CN1790025A - 莱克多巴胺侧流免疫层析半定量检测试纸 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种莱克多巴胺侧流免疫层析半定量检测试纸，该试纸的背衬上粘贴有样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分及吸水部分。检测反应部分上包被有莱克多巴胺抗体1－3条或检测用抗原1－3条作为检测线，同时包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1－3条作为参考线，组合时检测线和参考线不能同时多于1条，组合线条数为2－4条。本发明的检测试纸特异性强，能够实现半定量检测，4－40℃都可使用，3min以后便可观察结果，适合于卫生、质监、海关、家畜养殖场等单位或个人对动物源性食品样品中的莱克多巴胺药物进行快速检测。

Description

莱克多巴胺侧流免疫层析半定量检测试纸

技术领域

本发明涉及动物性食品中一种β-兴奋剂残留检测工具，特别涉及一种莱克多巴胺侧流免疫层析半定量检测试纸及其制备方法和使用方法。

背景技术

莱克多巴胺是一种β-兴奋剂，俗称“瘦肉精”，因其在动物性食品中的残留会造成人体健康损害，因此我国明确规定禁止将其作为营养分配剂使用。但是，由于经济利益的驱使，莱克多巴胺违法滥用现象仍时有发生。

对莱克多巴胺残留的检测目前主要采用高效液相色谱法(HPLC)。然而应用HPLC时样品前处理非常繁琐，测定方法相当复杂，需受过专门训练的人员才能操作，检测通量很小。在我国目前动物养殖分散经营的情况下，很难统一管理，因此造成动物源性食品的质量很难一致，单纯采用大型仪器检测监控产品质量，很不现实，而且仪器检测费用高，很难普及使用。ELISA法是另一种目前研究较多的兽药残留检测方法，具有灵敏度高、检测量大、成本低等优点，但该方法也需酶标仪等部分实验室设备，分析时间一般1-4小时，仍有一定局限性。因此，目前我国相应的莱克多巴胺检测技术并不很完备，很有必要研制更加简单快捷方便的检测工具。

发明内容

(一)、要解决的技术问题

本发明的目的在于提供一种使用简便、灵敏度高、价格低廉的莱克多巴胺半定量检测试纸及其制备方法和使用方法。

(二)、技术方案

本发明提供的莱克多巴胺侧流免疫层析半定量检测试纸是在涂有不干胶的不吸水的韧性材料的背衬上依次贴有样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分和吸水部分。

所述胶体金标记部分为玻璃纤维或醋酸纤维或尼龙膜，其上标记的物质为第二种属动物蛋白与莱克多巴胺抗体的混合物，或第二种属动物蛋白与莱克多巴胺检测用抗原的混合物。

所述检测反应部分上面包被有莱克多巴胺检测用抗原1-3条作为检测线，或包被有莱克多巴胺抗体1-3条作为检测线，同时还包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1-3条作为参考线。检测线和参考线组合时不能同时多于1条，组合线条数为2-4条，组合方式为1条检测线+1条参考线、1条检测线+2条参考线、1条检测线+3条参考线、2条检测线+1条参考线、3条检测线+1条参考线五种形式。根据半定量检测的准确度要求，组合线数越多，半定量越准确。

其中检测用抗原是指莱克多巴胺与载体物质形成的偶合物，其中载体物质包括蛋白质、蛋白质片段、合成多肽、半合成多肽、多糖，如血清白蛋白、球蛋白、脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖，优选的载体物质包括牛血清白蛋白、卵清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、L-多聚赖氨酸等。另外，载体物质也可以是具有活性基团的其他合成或天然聚合物，如白喉毒素、破伤风毒素、酵母、尼龙、右旋葡聚糖、纤维素等，同样也可以用来制备检测用抗原。第二种属动物蛋白指非抗体来源属动物的蛋白，例如，抗体为鼠源性，则第二种属动物蛋白可以是卵清白蛋白、兔血清白蛋白等鸡、兔或其他非鼠源性动物蛋白。

本发明的试纸的各部分制备方法与功能如下：

1、背衬：为一面涂有不干胶的不吸水的韧性材料，如PVC板，起固定支持试纸其他组成部分的作用。

2、样液吸收部分制备：将滤纸或玻璃纤维纸浸入pH7.0-8.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即作为样液吸收部分，检测时起吸收样品溶液的作用，便于样品溶液向上移动。

3、胶体金标记部分的制备：该部分起固定胶体金标记的抗原或抗体的作用。制备步骤包括胶体金溶胶的制备、胶体金标记莱克多巴胺抗体或莱克多巴胺抗原、胶体金标记部分处理。其中，

(1)胶体金溶胶的制备：将氯金酸(HAuCL₄)用超纯水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超纯水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加热至沸腾，加入1-5mL的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，即为胶体金溶胶。

(2)胶体金标记莱克多巴胺抗体：将莱克多巴胺单克隆抗体或多克隆抗体和第二种属动物蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)溶解稀释至2-4mg/mL，每100mL胶体金溶胶加入1-3mL 2-4mg/mL的莱克多巴胺抗体和1-1.5mL 2-4mg/mL第二种属动物蛋白，震荡2min，用0.2mol/L的K₂CO₃调节pH至8.4，振荡5min，加入11％PEG-100002mL，振荡5min，8000-15000r/min离心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)复溶，以6000-13000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)稀释500-2000倍，产物作为金标莱克多巴胺抗体(GAb)。

(3)胶体金标记莱克多巴胺抗原：将莱克多巴胺检测用抗原和第二种属动物蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH7.0-8.4)溶解稀释至2-4mg/mL，每100mL胶体金溶胶加入1-3mL 2-4mg/mL的检测用抗原和1-1.5mL 2-4mg/mL第二种属动物蛋白，震荡2min，用0.2mol/L的K₂CO₃调节pH至8.4，振荡5min，加入11％PEG-100002mL，振荡5min，8000-15000r/min离心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)复溶，以6000-13000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0-7.5)稀释500-2000倍，产物作为金标记的莱克多巴胺抗原(GAg)。

(4)胶体金标记部分处理：将GAb或GAg倒入一槽中，将玻璃纤维纸或滤纸浸入1min，取出，室温干燥后，即作为胶体金标记部分。

4、检测反应部分制备：用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亚胺溶液浸泡硝酸纤维膜或醋酸纤维膜或尼龙膜30min，取出，37℃烘干，上边包被1-3条不同浓度的莱克多巴胺检测用抗原线或莱克多巴胺抗体线作为检测线，同时包被1-3条不同浓度的抗第二种属动物蛋白的IgG线作为参考线。当胶体金标记部分标记对象为莱克多巴胺抗体和第二种属动物蛋白时，检测线则包被莱克多巴胺检测用抗原；当胶体金标记部分标记对象为莱克多巴胺检测用抗原和第二种属动物蛋白时，检测线则包被莱克多巴胺抗体；检测线和参考线不能同时多于1条，组合线数2-4条。此即为检测反应部分，该部分主要作用是将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。

5、吸水部分制备：将玻璃纤维纸或滤纸或吸水纸室温干燥后，即作为吸水部分。该部分主要作用在于将移动上来的多余的样品溶液吸收。

在背衬上依次粘贴样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分和吸水部分，即成本发明的莱克多巴胺侧流免疫层析半定量检测试纸。

本发明试纸的检测原理因胶体金标记的对象不同，而稍有差异。

当胶体金标记部分的标记对象为莱克多巴胺抗体和第二种属动物蛋白时，如果样品中含有莱克多巴胺，样品溶液被试纸的样液吸收部分吸收并通过毛细作用上移到达胶体金标记部分，样品溶液中的莱克多巴胺与胶体金标记的莱克多巴胺抗体反应形成结合物，结合物继续上移到检测线，因胶体金标记的莱克多巴胺抗体只有一个结合位点，样品溶液中的莱克多巴胺与之结合后，检测线上的检测用抗原就不能再与胶体金标记的莱克多巴胺抗体结合，于是检测线无色；当样品中没有莱克多巴胺时，胶体金标记的莱克多巴胺抗体到达检测线时被检测用抗原捕获，则形成肉眼可见红色，此即为阴性。无论样品中是否含有莱克多巴胺，胶体金标记的第二种属动物蛋白上移到达参考线时都可被参考线上包被的抗第二种属动物蛋白的IgG捕获形成肉眼可见的红色，此即为参考线。

当胶体金标记部分的标记对象为莱克多巴胺检测用抗原和第二种属动物蛋白时，如果样品中含有莱克多巴胺，样品溶液被试纸的样液吸收部分吸收并通过毛细作用上移，样品中的游离莱克多巴胺分子量小移动速度快，先到达检测线，先与检测线上包被的莱克多巴胺抗体结合，因检测线上包被的莱克多巴胺抗体只有一个结合位点，而且样品中游离的莱克多巴胺结合能力比偶合态的莱克多巴胺检测用抗原强，于是胶体金标记的检测用抗原不能再被检测线上的莱克多巴胺抗体捕获，于是检测线无色，此即为阳性；如果样品中无莱克多巴胺，则胶体金标记的莱克多巴胺检测用抗原到达检测线后就被检测线上包被的莱克多巴胺抗体捕获，形成肉眼可见的红色，此即为阴性。无论样品中是否含有莱克多巴胺，胶体金标记的第二种属动物蛋白上移到达参考线时都可被参考线上包被的抗第二种属动物蛋白的IgG捕获形成肉眼可见的红色，此即为参考线。

以上两种方式的试纸，在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物浓度，控制检测时检测线和参考线的显色深浅，并将其显色深浅或显色条数与标准物质浓度对应起来，即可达到半定量检测目的。

(三)、有益效果

本发明的积极效果：

1、特异性强。该试纸特异性极强，与克伦特罗、沙丁胺醇、己烯雌酚等基本没有交叉反应，避免了其它药物对检测的干扰，符合了农业部检测莱克多巴胺合药物的要求。

2、灵敏度高。本试纸最低检测下限为1ng/mL，达到了快速筛选检测要求。

3、能够实现半定量检测。本试纸不但能够定性检测，更重要的的是根据检测线颜色与参考线颜色对比或根据检测线呈色条数达到半定量检测目的。

4、操作简单方便。对牛奶、动物尿液可直接检测，肉类等组织样品简单处理后即可检测。本试纸不需任何专业培训，不需任何仪器设备，普通非专业人员都可操作，只要将试纸插入检测液中，用肉眼判读。因此，本试纸适用面宽，卫生检验监督部门、动物养殖单位以及消费者个人均可使用。

5、速度快，通量大，颜色稳定。试纸插入样液中，3min以后便可观察结果，一个人可以同时、连续检测，检测通量远远高于HPLC法，比莱克多巴胺ELISA试剂盒检测速度则快40-160倍以上，并且其颜色可永久保存，而不会象ELISA底物那样很快就变色。

6、检测温度适宜范围宽。在4-40℃均可使用，结果正常，不需在低温下进行，不需采取保温措施，室内野外均可使用。

7、试纸保质期长。据加速老化试验结果，干燥条件下试纸保质期可达2年。

8、成本低廉。本试纸法检测成本远远低于莱克多巴胺ELISA试剂盒检测法，随着规模化生产后，其成本还会大幅度降低。

附图说明

图1为本发明试纸的结构示意图。其中1为样液吸收部分、2为胶体金标记部分、3为检测反应部分、4为检测线、5为参考线、6为吸水部分。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1  1条检测线+1条参考线形式的试纸

检测线包被有浓度为0.1-30μg/mL的莱克多巴胺单克隆抗体或莱克多巴胺检测用抗原1条，宽1mm；参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG 1条，宽1mm；两条线之间间隔2-6mm。当检测线颜色与参考线颜色相同时，则样品为阴性；当检测线比参考线颜色浅时，则样品为阳性，浓度大于Aμg/kg，A为设定的检测限，可以是大于或等于10μg/kg的某一浓度。参考线始终显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

实施例2  2条检测线+1条参考线形式的试纸

2条检测线包被有0.01-30μg/mL莱克多巴胺单克隆抗体或莱克多巴胺检测用抗原，第2条检测线上包被物的浓度小于第1条检测线参考线包被物浓度；参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG，宽1mm；各条线之间间隔2-6mm。当两条检测线都呈现颜色时，则样品为阴性；当检测线第1条检测线呈色，第2条检测线不呈色时，则样品中莱克多巴胺浓度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；当两条检测线都不呈色时，样品中莱克多巴胺浓度大于Bμg/kg。A、B为设定的检测限，可以是大于或等于10μg/kg的某一浓度。参考线始终显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

实施例3  3条检测线+1条参考线形式的试纸

3条检测线包被有0.01-30μg/mL莱克多巴胺单克隆抗体或莱克多巴胺检测用抗原，三条检测线上包被物的浓度依次递减；参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG；各条线之间间隔2-6mm。当3条检测线都呈现颜色时，则样品为阴性；当检测线第1，2条检测线呈色，第3条检测线不呈色时，则样品中莱克多巴胺浓度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；当第1条检测线呈色，第2，3条检测线都不呈色时，样品中莱克多巴胺浓度大于Bμg/kg，小于Cμg/kg；当3条检测线都不呈色时，样瓶中莱克多巴胺含量大于Cμg/kg；A、B、C为设定的检测限，可以是大于或等于10μg/kg的某一浓度。参考线始终显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

实施例4  1条检测线+3条参考线形式的试纸

检测线上包被有0.01-30μg/mL莱克多巴胺单克隆抗体或莱克多巴胺检测用抗原，检测线之后包被有3条参考线，参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG，调节参考线包被物浓度和胶体金标记的第2种属动物蛋白的标记浓度，使3条参考线的颜色分别与标准样品中莱克多巴胺含量为C、B、Aμg/kg时检测线的颜色相同，依此确定参考线包被物浓度；各条线之间间隔2-6mm；当检测线颜色深于第3条参考线颜色时，表明样品为阴性；当检测线颜色深于第3条参考线颜色浅于第2条检测时，表明样品中莱克多巴胺浓度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；当检测线颜色深于第2条参考线颜色浅于第1条参考线时，表明样品中莱克多巴胺浓度大于Bμg/kg，小于Cμg/kg；当检测线不呈色时，表明样品中莱克多巴胺浓度大于Cμg/kg。

实施例5  1条检测线+2条参考线形式的试纸

检测线上包被有0.01-30μg/mL莱克多巴胺单克隆抗体或莱克多巴胺检测用抗原，检测线之后包被有2条参考线，参考线包被有浓度为0.01-30μg/mL的抗第二种属动物蛋白的IgG，调节参考线包被物浓度和胶体金标记的第2种属动物蛋白的标记浓度，使2条参考线的颜色分别与标准样品中莱克多巴胺含量为B、Aμg/kg时检测线的颜色相同，依此确定参考线包被物浓度；各条线之间间隔2-6mm；当检测线颜色深于第2条参考线颜色时，表明样品为阴性；当检测线颜色深于第2条参考线颜色浅于第1条检测时，表明样品中莱克多巴胺浓度大于Aμg/kg，小于Bμg/kg；当检测线颜色深于第1条参考线颜色浅于第1条参考线时，表明样品中莱克多巴胺浓度大于Bμg/kg。

实施例6  莱克多巴胺偶合抗原合成

莱克多巴胺偶合抗原分为免疫用抗原和检测用抗原，前者用于免疫动物，后者用于抗体制备中抗体的检测筛选和试纸制备中的胶体金标记或检测线包被。

免疫用抗原制备：将30mg莱克多巴胺盐酸盐与10mg丁二酸酐在吡啶溶液中反应，反应液经氮气吹干后溶于二氧六环中，加三丁胺25μL，冰浴搅拌15min，加氯甲酸异丁酯13μL，搅拌1h。滴加BSA溶液(100mgBSA溶于0.11mol/L硼酸钠溶液中，pH8.5)，滴加完毕后在室温下反应过夜，反应液装于透析膜袋透析3d，分装即可。

检测用抗原：用卵清白蛋白OVA取代牛血清白蛋白BSA，其余步骤同免疫用抗原制备。

实施例7  莱克多巴胺单克隆抗体制备

取健康5周龄雌性二级Balb/c小鼠6只进行免疫。第一次基础免疫将0.1mL莱克多巴胺免疫用抗原与等量完全弗氏佐剂用搅拌器充分混匀乳化，进行腹腔注射，注射量0.2mL/只。四周后开始进行加强免疫，佐剂换为不完全弗氏佐剂，每隔两周加强免疫一次，末次免疫3d后取脾脏融合。

先将HAT培养液、IMDM不完全培养液、IMDM完全培养液和50％PEG-6000溶液于37℃水浴中预温，同时将另一盛水的烧杯放入37℃水浴中预温。将上述制备好的脾细胞和骨髓瘤细胞和脾细胞按1∶5的比例混合，在50mL塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200r/min离心8min，弃上清，用滴管吸净残留液体。置37℃水浴中，将吸管插入管底，在90s内边搅拌边加入预热的1mL、50％PEG-6000。静置90s后，于37℃水浴中60s内加入10mL预热的完全培养液。轻轻悬浮一次，以1000r/min离心6min，弃去上清，先用6mL左右完全培养液轻轻悬浮。根据所用96孔培养板的数量，补加HAT培养液到76.8mL，轻轻混匀，将混匀悬液接种于有饲养细胞的96孔板中，每孔0.1mL，一次接种8块板。将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养。融合后7d，用HT培养液半量换液1次，在13d后根据增殖情况改用20％NBS的完全培养液。约7d后出现杂交瘤细胞集落，细胞大、圆且透亮。待集落长至孔底1/3时，在培养板的盖板上画上克隆生长的标记，此时即可取上清检测相应的特异性抗体。细胞完全克隆化后，将细胞注入小鼠腹腔，间隔一段时间等腹水足够多时，取腹水，将腹水用蛋白A免疫亲和层析纯化后，即得到莱克多巴胺单克隆抗体。

实施例8  样液吸收部分处理

将滤纸或玻璃纤维纸等浸入0.1mol/LpH7.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即成样液吸收部分。

实施例9  胶体金标记部分的制备和处理

胶体金标记部分的制备和处理包括胶体金溶胶制备、胶体金标莱克多巴胺抗体、胶体金标记部分处理。

胶体金溶胶制备：将氯金酸(HAuCL₄)用超纯水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超纯水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加热至沸腾，加入一定量的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热到出现透明的橙红色为止，即为胶体金溶胶。

胶体金标记莱克多巴胺单克隆抗体制备：将莱克多巴胺单克隆抗体和猪血清白蛋白分别用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)溶解稀释至3mg/mL，每100mL胶体金溶胶加入1mL 4mg/mL的莱克多巴胺单克隆抗体和1mL 2mg/mL猪血清白蛋白，震荡2min，用0.2mol/L的K₂CO₃调节pH至8.4，振荡5min，加入11％PEG-100002mL，振荡5min，15000r/min离心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.4)复溶，以6000～13000r/min离心15min，除去上清，将沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.5)稀释1000倍，产物作为金标莱克多巴胺单克隆抗体。

胶体金标记部分处理：将金标莱克多巴胺单克隆抗体倒入一槽中，将玻璃纤维纸或滤纸浸入1min，取出，室温干燥或真空冷冻干燥，即成为胶体金标记部分。

实施例10  1条检测线+2条参考线组合形式的试纸检测反应部分处理

用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亚胺溶液浸泡硝酸纤维膜30min，取出，37℃烘干，上边用喷涂机喷涂包被1条莱克多巴胺检测用抗原线作为检测线，浓度为3μg/mL；包被2条羊抗猪血清白蛋白的IgG线作为参考线，靠近下端的浓度为2μg/mL，另一条为1μg/mL。此即为检测反应部分，检测线和参考线组合形式为1条检测线+2条参考线。

实施例11  吸水部分处理及试纸组装

将吸水纸室温干燥后，即作为吸水部分。

在背衬上依次粘贴样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分和吸水部分，即成组合形式为1条检测线+2条参考线的莱克多巴胺快速半定量检测试纸。

实施例12  检测方法

1、动物尿样：给试纸检测部分直接滴2滴尿样，约100μL，2min后，观察颜色。若2条检测线都呈现颜色，表明样品为阴性；若第1条检测线呈色，第2条不呈色，则表明样品中莱克多巴胺含量为2ng/mL以上；若第1条检测线与第2条检测线都不显色，则表明样品中莱克多巴胺含量为8ng/mL以上。无论样品中莱克多巴胺含量如何，参考线应该显色，若参考线不显色，表明试纸失效。

2、动物肝脏、肾脏、肌肉等组织样品：移去脂肪的10g组织样捣碎，加入30mL PBS(0.01mol/L pH7.4)中，在80℃孵育30min，然后置于冰浴10min，离心，小心去除表面的脂肪层，上清作为检测液。余下操作同尿样。

Claims (6)

1、一种莱克多巴胺侧流免疫层析半定量检测试纸，由背衬和粘贴在背衬上的样液吸收部分、胶体金标记部分、检测反应部分及吸水部分组成，其中检测反应部分上包被有莱克多巴胺抗体1-3条或检测用抗原1-3条作为检测线，同时包被有抗第二种属动物蛋白的IgG 1-3条作为参考线，组合时检测线和参考线不能同时多于1条，组合线条数为2-4条。

2、如权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述的检测用抗原是指莱克多巴胺与载体物质形成的偶合物，其中载体物质选自蛋白质、蛋白质片段、合成多肽、半合成多肽或多糖。

3、如权利要求2所述的试纸，其特征在于，所述的载体物质选自牛血清白蛋白、卵清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、甲状腺球蛋白、L-多聚赖氨酸、白喉毒素、破伤风毒素、酵母、尼龙、右旋葡聚糖或纤维素。

4、如权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述的第二种属动物蛋白是非抗体来源属动物的蛋白。

5、如权利要求1-4任一项所述的试纸，其特征在于，所述的检测线和参考线的组合方式为1条检测线和1条参考线、1条检测线和2条参考线、1条检测线和3条参考线、2条检测线和1条参考线、3条检测线和1条参考线共5种形式。

6、如权利要求1-4任一项所述的试纸的使用方法，其特征在于，在试纸制备时通过调节检测线和参考线包被物浓度，控制检测时检测线和参考线的显色深浅，并将其显色深浅或显色条数与标准物质浓度对应起来，达到半定量检测。