CN1777622A - 脊髓灰质炎病毒受体功能的调节 - Google Patents

Abstract

本发明涉及干扰细胞上的脊髓灰质炎病毒受体(PVR)所介导功能的分子的鉴定、分离及其用途。该分子可被用于治疗有转移潜能的细胞、转移灶和癌症。本发明进一步提供的方法可用于鉴定和分离能够调节PVR介导的细胞粘附或侵袭潜能的分子。

Description

脊髓灰质炎病毒受体功能的调节

本发明是利用国家卫生部所给予的CA81668政府资助完成的。因此，政府在本发明中享有一定的权利。

摘要

本发明涉及干扰细胞上的脊髓灰质炎病毒受体(PVR)所介导功能的分子的鉴定、分离及其用途。该分子可被用于治疗有转移潜能的细胞、转移灶和癌症。本发明进一步提供的方法有助于鉴定和分离能够调节PVR介导的细胞粘附或侵袭潜能的分子。

发明背景

恶性肿瘤脱落的细胞会迁移至新组织并形成继发瘤。生成继发瘤的过程被称为转移，这是一个复杂过程，其中肿瘤细胞移植位点远离了原发瘤。Liotta((1986)Cancer Res.46，1-7)曾对该转移过程提出三步假设：第一步是肿瘤细胞借助于细胞表面受体实现的附着。被锚定的肿瘤细胞紧接着分泌水解酶或诱导宿主细胞分泌可降解局部基质的酶。基质溶解最可能发生在被高度定位接近于所述肿瘤细胞表面的区域中。第三步是肿瘤细胞转移进入经由蛋白质水解修饰的基质区中。最近，研究集中于鉴定转移所牵涉的特异性蛋白，这可以作为更好地诊断或改进治疗方案的基础。介导了细胞-细胞或细胞-基质相互作用的细胞粘附分子(CAM’s)被认为参与了上述转移过程。正常细胞内的细胞粘附包括许多细胞表面蛋白之间的相互作用。具体而言，已知粘附相互作用包括所述细胞周围物质与胞外粘附受体之间的相互作用。同样日渐清楚的是细胞粘附分子完成了更多可能导致细胞获得增殖能力并侵袭宿主组织的复杂功能。细胞粘附受体包括诸如选择蛋白、钙粘附蛋白、整联蛋白和免疫球蛋白的分子。

业已深入研究了整联蛋白受体家族，且众所周知粘附受体αvβ3整联蛋白影响了肿瘤细胞功能，并潜在地参与了黑素瘤生长和转移。Felding-Habermann等人(Clin Exp Metastasis (2002)19，427-36)的研究结果显示整联蛋白αvβ3的表达通过支持所述肿瘤细胞的特异性粘附、侵袭和迁移特性，从而促进了人黑素瘤中的转移表型。对黑素瘤细胞上表达的αvβ3的抑制显著减少了转移的发生，并进一步延长了动物的存活时间。Haier等人的研究结果显示肿瘤细胞粘附胞外基质蛋白的能力是转移形成的重要因素(Haier et al(2002)J.Exp.Ther.Oncol.2，237-45和Haier et al.(1999)Br.J.of Cancer 80，1867-74)。

转移形成过程也取决于肿瘤细胞的侵袭力。侵袭力描述的是肿瘤细胞迁移的潜能，而忽略了胞外基质。该胞外基质由包括胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、糖蛋白和糖胺聚糖在内的结缔组织蛋白的超分子集合体组成。通常对组织的发育和组成具有支持和营养功能，还充当了可限制正常细胞迁移的物理障碍。尽管在肿瘤酶消化分离结缔组织方面有大量资料可以利用，但与肿瘤细胞凭以穿透高度复杂的胞外基质蛋白混合物的机制有关的信息却较少。

发明目的

因此，本发明的一个目的是鉴定并分离可优选地借助于被主要表达在肿瘤细胞上的受体，调节癌症或转移细胞的粘附和/或侵袭行为的物质。

本发明发明者的成就是确定了一种试验设计，包括多种可鉴定并最终分离特定分子的功能测定试验，所述特定分子具有的主要特征是能够调节细胞的粘附和/或侵袭行为。在另一些试验中，发明者详细说明了参与细胞粘附和侵袭行为并受本发明所述分子调节的相关受体分子，即脊髓灰质炎病毒受体(PVR)及其衍生物和/或类似物。

PVR是具有N-末端信号序列、3个胞外免疫球蛋白(Ig)样结构域、跨膜结构域和胞质尾区的跨膜糖蛋白。也可被描述为特定免疫球蛋白超家族的成员，该免疫球蛋白超家族的分子大小约为80kDa，其特定结构包括3个Ig样结构域，具体而言是最外面的一个V样结构域及其后的两个C2样结构域。PVR的可选名称是CD155。

最初，PVR被发现是脊髓灰质炎的病原体，即脊髓灰质炎病毒的细胞受体。业已相当具体地研究了脊髓灰质炎病毒与PVR之间的相互作用(参见，例如Koike et al.(1991)Proc.Nat.Acad.Sci.USA88，4104-08；Belnap et al.(2000)PNAS 97，73-78；Racaniello(1996)Structure 4，769-73；Racaniello(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，11378-81)。

尽管如此，PVR的生理学功能仍然存在大量未知，PVR的生物学重要性也刚开始逐渐地得到阐明。Solecki等人((2002)J.Biol.Chem.277，25697-700)最近论述的是PVR/CD155参与介导了细胞与胞外基质分子的粘附，并在神经外胚层肿瘤内被正调节。对CD155的转录调节的分析表明存在两种有效的CD155转录调节物(激活蛋白-2和核呼吸因子-1。两种转录因子均在CNS发育期间被表达，并可能引导发展性CD155表达。CD155在神经外胚层肿瘤内的过量表达说明神经外胚层肿瘤中存在可再次激活CD155表达的基因调节途径。

Mason等人((2001)Gut 49，236-40)的研究结果表明CD155基因在结直肠肿瘤内也被过量表达，且该过量表达开始于肿瘤发生的极早期，并持续至晚期。

Lange等人((2001)Virol.285，218-227)进一步报导了多种脊髓灰质炎受体相关(PRR)蛋白对细胞粘附的介导和特异性CD155/玻连蛋白相互作用，该相互作用似乎是在次级淋巴组织的生发中心内建立正确免疫反应所必需的。

但是，CD155/PVR的生理学功能尚未被完全理解。确定蛋白的生理学作用是判断干扰该蛋白功能是否可能是治疗疾病的途径的前提。必须谨记的是在生理学环境中，即指例如在患者自然发生的肿瘤细胞内，PVR被过量表达。这种过量表达可能使细胞对刺激的反应不同，从而可以调节并改变生理学PVR功能。

相应地，本发明的一个进一步的目标是提供调节PVR功能的方式和方法，从而有助于更好地理解PVR的作用。

此外，本发明的另一个进一步的目的是研制可抑制PVR介导功能，诸如细胞的粘附性和/或侵袭力的药物组合物或药物。

发明概述

本发明第一次提供了可调节对细胞粘附、运输、侵袭和/或转移潜能而言必要的PVR功能的分子。这些分子选自小化合物、寡核苷酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、抗体、抗体片段、抗独特型抗体和/或生物偶联物。

上述分子的一个特征在于它们均可特异性地与被表达在特定细胞上的PVR、CD155或其任意衍生物或类似物的一个或多个胞内或胞外结构域结合，所述特定细胞参与了增殖性疾病或失调，并具有转移潜能或来源于自然发生的肿瘤。

该特异性结合本身和/或对上述分子所连标记的活化或诱导启动了对PVR功能的调节。换言之，由于对PVR中活性位点的阻断和/或破坏，其介导的可影响细胞粘附、运输或侵袭行为的功能被诱导、增加、稳定、加强、阻止、抑制、减少和/或削弱了。

在对可抑制自然发生的肿瘤细胞的粘附性和侵袭力的分子进行的无偏筛选中，业已意外地鉴别出与PVR的胞外结构域结合并具有氨基酸序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的特异性抗体片段，可作为所述调节物。

本发明进一步包括具有氨基酸序列LWLRRD(SEQ ID NO：1)和/或WTGDFDY(SEQ ID NO：2)的肽、多肽、蛋白质、抗体或抗体片段，它们均可特异性地结合PVR的胞外结构域并抑制细胞的粘附和/或侵袭行为。

本发明进一步涉及可翻译为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4的DNA序列(SEQ ID No.：5或6)，SEQ ID NO：5或6的DNA序列或同源的DNA序列，以及具有简并密码但仍可翻译为上述氨基酸序列的DNA序列。

本发明的一种进一步的实施方案涉及编码本发明所述任意分子或多肽的核酸分子。

本发明进一步提供了编码上述任意DNA序列的表达载体，以及含有该载体的宿主细胞。本发明还进一步提供了包括上述任意氨基酸序列、DNA序列或载体的药物组合物、生物偶联物或试剂盒。

本发明提供了可作为药剂或药物调节或抑制PVR功能和/或用于生产治疗或预防自然发生的癌症细胞的粘附、运输、侵袭和/或转移潜能的药剂或药物的上述分子，其中所述癌症细胞的粘附性、侵袭力和/或转移潜能取决于PVR介导功能。

本发明的一种进一步的实施方案涉及鉴定有助于抑制自然发生的癌症细胞的粘附性或侵袭力的配体的方法，尤其是对可结合PVR胞外结构域的配体的鉴定。该方法包括的第一步是建立配体文库。这种文库提供的典型配体是小化合物、寡核苷酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、抗体、抗体片段、抗独特型抗体和/或生物偶联物。该文库随后被用于筛选肿瘤特异性配体，进一步检验这些配体，可鉴别出在本发明进一步提供的试验中调节了所述PVR功能的配体。

本发明的一种进一步的实施方案提供了若干种可确定自然发生的癌症细胞的粘附性和/或侵袭力以及转移潜能的诊断方法，包括分离自然发生的癌症细胞、应用所述试验以确定该细胞的粘附性或侵袭力，并分析与正常细胞相比的结果。

本发明的一种进一步的实施方案涉及治疗或预防患者体内细胞的粘附、运输、侵袭和/或转移潜能的方法，其中该方法包括对需要该治疗的人施用有效量的本发明所述分子、载体和/或药物组合物。

发明详述

为使本文所述发明可以被更充分地理解，下文进行了具体描述和定义。

实现本发明目标，即调节细胞的粘附、运输和/或侵袭行为的方案是由独立权利要求的特征实现的。

业已被本发明者鉴别的上述分子具有共有特征，即它们均可特异性地结合所述PVR受体或其任意衍生物。特异性结合本发明所述PVR的分子或配体与所述PVR或其任意衍生物的结合与生理学环境无关，因而可以发生在天然存在的受体、分离受体以及柱结合受体上。

本文所用术语“PVR”包括最初发现的与CD155分子相关的脊髓灰质炎病毒受体。本文所用的PVR进一步包括已知相关PVR家族的任意成员，是通过可变RNA剪接产生的，或者是相关同源基因，即人PRR1、PRR2和PRR3基因的转录物(Racaniello(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.93 pp 11378-81；Lange et al.(2001)Virol.285，218-227)。下文描述的即使是完整的相关受体家族，例如CD155、PRR1-PRR3或它们的衍生物、类似物或片段，仍采用缩写PVR。

本发明所述分子结合PVR的一个或多个胞内或胞外区域或结构域。PVR的胞外区被定义为PVR蛋白在细胞膜外的部分，具体而言是氨基酸26与氨基酸854之间的胞外氨基酸环。更具体而言，是V样结构域和2个C2样结构域。因此，本发明所述分子特异性地识别PVR的一个或多个表位，或上文所列PVR的保守变体的表位。

本文所用术语“表位”包括任何能够特异性结合免疫球蛋白或抗体片段的蛋白决定簇。表位决定簇通常由聚集了诸如暴露的氨基酸、氨基糖的分子或其它糖侧链的化学活性表面组成，并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。应当理解的是，PVR是糖蛋白，所以，其上的氨基酸序列以及糖修饰均被认为是PVR胞外区的表位或可识别部分。

本发明所述分子的特征在于另一种功能定义，即它们均具有可作为配体，例如位于活或固定细胞上的配体特异性结合PVR的能力。本文所述“特异性结合PVR”的配体可以是在实施例的指定缓冲条件下与PVR结合的配体。配体与PVR之间的解离常数可以测定，例如通过利用被称为BIACORE的系统(参见，例如Fivash et al.Curr OpinBiotechnol.(1998)9，97-101)，“特异性地结合”便可被理解为指如果在标准条件，例如20℃、环境压力和在合适的缓冲液，例如含有20mM Tris、100mM NaCl和0,1mM EDTA且pH为7.0的缓冲液中进行测定时，配体与PVR之间的解离常数小于10μM，优选地小于1μm，更优选地小于500、400、300、200、100、50、20nM，最优选地是0,1nM-20nM。

此外，本发明所述分子具有调节PVR的生理学功能和/或相互作用的能力。“PVR功能调节分子”是可调节PVR的生物活性的分子，例如，是PVR表达细胞粘附胞外基质结构的介导、是PVR表达细胞通过正常相邻或远距组织、器官和/或胞外基质结构运输的介导、和/或是PVR表达细胞侵袭进入正常相邻或远距组织、器官或胞外基质结构的介导。通过测定一项或多项PVR生物活性指标，诸如PVR依赖性侵袭力或PVR依赖性粘附性，可评估这种对PVR生物活性的调节。这些PVR生物活性指标可通过体外或体内试验(参见实例)评估。分子抑制PVR活性的能力主要通过抑制PVR诱导的粘附性，并与侵袭性人癌症细胞(例如肉瘤细胞、乳癌细胞)的粘附进行对比，从而得到评估。

本发明所述的PVR功能调节分子并非可作为普通的蛋白质功能抑制剂的分子，如同蛋白酶、诸如脲或盐酸胍的变性剂，以及重金属原子或与生物分子(脂质、蛋白质、糖)共价且非特异性反应的小分子(例如醛或异氰酸盐)。PVR功能调节分子的特征-尤其-在于其以特定浓度调节PVR功能的能力，该特定浓度下的所述分子不能抑制胰岛素受体的功能(例如，在抗磷酸酪氨酸蛋白质印迹试验中测定的，参见例如B.Cariou et al.(2002)J Biol Chem.，277，4845-52)，或乙酰胆碱受体的功能(例如，通过测定Ca流入所确定的，参见M.Montiel et al.(2001) Biochem Pharmacol.63，337-42.)或B-CAM细胞表面糖蛋白的功能(例如，通过如Udani et al.(1998)J.Clin.Irnvest.101，2550-2558第2551页“流动腔试验”部分所述方法测定血红蛋白A红细胞(AARBCs)与固定化层粘连蛋白的结合)。只有可以相同浓度调节PVR功能，而不显著影响其它三种被提及受体的功能的分子才是本专利所采用的分子。

根据一种实施方案，所述PVR功能调节分子以特定方式结合PVR，优选但并非专有地结合PVR的胞外部分，所述特定方式即完整受体或其至少一个或多个活性结构域被所述分子覆盖，并因此不可用于其它配体。相应地，因为该受体或其活性结构域被覆盖了，所以无法发生受体介导功能。

根据另一种实施方案，所述PVR功能调节分子以特定方式结合PVR，优选但并非专有地结合PVR的胞外部分，所述特定方式即所述受体只有一个或多个活性结构域被所述分子结合，并因此不能与其它配体相互作用。相应地，无法诱导任何自然发生的受体介导功能。

根据另一种实施方案，所述PVR功能调节分子以特定方式结合PVR，优选但并非专有地结合PVR的胞外部分，所述特定方式即所述分子结合在活性结构域附近，并因此干扰和/或破坏了其它配体的结合。相应地，无法发生受体介导功能或仅发生已调节的受体介导功能。

根据另一种实施方案，所述PVR功能调节分子以特定方式结合PVR，优选但并非专有地结合PVR的胞外部分，所述特定方式即所述分子通过结合使所述受体的胞外结构域重排，并因此干扰和/或破坏了其它配体的结合。相应地，无法发生受体介导功能或仅发生已调节的受体介导功能。

根据另一种实施方案，所述PVR功能调节分子以特定方式结合PVR，优选但并非专有地结合PVR的胞外部分，所述特定方式即所述分子通过结合破坏了所述受体的一个或多个活性结构域，或者甚至是整个受体，并因此干扰和/或破坏了其它配体的结合。相应地，无法诱导受体介导功能或仅诱导已调节的受体介导功能。

根据另一种实施方案，所述PVR功能调节分子以特定方式结合PVR，优选但并非专有地结合PVR的胞外部分，所述特定方式即所述分子通过结合活化并增强了上述受体介导功能。

根据另一种实施方案，所述PVR功能调节分子以特定方式结合PVR，优选但并非专有地结合PVR的胞外部分，所述特定方式即所述分子通过结合促进了分子与所述受体或其一个或多个活性结构域的进一步结合。在该情况中，受体介导功能被增强、促进和/或延时。

本发明进一步提供了通过筛选原初或免疫文库，优选噬菌体展示文库以鉴定可特异性结合PVR的胞外区域的配体的方法，其中所述配体能够影响PVR的生物学功能，诸如粘附性和侵袭力，该方法包括下述步骤：

a)使配体的噬菌体文库与癌症细胞接触；

b)使上述癌症细胞及其结合的配体与未结合该细胞的配体分离；

c)除去非特异性结合上述细胞的噬菌体，例如通过采用缓冲的去污剂溶液在所述细胞不会裂解的条件下洗涤该细胞；

d)洗脱与上述细胞结合的噬菌体；并

e)确定上述洗脱噬菌体所展示的配体的身份；

f)利用生化或生物学试验检验上述配体干扰PVR功能的能力。

展示了步骤e)所获配体的噬菌体的身份可通过下述方法确定，例如，当该配体为抗体或抗体片段时，对编码该配体的DNA进行测序，或者在商品配体文库具有的噬菌体被网格定位或编号的情况中，则通过测定该噬菌体的网格位置或编号。该网格位置或编号可表明所述噬菌体展示的配体的身份。

步骤d)完成后，噬菌体库富集了可结合PVR的噬菌体。这些PVR结合噬菌体可最终通过本领域已知的诸多方法而得以鉴别。噬菌体可以被分离，形成单个克隆，可利用标记的PVR蛋白质或PVR蛋白质中被标记的部分，例如PVR胞外区中至少有7个氨基酸长的肽探测该噬菌体克隆。与这种探针结合的克隆被鉴定为PVR-结合物。还可利用纯化PVR蛋白质或重组PVR亲和纯化噬菌体。

可选地，当所述配体是例如，抗体或抗体片段时，可从完整的富集库中将编码该抗体或抗体片段的可读框再次克隆进表达载体中，该抗体或抗体片段可随后被表达在另一种宿主细胞的克隆中，而携带了特定表达载体的宿主细胞克隆可通过例如，上述鉴定相关噬菌体克隆的方法、实施例2和3所述方法或利用重组PVR进行的亲和纯化方法得以鉴定，其中所述特定表达载体含有编码可特异性结合PVR的抗体或抗体片段的核酸。

该方法的一个独特优势在于获得了对PVR胞外区的易接近部分具有特异性的配体，因为最初的筛选步骤是利用完整细胞进行的，而完整细胞为噬菌体结合提供了PVR胞外区的易接近部分。

在本发明的另一种优选实施方案中，所述方法包括另一个利用重组PVR蛋白质进行筛选的步骤。

该方法包括更改的步骤e)及其它步骤：

e)使分离的噬菌体与重组PVR接触；

f)采用缓冲去污剂和/或高盐溶液洗涤该PVR；并

g)洗脱结合了PVR的噬菌体；并

h)确定上述洗脱噬菌体所展示的配体的身份。

在某些实施方案中，被表达在上述噬菌体上的配体包括选自scFv、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)₂、Fv、单结构域抗体(DABs)和双抗体之一的抗体或抗体片段，更具体而言是选自scFv、dsFv、Fv、单结构域抗体或双抗体之一的抗体或抗体片段，还要更具体而言是选自scFv、单结构域抗体或双抗体之一的抗体或抗体片段，还要更优选的是scFv。

有助于噬菌体展示的噬菌体可以是所有可通过培养获得的噬菌体，且这些噬菌体可以接受遗传工程技术并能够在其表面展示外源配体。Smith et al.(1985) Science，228，1315-17公开了噬菌体展示技术，WO 91/17271则公开了抗体的噬菌体展示技术。

步骤c)和f)所采用的“去污剂”指去污剂溶液，优选缓冲的去污剂溶液，并且可以是浓度为0.001-0.5％，优选为0.01-0.1％的Tween。步骤f)中的“高盐”指高盐溶液，优选缓冲的高盐溶液，且其离子强度为10mM-1M，优选为20-500mM更优选为50-350mM，还要更优选为80-250mM。典型有用的阴离子是，例如，氯离子、柠檬酸根离子、磷酸根离子、磷酸氢根离子或硼酸根离子。典型有用的阳离子是，例如，钠离子、钾离子、锂离子、钙离子或镁离子。

上述缓冲溶液典型具有的pH为7-8。例如，可采用优选地含有1-20％、更优选地含有5-15％、还要更优选地含有大约10％FCS的DMEM或PBS作为缓冲剂。

通过以200-300g持续3-20分钟，优选5-10分钟的温和离心，可分离结合了噬菌体的细胞。通过采用pH为0-2.5，优选为1-2.5，更优选为1.5-2.5的2-100mM，优选为4-50mM，更优选为5-20mM，还要更优选地约为10mM的甘氨酸溶液，可洗脱同时结合了细胞和固定化PVR的噬菌体。

可干扰或抑制所述配体的功能性，尤其是所述抗体或抗体片段的功能性的PVR可如上所述，在体内或细胞培养试验中得到鉴定。细胞培养试验包括确定本发明所述配体在实施例8和9、9.1-9.3或实施例11和12所述侵袭、迁移或粘附试验中的抑制效果的试验。附图提供了不同试验的结果。

该方法有利地将基于结合细胞表面的筛选步骤与基于功能测定的筛选步骤结合在一起，可鉴别具有干扰或抑制PVR功能能力的配体。

在一种优选实施方案中，所述配体能够抑制PVR的生物学功能。例如，PVR的生物学功能可以是侵袭、粘附、增殖或血管生成。侵袭或迁移试验测定的是细胞的侵袭力。侵袭试验是，例如本申请书中的实施例8和9、9.1和9.2进行的试验，实施例9.3描述的是迁移试验。本申请书中的实施例11和12描述了粘附试验。

本文所用术语“侵袭力”指细胞迁移通过其它细胞层或迁移通过胞外基质的能力。可通过实施例中所描述的Matrigel试验评估侵袭力。根据本发明测定的侵袭指细胞在某一温育期间抵达滤器底面。在侵袭试验，诸如实施例所描述的一种侵袭试验中，当40％以上的细胞在6-12小时内抵达滤器另一面并形成菌落时，便将自然发生的癌症细胞定义为侵袭性。在相同时间内仅形成5％菌落的对照细胞被定义为非侵袭性。

本文所用术语“粘附性”指细胞在与其曾经赖以生长的基质分离、以单细胞(不与所述溶液中的其它细胞直接接触)溶液形式重新悬浮并再次覆盖在其可能粘附的基质上后，重新附着的能力。在实施例所述试验中，如果40％以上的细胞在30-120分钟的时间段内实现粘附，便将该细胞定义为粘附性。与之相反，在相同时间段内仅有5％实现粘附的细胞为对照细胞。

术语“血管生成”指细胞诱导新血管在其附近形成的过程。血管生成可伴随恶性组织的生长，因而可作为恶性细胞的特性。就是说恶性细胞可具有诱导血管生成的特性。

优选地，通过本发明方法鉴定癌症细胞将受配体，例如抗体或抗体片段抑制的生物学功能，诸如粘附性和侵袭力。

术语“抑制”正如PVR功能在上文提及的侵袭试验中所定义的，被理解为与除了无本发明所述分子外，其它试验条件均相同的阴性对照试验相比，功能降低了至少20％、优选的是30％、更优选的是50％，还要更优选的是60％。如果受本发明所述分子影响的功能减量小于20％，更优选的是小于15％，还要更优选的是小于10％，则该分子被定义为没有显著影响其它三种受体的功能。

此外，如果在试验中可检测到自然发生的癌症细胞的粘附性和侵袭力减量大于20％，优选的是大于60％，则本发明所述的多肽、抗体或抗体片段被认为抑制了PVR的生物学功能。

此外，就本发明所述可抑制PVR的基因表达的分子而言，当在被归一化为β微管蛋白水平的定量蛋白质印迹试验中进行测定时，当该分子在试验中的浓度为10nM-100μm，优选大约1μm，其中PVR的量是在两个其它方面一致的样品中进行比较的，而其中一个样品允许本发明所述分子抑制PVR表达时，这种分子将PVR表达降低了50％以上，优选的是80％以上，还要更优选的是90％以上，最优选的是95％以上。在相同试验中，本发明所述分子不能将每个细胞上存在的β微管蛋白的量减少20％以上，且该分子不能将胰岛素受体和B-CAM细胞表面糖蛋白的相对水平降低20％以上。

利用该方法，发明者首次提供了鉴定并随后分离PVR功能调节分子的可能性。此外，通过与可在例如激光或光束的控制下被诱导的特定标记相连，发明者能够以特定方式修饰被选定的分子，该方式即上述被选定的分子能够将PVR介导的细胞粘附行为抑制大约41％-55％(参见图3)。此外，与未经处理的细胞相比，PVR介导的细胞侵袭行为被抑制了至少25％(图2a、2b、2c或2d)。

根据本发明的一种实施方案，因具有特异性结合PVR的能力和调节PVR功能的能力而得以鉴定和/或分离的分子选自小化合物、寡核苷酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、抗体、抗体片段、抗独特型抗体和/或生物偶联物。

本发明所用的“小化合物”指分子量介于50Da-10000Da，优选地介于100Da-4000Da，更优选地介于150Da-2000Da之间的分子或其生理学可接受盐。此外，就本发明所述的小化合物而言，如果该化合物将自然侵袭性癌症细胞的粘附性降低了30％以上，优选降低60％以上，并未由此影响细胞形态、细胞周期进展(通过碘化丙锭染色和FACS分析细胞群体的DNA含量而得以确定)，且未提高培养物中显示凋亡迹象(通过采用例如通常所说的隧道试验测定显示了DNA断裂的细胞的百分比而得以确定)的细胞的百分比，则该化合物被认为调节或抑制了PVR的生物学功能。

本文所用“多肽”指含有多于10个，优选地多于20个，最优选地多于30个，并少于10000个，更优选地少于2500个，最优选地少于1000个氨基酸的分子。也包括含有低比例的修饰或非天然氨基酸的多肽。

对含有多于10000个残基的氨基酸序列而言，下文采用了术语“蛋白质”，对含有少于10个残基的氨基酸序列而言，则采用术语“肽”。也包括了含有低比例的修饰或非天然氨基酸的肽或蛋白质。

本文所用术语“抗体”和“免疫球蛋白”指所有的免疫学结合剂，包括多克隆和单克隆抗体。普通抗体具有一个共有核心结构，即两条一致轻链和两条一致重链。一条轻链与一条重链对应连接，两条重链又彼此相连。轻链与重链均含有系列的重复、同源单位，每一单位的长度约为110个氨基酸残基，这些单位独立地折叠在通常所说的免疫球蛋白(Ig)结构域中。为使抗抗原的抗体具有无限的和高的特异性，并使结构具有相关多样性，轻链和重链的N-末端包括了通常所说的可变(V)区，以区分于各链其余部分中更为保守的恒定(C)区。各V区含有三个也被称为“互补性决定区”(CDR)的高变区，因为这些序列形成了一个与结合抗原的三维表面互补的表面。抗体的CDRs是上述分子中决定其特异性并与特异性配体接触的部分。CDRs是所述分子中最易变的部分，从而使这些分子具有了多样性。在人IgG中，它们在结构上被定义为轻链的氨基酸24-41(CDR-L1)、50-57(CDR-L2)和90-101(CDR-L3)和重链的氨基酸26-38(CDR-H1)、51-70(CDR-L2)和100-125(CDR-H3)(参见Kabat et al.(1987)4th edn USDepartment of Health and Human Services，Public Health Service，NIH，Bethesda)。抗体片段的CDR区可由本领域技术人员通过将抗体片段与所述人IgG进行对比而得以确定，例如利用可运行“Blast”的NCBI程序，使两个序列相互对比，鉴别出与人IgG的CDRs对应的抗体片段的氨基酸。

本发明所述抗体还可能选自修饰的免疫球蛋白，例如通过化学或重组方法生成的抗体、CDR嫁接抗体或人源化抗体、定位诱变抗体之一。

在一种进一步的实施方案中，本发明所述分子为抗体片段，具体而言是单链抗体片段(scFv)、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)2、Fv、单结构域抗体和/或双抗体。

所用术语“抗体片段”指具有抗原结合区的抗体样分子的所有片段，该术语包括诸如scFv、dsFv、Fab′、Fab、F(ab′)2、Fv、单结构域抗体(DABs)、双抗体等的抗体片段。制备和利用多种以抗体为基础的构建体和片段的技术是本领域所熟知的(参见Kabat et al.(1991)J.Immunol.147，1709-19)。

“单链抗体片段”(scFv)含有抗体重链的可变结构域(VH)和轻链的可变结构域(VL)，其中这些结构域均出现在单条多肽链中。通常，scFv多肽进一步地在VH和VL结构域之间含有能够使scFv形成抗原结合所需理想结构的多肽接头。

“Fv”片段是保留了完整抗原结合位点的最小抗体片段。“dsFv”是二硫化稳定Fv。“F(ab′)2”片段是含有两个通过二硫键连接在铰链区的Fab片段的二价片段。“Fab”片段是抗原结合片段，含有完全与重链的VH和CH1结构域配对的轻链。“Fab”片段是还原的F(ab′)2片段。

“单结构域抗体”(DAB)是仅具有一条(而不是两条)仅来源于所述抗体结构的一个结构域的蛋白质链的抗体。DABs开拓了一个发现，即对某些抗体而言，抗体分子的一部分几乎像完整分子一样地结合了它的靶抗原(Davies et al.(1996)Protein Eng.9：531-537)。

“双抗体(diabodies)”是二价或双特异性抗体，其中的VH和VL结构域被表达在单条多肽链上，但利用了过短以至于不能使相同链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使这些结构域与另一条链上的互补结构域配对，并形成两个抗原结合位点(Holliger et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，6444-6448)。

在另一种实施方案中，本发明所述分子为多克隆或单克隆抗体，在又一种实施方案中，所述抗体为人或人源化抗体。在另外一种实施方案中，所述抗体可能包括的轻链是本发明所述的一个或两个scFv抗体片段。在又一种实施方案中，所述抗体为抗人PVR结合抗体，该抗体可能选自修饰的免疫球蛋白，例如通过化学或重组法制备的抗体或人源化抗体，基本上保留了对PVR的相同亲和力的定位诱变抗体。

在另一种实施方案中，本发明所述多肽为人抗体，选自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM之一，尤其是IgG和IgM，更具体而言是IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgG4。

通过利用本发明所述的合适分子，尤其是所述抗体片段或抗体，进一步可能制备本发明所述的抗独特型抗体。这种抗-独特型抗体可利用众所周知的杂交瘤技术制备(Kohler et al.(1975)Nature，256：495)。抗独特型抗体是可识别另一种抗体上存在的独特决定簇的抗体。这些决定簇位于所述抗体的高变区中。正是该区域结合了特定表位并从而使抗体具有了特异性。抗独特型抗体可通过用所述被关注的多肽，尤其是所述被关注的抗体片段或抗体使动物免疫而得以制备。该免疫动物将识别和应答该免疫抗体的独特型决定簇，并生成抗这些独特型决定簇的抗体。通过利用抗独特型抗体，有可能鉴别出可表达具有相同表位特异性的单克隆抗体的其它杂交瘤。本发明所述的抗独特型抗体可被用于筛选抗体并检验该抗体是否具有与本发明所述分子一样的结合特异性和功能性。

利用抗独特型技术制备可模拟表位的单克隆抗体也是可能的。例如，被制备用于抗第一种单克隆抗体的抗独特型单克隆抗体在高变区中应具有结合结构域，这是被所述第一种抗体结合的表位的“像”。因此，该抗独特型单克隆抗体可被用于免疫接种，因为该抗独特型单克隆抗体结合结构域有效地充当了抗原。

在另一种实施方案中，本发明所述分子可分别地与另一种蛋白质、可与自身形成多聚体的固体基质(例如珠子)、可进一步增强对被靶定细胞的毒性的细胞毒性剂、细胞生长抑制剂、前体药物或能够改变PVR表达细胞或募集免疫细胞的效应分子共价或非共价结合和/或偶联。所有这些结合物均是本发明所述的“生物偶联物”。

本发明所述术语“生物偶联物”包括本发明所述分子，尤其是本发明所述抗体片段或抗体，连同一个或多个细胞毒性部分，是利用多种双功能蛋白质偶联剂制备的。这种试剂的若干实例是N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫)-丙酸酯(SPDP)、亚胺酯的双功能衍生物，诸如二甲基己二酰亚胺酯HC1、诸如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯的活化酯、诸如戊二醛的醛、诸如组氨酸(R-叠氮苯甲酰基)己二胺的双叠氮化合物、诸如双-(R-重氮苯甲酰基)乙二胺的双重氮衍生物、诸如2，6-二异氰酸甲苯酯的二异氰酸酯，以及诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯的双活化氟化合物。有助于制备生物偶联物的方法是本领域技术人员已知的，被具体描述于March′s Advanced Organic Chemistry：Reactions，Mechanisms and Structure，5th Edition，Wiley-Interscience或Bioconjugate Techniques，Ed.Greg Hermanson，Academic Press中。

可与本发明所述生物偶联物连接的优选细胞毒性剂包括，但不限于道诺红菌素、紫杉醇、阿霉素、氨甲蝶呤、5FU、长春灭瘟碱、放线菌素D、表臼亚乙苷、顺式铂氨、阿霉素、染料木黄酮和核糖体抑制剂(例如天花粉蛋白)或多种细菌毒素(例如假单胞菌外毒素、金黄色葡萄球菌A蛋白)。

在一种实施方案中，这种分子是可通过抑制PVR的基因表达从而调节PVR功能的分子或寡核苷酸，例如反义寡核苷酸或干扰性双链RNAs(siRNAs)或可使细胞生成这种siRNAs的载体。此外，这种分子特异性地结合已表达的PVR并抑制与细胞的粘附性、侵袭力和/或转移潜能相关的PVR功能。

反义寡核苷酸是本领域熟知的，是降低特定基因的基因表达的方法(参见例如，Probst J.C.(2000)Methods 22(3)：271-281；HeasmanJ.(2002)Dev.Biol.243(2)：209-214；Castanotto et al.(2000)Methods Enzymol.313：401-420，以及Jen and Gewirtz(2000)Stem Cells.18(5)：307-319)。最近，业已发现短双链RNAs有效并特异性地抑制具有互补外显子序列的mRNA的表达。该现象被称为RNA干扰(RNAi)。这些双链RNAs被称为siRNAs，即小干扰RNAs，具有含至少18个、优选至少19个核苷酸的配对区(该配对双链区使其靶定具有互补外显子序列的mRNA)，并具有20-25个核苷酸，优选21-23个核苷酸的长度(Elbashir et al.(2001)Nature 411，428-429)。这些siRNAs可通过本领域熟知的方法化学合成，并可通过商业渠道获得(参见例如在上述Elbashir等人的报导和Elbashiret al.，(2002)Methods 26，199-213中提供的供应商)，或者通过利用合适的DNA模板进行T7转录获得(参见Yu et al.(2002)PNAS99，6047-6052)。它们可被送递给广泛的细胞类型，通过例如，合成两条RNA链，使它们退火并转染细胞，其中需要抑制某些基因的基因表达(参见上述Elbashir等人和Yu等人的报导)。Elbashir et al.，(2002)Methods 26，199-213描述了应用siRNAs的具体方法。

另一种影响RNA干扰的方法是转染质粒，使细胞生成siRNAs或在RNAi中也起作用的siRNA样发夹RNAs。这可通过利用同时具有siRNA的有义和反义链的质粒而得以实现，该siRNA受哺乳动物，优选人或小鼠的U6启动子的控制，该启动子可使双链在被转染细胞内转录，一部分质粒在被转染细胞内退火形成功能性双链siRNAs(Miyagishi andTaira(2002)Nature Biotech.19，497-500)。可选地，由U6启动子转录的RNA可以是由含19个碱基对的siRNA茎区与两条通过反义链末端的结构环和U_1-4 3′突出端连接在一起的链组成的siRNA样发夹RNAs(Paul et al.(2002)Nature Biotech.19，505-508)。可选地，由U6启动子转录的RNA可以是短发夹RNAs，该RNA被转录为小的临时RNAs，即含有大约70个核苷酸的短发夹前体，并被加工进其转录所在细胞内的活化siRNAs中(Paddison et al.(2002)Genes andDevelopment 16，948-958)。所有这些基于质粒转染的方法均具有共同点，即它们使细胞生成siRNAs，进而抑制了具有特定外显子区的基因，该外显子区与所述siRNA中至少18个核苷酸长的碱基配对区互补。应当清楚的是还将有其它可影响siRNAs在细胞中的存在的方法，可产生抑制PVR功能的理想效果，并且属于本发明范畴。

在另一种实施方案中，本发明所述分子被标记了可检测标记。术语“标记”或“被标记的”分别指可检测标记或下述物质的掺入，例如，通过掺入荧光团-、发色团-或放射标记的氨基酸，或者使荧光团-、发色团-或放射性标记附着多肽，或者附着可被含有荧光标记的另一种标记分子检测到的部分或可通过光学或比色法检测的酶促活性。这种两步检测体系的实例是众所周知的生物素-抗生物素蛋白体系。有多种标记多肽和糖蛋白的方法是本领域已知的，并且可以被应用(Lobl et al.(1988)Anal.Biochem.，170，502-511)。具体而言，本发明所述可检测标记的实例有放射性同位素、发色团、荧光团、酶或放射性同位素。

根据另一种实施方案，本发明所述分子被标记和/或化学修饰有可诱导标记，从而提高了生物学活性。该化学标记的诱导可通过温度升高、激光诱导或其它任意高能波而得以活化。根据本发明的一种进一步的实施方案，所述分子被化学标记有例如，上述一种或多种生色剂，结合发色团辅助激光钝化(CALI)提高了配体的生物学活性。

CALI的原理是基于可导致生成短命反应物的光化学反应的局部引发，反过来选择性地修饰了靶分子，并使其功能失活。高特异性而无抑制性的配体(例如抗体、抗体片段、小分子)被标记有合适的发色团(例如孔雀绿、荧光素、亚甲蓝、伊红)。靶分子(例如蛋白质)与所述配体形成复合物后，采用合适波长的光(激光或可见光)照射该复合物以激发发色团。该激发引发了可起动生成短命反应物(例如羟基或高反应性氧物质)的光化学反应。这些反应物在其生成位点周围的小范围内修饰了所述蛋白质。因为寿命短，反应物可活动的距离非常短。因此，对所述蛋白质中氨基酸残基的修饰发生在接近所述配体结合位点的地方。所述破坏作用局限于15-40的范围，恰好小于细胞中两个蛋白质的平均距离，即大约80，(假设平均胞质蛋白浓度为300mg/ml，蛋白质平均大小为50kDa)确保了对所述过程而言的高空间分辨率。当所述配体的结合位点接近所述蛋白质的重要功能结构域或在其内时，被诱导产生的修饰导致了所述蛋白质的永久失活。该蛋白质的功能失活是在合适的读出试验中测定的，并在诸如细胞侵袭、细胞粘附、细胞信号传导或凋亡的疾病相关生理学功能范畴内得到评估。因此，这些配体可被用于调节抑制性配体的作用。

在一种实施方案中，当采用粘附试验或侵袭试验(参见实施例)进行检验时，与人PVR结合的本发明所述修饰多肽或生物偶联物将人癌症细胞的粘附性和/或侵袭力降低了20-60％，或优选的30-55％、40-50％或者甚至至少60％。

进一步的实例是，抗特定蛋白质的修饰抗体即使在未进行CALI时并没有显示抑制功能，通常仍可在CALI后选择性地抑制该特定蛋白质的功能。当所述配体的结合位点接近所述蛋白质的重要功能结构域或在其内时，这些被诱导产生的修饰导致了所述蛋白质的永久失活。该蛋白质的功能失活是在合适的读出试验中测定的，并在诸如细胞侵袭、细胞粘附、细胞信号传导或凋亡的疾病相关生理学功能范畴内得到评估。发明者证实CALI能够将具有特异性而无抑制性的配体转化为阻断试剂(参见实施例)。

根据本发明的一种进一步的实施方案，表达CD155、PVR或其任意衍生物的细胞优选属于增殖性失调或疾病的一部分或参与其中的增殖细胞。例如，这种细胞是癌症细胞，来源自原发或转移性肿瘤的细胞或微量转移的细胞。此外，本发明所述增殖细胞是具有转移潜能的细胞，例如进入或入侵远程组织的准备状态得到加强的细胞。在本发明的另一种实施方案中，表达PVR、CD 155或它们的任意衍生物的细胞产生或来源于自然发生的肿瘤或癌症。

本文所用“产生或来源于自然发生的癌症的细胞”指在实验室中未被转染、转导或通过其它方式遗传改造过的细胞。这种细胞不含任何人工DNA序列，例如被发现仅存在于其它物种，而通常不存在于自然发生的癌症细胞所来源的物种中的载体或DNA序列。不过，自然发生的癌症细胞可能包括通常未被发现存在于其来源的物种中的序列，条件是这些序列是因为在所述自然发生的癌症细胞来源的个体内发生的突变、病毒感染和/或选择过程而出现的，和/或在连续培养该自然发生的癌症细胞期间获得的。

本文所用“转移性肿瘤”包括位于能够转移的原发部位上的肿瘤和位于继发部位的转移肿瘤。这种转移性肿瘤可来源于任意器官或组织，诸如脑、中枢神经系统、肺、胃、较低位置的肠、肝、胸，前列腺，肾或胰腺等。

本文所用的“转移潜能”指肿瘤细胞在远距其来源的原发肿瘤的部位形成新肿瘤的能力(转移)。转移潜能可通过下述方法测定，即将例如1×10⁶个细胞注射进无胸腺裸鼠的侧尾静脉，并在例如注射后2个月确定肺内的肿瘤结节数量，例如，正如Huang et al(1996)Oncogene13，2339-2347中第2346页“肿瘤细胞注射”部分或Radinsky et al.(1994)Oncogene 9：1877-1883中第1882页“动物与肿瘤的生成”和“对钙化基质的组织化学分析”部分所描述的方法。该试验中，在肺内形成多于3个，优选地多于8个，更优选地多于20个肿瘤结节的细胞系被认为具有转移性。

“微量转移”指肿瘤细胞小于2mm的积聚，通常仅可通过组织学方法检测到。

根据一种进一步的实施方案，本发明所述的增殖细胞来源于诸如下列的选定癌症细胞类型。

优选地根据本发明所述方法筛选并优选地根据本发明治疗的选定“癌症细胞类型”选自星形细胞瘤、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(PNET)、软骨肉瘤、骨肉瘤、胰管腺癌、小和大细胞肺腺癌、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、鳞状细胞癌、支气管肺泡癌、上皮腺癌、及它们的肝转移、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、肝细胞瘤、黑素瘤、胆管癌、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、基层细胞癌、汗腺瘤、乳头状癌、皮脂腺癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、维耳姆斯氏瘤、睾丸瘤、前列腺、乳房、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜细胞瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病、多发性骨髓瘤、Waldenstrom氏巨球蛋白血症、重和轻链病，以及子宫颈、子宫的腺癌和卵巢上皮癌、膀胱的移行细胞癌、B和T细胞淋巴瘤(结节性和弥散性)浆细胞瘤、急性和慢性白血病、软组织肉瘤、平滑肌肉瘤或其它任意具有高PVR表达的肿瘤细胞。

根据一种进一步的实施方案，并且如本文和实例所述一种试验设计的例证结果所示，分离出了具有氨基酸序列SEQ ID No.：3、SEQ ID No.：4、SEQ ID No.：69或SEQ ID No.：70的scFv，或具有氨基酸序列LWLRRD(SEQ ID No.：1)或WTGDFDY(SEQ ID No.：2)且特异性结合PVR并调节其功能的CDR。

在本发明的另一种实施方案中，本发明所述分子、多肽和/或生物偶联物被用于鉴别其它可在筛选试验中特异性结合人PVR的分子。这些方法需要使参照抗-PVR分子或抗体片段在假定竞争剂试验-结合剂的存在情况下与含有所述PVR结构域的靶物质接触。该接触步骤是在特定条件下进行的，该条件适合参照抗体片段与所述靶物质在试验结合剂的存在情况下形成复合物。存在试验结合剂的情况下，所述参照抗体片段与靶物质之间形成复合物是作为该试验结合剂与PVR的特异性结合活性的指标被检测的。该筛选方法有助于高通量地筛选例如，其它抗体文库或抗体片段文库、反义寡核苷酸文库或肽和小分子文库，以鉴别并表征其它可特异性结合PVR的分子。竞争是通过特定试验测定的，该试验中的被检抗体片段或其它结合剂基本上抑制了参照抗体片段与含有所述PVR结构域的靶物质的特异性结合。这是可以确定的，例如通过测定所述参照抗体片段在假定竞争剂，即在适合复合物形成的条件下可特异性结合PVR的分子存在和缺乏情况下与含有PVR结构域的靶物质的结合。许多类型的竞争结合试验是已知并可被常规应用于本发明的，正如US 4,376,110中的实例所述。这种试验典型地包括利用含有PVR结构域的靶物质(例如纯化PVR或表达PVR抗原的细胞系)、特异性结合PVR的未标记分子和标记的参照抗体片段或其它结合剂。竞争抑制是通过测定在PVR特异性结合分子存在条件下与所述靶物质结合的标记量而得以确定的。通常，PVR特异性结合分子过量存在。由上述竞争试验鉴别的PVR特异性结合分子(“竞争性结合剂”)包括可与所述参照抗体片段所结合的表位或结合位点结合的抗体、抗体片段、肽、反义寡核苷酸、小分子及其它结合剂，以及与基本上邻近参照抗体片段所结合表位的表位或结合位点结合的PVR特异性结合分子。优选地，本发明的竞争性结合剂过量存在时，将参照抗体片段与选定靶物质的特异性结合抑制了至少10％，优选的是至少25％，更为优选的是至少50％，还要更为优选的是至少75％-90％或更高。除了本发明所述多肽，尤其是本发明所述的修饰抗体片段或修饰抗体，还可应用能够特异性导向人PVR的天然或人工配体、肽、反义或其它小分子。

本发明进一步涉及通过重组技术扩增本发明所述分子，包括抗体片段，更具体而言是本发明所述的scFv、dsFv、Fv、单结构域抗体或双抗体的方法。这些技术是本领域熟知的(Skerra et al.(1993)，Curr.Opin.Immunol.5，256-62；Chadd et al.(2001)，Curr.Opin.Biotechnol.12，188-94)。

例如，编码本发明多肽，尤其是抗体片段或抗体的核酸序列(例如编码SEQ ID No.：1-4的基因)可被分离并克隆进一种或多种表达载体中，该载体可被转化进用于表达本发明所述重组多肽的合适宿主细胞系中。编码本发明所述多肽的基因的表达使该多肽的产量提高，还通过将氨基酸替代、缺失、添加及其它修饰，例如人源化修饰(Rapley(1995)Mol.Biotechnol.3：139-154)导入本发明所述抗体片段或抗体的可变和恒定区中，并且没有临界损失结合特异性或PVR阻断功能，从而实现了对该多肽的常规修饰(Skerra et al.(1993)Curr.Opin.Immunol.5，256-262)。

因此，本发明的一种进一步的实施方案包括来源于本发明所述分离分子的核酸序列。在另一种进一步的实施方案中，本发明提供了SEQ IDNo.：5、SEQ ID No.：6、SEQ ID No.：71或SEQ ID No.：72所示的核酸序列以及同源DNA序列，或具有简并密码但仍可翻译成与SEQ IDNo.：1-4或SEQ ID No.：69或SEQ ID No.：70基本上一致的氨基酸序列的DNA序列。本文所用“大体的氨基酸序列同一性”指至少70％，优选的是至少75％、80％、85％、90％，更为优选的是两个对比氨基酸序列，尤其是对比CDRs的全部氨基酸中仅有5个，还要更为优选的是仅有3个，还要更为优选的是仅有1个氨基酸不同。

本发明在另一种实施方案中进一步涉及含有本发明所述核酸的原核或真核表达载体。该载体例如，质粒、噬菌粒或粘粒。这些表达载体含有至少一个启动子、至少一个用于翻译起始的信号、至少一个本发明所述的核酸序列以及，在原核表达载体情况中的用于翻译终止的信号，而真核表达载体的情况则优选用于转录终止和用于聚腺苷酸化的其它信号。

用于在大肠杆菌中表达的原核表达载体实例是例如，US 4,952,496所述以可被T7 RNA聚合酶识别的启动子为基础的表达载体，用于在酿酒酵母中表达的真核表达载体的实例则例如，载体p426Met25或526GAL1(Mummberg et al.(1994)Nucl.Acids Res.，22，5767-5768)，用于在昆虫细胞内表达的载体例如，EP-B1-0 127 839或EP-B1-0 549 721所述的杆状病毒载体，用于在哺乳动物细胞内表达的载体例如载体Rc/CMV和Rc/RSV或SV40-载体，这些载体通常是已知的，并可通过商业渠道获得。

扩增上述表达载体的分子生物学方法和转染宿主细胞并培养被转染宿主细胞的方法，以及由该转化宿主细胞生成并获得本发明所述多肽的条件均是熟练技术人员熟知的。例如，本发明所述的核酸分子可通过合适的方式被克隆进Sambrook等人所述的表达载体中(1989)(“Molecular cloning：a laboratory manual(分子克隆：实验手册)”第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。

本发明进一步涉及含有本发明所述核酸和/或载体的宿主细胞，具体而言，其中的宿主细胞是诸如酵母或其它真菌、大肠杆菌、枯草杆菌或其它细菌的微生物。该宿主细胞还可以是高等真核起源的细胞，诸如昆虫细胞，优选病毒感染的昆虫细胞，更优选的是杆状病毒感染的昆虫细胞，或者是诸如HeLa、COS、MDCK 293-EBNA1、NS0或杂交瘤细胞的哺乳动物细胞。

本发明进一步提供了生成并复制本发明所述多肽，尤其是本发明所述抗体片段的方法，包括培养经过含有本发明所述DNA的重组载体转化的微生物，并从培养基中回收本发明所述的相应多肽，尤其是本发明所述的抗体片段或含有该抗体片段的融合蛋白。

根据本发明的一种进一步的实施方案，PVR在细胞表面的表达可在采用了含有序列列表所列SEQ ID No.：1-4或SEQ ID No.：69或SEQID No.：70中的任一序列的分子、生物偶联物或多肽、抗体或抗体片段的试验中被检测出来。该试验的样品取自被试者，例如活检标本取自被怀疑患有增殖性疾病的组织。通常，该样品在进行试验前通过众所周知的方法被处理过。可应用的试验包括ELISA、RIA、EIA、蛋白质印迹分子、免疫组织学染色等。根据被采用的试验方法，可以酶、荧光团或放射性同位素标记所述抗原或抗体(参见例如Coligan et al.(1994)Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons Inc.，New York，New York；and Frye et al.(1987)Oncogene 4，1153-1157)。该试验尤其有助于鉴定对利用PVR调节剂进行的治疗易感的患者，因为从他们的原发肿瘤或转移瘤来源的细胞显示了PVR表达。

本发明进一步提供了调节并确定自然发生的PVR表达癌症细胞的粘附性的方法。该方法测定了靶的粘附性，例如细胞对其它物质，例如另一种细胞、病毒、复杂生物学混合物，例如胞外基质或基底层的粘附性。该方法包括下述步骤：

a.使细胞与PVR功能调节分子接触；

b.使癌症细胞在适合其生长的条件下与ECM蛋白层接触；

c.分析该癌症细胞与ECM蛋白层的粘附；

d.任选地，将附着所述分子的可诱导标记活化，并再次进行步骤c)；并

e.确定与未经处理的细胞相比，步骤c)和任选步骤d)中再次附着的细胞的百分比。

本文所用术语“ECM蛋白层”被理解为一层半干的蛋白质溶液，能够培养与该蛋白层接触的癌症细胞并使侵袭性癌症细胞附着该蛋白层。该“ECM蛋白层”的厚度介于0,1mm-1mm之间，优选0,3mm厚。ECM蛋白的实例是胞外基质的物质。具体而言，ECM蛋白选自蛋白质胶原蛋白、触觉蛋白、巢蛋白、玻连蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。更具体而言，ECM蛋白选自I型胶原蛋白S、IV型胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。

在一种优选实施方案中，步骤a)的干扰分子是特异性结合PVR的胞外表位的分子，具体而言是本发明所述的修饰分子，更具体而言是本发明所述的修饰抗体或被修饰的抗体片段，还要更具体而言是被修饰的抗体片段，甚至还要更具体而言是被修饰的scFv、dsFv、Fv、单结构域抗体或双抗体。

另一种实施方案中，所述方法的步骤a)包括利用抗PVR的反义寡核苷酸、抗PVR的siRNA或siRNA样发夹RNA，或可使细胞出现抗PVR的siRNA或抗PVR的siRNA样发夹RNA的载体。尤其优选的是利用抗PVR的siRNA或siRNA样发夹RNA或可使细胞出现抗PVR的siRNAs或抗PVR的siRNA样发夹RNA的载体。

在本发明的该特定实施方案中，所述反义寡核苷酸分子抑制PVR的基因表达。优选地，抑制PVR的基因表达的分子可以是抗PVR的反义寡核苷酸、通常被称为siRNA(小干扰RNA)的抗PVR的干扰性双链RNA、作为基因表达抑制剂抗PVR功能的siRNA样发夹RNAs，或可使细胞出现抗PVR的siRNA或抗PVR的siRNA样发夹RNA的载体。

在另一种优选实施方案中，步骤d)被引入所述方法中，以将附着于本发明所述的PVR特异性结合分子的可诱导标记活化。如果，例如所连标记为发色团，则通过前述CALI的活化可能破坏PVR的临近活性结构域，并从而提高对PVR功能性的调节和/或抑制。之前显示仅具有适度调节PVR功能性的能力，例如仅具有抑制能力或者甚至仅具有PVR结合能力的分子可以因此成为PVR功能的高度潜在调节剂或抑制剂。该方法通过将癌症细胞与未活化分子所结合细胞和/或未经处理的细胞进行比较，可量化对该癌症细胞的粘附性的调节或抑制。

业已认为肿瘤细胞与宿主细胞或胞外基质之间的粘附相互作用是转移形成过程中的基础步骤。因此，利用粘附阻断剂对肿瘤细胞粘附潜能的干扰是有希望阻止转移的方法。本发明的成就不仅在于提供了可与PVR结合并如Lange et al.((2000)Virology，285，218-227)所述可能具有抑制能力的分子，还在于通过复杂和组合的筛选、选择和任选的诱导方法鉴定、分离并提供了可基本上调节或破坏特定细胞上的PVR功能的分子，该特定细胞来源于增殖性失调或疾病和/或自然发生的癌症。优选的调节是对肿瘤相关粘附行为的抑制，进一步优选的调节是通过破坏PVR的活性结构域对肿瘤相关粘附行为的阻止。

不过，本发明还提供了对所述粘附行为的活化或增强，例如增强对选定的免疫细胞，诸如天然杀伤细胞或特定合成成分的粘附行为，所述特定合成成分可以，例如在血液透析中提取所述肿瘤细胞。总之，本发明提供了可通过与活性结构域结合或将其破坏，有效阻止肿瘤相关PVR功能，即例如癌症细胞的粘附行为的分子或经过修饰或标记的分子。

肿瘤细胞迁移进入组织也是转移过程中的重要步骤。可利用跨内皮模型研究该侵袭过程(参见Woodward et al.(2002)InyestOphthalmol Vis Sci 43，1708-14 and Vachula et al.(1992)Invasion Metastasis 12，66-81)。类似的跨内皮模型提供了进一步有助于鉴定上述分子和筛选可调节或抑制PVR介导的侵袭过程的分子的体外试验方法。

因此，本发明进一步提供了调节并确定自然发生的PVR表达癌症细胞的侵袭力的方法。该方法包括下述步骤：

a.使所述细胞与PVR功能调节分子接触；

b.使所述癌症细胞在适合其生长的条件下与凝胶样基质接触；并

c.分析该癌症细胞通过所述凝胶形成基质的迁移；

d.任选地，将附着所述分子的可诱导标记活化并再次进行步骤c)；并

e.确定与未经处理的细胞相比，步骤c)和任选步骤d)中迁移的细胞百分比。

本文所用术语“凝胶样基质”指含水量至少90％的半固态物质，允许培养与该基质接触的癌症细胞，并允许侵袭性癌症细胞迁移通过0,1mm-1mm，优选0,3mm厚度的“凝胶样基质”层，但不允许非侵袭性细胞迁移。这种“凝胶样基质”的实例是与蛋白质中的胞外基质和糖类组合物类似的物质，具体而言是通过商业渠道可获得的“Matrigel”。具体而言，该“凝胶样基质”含有选自蛋白质IV型胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白之一的蛋白质。更具体而言，该凝胶样基质含有蛋白质IV型胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白。更优选的凝胶样基质含有蛋白质IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、触觉蛋白、巢蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖或IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、触觉蛋白和玻连蛋白。

在一种优选实施方案中，步骤a)的干扰分子是特异性结合PVR的胞外表位的分子，具体而言是本发明所述的修饰多肽，更具体而言是本发明所述的修饰抗体或经过修饰的抗体片段，还要更具体而言是经过修饰的抗体片段，还要更具体而言是经过修饰的scFv、dsFv、Fv、单结构域抗体或双抗体。

在另一种优选实施方案中，所述方法的步骤a)包括利用抗PVR的反义寡核苷酸、抗PVR的siRNA或siRNA样发夹RNA或可使细胞出现上述抗PVR的siRNA或抗PVR的siRNA样发夹RNA的载体。

在另一种优选实施方案中，步骤d)被引入所述方法中，以将附着本发明所述PVR特异性结合分子的可诱导标记活化。如果，例如所连标记为发色团，则通过下文所述CALI的活化可能破坏PVR的邻近活性结构域，并从而增强对PVR功能性的调节和/或抑制。之前显示仅具有适度调节PVR功能性的能力，例如仅具有抑制一种功能而不抑制其它功能的能力或者甚至仅具有PVR结合能力的分子可以因此成为PVR功能的高度潜在调节剂或抑制剂。该方法通过将癌症细胞与未活化分子所结合细胞和/或未经处理的细胞进行比较，可量化对该癌症细胞的侵袭力的调节或抑制。本发明所述对癌症细胞的侵袭行为的调节或抑制大于20％、大于40％、大于60％或者甚至大于80％的分子是优选的。

所述方法还可选择最适合个体患者的本发明所述分子，以避免任何会干扰治疗方法的个体失配。

血管生成试验测定了细胞诱导血管形成的能力，该血管形成是通常伴随恶性组织生长的过程。血管生成试验可如上述Kanda et al(2002)J.Natl.Cancer Inst.94，1311-9所述方法进行。

该试验一方面被包括在鉴定本发明所述合适分子的方法中，该合适分子除与PVR结合外还可调节其功能。不过，这些方法与鉴定本发明所述分子的方法分开也是非常有用的，因为它们提供了具有高度选择性的工具，可筛选患者来源的癌症细胞(例如通过活组织检查)，以选择本发明所述的合适分子，该分子与患者的个体PVR反应最佳，从而显示对该患者来源的癌症细胞的调节最有效。优选的，体外试验中鉴定的用于后续治疗的分子应将所述患者来源肿瘤细胞的粘附、运输或侵袭行为抑制大约20％、优选40％、50％、60％、80％或者高达90％。因此，后续治疗可经过特定调整，以避免在受体结合活性方面的个体偏差。

在令一种实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物含有有效量的至少一种，但不限定为本发明所述的一种分子，具体而言是可调节PVR功能的小化合物、抗体、抗体片段或生物偶联物，或至少一种可抑制PVR的基因表达的分子，更具体而言，其中的分子是抗PVR的反义寡核苷酸、抗PVR的干扰性dsRNA(siRNA)或siRNA样发夹RNA或可使细胞出现抗PVR的siRNA或抗PVR的siRNA样发夹RNA的载体，该药物组合物还组合含有药学可接受载体和/或稀释剂。PVR功能抑制分子还可作为单个有效化合物被用作药物或治疗组合物。

“治疗有效量”指可消除或减轻患者的肿瘤负担，或可预防、延迟或抑制转移的量。该剂量应取决于许多参量，包括肿瘤的性质、既往病史、患者情况、可能共用的细胞毒性剂以及给药方法。给药方法包括注射(例如肠胃外、皮下、静脉内、腹膜内等)，就该方法而言，PVR功能抑制分子是被提供无毒的药学可接受载体中。

“药学可接受载体”通常指为了不显著削弱结合剂的生物学活性(例如结合特异性、亲和性或稳定性)而选择的合适载体和稀释剂，诸如水、盐水、林格液、葡萄糖溶液、5％人血清白蛋白、不挥发性油、油酸乙酯或脂质体。可接受载体可能包括生物适合的惰性或生物可吸收盐、缓冲剂、寡或多糖、聚合物、诸如透明质酸的粘弹性化合物、粘性改良剂、防腐剂等。此外，药物组合物或配方还可包括其它载体、佐剂或无毒、无治疗性、无免疫原性的稳定剂、稀释剂等。典型剂量的范围可以是大约0.01到大约20mg/kg或者更具体而言是大约1到大约10mg/kg。

药物组合物可被用于治疗与人PVR过量表达或异常表达相关的病症，尤其是治疗肿瘤，具有转移潜能和/或微量转移的肿瘤，尤其是来源于上述癌症细胞类型的转移性肿瘤。

在另一种实施方案中，本发明涉及治疗或预防患者体内的任何增殖性失调或疾病、原发或继发性肿瘤以及转移的方法，该方法包括施用药学可接受组合物中所含特定量的PVR功能抑制分子，该量可有效治疗，即抑制、延迟或预防PVR介导的粘附和/或侵袭的转移，具体而言，其中的分子抑制PVR的基因表达，更具体而言，其中的分子是抗PVR的反义寡核苷酸、抗PVR的干扰性dsRNA(siRNA)或siRNA样发夹RNA或可使细胞出现抗PVR的siRNA或抗PVR的siRNA样发夹RNA的载体。可选地，具体而言，PVR功能抑制分子可以是可结合PVR胞外区的分子，可通过鉴定特异性结合PVR胞外区的配体的方法得以鉴定，更具体而言，其中的分子是本发明所述的小化合物或抗体或抗体片段或修饰多肽，或本发明所述的生物偶联物，还要更优选的是其中的分子是本发明所述经过修饰的scFv或本发明所述来源于这种scFv的修饰抗体。此外，该分子可被发色团、荧光团、酶或放射性同位素标记，可通过例如施用化学诱导物或暴露于光化学活化剂而被体内诱导或活化。治疗或预防增殖性失调、癌症、转移性肿瘤、微量转移和/或转移的方法可有效减少或抑制特定癌症细胞中自然发生的癌症细胞的粘附和/或侵袭，所述特定癌症细胞来源于上述选定癌症细胞类型的转移性肿瘤，因为该方法显示对PVR功能的阻断抑制了上述选定类型来源的癌症细胞的粘附性和/或侵袭力。在一种优选实施方案中，采用一种或多种经过修饰的抗体片段对根据本发明具有自然发生的PVR表达癌症细胞的患者进行的治疗引起或导致了对人肉瘤细胞的粘附和/或侵袭能力的降低或抑制。

本文所用的“治疗转移性肿瘤”或“治疗微量转移”指本发明所述分子以单一药物形式或与其它药物组合应用，稳定、阻止、延迟或抑制了具有转移潜能的细胞或肿瘤的转移。稳定的疾病或“无变化”(NC)描述的是在至少4周后无转移变化或减轻程度小于50％或加重程度小于25％的病程。阻止可以指例如，在治疗开始后未检测到新的转移。这可使经过治疗的患者与未经治疗的患者相比，具有了2-3倍的中位值和/或5年的存活期。延迟可以指在治疗开始后至少8周、3个月、6个月或者甚至一年的时间内未检测到新的转移。抑制可以指与未经处理的试验组相比，经由本发明所述分子治疗的试验组的新转移的平均尺寸或总数量减小了至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或者甚至90％。肿瘤学领域的熟练医师遵循已被普遍接受的转移检测实践和诊断方法，例如Harrisons Principles of Internal Medicine 15th ed2001 Mc Graw Hill所概述的方法，可检测转移的数量、尺寸和流行率。

根据一种进一步的实施方案，本发明所述的治疗方法可与多种治疗方法组合。在本文中，所述治疗与术语“治疗方法”的组合指根据肿瘤类型、患者情况、其它健康问题和多种因素，将利用PVR功能抑制分子进行的治疗方法与化学疗法、外科和放射疗法组合应用。

因此，本发明的一种实施方案是利用至少一种可结合PVR胞外区的分子，该分子可通过鉴定特异性结合PVR胞外区的配体的方法得以鉴定，更具体而言，其中的分子是本发明所述的小化合物或抗体或抗体片段或修饰多肽，或本发明所述的生物偶联物，还要更为优选的是，其中的分子是本发明所述经过修饰的scFv或本发明所述来源于这种scFv的修饰抗体，以及本发明所述的标记分子，该标记分子可通过施用或应用特定诱导物而被体内诱导或活化，所述特定诱导物可用于生产可治疗或预防自然发生的癌症细胞的粘附、侵袭和/或任何转移潜能的药物，其中所述癌症细胞的粘附性、侵袭力和/或转移潜能受PVR功能的影响。

本发明因而提供了制备药物组合物或药物的方法，包括将本发明所述分子或配体掺入治疗、预防或诊断组合物中的步骤。这可以通过例如，将已确定的配体或修饰配体与本领域已知的药学可接受载体混合而得以实现，其中配体的含量是治疗有效量。

在另一种实施方案中，本发明包括了诊断试剂盒。该试剂盒包括本发明所述的至少一种生物偶联物和/或至少一种标记分子或多肽和/或本发明所述的抗体片段或抗体，或它们的标记形式，此外还包括进行标准竞争或夹心试验所必需的试剂和材料。该诊断试剂盒可被用于测定生物学样品，尤其是某些癌症细胞类型的生物学样品的侵袭潜能。试剂盒典型地进一步包括容器。

包括所进行试验和所获结果在内的下述实例仅用于例证，对本发明不构成限制。

附图简述

图1所示为染色的HT1080细胞侵袭通过Matrigel包被的8μm滤器。37℃.温育6小时后定量荧光。所示数据为n＝3个孔的平均值+/-SD。

图2a所示为scFv1对HT1080细胞侵袭的抑制作用。侵袭是在利用Matrigel包被的细胞迁移池进行的趋化性试验中测定的。该侵袭是在激光照射(进行CALI)后测定的。HT1080细胞在缺乏所有抑制分子条件下的侵袭被用作对照(左柱)。分子scFv1将HT1080细胞的侵袭抑制了大约22％(p-值＜0.05)

图2b所示为商品抗PVR抗体(D171)、scFv3和scFv4对HT1080细胞侵袭的抑制作用。侵袭是在利用Matrigel包被的细胞迁移池进行的趋化性试验中测定的。该侵袭是在光照射之前和之后测定的(黑柱表示未进行CALI，灰柱表示进行了CALI)。HT1080细胞在缺乏所有抑制分子(0)条件下的侵袭被用作对照(左柱)。分子scFv3和scFv4将HT1080细胞的侵袭抑制了大约30％(p-值＜0.001)

图2c所示为scFv3和scFv4对MDA-MD231细胞侵袭的抑制作用。侵袭是在利用Matrigel包被的细胞迁移池进行的趋化性试验中测定的。该侵袭是在光照射之前和之后测定的(黑柱表示未进行CALI，灰柱表示进行了CALI)。HT1080细胞在缺乏所有抑制分子(0)条件下的侵袭被用作对照(左柱)。scFv3和scFv4将MDA-MD231细胞的侵袭抑制了大约23％(p-值＜0.001)

图2d所示为scFv3*和scFv4*对两种不同成胶质细胞瘤细胞系(U87MG细胞＝左侧柱组，A172＝右侧柱组)迁移的抑制作用。迁移是在光照射之前和之后测定的(黑柱表示未进行CALI，灰柱表示进行了CALI)。细胞在缺乏所有抑制分子(对照)条件下的迁移被用作对照(各组的左柱)。符号“*”表示由图10和图11所示编号区分的各scFv被克隆成IgG形式。

图3所示为scFv1和scFv2对HT1080细胞粘附I型胶原蛋白S的抑制作用。该粘附是在激光照射(进行CALI)后测定的。HT1080细胞在缺乏所有抑制分子条件下的粘附被用作对照(左柱)。分子scFv1将该粘附抑制了大约56％，分子scFv2则抑制了42％(p-值＜0.05)。

图4所示为FACS分析结果。例证了scFv1和scFv2与HT1080细胞(粗线)和对照HS-27细胞(虚线)的结合活性。也例证了scFv1与PC3-细胞、KHOS-细胞和肝细胞的结合。

图5所示为免疫沉淀试验的结果。scFv1和scFv2与HT1080细胞和对照HS-27细胞的裂解产物一起温育。通过SDS-PAGE和银染色分离免疫复合物。图示指出了scFv条带以及PVR特异性条带。

图6所示为从利用scFv1免疫沉淀所得大约75kDa大小的条带获得的肽混合物的MALDI-MS图谱。两个被标为T的胰蛋白酶自身消化峰被用于内部校准。共计6个被标记以星号的峰与PVR匹配(SwissProt，P15151)，质量偏差小于10ppm。匹配肽占所述蛋白质的18％(74/417个残基)。

图7所示为scFv展示载体pXP10的载体图和对应序列(SEQ ID No.：7)

图8所示为scFv表达载体pXP14的载体图和对应序列(SEQ ID NO.：8)

图9所示为scFv1的氨基酸序列(SEQ ID NO.：3)和核苷酸序列(SEQ ID NO.：5)

图10所示为scFv2的氨基酸序列(SEQ ID NO.：4)和核苷酸序列(SEQ ID NO.：6)

图11所示为scFv3的氨基酸序列(SEQ ID NO.：69)和核苷酸序列(SEQ ID NO.：71)

图12所示为scFv4的氨基酸序列(SEQ ID NO.：70)和核苷酸序列(SEQ ID NO.：72)

图13所示为发色团辅助激光钝化(CALI)的原理

图14所示为引物SEQ ID No.：9-52、63-68的序列。

实施例

实施例1：免疫文库的构建

采用2×10⁷个多聚甲醛固定的HT1080细胞(人纤维肉瘤细胞系；ATCC，CCL-121)皮内免疫接种两只BALB/c小鼠。初次免疫后，在39天内重复注射2次，处死小鼠，分离脾脏并冷冻在液氮中。

从两份脾脏制备物中各取出一半，利用RNeasy Midi试剂盒(QIAGEN #75142)并参照生产商所述方法分离总RNA。RNA浓度和纯度是通过变性甲醛凝胶和光度测定而得以确定的。

利用Superscript^TM II试剂盒(GibcoBRL Life Technologies#18064-014)和8.9μg新鲜制备的RNA和10pmol引物混合物(IgG1-c(SEQ ID NO.：63)、IgG2a-c(SEQ ID NO.：64)、IgG2b-c(SEQ ID NO.：65)、IgG3-c(SEQ ID NO.：66)、VLL-c(SEQ ID NO.：67)、VLK-c(SEQ ID NO.：68))合成cDNA。这些引物退火至编码κ和λ家族的IgG重链(VH)基因和轻链(VL)基因的RNA上。VH基因是利用9种正向引物(M-VH1(SEQ ID NO.：9)、M-VH2(SEQ ID NO.：10)、M-VH3(SEQ ID NO.：11)、M-VH4(SEQ ID NO.：12)、M-VH5(SEQ ID NO.：13)、M-VH6(SEQ ID NO.：14)、M-VH7(SEQ ID NO.：15)、M-VH8(SEQ ID NO.：16)、M-VH9(SEQ ID NO.：17))和4种无限制位点的反向引物(M-JH1(SEQ ID NO.：18)、M-JH2(SEQ ID NO.：19)、M-JH3(SEQ ID NO.：20)、M-JH4(SEQ ID NO.：21))的36种个体组合，通过PCR由1μl cDNA扩增而得。VL是利用一种无限制位点的引物混合物(M-VK1(SEQ ID NO.：22)、M-VK2(SEQ ID NO.：23)、M-VK3(SEQ ID NO.：24)、M-VK4(SEQ ID NO.：25)、M-VL1(SEQ ID NO.：26)、M-JK1(SEQ ID NO.：27)、M-JK2(SEQ ID NO.：28)、M-JK3(SEQ ID NO.：29)、M-JL1(SEQ ID NO.：30))通过PCR扩增而得。经过凝胶纯化(QIAquick GelExtraction Kit，#28706)PCR产物后，利用9种正向引物(MVH1 SfiI(SEQ ID NO.：31)、MVH2 SfiI(SEQ ID NO.：32)、MVH3 SfiI(SEQ ID NO.：33)、MVH4 SfiI(SEQ ID NO.：34)、MVH5 SfiI(SEQ ID NO.：35)、MVH6 SfiI(SEQ ID NO.：36)、MVH7 SfiI(SEQ ID NO.：37)、MVH8 SfiI(SEQ ID NO.：38)、MVH9 SfiI(SEQ ID NO.：39))和4种具有用于VH的限制位点的反向引物(M-JH1SalI(SEQ ID NO.：40)、M-JH2 SalI(SEQ ID NO.：41)、M-JH3 SalI(SEQ ID NO.：42)、M-JH4 SalI(SEQ ID NO.：43))的个体组合和一种具有用于VL的限制位点的引物混合物(M-VK1 ApaLI(SEQ ID NO.：44)、M-VK2 ApaLI(SEQ ID NO.：45)、M-VK3 ApaLI(SEQ ID NO.：46)、M-VK4 ApaLI(SEQ ID NO.：47)、M-VL1 ApaLI(SEQ ID NO.：48)、M-JK1 NotI(SEQ ID NO.：49)、M-JK2 NotI(SEQ ID NO.：50)、M-JK3 NotI(SEQ ID NO.：51)、M-JL1 NotI(SEQ ID NO.：52))再次将其扩增。凝胶纯化(QIAquick GelExtraction Kit，#28706)PCR产物后，利用用于VH的限制位点SfiI/SalI和用于VL的限制位点ApaLI/NotI将其克隆进噬菌体展示载体pXP10(SEQ ID No.：7)中。通过电穿孔将连接混合物转染进大肠杆菌TG-1中，获得大小为10⁷个可表达不同单链抗体片段(scFv)的独立克隆(噬菌体)的文库。

实施例2：对肿瘤细胞特异性scFv的选择(基于固定细胞进行的选择)

如下选择可表达对肿瘤细胞具有高亲和力的scFv的噬菌体：利用0.05％EDTA收获HT1080细胞，用多聚甲醛将其固定，在PBS中稀释至1×10⁷个细胞/ml，并固定在96孔UV交联板(Corning Costar)的孔上。采用溶解在PBS(MPBS)中的5％脱脂奶粉(#70166，Fluka)封闭该UV交联板的孔。用MPBS在25℃条件下将10¹² cfu(菌落形成单位)的噬菌体文库/10⁶个细胞预封闭1小时，并随后与细胞一起在室温(RT)下温育1.5小时。用PBS+0.05％Tween-20将该UV交联板的孔洗涤6次后，再用PBS洗涤6次。通过加入pH2.2的10mM甘氨酸，并以pH7.4的1M Tris/HCl中和，洗脱已结合的噬菌体。典型地，在第一轮选择中洗脱了10³-10⁶ cfu，因此，与原始的所有组成成分相比，富集的所有组成成分的多样性降低了。通过感染指数生长的大肠杆菌TG1，扩增含有富集的所有组成成分的洗脱物。选择含有噬菌粒的大肠杆菌，并使其于30℃条件下，在补充有100μg/ml氨苄青霉素和1％葡萄糖的LB琼脂平板上过夜(o/n)生长，以增殖。在该步骤后，或者将富集的所有组成成分作为多克隆集合扩增，并用于以反复方式进行进一步选择，直到实现预期特性的会聚为止，或者是被空间分离并在单克隆水平进行筛选。用于下一轮选择的噬菌体颗粒是通过下述步骤制备的，即采用辅助噬菌体VCS-M13(Stratagene，La Jolla，CA)超感染前一轮选择的指数生长培养物，并使该培养物于20℃条件下在补充有100μg/ml氨苄青霉素(amp)和50μg/ml卡那霉素(kan)的2xTY中生长过夜。利用0.5M NaCl/4％PEG-6000，从澄清的细菌上清液中沉淀出选择所获噬菌体，并使其再次悬浮于PBS中。进行一轮选择后，如实施例3所述方法在单克隆水平上进行筛选。

实施例3：scFv的筛选(基于固定细胞进行的筛选)

为进行筛选，将噬菌体展示载体所含编码选定scFv的基因再次克隆进表达载体pXP14(SEQ ID No.：8)中。该载体引导了融合有Strep-标记和E-标记的scFv的表达，并且不含丝状噬菌体基因-3。使含有单菌落来源的大肠杆菌TG1的表达载体生长在微量滴定板的独立孔中，使各孔仅含一个scFv克隆。在30℃条件下，使细菌生长在96孔微量滴定板(#9297，TPP)各孔内补充有100μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖的2xTY中，直到OD600为0.7为止。利用最终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达，并于25℃持续表达过夜。通过加入鸡蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)至最终浓度50μg/ml，在25℃条件下温育1小时，并以3000xg离心15分钟，制备出含有单链Fv的澄清裂解产物。进行筛选ELISA之前，通过加入等体积DMEM+10％FCS，将上述澄清裂解产物封闭1小时。为进行筛选ELISA，采用0.05％EDTA收获HT1080细胞，用多聚甲醛固定，在PBS中稀释至1×10⁷个细胞/ml，并将其固定在96孔UV交联板(Corning Costar)的孔内。采用MPBS封闭该UV交联板的各孔，加入含有scFv的已封闭澄清裂解产物并于25℃温育1.5小时。采用PBS+0.1％Tween-20洗涤该板2次后，再用PBS洗涤1次，与结合了HRP的α-E-标记(#27-9413-01，Pharmacia Biotech；利用含有0.1％Tween-20的MPBS将其1∶5000稀释)一起温育1小时，利用PBS+0.1％Tween-20将其洗涤3次后，再用PBS洗涤3次，用POD(#1 484 281，Roche)显影，并于370nm读出信号。

利用上述ELISA筛选方法再次检验抗HT1080细胞的阳性克隆和抗对照人成纤维细胞Hs-27(ATCC CRL-1634)的克隆，并将它们保存在甘油冻存管中。在典型的筛选中，对2760(30×92)个克隆进行筛选，与HT1080细胞的结合有5％为阳性的克隆被定义为可提供背景扣除信号＞0.1的克隆。再次检验155个阳性克隆与HT1080细胞的特异性结合，并与Hs-27对照细胞进行比较，28％的结合为阳性的克隆被定义为可提供的基于HT1080的背景扣除信号值是基于Hs-27对照细胞的信号值的至少2倍的克隆。

实施例4：对已确定的scFv的测序及其大规模表达

对scFv1-scFv4及它们的基因的测序是由德国的Sequiserve GmbH，Vaterstetten利用引物pXP2 Seq2(5’-CCCCACGCGGTTCCAGC-3’(SEQID No.：53)和pXP2 Seq1(5′TACCTATTGCCTACGGC-3′(SEQ ID No.：54)进行的。附图显示了它们的氨基酸序列和核苷酸序列。

将通过测序鉴定的独特克隆从甘油冻存管中划取出来，并划线接种至LB/Amp(100μg/ml)/1％葡萄糖琼脂平板上，于30℃温育过夜。将单菌落接种进10ml LB/Amp/Glu(1％)培养基中，使其在30℃和200rpm震荡条件下生长过夜。第二天早晨，在接种进2L椎形瓶中补充有100μg/ml氨苄青霉素和0.1％葡萄糖的1L 2xTY培养基之前，将过夜培养物置于冰上。该培养物于25℃震荡条件下生长至OD600 0.5-0.6后，用最终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导。加入50μg/ml的新鲜氨苄青霉素，并于22℃震荡条件下继续温育过夜。第二天早晨，于4℃、5000xg条件下离心该培养物15分钟，抛弃上清液，并在冰上利用吸液管小心地将沉淀重新悬浮在含有完全蛋白酶抑制剂(#1697498，Roche)的10ml预冷PBS-0.5M Na缓冲液中。重新悬浮完成后，将细菌悬液转移进20ml的akrodge离心管中，加入鸡蛋溶菌酶(#L-6876，Sigma)至最终浓度50μg/ml，并于冰上放置1小时。在4℃和20000xg条件下离心裂解的细菌15分钟，并将上清液(裂解产物)转移进15ml的塑料管中。为进行亲和纯化，借助于平行蛋白质纯化系统，以1ml/min的速率将上述裂解产物上样至经由10倍柱体积(CV)的PBS-0.5M Na缓冲液平衡过的1ml StrepTactin(#2-1505-010，IBA)柱上。采用10CV的PBS进行洗涤，并采用5CV的PBS/5mM Desthiobiotin(#D-1411，Sigma)进行洗脱，收集1ml洗脱组分。在UV280波长检测该洗脱组分，将含有蛋白质的洗脱组分混合，并利用Amicon超离心滤器装置10.000 MWCO(#UFC801024，Millipore)以4700xg将其浓缩。

在经由考马斯蓝染色的12％Bis-Tris SDS-PAGE凝胶上检查浓缩scFv的纯度，并将其分为等分试样与20％甘油一起-80℃冷冻保存。

实施例4.1：鼠scFv重构进入嵌合IgG(人-鼠)及其表达

鼠scFvs由通过接头序列连接在一起的可变轻链和重链的序列组成。该可变轻链和可变重链是分别利用引物通过PCR而得以扩增的，含有限制位点。这些限制位点还存在于特定载体中，该载体含有适合用于所述重和轻链的鼠恒定结构域。采用限制酶切割扩增的可变结构域，并将其克隆进已切割的载体中。通过测序证实序列正确。

利用4种载体，其中一种载体含有用于IgG1形式的重链的鼠恒定结构域。第二种载体含有用于IgG4形式的重链的鼠恒定结构域，另外两种载体分别含有λ和κ轻链的鼠恒定结构域。不同的限制位点可使对这些载体的切割和将这些载体中的可变结构域连接得以实现。

为使所述嵌合IgGs在哺乳动物细胞系中表达，上述载体含有埃-巴二氏病毒复制起点(oriP序列)，可提高在293-EBNA-HEK细胞内的转录水平，因为EBNA蛋白可引起游离型载体的复制。

利用用于所述重链的载体和用于所述轻链的载体进行共转染，使细胞表达两条链，并实现IgG在内质网中的装配。随后，已装配的IgG被分泌进培养基中。转染方法采用的是磷酸钙转染法，其中形成了磷酸钙与所述DNA的沉淀，将其整合进细胞中。转染后，将上述培养基更换为无血清培养基。每3天收获一次IgG，每种IgG取三份样品。无菌过滤上清液(培养基)并于4℃保存。

为了纯化IgGs，借助于A蛋白琼脂糖，根据上清液的体积，或者通过重力流动或者通过HPLC纯化上清液。对于高达200ml的体积而言，采用重力流动方法。对这两种类型的纯化方法而言，均是将上清液上样在A蛋白柱上，采用pH7的50mM Tris缓冲液洗涤，并采用pH约2-3的0.1M柠檬酸盐进行洗脱。将pH9的0.25M Tris加入洗脱组分中，使其pH值为5.5-6.0。根据IgGs的进一步用途，用PBS缓冲液对它们进行透析并于-80℃或4℃保存。

实施例5：针对肿瘤细胞特异性结合的FACS分析

为了检验纯化抗HT1080 scFv特异性结合靶细胞的能力，我们采用HT1080细胞(ATCC CCL-121)和对照细胞系Hs-27细胞(10⁶个细胞/ml)进行荧光激活细胞分选仪(FACS)分析(参见图4)。还检验了ScFv与KHOS细胞(ATCC CRL-1544)、PC-3细胞(ATCC CRL-1435)，以及张氏肝细胞(含有Hela细胞杂质的DSMZ ACC-57)(均为10⁶个细胞/ml)的结合，与HT1080细胞进行比较。4℃条件下，温育CellWash(BD(Becton，Dickinson and Company)#349524)中的细胞和10μg/ml纯scFv 20分钟，洗涤后，利用次级FITC标记的抗E-标记mab(Amersham #27-9412-01)检测已结合的scFv’s。洗涤样品并利用Becton Dickinson FACSscan对其进行分析。图4(上图)所示为与scFv1和scFv2反应的细胞的对数荧光强度(FL1-H；x-轴)与相对细胞数量(计数；y-轴)的关系曲线。细线代表对照细胞系(HS-27)，粗线则代表HT1080细胞。scFv1和scFv2特异性地使肿瘤细胞系着色，其信号强度比对照细胞系高达10倍。图4的下图所示为scFv1与PC3、KHOS和张氏肝细胞的结合，相比较于其与HT1080细胞的结合。scFv1可与全部这三种细胞系结合，但与HT1080细胞相比，这些结合的程度较低(PC3、KHOS或张氏肝细胞＝虚线)。

实施例6：通过FACS进行的竞争性分析

为检验纯化抗PVR-scFv阻断靶细胞上共有PVR表位的能力，用0,5mM EDTA/PBS收获HT1080的单细胞悬液。4℃条件下，在含有10μg/ml scFv的CellWash(BD，#349524)中温育大约1×10⁶个细胞1小时。用Cell Wash洗涤后，加入10μg/ml的FITC标记scFv，并于4℃温育20分钟。利用Becton Dickinson FACSscan对经过和未经过其它PVR结合剂预先温育的已结合FITC标记scFvs的信号进行分析。

实施例7：采用FITC对抗体片段的标记

通过下述方法，采用异硫氰酸荧光素(FITC)(Molecular Probes，Eugene，USA #F1906)标记scFv：将FITC在二甲基亚砜中形成的10mg/ml溶液的等分试样加入由100μg scFv以30∶1(FITC∶scFvl)的比率溶解于pH 9.5的PBS/0.5M NaHCO₃所形成的溶液中。室温搅拌条件下温育样品2小时，利用脱盐柱(2 Micro Spin G-25，Pharmacia27-5325-01)分离游离的FITC。标记比率是通过质谱分析法和UV/VIS光谱法确定的，由此可计算280nm的蛋白质浓度和494nm的FITC浓度。

实施例8：用于鉴定抑制性分子的侵袭试验

可采用ChemoTx^系统(Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)作为一次性使用的趋化性/细胞迁移池，该系统为具有8μm滤器的96孔形式，刻痕聚碳酸酯材质，孔径为5.7mm直径/位。

将稀释于Dulbeccos PBS(Gibco #14040-091)中的13,3μl0.3mg/ml Matrigel(Matrigel是从富含胞外基质蛋白的肿瘤，即Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤中提取的增溶性基底膜制剂。其主要成分为层粘连蛋白，其次是胶原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、触觉蛋白和巢蛋白。它还含有TGF-α成纤维细胞生长因子、组织纤溶酶原激活物及其它自然发生于EHS肿瘤内的生长因子)(Becton Dickenson，BD #356234)应用在上述96孔板B-H排的膜滤器上，用0,05M HCl(Sigma #945-50)稀释A排中1，2μg/位的I型胶原蛋白S(Roche #10982929)，并在干燥器内20℃温育过夜，使其凝胶化。HT1080细胞在补充有GlutamaxI(862mg/1(Gibco#31966-021))和10％FCS(Gibco #10270106)的DMEM中生长至70-80％铺满。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma #A-7030)洗涤该细胞2次后，用Bisbenzimide H 33342(Sigma #B-2261)原位标记，并以1∶100稀释于DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA，在37℃和7,5％CO₂条件下温育15分钟。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗涤细胞2次，加入DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA，于37℃和7,5％CO₂条件下温育15分钟，使细胞恢复。用无Ca²⁺，Mg²⁺的(PBSGibco，10010-015)洗涤细胞2次后，用0.5mM EDTA(Sigma #E8008)使细胞脱离，并用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco #15630-056)收集，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗涤2次，将细胞悬浮于DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes中，用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mM Hepes将其稀释至6,7×10⁶个细胞/ml。在冰上温育1小时比率为1∶1的6,7×10⁶个细胞/ml和40μg/ml作为抑制侵袭的阴性对照的对照scFv，以及比率为1∶1的6,7×10⁶个细胞/ml和HT1080特异性scFv。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA将细胞稀释至6,7×10⁵个细胞/ml后，将HT1080细胞和HT1080细胞/scFv稀释液吸取三份，转移至趋化池(B-H排)，密度为3,4×10⁴个细胞/孔，并于37℃和7,5％CO₂条件下温育6小时。用含有5％FCS的DMEM/GlutamaxI作为后几排池中的化学吸引剂。在I型胶原蛋白S包被的A排趋化池作出1×10⁴-4×10⁴个细胞/位的标准曲线。在后几排池中应用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(细胞未迁移)。将未迁移细胞从膜上部刮下后(除了A排的标准曲线)，利用Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板读出器以及370/460nm的激发/发射波长，测定迁移通过膜(在标准曲线的情况中未迁移)的细胞的荧光性(图1)。

实施例9：利用CALI鉴定靶的侵袭试验

该实例的原理与实例8一致，但在侵袭试验中利用了FITC-标记的scFv并另外综合了CALI方法。在CALI方法中，scFv标记有CALI可诱导标记。

可采用ChemoTx^系统(Neuro Probe Inc.#106-8，Gaithersburg)作为一次性使用的趋化性/细胞迁移池，该系统为具有8μm滤器的96孔形式，刻痕聚碳酸酯材质，孔径为5.7mm直径/位。

将稀释于Dulbeccos PBS(Gibco #14040-091)中的13,3μl0.3mg/ml Matrigel(参见实例8)应用在上述96孔板B-H排的膜滤器上，用0,05M HCl(Sigma #945-50)稀释A排中1,2μg/位的I型胶原蛋白S(Roche #10982929)，并在干燥器内20℃温育过夜，使其凝胶化。HT1080细胞在补充有GlutamaxI(862mg/l(Gibco#31966-021))和10％FCS(Gibco #10270106)的DMEM中生长至70-80％铺满。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma #A-7030)洗涤该细胞2次后，用Bisbenzimide H 33342(Sigma #B-2261)原位标记，并以1∶100稀释于DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA，在37℃和7,5％CO2条件下温育15分钟。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗涤细胞2次，加入DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA，于37℃和7,5％CO₂条件下温育15分钟，使细胞恢复。用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS(Gibco，10010-015)洗涤细胞2次后，用0.5mM EDTA(Sigma #E8008)使细胞脱离，并用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco #15630-056)收集，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗涤2次后，将细胞悬浮于DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes中，并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mMHepes将其稀释至6,7×10⁶个细胞/ml。在冰上温育1小时比率为1∶1的6,7×10⁶个细胞/ml和40μg/ml作为CALI后抑制侵袭的对照的FITC-标记抗β整联蛋白单克隆抗体(JB1，Chemicon #MAB1963)，以及比率为1∶1的6,7×10⁶个细胞/ml和HT1080特异性FITC标记scFv。将1,3×10⁵个HT1080细胞/孔或HT1080细胞/scFv或Ab稀释液吸取三份，转移进两个具有超薄透明的特殊光学平底的黑色96-孔板中(Costar #3615)。将一块板保持在黑暗处的冰上，另一块板则在冰块上接受488nm的连续波激光的照射(0.5W、30秒)。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA将细胞稀释至6,7×10⁵个细胞/ml后，将HT1080细胞和HT1080细胞/scFv的稀释液吸取三份(未接受照射的三份和接受照射的三份)，转移至趋化池(B-H排)，密度为3,4×10⁴个细胞/孔，并于37℃和7,5％CO2条件下温育6小时。用含有5％FCS的DMEM/GlutamaxI作为后几排池中的化学吸引剂。在I型胶原蛋白S包被的A排趋化池作出1×10⁴-4×10⁴个细胞/位的标准曲线。后几排池中应用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(细胞未迁移)。将未迁移细胞从膜上部刮下后(除了A排的标准曲线)，利用Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板读出器以及370/460nm的激发/发射波长，测定迁移通过膜(在标准曲线的情况中未迁移)的细胞的荧光性。在激光照射情况下进行的侵袭试验的结果如图2a所示。scFv1将侵袭抑制了大约22％。

实施例9.1：利用CALI(采用滤去蓝光的光)鉴定靶的侵袭试验

该实例的原理与实例9一致，但照射样品的是滤去蓝光的300W光，而非激光照射。

用20μg/mL异硫氰酸荧光素(FITC)标记抗体温育HT-1080细胞1小时后，由滤去蓝光的300瓦光另外照射1小时。接着分析细胞6小时通过Matrigel包被多孔膜(Neuro Probe Inc.)的侵袭力。柱状图表示被归一化为无照射条件下的侵袭百分比±标准误差，并表示至少2个各平行3次的独立试验。图2b(0)中的左柱所示为未经任何抗体处理的细胞的侵袭，D171(NeoMarker #MS-465)是通过商业渠道可获得的直接抗PVR/CD155的单克隆抗体。scFv3和scFv4这两种scFV均将HT1080细胞的侵袭抑制了大约30％。参见图2b。

实施例9.2：利用乳癌细胞进行的侵袭试验

该实例的原理与实例9.1一致，但利用了MDA-MD231乳癌细胞以取代HT1080细胞。scFv3和scFv4均显示将MDA-MD231细胞的侵袭抑制了大约23％。参见图2c。

实施例9.3：利用成胶质细胞瘤细胞(U87MG和A172细胞)进行的迁移试验

该实例的原理与实例9.1一致，但利用了Beckton Dickinson板以取代ChemoTx系统。这些Beckton Dickinson板包括由PET膜和蓝色染料(Fluoroblok)组成的嵌入部分，有助于测定仅来源于顶部或底部的荧光。各孔含有25,000个细胞(U87MG和A172)。scFv1显示将U87MG细胞的迁移抑制了大约15％(数据未显示)。scFv1*和scFv2*显示对U87MG细胞的抑制分别为16％和17％，对A172细胞的抑制分别为20％和18％(符号“*”指由图10和图11所示编号区分的对应scFv被克隆为I gG形式，参见图4.1)，结果如图2d所示。

该实例进一步研究了不同细胞系的PVR表达是如何变化的，及其与迁移行为的关联。PVR表达水平是通过对4个成胶质细胞瘤(GBM)细胞系的免疫印迹分析而得以确定的，该表达水平随后被用于分析迁移试验中的迁移行为。PVR在HT1080细胞内的表达最高，在U87和U251GBM细胞内的表达中等，在SNB19和A172 GBM细胞内的表达最低。该表达水平与GBM细胞系当中的迁移行为无关，因为U87(中等)和A172(差)的侵袭速度比SNB19(差)或U251(中等)快得多。(数据未显示)。众所周知，HT1080细胞通过过量表达N-ras而无限增殖化，且U87和U251 GBM细胞均被报导具有高组成水平的ras活性。由于这些观察结果与PVR表达水平相关，因此，对ras在调节PVR表达方面可能以某种方式发挥作用的推测是令人感兴趣的。

实施例10：MTS生存力测定

通过测定从四氮唑染料MTS(MTS，Celltiter Aqueous one，Promega#G4000)到甲的转化，以检测活细胞。将HT1080细胞和HT1080细胞/scFv稀释液(由上述粘附试验中制备的稀释液获得)吸取三份，转移进96-孔板(黑色、超薄透明平底，特殊光学，Costar #3615)中，密度为3,4×10⁴个细胞/孔。将10μl MTS加入各孔，并于37℃和7,5％CO₂条件下温育1小时。利用Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板读出器测定492nm的吸光度。对被检的scFv1和scFv2而言，未发现对细胞的生存力有任何影响。

实施例11：用于鉴定抑制性抗体片段的细胞-基质粘附试验

4℃条件下，将96-孔平底板(Costar #3614)中的21个孔包被以选自下列之一的基质蛋白过夜，即分别溶于Dulbeccos PBS(Gibco#14040-091)的I型胶原蛋白S 1μg/孔(Roche #10982929)、IV型胶原蛋白1μg/孔(Rockland 009-001-106)、纤连蛋白1μg/孔(SigmaF2518)和层粘连蛋白1μg/孔(Roche 1243217)。同时将A排中的3个孔包被以2％BSA(Sigma #A-7030)/Dulbeccos PBS，作为空白。用Dulbeccos PBS洗涤各孔2次，于37℃用2％BSA(Sigma #A-7030)/Dulbeccos PBS封闭1小时，并用Dulbeccos PBS洗涤。收获HT1080细胞，用2,5mM(最终浓度)钙黄绿素AM(Molecular Probes C-3099)染色后，用无CaCl₂无MgCl₂的PBS(Gibco 10010-015)洗涤2次，并在缓冲液(0,5％BSA(Sigma #A-7030)+10mM Hepes+DMEM(Gibco31966-02))中稀释至1,5×10⁵/ml。将HT1080细胞与10μg/ml scFv混合，并于冰上温育30分钟。将单独的HT1080细胞和HT1080/scFv稀释液吸取三份转移进96孔板中，密度为1,5×10⁴个细胞/孔，并于37℃和7,5％CO₂条件下温育1小时。用Dulbeccos PBS另外洗涤2次，将未粘附细胞洗去后，可基于A排一式三份的样品作出用DulbeccosPBS稀释所获的3,7×10³-1,5×10⁴个染色细胞/孔的标准曲线。将洗涤后的各孔充满100μl Dulbeccos PBS，并利用Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板读出器和485/520nm的激发/发射波长测定粘附细胞的吸光度和标准曲线的吸光度。

实施例12：利用CALI鉴定靶的细胞-基质粘附试验

在4℃条件下，将96孔板(TPP #9296)(经由细胞培养物处理的)的B-H排孔包被以溶于Dulbeccos PBS(Gibco #14040-091)的I型胶原蛋白S 1μg/孔(Roche #10982929)，A排的孔10-12则包被以2％BSA(Sigma #A-7030)/Dulbeccos PBS，过夜。用Dulbeccos PBS洗涤该板，并于37℃，用2％BSA/Dulbeccos PBS将B-H排和A排的孔10-12封闭1小时，再次用Dulbeccos PBS洗涤。HT1080细胞在补充有GlutamaxI(862mg/1(Gibco #31966-021))和10％FCS(Gibco#10270106)的DMEM中生长至70-80％铺满。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA(Sigma #A-7030)洗涤该细胞2次，用Bisbenzimide H 33342(Sigma #B-2261)原位标记后，以1∶100的比率稀释于DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA中，并于37℃和7,5％CO₂条件下温育15分钟。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA洗涤细胞2次，并加入DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA，于37℃和7,5％CO₂条件下温育15分钟，使细胞恢复。用无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS(Gibco，10010-015)洗涤2次后，用0.5mM EDTA(Sigma #E8008)使细胞脱离，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes(Gibco #15630-056)收集，用DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes洗涤2次后，使细胞悬浮于DulbeccosPBS/0.1％BSA/10mM Hepes中，并用Dulbeccos PBS/0.1％BSA/10mMHepes将其稀释至6,7×10⁶个细胞/ml。在冰上温育1小时比率为1∶1的6,7×10⁶个细胞/ml和40μg/ml作为CALI后抑制粘附对照的FITC-标记抗β1整联蛋白单克隆抗体(JB1，Chemicon #MAB1963)，以及比率为1∶1的6,7×10⁶个细胞/ml和HT1080特异性FITC标记scFv。将1,3×10⁵个HT1080细胞/孔或HT1080细胞/scFv或Ab稀释液吸取三份，转移进两个具有超薄透明的特殊光学平底的黑色96-孔板中(Costar #3615)。将一块板保持在黑暗处的冰上，另一块板则在冰块上接受488nm的连续波激光的照射(0.5W、30秒)。用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA将细胞稀释至6,7×10⁵个细胞/ml后，将HT1080细胞和HT1080细胞/scFv的稀释液吸取三份(未接受照射的三份和接受照射的三份)，转移至已包被和封闭的板中。在A排的孔10-12中，加入用DMEM/GlutamaxI/0.1％BSA稀释后获得的6,7×10⁵个细胞/ml作为背景对照。于37℃和7,5％CO₂条件下温育该板1小时，并用Dulbeccos PBS洗涤2次，将未粘附细胞洗去。在A排孔1-9，作1×10⁴-4×10⁴个细胞/孔的标准曲线，在其它孔中则加入50μlDulbeccos PBS。利用Fluostar Galaxy(bMG)微量滴定板读出器和370/460nm的激发/发射波长测定与I型胶原蛋白S粘附(在标准曲线的情况中未粘附)的细胞的荧光性。scFv1将粘附抑制了55.5％，scFv2则将该粘附抑制了42％。与这两种scFv对应的结果如图3所示。

实施例13：免疫沉淀

使HT1080和Hs-27细胞(10⁸)裂解在3ml含有150mM NaCl、1％Triton X-100(v/v)、蛋白酶抑制剂混合物(50ml缓冲液1丸)(Boehringer Mannheim，Cat.-No.1697498)和100μM Pefablock(Roth，Cat.-No.A154.1)的50mM Tris-HCl，pH 8.0中。4℃条件下，将裂解产物与Streptactin-偶联磁珠一起预先温育2小时，并将上清液用于免疫沉淀反应。将HT1080特异性scFv(50μg/1mg细胞提取物)加入澄清的裂解产物中，于4℃搅拌样品2小时，将其置于磁铁上，以收集管壁上的磁珠，将该磁珠洗涤4次，每次用1ml体积的PBS+0.1％Tween缓冲液，之后，通过用pH 3.1的20μl 0.1M柠檬酸盐溶液进行洗脱，使复合物与streptactin磁珠分离。立即加入5μl1M Tris-HCl pH 8.0，以中和洗脱物。通过SDS-PAGE分离该免疫复合物，银染色后用于MS分析。

scFv1和scFv2均可捕获一种蛋白质，通过银染色可使该蛋白质在SDS-PAGE上大约70kDa分子量处形成一个可检测的条带。该条带被发现仅出现在HT1080细胞提取物中，在Hs-27细胞(对照细胞)中未出现，参见图5。

实施例14：通过质谱分析进行的蛋白质鉴定

37℃条件下，对先后通过免疫沉淀和SDS PAGE所获得的凝胶条带进行胰蛋白酶胶内消化过夜。利用5％甲酸提取肽，并用ZipTip μC18(Millipore)将获得的肽混合物脱盐，首先用2μl的30％ACN/0.1％TFA进行洗脱后，再用2μl的70％ACN/0.1％TFA洗脱。将两份洗脱组分合并，将1微升所获肽混合物与α-氰-4-羟基肉桂酸溶液(3mg/ml)以1∶1的比率混合，在Teflon包被的不锈钢靶上共结晶，并利用MALDI-TOF设备进行分析，获得质量范围是m/z 800-3000的肽质量指纹图谱(PMF)。获得的PMF被用于研究NCBI和SwissProt资料库中与智人有关的所有条目。在所有情况中，仅考虑鉴定与特定蛋白质匹配且质量偏差小于10ppm的肽。

对与资料库中的PVR匹配的4-6种肽进行检测，测定值与实际质量之间的差值始终在+/-10ppm范围内。在某些实验中，将这4种肽分为2对进行观测，每一对均代表由于甲硫氨酸氧化而有或无+16Da的肽。当对该肽混合物进行去糖基化时，观测到另一种肽，该肽含有Asn120，在资料库中被注解为糖基化的。图谱如图6所示。

通过纳诺ES-MSMS还测定了另一个样品。用该方法检测了4种肽。通过CID(碰撞诱导解离)将其中的三种片段化，用于MSMS分析。获得与每一个片段对应的序列标记，并将其用于资料库研究。这三种肽与已知的脊髓灰质炎病毒受体匹配，其中的一种具有氧化的甲硫氨酸。

实施例15：表位作图方法

表位作图可根据下述方法之一进行：

实施例15.1：“经典”表位作图

将cDNA用于被关注抗原的定义片段作为重组融合蛋白或蛋白质表达，并在诸如蛋白质印迹法或ELISA的多种试验中对其进行探测。

实施例15.2：噬菌体展示技术

利用随机肽噬菌体展示文库进行表位作图的技术被发展用于将cDNA中用于被关注抗原的小随机片段克隆进丝状噬菌体的噬菌体蛋白pIII中，并将它们展示在该噬菌体的表面(Fack et al.，(1997)J.Immunol.Methods 7，43-52)。在被称为“生物淘选”的操作中，可利用抗体捕获表位展示噬菌体。对相应噬菌体的插入片段的测序提供了有关所述表位的若干信息。该方法被用于鉴定构象性表位。

实施例15.3：肽筛选技术

该技术的基础是利用Fmoc化学在活化膜上合成固定化肽。将氨基酸溶液应用于该活化膜，使该膜(用PEG活化该膜)上的氨基与所应用氨基酸的活化羧基之间形成肽键。在每一个特异性洗涤操作循环之后，对游离氨基进行乙酰化、脱保护和监测。与体内蛋白质合成相比，膜结合寡肽链是从C-到N-末端逐步合成的。含有天然以及修饰氨基酸的寡肽可被合成的长度可达20个氨基酸。合成完成后，平衡该膜并封闭非特异性结合位点。在用被关注抗体进行温育和若干个洗涤步骤后，利用HRP结合的次级抗体并结合ECL-系统进行检测。根据抗体的情况，可将膜剥离、再生并重新使用达10次。在固体支持物上合成理想地包括了被关注抗原的完整氨基酸序列的小重叠寡肽。该方法被用于鉴定氨基酸水平的线型表位。也被用于快速突变研究。

实施例16：利用抗PVR mRNA的RNAi对细胞PVR蛋白的排除

下述核糖寡核苷酸可购自例如，Proligo(Hamburg，Germany，wWW.proligo.com)、Pierce Chemical(part of Perbio Science，Rockford，Illinois，WWW.perbio.com)或RNA寡核苷酸的其它供应商：

1A    (5′-CCAGTCACTTGTCTGGAGCTT-3′)

      (SEQ ID No.：55)，

2A    (5′-GAGCTTGAAGAAGTGGGTATT-3′)

      (SEQ ID No.：56)，

1B    (5′-TGCTGGTGGC ATTACTGGTGC-3′)

      (SEQ ID No.：57)，

2B    (5′-GCTGTCCTGGCCACCCC GTGGAA-3′)

      (SEQ ID No.：58)，

3A    (5′-GGCGCGGAGCTGCGGAATGCCT-3′)

      (SEQ ID No.：59)，

4A    (5′-CCTCGCTGAGGATGTTCGGGTT-3′)

      (SEQ ID No.：60)，

3B    (5′-CCC GTGAACACAGCTGAGGTT-3′)

      (SEQ ID No.：61)，

4B    (5′-CAAGGTGGA CCCACGAGAGCTTT-3′)

      (SEQ ID No.：62)，

5A    (5’-CAACUUUAAUCUGCAACGUTT-3’)

      (SEQ ID No.：73)，

5B    (5’-TTGUUGAAAUUAGACGUUGCA-3’)

      (SEQ ID No.：74).

寡核苷酸1A和2A退火形成直接抗所述PVR mRNA的siRNA，寡核苷酸1B和2B退火形成上一对寡核苷酸的阴性对照，下有划线的核苷酸与所述PVR mRNA失配。同样，下有划线的寡核苷酸3A和4A退火形成直接抗所述PVR mRNA的siRNA，寡核苷酸3B和4B则退火形成3A/4A-对的阴性对照，黑体所示核苷酸与所述PVR mRNA失配。5A/B的靶是PVR mRNA序列(GI 19923371)的1094位。

采用Elbashir et al.，Methods(2002)26：199-213中第203页所述方案2使寡核苷酸对1A/2A、1B/2B、3A/4A、3B/4A退火。当用RNA进行研究时，需特别注意，以避免RNAse污染寡核苷酸。经过DEPC处理的水被用于制备缓冲剂。始终戴着手套以避免因皮肤接触导致的RNAse污染。有关RNA-相关研究的具体说明可参考例如ColdSpring Harbor Laboratory Press出版的Sambrook等人的“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”(1989)第二版第7.3和7.4章。

HT1080细胞在补充有Glutamax(Gibco# 31966-021)和10％FCS(Gibco #10270106)的DMEM中生长至大约90％铺满。利用上述退火的寡核苷酸对转染前24小时，从175ml的细胞培养瓶中收获上述90％铺满的细胞，例如用10ml胰蛋白酶-EDTA溶液(Life Technologies)将其胰蛋白酶化、温和离心并重新悬浮于10ml DMEM中。用含有10％FCS而无抗生素的DMEM培养基将该细胞悬液1∶10稀释，并分成500μl的等分试样，转移进24孔培养板的各孔内。接种该细胞后24小时，获得大约50％的铺满。

根据Elbashir et al.，Methods(2002)26，199-213第207页所述的方案5，利用上述退火的寡核苷酸对转染各孔内的细胞。

根据上述方案5的第5步进行2天的温育后，收获各孔的细胞，并对各孔的细胞进行加工，用于蛋白质印迹分析，例如，将来源于未经寡核苷酸转染的孔(未经处理的细胞)、经由寡核苷酸对1A/2A、1B/2B(阴性对照1/2)、3A/4A和3B/4B(阴性对照3/4)转染的孔的样品(对应相同细胞数量)加样在丙烯酰胺凝胶上，电泳结束后，例如，利用半干印迹仪器，将蛋白质印迹到例如，硝化纤维素上，并用抗PVR抗体对该硝化纤维素膜进行探测。

与未经处理的细胞相比，在样品1A/2A或3A/4A中检测到的PVR蛋白质的量降低了75％以上。与未经处理的细胞相比，在阴性对照1B/2B和3B/4B中未检测到PVR蛋白质水平的显著降低。

实施例17：抗PVR的RNAi对粘附和侵袭的抑制

HT1080细胞在补充有Glutamax(Gibco #31966-021)和10％FCS(Gibco #10270106)的DMEM中生长至大约90％扑满。利用上述退火寡核苷酸对转染前24小时，用10ml胰蛋白酶-EDTA溶液(LifeTechnologies)将从175ml细胞培养瓶中收获的90％铺满的细胞胰蛋白酶化。用含有10％FCS而无抗生素的DMEM培养基将该细胞悬液1∶10稀释，并分成500μl的等分试样，转移进24孔培养板的各孔内。接种该细胞后24小时，获得大约50％的铺满。

根据Elbashir et al.，Methods(2002)26，199-213第207页所述的方案5，利用上述退火寡核苷酸对转染各孔内的细胞。

根据上述方案5的第5步进行2天的温育后，于37℃和7,5％CO2条件下用Bisbenzimide H 33342(Sigma #B-2261)原位标记细胞15分钟。洗涤后，用0.5mM EDTA/PBS(Sigma #E8008)使细胞解离，洗涤后使其悬浮于0.1％BSA(Sigma #A7030)/DMEM中。接着用0.1％BSA/DMEM将细胞稀释至6,7×10⁵个细胞/ml，将HT1080细胞加入实例8所述的趋化池或实例11所述的96孔板。接着如实例8所述确定侵袭力，如实例11所述确定粘附性。

与未经处理的细胞相比，在至少一个样品1A/2A或3A/4A中测定的粘附性或侵袭力降低了40％以上。与未经处理的细胞相比，在阴性对照1B/2B和3B/4B中未检测到侵袭力的显著降低。

实施例17.1：抗PVR的RNAi对迁移的抑制

在类似试验中，HT1080细胞在6孔培养板中生长至大约75％铺满，利用Oligofectamine和200nM 5A/B进行转染。48小时后，用细胞追踪剂橙黄染料标记细胞，并用EGTA/Versene收获细胞。对细胞进行记数，并调整至预期浓度以根据实例9.3进行迁移试验。

实施例18：针对石蜡载玻片的免疫组织化学方案

IHC是在LifeSpan BioSciences，Inc.，Seattle，USA进行的。利用切片机获得4-5微米厚的组织切片。使该组织切片漂浮在水浴上，并转移至载玻片上。利用二甲苯和乙醇使含有石蜡切片的载玻片脱蜡，再水化，并对其实施蒸发法以提取靶(DAKO试剂 #S1700)。利用DAKO自动染色仪并遵循DAKO研发的操作和试剂进行IHC试验。具体而言，将上述载玻片封闭20分钟(用DAKO无血清蛋白质封闭剂#X0909)，应用生物素-人初级抗体，并于室温温育2小时，在TBST中漂洗该载玻片。应用载体ABC-AP(AK-5000)试剂。以载体Red(SK-5100)作为底物。所用抗体浓度为200μg/ml。在肾上腺、膀胱、脑、乳房、结肠、新、胰腺、胎盘、前列腺、皮肤、骨骼肌、小肠上皮、脾、胃、胸腺、甲状腺或子宫的正常组织内，未检测到与scFv2*对应的着色。在肾、浆细胞、肝、肺、卵巢内膜、睾丸和扁桃腺中的罕有生发中心细胞内检测到与scFv2*对应的适度着色。在癌的情况中，与scFv2*对应的从微弱到适度的着色被鉴定为结肠癌2、非小细胞肺癌1、卵巢癌2、前列腺癌4、胰腺癌7和肾细胞癌4。

实施例19：通过CALI进行的FasL-介导凋亡试验

概要：发色团辅助光钝化(CALI)可被用于钝化HT1080细胞表面上的蛋白质(例如PVR)。CALI后，利用Fas配体(FasL)(或以缓冲剂作为对照)攻击细胞，以诱导凋亡。与对照缓冲剂攻击相比，4小时后测定到半胱氨酸蛋白酶活性的提高。半胱氨酸蛋白酶活性是利用仅在被活性半胱氨酸蛋白酶裂解后才产生荧光的荧光底物测定的。如果通过CALI钝化与凋亡相关的蛋白，在加入FasL后未出现凋亡。

通过FasL处理鉴定scFv1抑制半胱氨酸蛋白酶活化的能力。在CALI后，观测到对FasL_的半胱氨酸蛋白酶反应的增强。这可通过钝化PVR进行解释。

试验设计：将HT-1080人纤维肉瘤细胞分配进微量滴定板(MTP)中，并用与异硫氰酸荧光素(FITC)结合的scFv1进行温育。CALI利用该FITC-结合的scFv以引导白炽光钝化特异性蛋白质。CALI是利用滤去蓝光的漫射光进行的。用黑暗条件处理的MTP进行对照试验。在CALI后，用凋亡诱导剂(FasL)处理细胞。短时间温育后，根据“均相Caspase检测”(Roche，Cat-No.2-236-869)所述方法，裂解细胞的同时用半胱氨酸蛋白酶的前荧光底物进行温育。裂解的游离罗丹明-110的量反映了凋亡的特异性早期/中期标记半胱氨酸蛋白酶的活性。半胱氨酸蛋白酶活性是利用自动荧光MTP读出器测定的。

利用与荧光素结合的商品抗-Fas抗体(UB2)对Fas受体(Fas)进行的CALI导致Fas的功能特异性丧失，阻断了FasL-介导的发信号。对scFv1而言的半胱氨酸蛋白酶活性大幅降低(大于20％的抑制)。无任何scFv的情况下则无CALI影响。将样品分为三份进行评估，数据为三个独立试验的代表性数据。

Claims (19)

1.一种特异性结合CD155(分化簇155)、脊髓灰质炎病毒受体(PVR)或其任意衍生物的至少一个胞内或胞外结构域的分子，其中该分子具有调节表达CD155、PVR或其任意衍生物的细胞的受体介导的粘附、运输和/或侵袭行为的能力。

2.权利要求1所述的分子，其中该分子包括小化合物、寡核苷酸、肽、寡肽、多肽、蛋白质、抗体、抗体片段、抗独特型抗体和/或生物偶联物。

3.权利要求1或2所述的分子，其中该分子是与可检测和/或可诱导标记物理相连。

4.上述权利要求1-3中任意一项所述的分子，其中调节能力包括诱导、增加、稳定、加强、阻止、抑制、减少、通过凋亡破坏和/或削弱表达CD155、PVR或其任意衍生物的细胞的粘附、运输和/或侵袭行为。

5.上述权利要求1-4中任意一项所述的分子，其中表达CD155、PVR或其任意衍生物的细胞参与了增殖性疾病或失调，具有转移潜能或者来源于自然发生的肿瘤。

6.上述权利要求1-5中任意一项所述的分子，其中该分子，优选肽、多肽、抗体、抗体片段或生物偶联物，含有氨基酸序列LWLRRD(SEQID No.：1)和/或WTGDFDY(SEQ ID No.：2)。

7.上述权利要求1-6中任意一项所述的分子，其中该分子，优选肽、多肽、抗体、抗体片段或生物偶联物，含有氨基酸序列SEQ ID No.：3、SEQ ID No.：4、SEQ ID No.：69或SEQ ID No.：70。

8.上述权利要求6或7所述的分子，其中该分子，优选肽、多肽、抗体、抗体片段或生物偶联物，含有DNA序列SEQ ID No.：5、SEQ IDNo.：6、SEQ ID No.：71或SEQ ID No.：72，或同源DNA序列或具有简并密码但仍可翻译为SEQ ID No.：1-SEQ ID No.：4、SEQ ID No.：69或SEQ ID No.：70的任意氨基酸序列的DNA序列。

9.上述权利要求1-5中任意一项所述的分子，其中该分子优选为寡核苷酸，尤其是含有选自SEQ ID No.：55-62、73或74的序列的RNA。

10.鉴定并分离权利要求1-9所述分子的方法，包括下述步骤：

a)使配体的噬菌体文库与癌症细胞接触；

b)使该癌症细胞及其结合的配体与未结合该细胞的配体分离；

c)除去非特异性结合该细胞的噬菌体，例如通过在所述细胞不裂解的条件下，用缓冲的去污剂溶液洗涤细胞；

d)洗脱与所述细胞结合的噬菌体；并

e)确定由上述洗脱噬菌体所展示的配体的身份；

e)利用生化或生物学试验检验该配体干扰PVR功能的能力。

11.编码上述任意一项或若干项权利要求所述分子或可根据权利要求10所述方法鉴定的配体的核酸分子。

12.含有权利要求11所述核酸分子的载体。

13.包括权利要求1-9所述分子、可根据权利要求10所述方法鉴定的分子或配体、权利要求11所述核酸分子、权利要求12所述载体和/或药学可接受载体和/或稀释剂的药物组合物。

14.权利要求1-9所述分子、可根据权利要求10所述方法鉴定的分子或配体、权利要求11所述核酸分子、权利要求12所述载体和/或权利要求13所述药物组合物作为用于预防和/或治疗增殖性失调、癌症或转移的药物的用途。

15.体外调节表达CD155、PVR或其任意衍生物的细胞的粘附行为的方法，该方法包括

a)使该细胞与权利要求1-9中任意一项所述分子接触；

b)使该细胞在适合其生长的条件下与ECM蛋白层接触；

c)对该细胞与ECM蛋白层的粘附进行分析；

d)任选地，在本发明所述经过化学修饰的分子被诱导提高其生物学活性之后，分析该细胞与ECM蛋白层的粘附；并

e)测定与未经处理的细胞相比，被本发明所述未修饰分子结合的细胞和/或被本发明所述已修饰和诱导分子结合的细胞再次附着的百分比。

16.体外调节表达CD155、PVR或其任意衍生物的细胞的侵袭行为的方法，该方法包括：

a)使该细胞与权利要求1-9中任意一项所述的分子接触；

b)使该细胞在适合其生长的条件下与凝胶样基质接触；

c)分析该细胞通过凝胶样基质的迁移；

f)任选地，在本发明所述经过化学修饰的分子被诱导提高其生物学活性之后，分析上述细胞通过所述凝胶样基质的迁移；并

g)测定与未经处理的细胞相比，被本发明所述未修饰分子结合的细胞和/或被本发明所述已修饰和诱导分子结合的细胞迁移的百分比。

17.治疗或预防增殖性失调或疾病、癌症和/或转移的方法，该方法包括对有需要的患者施用特定量的权利要求1-9所述的分离分子、根据权利要求10鉴定的分子或配体、权利要求11所述核酸分子、权利要求12所述载体和/或权利要求13所述药物组合物，所述的特定量是可有效调节受CD155、PVR或其任意衍生物介导的粘附、运输和/或侵袭行为的量。

18.包括权利要求1-9所述分子、可根据权利要求10所述方法鉴定的分子或配体、权利要求11所述核酸分子、权利要求12所述载体和合适的试验容器的试剂盒。

19.检测和/或分离表达CD155、PVR或其任意衍生物的细胞的方法，包括下述步骤：

a)使权利要求6或7所述分子与患者来源的癌症细胞接触；

b)分离与本发明所述分子结合的细胞

c)分离与本发明所述分子结合的细胞；并

d)检验所述分子是否检测并选择了表达PVR的细胞。

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