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CN1780607A - 包含锌的缓释组合物、其制剂及其制备方法 - Google Patents

包含锌的缓释组合物、其制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

提供了一种简单和高收率的制备方法，一种能通过沉淀稳定生理学活性蛋白质或肽，一般为G－CSF并由于其缓释性而使药效可以在活体内保留几天的包含锌的缓释组合物。具体而言，通过将生理学活性蛋白质或肽、水溶性锌盐、水溶性碳酸盐和/或水溶性磷酸盐的水溶液进行混合形成一种沉淀来制备一种包含锌的缓释组合物。该包含锌的缓释组合物可以以根据需要加入可药用添加剂的包含锌的缓释制剂的形式进行给药。

Description

包含锌的缓释组合物、其制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及包含锌的缓释组合物、其制剂及其制备方法，其特征在于将具有生理学活性的蛋白质或肽和水溶性的锌盐与水溶性碳酸盐和/或水溶性磷酸盐的水溶液进行混合，从而形成一种沉淀。
背景技术
目前，包含粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的制剂被用来对抗伴有嗜中性白细胞降低的病症和临床病症。这些制剂可以通过静脉内注射、皮下注射、或点滴来进行给药，但是其应当每天给药一次或两次。
这是由于G-CSF在血中的稳定性差且半衰期短，并且要求G-CSF在血中应高于一定浓度存在以保持其药效。为此，患者受到每日给药的困扰，并且因此具有使用过量G-CSF的负担。因此，需要可以保持恒定的G-CSF血液水平的制剂。
由于粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与金属离子如钙离子和锌离子形成沉淀的事实，所以一种传统技术尝试以该类水不溶性沉淀为基础研制缓释制剂。例如，仅由蛋白质和多价金属离子形成的沉淀易于溶解，从而使得不能如所希望那样获得所需的缓释性。为了应付这种情况，已经提出了一种向G-CSF和金属离子所形成的沉淀组合物中加入第二种可沉淀物质以抑制G-CSF和金属离子所形成的沉淀溶解的方法(日本专利公开出版物2003-81865)。在这种情况中，所加入的第二种可沉淀物质是例如可以与金属离子结合但是其本身几乎没有药效的蛋白质如人血清白蛋白等等。还公开了通过加入酸性粘多糖如硫酸软骨素可以更有效地对该混合蛋白质进行沉淀，并且所得沉淀表现出更好的G-CSF缓释性。
但是，上面的方法存在的问题是，虽然当以大约几百μg/ml的浓度使用时通过与这些蛋白质共沉淀可以使95％或更多的G-CSF沉淀，但是当G-CSF的浓度为1mg/ml或更高时，沉淀效率降至90％或更低。此外，因为用作共沉淀物的人血清白蛋白或硫酸软骨素是一种生物学材料，所以产生了一种安全问题。因为这些生物学材料很贵并且对生产成本有不小的影响，所以避免使用必需加入的生物学材料也是上述方法应当注意的问题。此外，考虑到加工步骤数取决于组合物的类型，所以还有很大的改善空间。
国际公开号为WO 03/000282的国际申请公开，为了将生长激素固化而将生长激素、碳酸氢钠和醋酸锌相结合(见实施例1和2)，但是，其没有提及所形成的固体生长激素的缓释作用。这也与本发明的发明人所发现的用于获得缓释性的组合物不同。
因此，本发明的目的是提供一种水不溶性制剂，其能比使用上述方法更容易地进行制备和能以高收率使生理学活性蛋白质或肽如G-CSF沉淀并使其稳定，并且由于所获得沉淀的缓释作用而能使该生理学活性蛋白质或肽在活体内的药效保留几天。
为了达到这一目的，本发明的发明人对一种利用与水不溶性锌盐共沉淀的方法进行了研究，发现了一种物质，它能在不使用如上所述的生物学材料如人血清蛋白或硫酸软骨素的情况下，在锌离子的存在下使与锌离子具有相互作用的生理学活性蛋白质以高效率沉淀。
结果发现了一种与锌离子具有相互作用的生理学活性蛋白质被有效包含在通过将水溶性锌盐如氯化锌或醋酸锌与水溶性碳酸盐如碳酸氢钠或碳酸钠和/或水溶性磷酸盐如磷酸钠进行混合所形成的沉淀中。
简单地说，本发明的发明人发现，如果在将水溶性锌盐和水溶性碳酸盐和/或水溶性磷酸盐的水溶液混合形成沉淀的过程中共存锌结合性生理学活性蛋白质如G-CSF，则可以形成一种有效包含该生理学活性蛋白质的沉淀物。还证实了由此所获得的沉淀组合物能以持续的方式释放包含于其中的生理学活性蛋白质。
还发现通过使用水溶性碳酸盐和水溶性磷酸盐的组合并改变其混合比，可以控制生理学活性蛋白质如G-CSF的缓释速率。
作为使用相似的水不溶性无机盐的微粒缓释制剂，已知在日本专利公开出版物2002-348234中公开的一种碳酸钙制剂。在这种情况中，为了使所得的沉淀包含约100μg/ml的G-CSF，需要在1M或更高的浓度下来形成碳酸钙微粒。此外，因为从所得的沉淀中释放的G-CSF的数量很少，因此，该沉淀的特性与本发明的沉淀组合物不同。
例如，根据本发明，可以通过将约20mM醋酸锌或氯化锌(锌浓度：约1.3mg/ml)和约20mM碳酸氢钠和/或一种磷酸盐同时进行混合而在所得的沉淀中以约1mg/ml G-CSF的浓度混入几乎所有的G-CSF。
即，本发明的发明人发现，通过使用水溶性锌盐和水溶性碳酸盐和/或磷酸盐，例如锌与G-CSF几乎等当量重量，几乎100％的G-CSF可以沉淀，并且由此完成了本发明。
所得的沉淀细到足以通过注射针，从而使得其可用作可注射制剂。
此外，用小鼠进行的实验研究已经证明，本发明不仅改善了生理学活性蛋白质质形成沉淀的收率，而且还在活体内具有缓释作用，因此，本发明得以完成。
发明内容
因此，本发明一方面提供一种包含锌的缓释组合物，其包含一种沉淀，该沉淀包含通过将生理学活性蛋白质或肽、水溶性锌盐、和水溶性碳酸盐和/或水溶性磷酸盐的水溶液进行混合所获得的生理学活性蛋白质或肽。
更具体而言，本发明是一种包含锌的缓释组合物，其中所述水溶性锌盐是醋酸锌或氯化锌。
具体而言，本发明提供一种包含锌的缓释组合物，其中所述水溶性碳酸盐是碳酸钠或碳酸氢钠，所述水溶性磷酸盐是磷酸钠或磷酸氢钠。
在这种情况中，该水溶性碳酸盐改善了沉淀的形成和得自该沉淀的初始缓释性，并且该水不溶性磷酸盐改善了该生理学活性蛋白质或肽从该沉淀缓释的持久性。
更具体而言，本发明提供一种包含锌的缓释组合物，其中所述生理学活性蛋白质是G-CSF、抗体、生长激素、IFN、EPO、GM-CSF、BDNF、NT3、白介素、或FGF。
在更优选的具体方面，本发明是一种包含锌的缓释组合物，其中所述包含锌的缓释组合物被冷冻干燥并且为适于皮下注射或肌内注射的形式。
另一方面，本发明提供一种包含锌的缓释制剂，其包含上述包含锌的缓释组合物，并且更具体而言，如果需要的话，提供一种通过向上述包含锌的缓释组合物中加入可药用添加剂所制备的包含锌的缓释制剂。
具体而言，本发明是一种其中所述可药用添加剂是分散剂、表面活性剂、抗菌剂或稳定剂的包含锌的缓释制剂，并且更具体地是其中所述可药用添加剂是糖的包含锌的缓释制剂。
优选本发明是一种包含锌的缓释制剂，其中其被冷冻干燥并且为适于皮下注射和肌内注射的形式。
其中，本发明特别是一种白细胞增加剂，其包含其中生理学活性蛋白质是G-CSF的包含锌的缓释制剂。
另一方面，本发明提供一种制备包含锌的缓释组合物的方法，其特征在于将生理学活性蛋白质或肽、水溶性锌盐、以及水溶性碳酸盐和/或水溶性磷酸盐的水溶液进行混合，从而形成一种包含生理学活性蛋白质或肽的沉淀。
实施本发明的最佳方式
如上所述，本发明一方面提供一种含有包含生理学活性蛋白质或肽的沉淀的包含锌的缓释组合物，其典型化合物是G-CSF，其是通过将生理学活性蛋白质或肽、水溶性锌盐、以及水溶性碳酸盐和/或水溶性磷酸盐的水溶液进行混合而获得的。
本发明的特征为特别是在4.5至9.0的pH范围内形成一种沉淀。即，因为pH范围被设定在中性附近，所以对于蛋白质如G-CSF(其活性在极端pH值下会丧失)而言，可以进行不会丧失活性的制备。此外，本发明的特征还在于使得G-CSF以高比例被包含于所述沉淀中。在这种情况的最佳条件下，实现了G-CSF的含量不低于99％。
作为本发明所提供的沉淀的水不溶性缓释组合物优选地是通过首先主要将10至2000μg/ml G-CSF与终浓度不低于20mM的碳酸氢钠溶液进行混合，然后以不低于20mM的终浓度加入醋酸锌或氯化锌溶液，从而形成作为所述缓释沉淀组合物的沉淀。在这种情况中，优选加入水溶性锌盐以使生理学活性蛋白质或肽与水溶性锌盐中锌的摩尔比为1∶100或更高。
同样，就抗体、干扰素、或生长激素而言，可通过本发明制备沉淀的方法制备一种沉淀组合物，其看起来具有与G-CSF的这些性质几乎相同的性质。
此外，作为本发明目标的缓释组合物还可以通过使用大约中性的磷酸盐代替碳酸盐来进行制备，但是G-CSF在该沉淀中的含量或多或少地降低。此外，还发现通过既使用水溶性碳酸盐又使用水溶性磷酸盐并改变其混合比，可控制G-CSF的缓释速率。
此外，通过加入酸性粘多糖如硫酸软骨素或聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)，可以控制缓释作用。
在本发明的沉淀组合物中，在形成沉淀后可以向混悬液中加入糖类如甘露醇和海藻糖，然后将其冷冻干燥并在使用前将其重新混悬于注射用蒸馏水中。
在进行冷冻干燥前后用HPLC对用DETA溶解的沉淀进行分析，以发现洗脱方式与用于形成沉淀的G-CSF的洗脱方式没有不同，并且在形成沉淀或冷冻干燥过程中G-CSF不会聚集或分解。因此，证实了该沉淀具有优异的稳定性。还证实了对于包含本发明的沉淀的制剂而言，在存储稳定性试验中，在37℃下储存一个月时G-CSF不会变性。
本发明另一方面所提供的包含沉淀组合物的制剂例如包含G-CSF的制剂包含通过如上所述形成沉淀所获得的沉淀和可药用添加剂如分散剂、表面活性剂、抗菌剂、或糖，并且这种制剂可以通过皮下注射、肌内注射等等方法来进行给药。
由此所提供的本发明的制剂，例如G-CSF制剂不仅其单一剂量可以将其在小鼠体内的药效保持一周或更久，而且与为了保持药效而每天给予的G-CSF数量相比还可以降低其剂量。
因此，本发明所提供的包含锌的缓释组合物具体是通过将生理学活性蛋白质或肽、水溶性锌盐、和水溶性碳酸盐和/或水溶性磷酸盐的水溶液进行混合，从而形成包含生理学活性蛋白质或肽的沉淀来进行制备的。
在由本发明方法所制备的包含锌的缓释制剂中，可以包含能与锌离子形成沉淀的生理学活性蛋白质或肽以及G-CSF。这种生理学活性蛋白质或肽的实例包括水蛭素、白介素-2(IL-2)、干扰素(IFN)、依那西普、抗体、TNF抗体、红细胞生成素(EPO)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长激素、BDNF、NT3、FGF、具有γ-羧基谷氨酸的蛋白、带有His-标记的重组蛋白质制剂等等。其中，特别优选少量就可以表现出药效的生物学因子。
例如，当根据本发明的方法使抗体、干扰素、或生长激素沉淀时，其以与在G-CSF中所观察到的收率一样高的收率被包含在沉淀中，从而预期可以达到与G-CSF相当的缓释作用。
通过利用其性质，本发明所提供的缓释组合物可以被制备成用于胃肠外给药的制剂。
胃肠外制剂的实例包括可注射的(皮下注射、肌内注射、静脉内注射等等)制剂、溶液制剂如点滴、鼻制剂如喷雾制剂、和用于经粘膜给药的制剂。这些制剂中的任何一种都可以根据日本药典中“制剂通则(General Rules for Preparations)”中所述的方法来进行制备。在制备时，可以对药学领域常用的载体、增塑剂、等渗剂、稳定剂等等进行适当的选择和使用。
对作为本发明所提供的缓释制剂中的活性成分的沉淀组合物的含量没有特别限制。一般而言，虽然剂量随着被给药患者的年龄、性别、体重、临床情况等等而不同，但是该剂量应使得生理学活性蛋白质或肽可以发挥其药理学活性并且表现出该沉淀组合物所应包含的作用。
实施例
通过实施例对本发明进行详细描述，但是，本发明并不限于这些
实施例。
实施例1： 通过将G-CSF与醋酸锌或氯化锌(20mM)和碳酸氢钠溶液 (20mM)进行混合进行的缓释沉淀组合物的制备、G-CSF的沉淀速率、 和与使用钙作为金属盐的情况进行的比较
首先将50μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、8μl碳酸氢钠(0.5M)和134μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向该混合物中加入8μl醋酸锌溶液(0.5M)或氯化锌(0.5M)并使其在室温下放置10分钟。以相同的方式，首先将50μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、8μl碳酸氢钠(0.5M)和134μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向该混合物中加入8μl氯化钙(0.5M)并使之在室温下静置10分钟。将这些混悬液在约10,000×g下进行离心。收集上清液并将沉淀溶解于0.1M EDTA溶液(pH 7.4)中，用ELISA法对包含于上清液和沉淀中的G-CSF含量进行测定。
结果如表1所示。
表1：在通过将G-CSF与醋酸锌或氯化锌溶液和碳酸氢钠溶液进行混合所形成的沉淀中G-CSF的沉淀速率、以及通过与氯化钙溶液
 和碳酸氢钠溶液进行混合时G-CSF的沉淀速率
                           G-CSF的含量(％)
  上清液   沉淀
  碳酸氢钠+醋酸锌 0.8 99.2
  碳酸氢钠+氯化锌 0.1 99.9
  碳酸氢钠+氯化钙 93.2 6.8
如表1所示，在1mg/ml的G-CSF浓度下，当用氯化钙形成沉淀时，在该沉淀中包含不高于10％的G-CSF。相反，当用20mM醋酸锌或氯化锌形成沉淀时，G-CSF以不低于99％的高效率被包含于沉淀中。
在之前被称为现有技术的日本专利公开出版物2002-348234中，为了使G-CSF以高效率被包含于沉淀中，通过再向650μl氯化钙(5M)和250μl G-CSF(0.5mg/ml)中加入2.5ml碳酸钠(1M)来产生沉淀。
实施例2： 以99％或更高的效率由1mg/ml G-CSF溶液制备沉淀所需 锌浓度的研究
(1)通过首先将50μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、40μl碳酸氢钠(0.1M)和70μlMilli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入40μl醋酸锌溶液(0.1M)并使所得的溶液在室温下放置10分钟来制备一种其中锌的终浓度为20mM的制剂。
(2)通过首先将50μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、20μl碳酸氢钠(0.1M)和110μlMilli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入20μl醋酸锌溶液(0.1M)并使所得的溶液在室温下放置10分钟来制备一种其中锌的终浓度为10mM的制剂。
(3)通过首先将50μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、10μl碳酸氢钠(0.1M)和130μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入10μl醋酸锌溶液(0.1M)并使所得的溶液在室温下放置10分钟来制备一种其中锌的终浓度为5mM的制剂。
(4)通过首先将50μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、4μl碳酸氢钠(0.1M)和142μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入4μl醋酸锌溶液(0.1M)并使所得的溶液在室温下放置10分钟来制备一种其中锌的终浓度为2mM的制剂。
将这些混悬液(1)至(4)在约10,000×g下进行离心。收集上清液并将沉淀溶解于0.1M EDTA溶液(pH 7.4)中，用ELISA方法对包含于上清液和沉淀中的G-CSF的量进行测定。
结果如表2所示。
表2：通过用醋酸锌和碳酸氢钠由1mg/ml G-CSF浓度的溶液
         所形成的沉淀的锌浓度和G-CSF含量
  锌浓度(mM)                                G-CSF的含量(％)
  上清液   沉淀
  20   0.3   99.7
  10   66.1   33.9
  5   79.2   20.8
  2   89.0   11.0
如表2所示，当使用终浓度为20mM的醋酸锌溶液(G-CSF∶Zn(w/w)＝1∶1.3)时，不低于99％的G-CSF被包含于沉淀中，而当终浓度不高于10mM时，G-CSF的沉淀速率显著降低。
实施例3： 以99％或更高效率由1mg/ml没有磷酸盐的G-CSF溶液 制备沉淀所需锌浓度的研究
(1)通过首先将80μl溶解于注射用水中的G-CSF溶液(2.5mg/ml)、8μl碳酸氢钠(0.5M)和104μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入8μl醋酸锌溶液(0.5M)并使所得的溶液在室温下放置10分钟来制备一种锌的终浓度为20mM的制剂。
(2)通过首先将80μl溶解于注射用水中的G-CSF溶液(2.5mg/ml)、6μl碳酸氢钠(0.5M)和108μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入6μl醋酸锌溶液(0.5M)并使所得的溶液在室温下放置10分钟来制备一种锌的终浓度为15mM的制剂。
(3)通过首先将80μl溶解于注射用水中的G-CSF溶液(2.5mg/ml)、4μl碳酸氢钠(0.5M)和112μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入4μl醋酸锌溶液(0.5M)并使所得的溶液在室温下放置10分钟来制备一种锌的终浓度为10mM的制剂。
(4)通过首先将80μl溶解于注射用水中的G-CSF溶液(2.5mg/ml)、2μl碳酸氢钠(0.5M)和116μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入2μl醋酸锌溶液(0.5M)并使所得的溶液在室温下放置10分钟来制备一种锌的终浓度为5mM的制剂。
将这些混悬液(1)至(4)在约10,000×g下进行离心。收集上清液并将沉淀溶解于0.1M EDTA溶液(pH 7.4)中，用ELISA法对包含于上清液和沉淀中的G-CSF的量进行测定。结果如表3所示。
表3：通过使用醋酸锌和碳酸氢钠由1mg/ml G-CSF浓度的溶液
         形成的沉淀的锌浓度和G-CSF含量
醋酸锌和碳酸氢钠的浓度(mM)                             G-CSF的含量(％)
  上清液   沉淀
  20   0.7   99.3
  15   0.7   99.3
  10   1.3   98.7
  5   0.7   99.3
由表3所示结果清晰可见，当在所形成的沉淀中不存在磷酸盐时，既使用终浓度低至5mM(G-CSF∶Zn(w/w)＝1∶0.33)的醋酸锌溶液也能使得约99％的G-CSF沉淀。
实施例4： 磷酸盐对通过使用20mM醋酸锌和20mM碳酸氢钠由1 mg/ml G-CSF溶液形成的沉淀的影响
首先将80μl脱盐的G-CSF溶液(2.5mg/ml)(终浓度：1mg/ml)和8μl碳酸氢钠(0.5M)(终浓度：20mM)的混合物与如下不同比例的磷酸盐缓冲剂(0.2M)(pH 7.2)/Milli-Q水进行混合：
(1)40μl/64μl(磷酸盐终浓度：40mM)
(2)20μl/84μl(磷酸盐终浓度：20mM)
(3)10μl/94μl(磷酸盐终浓度：10mM)
(4)5μl/99μl(磷酸盐终浓度：5mM)
(5)0μl/104μl(磷酸盐终浓度：0mM)
然后，在搅拌下向这些溶液中加入8μl醋酸锌溶液(0.5M)并使之在室温下静置10分钟，从而制备具有各自磷酸盐终浓度的混悬液。将这些混悬液在约10,000×g下进行离心。收集上清液并将沉淀溶解于0.1M EDTA溶液(pH7.4)中，并用ELISA法对包含于上清液和沉淀中的G-CSF的量进行测定。
结果如表4所示。由表4所示结果清晰可见，当通过20mM醋酸锌/20mM碳酸氢钠的组合形成1mg/ml G-CSF的沉淀时，在10mM或更低的终浓度下，磷酸盐不会抑制G-CSF沉淀的形成。
表4：通过使用20mM醋酸锌和20mM碳酸氢钠由含有磷酸盐的1mg/ml浓度的G-CSF溶液形成的沉淀的G-CSF含量
  磷酸盐的浓度(mM)                                    G-CSF的含量(％)
  上清液   沉淀
  40   73.3   26.7
  20   50.1   49.9
  10   0.2   99.8
  5   0.2   99.8
  0   0.1   99.9
实施例5： 通过使用溶解于磷酸盐缓冲剂中G-CSF所制备的G-CSF 缓释制剂的血液动力学特性
(1)通过首先将1000μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、160μl碳酸氢钠(0.5M)和680μl Milli-Q水进行混合并在搅拌下向这种溶液中加入160μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种包含2mg/ml G-CSF的缓释制剂。
(2)通过首先将100μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、160μl碳酸氢钠(0.5M)和1580μl Milli-Q水进行混合并在搅拌下向这种溶液中加入160μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种包含0.2mg/ml G-CSF的缓释制剂。
(3)通过首先将10μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、160μl碳酸氢钠(0.5M)和1670μl Milli-Q水进行混合并在搅拌下向这种溶液中加入160μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种包含0.02mg/ml G-CSF的缓释制剂。
(4)通过将100μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)和1900μl Milli-Q水进行混合来制备一种包含0.2mg/ml G-CSF的溶液制剂。
向这些溶液(1)至(4)中加入0.1g甘露醇，并将所得的溶液各自以5ml/kg的量皮下给药于8周大的ddY小鼠(每组2只小鼠)。在给药后4小时、1、2、3和4天采集血样(65μl)，用ELISA法来测量G-CSF浓度。
由表5所示结果清晰可见，在几天内以持续的方式在血液中观察到经皮下给药的包含G-CSF的缓释制剂。与此相反，当将溶液制剂进行给药时，仅在一天内在血中检测到G-CSF。
表5：G-CSF在以G-CSF制剂进行给药的小鼠体内的血液动力学特性
制剂(剂量)                                血液G-CSF浓度(ng/ml)
  4小时   1天   2天   3天   4天
  缓释制剂(2mg/ml) 907.35 272.44 77.62 15.74 0.30
  缓释制剂(0.2mg/ml)   27.31   46.04   6.91   1.04   0.09
  缓释制剂(0.02mg/ml)   1.13   0.84   0.06   ND   ND
  溶液制剂(0.2mg/ml)   208.02   0.24   ND   ND   ND
ND：未检测
实施例6： 用溶解于磷酸盐缓冲剂中的G-CSF所制备的G-CSF缓释 制剂和用通过脱盐获得的没有磷酸盐的G-CSF溶液所制备的G-CSF 缓释制剂之间血液动力学特性的比较
通过首先将250μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、40μl碳酸氢钠(0.5M)和170μl Milli-Q水进行混合并在搅拌下向这种溶液中加入溶液40μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种包含磷酸盐的缓释制剂。通过首先将400μl脱盐的G-CSF溶液(2.5mg/ml)、40μl碳酸氢钠(0.5M)和20μl Milli-Q水在注射用水中进行混合并在搅拌下向这种溶液中加入40μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种不含磷酸盐的缓释制剂。向这些制剂中加入0.025g甘露醇，并将所得的制剂各自以5ml/kg的量皮下给药于8周大的ddY小鼠(每组2只小鼠)。在给药后4小时、1、2、3和4天采集血样(65μl)，用ELISA法来测量G-CSF浓度。
从表6的结果可见，包含磷酸盐的G-CSF制剂保留了约10倍保持量的血液中的G-CSF浓度。
表6：用G-CSF制剂进行给药的小鼠体内的G-CSF血液动力学特性
制剂                                         血液G-CSF浓度(ng/ml)
  4小时   1天   2天   3天   4天
  缓释制剂(含有磷酸盐)   8457.41   747.93   59.41   9.03   1.94
  缓释制剂(不含磷酸盐)   1891.14   590.43   12.18   0.78   0.24
实施例7： G-CSF和锌之间的数量比对G-CSF缓释制剂持续缓释性的 影响
(1)通过首先将834μl脱盐的G-CSF溶液(2.4mg/ml)、80μl碳酸氢钠(0.5M)和6μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入80μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种其中G-CSF∶Zn的摩尔比为1∶400的制剂。
(2)通过首先将834μl脱盐的的G-CSF溶液(2.4mg/ml)、40μl碳酸氢钠(0.5M)和86μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入40μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种其中G-CSF∶Zn的摩尔比为1∶200的制剂。
(3)通过首先将834μl脱盐的的G-CSF溶液(2.4mg/ml)、20μl碳酸氢钠(0.5M)和126μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入20μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种其中G-CSF∶Zn的摩尔比为1∶100的制剂。
(4)通过首先将834μl脱盐的的G-CSF溶液(2.4mg/ml)和86μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入80μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种其中G-CSF∶Zn的摩尔比为1∶400的制剂(不包含碳酸盐)。
向这些制剂中加入0.05g甘露醇，将所得的制剂各自以5ml/kg的量皮下给药于8周大的ddY小鼠(每组2只小鼠)。在给药后4小时、1、2、3和4天采集血样(65μl)，用ELISA法来测量G-CSF浓度。
结果如表7所示。由表中结果清晰可见，锌与G-CSF的比值越小，所得制剂的缓释性就越差。在相同的锌与G-CSF的比值下，不包含碳酸盐的制剂的缓释性显著降低。
表7：用具有各种G-CSF与锌比例的G-CSF制剂进行给药
         的小鼠体内的G-CSF血液动力学特性
  G-CSF制剂G-CSF∶Zn比例                                  血液G-CSF浓度(ng/ml)
  4小时   1天   2天   3天   4天
  1∶400   1772.29   449.93   26.35   0.59   0.23
  1∶200   5811.21   214.2   0.94   0.09   ND
  1∶100   5187.81   87.72   0.27   ND   ND
  1∶400(不含碳酸盐) 1463.42 191.69 1.71 0.06 ND
ND：未检测
实施例8： 通过碳酸盐和磷酸盐对包含锌的G-CSF缓释制剂的缓释性 的控制
(1)通过首先将640μl脱盐的G-CSF溶液(2.3mg/ml)和64μl碳酸氢钠(0.5M)进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入64μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种使用碳酸盐的制剂。
(2)通过首先将640μl脱盐的G-CSF溶液(2.3mg/ml)、64μl碳酸氢钠(0.5M)和40μl磷酸盐缓冲剂(0.2M)(pH 7.2)进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入64μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种使用碳酸盐和磷酸盐两者的制剂。
(3)通过首先将640μl脱盐的G-CSF溶液(2.3mg/ml)和20μl磷酸盐缓冲剂(0.2M)(pH 7.2)进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入64μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种使用磷酸盐的制剂。
向这些制剂中加入0.04g甘露醇，将所得的制剂各自以5ml/kg的量皮下给药于8周大的ddY小鼠(每组2只小鼠)。在给药后4小时、1、2、3和4天采集血样(65μl)，用ELISA法来测量G-CSF浓度。
结果如表8所示。由表8结果可见，在制备包含锌的G-CSF制剂时加入碳酸盐或磷酸盐产生了不同的缓释性，并且当同时使用碳酸盐和磷酸盐时得到优异的缓释性。还发现可以通过改变碳酸盐和磷酸盐的混合比来控制缓释速率。
表8：以使用碳酸盐和/或磷酸盐的包含锌的G-CSF缓释制剂
            给药的小鼠体内的G-CSF血液动力学特性
制剂                                     血液G-CSF浓度(ng/ml)
  4小时   1天   2天   3天   4天
  醋酸锌/碳酸氢钠 3335.96 692.46 25.92 0.59 0.15
  醋酸锌/碳酸氢钠/磷酸盐缓冲剂 4683.65 742.90 50.72 3.90 0.67
  醋酸锌/磷酸盐缓冲剂 11104.73 75.64 1.55 0.43 0.18
实施例9： 冷冻干燥对G-CSF缓释制剂的影响及其血液动力学特性
首先将0.5ml溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、4.0ml碳酸氢钠(0.1M)和4.7mlMilli-Q水进行混合，在搅拌下向这种溶液中加入0.8ml醋酸锌溶液(0.5M)，从而形成一种沉淀，然后向其中加入0.5g甘露醇或海藻糖，将其分配成1ml的等分试样并将其冷冻干燥。在冷冻干燥前，向450μl样品中加入50μl 0.5M EDTA以将沉淀溶解，从中取出100μl，用反相HPLC对其进行分析。在冷冻干燥后，将样品重新混悬于1ml注射用水中，从中取出450μl并通过加入50μl 0.5M EDTA来使沉淀溶解。以如上所述相似的方式用反相HPLC对100μl样品进行分析。以洗脱峰的面积为基础来对G-CSF的回收率进行比较。
结果如表9所示。由表中结果清晰可见，既使在冷冻干燥后，G-CSF也几乎100％被回收，并且既没有观察到聚集也没有观察到分解。
表9：在冷冻干燥G-CSF缓释制剂后G-CSF的回收率
                        甘露醇                     海藻糖
  G-CSF的峰面积(mAU×ml)   回收率(％)  G-CSF的峰面积(mAU×ml)   回收率(％)
  冷冻干燥前   357.0643   100   346.3886   100
  冷冻干燥后   373.9416   105   333.5237   96
因为证实了冷冻干燥的可利用性，所以用冷冻干燥制剂来进行实施例5的实验。将冷冻干燥的制剂重新混悬于0.5％的羧甲基纤维素中，并且用单次剂量将这些溶液各自以5ml/kg的量给药于8周大的ddY小鼠。如表10所示，在该冷冻干燥制剂中也观察到缓释作用。
表10：以冷冻干燥的G-CSF缓释制剂给药的小鼠体内的G-CSF血液药动学性质
制剂(剂量)                                      血液G-CSF浓度(ng/ml)
  4小时   1天   2天   3天   4天
  缓释制剂(2mg/ml) 4683.35 497.86 49.89 6.86 1.66
  缓释制剂(0.2mg/ml)   46.30   49.11   8.42   0.94   0.41
  缓释制剂(0.02mg/ml)   0.33   0.57   0.12   0.06   0.06
  溶液制剂(0.2mg/ml)   283.90   0.62   ND   ND   ND
ND：未检测
实施例10： 加入甘露醇对G-CSF缓释制剂的缓释性的影响
通过首先将476μl溶解于约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.2mg/ml)、80μl碳酸氢钠(0.5M)和364μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入80μl醋酸锌溶液(0.5M)和加入0.05g甘露醇来制备一种包含甘露醇的缓释制剂。
通过首相将476μl溶解于约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.2mg/ml)、80μl碳酸氢钠(0.5M)和364μl盐水进行混合，然后向这种溶液中加入80μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种不包含甘露醇的缓释制剂。
将这些制剂各自以5ml/kg的量皮下给药于8周大的ddY小鼠(每组2只小鼠)。在给药后4小时、1、2、3和4天采集血样(65μl)，用ELISA法来测量G-CSF浓度。
结果如表11所示。如表11所示，加入甘露醇并没有表现出任何改善缓释性的作用。
              表11：用G-CSF制剂进行给药的小鼠体内
                     的G-CSF血液学动力学特性
制剂                                         血液G-CSF浓度(ng/ml)
  4小时   1天   2天   3天   4天
  缓释制剂(含有甘露醇) 4193.76 290.37 62.95 7.96 2.95
  缓释制剂(不含甘露醇) 3700.81 803.20 67.07 16.08 6.92
实施例11： G-CSF缓释制剂的白细胞增加作用
通过首先将100μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、160μl碳酸氢钠(0.5M)和1580μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入160μl醋酸锌溶液(0.5M)制备包含0.2mg/ml G-CSF的缓释制剂；通过首先将10μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、160μl碳酸氢钠(0.5M)和1670μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入160μl醋酸锌溶液(0.5M)制备包含0.02mg/ml G-CSF的缓释制剂；向以上两种制剂中各自加入0.1g甘露醇并将混合物冷冻干燥。通过加入0.5％羧甲基纤维素将所得的冷冻干燥制剂重新混悬，用单次剂量将这些制剂各自以5ml/kg的量皮下给药于7周大的ddY小鼠(每组3只小鼠)。在12天中采集血样(35μl)并用自动血细胞计数器对白细胞的数目进行计数。
结果如表12所示。如表12所示，虽然剂量不同时白细胞的增加有差异，但是对两种剂量而言，其在一周内都保持了药效。
表12：用G-CSF缓释制剂进行给药的小鼠体内白细胞数目的变化
                             白细胞数目(×102个细胞/mm3)
                                           剂量
  0.2mg/ml G-CSF   0.02mg/ml G-CSF
  给药前   75±15   81±30
  第1天   156±30   189±60
  第2天   326±53   294±92
  第3天   383±103   275±85
  第4天   359±36   240±93
  第5天   416±57   239±102
  第6天   342±184   173±55
  第8天   264±151   106±29
  第9天   171±107   94±9
  第10天   188±109   83±9
  第11天   132±75   72±17
  第12天   114±20   96±29
实施例12： G-CSF缓释制剂和G-CSF溶液制剂之间白细胞增加作用 的比较
(1)通过首先将28.6μl溶解于约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.2mg/ml)、48μl碳酸氢钠(0.5M)和1075.4μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入48μl醋酸锌溶液(0.5M)形成一种沉淀，向其中加入0.06g甘露醇来制备一种包含0.1mg/mlG-CSF的缓释制剂。
(2)通过首先将48μl溶解于约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.2mg/ml)和1952μl Milli-Q水进行混合，然后向其中加入0.1g甘露醇来制备一种包含0.1mg/ml G-CSF的溶液制剂。
将如上所述制备的制剂冷冻干燥。通过加入0.5％羧甲基纤维素将所得的冷冻干燥的制剂重新混悬，并用单次剂量将这些制剂各自以10ml/kg的量给药于7周大的ddY小鼠(每组3只小鼠)。
为了每天给药，将38.4μl溶解于约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.2mg/ml)和7961.6μl Milli-Q水混合，然后向其中加入0.4g甘露醇，从而制得一种0.02mg/ml的溶液制剂，然后将其分成1.5ml的等分试样并冷动干燥，从而制得一种包含G-CSF的冷冻干燥制剂。最初五天，将这些制剂每天各自以10ml/kg的量给药于7周大的ddY小鼠(三只动物)。
在各试验中，在12天中收集血样(35μl)，并用自动血细胞计数器对白细胞数目进行计数。
结果如表13所示。如表13所示，以与缓释制剂相等的量用单次剂量给药的溶液制剂的药效仅维持了约2天。用单次剂量给药的缓释制剂表现出可以与用五个每日剂量进行给药的溶液制剂所获得的药效相当的药效或比其药效更高的药效。在停止给药后，溶液制剂立即丧失了其药效，但是缓释制剂显示保留了药效。
表13：用G-CSF缓释制剂(单次剂量)给药的小鼠和用溶液制剂(单剂
  量和五个每日剂量)给药的小鼠之间白细胞数目增加效果的比较
                               白细胞数目(×102个细胞/mm3)
  制剂   缓释制剂   溶液制剂   溶液制剂
  G-CSF剂量   0.1mg/ml   0.1mg/ml   0.02mg/ml
  剂量数   单次剂量   单次剂量   5天剂量
  给药前   76±18   87±7   64±31
  第1天   141±28   162±31   147±35
  第2天   302±81   161±21   267±69
  第3天   294±110   96±15   312±51
  第4天   262±76   92±16   303±58
  第5天   342±124   89±33   392±108
  第6天   280±128   93±26   80±12
  第8天   156±37   92±35   79±28
  第9天   112±34   90±28   72±30
  第10天   115±28   102±34   76±19
  第11天   93±27   76±23   71±25
  第12天   82±28   73±26   67±20
实施例13： 用醋酸锌或氯化锌制备的G-CSF缓释制剂白细胞数目增 加效果的比较
通过首先将50μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、80μl碳酸氢钠(0.5M)和1790μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入80μl醋酸锌溶液(0.5M)或80μl氯化锌(0.5M)制备包含0.1mg/ml G-CSF的缓释制剂，向其中加入0.1g甘露醇并将该混合物冷冻干燥。通过加入0.5％羧甲基纤维素使所得的冷冻干燥制剂重新混悬，将这些制剂各自以10ml/kg的量用单次剂量给药于7周大的ddY小鼠(每组3只小鼠)，收集12天血液(35μl)，并用自动血细胞计数器对白细胞的数目进行计数。
结果如表14所示。如表14所示，在缓释制剂的制备中分别使用醋酸锌和氯化锌制备的缓释制剂表现出相似的药效。
表14：用G-CSF缓释制剂进行给药的小鼠体内的白细胞数目的变化
                             白细胞的数目(×102个细胞/mm3)
  缓释制剂   使用醋酸锌   使用氯化锌
  给药前   70±12   71±9
  第1天   168±32   147±21
  第2天   352±71   272±32
  第3天   340±89   271±22
  第4天   362±101   293±23
  第5天   468±72   423±25
  第6天   502±93   429±118
  第8天   426±98   363±118
  第9天   361±39   306±151
  第10天   324±36   275±157
  第11天   268±50   202±146
  第12天   188±113   143±57
实施例14： 包含硫酸软骨素的G-CSF缓释制剂对白细胞的增加和维 持作用
通过首先将28.6μl溶解于约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.2mg/ml)、48μl碳酸氢钠(0.5M)和1075.4μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入48μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种包含0.1mg/ml G-CSF的缓释制剂；和通过首先将28.6μl溶解于约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.2mg/ml)、48μl碳酸氢钠(0.5M)和1015.4μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向这种溶液中加入48μl醋酸锌溶液(0.5M)，然后加入60μl硫酸软骨素(20mg/ml)来制备一种包含硫酸软骨素的0.1mg/ml的G-CSF制剂。
向这些制剂中加入0.06g甘露醇，然后将其冷冻干燥。通过加入0.5％羧甲基纤维素使所得的冷冻干燥制剂重新混悬，将这些制剂各自用单次剂量以10ml/kg的量给药于7周大的ddY小鼠(每组3只小鼠)，收集12天血样(35μl)，并用自动血细胞计数器对白细胞数目进行计数。
结果如表15所示。如表15所示，加入了硫酸软骨素的制剂虽然降低了白细胞数目的最大值，但是更清楚地观察到白细胞数目连续增加。
表15：用G-CSF缓释制剂给药的小鼠体内的白细胞数目变化
                           白细胞的数目(×102个细胞/mm3)
  缓释制剂   不含有硫酸软骨素   含有硫酸软骨素
  给药前   84±19   80±7
  第1天   138±37   159±28
  第2天   307±101   237±49
  第3天   293±114   183±36
  第4天   255±79   175±44
  第5天   313±98   226±33
  第6天   218±29   197±8
  第8天   145±42   145±22
  第9天   97±6   128±26
  第10天   115±36   132±11
  第11天   100±25   135±34
  第12天   77±37   124±30
实施例15： 使用磷酸盐的G-CSF缓释制剂的白细胞增加作用
通过首先将100μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)、400μl磷酸钠缓冲剂(0.2M)(pH7.2)和3340μlMilli-Q水进行混合，然后在搅拌下向其中加入160μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种包含0.1mg/ml G-CSF的缓释制剂。向这种制剂中加入0.1g甘露醇并将其冷冻干燥。通过加入注射用水使所得的冷冻干燥制剂重新混悬，并将该制剂各自用单次剂量以10ml/kg的量给药于7周大的ddY小鼠(每组3只小鼠)，收集12天血液(35μl)，并用自动细胞计数器对白细胞的数目进行计数。
结果如表16所示。如表中所示，即使在使用磷酸盐而不是碳酸盐的包含锌的缓释制剂的情况下药效也维持了一周。
表16：用G-CSF缓释制剂给药的小鼠体内的白细胞数目变化
  白细胞的数目(×102个细胞/mm3)
  缓释制剂   0.1mg/ml G-CSF
  给药前   82±9
  第1天   175±18
  第2天   258±17
  第3天   246±60
  第4天   207±40
  第5天   262±60
  第6天   237±15
  第8天   166±21
  第9天   142±23
  第10天   139±16
  第11天   106±16
  第12天   126±16
实施例16： 通过最后加入G-CSF制备的沉淀中的G-CSF含量和沉淀 制剂的药效
首先将16μl碳酸氢钠溶液(0.5M)和158μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向该溶液中加入16μl醋酸锌溶液(0.5M)并且在搅拌的情况中在向其中加入10μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)，然后使之在室温下静置10分钟。将该混悬液在约10,000×g下进行离心，收集上清液，并将所得的沉淀溶解于0.1MEDTA溶液(pH 7.4)中。用ELISA法对包含于上清液和沉淀中的G-CSF含量进行测定。结果，几乎100％的G-CSF包含在沉淀中。
为了检查药效，首先将176μl碳酸氢钠水溶液(0.5M)和1738μlMilli-Q水进行混合，然后在搅拌下向该溶液中加入176μl醋酸锌溶液(0.5M)并且在搅拌下再向其中加入110μl溶解于大约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF溶液(4.0mg/ml)，从而制得一种包含0.2mg/mlG-CSF的缓释制剂。向所得的制剂中加入0.11g甘露醇并将其冷冻干燥。通过加入注射用水使所得的冷冻干燥制剂重新混悬，并将该制剂各自用单次剂量以5ml/kg的数量给药于7周大的ddY小鼠(每组3只小鼠)，收集12天血样(35μl)，并用自动血细胞计数器对白细胞数目进行计数。
结果如表17所示。如表17所示，证实甚至在首先加入醋酸锌和碳酸氢钠水溶液，然后加入G-CSF所制备的沉淀制剂中也保留了足够的药效。
表17：用G-CSF缓释制剂给药的小鼠体内的白细胞数目变化
  白细胞的数目(×102个细胞/mm3)
  缓释制剂   0.2mg/ml G-CSF
  给药前   51±9
  第1天   100±35
  第2天   277±94
  第3天   242±119
  第4天   185±54
  第5天   299±76
  第6天   285±115
  第8天   271±103
  第9天   221±105
  第10天   167±86
  第11天   125±51
  第12天   124±39
实施例17： 对于抗-TNF抗体(单克隆)、干扰素-α和生长激素，通过 将醋酸锌溶液(20mM)和碳酸氢钠溶液(20mM)进行混合形成沉淀的沉 淀速率
首先将10μl抗-TNF抗体溶液(10mg/ml)、8μl碳酸氢钠溶液(0.5M)和174μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向所得的溶液中加入8μl醋酸锌溶液(0.5M)，并使之在室温下放置10分钟，从而得到一种混悬液。
以相似的方式，首先将77μl干扰素-α(1.3mg/ml)、8μl碳酸氢钠水溶液(0.5M)和107μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向所得的溶液中加入8μl醋酸锌溶液(0.5M)，并使之在室温下放置10分钟，从而得到一种混悬液。
此外，首先将200μl生长激素(0.5mg/ml)、16μl碳酸氢钠溶液(0.5M)和168μl Milli-Q水进行混合，然后在搅拌下向所得的溶液中加入16μl醋酸锌溶液(0.5M)并使之在室温下放置10分钟，从而得到一种混悬液。
将这些混悬液各自在约10,000×g下进行离心，收集上清液，并将沉淀溶解于0.1M EDTA溶液(pH7.4)中。用ELISA法对包含于上清液和沉淀中的抗-TNT抗体和干扰素-α进行定量，并用反相HPLC对生长激素进行定量。
结果如表18所示。如表18所示，当为了形成沉淀而将0.5mg/ml抗-TNF抗体或干扰素-α、或0.25mg/ml生长激素与碳酸氢钠溶液和醋酸锌溶液进行混合时，已知与锌结合的蛋白质如抗-TNF抗体、干扰素-α和生长激素以可以与用G-CSF获得的高含量相当的非常高的含量包含在沉淀中。
表18：抗-TNF抗体、干扰素-α和生长激素的含量
                                   蛋白质的含量(％)
  上清液   沉淀
  抗-TNF抗体   0.1   99.9
  干扰素-α   2.0   98.0
  生长激素   0.8   99.2
实施例18： 通过碳酸盐和磷酸盐对包含锌的人生长激素(hGH)缓释制 剂的缓释性的控制
(1)通过首先将720μl脱盐的hGH溶液(0.5mg/ml)、24μl碳酸氢钠溶液(0.5M)和432μl Milli-Q水进行混合，并在搅拌下向其中加入24μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种使用碳酸盐的制剂。
(2)通过首先将720μl脱盐的hGH溶液(0.5mg/ml)、24μl碳酸氢钠溶液(0.5M)、30μl磷酸盐缓冲剂(0.2M)(pH 7.2)和402μlMilli-Q水进行混合，并在搅拌下向其中加入24μl醋酸锌溶液(0.5M)来制备一种同时使用碳酸盐和磷酸盐的制剂。
(3)通过将720μl脱盐的hGH溶液(0.5mg/ml)、24μl碳酸氢钠溶液(0.5M)和432μl Milli-Q水进行混合来制备一种溶液制剂。
向这些制剂中加入0.03g甘露醇，然后将其冷冻干燥。在给药前，将制剂(1)和(2)溶解于600μl 20mM醋酸锌/20mM碳酸氢钠混合物中，将制剂(3)溶解于600μl Milli-Q水中。将上面的制剂各自以5ml/kg的量皮下给药于7周大的ddY小鼠(每组2只小鼠)。在给药后4小时、1、2、3和第4天，采集血样(65μl)，并用自动EIA装置对hGH浓度进行测量。
结果如表19所示。由表中结果清晰可见，包含锌/碳酸盐组合的hGH制剂以缓释的方式洗脱药物。通过向这种制剂中加入磷酸盐，改善了其缓释性，从而抑制了几小时后的洗脱并在几天中观察到了更高的hGH血浓度。
          表19：用包含锌的hGH缓释制剂给药的小鼠体内的
                        hGH的血液动力学
制剂                                        血液hGH浓度(ng/ml)
  4小时   1天   2天   3天   4天
  醋酸锌/碳酸氢钠 79.05 7.94 2.27 0.62 0.24
  醋酸锌/碳酸氢钠/磷酸盐缓冲剂 9.15 17.00 5.22 3.03 1.56
  碳酸氢钠   92.88   ND   ND   ND   ND
ND：未检测
实施例19： 冷冻干燥的G-CSF缓释制剂的稳定性
首先将0.5ml溶解于约30mM磷酸盐缓冲剂中的G-CSF(4.0mg/ml)、0.8ml碳酸氢钠(0.5M)和7.9mlMilli-Q水进行混合，并在搅拌下向该混合物中加入0.8ml醋酸锌溶液(0.5M)形成一种沉淀，其后加入0.5g海藻糖，将其填充到1ml的小瓶中，然后将其冷冻干燥。在冷冻干燥后，将这些样品放置到37℃的恒温室中。在冷冻干燥前，向450μl样品中加入50μl 0.5M EDTA以使该沉淀溶解。对100μl所得溶液进行反相HPLC分析来测定G-CSF的含量。另一方面，在冷冻干燥后立即将在恒温室中储存1周和4周后的各1ml样品重新混悬于注射用水中，从中取出450μl。然后向其中加入50μl 0.5M EDTA以使该沉淀溶解，并对100μl所得溶液进行反相HPLC分析以测定G-CSF含量。
在G-CSF洗脱峰峰面积的基础上对G-CSF的回收率进行比较。
如表20所示，甚至当将冷冻干燥的G-CSF制剂在37℃下储存4周时，G-CSF也是几乎100％地被回收，并且没有观察到聚集和分解。
表20：在37℃下储存4周冷冻干燥G-CSF缓释制剂的稳定性
  G-CSF的回收率(％)
  冷冻干燥前   100.0
  冷冻干燥后立即   88.1
  冷冻干燥后1周   90.0
  冷冻干燥后4周   90.6
实施例20： 制剂实施例(混悬液注射剂)
向实施例10所制备的包含0.2mg/ml G-CSF的缓释制剂中加入甘露醇并冷冻干燥。将所得的冷冻干燥制剂装到小瓶中，并通过加入在其它小瓶中的0.5％羧甲基纤维素或注射用水使其重新混悬，制得一种混悬液注射剂。
工业实用性
如上所述，本发明提供了一种以高收率使生理学活性蛋白质或肽如G-CSF沉淀并使其稳定以及由于所得沉淀的缓释性而使生理学活性蛋白质或肽在活体内的药效可以保留几天的水不溶性制剂。因此，本发明对医学和药学工业作出了显著贡献。

Claims (15)

1.一种包含锌的缓释组合物，其特征在于通过将生理学活性蛋白质或肽、水溶性锌盐、和水溶性碳酸盐和/或水溶性磷酸盐的水溶液进行混合而形成一种沉淀。
2.权利要求1的包含锌的缓释组合物，其中所述水溶性锌盐是醋酸锌或氯化锌。
3.权利要求1的包含锌的缓释组合物，其中在所述水溶性锌盐中生理学活性蛋白质或肽与锌的摩尔比为1∶100或更高。
4.权利要求1的包含锌的缓释组合物，其中所述水溶性碳酸盐是碳酸钠或碳酸氢钠。
5.权利要求1的包含锌的缓释组合物，其中所述水溶性磷酸盐是磷酸钠或磷酸氢钠。
6.权利要求1至5中任意一项的包含锌的缓释组合物，其中所述生理学活性蛋白质是G-CSF、抗体、生长激素、IFN、EPO、GM-CSF、BDNF、NT3、TNF抗体、白介素或FGF。
7.权利要求1至6中任意一项的包含锌的缓释组合物，其中所述包含锌的缓释组合物被冷冻干燥。
8.权利要求1至7中任意一项的包含锌的缓释组合物，其中所述包含锌的缓释组合物为适于皮下注射或肌内注射的形式。
9.一种包含锌的缓释制剂，其特征在于根据需要向权利要求1至7中任意一项的包含锌的缓释组合物中加入可药用添加剂。
10.权利要求9的包含锌的缓释制剂，其中所述可药用添加剂是分散剂、表面活性剂、抗菌剂或稳定剂。
11.权利要求9或10的包含锌的缓释制剂，其中所述可药用添加剂是糖。
12.权利要求9至11中任意一项的包含锌的缓释制剂，其中所述包含锌的缓释制剂被冷冻干燥。
13.权利要求9至12中任意一项的包含锌的缓释制剂，其中所述包含锌的缓释制剂是适于皮下注射和肌内注射的形式。
14.一种包含权利要求9至12中任意一项的包含锌的缓释制剂的白细胞增加剂，其中所述生理学活性蛋白质是G-CSF。
15.一种制备包含锌的缓释组合物的方法，其特征在于将生理学活性蛋白质或肽、水溶性锌盐、水溶性碳酸盐和/或水溶性磷酸盐的水溶液进行混合，从而形成一种沉淀。
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