CN1821262A

CN1821262A - 灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN1821262A
Application number: CN 200610039294
Authority: CN
Inventors: 冯煦; 贾晓东; 王鸣; 赵友谊; 孙浩; 郭可耀
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2006-04-04
Filing date: 2006-04-04
Publication date: 2006-08-23
Anticipated expiration: 2026-04-04
Also published as: CN100408594C

Abstract

本发明涉及一种灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物及其制备方法和用途。提取物为灰毡毛忍冬活性总皂苷，制备方法包括50－90％乙醇提取，低极性溶剂萃取，乙酸乙酯萃取，碱水解，丙酮沉淀，离心，大孔树脂或聚酰胺柱层析，活性炭脱色，得到灰毡毛忍冬活性总皂苷。本发明的提取工艺及方法获得的有效成分得率及纯度高，已明确了灰毡毛忍冬活性总皂苷的药理、药效作用及其中的有效成分和它们的含量比例，易于掌握有效剂量。本发明获得的有效成分的有效剂量对体外培养的人癌细胞株有细胞毒活性，对小鼠肝癌H₂₂实体瘤和Lewis肺癌实体瘤具有抑制作用。

Description

灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物及其制备方法，以及该活性总皂苷在制备治疗癌症药物中的应用。更具体的说，本发明涉及灰毡毛忍冬花及花蕾中包括含抗癌活性糖链结构皂苷在内的成分及其制备方法，通过将总皂苷先水解再分，由此获得的提取物直接由活性皂苷成分组成，主要皂苷成分比例明确，易于掌握其有效剂量，且用于制备治疗癌症药物更为安全、更为稳定。

背景技术

灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.)为忍冬科Caprfoliaceae忍冬属植物，2005版中华人民共和国药典收载，列入山银花项下。忍冬属植物含有大量的皂苷，主要为常春藤型和齐墩果酸型皂苷。常春藤皂苷及齐墩果酸型皂苷具有保肝(时京珍等，黄褐毛忍冬和灰毡毛忍冬几种成分对大、小鼠化学性肝损伤的保护作用，中国中药杂志，1999，24(6)：363-364)、抗癌(Cytotoxic saponins from the root of Dipsacus asper Wall.Arch Pharm Res.2005，28(9)：1053-6.)活性。江苏省中国科学院药用植物研究开发中心在对灰毡毛忍冬花及花蕾中主要皂苷类成分的分离中，得到了二个主要皂苷类成分，明确了其皂苷类成分的组成和性质和用途。本发明采取碱水解后分离，既简化了工艺步骤，适合工业化大量生产，又大大提高了活性皂苷的得率，且由此得到的灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物的抗癌活性比未水解总皂苷高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，给出一种从灰毡毛忍冬花及花蕾中提取以灰毡毛忍冬活性总皂苷为主要活性部位的组合物以及该组合物的制备方法，使制剂原料(活性总皂苷)得率及纯度高，工艺简便易行，适于工业化生产。

本发明进一步要解决的技术问题是，给出以灰毡毛忍冬活性总皂苷为有效部位制备药物的医药用途。

本发明所采用的技术方案如下：

本发明涉及一种灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物，提取物中主要活性部位活性总皂苷含量为50％-90％，所含的皂苷类成分符合权利要求1中通式(1)。其中主要所含的皂苷及它们的重量比为：灰毡毛忍冬次皂苷乙∶灰毡毛忍冬次皂苷甲＝12～6∶1。

本发明所述的灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物是通过下述方法获得的提取物：灰毡毛忍冬花及花蕾，用浓度为50％-90％的乙醇提取，回收溶剂，用石油醚、汽油、苯等低极性溶剂萃取，水层再用乙酸乙酯萃取，水层回收溶剂至浓浸膏，加入1％-10％NaOH或KOH溶液，40-100□下降解2-4小时，冷后加入丙酮沉淀，离心，离心所得沉淀用水洗至中性，用稀醇溶解，调节PH值为4-7，上大孔树脂柱(HP20、D101、AB-8、HPD100、HPD300等)或聚酰胺柱，先用水及20％乙醇洗涤柱，再用30％-90％乙醇洗脱，收集洗脱液，加3％-5％的药用活性炭脱色，过滤，浓缩干燥，即得灰毡毛忍冬活性总皂苷。

本发明所说的灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物，是指经过上述方法提取获得的有效部位。

本发明所述的灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物，经药理学、药效学和大量的动物实验研究证明，具有抗肿瘤作用；在体外实验中，显著抑制人肝癌HepG₂细胞及人肺癌A549细胞增殖；在体内实验中，对H₂₂肝癌细胞荷瘤小鼠及Lewis肺癌细胞荷瘤小鼠，能抑制肿瘤的生长，增长荷瘤小鼠免疫力及生存期。所含成分明确，剂量易于掌握控制，因此可以在制备治疗癌症的药物中应用。

本发明提取物灰毡毛忍冬活性总皂苷可以制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂、散剂、丸剂、口服液、糖浆剂、混悬剂、喷雾剂、溶液、汤剂、凝胶剂、霜剂、乳膏剂、滴剂等。在上述制剂中，有效剂量的本发明提取物可以单独或与药学尚可接受的载体：赋形剂、崩解剂、润滑剂、着色剂等组成混合物。

具体实施方式

实施例一灰毡毛忍冬花蕾水部分得到的皂苷类成分

灰毡毛忍冬干燥花蕾，90％乙醇回流提取三次，合并提取液，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，剩下的水液上大孔树脂柱，经水-乙醇梯度洗脱，反相柱反复纯化脱色得到二个主要皂苷类成分，结构均含有抗癌活性单位。

二个皂苷分别为：

灰毡毛忍冬次皂苷乙(A)，即3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(14)-β-D-吡喃葡萄糖基(1-3)-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-常春藤皂甙元；

灰毡毛忍冬次皂苷甲(B)，即3-O-β-D-吡喃葡萄糖基(1-3)-α-L-吡喃鼠李糖基(1-2)-α-L-吡喃阿拉伯糖基-常春藤皂甙元；

皂苷的含量测定

1.仪器与试剂

高效液相色谱仪Aglient 1100系列，四元泵，自动进样器，检测器：Alltech ELSD2000(Alltech，Deerfield，IL，USA)，色谱柱：Aglient Zorbax SB-C₁₈柱(150×4.6mm，5.0μm)，乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯。

2.色谱条件

流动相：0-10min，乙腈：0.5％磷酸溶液维持比例(29∶71)，10-25min，流动相比例由(29∶71)线形改变到(46∶54)，25-30min，流动相维持比例(46∶54)。ELSD管温度：106□。氮气流速：2.6L/min。

3.对照品溶液的制备

分别精密称取经五氧化二磷干燥过夜的灰毡毛忍冬次皂苷乙和灰毡毛忍冬次皂苷甲对照品，各加甲醇制成每1ml分别含0.03mg的溶液，作为对照溶液。

4.样品测定

取本品中粉约20mg(同时另取本品粉测定水分)，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇回流提取4小时，放冷后，转移至100ml容量瓶中，甲醇定容即得。各样品经高效液相检测，计算得两种次皂苷的含量比例为12～6∶1，详见实施实例三至十。下面给出按前述技术方案的制备方法提取灰毡毛忍冬活性总皂苷及皂苷的含量测定的8个实施实例，详见下表：

实施例二

材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例
材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例	花蕾	50％	石油醚	1％	40℃	2小时	6	HP-20	3％	1.4％	88％	12∶1

实施例三

材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例
材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例	花	60％	汽油	3％	60℃	3小时	7	HP-20	4％	1.4％	72％	10.4∶1

实施例四

材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例
材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例	花蕾	70％	石油醚	4％	60℃	2小时	6	D₁₀₁	3％	1.8％	80％	8.2∶1

实施例五

材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例
材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例	花	80％	汽油	5％	80℃	4小时	4	D₁₀₁	4％	1.6％	76％	6.4∶1

实施例六

材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例
材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例	花蕾	90％	石油醚	2％	80℃	2小时	7	AB-8	5％	1.7％	64％	8.7∶1

实施例七

材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例
材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例	花蕾	80％	石油醚	4％	100℃	2小时	7	HPD100	4％	1.9％	69％	7.9∶1

实施例八

材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例
材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例	花蕾	70％	石油醚	6％	100℃	2小时	6	HPD300	3％	2.00％	71％	7.5∶1

实施例九

材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例
材料	提取液浓度	萃取液	碱浓度	水解温度	水解时间	PH值	吸附柱	活性C	得率	总皂苷含量	皂苷比例	花蕾	60％	苯	10％	60℃	2小时	5	聚酰胺	4％	1.7％	60％	6∶1

实施例十灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物的体内外抗肿瘤活性评价实验

1.灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物对人肝癌细胞HepG₂及人肺癌细胞A549的抑制作用

1.1目的：研究灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物对人肝癌细胞HepG₂及人肺癌细胞A549的体外生长抑制作用。

1.2材料：四甲基唑氮蓝(MTT)；灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物：临用前配成相应浓度；人肝癌HepG₂细胞株或人肺癌A549细胞株置于含10％小牛血清的RPMI-1 640培养基中，在5％CO₂、37□的细胞培养箱中传代待用。

1.3方法与结果：将处于对数生长期的人肝癌HepG₂细胞株或人肺癌A549细胞株调整浓度为2×10⁵ml^-1，培养24小时后，按表中所列药物浓度分别加入到5个药物组，每个药物浓度均设4个复孔，取平均值计算，另设一个空白对照孔。细胞在37□、5％CO₂条件下继续培养48小时后，加入5mg/ml的MTT液20M1，再继续培养4小时，加入DMSO溶解后迅速用酶标仪在570nm处测定OD值，计算细胞生长抑制率，实验结果见表1。

生长抑制率(％)＝(1-加药孔平均A值/空白对照孔平均A值)×100％

表1 对HepG₂细胞及A549细胞的细胞毒作用

加药浓度(μg/ml)	对HepG₂细胞抑制率	对A549细胞抑制率
加药浓度(μg/ml)	对HepG₂细胞抑制率	对A549细胞抑制率	163264128200IC₅₀	8.34％32.43％52.43％67.20％77.25％58.80μg/ml	9.90％29.34％59.41％70.20％84.85％55.84μ g/ml

用不同浓度的灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物处理HepG₂细胞及A549细胞，可见癌细胞的生长均受到抑制，且呈浓度和时间依赖性。结果表明，灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物对肿瘤细胞有较强的细胞毒作用。

2.灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物与未水解总皂苷提取物抗癌活性的比较研究

2.1目的：比较灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物与未水解总皂苷提取物的抗癌活性。

2.2材料：灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物：临用前配成相应浓度；未水解总皂苷提取物：灰毡毛忍冬花蕾，用浓度为90％的乙醇提取，回收溶剂，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，水层回收溶剂至浓浸膏，加入丙酮沉淀，离心，沉淀用稀醇溶解，调节PH值为6，上D₁₀₁大孔树脂柱，先用水及20％乙醇洗涤柱，再用30％-90％乙醇洗脱，洗脱液脱色、过滤、浓缩干燥即得。

2.3方法与结果：MTT比色法同前，分为空白对照组、活性组和未水解组，其中为水解组分为五个浓度组，实验结果见表2。

表2 灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物与未水解总皂苷提取物的抗癌活性的比较

加药浓度(μg/ml)	对HepG₂细胞抑制率	对A549细胞抑制率
加药浓度(μg/ml)	对HepG₂细胞抑制率	对A549细胞抑制率	活性组-60未水解组-20未水解组-60未水解组-120未水解组-250IC₅₀	50.90％3.40％5.11％7.91％15.77％＞300μg/ml	54.71％3.17％5.39％8.34％16.86％＞300μg/ml

从实验结果可以看出，未水解灰毡毛忍冬总皂苷抗肿瘤活性降低，IC₅₀＞300μg/ml。水解反应大大提高了提取物的抗肿瘤活性。

3.灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物对H₂₂荷瘤小鼠的抗肿瘤实验

3.1目的：研究灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物对小鼠肝癌H₂₂的抑制作用。

3.2材料：昆明种雄性小鼠40只，体重(20±2g)；5-氟尿嘧啶，上海旭东海普药业产品；灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物：临用前用生理盐水配成相应浓度。实验室温度20±3□，相对湿度：75％。

3.3方法与结果：无菌条件下剥取传代10天的肝癌H₂₂癌块，制成匀浆，用生理盐水1∶3稀释，计数调整细胞浓度为2×10⁶L^-1，每只0.2ml，接种于小鼠右腋部皮下，24小时后随机分为5组，即阴性对照组(生理盐水)、药物大剂量组、药物中剂量组、药物小剂量组及阳性对照组(5-氟尿嘧啶)，每组均灌胃相应浓度药物或生理盐水，每天一次，十天后称重处死，肿瘤块称重计算肿瘤生长抑制率，结果见表3。

肿瘤生长抑制率抑制率(％)＝(1-治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％

表3 灰毡毛忍冬活性总皂苷对H₂₂荷瘤小鼠和Lewis荷瘤小鼠抑瘤率的影响

Group	n	对H₂₂荷瘤小鼠的抑瘤率	对Lewis荷瘤小鼠德抑瘤率
Group	n	对H₂₂荷瘤小鼠的抑瘤率	对Lewis荷瘤小鼠德抑瘤率	药物大剂量组80m/kg药物中剂量组40mg/kg药物小剂量组20mg/kg阳性对照组	8888	50.6％39.7％27.4％56.7％	46.61％37.56％26.24％-

灰毡毛忍冬活性总皂苷对H₂₂荷瘤小鼠生存期的影响结果见表4。

表4 灰毡毛忍冬活性总皂苷对H₂₂荷瘤小鼠生存期的影响

Group	n	Living phases
Group	n	Living phases	阴性对照组药物中剂量组阳性对照组	888	14.1±2.1329.3±1.3629.1±2.15

结果表明：样品组与阴性对照组比较小鼠生存期显著增长，有非常显著差异，p＜0.01。

4.灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物对小鼠Lewis肺癌的抑制作用

4.1目的：研究灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物对小鼠Lewis肺癌的抑制作用。

4.2材料：昆明种雄性小鼠32只，体重(20±2g)；灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物：临用前用生理盐水配成相应浓度。实验室温度20±3□，相对湿度：75％。

4.3方法与结果：无菌条件下剥取传代10天的Lewis肺癌癌块，制成匀浆，用生理盐水1∶3稀释，计数调整细胞浓度为1×10⁷ml^-1，每只0.2ml，接种于小鼠右腋部皮下，24小时后随机分为5组，即阴性对照组(生理盐水)、药物大剂量组、药物中剂量组及药物小剂量组，每组均灌胃相应浓度药物或生理盐水，每天一次，十天后称重处死。称量肿瘤块重量，计算肿瘤生长抑制率，见表3。

结果表明：灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物能显著抑制H₂₂荷瘤小鼠瘤重及Lewis荷瘤小鼠瘤重，具有抗癌活性。

Claims

1.一种灰毡毛忍冬活性总皂苷提取物，其特征是提取物中主要活性部位活性总皂苷含量为50％-90％，所含的皂苷类成分符合以下通式(1)，其中主要所含的皂苷及它们的重量比为：灰毡毛忍冬次皂苷乙∶灰毡毛忍冬次皂苷甲＝12～6∶1，

R₃＝H，OH

R₂＝H

R₁＝H，糖链 (1)。

2.根据权利要求1所述的提取物，其特征是所说的提取物是通过下述方法获得的提取物：灰毡毛忍冬花及花蕾，用浓度为50％-90％的乙醇提取，回收溶剂，用低极性溶剂萃取，水层再用乙酸乙酯萃取，水层回收溶剂至浓浸膏，加入1％-10％NaOH或KOH溶液，40-100□下降解2-4小时，冷后加入丙酮沉淀，离心，离心所得沉淀用水洗至中性，用稀醇溶解，调节PH值为4-7，上大孔树脂柱或聚酰胺柱，先用水及20％乙醇洗涤柱，再用30％-90％乙醇洗脱，收集洗脱液，加3％-5％的药用活性炭脱色，过滤，浓缩干燥，即得灰毡毛忍冬活性总皂苷。

3.根据权利要求2所述的提取物，其特征是用石油醚、汽油、苯等低极性溶剂萃取，水层再用乙酸乙酯萃取，水层回收溶剂至浓浸膏，加入1％-10％NaOH或KOH溶液，40-100□下降解2-4小时，冷后加入丙酮沉淀，离心，离心所得沉淀用水洗至中性，用稀醇溶解，调节PH值为4-7，拌样或直接上大孔树脂柱(HP20、D101、AB-8、HPD100、HPD300)或聚酰胺柱，先用水及20％乙醇洗涤柱，再用30％-90％乙醇洗脱，收集洗脱液，加3％-5％的药用颗粒状活性炭脱色，过滤，浓缩干燥，即得灰毡毛忍冬活性总皂苷。

4.根据权利要求1-3所提取的灰毡毛忍冬花及花蕾有效部位灰毡毛忍冬活性总皂苷的提取工艺方法，其特征是所提的灰毡毛忍冬活性总皂苷为：灰毡毛忍冬次皂苷乙：灰毡毛忍冬次皂苷甲。

5.根据权利要求1-3所提取的灰毡毛忍冬次皂苷乙：灰毡毛忍冬次皂苷甲，

其特征在制备治疗或预防人体肝癌的药中的应用。