CN1780854A - 具有延长时间作用的胰岛素类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了胰岛素类似物A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg，其提供延长且平稳的基础持续作用。本发明也提供了治疗糖尿病的方法，其包括施与胰岛素类似物。
Description
本申请要求2003年4月29日申请的美国临时申请号60/466,501的优先权、2003年4月29日申请的美国临时申请号60/466,500的优先权、2003年5月13日申请的美国临时申请号60/470,118的优先权，上述各文件此处引用作为参考。
发明领域
本发明涉及用于治疗以糖尿病为特征的高血糖症的胰岛素类似物。
发明背景
对胰岛素的生理性需要可分为两个阶段：a)营养吸收阶段，其需要脉冲量的胰岛素以分解与进餐相关的血液葡萄糖激增，b)吸收后的阶段，其需要胰岛素的持续释放从而调节肝脏葡萄糖的输出以维持最佳的空腹血液葡萄糖水平，这又称为“基础性”胰岛素分泌。
对糖尿病人有效的胰岛素治疗通常包括联合运用两种类型的外源性胰岛素制剂：一种为通过大丸剂注射而提供的进餐时间速效胰岛素，以及一种为每日1-2次注射施用以调节进餐间隔期血液葡萄糖水平的长效胰岛素。
理想的外源基础性胰岛素可提供延长而“平坦”的时间作用-即能控制血液葡萄糖水平至少12小时，并且优选地为24小时而没有明显的低血糖风险。
所用的商业化长效胰岛素分子不能提供24小时的胰岛素效应。因此，仍需要提供胰岛素效应长达24小时的胰岛素分子。
发明概述
本发明提供了胰岛素类似物A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素。本发明也提供了包含胰岛素类似物A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素的组合物。在一个优选的实施方案中，该组合物为药物组合物。
本发明也提供了胰岛素类似物A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素。本发明也提供了包含胰岛素类似物A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素的组合物。在一个优选的实施方案中，该组合物为药物组合物。
本发明也提供了治疗高血糖症的方法，该方法包括将本发明的胰岛素类似物以足以调节血液葡萄糖浓度的量施与受试对象。
发明详述
本发明的A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素类似物可显示为具有式I的A链和式II的B链。
“式I”为：
A0 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14
Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-
A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21
Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly(Seq.ID No.1).
式I中A0至A21位置的氨基酸分别对应于Seq.ID No.1中1至22位的氨基酸。式I中A1至A20位置和Seq.ID No.1中2至21位的氨基酸对应于人胰岛素A链(Seq.ID No.3)1-20位的氨基酸。
“式II”为
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu
B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30
Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
B31 B32
Arg-Arg(Seq.ID No.2).
式II中B1至B32位置的氨基酸分别对应于Seq.ID No.2中1至32位的氨基酸。式II中B1至B30位置和Seq.ID No.2中1-30位置的氨基酸对应于人胰岛素B链(Seq.ID No.4)1-30位置的氨基酸。
来自众多不同物种的胰岛素分子的多核苷酸序列和氨基酸序列为本领域内普通技术人员熟知。优选地，″胰岛素″指人胰岛素。“人胰岛素”具有一条21个氨基酸的A链，其氨基酸序列为Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(Seq.ID No.3)；一条30个氨基酸的B链，其氨基酸序列为Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(Seq.ID No.4)。
人胰岛素A链、B链和本发明A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素类似物的A链、B链通过二硫键交联。一个链间二硫键在式I中A7位置的Cys残基和式II中B7位置的Cys残基之间，另一个链间二硫键在式I中A20位置的Cys残基和式II中B19位置的Cys残基之间。一个链内二硫键在式I中A6和A11位置的Cys残基之间。
如此处用一种简化符号表示胰岛素分子和胰岛素原分子。对于A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素，参照式I的A链(Seq.ID No.1)、式II的B链(Seq.ID No.2)、人胰岛素A链(Seq.ID No.3)、人胰岛素B链(Seq.ID No.4)设定符号。A0Arg意指精氨酸共价连接于Seq.ID No.3中A1位置的甘氨酸。A21Gly意指野生型人胰岛素(Seq.ID No.3)中天冬酰胺替换为甘氨酸。B31Arg意思是精氨酸共价连接于Seq.ID No.4中B30位置的苏氨酸。B32Arg意思是精氨酸共价连接于Seq.ID No.2中B31位置的精氨酸。总之，对野生型人胰岛素A链和B链的这些改变提供了胰岛素类似物“A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素”。符号“A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素”与符号“A0Arg，A21Gly，B31Arg，B32Arg-人胰岛素”和符号“ArgA0，GlyA21，ArgB31，ArgB32-人胰岛素”同义。
本发明的A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素类似物可表示为具有式I的A链和式III的B链。如上述讨论，“式I”为：
A0 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14
Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-
A15 A16 A17 A18 A19 A20 A21
Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Gly(Seq.ID No.1).
“式III”为：
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 B12 B13 B14 B15
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu
B16 B17 B18 B19 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B26 B27 B28 B29 B30
Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Arg-Thr
B31 B32
Arg-Lys(Seq.ID No.5).
式III中B1至B32位置的氨基酸分别对应于Seq.ID No.5第1-32位置的氨基酸。式III中B1至B28和B30位置的氨基酸以及Seq.ID No.5第1-28和第30位置的氨基酸对应人胰岛素B链(Seq.ID No.4)第1-28和第30位置的氨基酸。
一个链间二硫键位于式I中A7位置的Cys和式III中B7位置的Cys之间，另一个链间二硫键位于式I中A20位置的Cys和式III中B19位置的Cys之间。一个链内二硫键位于式I中A6和A11位置的Cys之间。
使用前述简化符号，A0Arg意指精氨酸共价连接于Seq.ID No.3中A1位置的甘氨酸。A21Gly意指野生型人胰岛素(Seq.ID No.3)中天冬酰胺替换为甘氨酸。B29Arg意指野生型人胰岛素B29位置的赖氨酸替换为精氨酸。B31Arg意指精氨酸共价连接于Seq.ID No.4中B30位置的苏氨酸。B32Lys意指赖氨酸共价连接于Seq.ID No.5中B31位置的精氨酸。概而言之，对野生型人胰岛素A链和B链的这些改变提供了胰岛素类似物“A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素”。符号“A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素”与符号“A0Arg，A21Gly，B29Arg，B31Arg，B32Lys-人胰岛素”和符号“ArgA0，GlyA21，ArgB29，ArgB31，LysB32-人胰岛素”同义。
本发明也提供了分子中一个或多个精氨酸(Arg)替换为高精氨酸(hArg)的胰岛素类似物和胰岛素原类似物。因此本发明提供了例如A0hArgA21GlyB31hArgB32hArg-人胰岛素，A0hArgA21GlyB29hArgB31hArgB32Lys-人胰岛素，A0hArgA21GlyB31hArgB32hArg-人胰岛素原，A0hArgA21GlyB29hArgB31hArgB32Lys-人胰岛素原。
术语“宿主细胞”和“该宿主细胞”指单个宿主细胞和多于一个宿主细胞。
如此处所用的“胰岛素分子”包括野生型胰岛素和胰岛素类似物。
如此处所用的“胰岛素原分子”包括野生型胰岛素原和胰岛素原类似物。
“胰岛素类似物”是指经修饰而不同于野生型胰岛素的胰岛素分子。因此，胰岛素类似物可具有与人胰岛素A链和B链氨基酸序列基本相同的A链和/或B链，但是通过在人胰岛素A链和B链中具有一个或多个氨基酸缺失、和/或在人胰岛素A链和B链中具有一个或多个氨基酸替换、和/或将一个或多个氨基酸共价连接至A链和/或B链的氨基端和/或羧基端而不同于人胰岛素A链和B链。
“胰岛素原类似物”是经修饰后不同于野生型胰岛素原的胰岛素原分子。因此，胰岛素原类似物可分别具有与人胰岛素原A-链、B-链和C-肽的氨基酸序列基本相同的A-链、B-链和C-肽，但通过胰岛素原类似物A链、B链或C肽内具有一个或多个氨基酸缺失和/或一个或多个氨基酸替换而不同于人胰岛素原A-链、B-链和C-肽。在一个优选的实施方案中，胰岛素原类似物为A21Gly-人胰岛素原，其去除连接肽后，产生A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素。在另一个优选的实施方案中，胰岛素原类似物为A21GlyB29ArgB32Lys-人胰岛素原，其去除连接肽后，产生A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素。在另一个实施方案中，胰岛素原类似物为A21GlyB0LysB29ArgB32Lys-人胰岛素原，其去除连接肽后，产生A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素。在一个优选的实施方案中，胰岛素原类似物得以纯化。在另一个优选的实施方案中，胰岛素原类似物得以分离。
“胰岛素模板”意为经化学修饰以形成本发明的胰岛素类似物的胰岛素分子。可经一系列化学修饰的用作模板的胰岛素分子包括但不限于任何一种天然存在的胰岛素并优选地为人胰岛素。胰岛素模板优选地为重组胰岛素。胰岛素模板更为优选地为重组人胰岛素或其类似物。胰岛素模板最优选地为重组人胰岛素。
“重组蛋白质”意为在真核或原核细胞内从含有编码蛋白质的多核苷酸序列的表达载体表达的蛋白质。优选地，重组蛋白质为重组胰岛素分子。
“重组胰岛素分子”是在真核或原核细胞内从含有编码胰岛素分子A-链和/或B-链的多核苷酸序列的表达载体表达的胰岛素分子。
“重组胰岛素原分子”是在真核或原核细胞内从含有编码胰岛素原分子A-链、B-链和连接肽的多核苷酸序列的表达载体表达的胰岛素原分子。在一个优选的实施方案中，重组胰岛素原分子是A21Gly-人胰岛素原。在另一个优选的实施方案中，重组胰岛素原分子是A21GlyB29ArgB32Lys-人胰岛素原。
“重组人胰岛素”意为具有野生型(即天然的)人胰岛素A链(Seq.IDNo.3)和B链(Seq.ID No.4)氨基酸序列的重组胰岛素。
“足以调节受试者血葡萄糖”意为胰岛素分子的施用导致临床上正常的空腹血浆葡萄糖水平。临床上正常的空腹血浆葡萄糖水平为70-110mg/dl。临床上正常的餐后血浆葡萄糖水平小于140mg/dl。为本领域内普通技术人员熟知，胰岛素效应可由“葡萄糖钳夹”技术定量，即以维持一段时间预设血浆葡萄糖水平的外源葡萄糖需要量而衡量胰岛素分子引起的胰岛素效应持续时间和强度。例见“Burke等，Diabetes Research，4：163-167(1987)”。一般地，在葡萄糖钳夹研究中，葡萄糖由静脉内输入。若胰岛素分子导致血浆葡萄糖水平下降，则增加葡萄糖输入速率，从而预设血浆葡萄糖水平得以维持。当胰岛素分子效应减弱，则降低葡萄糖输入速率，从而预设血浆葡萄糖水平得以维持。
“胰岛素效应”意为在葡萄糖钳夹研究中，胰岛素分子的施用需要静脉内血葡萄糖施与速率的增加以维持葡萄糖钳夹实验中受试者预设的血浆葡萄糖水平。在一个优选的实施方案中，预设的葡萄糖水平为正常空腹血浆葡萄糖水平。在另一个优选的实施方案中，预设的葡萄糖水平为正常餐后血浆葡萄糖水平。
若一种胰岛素分子对高血糖症如糖尿病患者提供的胰岛素效应持续时间超过人胰岛素，则该胰岛素分子具有“延长的作用持续时间”。在一个优选的实施方案中，单次施与胰岛素分子后，胰岛素分子提供约8小时至约24小时的胰岛素效应。在另一个优选的实施方案中，胰岛素效应持续约10小时至约24小时。在另一个优选的实施方案中，胰岛素效应持续约12小时至约24小时。在另一个优选的实施方案中，胰岛素效应持续约16小时至大约24小时。在另一个优选的实施方案中，胰岛素效应持续约20小时至大约24小时。
若一种胰岛素分子单次施与可使受试者葡萄糖降低效应持续约24小时，则该胰岛素分子具有“基础的胰岛素效应”。在一个优选的方案中，胰岛素分子单次施用后在约24小时的期间可提供接近稳定量(也即无峰值)的葡萄糖降低效应。
本发明的胰岛素类似物或组合物的“有效量”是在施与需要胰岛素治疗的受试者时产生所需的胰岛素效应而没有不可接受副作用的量。施与受试者本发明的胰岛素类似物的“有效量”也取决于疾病类型和严重程度和受试者特征如总体健康状况、年龄、性别、体重和对药物的耐受等。熟练的技术人员根据这些及其它因素将能够决定适当的剂量。一般地，本发明的胰岛素类似物的治疗有效量对成年人可为大约0.01mg每日至大约1000mg每日之间。剂量优选地为大约0.1mg每日至大约100mg每日，更优选地为大约1.0毫克/日至大约10毫克/日。
剂量、施与途径和每日施与次数由内科医生考虑下列因素如治疗目标、病人的疾病性质和原因、病人的性别和体重、运动水平、饮食习惯、施与方法和其它内科医生熟知的因素后决定。在较宽范围内，每日剂量将在大约1nmol/Kg体重至大约6nmol/Kg体重(认为6nmol等同于约1单位胰岛素活性)。大约2至大约3nmol/Kg之间的剂量是一般的当前胰岛素疗法。
本发明提供包含本发明的胰岛素类似物的容器。在一个优选的实施方案中，容器为小瓶。在另一个优选的实施方案中，小瓶含有包含本发明的胰岛素类似物的药学制剂。在另一个优选的实施方案中，容器为用于递送装置如胰岛素笔式注射系统中的药筒。本发明也提供了包括药筒的胰岛素笔式注射系统，其中所述药筒含有包含本发明胰岛素类似物的药学制剂。本发明也提供了含有包含本发明胰岛素类似物的药学制剂的单位剂量系统。
“所需的治疗效应”包括下列一种或多种情况：1)糖尿病相关(诸)症状的改善、2)与糖尿病关联的诸症发生的延迟、3)与未治疗相比增加的寿命和4)与未治疗相比更好的生活质量。例如本发明的胰岛素类似物对糖尿病治疗的“有效量”是与不治疗相比导致更好的血葡萄糖浓度的调节，从而导致糖尿病并发症如视网膜病变、神经病变或肾病等发生延迟的量。
本发明提供治疗高血糖症的方法，该方法包括以足以调节受试者血葡萄糖浓度的量对受试者施与本发明的胰岛素类似物、组合物和药物组合物。在一个优选的实施方案中，受试者因糖尿病接受治疗。
本发明提供本发明的胰岛素类似物的用途，用于制备治疗高血糖症的药物。本发明也提供了本发明胰岛素类似物的用途，用于制备治疗糖尿病的药物。
本发明的胰岛素类似物及其组合物可以肠胃外施与。肠胃外施与包括例如全身施与例如肌肉内、静脉内、皮下或腹膜内注射。肠胃外施与途径优选地为皮下。
“受试者”意为哺乳动物，优选地为人，但也可为动物如陪伴动物(如狗、猫等)、农场动物(如奶牛、绵羊、猪、马等)和实验室动物(如大鼠、小鼠、豚鼠等)。
此处所用“分离的蛋白质”是指蛋白质从其产生的环境中移出。当天然存在的蛋白质从该蛋白质存在的细胞环境中移出时，则所述天然存在的蛋白质得以分离。当重组蛋白质从表达其的细胞环境中移出时，则所述重组蛋白质得以分离。当经化学修饰的天然存在蛋白质或经化学修饰的重组蛋白质从所述蛋白发生化学修饰的反应混合物中移出时，则所述经化学修饰的蛋白质得以分离。分离的蛋白质优选地从其它蛋白质、多肽、肽中被移出。分离蛋白质的方法包括离心、层析、冻干或电泳。这些蛋白质分离方法和其它方法为本领域普通技术人员所熟知。本发明中的胰岛素类似物和胰岛素原类似物优选地为被分离。
用以产生本发明的胰岛素类似物或胰岛素原类似物的氨基酸可为D-或L-型，可为天然存在的氨基酸或人造氨基酸。
在一个优选的实施方案中，本发明的胰岛素类似物未与脂肪酸共价结合。在另一个优选的实施方案中，本发明的胰岛素类似物未与脂肪酸酰化。
“可药用”意为临床上适合施与人。可药用制剂不含毒性成分、不合需要的污染物或其它等，并且不干扰其中活性化合物的活性。
“药物组合物”意为临床上可接受的施与人类受试者的组合物。本发明的胰岛素类似物可在药物组合物中制剂，这样蛋白质与一种或多种无机碱和无机或有机酸形成盐。因此本发明的组合物和药物组合物可包含本发明的胰岛素类似物的盐。
通常使用的形成酸加成盐的酸为无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸等和有机酸如对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、琥珀酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸、三氟乙酸等。此类盐的实例包括硫酸盐、焦硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、亚硫酸氢、磷酸盐、磷酸一氢盐、磷酸二氢盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、乙酸盐、丙酸盐、癸酸盐、辛酸盐、丙烯酸盐、甲酸盐、异丁酸盐、己酸盐、庚酸盐、丙炔酸盐、草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、辛二酸盐、癸二酸盐、延胡索二酸盐、顺丁烯二酸盐、丁炔-1，4二酸盐、己炔-1，6二酸盐、苯甲酸盐、氯苯甲酸盐、甲基苯甲酸盐、二硝基苯甲酸盐、羟基苯甲酸盐、甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸盐、磺酸盐、二甲苯磺酸盐、苯乙酸盐、苯丙酸盐、苯丁酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、γ-羟基丁酸盐、羟基乙酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、丙磺酸盐、1-萘磺酸盐、2-萘磺酸盐、苯乙醇酸盐等。
碱加成盐包括那些从无机碱如氨、碱金属、碱土金属氢氧化物、碳酸盐、重碳酸盐等衍生的盐。在制备本发明的盐中有用的碱因此包括氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、碳酸钾等。
本发明的药物组合物优选地为酸性水溶液。在一个优选的实施方案中，酸性水溶液pH为从大约3至大约5，这里“大约”意为加或减0.1pH单位。在另一个优选的实施方案中，pH为从大约3.5至大约4.5。在另一个优选的实施方案中，pH为从大约3.75至大约4.25。在另一个优选的实施方案中，酸性水溶液pH为大约4。酸性水溶液pH最优选地为4。
本发明的胰岛素类似物和其组合物可与作为高血糖症治疗的药物组合物的部分的一种或多种药学可接受赋形剂、载体和稀释剂一起施与受试者。于此提供的组合物包含本发明的胰岛素类似物和选自等张剂、二价阳离子、六聚体稳定化合物、防腐剂和缓冲剂中的至少一种成分。
合适的药学载体可含有不与本发明的胰岛素类似物相互作用的惰性成分。可使用如Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，PA中描述那些标准药学制剂技术。适于肠胃外施与的药学载体包括如灭菌水、生理盐水、抑菌盐水(盐水中包含约0.9％mg/ml苯酚)、磷酸盐缓冲盐水、Hank′s溶液、Ringer′s-乳酸和其它等。一些合适的赋形剂实例包括甘油、乳糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇和甘露醇。
“等张剂”意为生理上可耐受并赋予制剂合适的张力以阻止水跨越与所使用制剂接触的细胞膜的净流动的化合物。甘油(又名丙三醇)和甘露醇是通常使用的等张剂。其它等张剂包括盐如氯化钠和单糖如葡萄糖和乳糖。甘油是优选的等张剂。本发明的组合物和药物组合物可包含等张剂。
“六聚体稳定化合物”意为以六聚体方式存在且使本发明的胰岛素类似物稳定的非蛋白质的小分子量化合物。酚类化合物尤其是酚类防腐剂是众知的使胰岛素分子稳定的化合物。六聚体稳定化合物优选地为苯酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、对羟基苯甲酸甲酯中一种或上述化合物中两种或多种的混合剂。六聚体稳定化合物更优选地为苯酚、间甲酚、或其混合剂。本发明的组合物和药物组合物可包含六聚体稳定化合物。
“防腐剂”指添加到药学制剂中作为抗微生物剂而发挥作用的化合物。本发明制剂中使用的防腐剂可为酚类防腐剂并且与六聚体稳定化合物可相同或不同。肠胃外制剂必须符合防腐剂效力规范成为商业上可行的多用途产品。氯化苯甲烷铵、苯乙铵、氯乙醇、苯酚、间甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、硝酸苯汞、硫汞柳酸钠、苯甲酸、苯甲酸丁酯、苯甲酸乙酯、苯氧基乙醇、苯乙醇、苯甲酸丙酯、苯基氯甲酚、氯甲酚及其多种的混合剂是本领域内众知有效且为肠胃外制剂可接受的防腐剂。本发明的组合物和药物组合物可包含防腐剂。
“酚类防腐剂”包括化合物苯酚、间甲酚、邻甲酚、对甲酚、氯甲酚、苯甲酸甲酯及其混合剂。某些酚类防腐剂如苯酚和间甲酚已知结合胰岛素样分子从而诱导提高物理、化学稳定性或两者稳定性的构象的变化。酚类防腐剂优选地为间甲酚或苯酚。本发明的组合物和药物组合物可包含酚类防腐剂。
“缓冲剂”或“可药用缓冲剂”意为在胰岛素制剂中可安全使用并具有调节制剂的pH至制剂所需pH的化合物。本发明的组合物和药物组合物可包含可药用缓冲剂。可药用调节pH至中等酸性pH到中等碱性pH的缓冲剂包括下列化合物如乳酸盐、酒石酸盐、磷酸盐尤其磷酸钠、乙酸盐尤其乙酸钠、柠檬酸盐尤其柠檬酸钠、精氨酸、TRIS和组氨酸。“TRIS”是指2-氨基-2-羟甲基-1，3，-丙二醇及其任何可药用盐。游离碱和盐酸形式是TRIS的两种常见形式。本领域内TRIS又称为三羟甲基氨基甲烷、缓血酸胺、3(羟基-甲基)氨基甲烷。其它合适的调节pH至所需水平的可药用缓冲剂为普通药剂师熟知。
本发明的胰岛素类似物可为也使用进餐时间胰岛素分子的受试者使用。一种优选的进餐时间胰岛素分子是B28LysB29Pro-胰岛素(所谓“赖脯”胰岛素)，该分子中野生型胰岛素B链(Seq.ID No.4)28位置的Pro和野生型胰岛素B链(Seq.ID No.4)29位置的Lys被转换。例见美国专利号5,514,646、5,474,978和5,700,662。另一种进餐时间胰岛素分子是B28Asp-胰岛素，该分子中B链28位置的野生型Pro已为Asp替换。见美国专利号5,547,930。另一种进餐时间胰岛素分子为B3LysB29Glu-胰岛素。见美国专利号6,221,633。
本发明的胰岛素类似物可复合合适的二价金属阳离子。“二价金属阳离子”意为参与同多个蛋白分子形成复合物的离子。过渡金属、碱金属和碱土金属是已知与胰岛素形成复合物的金属离子的例子。过渡金属是优选的。二价金属阳离子优选地为一种或多种选自锌离子、铜离子、钴离子、镁离子、钙离子、镉离子、镍离子和铁离子的阳离子。锌更为优选地为二价金属阳离子。锌优选地以盐提供，如硫酸锌、氯化锌、氧化锌或乙酸锌。
为得到本发明的胰岛素类似物与二价金属阳离子的复合物，将蛋白质溶解于同时存在金属盐的适合的缓冲液内。使混合物在环境温度下孵育而使复合物沉淀。适合的缓冲剂为那些可维持混合物pH至大约3.0到9.0而不干扰复合反应的缓冲液。实例包括磷酸盐缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和Good′s缓冲液如HEPES、Tris和Tris乙酸盐。合适的金属盐是那些其中的金属为复合反应可得的盐。合适的锌盐实例包括氯化锌、乙酸锌、氧化锌、硫酸锌。
本发明的胰岛素类似物可利用重组方法获得。例如可利用重组的胰岛素原类似物。另外，重组胰岛素A-和B-链可在宿主细胞内表达然后重新组合。或者利用胰岛素前体分子。这些方法中的每一种均为本领域内普通技术人员熟知。例见美国专利号4,421,685、美国专利号4,569,791、美国专利号4,569,792、美国专利号4,581,165、美国专利号4,654,324、美国专利号5,304,473、美国专利号5,457,066号、美国专利号5,559,094、欧洲专利申请EP 741188A1。也见Chance等，Diabetes Care 16(Suppl 3)：133-142(1993)、Chance等，Proceedings of the 7th American Peptide Symposium中“肽：合成-结构-功能”、Rich，D.H.等编Pierce Chemical Company，Rockford，IL，pp.721-738(1981)和Frank等Munch med Wsch 125(Suppl.1)：S14-20(1983)。
胰岛素原类似物可经羧肽酶B和胰蛋白酶的切割而酶法加工形成胰岛素类似物。此外，胰岛素原类似物也可以赖氨酰内蛋白酶如LysC内蛋白酶和胰蛋白酶切割。调节酶切反应条件以便赖氨酰内蛋白酶不切割B29Lys。
用于培养细胞的培养基可为任何常规的适合生长宿主细胞的培养基如基本培养基或含有适当补充成分的复合培养基。适合的培养基可自供应商获得或自公开发表(如在美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)目录中)的配方制备。然后细胞生产的肽可用常规步骤包括：通过离心或过滤将宿主细胞从培养基中分离、通过盐如硫酸铵等沉淀上清和过滤物中的蛋白质成分、通过多种层析步骤进行纯化如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析以及其它取决于目的肽类型的步骤等从培养基中回收。
本发明也提供了包含编码本发明的胰岛素原类似物的核酸序列的核酸。在一个优选的实施方案中，胰岛素原类似物为A21Gly-人胰岛素原。在另一个优选的实施方案中，胰岛素原为A21GlyB29ArgB32Lys-人胰岛素原。
本发明也提供了包含编码本发明胰岛素原类似物的核酸序列的载体。本发明也提供了包含该载体的宿主细胞。在一个优选的实施方案中，宿主细胞为真核细胞。真核细胞优选地为真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或永生化的哺乳动物细胞系细胞。真核细胞更为优选地为酵母细胞。在另一个优选的实施方案中，宿主细胞为原核细胞。原核细胞优选地为细菌细胞，更为优选地为大肠杆菌(E.coli)细胞。
本发明也提供了包含本发明的胰岛素原类似物的组合物。在一个优选的实施方案中，也提供了包含本发明的胰岛素原类似物的细胞培养基。
也提供了表达本发明的胰岛素原类似物的方法，包括在适合宿主细胞的增殖和胰岛素原类似物的表达的条件下培养含有编码本发明的胰岛素原类似物的核酸序列的宿主细胞。在一个优选的实施方案中，该方法进一步包括从宿主细胞中纯化胰岛素原类似物。在另一个优选的实施方案中，该方法进一步包括从培养基中纯化胰岛素原类似物。在另一个优选的实施方案中，该方法进一步包括从宿主细胞和培养基中纯化胰岛素原类似物。
也提供了表达本发明的类似物的重组方法，包括a)在适合宿主细胞的增殖和胰岛素原类似物表达的条件下培养含有编码具有连接肽序列的胰岛素原类似物的核酸序列的宿主细胞，b)纯化胰岛素原类似物并除去连接肽。在一个优选的实施方案中，用一种或多种酶如胰蛋白酶和/或羧肽酶B除去连接肽。在另一个优选的实施方案中，前导肽存在于胰岛素原类似物内并且前导肽被除去。
本发明也提供了包含编码本发明的胰岛素类似物A-和/或B-链的核酸序列的核酸。在一个优选的实施方案中，胰岛素类似物为A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素。在另一个优选的实施方案中，胰岛素类似物为A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素。在表达和纯化后，使胰岛素类似物A-和B-链组合形成本发明的胰岛素类似物。
本发明也提供了包含编码本发明的胰岛素类似物A-和/或B-链的核酸序列的载体。本发明也提供了包含该载体的宿主细胞。在一个优选的实施方案中，宿主细胞为真核细胞。真核细胞优选地为真菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或永生化的哺乳动物细胞系细胞。宿主细胞更为优选地为酵母细胞。在另一个优选的实施方案中，宿主细胞为原核细胞。原核细胞优选地为细菌细胞，更为优选地为大肠杆菌细胞。
也提供了表达本发明的胰岛素类似物的方法，包含在适合宿主细胞的增殖和A-和/或B-链的表达的条件下培养含有编码本发明的胰岛素类似物A-和/或B-链的核酸序列的宿主细胞。在一个优选的实施方案中，该方法进一步包含从宿主细胞中纯化A-和/或B-链。在另一个优选的实施方案中，该方法进一步包括从培养基中纯化A-和/或B-链。在另一个优选的实施方案中，该方法进一步包含从宿主细胞和培养基中纯化A-和/或B-链。
编码胰岛素原类似物或A-和/或B-链的核酸序列可插入任何便于进行重组DNA步骤的载体内，且载体的选择常常取决于载体将要导入的宿主细胞。因此载体可为自主复制的载体，即作为染色体外的实体而存在，其复制独立于染色体的复制的载体如质粒。此外，载体也可为一种导入宿主细胞后整合进入宿主细胞基因组而与被整合(诸)染色体共同复制的载体。
载体优选地为编码肽的DNA序列有效地连接至DNA转录所需额外的核酸序列如启动子的表达载体。启动子可为在所选择的宿主细胞内表现转录活性的任何DNA序列并且可来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质基因。在多种宿主细胞内指导编码本发明肽的DNA序列转录的合适启动子实例为本领域公知。
编码肽的DNA序列根据需要可有效地连接合适的终止子、多聚腺苷酸化信号、转录增强子序列和翻译增强子序列。本发明的重组载体可进一步包含使该载体所在讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。
载体也可包含可选择的标记，如其基因产物互补宿主细胞内的缺陷或其产物提供对药物如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或甲氨蝶呤抗性的基因。
为指导本发明的亲本肽进入宿主细胞的分泌途径，在重组载体中提供分泌性信号序列(又称为前导序列、前原序列或前序列)。分泌性信号序列按正确阅读框连接编码肽的DNA序列。分泌性信号序列一般位于编码肽的DNA序列5’端。分泌性信号序列可为通常与该肽联合的序列或源于编码另一个分泌性蛋白质的基因。
本发明也提供了包含本发明的胰岛素原类似物的细胞培养基。本发明也提供了包含本发明的胰岛素类似物A-和/或B-链的细胞培养基。在一个优选的实施方案中，该培养基也含有宿主细胞物质。在另一个优选的实施方案中，培养基内基本无宿主细胞物质。
本发明的胰岛素类似物也可由固相肽合成技术的标准方法制备。肽合成仪可从如Applied Biosystems in Foster City CA商业地获得。固相合成使用的试剂可从如Midwest Biotech(Fishers，IN)商业地获得。在一个实施方案中，自动固相肽合成仪根据制造商用法说明用于封闭干扰基团、保护欲反应的氨基酸、偶联、脱偶联和对未反应的氨基酸加帽。在另一个实施方案中，自动固相肽合成仪根据制造商用法说明通过氨基酸偶联、对未反应α-氨基酸加帽、去保护的连续循环用于合成肽。
使用标准自动化固相合成程序以叔丁氧基羰基或芴基甲氧羰基-α氨基酸和适当的侧链保护反应合成肽。合成完成后，以标准氢氟酸法或TFA法将肽从固相支持物上切下及同时的侧链去保护。然后粗肽得以纯化，例如利用在Vydac C18柱上以所有溶剂均含0.1％TFA的水-乙腈线性梯度的反相层析法纯化。将肽从含0.1％TFA、乙腈和水的溶液中冻干以去除乙腈和水。分析性反相层析验证肽纯度。质谱法验证肽身份。肽可以溶解于中性pH的水缓冲剂中。
实施例1
以Boc-Arg(Pbf)-NHS酯酰化A21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素产生
A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素
Boc-Arg(Pbf)-OH、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)各0.4mml在二氯甲烷中混合30分钟制备Boc-Arg(Pbf)-NHS酯(0.4mmol)。反应混合物过滤后，在旋转蒸发器中浓缩至干燥，溶解于4mlMeOH中。将180mg A21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素(0.030mmol)溶解于20ml含有50mmol Na2HPO4的50∶50水/CH3CN内，以5M KOH溶液调节pH至7.7。向胰岛素溶液内加入1.2ml Boc-Arg(Pbf)-NHS酯溶液(0.12mmol)。反应物室温搅拌50分钟，然后加入另外1.2mlBoc-Arg(Pbf)-NHS酯溶液(0.12mmol)，使其反应另外30分钟，随后以100μl TFA酸化。样品在Zorbax Eclipse XDB-C84.6mm i.d.×15cm柱上以10％-100％B经15分钟的线性AB梯度而在线性梯度中A＝0.05％TFA/H2O同时B＝在60∶40 CH3CN∶H2O中0.05％TFA且流速为1ml/分钟的反相HPLC和质谱检测(LC-MS)分析。混合物内含一些未衍生的蛋白质，三个单酰化峰的相对比率为7.5∶1.5∶1而三个二酰化峰的相对比率为2∶5∶3。
基于以前的实验，主要的单酰化产物预期为源于A链N末端酰化的产物。这是进行分离和表征的化合物。反应混合物在流速8ml/分钟的Kromasil C18 1.2cm i.d.×25cm制备柱(10μm颗粒大小)上纯化。样品用0-20％B经15分钟后接20％-70％B经100分钟的二阶线性AB梯度洗脱，其中A＝0.05％TFA/H2O而B＝0.05％TFA/CH3CN。合并且纯化的物质经冻干后产生28mg主要的单衍生化化合物。冻干的蛋白质溶解于20ml的94∶2∶2∶2 TFA∶苯甲醚∶三异丁基硅烷∶MeOH中并置室温1.5小时。样品在旋转蒸发器上蒸发至＜2mL，以25ml 10∶90乙腈∶水稀释并经乙醚抽提3次。最后的纯化过程如上述进行但使用0-15％B经15分钟后接15％-55％B经100分钟的二阶线性AB梯度。合并的纯化级分冻干且产量为21mg(大约12％产率)。观测的分子量为6218.3(计算分子量＝6210.1)。产物的身份通过0.1mg蛋白质以5μg内蛋白酶Glu-C(来自金黄色葡萄球菌V8，SigmaP6181)在pH8缓冲液，37℃下2小时的消化而确认。得到的混合物的LC-SM分析显示存在可辨认的片段A(1-4)+Arg、A(1-17)-B(1-13)+Arg和A(5-17)-B(1-13)，因此证实加入的Arg残基定位在A链N末端。
实施例2
体外的受体亲和力
胰岛素类似物对人胰岛素受体(IR)的亲和力在使用放射性标记配体[125I]胰岛素的竞争性结合试验中测定。人胰岛素受体膜通过过量表达受体的稳定转染的293EBNA细胞P1膜制备而得。分析方法在获得可比结果的过滤和SPA(闪烁迫近分析)模式下进行和验证，但在使用AmershamPharmacia Biotech.公司经PVT PEI处理的小麦凝集素偶联SPA珠，A型(WGA PVT PEI SPA)珠的SPA模式下进行。
放射标记的配体([125I]重组人胰岛素)可自制或购自AmershamPharmacia Biotech.公司，参考日期的比放射活性为2000Ci/mmol。SPA分析缓冲液为50mM Tris-HCL，pH 7.8、150mM NaCl、0.1％BSA。分析以在96-孔微量培养板(Costar，#3632)中高通量设置并通过Titertec/Plus(ICN Pharmaceuticals)加入放射性配体、膜和SPA珠而自动化。
诸试剂按如下顺序加入培养板孔
| 试剂 | 终浓度 |
| 胰岛素类似物或对照人胰岛素稀释物 | 最小信号[BHI]＝0.1μM，其他化合物[Hi]＝0.1μM |
| [125I]重组人胰岛素 | 50pM |
| HIR膜 | 1.25μg |
| WGA PVT PEI SPA珠 | 0.25毫克/孔 |
培养板以粘性培养板盖密封并在LabLine Instruments层板振荡器上振荡1分钟。培养板通过放入Wallac Microbeta闪烁计数器并设置计时器12小时在室温(22℃)下孵育12小时。通过[125I]已标准化的方法每孔1分钟计数。每种胰岛素分子的IC50由4-参数对数非线性回归分析测定。数据报告为平均值±SEM。相对亲和力通过将胰岛素类似物与每个试验中的重组人胰岛素对照对比并按所进行试验次数平均化相对亲和力而测定。因此胰岛素类似物的平均IC50与胰岛素的平均IC50的比较不能生成相同值。
胰岛素类似物和重组人胰岛素对胰岛素生长因子受体(IGF1-R)的亲和力在使用[125I]IGF-1放射标记配体的竞争性结合分析中测定。人IGF-1受体膜通过过量表达受体的稳定转染的293EBNA细胞P1膜制备而得。分析方法在获得可比结果的过滤和SPA(闪烁迫近分析)模式下进行和验证，但在使用Amersham Pharmacia Biotech.公司经PVT PEI处理的小麦凝集素偶联SPA珠，A型(WGA PVT PEI SPA)珠的SPA模式下进行。
[125I]IGF-1放射标记配体可自制或购自Amersham Pharmacia Biotech.公司，参考日期的比放射活性为2000Ci/mmol。SPA分析缓冲液为50mMTris-HCL、pH 7.8、150mM NaCl、0.1％BSA。分析以在96-孔微量培养板(Costar，#3632)中高通量设置并通过Titertec/Plus(ICNPharmaceuticals)加入放射性配体、膜和SPA珠而自动化。
诸试剂按如下顺序加入培养板孔
| Reagent试剂 | 终浓度 |
| 胰岛素类似物或对照人胰岛素稀释物 | 最小信号[IGF-1]＝1μM，其他化合物[Hi]＝10μM， |
| [125I]IGF-1 | 50pM |
| IGF-1R膜 | 1.25μg |
| WGA PVT PEI SPA珠 | 0.25毫克/孔 |
培养板以粘性培养板改密封并在LabLine Instruments层板振荡器上振荡1分钟。培养板通过放入Wallac Microbeta闪烁计数器并设置计时器12小时在室温(22℃)下孵育12小时。通过[125I]已标准化的方法每孔1分钟计数。
每种胰岛素分子的IC50由4-参数对数非线性回归分析测定。数据报告为平均值+SEM。相对亲和力通过将胰岛素类似物与每个试验中的重组胰岛素对照对比并按所进行试验次数平均化相对亲和力而测定。因此胰岛素类似物的平均IC50与胰岛素的平均IC50的比较不能生成相同值。
将选择指数计算为IR相对亲和力与IGF-1 R相对亲和力的比值。选择指数＞1表示对IR更强的相对选择性。选择指数＜1表示对IGF-1R更强的相对选择性。
表1描述胰岛素类似物和重组人胰岛素的胰岛素受体(IR)亲和力、胰岛素样生长因子1(IGF-1R)受体亲和力及受体选择指数(IR/IGF1-R)。
| 表1 | |||
| 分子 | 相对IR亲和力 | 相对IGF1-R亲和力 | 指数 |
| 平均值 | SEM | 次数 | 平均值 | SEM | 次数 | ||
| 重组人胰岛素 | 1.00 | 0.00 | 86 | 1.00 | 0.00 | 85 | 1.00 |
| A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素 | 0.32 | 0.03 | 3 | 1.2 | 0.12 | 3 | 0.26 |
| A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素 | 0.21 | 0.01 | 3 | 1.1 | 0.21 | 3 | 0.20 |
实施例3
体外的代谢能力
A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素和重组人胰岛素的代谢能力(葡萄糖摄入)在使用已分化的小鼠3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄入分析中测定。在100μl生长培养基(高葡萄糖且不含L-谷氨酰胺的DMEM、10％小牛血清、2mM L-谷氨酰胺、1％抗生素/抗真菌溶液)中以密度为25,000个细胞/孔的未分化的小鼠3T3细胞铺板。
铺板后3天通过加入分化培养基：高葡萄糖且不含L-谷氨酰胺的DMEM、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1％抗生素/抗真菌溶液、10mMHEPES、0.25mM地塞米松、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、5mg/ml胰岛素而启动分化。48小时后(第3天)，原分化培养基换成一种含有胰岛素但没有IBMX或地塞米松的分化培养基而至第6天细胞转换以不含胰岛素、IBMX或地塞米松的分化培养基。细胞在FBS培养基中维持并隔日换液。
葡萄糖转运分析使用Cytostar T 96孔板进行。在分析前24小时。细胞转换以100μl含有0.1％BSA的无血清培养基。在分析当日，移去培养基并加入50μl分析缓冲液：含有HEPES，pH 7.4(118mM NaCl、4.8mMKCl、1.2mM MgSO4×7H2O、1.3mM CaCl2H2O、1.2mM KH2PO4、15mM HEPES)的称为KRBH或Krebs-Ringer缓冲液。用含有0.1％BSA的相同缓冲液配制胰岛素稀释物并以2×加入。空白含有KRBH、0.1％BSA和20mM 2×2-脱氧-D-葡萄糖、0.2μCi/孔的2-脱氧-D-(U-14C)葡萄糖和2×10-7胰岛素。细胞37℃孵育1小时。此后在KRBH液中加入10μl松胞菌素B至终浓度200μM并在Microbeta培养板读数仪上对培养板读数。相对亲和力通过将A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素与每个试验中的重组人胰岛素对照对比并按所进行的试验次数平均化相对亲和力而测定。因此，A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素的平均EC50与胰岛素平均EC50的比较不能生成相同值。
表2描述A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素和重组人胰岛素的体外代谢能力。
| 表2 | ||
| 分子 | 代谢能力 | |
| 平均值 | N | |
| 重组人胰岛素 | 1.00 | ＞50 |
| A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素 | 0.23 | 2 |
实施例4
体外促有丝分裂性
A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素的促有丝分裂能力经测定培养的人乳腺上皮细胞(HMEC)增殖而测定。HMEC由Clonetics Corporation(San Diego，CA)获得为第7代并扩增至第8代冻存。每次使用一支新鲜安瓿因而所有试验均使用相同的第10代HMEC进行。细胞按照BioWhittaker使用说明书维持培养。生长培养基隔日更换以维持细胞培养并且每日检查培养物。
以BioWhittaker的两种产品作为生长培养基：
1.完全补充的MEGM(CC-3051)：包括(数字表示终浓度，除BPE外)
10ng/ml hEGF(人重组表皮生长因子)
5μg/ml胰岛素
0.5μg/ml氢化可的松
50μg/ml庆大霉素，50ng/ml两性霉素-B
13mg/mlBPE(牛垂体抽提物)2ml(附加的)；及
2.含所有下列补充物(SingleQuots，CC-3150)的基础培养基(MEBM，CC-3151)
13mg/ml BPE(牛垂体抽提物(CC-4009)2ml
10μg/ml hEGF(CC-4017)0.5ml
5μg/ml胰岛素(CC-4031)0.5ml
0.5mg/ml氢化可的松(CC-4031)0.5ml
50mg/ml庆大霉素，50mg/ml两性霉素-B(CC-4081)0.5ml。
对生长试验而言，分析培养基是无5μg/ml胰岛素、含0.1％BSA的生长培养基。分析在96孔Cytostart闪烁微量培养板(AmershamPharmacia Biotech，RPNQ0162)上进行。重组人胰岛素和IGF-1作为每轮分析的对照使用且在每个分析培养板上有重组人胰岛素。
分析按如下程序进行。第一天，在100μl分析培养基内按4000个细胞/孔密度铺种HMEC。生长培养基中的胰岛素以0-1000nM终浓度的梯度剂量的重组人胰岛素或另一种胰岛素分子替代。孵育4小时后，每孔加入10μl含0.1μCi14C-胸苷的分析培养基并在Trilux上第48小时和/或72小时对培养板读数。
一般地，最大生长反应在基础之上3-4倍刺激量之间。反应数据标准化至0-100％反应之间，等同于100X(在X浓度的反应-在0浓度的反应)除以(在最大浓度的反应-在0浓度的反应)。浓度-反应数据用JMP软件非线性回归拟合。
相对促有丝分裂能力通过A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素与每次试验中胰岛素对照的对比并按所做试验次数平均化相对能力而测定。因此A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素的平均EC50与胰岛素的平均EC50的比较不能生成相同值。
表3描述以细胞增殖测量的A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素和重组人胰岛素的体外促有丝分裂性。表3数据表明A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素的促有丝分裂性低于重组人胰岛素。
| 表3 | |||
| 分子 | 促有丝分裂能力 | ||
| 平均值 | SEM | N | |
| 重组人胰岛素 | 1.00 | 0.00 | 250 |
| A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素 | 0.86 | 0.05 | 4 |
实施例5
磷酸盐缓冲盐水中的溶解性
如下开展了指示体内延长时间作用倾向的体外沉淀分析法。将含有药学剂量(100个国际单位)胰岛素分子和30μg/ml Zn2+、2.7mg/ml间甲酚和17mg/ml甘油％同时pH调节至4的水溶液用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中和至2个国际单位并以14,000转每分钟室温离心5分钟。转移上清并将约十分之一上清注入分析性Symmetry Shield RP8 RP-HPLC系统(Waters，Inc.)。洗脱峰下的面积合并后与参考标准物峰下的面积比较，参考标准物或为0.1N HCl中的重组人胰岛素。面积比乘以100而得在PBS中的溶解性％。
重组人胰岛素制剂和胰岛素类似物的PBS溶解性见表4
| 表4 | |
| 分子 | PBS溶解性 |
| 重组人胰岛素 | 89.5 |
| A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素 | 9.6 |
| A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素 | 26.8 |
实施例6
等电点
等电聚焦是基于蛋白质的等电点(pI)分离蛋白质的电泳技术。pI是蛋白质不具有净电荷同时在电场中不移动时所在的pH。IEF凝胶可有效产生pH梯度因而蛋白质按它们独特的PI特性分离。蛋白质条带的检测可用灵敏染料染色如Novex Collodial Coomassie Staining Kit完成。或者将凝胶印迹至聚偏二乙烯二氟化物(PVDF)膜同时丽春红染色而完成检测。蛋白质等电点测定可与已知标准物的等电点比较而得。IEF蛋白标准物是pI值充分表征的并混合以提供均一染色的诸蛋白质的合并物。另一pI测定方法是毛细管电泳(cIEF)。pI通过与已知标记物对比测定。
重组人胰岛素和A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素的等电点(pI)使用可产生pI性能范围3.5-8.5的pH 3-10的Novex IEF凝胶通过等电聚焦凝胶电泳测定。等电点示于表5
| 表5 | |
| 分子 | 等电点 |
| 重组人胰岛素 | 5.62 |
| A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素 | 7.30 |
实施例7
A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素的生物合成
用含有编码A21GlyB0LysB29ArgB32Lys-人胰岛素原序列的重组质粒转化商业购买的大肠杆菌表达菌株以生产胰岛素原分子。前导序列以起始子Met密码子开始，后接Lys残基以在胰岛素原分子内形成B0Lys。过度表达的蛋白质聚集在包涵体内，包涵体在4000转每分钟的细胞裂解物终末离心后收集。前导序列-A21GlyB0LysB29ArgB32Ly-人胰岛素原蛋白质溶于50mMTrispH 9.0、7M尿素中并且使蛋白质混合物经1小时pH梯度至pH 11.0同时室温搅拌进一步增溶。室温下以亚硫酸钠(100mM终浓度)和连四硫酸钠(4.9mM终浓度)继续亚硫酸盐解4小时同时温和搅拌。亚硫酸化的蛋白质通过在50mM Tris pH 9.0、7M尿素中以0至400mM NaCl梯度洗脱进行Pharmacia Fast Flow Q Sepharose层析纯化。然后以pH 10.5 20mM甘氨酸稀释已纯化的蛋白质溶液至约150μg/ml。加半胱氨酸至终浓度2mM启动折叠过程并在4℃经60-72小时温和搅拌完成。折叠的蛋白质通过在100mM乙酸钠、pH 4.0、30％乙腈中以线性NaCl梯度洗脱进行Pharmacia Fast Flow SP Sepharose层析法纯化。冻干合并的含有已纯化蛋白质的级分，在水中重溶解并装载到C18反相柱上然后以乙腈梯度洗脱。冻干收集的含胰岛素原的洗脱液而获得210mg蛋白质。
在B0、B32、C64处3个赖氨酸残基C-末端侧的切割预期导致所需的胰岛素类似物的直接产生。22mg胰岛素原(MW 9990.4；0.0022mmol)溶于2ml 25mM tris，pH 8.2缓冲液中，然后向该蛋白质溶液加25μg内蛋白酶Lys-C(Sigma目录编号P-3428；获自Lysobacter enzymogenes)，在37℃孵育5小时然后在室温下孵育额外15小时。此时显著量的白色沉淀物出现在样品中。样品在3000转每分钟离心5分钟并移去上清。沉淀重溶在3mlpH2的30∶70乙腈∶水中。
上清的分析性反相HPLC记录显示在10.77分钟(上清的主要成份)时的一个峰，分子量为3148.5Da，正好是在B32Lys/B33Glu和C64Lys/C65Arg处切割后得到的C-肽片段的预期分子量。
沉淀物的分析性反相HPLC记录表明显示在11.25分钟(沉淀的主要成份)时的一个峰，分子量为6219.8Da，与目的产物的计算分子量(6219.1Da)很好吻合。因此，在沉淀中获得目的产物。分析显示小比例的目的产物同时滞留在上清中。
产物在流速6mL/分钟、线性0.5％乙腈/分钟梯度的Vydac C18反相HPLC柱(10mm i.d.×25cm)上再纯化。冻干的终产物产量为9mg，从胰岛素原形式的回收率约为66％(由于前导肽和C肽质量损失，100％效率将产出62％的初始质量)。
这里提及的全部专利、专利申请、论文、书和其他出版物此处完整引用作为参考。
序列表
<110>伊莱利利公司
<120>具有延长时间作用的胰岛素类似物
<130>X-16270M
<150>US 60/466,501
<151>2003-04-29
<150>US 60/466,500
<151>2003-04-29
<150>US 60/470,118
<151>2003-05-13
<160>5
<170>PatentIn版本3.2
<210>1
<211>22
<212>PRT
<213>人(HOMO SAPIENS)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(22)
<223>A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素和A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素的A链氨基酸序列
<400>1
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
1 5 10 15
Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
20
<210>2
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(32)
<223>A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素的B链氨基酸序列
<400>2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
<210>3
<211>21
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(21)
<223>野生型人胰岛素的A链氨基酸序列
<400>3
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210>4
<211>30
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(30)
<223>野生型人胰岛素的B链氨基酸序列
<400>4
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210>5
<211>32
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(32)
<223>A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素的B链氨基酸序列
<400>5
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Arg Thr Arg Lys
20 25 30
Claims (21)
1.胰岛素类似物A0ArgA21GlyB31ArgB32Arg-人胰岛素。
2.包含权利要求1的胰岛素类似物的组合物。
3.权利要求2的组合物，其中该组合物为药物组合物。
4.权利要求3的组合物，其进一步包含一种或多种可药用赋形剂。
5.权利要求2-4中任意一项所述的组合物，其进一步包含二价金属阳离子。
6.权利要求5的组合物，其中二价金属阳离子为锌。
7.权利要求2-6中任意一项所述的组合物，其进一步包含酚类防腐剂。
8.权利要求2-6中任意一项所述的组合物，其进一步包含等张剂。
9.治疗高血糖症的方法，该方法包括对受试者以足以调节受试者血葡萄糖浓度的量施与权利要求1的胰岛素类似物。
10.治疗高血糖症的方法，该方法包括对受试者以足以调节受试者血葡萄糖浓度的量施与权利要求2-8中任意一项所述的组合物。
11.权利要求9或10的方法，其中受试者因糖尿病而治疗。
12.胰岛素类似物A0ArgA21GlyB29ArgB31ArgB32Lys-人胰岛素。
13.包含权利要求12的胰岛素类似物的组合物。
14.权利要求13的组合物，其进一步包含一种或多种可药用赋形剂。
15.权利要求12-14中任意一项所述的组合物，其进一步包含二价金属阳离子。
16.权利要求15的组合物，其中二价金属阳离子为锌。
17.治疗高血糖症的方法，该方法包括对受试者以足以调节受试者血葡萄糖浓度的量施与权利要求12-16中任意一项所述的组合物。
18.胰岛素原类似物A21GlyB0LysB29ArgB32Lys-人胰岛素原。
19.包含权利要求18的胰岛素原类似物的组合物。
20.胰岛素原类似物A21GlyB29ArgB32Lys-人胰岛素原。
21.包含权利要求20的胰岛素原类似物的组合物。
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2004
- 2004-04-22 CN CN 200480011107 patent/CN1780854A/zh active Pending
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