pET28A-UGT72B1 DNA模板。进行25轮PCR，各自包括94℃下45秒，58℃下45秒，和72℃下2分钟。对PCR产物进行凝胶纯化，并且按照生产商的说明，使用TOPO T/A克隆试剂盒克隆到pCR2.1载体上。在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上生长重组克隆。分离质粒DNA，并且进行DNA测序。用BamHI和Hind III消化缺少PCR-诱导的突变的质粒DNA。对代表UGT72B1基因的1.4kb限制片段进行凝胶纯化，并且连接到业已用BamHI和Hind III限制酶消化过的pMPMT3载体上。将连接产物转化入电感受态DH10B细胞(Invitrogen)，并且在含有50mg/L壮观霉素的LB培养基上选择转化体。用标准方法分离质粒DNA。

对于通过在大肠杆菌中共同表达CPL，pHBA 1-H，和HQ-葡糖基转移酶实现的对苯二酚葡糖苷生产来说，将pET24a CPL(实施例4)，pMPMT3pHBA 1-H，和pCL1920 HQ-GT质粒载体导入能表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌宿主，所述表达的基因受诱导型启动子控制。具有这种特征的合适的宿主是大肠杆菌BL21DE3(Novagen)。在该菌株中，T7聚合酶的表达是受lacUV5启动子的控制的。通过电穿孔将所述质粒同时导入表达宿主。在含有50mg/L卡那霉素，50mg/L壮观霉素，和10mg/L四环素的LB培养基上选择转化体。

为了由葡萄糖生产对苯二酚葡糖苷，将获得了三种对苯二酚葡糖苷生产质粒的BL 21DE3宿主的单一菌落用于接种100mL的含有50mg/L卡那霉素，50mg/L壮观霉素和10mg/L四环素的无菌M9培养基(每升：6g Na₂HPO₄，3g KH₂PO₄，2g葡萄糖，1g NH₄Cl，1mMMg SO₄，1mM硫胺素，和0.1mM CaCl₂)。在连续振荡(250rpm)的条件下，在25℃下让细胞生长到OD_600nm为0.6，并且通过添加IPTG到最终浓度为1mM诱导对苯二酚葡糖苷的生产。24小时之后，通过以下方法测定培养基和大肠杆菌细胞中的对苯二酚葡糖苷浓度。通过离心收获培养物(1mL)，按以下方法对培养上清液进行HPLC分析。将细胞沉淀物重新悬浮在50μL的水中，并且通过向细胞的水性悬浮液中添加等体积的100％MeOH提取细胞成分。通过离心澄清细胞悬浮液，并且按以下方法对培养基和甲醇细胞提取物进行HPLC分析：使用从2％乙腈，1.5％磷酸(溶剂A)到48％乙腈，1.5％磷酸(溶剂B)的梯度，在Nova-PakC18柱(60孔度，4μm粒度)上分离10μL的分析物，并且在282nm波长下进行UV检测。使用了以下溶剂梯度：0-5min 100％溶剂A；5-20min 0-100％溶剂B的线性梯度；21-25min 100％溶剂A。在282nm的吸收波长下检测对苯二酚葡糖苷，并且通过用通过商业渠道获得的对苯二酚葡糖苷(Sigma)标准物制备的校正曲线进行定量。

                         实施例8

构建用于在大肠杆菌中表达CPL和pHBA 1-H的合成操纵子。

构建能表达多顺反子转录物的质粒，用于在大肠杆菌中翻译从单一的转录单位生产氢醌所需要的酶。通过用NdeI和XhoI进行限制性消化，将pET29a载体的质粒DNA线性化。线性化的质粒DNA与携带CPL和pHBA1-羟化酶基因的两个限制片段组合。按以下方法制备这两种基因的限制片段：

使用引物27(SEQ ID NO：52)和28(SEQ ID NO：53)，将大肠杆菌BL21 DE3的单一菌落用于PCR反应。

引物27-(SEQ ID NO：52)：

5′- CTACTCATTTcatatg TCACACCCCGCGTTAA-3′

引物28-(SEQ ID NO：53)：

5′- CATCTTACTgtcgac TTAGTACAACGGTGACGCC-3′

加下划线的用大写字母表示的核苷酸相当于大肠杆菌CPL基因序列。用小写字母表示的核苷酸分别在PCR产物的5’和3’末端导入了NdeI和SalI限制位点。

合并括2.5mM MgCl₂，2mM dNTPs，10mM Tris/HCl(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40的PCR反应混合物(100μL)，1μM的引物27和引物28，10U Taq聚合酶，并且补充来自BL21 DE3细胞的单一菌落的大肠杆菌细胞。进行25轮PCR，每一轮包括94℃下45秒，58℃下45秒，和72℃下2分钟。对PCR产物进行凝胶纯化，并且按照生产商的说明，使用TOPO T/A克隆试剂盒克隆到pCR2.1载体上。在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上生长重组克隆。分离质粒DNA，并且进行DNA测序。用NdeI和SalI消化缺少PCR-诱导的突变的质粒DNA。对代表pHBA 1-羟化酶基因的0.49kb限制片段进行凝胶纯化。

使用引物19(SEQ ID NO：43)和20(SEQ ID NO：44)，将实施例3所述用于重组生产pHBA 1-羟化酶蛋白的pET29A构建体的质粒DNA用于PCR反应。

合并包括2.5mM MgCl₂，2mM dNTPs，10mM Tris/HCl(pH 8.8)，50mM KCl，0.08％Nonidet P40的PCR反应混合物(100μL)，1μM的引物19和引物20，10UTaq聚合酶，和100ng的pET29A-pHBA 1-HDNA模板。进行25轮PCR，每一轮包括94℃下45秒，58℃下45秒，和72℃下2分钟。对PCR产物进行凝胶纯化，并且按照生产商的说明，使用TOPO T/A克隆试剂盒克隆到pCR2.1载体上。在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上生长重组克隆。分离质粒DNA，并且进行DNA测序。用SalI消化缺少PCR-诱导的突变的质粒DNA。对代表pHBA 1-羟化酶基因的1.4kb SalI限制片段进行凝胶纯化。

在5μL的最终体积中组装连接反应物，它包括100ng的NdeI/XhoI线性化的，凝胶纯化的pET29a DNA，和分别相当于CPL和pHBA 1-羟化酶基因的NdeI SalI和SalI限制片段各50ng。按照生产商的说明，将连接产物导入电感受态DHl0B细胞。

在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上回收重组克隆，并且在液体LB培养基在选择条件下生长。分离质粒DNA，并且用XbaI和HindIII进行诊断性限制消化，它能切除包括CPL和pHBA 1-羟化酶基因的2kb限制片段。包括CPL和pHBA 1-羟化酶基因的所述DNA插入片段的序列如SEQ ID NO：54所示。

在大肠杆菌中用葡萄糖生产氢醌或对苯二酚葡糖苷是按以下方法实现的。将上述用于生产对苯二酚葡糖苷的多顺反子构建体和实施例6所述用于表达氢醌-特异性葡糖基转移酶的构建体分别导入大肠杆菌宿主BL21 DE3的细胞。在该菌株中，T7聚合酶的表达受lacUV5启动子的控制。在含有50mg/L卡那霉素的LB培养基上选择转化体。为了用葡萄糖生产对苯二酚葡糖苷，将获得了CPL和pHBA 1-羟化酶或HQ-GT基因的BL21 DE3宿主的单一菌落用于接种50mL的含有50mg/L卡那霉素的无菌M9培养基(每升：6gNa₂HPO₄，3g KH₂PO₄，2g葡萄糖，1g NH₄Cl，1mM Mg SO₄，1mM硫胺素，和0.1mM CaCl₂，用磷酸调整到pH 6)。细胞在连续振荡(300rpm)的条件下，在37℃下生长到OD_600nm为0.6。通过离心收获细胞，并且重新悬浮在5mL的M9培养基中。

氢醌在大肠杆菌中的生产是通过将含有CPL/pHBA 1-羟化酶构建体的两个50mL的收获的细胞组合在100mL的含有25mg/L卡那霉素和0.5mM IPTG的新的M9培养基中实现的。细胞在连续振荡(300rpm)的条件下在26℃下生长14小时。

对苯二酚葡糖苷在大肠杆菌中的生产是通过将含有CPL/pHBA 1-羟化酶或HQ-GT构建体的收获细胞的50mL培养物组合在100mL的含有25mg/L卡那霉素和0.5mM IPTG的新的M9培养基中实现的。细胞在连续振荡(300rpm)的条件下在26℃下生长14小时。

出于对照目的，将仅包括具有HQ-GT构建体的细胞的第三种培养物在相同的条件下建立。

通过离心使培养物澄清，并且按以下方法进行HPLC分析：使用从1.5％乙腈，1.5％磷酸(溶剂A)到48％乙腈，1.5％磷酸(溶剂B)的梯度，在Nova-PakC18柱(60孔度，4μM粒度)上分离10μL的培养上清液，并且在221nm波长下进行UV检测。使用以下溶剂梯度：0-5min 100％溶剂A；5-20min 0-100％溶剂B的线性梯度；21-25min 100％溶剂A。在221nm吸收波长下检测的对苯二酚葡糖苷和氢醌通过用通过商业渠道获得的标准物制备的校正曲线进行定量。

图7表示说明大肠杆菌培养物的培养基组成的HPLC痕迹。比较痕迹1和痕迹3发现，共同表达CPL和pHBA 1-羟化酶导致了新的化合物的产生，它的驻留时间与氢醌标准物的驻留时间相同。另外，比较痕迹1和痕迹4/5发现，当表达CPL和pHBA 1-羟化酶和HQ-GT的培养物混合，并且通过添加IPTG诱导酶产生时，推定的氢醌中间产物被转化成新的化合物，它的驻留时间与对苯二酚葡糖苷的驻留时间相同。按以下方法通过LC-MS分析证实由微生物生产的对苯二酚葡糖苷的性质。通过HPLC如上文所述分离100微升的无细胞培养上清液，并且手工收集推定的对苯二酚葡糖苷峰。通过LC-MS分析纯化的对苯二酚葡糖苷。将100μL的HPLC纯化的化合物注入到ZORBAX EclipseXDB-C18柱(2.1×150mm，80，3.5μm)(Bio-RAD，USA)上。所述柱是在以下条件下洗脱的：溶剂A(H₂O/0.1％(v/v)甲酸)，溶剂B(100％乙腈)；0-25min 0％-60％B(0.3mL/min)，25-25.5min 60-100％B(0.4mL/min)，25.5-30min 100％B(0.4mL/min)，30-31min 100％-0％B(0.3mL/min)，和31-40min 0％B(0.3mL/min)。将装有电喷射界面的Hewlett-Packard质谱仪MSD1100用于检测分析物。数据是以阳离子模式获得的，使用的毛细管电压为3kV。解溶剂化气流是12L/min的氮气。解溶剂化和来源阻断温度为350℃。调节所述仪器，以便进行单位分辨。通过MS实验用1秒钟时间扫描80-600道尔顿的范围采集数据。

能表达CPL和pHBA 1-羟化酶的细胞和能表达来自拟南芥属的氢醌-特异性葡糖基转移酶的细胞的混合的大肠杆菌培养物含有新的化合物。在通过谱分析方法进行分析时，所述新的化合物以电喷射阳离子化方式产生分子离子，它具有的质量与电荷的比例(m/z+)为290.1。这种分子离子的特性与氢醌葡糖苷(MW 272.25)的铵加合物(MW290.29)的预期的m/z+非常接近。另外，所述化合物一致性地产生m/z+＝180.0的片段，它与葡萄糖(MW＝180.16)的预期的m/z+非常接近。

能表达CPL和pHBA 1-羟化酶的大肠杆菌BL21 DE3细胞的培养基在发酵14小时之后含有29.3mg/L氢醌。能表达CPL和pHBA 1-羟化酶和HQ-GT酶的大肠杆菌BL21 DE3细胞的混合培养物的培养基在发酵14小时之后含有63.5mg/L对苯二酚葡糖苷。如实施例7所述，通过在单一细胞中表达生产对苯二酚葡糖苷所需要的所有三种酶可以进一步改进对苯二酚葡糖苷在大肠杆菌培养物中的积累。

                               序列表

<110>E.I.duPont de Nemours and Company

<120>在绿色植物和微生物中高水平生产对苯二酚葡糖苷

<130>CL 2155 US NA

<160>54

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>24

<212>PRT

<213>近平滑假丝酵母

<400>1

Ala Val Gln Ala Pro Ser Lys Thr Tyr Gly Phe Gln Lys Ala Pro Ile

1               5                   10                  15

Gln Leu Thr Phe Val Val Val Gly

            20

<210>2

<211>7

<212>PRT

<213>近平滑假丝酵母

<400>2

Asn Pro Thr Tyr Thr Tyr Pro

1               5

<210>3

<211>14

<212>PRT

<213>近平滑假丝酵母

<400>3

Gln Tyr Val Gly Asp Val Ile Val Gly Tyr Asp Gly Val Arg

1               5                   10

<210>4

<211>13

<212>PRT

<213>近平滑假丝酵母

<400>4

Ala Leu Leu Thr Gly Asp Ser Ser Gly Ala Tyr Asp Thr

1               5                   10

<210>5

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物1

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>N＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>N＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>R＝A或G

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>n＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>n＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(19)

<223>W＝A或T

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>S＝C或G

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>n＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>R＝A或G

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>n＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)..(30)

<223>n＝肌苷

<400>5

atggcngtnc argcnccnws naaracntan gg                              32

<210>6

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物2

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>R＝A或G

<220>

<221>misc_feature

<222>(6)..(6)

<223>R＝A或G

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>n＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(12)..(12)

<223>n＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(15)..(15)

<223>D＝A，G，或T

<220>

<221>misc_feature

<222>(18)..(18)

<223>n＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>R＝A或G

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>n＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>n＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)..(30)

<223>R＝A或G

<400>6

ccrtcrtanc cnacdatnac rtcnccnacr ta                              32

<210>7

<211>11

<212>PRT

<213>近平滑假丝酵母

<400>7

Met Ala Val Gln Ala Pro Ser Lys Thr Tyr Gly

1               5                   10

<210>8

<211>11

<212>PRT

<213>近平滑假丝酵母

<400>8

Tyr Val Gly Asp Val Ile Val Gly Tyr Asp Gly

1               5                   10

<210>9

<211>518

<212>DNA

<213>近平滑假丝酵母

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>R＝A或G

<220>

<221>misc_feature

<222>(489)..(489)

<223>Y＝C或T

<220>

<221>misc_feature

<222>(504)..(504)

<223>W＝A或T

<220>

<221>misc_feature

<222>(513)..(513)

<223>Y＝C或T

<400>9

atggcggtgc aggcgccgtg gaaracgtac ggtttccaaa aggctccaat acaacttaca    60

tttgtcgttg taggtgccgg tctcggggga gtcgccgcta gtatttgcct cagattggca    120

ggccacagag tcattttatt agaagcagct actgaattgg gtgaagttgg agctggtatt    180

caaattccac caccatcaac caagatttta aaagcaattg gcgtattgga tgcagttgat    240

aaagtctcga ttcatccaca tgatatcttg gtcaagaaat ataaaggtga acttttatct    300

acgcaaaact tggtgcctta tgttctggag aaatacgatg gaatgtattt acatattcac    360

agggctgatt atcataaagt attggttgat agagccgaag aattgggggt tgaaatceat    420

acaaattcaa gagttgttga tattgatttt gaaaaagcaa ctgtcactac tgcaactgga    480

aaacaatayg tcggcgatgt catwgtcggc taygatgg                            518

<210>10

<211>172

<212>PRT

<213>近平滑假丝酵母

<400>10

Met Ala Val Gln Ala Pro Trp Lys Thr Tyr Gly Phe Gln Lys Ala Pro

1               5                   10                  15

Ile Gln Leu Thr Phe Val Val Val Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Ala

            20                  25                  30

Ala Ser Ile Cys Leu Arg Leu Ala Gly His Arg Val Ile Leu Leu Glu

        35                  40                  45

Ala Ala Thr Glu Leu Gly Glu Val Gly Ala Gly Ile Gln Ile Pro Pro

    50                  55                  60

Pro Ser Thr Lys Ile Leu Lys Ala Ile Gly Val Leu Asp Ala Val Asp

65                  70                  75                  80

Lys Val Ser Ile His Pro His Asp Ile Leu Val Lys Lys Tyr Lys Gly

                85                  90                  95

Glu Leu Leu Ser Thr Gln Asn Leu Val Pro Tyr Val Leu Glu Lys Tyr

            100                 105                 110

Asp Gly Met Tyr Leu His Ile His Arg Ala Asp Tyr His Lys Val Leu

        115                 120                 125

Val Asp Arg Ala Glu Glu Leu Gly Val Glu Ile His Thr Asn Ser Arg

    130                 135                 140

Val Val Asp Ile Asp Phe Glu Lys Ala Thr Val Thr Thr Ala Thr Gly

145                 150                 155                 160

Lys Gln Tyr Val Gly Asp Val Ile Val Gly Tyr Asp

                165                 170

<210>11

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物3

<400>11

ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt tttt                            34

<210>12

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物4

<400>12

ggttgataga gccgaagaat tgggggttga aatcc                           35

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物5

<400>13

ggccacgcgt cgactagtac                                            20

<210>14

<211>1526

<212>DNA

<213>近平滑假丝酵母

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>R＝A或G

<400>14

atggcggtgc aggcgccgtg gaaracgtac ggtttccaaa aggctccaat acaacttaca    60

tttgtcgttg taggtgccgg tctcggggga gtcgccgcta gtatttgcct cagattggca    120

ggccacagag tcattttatt agaagcagct actgaattgg gtgaagttgg agctggtatt    180

caaattccac caccatcaac caagatttta aaagcaattg gcgtattgga tgcagttgat    240

aaagtctcga ttcatccaca tgatatcttg gtcaagaaat ataaaggtga acttttatct    300

acgcaaaact tggtgcctta tgttctggag aaatacgatg gaatgtattt acatattcac    360

agggctgatt atcataaagt attggttgat agagccgaag aattgggggt tgaaatccat    420

acaaattcaa gagttgttga tattgatttt gaaaaagcaa ctgtcactac tgcaactgga    480

aaacaataca gtggtgatgt cattgtaggg tatgatggag tcagatcaca aaccagagct    540

ttattaactg gtgactcttc tggagcttac gatactggtg atttagcata ccgtgcattg    600

attaaagttg aagatatgaa gaaagttcct ggattggaga aattttacgc caacccaaac    660

atcaacttct ggtggggtcc caccatgcac attgtcatgt atttcttgca cgaaggtgaa    720

atctgtaatg ttgttgcctt gtgccctgac acattaccaa aaggagtttt gaaacaagat    780

gcatcacaag aggaattatt agacttggtt aaaggttggg atcaagacct caccactgtt  840

ttcaaattga ttacatcagt gagtaaatgg cgtttacaag actcacgtga attgaaaacg  900

tgggtcaatt ccaaaactgg caattttata atcttgggtg atgcttccca ttcaaccttg  960

ccttatttgg ccagtggtgc atcgcaagca gttgaggatg gtgctgttct tgctggatta  1020

ttctccaaga tcgaactgcg tgaccaaatc cctcaacttt tacaaatgac ggagaatttg  1080

cgtaaatgga gaagttctca agtggttaga ggatctcatc aatgtcaaga tatttatcat  1140

ttacccgatg gtgaattaca agaaattaga gattcttatt tgtatgataa acaaccggaa  1200

ttgggatgtc ccaatagatt tgctgatcca gttttccaag attttctttg gggatataat  1260

gcttttgatg aagttgaaag agcttggaag gagtttaagg ctggtggtaa tccaacttat  1320

acttatccta acttgtataa accaaagagt agtggtgaga aggatgtgtc aggtggagga  1380

gcagcagcaa cccttgctgc tggtaatacc ccagctgctc cattaagtgc atcaggctaa  1440

gggcatgtgc gggatggata tcttatgtag tttaaattgt atttgaagtt atttacatct  1500

ttttgcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                                       1526

<210>15

<211>1440

<212>DNA

<213>近平滑假丝酵母

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>R＝A或G

<400>15

atggcggtgc aggcgccgtg gaaracgtac ggtttccaaa aggctccaat acaacttaca   60

tttgtcgttg taggtgccgg tctcggggga gtcgccgcta gtatttgcct cagattggca   120

ggccacagag tcattttatt agaagcagct actgaattgg gtgaagttgg agctggtatt   180

caaattccac caccatcaac caagatttta aaagcaattg gcgtattgga tgcagttgat   240

aaagtctcga ttcatccaca tgatatcttg gtcaagaaat ataaaggtga acttttatct   300

acgcaaaact tggtgcctta tgttctggag aaatacgatg gaatgtattt acatattcac   360

agggctgatt atcataaagt attggttgat agagccgaag aattgggggt tgaaatccat   420

acaaattcaa gagttgttga tattgatttt gaaaaagcaa ctgtcactac tgcaactgga   480

aaacaataca gtggtgatgt cattgtaggg tatgatggag tcagatcaca aaccagagct   540

ttattaactg gtgactcttc tggagcttac gatactggtg atttagcata ccgtgcattg   600

attaaagttg aagatatgaa gaaagttcct ggattggaga aattttacgc caacccaaac   660

atcaacttct ggtggggtcc caccatgcac attgtcatgt atttcttgca cgaaggtgaa   720

atctgtaatg ttgttgcctt gtgccctgac acattaccaa aaggagtttt gaaacaagat   780

gcatcacaag aggaattatt agacttggtt aaaggttggg atcaagacct caccactgtt   840

ttcaaattga ttacatcagt gagtaaatgg cgtttacaag actcacgtga attgaaa cg   900

tgggtcaatt ccaaaactgg caattttata atcttgggtg atgcttccca ttcaaccttg   960

ccttatttgg ccagtggtgc atcgcaagca gttgaggatg gtgctgttct tgctggatta   1020

ttctccaaga tcgaactgcg tgaccaaatc cctcaacttt tacaaatgac ggagaatttg   1080

cgtaaatgga gaagttctca agtggttaga ggatctcatc aatgtcaaga tatttatcat   1140

ttacccgatg gtgaattaca agaaattaga gattcttatt tgtatgataa acaaccggaa   1200

ttgggatgtc ccaatagatt tgctgatcca gttttccaag attttctttg gggatataat   1260

gcttttgatg aagttgaaag agcttggaag gagtttaagg ctggtggtaa tccaacttat   1320

acttatccta acttgtataa accaaagagt agtggtgaga aggatgtgtc aggtggagga   1380

gcagcagcaa cccttgctgc tggtaatacc ccagctgctc cattaagtgc atcaggctaa   1440

<210>16

<211>479

<212>PRT

<213>近平滑假丝酵母

<400>16

Met Ala Val Gln Ala Pro Trp Lys Thr Tyr Gly Phe Gln Lys Ala Pro

1               5                   10                  15

Ile Gln Leu Thr Phe Val Val Val Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Ala

            20                  25                  30

Ala Ser Ile Cys Leu Arg Leu Ala Gly His Arg Val Ile Leu Leu Glu

        35                  40                  45

Ala Ala Thr Glu Leu Gly Glu Val Gly Ala Gly Ile Gln Ile Pro Pro

    50                  55                  60

Pro Ser Thr Lys Ile Leu Lys Ala Ile Gly Val Leu Asp Ala Val Asp

65                  70                  75                  80

Lys Val Ser Ile His Pro His Asp Ile Leu Val Lys Lys Tyr Lys Gly

                85                  90                  95

Glu Leu Leu Ser Thr Gln Asn Leu Val Pro Tyr Val Leu Glu Lys Tyr

            100                 105                 110

Asp Gly Met Tyr Leu His Ile His Arg Ala Asp Tyr His Lys Val Leu

        115                 120                 125

Val Asp Arg Ala Glu Glu Leu Gly Val Glu Ile His Thr Asn Ser Arg

    130                 135                 140

Val Val Asp Ile Asp Phe Glu Lys Ala Thr Val Thr Thr Ala Thr Gly

145                 150                 155                 160

Lys Gln Tyr Ser Gly Asp Val Ile Val Gly Tyr Asp Gly Val Arg Ser

                165                 170                 175

Gln Thr Arg Ala Leu Leu Thr Gly Asp Ser Ser Gly Ala Tyr Asp Thr

            180                 185                 190

Gly Asp Leu Ala Tyr Arg Ala Leu Ile Lys Val Glu Asp Met Lys Lys

        195                 200                 205

Val Pro Gly Leu Glu Lys Phe Tyr Ala Asn Pro Asn Ile Asn Phe Trp

    210                 215                 220

Trp Gly Pro Thr Met His Ile Val Met Tyr Phe Leu His Glu Gly Glu

225                 230                 235                 240

Ile Cys Asn Val Val Ala Leu Cys Pro Asp Thr Leu Pro Lys Gly Val

                245                 250                 255

Leu Lys Gln Asp Ala Ser Gln Glu Glu Leu Leu Asp Leu Val Lys Gly

            260                 265                 270

Trp Asp Gln Asp Leu Thr Thr Val Phe Lys Leu Ile Thr Ser Val Ser

        275                 280                 285

Lys Trp Arg Leu Gln Asp Ser Arg Glu Leu Lys Thr Trp Val Asn Ser

    290                 295                 300

Lys Thr Gly Asn Phe Ile Ile Leu Gly Asp Ala Ser His Ser Thr Leu

305                 310                 315                 320

Pro Tyr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Gln Ala Val Glu Asp Gly Ala Val

                325                 330                 335

Leu Ala Gly Leu Phe Ser Lys Ile Glu Leu Arg Asp Gln Ile Pro Gln

            340                 345                 350

Leu Leu Gln Met Thr Glu Asn Leu Arg Lys Trp Arg Ser Ser Gln Val

        355                 360                 365

Val Arg Gly Ser His Gln Cys Gln Asp Ile Tyr His Leu Pro Asp Gly

    370                 375                 380

Glu Leu Gln Glu Ile Arg Asp Ser Tyr Leu Tyr Asp Lys Gln Pro Glu

385                 390                 395                 400

Leu Gly Cys Pro Asn Arg Phe Ala Asp Pro Val Phe Gln Asp Phe Leu

                405                 410                 415

Trp Gly Tyr Asn Ala Phe Asp Glu Val Glu Arg Ala Trp Lys Glu Phe

            420                 425                 430

Lys Ala Gly Gly Asn Pro Thr Tyr Thr Tyr Pro Asn Leu Tyr Lys Pro

        435                 440                 445

Lys Ser Ser Gly Glu Lys Asp Val Ser Gly Gly Gly Ala Ala Ala Thr

    450                 455                 460

Leu Ala Ala Gly Asn Thr Pro Ala Ala Pro Leu Ser Ala Ser Gly

465                 470                 475

<210>17

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物6

<400>17

ggatttcaac ccccaattct tcggctctat caacc                           35

<210>18

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物7

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(25)

<223>n＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(30)

<223>n＝肌苷

<220>

<221>misc_feature

<222>(34)..(35)

<223>n＝肌苷

<400>18

ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng                          36

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物8

<400>19

cttggttgat ggtggtggaa tttgaatacc                                 30

<210>20

<211>264

<212>DNA

<213>近平滑假丝酵母

<400>20

aaccagaatc ttctgtactt tcacgaatca aacaatatac aacaagtaca caccagagaa    60

atggcagttc aagcaccatc aaaaacttat ggtttccaaa aggctccaat acaacttaca    120

tttgtcgttg taggtgccgg tctcggggga gtcgccgcta gtatttgcct cagattggca    180

ggccacagag tcattttatt agaagcagct actgaattgg gtgaagttgg agctggtatt    240

caaattccac caccatcaac caag                                           264

<210>21

<211>1586

<212>DNA

<213>近平滑假丝酵母

<400>21

aaccagaatc ttctgtactt tcacgaatca aacaatatac aacaagtaca caccagagaa    60

atggcagttc aagcaccatc aaaaacttat ggtttccaaa aggctccaat acaacttaca    120

tttgtcgttg taggtgccgg tctcggggga gtcgccgcta gtatttgcct cagattggca    180

ggccacagag tcattttatt agaagcagct actgaattgg gtgaagttgg agctggtatt    240

caaattccac caccatcaac caagatttta aaagcaattg gcgtattgga tgcagttgat    300

aaagtctcga ttcatccaca tgatatcttg gtcaagaaat ataaaggtga acttttatct    360

acgcaaaact tggtgcctta tgttctggag aaatacgatg gaatgtattt acatattcac    420

agggctgatt atcataaagt attggttgat agagccgaag aattgggggt tgaaatccat    480

acaaattcaa gagttgttga tattgatttt gaaaaagcaa ctgtcactac tgcaactgga    540

aaacaataca gtggtgatgt cattgtaggg tatgatggag tcagatcaca aaccagagct    600

ttattaactg gtgactcttc tggagcttac gatactggtg atttagcata ccgtgcattg    660

attaaagttg aagatatgaa gaaagttcct ggattggaga aattttacgc caacccaaac    720

atcaacttct ggtggggtcc caccatgcac attgtcatgt atttcttgca cgaaggtgaa    780

atctgtaatg ttgttgcctt gtgccctgac acattaccaa aaggagtttt gaaacaagat    840

gcatcacaag aggaattatt agacttggtt aaaggttggg atcaagacct caccactgtt    900

ttcaaattga ttacatcagt gagtaaatgg cgtttacaag actcacgtga attgaaaacg    960

tgggtcaatt ccaaaactgg caattttata atcttgggtg atgcttccca ttcaaccttg    1020

ccttatttgg ccagtggtgc atcgcaagca gttgaggatg gtgctgttct tgctggatta    1080

ttctccaaga tcgaactgcg tgaccaaatc cctcaacttt tacaaatgac ggagaatttg    1140

cgtaaatgga gaagttctca agtggttaga ggatctcatc aatgtcaaga tatttatcat    1200

ttacccgatg gtgaattaca agaaattaga gattcttatt tgtatgataa acaaccggaa    1260

ttgggatgtc ccaatagatt tgctgatcca gttttccaag attttctttg gggatataat    1320

gcttttgatg aagttgaaag agcttggaag gagtttaagg ctggtggtaa tccaacttat    1380

acttatccta acttgtataa accaaagagt agtggtgaga aggatgtgtc aggtggagga  1440

gcagcagcaa cccttgctgc tggtaatacc ccagctgctc cattaagtgc atcaggctaa  1500

gggcatgtgc gggatggata tcttatgtag tttaaattgt atttgaagtt atttacatct  1560

ttttgcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                                       1586

<210>22

<211>1440

<212>DNA

<213>近平滑假丝酵母

<400>22

atggcagttc aagcaccatc aaaaacttat ggtttccaaa aggctccaat acaacttaca    60

tttgtcgttg taggtgccgg tctcggggga gtcgccgcta gtatttgcct cagattggca    120

ggccacagag tcattttatt agaagcagct actgaattgg gtgaagttgg agctggtatt    180

caaattccac caccatcaac caagatttta aaagcaattg gcgtattgga tgcagttgat    240

aaagtctcga ttcatccaca tgatatcttg gtcaagaaat ataaaggtga acttttatct    300

acgcaaaact tggtgcctta tgttctggag aaatacgatg gaatgtattt acatattcac    360

agggctgatt atcataaagt attggttgat agagccgaag aattgggggt tgaaatccat    420

acaaattcaa gagttgttga tattgatttt gaaaaagcaa ctgtcactac tgcaactgga    480

aaacaataca gtggtgatgt cattgtaggg tatgatggag tcagatcaca aaccagagct    540

ttattaactg gtgactcttc tggagcttac gatactggtg atttagcata ccgtgcattg    600

attaaagttg aagatatgaa gaaagttcct ggattggaga aattttacgc caacccaaac    660

atcaacttct ggtggggtcc caccatgcac attgtcatgt atttcttgca cgaaggtgaa    720

atctgtaatg ttgttgcctt gtgccctgac acattaccaa aaggagtttt gaaacaagat    780

gcatcacaag aggaattatt agacttggtt aaaggttggg atcaagacct caccactgtt    840

ttcaaattga ttacatcagt gagtaaatgg cgtttacaag actcacgtga attgaaaacg    900

tgggtcaatt ccaaaactgg caattttata atcttgggtg atgcttccca ttcaaccttg    960

ccttatttgg ccagtggtgc atcgcaagca gttgaggatg gtgctgttct tgctggatta  1020

ttctccaaga tcgaactgcg tgaccaaatc cctcaacttt tacaaatgac ggagaatttg  1080

cgtaaatgga gaagttctca agtggttaga ggatctcatc aatgtcaaga tatttatcat  1140

ttacccgatg gtgaattaca agaaattaga gattcttatt tgtatgataa acaaccggaa  1200

ttgggatgtc ccaatagatt tgctgatcca gttttccaag attttctttg gggatataat  1260

gcttttgatg aagttgaaag agcttggaag gagtttaagg ctggtggtaa tccaacttat  1320

acttatccta acttgtataa accaaagagt agtggtgaga aggatgtgtc aggtggagga  1380

gcagcagcaa cccttgctgc tggtaatacc ccagctgctc cattaagtgc atcaggctaa  1440

<210>23

<211>479

<212>PRT

<213>近平滑假丝酵母

<400>23

Met Ala Val Gln Ala Pro Ser Lys Thr Tyr Gly Phe Gln Lys Ala Pro

1               5                   10                  15

Ile Gln Leu Thr Phe Val Val Val Gly Ala Gly Leu Gly Gly Val Ala

            20                  25                  30

Ala Ser Ile Cys Leu Arg Leu Ala Gly His Arg Val Ile Leu Leu Glu

        35                  40                  45

Ala Ala Thr Glu Leu Gly Glu Val Gly Ala Gly Ile Gln Ile Pro Pro

    50                  55                  60

Pro Ser Thr Lys Ile Leu Lys Ala Ile Gly Val Leu Asp Ala Val Asp

65                  70                  75                  80

Lys Val Ser Ile His Pro His Asp Ile Leu Val Lys Lys Tyr Lys Gly

                85                  90                  95

Glu Leu Leu Ser Thr Gln Asn Leu Val Pro Tyr Val Leu Glu Lys Tyr

            100                 105                 110

Asp Gly Met Tyr Leu His Ile His Arg Ala Asp Tyr His Lys Val Leu

        115                 120                 125

Val Asp Arg Ala Glu Glu Leu Gly Val Glu Ile His Thr Asn Ser Arg

    130                 135                 140

Val Val Asp Ile Asp Phe Glu Lys Ala Thr Val Thr Thr Ala Thr Gly

145                 150                 155                 160

Lys Gln Tyr Ser Gly Asp Val Ile Val Gly Tyr Asp Gly Val Arg Ser

                165                 170                 175

Gln Thr Arg Ala Leu Leu Thr Gly Asp Ser Ser Gly Ala Tyr Asp Thr

            180                 185                 190

Gly Asp Leu Ala Tyr Arg Ala Leu Ile Lys Val Glu Asp Met Lys Lys

        195                 200                 205

Val Pro Gly Leu Glu Lys Phe Tyr Ala Asn Pro Asn Ile Asn Phe Trp

    210                 215                 220

Trp Gly Pro Thr Met His Ile Val Met Tyr Phe Leu His Glu Gly Glu

225                 230                 235                 240

Ile Cys Asn Val Val Ala Leu Cys Pro Asp Thr Leu Pro Lys Gly Val

                245                 250                 255

Leu Lys Gln Asp Ala Ser Gln Glu Glu Leu Leu Asp Leu Val Lys Gly

            260                 265                 270

Trp Asp Gln Asp Leu Thr Thr Val Phe Lys Leu Ile Thr Ser Val Ser

        275                 280                 285

Lys Trp Arg Leu Gln Asp Ser Arg Glu Leu Lys Thr Trp Val Asn Ser

    290                 295                 300

Lys Thr Gly Asn Phe Ile Ile Leu Gly Asp Ala Ser His Ser Thr Leu

305                 310                 315                 320

Pro Tyr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Gln Ala Val Glu Asp Gly Ala Val

                325                 330                 335

Leu Ala Gly Leu Phe Ser Lys Ile Glu Leu Arg Asp Gln Ile Pro Gln

            340                 345                 350

Leu Leu Gln Met Thr Glu Asn Leu Arg Lys Trp Arg Ser Ser Gln Val

        355                 360                 365

Val Arg Gly Ser His Gln Cys Gln Asp Ile Tyr His Leu Pro Asp Gly

    370                 375                 380

Glu Leu Gln Glu Ile Arg Asp Ser Tyr Leu Tyr Asp Lys Gln Pro Glu

385                 390                 395                 400

Leu Gly Cys Pro Asn Arg Phe Ala Asp Pro Val Phe Gln Asp Phe Leu

                405                 410                 415

Trp Gly Tyr Asn Ala Phe Asp Glu Val Glu Arg Ala Trp Lys Glu Phe

            420                 425                 430

Lys Ala Gly Gly Asn Pro Thr Tyr Thr Tyr Pro Asn Leu Tyr Lys Pro

        435                 440                 445

Lys Ser Ser Gly Glu Lys Asp Val Ser Gly Gly Gly Ala Ala Ala Thr

    450                 455                 460

Leu Ala Ala Gly Asn Thr Pro Ala Ala Pro Leu Ser Ala Ser Gly

465                 470                 475

<210>24

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物9

<400>24

cccgcacata agcttagcct gatgcactta atgg                            34

<210>25

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物10

<400>25

gaattcgccc atatggcggt gcaggcgccg tcgaagacg                       39

<210>26

<211>1440

<212>DNA

<213>近平滑假丝酵母

<400>26

atggcggtgc aggcgccgtc gaagacgtac ggtttccaaa aggctccaat acaacttaca    60

tttgtcgttg taggtgccgg tctcggggga gtcgccgcta gtatttgcct cagattggca    120

ggccacagag tcattttatt agaagcagct actgaattgg gtgaagttgg agctggtatt    180

caaattccac caccatcaac caagatttta aaagcaattg gcgtattgga tgcagttgat    240

aaagtctcga ttcatccaca tgatatcttg gtcaagaaat ataaaggtga acttttatct    300

acgcaaaact tggtgcctta tgttctggag aaatacgatg gaatgtattt acatattcac    360

agggctgatt atcataaagt attggttgat agagccgaag aattgggggt tgaaatccat    420

acaaattcaa gagttgttga tattgatttt gaaaaagcaa ctgtcactac tgcaactgga    480

aaacaataca gtggtgatgt cattgtaggg tatgatggag tcagatcaca aaccagagct    540

ttattaactg gtgactcttc tggagcttac gatactggtg atttagcata ccgtgcattg    600

attaaagttg aagatatgaa gaaagttcct ggattggaga aattttacgc caacccaaac    660

atcaacttct ggtggggtcc caccatgcac attgtcatgt atttcttgca cgaaggtgaa    720

atctgtaatg ttgttgcctt gtgccctgac acattaccaa aaggagtttt gaaacaagat    780

gcatcacaag aggaattatt agacttggtt aaaggttggg atcaagacct caccactgtt    840

ttcaaattga ttacatcagt gagtaaatgg cgtttacaag actcacgtga attgaaaacg    900

tgggtcaatt ccaaaactgg caattttata atcttgggtg atgcttccca ttcaaccttg    960

ccttatttgg ccagtggtgc atcgcaagca gttgaggatg gtgctgttct tgctggatta    1020

ttctccaaga tcgaactgcg tgaccaaatc cctcaacttt tacaaatgac ggagaatttg    1080

cgtaaatgga gaagttctca agtggttaga ggatctcatc aatgtcaaga tatttatcat    1140

ttacccgatg gtgaattaca agaaattaga gattcttatt tgtatgataa acaaccggaa    1200

ttgggatgtc ccaatagatt tgctgatcca gttttccaag attttctttg gggatataat    1260

gcttttgatg aagttgaaag agcttggaag gagtttaagg ctggtggtaa tccaacttat    1320

acttatccta acttgtataa accaaagagt agtggtgaga aggatgtgtc aggtggagga    1380

gcagcagcaa cccttgctgc tggtaatacc ccagctgctc cattaagtgc atcaggctaa    1440

<210>27

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物11

<400>27

ctactcaatt catatgtcac accccgcgtt aa                              32

<210>28

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物12

<400>28

catcttacta gatctttagt acaacggtga cgcc                            34

<210>29

<211>498

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>29

atgtcacacc ccgcgttaac gcaactgcgt gcgctgcgct attgtaaaga gatccctgcc   60

ctggatccgc aactgctcga ctggctgttg ctggaggatt ccatgacaaa acgttttgaa   120

cagcagggaa aaacggtaag cgtgacgatg atccgcgaag ggtttgtcga gcagaatgaa   180

atccccgaag aactgccgct gctgccgaaa gagtctcgtt actggttacg tgaaattttg   240

ttatgtgccg atggtgaacc gtggcttgcc ggtcgtaccg tcgttcctgt gtcaacgtta   300

agcgggccgg agctggcgtt acaaaaattg ggtaaaacgc cgttaggacg ctatctgttc   360

acatcatcga cattaacccg ggactttatt gagataggcc gtgatgccgg gctgtggggg   420

cgacgttccc gcctgcgatt aagcggtaaa ccgctgttgc taacagaact gtttttaccg   480

gcgtcaccgt tgtactaa                                                 498

<210>30

<211>165

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>30

Met Ser His Pro Ala Leu Thr Gln Leu Arg Ala Leu Arg Tyr Cys Lys

1               5                   10                  15

Glu Ile Pro Ala Leu Asp Pro Gln Leu Leu Asp Trp Leu Leu Leu Glu

            20                  25                  30

Asp Ser Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln Gln Gly Lys Thr Val Ser Val

        35                  40                  45

Thr Met Ile Arg Glu Gly Phe Val Glu Gln Asn Glu Ile Pro Glu Glu

    50                  55                  60

Leu Pro Leu Leu Pro Lys Glu Ser Arg Tyr Trp Leu Arg Glu Ile Leu

65                  70                  75                  80

Leu Cys Ala Asp Gly Glu Pro Trp Leu Ala Gly Arg Thr Val Val Pro

                85                  90                  95

Val Ser Thr Leu Ser Gly Pro Glu Leu Ala Leu Gln Lys Leu Gly Lys

            100                 105                 110

Thr Pro Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Thr Ser Ser Thr Leu Thr Arg Asp

        115                 120                 125

Phe Ile Glu Ile Gly Arg Asp Ala Gly Leu Trp Gly Arg Arg Ser Arg

    130                 135                 140

Leu Arg Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu Pro

145                 150                 155                 160

Ala Ser Pro Leu Tyr

                165

<210>31

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物13

<400>31

ctactcactt agatctccat ggcttcctct gtcatttct                       39

<210>32

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物14

<400>32

catcttactc atatgccaca cctgcatgca gc                              32

<210>33

<211>684

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>33

atggcttcct ctgtcatttc ttcagcagct gttgccacac gcagcaatgt tacacaagct    60

agcatggttg cacctttcac tggtctcaaa tcttcagcca ctttccctgt tacaaagaag    120

caaaaccttg acatcacttc cattgctagc aatggtggaa gagttagctg catgcaggtg    180

tggcatatgt cacaccccgc gttaacgcaa ctgcgtgcgc tgcgctattg taaagagatc    240

cctgccctgg atccgcaact gctcgactgg ctgttgctgg aggattccat gacaaaacgt    300

tttgaacagc agggaaaaac ggtaagcgtg acgatgatcc gcgaagggtt tgtcgagcag    360

aatgaaatcc ccgaagaact gccgctgctg ccgaaagagt ctcgttactg gttacgtgaa    420

attttgttat gtgccgatgg tgaaccgtgg cttgccggtc gtaccgtcgt tcctgtgtca    480

acgttaagcg ggccggagct ggcgttacaa aaattgggta aaacgccgtt aggacgctat    540

ctgttcacat catcgacatt aacccgggac tttattgaga taggccgtga tgccgggctg    600

tgggggcgac gttcccgcct gcgattaagc ggtaaaccgc tgttgctaac agaactgttt    660

ttaccggcgt caccgttgta ctaa                                           684

<210>34

<211>227

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>34

Met Ala Ser Ser Val Ile Ser Ser Ala Ala Val Ala Thr Arg Ser Asn

1               5                   10                  15

Val Thr Gln Ala Ser Met Val Ala Pro Phe Thr Gly Leu Lys Ser Ser

            20                  25                  30

Ala Thr Phe Pro Val Thr Lys Lys Gln Asn Leu Asp Ile Thr Ser Ile

        35                  40                  45

Ala Ser Asn Gly Gly Arg Val Ser Cys Met Gln Val Trp His Met Ser

    50                  55                  60

His Pro Ala Leu Thr Gln Leu Arg Ala Leu Arg Tyr Cys Lys Glu Ile

65                  70                  75                  80

Pro Ala Leu Asp Pro Gln Leu Leu Asp Trp Leu Leu Leu Glu Asp Ser

                85                  90                  95

Met Thr Lys Arg Phe Glu Gln Gln Gly Lys Thr Val Ser Val Thr Met

            100                 105                 110

Ile Arg Glu Gly Phe Val Glu Gln Asn Glu Ile Pro Glu Glu Leu Pro

        115                 120                 125

Leu Leu Pro Lys Glu Ser Arg Tyr Trp Leu Arg Glu Ile Leu Leu Cys

    130                 135                 140

Ala Asp Gly Glu Pro Trp Leu Ala Gly Arg Thr Val Val Pro Val Ser

145                 150                 155                 160

Thr Leu Ser Gly Pro Glu Leu Ala Leu Gln Lys Leu Gly Lys Thr Pro

                165                 170                 175

Leu Gly Arg Tyr Leu Phe Thr Ser Ser Thr Leu Thr Arg Asp Phe Ile

            180                 185                 190

Glu Ile Gly Arg Asp Ala Gly Leu Trp Gly Arg Arg Ser Arg Leu Arg

        195                 200                 205

Leu Ser Gly Lys Pro Leu Leu Leu Thr Glu Leu Phe Leu Pro Ala Ser

    210                 215                 220

Pro Leu Tyr

225

<210>35

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物15

<400>35

cccgggggta cctaaagaag gagtgcgtcg aag                             33

<210>36

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物16

<400>36

gatatcaagc tttctagagt cgacatcgat ctagtaacat agatga               46

<210>37

<211>831

<212>DNA

<213>恶臭假单孢菌

<400>37

atgagcacat acgaaggtcg ctgggctacc gtgaaggtcg aactggagtc gggcattgcc    60

tgggtcaccc tcaaccggcc ggaaaagcgc aatgcaatga gccccacgct gaaccgggaa    120

atggtcgacg tgctggaaac cctggaacag gacggcgaag ccggggtgct cgtgctgacc    180

ggcgcgggtg aatcgtggac ggcaggcatg gacctgaagg aatacttccg tgaggtggac  240

gccggcccgg aaatcctcca ggaaaaaatc cgccgcgatg cctcgcaatg gcaatggagg  300

ctgctgcgca tgtacgccaa gccgactatc gccatggtca acggctggtg ctttggcggc  360

ggcttcagcc cgctggtggc ctgcgacctg gccatctgtg ccgacgaggc cacctttggc  420

ctgtcggaaa tcaactgggg catcccaccg ggcaacctgg tcagcaaagc catggccgat  480

accgttggcc accgccagtc gctgtactac atcatgaccg gcaagacttt cggcgggcct  540

aaagctgccg agatggggct ggttaacgag agcgtgccgc tggcgcaatt gcgcgacgtc  600

acccgcgaac tggcgctcaa cctgctggaa aagaacccgg tggtgctgcg tgcggccaag  660

aacggtttca agcgctgccg cgaactgacc tgggagcaga acgaagacta cctgtacgcc  720

aagctcgacc agtcccgtct gctggacacc gaaggtgggc gcgagcaggg catgaagcag  780

ttcctcgacg acaagagcat caagccaggc ctgcaagcca tcaagcgctg a           831

<210>38

<211>276

<212>PRT

<213>恶臭假单孢菌

<400>38

Met Ser Thr Tyr Glu Gly Arg Trp Ala Thr Val Lys Val Glu Leu Glu

1               5                   10                  15

Ser Gly Ile Ala Trp Val Thr Leu Asn Arg Pro Glu Lys Arg Asn Ala

            20                  25                  30

Met Ser Pro Thr Leu Asn Arg Glu Met Val Asp Val Leu Glu Thr Leu

        35                  40                  45

Glu Gln Asp Gly Glu Ala Gly Val Leu Val Leu Thr Gly Ala Gly Glu

    50                  55                  60

Ser Trp Thr Ala Gly Met Asp Leu Lys Glu Tyr Phe Arg Glu Val Asp

65                  70                  75                  80

Ala Gly Pro Glu Ile Leu Gln Glu Lys Ile Arg Arg Asp Ala Ser Gln

                85                  90                  95

Trp Gln Trp Arg Leu Leu Arg Met Tyr Ala Lys Pro Thr Ile Ala Met

            100                 105                 110

Val Asn Gly Trp Cys Phe Gly Gly Gly Phe Ser Pro Leu Val Ala Cys

        115                 120                 125

Asp Leu Ala Ile Cys Ala Asp Glu Ala Thr Phe Gly Leu Ser Glu Ile

    130                 135                 140

Asn Trp Gly Ile Pro Pro Gly Asn Leu Val Ser Lys Ala Met Ala Asp

145                 150                 155                 160

Thr Val Gly His Arg Gln Ser Leu Tyr Tyr Ile Met Thr Gly Lys Thr

                165                 170                 175

Phe Gly Gly Pro Lys Ala Ala Glu Met Gly Leu Val Asn Glu Ser Val

            180                 185                 190

Pro Leu Ala Gln Leu Arg Asp Val Thr Arg Glu Leu Ala Leu Asn Leu

        195                 200                 205

Leu Glu Lys Asn Pro Val Val Leu Arg Ala Ala Lys Asn Gly Phe Lys

    210                     215                 220

Arg Cys Arg Glu Leu Thr Trp Glu Gln Asn Glu Asp Tyr Leu Tyr Ala

225                 230                 235                 240

Lys Leu Asp Gln Ser Arg Leu Leu Asp Thr Glu Gly Gly Arg Glu Gln

                245                 250                 255

Gly Met Lys Gln Phe Leu Asp Asp Lys Ser Ile Lys Pro Gly Leu Gln

            260                 265                 270

Ala Ile Lys Arg

        275

<210>39

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物17

<400>39

gaatatttgc atccatggag gaatcc                                     26

<210>40

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物18

<400>40

gaacatcgtc gacttagtgg ttgc                                       24

<210>41

<211>1443

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>41

atggaggaat ccaaaacacc tcacgttgcg atcataccaa gtccgggaat gggtcatctc  60

ataccactcg tcgagtttgc taaacgactc gtccatcttc acggcctcac cgttaccttc  120

gtcatcgccg gcgaaggtcc accatcaaaa gctcagagaa ccgtcctcga ctcgctccct  180

tcttcaatct cctccgtctt tctccctcct gttgatctca ccgatctctc ttcgtccact  240

cgcatcgaat ctcggatctc cctcaccgtg actcgttcaa acccggagct ccggaaagtc  300

ttcgactcgt tcgtggaggg aggtcgtttg ccaacggcgc tcgtcgtcga tctcttcggt  360

acggacgctt tcgacgtggc cgtagaattt cacgtgccac cgtatatttt ctacccaaca   420

acggccaacg tcttgtcgtt ttttctccat ttgcctaaac tagacgaaac ggtgtcgtgt   480

gagttcaggg aattaaccga accgcttatg ctccctggat gtgtaccggt tgccgggaaa   540

gatttccttg acccggccca agaccggaaa gacgatgcat acaaatggct tctccataac   600

accaagaggt acaaagaagc cgaaggtatt cttgtgaata ccttctttga gctagagcca   660

aatgctataa aggccttgca agaaccgggt cttgataaac caccggttta tccggttgga   720

ccgttggtta acattggtaa gcaagaggct aagcaatccg aagagtctga atgtttaaag   780

tggttggata accagccgct cggttcggtt ttatatgtgt cctttggtag tggcggtacc   840

ctcacatgta agcagctcaa tgagcttgct cttggtcttg cagatagtga gcaacggttt   900

ctttgggtca tacgaagtcc tagtggggtc gctaattcgt cgtattttga ttcacatagc   960

caaacagatc cattgacatt tttaccaccg ggatttttag agcggactaa aaaaagaggt   1020

tttgtgatcc ctttttgggc tccacaagcc caagtcttgg cgcatccatc cacgggagga   1080

tttttaactc attgtggatg gaattcgact ctagagagtg tagtaagtgg tattccactt   1140

atagcatggc cattatacgc agaacagaag atgaatgcgg ttttgttgag tgaagatatt   1200

cgtgcggcac ttaggccgcg tgccggggac gatgggttag ttagaagaga agaggtggct   1260

agagtggtaa aaggattgat ggaaggtgaa gaaggcaaag gagtgaggaa caagatgaag   1320

gaattgaagg aagcagcttg tagggtattg aaggatgatg ggacttcgac aaaagcactt   1380

agtcttgtgg ccttaaagtg gaaagcccac aaaaaagagt tagagcaaaa tggcaaccac   1440

taa                                                                 1443

<210>42

<211>480

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>42

Met Glu Glu Ser Lys Thr Pro His Val Ala Ile Ile Pro Ser Pro Gly

1               5                   10                  15

Met Gly His Leu Ile Pro Leu Val Glu Phe Ala Lys Arg Leu Val His

            20                  25                  30

Leu His Gly Leu Thr Val Thr Phe Val Ile Ala Gly Glu Gly Pro Pro

        35                  40                  45

Ser Lys Ala Gln Arg Thr Val Leu Asp Ser Leu Pro Ser Ser Ile Ser

    50                  55                  60

Ser Val Phe Leu Pro Pro Val Asp Leu Thr Asp Leu Ser Ser Ser Thr

65              70                      75                  80

Arg Ile Glu Ser Arg Ile Ser Leu Thr Val Thr Arg Ser Asn Pro Glu

                85                  90                  95

Leu Arg Lys Val  Phe Asp Ser Phe Val Glu Gly Gly Arg Leu Pro Thr

            100                  105                 110

Ala Leu Val Val Asp Leu Phe Gly Thr Asp Ala Phe Asp Val Ala Val

        115                 120                 125

Glu Phe His Val Pro Pro Tyr Ile Phe Tyr Pro Thr Thr Ala Asn Val

    130                 135                 140

Leu Ser Phe Phe Leu His Leu Pro Lys Leu Asp Glu Thr Val Ser Cys

145                 150                 155                 160

Glu Phe Arg Glu Leu Thr Glu Pro Leu Met Leu Pro Gly Cys Val Pro

                165                 170                 175

Val Ala Gly Lys Asp Phe Leu Asp Pro Ala Gln Asp Arg Lys Asp Asp

            180                 185                 190

Ala Tyr Lys Trp Leu Leu His Asn Thr Lys Arg Tyr Lys Glu Ala Glu

        195                 200                 205

Gly Ile Leu Val Asn Thr Phe Phe Glu Leu Glu Pro Asn Ala Ile Lys

    210                 215                 220

Ala Leu Gln Glu Pro Gly Leu Asp Lys Pro Pro Val Tyr Pro Val Gly

225                 230                 235                 240

Pro Leu Val Asn Ile Gly Lys Gln Glu Ala Lys Gln Ser Glu Glu Ser

                245                 250                 255

Glu Cys Leu Lys Trp Leu Asp Asn Gln Pro Leu Gly Ser Val Leu Tyr

            260                 265                 270

Val Ser Phe Gly Ser Gly Gly Thr Leu Thr Cys Lys Gln Leu Asn Glu

        275                 280                 285

Leu Ala Leu Gly Leu Ala Asp Ser Glu Gln Arg Phe Leu Trp Val Ile

    290                 295                 300

Arg Ser Pro Ser Gly Val Ala Asn Ser Ser Tyr Phe Asp Ser His Ser

305                 310                 315                 320

Gln Thr Asp Pro Leu Thr Phe Leu Pro Pro Gly Phe Leu Glu Arg Thr

                325                 330                 335

Lys Lys Arg Gly Phe Val Ile Pro Phe Trp Ala Pro Gln Ala Gln Val

            340                 345                 350

Leu Ala His Pro Ser Thr Gly Gly Phe Leu Thr His Cys Gly Trp Asn

        355                 360                 365

Ser Thr Leu Glu Ser Val Val Ser Gly Ile Pro Leu Ile Ala Trp Pro

    370                 375                 380

Leu Tyr Ala Glu Gln Lys Met Asn Ala Val Leu Leu Ser Glu Asp Ile

385                 390                 395                 400

Arg Ala Ala Leu Arg Pro Arg Ala Gly Asp Asp Gly Leu Val Arg Arg

                405                 410                 415

Glu Glu Val Ala Arg Val Val Lys Gly Leu Met Glu Gly Glu Glu Gly

            420                 425                 430

Lys Gly Val Arg Asn Lys Met Lys Glu Leu Lys Glu Ala Ala Cys Arg

        435                 440                 445

Val Leu Lys Asp Asp Gly Thr Ser Thr Lys Ala Leu Ser Leu Val Ala

    450                 455                 460

Leu Lys Trp Lys Ala His Lys Lys Glu Leu Glu Gln Asn Gly Asn His

465                 470                 475                 480

<210>43

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物19

<400>43

gtcgacaagg agatatacat atggcggtgc aggc                            34

<210>44

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物20

<400>44

gtcgacaagc ttagcctgat gcacttaatg g                               31

<210>45

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物21

<400>45

gtcgacaagg agatatacca tggaggaatc c                               31

<210>46

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物22

<400>46

ctcgagttag tggttgccat tttgctctaa ctc                             33

<210>47

<211>3452

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码CPL(来自大肠杆菌)、pHBA1-羟化酶(来自近平滑假丝酵母)和UGT72B1(来自拟南芥)的核酸片段的核苷酸序列

<400>47

catatgtcac accccgcgtt aacgcaactg cgtgcgctgc gctattgtaa agagatccct    60

gccctggatc cgcaactgct cgactggctg ttgctggagg attccatgac aaaacgtttt    120

gaacagcagg gaaaaacggt aagcgtgacg atgatccgcg aagggtttgt cgagcagaat    180

gaaatccccg aagaactgcc gctgctgccg aaagagtctc gttactggtt acgtgaaatt    240

ttgttatgtg ccgatggtga accgtggctt gccggtcgta ccgtcgttcc tgtgtcaacg    300

ttaagcgggc cggagctggc gttacaaaaa ttgggtaaaa cgccgttagg acgctatctg    360

ttcacatcat cgacattaac ccgggacttt attgagatag gccgtgatgc cgggctgtgg    420

gggcgacgtt cccgcctgcg attaageggt aaaccgctgt tgctaacaga actgttttta    480

ccggcgtcac cgttgtacta aagatccgaa ttcgagctcc gtcgacaagg agatatacat    540

atggcggtgc aggcgccgtc gaagacgtac ggtttccaaa aggctccaat acaacttaca    600

tttgtcgttg taggtgccgg tctcggggga gtcgccgcta gtatttgcct cagattggca    660

ggccacagag tcattttatt agaagcagct actgaattgg gtgaagttgg agctggtatt    720

caaattccac caccatcaac caagatttta aaagcaattg gcgtattgga tgcagttgat    780

aaagtctcga ttcatccaca tgatatcttg gtcaagaaat ataaaggtga acttttatct    840

acgcaaaact tggtgcctta tgttctggag aaatacgatg gaatgtattt acatattcac    900

agggctgatt atcataaagt attggttgat agagccgaag aattgggggt tgaaatccat    960

acaaattcaa gagttgttga tattgatttt gaaaaagcaa ctgtcactac tgcaactgga    1020

aaacaataca gtggtgatgt cattgtaggg tatgatggag tcagatcaca aaccagagct    1080

ttattaactg gtgactcttc tggagcttac gatactggtg atttagcata ccgtgcattg    1140

attaaagttg aagatatgaa gaaagttcct ggattggaga aattttacgc caacccaaac    1200

atcaacttct ggtggggtcc caccatgcac attgtcatgt atttcttgca cgaaggtgaa    1260

atctgtaatg ttgttgcctt gtgccctgac acattaccaa aaggagtttt gaaacaagat    1320

gcatcacaag aggaattatt agacttggtt aaaggttggg atcaagacct caccactgtt    1380

ttcaaattga ttacatcagt gagtaaatgg cgtttacaag actcacgtga attgaaaacg    1440

tgggtcaatt ccaaaactgg caattttata atcttgggtg atgcttccca ttcaaccttg    1500

ccttatttgg ccagtggtgc atcgcaagca gttgaggatg gtgctgttct tgctggatta    1560

ttctccaaga tcgaactgcg tgaccaaatc cctcaacttt tacaaatgac ggagaatttg    1620

cgtaaatgga gaagttctca agtggttaga ggatctcatc aatgtcaaga tatttatcat    1680

ttacccgatg gtgaattaca agaaattaga gattcttatt tgtatgataa acaaccggaa    1740

ttgggatgtc ccaatagatt tgctgatcca gttttccaag attttctttg gggatataat    1800

gcttttgatg aagttgaaag agcttggaag gagtttaagg ctggtggtaa tccaacttat    1860

acttatccta acttgtataa accaaagagt agtggtgaga aggatgtgtc aggtggagga    1920

gcagcagcaa cccttgctgc tggtaatacc ccagctgctc cattaagtgc atcaggctaa    1980

gcttgtcgac aaggagatat accatggagg aatccaaaac acctcacgtt gcgatcatac    2040

caagtccggg aatgggtcat ctcataccac tcgtcgagtt tgctaaacga ctcgtccatc    2100

ttcacggcct caccgttacc ttcgtcatcg ccggcgaagg tccaccatca aaagctcaga    2160

gaaccgtcct cgactcgctc ccttcttcaa tctcctccgt ctttctccct cctgttgatc    2220

tcaccgatct ctcttcgtcc actcgcatcg aatctcggat ctccctcacc gtgactcgtt    2280

caaacccgga gctccggaaa gtcttcgact cgttcgtgga gggaggtcgt ttgccaacgg    2340

cgctcgtcgt cgatctcttc ggtacggacg ctttcgacgt ggccgtagaa tttcacgtgc    2400

caccgtatat tttctaccca acaacggcca acgtcttgtc gttttttctc catttgccta    2460

aactagacga aacggtgtcg tgtgagttca gggaattaac cgaaccgctt atgctccctg    2520

gatgtgtacc ggttgccggg aaagatttcc ttgacccggc ccaagaccgg aaagacgatg    2580

catacaaatg gcttctccat aacaccaaga ggtacaaaga agccgaaggt attcttgtga    2640

ataccttctt tgagctagag ccaaatgcta taaaggcctt gcaagaaccg ggtcttgata    2700

aaccaccggt ttatccggtt ggaccgttgg ttaacattgg taagcaagag gctaagcaat    2760

ccgaagagtc tgaatgttta aagtggttgg ataaccagcc gctcggttcg gttttatatg    2820

tgtcctttgg tagtggcggt accctcacat gtaagcagct caatgagctt gctcttggtc    2880

ttgcagatag tgagcaacgg tttctttggg tcatacgaag tcctagtggg gtcgctaatt    2940

cgtcgtattt tgattcacat agccaaacag atccattgac atttttacca ccgggatttt    3000

tagagcggac taaaaaaaga ggttttgtga tccctttttg ggctccacaa gcccaagtct    3060

tggcgcatcc atccacggga ggatttttaa ctcattgtgg atggaattcg actctagaga    3120

gtgtagtaag tggtattcca cttatagcat ggccattata cgcagaacag aagatgaatg    3180

cggttttgtt gagtgaagat attcgtgcgg cacttaggcc gcgtgccggg gacgatgggt    3240

tagttagaag agaagaggtg gctagagtgg taaaaggatt gatggaaggt gaagaaggca    3300

aaggagtgag gaacaagatg aaggaattga aggaagcagc ttgtagggta ttgaaggatg  3360

atgggacttc gacaaaagca cttagtcttg tggccttaaa gtggaaagcc cacaaaaaag  3420

agttagagca aaatggcaac cactaactcg ag                                3452

<210>48

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物23

<400>48

ggtaccgtga aaggagatat acatatggcg gtgcaggc                        38

<210>49

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物24

<400>49

gagctcaagc ttagcctgat gcacttaatg g                               31

<210>50

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物25

<400>50

ggatccgtga aaggagatat accatggagg aatcc                           35

<210>51

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物26

<400>51

aagcttttag tggttgccat tttgctctaa ctc                             33

<210>52

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物27

<400>52

ctactcattt catatgtcac accccgcgtt aa                              32

<210>53

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物28

<400>53

catcttactg tcgacttagt acaacggtga cgcc                            34

<210>54

<211>1971

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>插入表达载体pET29a的编码CPL(来自大肠杆菌)和pHBA 1-羟化酶(来自近平滑

假丝酵母)的核酸片段的核酸序列

<400>54

catatgtcac accccgcgtt aacgcaactg cgtgcgctgc gctattttaa agagatccct    60

gccctggatc cgcaactgct cgactggctg ttgctggagg attccatgac aaaacgtttt    120

gaacagcagg gaaaaacggt aagcgtgacg atgatccgcg aagggtttgt cgagcagaat    180

gaaatccccg aagaactgcc gctgctgccg aaagagtctc gttactggtt acgtgaaatt    240

ttgttatgtg ccgatggtga accgtggctt gccggtcgta ccgtcgttcc tgtgtcaacg    300

ttaagcgggc cggagctggc gttacaaaaa ttgggtaaaa cgccgttagg acgctatctg    360

ttcacatcat cgacattaac ccgggacttt attgagatag gccgtgatgc cgggctgtgg    420

gggcgacgtt cccgcctgcg attaagcggt aaaccgctgt tgctaacaga actgttttta    480

ccggcgtcac cgttgtacta agtcgacaag gagatataca tatggcggtg caggcgccgt    540

cgaagacgta cggtttccaa aaggctccaa tacaacttac atttgtcgtt gtaggtgccg    600

gtctcggggg agtcgccgct agtatttgcc tcagattggc aggccacaga gtcattttat    660

tagaagcagc tactgaattg ggtgaagttg gagctggtat tcaaattcca ccaccatcaa    720

ccaagatttt aaaagcaatt ggcgtattgg atgcagttga taaagtctcg attcatccac    780

atgatatctt ggtcaagaaa tataaaggtg aacttttatc tacgcaaaac ttggtgcctt    840

atgttctgga gaaatacgat ggaatgtatt tacatattca cagggctgat tatcataaag    900

tattggttga tagagccgaa gaattggggg ttgaaatcca tacaaattca agagttgttg    960

atattgattt tgaaaaagca actgtcacta ctgcaactgg aaaacaatac agtggtgatg    1020

tcattgtagg gtatgatgga gtcagatcac aaaccagagc tttattaact ggtgactctt    1080

ctggagctta cgatactggt gatttagcat accgtgcatt gattaaagtt gaagatatga    1140

agaaagttcc tggattggag aaattttacg ccaacccaaa catcaacttc tggtggggtc    1200

ccaccatgca cattgtcatg tatttcttgc acgaaggtga aatctgtaat gttgttgcct    1260

tgtgccctga cacattacca aaaggagttt tgaaacaaga tgcatcacaa gaggaattat    1320

tagacttggt taaaggttgg gatcaagacc tcaccactgt tttcaaattg attacatcag    1380

tgagtaaatg gcgtttacaa gactcacgtg aattgaaaac gtgggtcaat tccaaaactg    1440

gcaattttat aatcttgggt gatgcttccc attcaacctt gccttatttg gccagtggtg    1500

catcgcaagc agttgaggat ggtgctgttc ttgctggatt attctccaag atcgaactgc    1560

gtgaccaaat ccctcaactt ttacaaatga cggagaattt gcgtaaatgg agaagttctc    1620

aagtggttag aggatctcat caatgtcaag atatttatca tttacccgat ggtgaattac    1680

aagaaattag agattcttat ttgtatgata aacaaccgga attgggatgt cccaatagat    1740

ttgctgatcc agttttccaa gattttcttt ggggatataa tgcttttgat gaagttgaaa    1800

gagcttggaa ggagtttaag gctggtggta atccaactta tacttatcct aacttgtata    1860

aaccaaagag tagtggtgag aaggatgtgt caggtggagg agcagcagca acccttgctg    1920

ctggtaatac cccagctgct ccattaagtg catcaggcta agcttgtcga g             1971

Claims (32)

1.一种在绿色植物中生产氢醌葡糖苷的方法，包括：

a)在合适的条件下生长绿色植物细胞，所述绿色植物具有

i)分支酸的内源来源；

ii)编码与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性对-羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；和

iii)氢醌葡糖基转移酶的内源来源；和

iv)具有以下结构的分支酸丙酮酸裂解酶表达盒：

                P-T-C-D-CPL

其中

P是适合驱动分支酸丙酮酸裂解酶基因表达的启动子；T是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽的核酸分子；C是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽裂解位点的核酸分子；而D是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽供体多肽的N-末端部分的四个连续氨基酸的核酸分子；CPL是编码具有SEQ ID NO：30所示氨基酸序列的分支酸丙酮酸裂解酶的核酸分子；并且P，T，C，D，和CPL是彼此可操作地连接的；和

b)回收在步骤a)中产生的氢醌葡糖苷。

2.一种在绿色植物中生产氢醌葡糖苷的方法，包括：

a)在合适的条件下生长绿色植物细胞，所述绿色植物具有

i)分支酸的内源来源；

ii)编码与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性对-羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；和

iii)编码与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性氢醌葡糖基转移酶的核酸片段；和

iv)具有以下结构的分支酸丙酮酸裂解酶表达盒：

                P-T-C-D-CPL

其中

P是适合驱动分支酸丙酮酸裂解酶基因表达的启动子；T是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽的核酸分子；C是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽裂解位点的核酸分子；而D是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽供体多肽的N-末端部分的四个连续氨基酸的核酸分子；CPL是编码与SEQ ID NO：30所示氨基酸序列具有至少90％同一性的分支酸丙酮酸裂解酶的核酸分子；并且P，T，C，D，和CPL是彼此可操作地连接的；和

b)从步骤a)产生的绿色植物中回收氢醌葡糖苷。

3.一种在绿色植物中生产氢醌葡糖苷的方法，包括：

a)在合适的条件下生长绿色植物，所述绿色植物包括

i)对-香豆酰-CoA的内源来源；

ii)编码活性4-羟基肉桂酰-CoA水合酶/裂解酶的核酸片段；

iii)编码与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性对-羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；和

iv)活性葡糖基转移酶的内源来源；和

b)从步骤a)的绿色植物中回收氢醌葡糖苷。

4.一种在绿色植物中生产氢醌葡糖苷的方法，包括：

a)在合适的条件下生长绿色植物，所述绿色植物包括

i)对-香豆酰-CoA的内源来源；

ii)编码活性4-羟基肉桂酰-CoA水合酶/裂解酶的核酸片段；

iii)编码与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性对-羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；

iv)编码与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性氢醌葡糖基转移酶的核酸片段；和

b)从步骤a)的绿色植物中回收氢醌葡糖苷。

5.一种在绿色植物中生产氢醌葡糖苷的方法，包括：

a)在合适的条件下生长绿色植物，所述绿色植物包括

i)对-香豆酰-CoA的内源来源；

ii)分支酸的内源来源；

iii)编码活性4-羟基肉桂酰-CoA水合酶/裂解酶的核酸片段；

iv)具有以下结构的分支酸丙酮酸裂解酶表达盒：

              P-T-C-D-CPL

其中P是适合驱动分支酸丙酮酸裂解酶基因表达的启动子；T是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽的核酸分子；C是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽裂解位点的核酸分子；而D是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽供体多肽的N-末端部分的四个连续氨基酸的核酸分子；CPL是编码与SEQ ID NO：30所示氨基酸序列具有至少90％同一性的分支酸丙酮酸裂解酶的核酸分子；并且P，T，C，D，和CPL是彼此可操作地连接的；

v)编码与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性对-羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；和

vi)活性氢醌葡糖基转移酶的内源来源；和

b)从步骤a)的绿色植物中回收氢醌葡糖苷。

6.一种在绿色植物中生产氢醌葡糖苷的方法，包括：

a)在合适的条件下生长绿色植物，所述绿色植物包括

i)对-香豆酰-CoA的内源来源；

ii)分支酸的内源来源；

iii)编码活性4-羟基肉桂酰-CoA水合酶/裂解酶的核酸片段；

iv)具有以下结构的分支酸丙酮酸裂解酶表达盒：

               P-T-C-D-CPL

其中

P是适合驱动分支酸丙酮酸裂解酶基因表达的启动子；T是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽的核酸分子；C是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽裂解位点的核酸分子；而D是编码核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶叶绿体转运肽供体多肽的N-末端部分的四个连续氨基酸的核酸分子；CPL是编码与SEQ ID NO：30所示氨基酸序列具有至少90％同一性的分支酸丙酮酸裂解酶的核酸分子；并且P，T，C，D，和CPL是彼此可操作地连接的；

v)编码与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性对-羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；

vi)编码与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性氢醌葡糖基转移酶的核酸片段；和

b)从步骤a)的绿色植物中回收氢醌葡糖苷。

7.如权利要求1，2，5，或6的方法，其中，所述启动子选自下组：35S启动子，胭脂碱合酶启动子，章鱼碱合酶启动子，花椰菜花叶病毒启动子，核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶启动子和叶绿素a/b结合蛋白的启动子。

8.如权利要求1，2，5，或6的方法，其中，所述核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶转运肽源于烟草，拟南芥属，甜菜，甘蔗，大豆，油菜籽，向日葵，棉花，玉米，苜蓿，小麦，大麦，燕麦，高粱，稻，canola，粟，菜豆，豌豆，黑麦，亚麻，或饲用牧草。

9.如权利要求1-6中任意一项的方法，其中，所述绿色植物细胞选自下组：烟草，拟南芥属，甜菜，和甘蔗。

10.如权利要求1，2，5，或6中任意一项的方法，其中，所述分支酸裂解酶表达盒编码具有SEQ ID NO：34所示氨基酸序列的多肽。

11.如权利要求3-6中任意一项的方法，其中，所述核酸片段编码与SEQ ID NO：38所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性4-羟基肉桂酰-CoA水合酶/裂解酶。

12.如权利要求1-6中任意一项的方法，其中，所述在步骤(b)中回收的氢醌葡糖苷超过10％/干重量的植物叶片生物物质。

13.如权利要求1-6中任意一项的方法，其中，所述在步骤(b)中回收的氢醌葡糖苷超过15％/干重量的植物叶片生物物质。

14.如权利要求1-6中任意一项的方法，其中，所述在步骤(b)中回收的氢醌葡糖苷超过20％/干重量的植物叶片生物物质。

15.一种在重组微生物中生产氢醌葡糖苷的方法，包括：

a)在合适的条件下，在存在合适的碳源的条件下生长重组微生物，所述重组微生物包括

i)编码与SEQ ID NO：30所示氨基酸序列具有至少90％同一性的分支酸丙酮酸裂解酶的核酸片段；

ii)编码与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性对-羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；

iii)编码与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性氢醌葡糖基转移酶的核酸片段；和

b)回收在步骤(a)中产生的氢醌葡糖苷。

16.一种在重组微生物中生产氢醌葡糖苷的方法，包括：

a)在合适的条件下，在存在对羟基苯甲酸的条件下生长重组微生物，所述重组微生物包括

i)编码与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性对-羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；

ii)编码与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性氢醌葡糖基转移酶的核酸片段；和

b)回收在步骤(a)中产生的氢醌葡糖苷。

17.一种在重组微生物中生产氢醌葡糖苷的方法，包括：

a)在合适的条件下，在存在氢醌和UDP-葡萄糖的条件下生长重组微生物，所述重组微生物包括编码与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性氢醌葡糖基转移酶的核酸片段；和

b)回收在步骤(a)中产生的氢醌葡糖苷。

18.一种重组微生物，包括

a)编码与SEQ ID NO：30所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性分支酸丙酮酸裂解酶的核酸片段；

b)编码与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性对-羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；和

c)编码与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的活性氢醌葡糖基转移酶的核酸片段。

19.如权利要求18的重组微生物，其中，所述宿主微生物是

a)选自下组的细菌：

沙门氏菌属，芽孢杆菌属，不动杆菌属，红球菌属，链霉菌属，埃希氏菌属，假单胞菌属，甲基单胞菌属，甲基细菌属，产碱杆菌属，集胞蓝细菌属，鱼腥蓝细菌属，硫杆菌属，甲烷杆菌属，克氏杆菌属，伯克霍尔德氏菌属，鞘氨醇单胞菌属，副球菌属，Pandoraea，Delftia，和丛毛单胞菌属；

b)选自下组的酵母：

曲霉属，木霉属，糖酵母属，毕赤酵母属，假丝酵母属，和汉逊酵母属；或

c)丝状真菌。

20.如权利要求19的重组微生物，其中，所述宿主微生物是大肠杆菌。

21.一种生产氢醌葡糖苷的方法，包括

a)在合适的条件下，在包括合适的碳源的含水培养基中生长混合的微生物培养物，所述混合的微生物培养物包括

i)重组氢醌-生产微生物，包括

1)编码具有与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性对-羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；和

2)编码具有与SEQ ID NO：30所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性分支酸丙酮酸裂解酶的核酸片段，和

ii)重组氢醌葡糖苷-生产微生物，包括编码具有与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性氢醌葡糖基转移酶的核酸片段；每一种重组微生物的细胞密度为大约1×10⁶-大约2×10¹⁰细胞/mL，并且，氢醌-生产微生物的数量超过氢醌葡糖苷-生产微生物的数量，其细胞比例超过1∶1-大约1∶20，以便产生氢醌葡糖苷；和

b)回收在步骤a)中产生的氢醌葡糖苷。

22.一种生产氢醌葡糖苷的方法，包括

a)在合适的条件下，在包括对羟基苯甲酸的含水培养基中生长以下微生物的混合的微生物培养物

i)氢醌-生产微生物，包括编码具有与SEQ ID NO：23所示氨

基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性对羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；和

ii)氢醌葡糖苷-生产微生物，包括编码具有与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性氢醌葡糖基转移酶的核酸片段；每一种微生物的细胞密度为大约1×10⁶-大约2×10¹⁰细胞/mL，并且，氢醌-生产微生物的数量超过氢醌葡糖苷-生产微生物的数量，其细胞比例超过1∶1-大约1∶20，以便生产氢醌葡糖苷；和

b)回收在步骤a)中产生的氢醌葡糖苷。

23.一种生产氢醌葡糖苷的方法，包括

a)让氢醌-生产微生物在合适的条件下与含水培养基接触，以便生产含有氢醌的培养基，所述微生物包括1)编码具有与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性对羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；和2)编码具有与SEQ ID NO：30所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性分支酸丙酮酸裂解酶的核酸片段；

(b)用氢醌葡糖苷-生产微生物接种在步骤a)生产的含有氢醌的培养基，所述微生物包括编码具有与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性氢醌葡糖基转移酶的核酸片段，并且温育足够的时间，以便产生氢醌葡糖苷；和

(c)回收在步骤b)中产生的氢醌葡糖苷。

24.一种生产氢醌葡糖苷的方法，包括

a)在存在对羟基苯甲酸的条件下接触氢醌-生产微生物以便产生含有氢醌的培养基，该微生物包括编码具有与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性对-羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段；

(b)用氢醌葡糖苷-生产微生物接种在步骤a)中生产的含有氢醌的培养基，所述微生物包括编码具有与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性氢醌葡糖基转移酶的核酸片段，并且温育足够的时间，以便产生氢醌葡糖苷；和

(c)回收在步骤b)中产生的氢醌葡糖苷。

25.如权利要求21-24中任意一项的方法，其中，所述宿主微生物是

a)选自下组的细菌：

沙门氏菌属，芽孢杆菌属，不动杆菌属，红球菌属，链霉菌属，埃希氏菌属，假单胞菌属，甲基单胞菌属，甲基细菌属，产碱杆菌属，集胞蓝细菌属，鱼腥蓝细菌属，硫杆菌属，甲烷杆菌属，克氏杆菌属，伯克霍尔德氏菌属，鞘氨醇单胞菌属，副球菌属，Pandoraea，Delftia和丛毛单胞菌属；

b)选自下组的酵母：

曲霉属，木霉属，糖酵母属，毕赤酵母属，假丝酵母属，和汉逊酵母属；或

c)丝状真菌。

26.如权利要求25的方法，其中，所述宿主微生物是大肠杆菌。

27.一种生产氢醌葡糖苷的方法，包括

a)让具有与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性氢醌葡糖基转移酶与氢醌和UDP-葡萄糖在合适的条件下，在含水反应混合物中接触；和

b)分离在步骤(a)中产生的氢醌葡糖苷。

28.编码对羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段，选自下组：

a)编码与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸的分离的核酸分子；

b)编码与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的多肽的分离的核酸分子，所述同一性是根据Needleman和Wunsch算法，在默认参数下确定的；和

c)完全互补于a)或b)的分离的核酸分子。

29.一种对羟基苯甲酸1-羟化酶，具有SEQ ID NO：23所示氨基酸序列。

30.转基因绿色植物，包括编码具有与SEQ ID NO：23所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性对羟基苯甲酸1-羟化酶的核酸片段。

31.如权利要求30的转基因绿色植物，还包括编码具有与SEQ IDNO：42所示氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的活性氢醌葡糖基转移酶的核酸片段。

32.如权利要求30或31转基因绿色植物，其中，所述宿主绿色植物选自下组：烟草，拟南芥属，甜菜，和甘蔗。

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