CN1782077A

CN1782077A - HAb18Gedomab1单抗和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用

Info

Publication number: CN1782077A
Application number: CN 200410078858
Authority: CN
Inventors: 陈志南; 邢金良; 张思河; 杨向民; 汪莉; 叶卉; 李别虎
Original assignee: 陈志南
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2004-06-14
Filing date: 2004-09-09
Publication date: 2006-06-07
Anticipated expiration: 2024-09-09
Also published as: CN100480388C

Abstract

本发明涉及HAb18Gedomab1单抗和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用。本发明以HAb18G/CD147胞外区蛋白免疫小鼠后所制备的特异性的杂交瘤细胞株HAb18Gedomab1，得到单抗HAb18Gedomab1，该单抗可与人肝纤维化组织中高表达的抗原HAb18G/CD147及肝星状细胞特异性结合。其具有促进MMPs分泌，降解细胞外基质的功能。应用该抗体制备用于逆转肝纤维化等基质沉积相关疾病的药物。本发明成功地克隆了该抗体的轻、重链可变区基因。基于上述基因，采用基因工程方法，构建和表达成多种形式的小分子基因工程抗体，制备用于逆转肝纤维化等基质沉积相关疾病的药物。基于上述基因所编码的多肽，交联上多种效应分子，制备用于逆转肝纤维化等基质沉积相关疾病的药物。

Description

HAb18Gedomab1单抗和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用

技术领域

本发明涉及生物技术及细胞工程领域，特别是单抗HAb18Gedomab1及其重链、轻链可变区基因、由所述基因编码的多肽和上述单抗及轻、重链可变区基因、多肽的应用。

背景技术

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和必经途径。慢性肝病主要包括各型病毒性肝炎，尤其是丙型肝炎和乙型肝炎。全球HbsAg携带者超过2.8亿。我国为乙肝高流行区，其HbsAg携带者1.3亿，乙型肝炎患者超过3000万，有25-40％的乙肝患者导致肝硬化、肝癌，其死亡人数为40万人/年，已成为我国严重的社会问题。因此控制和逆转肝纤维化成为降低肝病患者死亡率的关键环节。各种慢性肝病首先导致肝纤维化，然后演变成肝硬化。基于近年肝脏超微结构的研究和分子生物技术的应用，人类发生的肝纤维化乃至肝硬化是完全可以逆转的。已故国际肝病专家Hans Popper曾经断言“谁能阻止肝纤维化，谁就能治愈大多数肝病”。

肝癌相关抗原HAb18G是一种高度糖基化的膜蛋白分子。通过我室自己制备的抗人单克隆抗体HAb18从肝癌cDNA文库中筛选得到了其cDNA序列，查询Genbank证实其与CD147分子cDNA序列开放阅读框完全一致，与基质金属蛋白酶诱导剂EMMPRIN(Extrcellular Matrix metalloproteinase Inducer)、Basigin等为同一类分子。功能研究表明，HAb18G/CD147可刺激人成纤维细胞分泌三种蛋白酶，降解基底膜和细胞间质。已知，HAb18G/CD147在纤维化组织中高表达，尤以肝纤维化组织表达最为显著，其定位于肝细胞和肝脏纤维化基质中增殖的胆管上皮细胞，在HCV(丙型肝炎病毒)、AIH(自身免疫性肝炎)、HBV(乙型肝炎病毒)、PBC(原发性胆汁性肝硬化)引起的肝纤维化病变中HAb18G/CD147均高表达。这一特点显示出该分子在肝纤维化的病变进程中扮演了重要的角色，其可能与刺激肝实质细胞、肝星状细胞分泌MMPs有关。

MMPs具有降解各型胶原、蛋白聚糖等ECM成分的作用，TIMPs为MMPs特异性组织抑制因子，体内TIMPs和MMPs的转录和活性可受到多因素和多水平的调节，如果出现平衡紊乱则会出现相应的病理状态。许多学者发现，在人类的慢性肝病及鼠的肝纤维化的模型中都已观察到MMPs的表达量和活性下降，而TIMPs的表达却显著增加，并在肝纤维化发展的整个过程中持续存在，提示肝基质的过度沉积是肝纤维化进展的主要病理特征。而在肝纤维化的恢复期，以纤维状基质的降解和正常肝组织的恢复为特征。

当前肝纤维化的治疗进展是：减轻纤维化的程度，延缓发展，逆转病理进程，但是针对肝纤维化本身尚无特异性的治疗手段。如转化生长因子β1(TGF-β1)的肽类受体拮抗剂，由于其受体广泛存在于各类细胞中，使用后可导致自身免疫性疾病和细胞的退化等不良作用。其他的如内皮素受体拮抗剂、脯氨酰羟化酶抑制剂等均在研究之中，尚未有明确的药效学结果。

发明内容

本发明的一个目的在于制备高特异性的针对HAb18G/CD147胞外区的单克隆抗体HAb18Gedomab1，并提供单抗HAb18Gedomab1重链和轻链可变区基因及其所编码的多肽产物。

本发明的另一个目的在于以上述HAb18Gedomab1单抗、或其重链和轻链可变区基因、或所编码的多肽，或者重组成多种形式的基因工程抗体、抗体融合蛋白或蛋白交联物、衍生物等，用于逆转肝纤维化等基质沉积相关疾病的药物。

根据本发明的一个方面，涉及单抗HAb18Gedomab1的制备、鉴定、纯化。本发明以肝纤维化组织中高表达的HAb18G/CD147的胞外区蛋白为免疫原，采用杂交瘤技术制备并筛选出稳定分泌鼠抗人HAb18Gedomab1单抗的杂交瘤细胞株HAb18Gedomab1(2004年5月31日中国典型培养物保藏中心登记编号：CCTCC-C200408)。将其接种同系小鼠腹腔后收集腹水。采用流式细胞术、免疫组化等方法对细胞培养上清及腹水中分泌的特异性抗体进行亲和性鉴定，其结果显示HAb18Gedomab1与人星形细胞(HSCs)及人肝纤维化组织均有结合。所得腹水经离子交换层析纯化获得一定纯度的HAb18Gedomab1单抗。

根据本发明的另一个方面，涉及单抗HAb18Gedomab1重链和轻链可变区基因的克隆。本发明应用一套设计的PCR引物，从杂交瘤细胞株HAb18Gedomab1中成功地克隆了该抗体的轻、重链可变区基因。其中所述的重链可变区基因全长为336bp，其核苷酸序列如序列表中<400>1所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>3所示。所述的轻链可变区基因全长为324bp，其核苷酸序列如序列表中<400>2所示，其编码的氨基酸序列如序列表中<400>4所示，经分析证实所得到的重链和轻链可变区基因均可编码正确的小鼠抗体可变区。

附图说明

图1为杂交瘤细胞株HAb18Gedomab1的染色体组型图。

图2为单抗HAb18Gedomab1的SDS-PAGE纯度鉴定图。

图3为为RT-PCR扩增的单抗HAb18Gedomab1轻、重链可变区基因的琼脂糖凝胶电泳图。

图4为单抗HAb18Gedomab1重链可变区基因的测序图谱。

图5为单抗HAb18Gedomab1轻链可变区基因的测序图谱。

图6为单抗HAb18Gedomab1的明胶酶谱图。

图7为单抗HAb18Gedomab1的I型胶原酶谱图。

图8为重组基底膜降解实验的穿膜细胞图。

具体实施方式

1、单抗HAb18Gedomab1的制备与鉴定。

免疫方法：取8～10周龄重18g左右雌性BALB/C小鼠(本校动物中心提供)，以HAb18G/CD147胞外区蛋白为免疫源，进行常规免疫，采用皮下多点注射，100μg/只，每隔2周以相同剂量抗原加不完全福氏佐剂加强免疫，腹腔注射，细胞融合前检测小鼠血清多抗的效价，效价高者尾静脉再追加免疫1次，剂量同上。3天后将HAb18C/CD147胞外区蛋白免疫的小鼠脾细胞与体内传代获得的骨髓瘤细胞系SP2/0以5∶1的比例在PEG-1000作用下融合，融合细胞在HAT选择性培养基中培养。

杂交瘤细胞株的建立：以HAb18G/CD147胞外区蛋白抗原，间接ELISA方法筛选阳性克隆，将阳性孔连续有限稀释2～3次后。大量扩增并液氮冻存；同时给同系小鼠腹腔注射接种筛选的杂交瘤细胞，10～14d后收集腹水。所述的HAb18Gedomab1杂交瘤细胞株染色体在58-126，众数104-126，参见附图1，其分泌特异性单抗HAb18Gedomab1。

单克隆抗体鉴定：用流式细胞术FACS进一步检测杂交瘤细胞培养上清及腹水与人星形细胞(HSCs-T6)膜表面抗原的结合情况；SP免疫组织化学方法检测HAb18Gedomab1腹水与人肝纤维化组织的特异性结合；杂交瘤细胞株HAb18Gedomab1培养上清和小鼠腹水抗体滴度的测定。亚型鉴定为小鼠IgG1。

单克隆抗体HAb18Gedomab1的纯化方法：采用阳离子交换层析法，即FPLC系统SP Sepharose FF离子交换层析对HAb18Gedomab1腹水的粗提物进行纯化。洗脱液A液：0.02mol/L柠檬酸缓冲液(pH5.4)，B液：0.02mol/L柠檬酸缓冲液，1mol/L氯化钠(pH5.4)。流速1ml/min。

纯化后目的蛋白的鉴定：采用ELISA法和非还原聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶浓度5％，分离胶浓度10％，电泳缓冲液为PH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，参见附图2，图中1为200KD Marker，2为HAb18Gedomab1腹水，3为穿过峰，4为洗脱峰(即纯化的单抗HAb18Gedomab1)。

2、单抗HAb18Gedomab1轻、重链可变区基因的克隆、分析与重组。

所用细胞株为稳定分泌单抗HAb18Gedomab1杂交瘤细胞株HAb18Gedomab1，其分泌的抗体分子亚型为IgG1。

抗HAb18G/CD147胞外区蛋白单抗HAb18Gedomab1的可变区基因的克隆

取处于对数生长期的HAb18Gedomab1杂交瘤细胞(5×10⁶)，采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA，取少量进行紫外分光光度计定量及1％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测。随后以Oligo(dT)15(Promega公司)为随机引物，反转录合成cDNA第一链。然后，利用上述配对引物扩增产物Fd(约736bp)和全长轻链(约731bp)经低溶点琼脂糖凝胶(1.5％)电泳后，切胶分离靶片段。通过凝胶纯化试剂盒(promega Inc)回收纯化后，凝胶电泳鉴定，参见附图3，图中M为DL-2000Marker，1为HAb18Gedomab1重链可变区基因，2为HAb18Gedomab1轻链可变区基因。之后将目的片段克隆至T载体，测序分析参见附图4，5。

Oligo(dT)₁₅(Promega公司)为随机引物的反转录方案如下：20μL反应体系中依次加入1μg总RNA(2μL)，0.5ug随机引物Oligo(dT)₁₅(1μL)，4ulMgCL₂(25mM)2μL 5×dNTPs，2μL 10×缓冲液，0.5μL RNase抑制剂，加入反转录酶AMV 15U(0.75μL)，用水补至20μL，混匀，42℃水浴1h，煮沸3min，反应产物置于-20℃备用。

PCR扩增反映按常规方法进行：以上述产物为模板，分别用1对重链引物和1对轻链引物扩增抗体轻、重链可变区基因。反应体系为：模板cDNA2.5ul，dNTP(各0.4mM)，10×Buffer 5ul，Ex Taq DNA聚合酶1.25u，5’端和3’端引物各5ul(约30pmol)，加水至50ul，混匀，瞬时离心后，加入1-2滴液体石蜡，置PCR仪上反应。反应条件：94℃1min，54℃1min，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min。

目的片段T载体克隆测序方案如下：将PCR产物凝胶电泳分离后回收，连入pMD18-T载体。连接反应体系为：pMD18-T载体1ul，PCR产物凝胶纯化重链(或轻链)3ul，去离子水1ul，连接缓冲液5ul，混匀后4℃过夜，转化大肠杆菌JM109，筛选重组克隆，然后采用通用测序引物测序。

设计的HAb18Gedomab1单抗可变区基因PCR扩增引物序列如下：

小鼠重链V区5’端引物

5’-GGGGATATCCACCATGTACTTGGGACTGAACTGTGT-3’

小鼠重链V区3’端引物

5’-AGGCTTACTAGTACAATCCCTGGGCACAAT-3’

小鼠轻链V区5’端引

5’-GGGGATATCCACCATGGACACACAGACTCAGGTCTTTATA-3’

小鼠轻链V区3’端引物

5’-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3

序列分析表明，其VH基因与IG胚系基因HV6家族IGHV6S1*01基因同源性最高，其Fd基因与抗birch pollen allergen的小鼠单抗基因MMMABIP1H(NCBI：Y08908)及抗dsRNA的小鼠单抗基因VH10G1同源性最高(NCBI：AB050074)。其VL基因与IG胚系基因KV6家族的IGKV6-20*01基因同源性最高。其Lc基因与抗foot-and-mouth disease virus的小鼠单链抗体基因(NCBI：MMU68543)及抗anti-YGNNV的小鼠单抗基因同源性最高(NCBI：AF466699)。这说明，所得到的重链和轻链可变区基因均为可编码正确的小鼠抗体可变区的基因。

基于上述已克隆到的抗肝纤维化单抗HAb18Gedomab1轻、重链可变区基因或多肽产物，采用基因工程方法，可以构建成多种形式的基因工程抗体药物，也可以重构成多种形式的融合或重组蛋白药物，可以交联上调节细胞外基质改变的活性酶原或生物反应调节剂等作为前药，以用于逆转肝纤维化等基质沉积相关疾病的实验研究及临床应用。

从本发明所述的轻、重链可变区基因出发，可重组成的新型抗体主要有下列几种形式：(1)嵌合抗体。是用鼠MAb的V区与人Ig的C区连接而成为人-鼠嵌合抗体。其完整地保留了鼠MAb的特异性和亲和力，同时降低了HAMA等不良反应。(2)人源化抗体。针对可变区基因结构的人源化改造，包括CDR移植、表面氨基酸残基镶饰、骨架区交换、定位保留和表位导向选择等，从而不但降低了可变区的鼠源性同时又保持了鼠MAb的特异性和亲和力。(3)小分子抗体。主要有由VH-CH1和VL-C1组成Fab抗体、用一多肽(GLy4Ser)₃接头连接VH基因和VL基因而成的单链抗体、由VH和VL以非共价键结合而成Fv片段抗体、由VH或VL一个功能结构域组成的单域抗体、由单个CDR构成的最小识别单位等。(4)多价微型抗体。主要有双链抗体、(ScFv)₂、Flex微型抗体、LD微型抗体、F(ab’)₂、F(ab’)、(ScFv)等。(5)双特异性抗体。是一类具有双重特异性和双重功能的抗体，又称双功能抗体。(6)重组抗体融合蛋白。把Fab或Fv等基因片段，与非抗体的毒素或酶等其它蛋白基因连接形成的具有把特定的生物活性导向靶部位的一种重组蛋白。(7)噬菌体抗体。把Ig的V区基因与丝状噬菌体DNA上基因III或基因VIII连接经转染宿主菌后，使其在膜表面外壳蛋白表达Fab或ScFv的融合蛋白产物。通过对此产物多轮相关抗原的亲和吸附，从中淘筛出所需的特异性抗体。

以上述抗体或由其基因编码的多肽衍生的抗体为载体，交联上各种抗基质沉积的效应物质而形成的免疫偶联物或导向前药主要有下列几种形式：(1)抗体-基质调节剂偶联物。基质调节剂能单独调节细胞外的基质的沉积与降解已取得较好的疗效。但由于其输入体内后仅有部分到达作用靶部位，其调节作用得不到充分发挥且有毒副作用。将基质调节剂与单抗偶联，通过单抗携带其到达靶部位而充分发挥其降解基质的作用，使这些因子的作用更强，且更加专一。(2)抗体导向酶解前药。将抗体与药物专一性活化酶的偶联物注入体内，间隔一定时间后注入前药，使其在纤维化部位转化成高浓度有降解活性的药物，从而快速有效地降解细胞外沉积的基质。(3)免疫脂质体。将MAb偶联到脂质体的表面能充分将MAb与抗原特异性结合的导向性及脂质体能包裹大量药物的特性融为一体，再包埋上有关药物，则可提高药物靶向性和疗效。

3、单抗HAb18Gedomab1的体外生物学功能实验。

明胶酶谱实验：人星形细胞(HSCs-T6)培养至对数期，用0.25％胰酶消化，以10⁵/孔的密度接种于96孔板中，培养24h。弃去培养上清，换无血清培养液。加入终浓度为100μg/ml的单抗HAb18Gedomab1。并设立阴性对照孔。分别在10，20h收集无血清培养细胞上清。以明胶为底物配制一定体积的8％分离胶和5％浓缩胶，取培养上清与样品缓冲液混合物，上样开始电泳。电泳停止后，将胶放入Triton X-100溶液中复性，在明胶酶孵育缓冲液中孵育。染色、脱色、观察、拍片。实验结果，参见附图6，图中1为阴性对照(10h)，2为HAb18Gedomab1(10h)，3为阴性对照(20h)，4为HAb18Gedomab1(20h)。

I型胶原酶谱实验：方法同上，仅改变底物为I型胶原。实验结果参见附图7，图中1为阴性对照(10h)，2为HAb18Gedomab1(10h)，3为阴性对照(20h)，4为HAb18Gedomab1(20h)。

重组基底膜降解实验：在Millicell小室内膜上加入Matrigel胶，放至胶干。用2.5g/L胰酶消化HSC细胞，离心洗涤。用含0.1％BSA的RPIM-1640悬起，加入上室，同时在上室加入终浓度为100μg/ml的单抗HAb18Gedomab1。在小室的下室24孔板内加入500μl趋化剂。将24孔板放入37℃，5％CO2孵箱中培养20h。取出小室，弃去培养液，95％乙醇固定25min，滤膜HE染色，梯度酒精脱水，用棉签擦去上室中的Matrigel胶及细胞，切下滤膜；透明后封片。在40×光镜下计数膜背面侵袭的细胞数，随机计数膜上4个视野，每细胞计数3份，求出其平均值，测验重复3次。实验结果参见附图8，图中1为阴性对照，2为HAb18Gedomab1。

综上，明胶酶谱实验结果表明，HAb18Gedomab1抗体可促进MMP-2、MMP-9的生成；I型胶原酶谱实验结果表明，HAb18Gedomab1抗体可促进MMP-1、MMP-8的生成；重组基底膜降解实验检测表明，HAb18Gedomab1作用于HSC后可促进基底膜的降解。这些结果说明，HAb18Gedomab1单抗具有逆转肝纤维化等基质沉积相关疾病的潜力。

序列表

<110>陈志南

<120>HAb18Gedomab1单抗和其轻、重链可变区基因、编码多肽及应用

<160>4

<210>1

<211>336

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>V_region

<222>(1)...(336)

<400>1

gaa gtg aag ctt gag gag tct gga gga ggc ttg gtg caa cct gga gga 48

tcc atg aaa ctc tcc tgt gtt gcc tct gga ttc act ttc agt aac tac 96

tgg atg cac tgg gtc cgc cag tct cca gag aag ggg ctt gag tgg gtt 144

gct gaa att aga ttg aaa tct att aat tat gca aca cat tat gcg gag 192

tct gtg aaa ggg agg ttc acc atc tca aga gat gat tcc aaa agt agt 240

gtc tac ctg caa atg aac aac tta aga act gaa gac act ggc att tat 288

tac tgt acc agt tat gat tac gaa tac tgg ggc caa ggg act ctg atc 336

<210>2

<211>324

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>V_region

<222>(1)...(324)

<400>2

aac att gta atg acc caa tct ccc aaa tcc atg tcc atg tca gta gga 48

gag agg gtc acc ttg agc tgc aag gcc agt gag att gtg ggt act tat 96

gta tcc tgg tat caa cag aaa cca gaa cag tct cct aaa ctg ctg ata 144

tac ggg gca tcc aac cgg tac act ggg gtc ccc gat cgc ttc aca ggc 192

agt gga tct gca aca gat ttc act ctg acc atc agc agt gtg cag gct 240

gaa gac ctt gca gat tat cac tgt gga cag agt tac agc tat cca ttc 288

acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg gaa ata aaa cgg 324

<210>3

<211>112

<212>PRT

<213>小鼠

<220>

<221>V_segment

<400>3

1 5 10 15

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

20 25 30

Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

35 40 45

Asn Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Ile Asn Tyr Ala Thr

65 70 75

His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

80 85 90

Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Thr

95 100 105

Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Asp Tyr Glu Tyr

110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile

<210>4

<211>108

<212>PRT

<213>小鼠

<220>

<221>V_segment

<400>4

1 5 10 15

Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val

20 25 30

Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Ile Val Gly

35 40 45

Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp

65 70 75

Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

80 85 90

Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln

95 100 105

Ser Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu

Ile Lys Arg

Claims

1、一株抗HAb18G/CD147胞外区蛋白的单克隆抗体HAb18Gedomab1，其特征在于以HAb18G/CD147胞外区蛋白免疫小鼠后所制备的特异性的杂交瘤细胞株HAb18Gedomab1，其染色体数在58-126，众数104-126，所分泌的抗体亚型为IgG1。

2、权利要求1所述的单抗HAb18Gedomab1的重链可变区基因，其具有序列表<400>1的序列。

3、由权利要求2基因所编码的多肽产物，其具有序列表<400>3的序列。

4、权利要求1所述的单抗HAb18Gedomab1的轻链可变区基因，其具有序列表<400>2的序列。

5、由权利要求4基因所编码的多肽产物，其具有序列表<400>4的序列。

6、以所述的单克隆抗体HAb18Gedomab1或其重组蛋白或蛋白衍生物作为制备逆转肝纤维化治疗剂的应用。

7、以所述的单抗HAb18Gedomab1的重链可变区基因或其编码的多肽产物出发，重组成各种形式的基因工程抗体或抗体衍生物，作为制备逆转肝纤维化治疗剂的应用。

8、以所述的单抗HAb18Gedomab1的轻链可变区基因或其编码的多肽产物出发，重组成各种形式的基因工程抗体或抗体衍生物，作为制备逆转肝纤维化治疗剂的应用。