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CN1735433A - 哺乳动物epo模拟ch1缺失模拟体、组合物、方法和用途 - Google Patents

哺乳动物epo模拟ch1缺失模拟体、组合物、方法和用途 Download PDF

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CN1735433A
CN1735433A CNA038201100A CN03820110A CN1735433A CN 1735433 A CN1735433 A CN 1735433A CN A038201100 A CNA038201100 A CN A038201100A CN 03820110 A CN03820110 A CN 03820110A CN 1735433 A CN1735433 A CN 1735433A
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mimetibodies
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CNA038201100A
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G·A·希纳
D·M·奈特
J·格拉耶
B·J·斯卡伦
T·C·内斯珀尔
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Abstract

本发明涉及至少一种新的EP0人CH1缺失模拟体或特定部分或变体，包括编码至少一种CH1缺失模拟体或特定部分或变体的分离核酸、CH1缺失模拟体或特定部分或变体、载体、宿主细胞、转基因动物或植物，及其制备和使用方法，包括治疗组合物、方法和装置。

Description

哺乳动物EPO模拟CH1缺失模拟体、组合物、方法和用途
                         发明背景
发明领域
本发明涉及对生物学上的活性蛋白、片段或配体具有特异性的哺乳动物EPO模拟CH1缺失模拟体、特定部分或变体，EPO模拟CH1缺失模拟体编码核酸和互补核酸、宿主细胞，及其制备和使用方法，包括治疗配方、施用和装置。
相关技术
重组蛋白是一类新兴的治疗剂。这种重组体疗法在蛋白质配方和化学修饰方面已取得进展。这种修饰可潜在地增强治疗性蛋白质的治疗效用，例如通过延长半衰期(例如，通过阻碍其暴露于蛋白水解酶)，增强生物活性或减少有害副作用。一种这样的修饰是利用被融合至受体蛋白，如enteracept的免疫球蛋白片段。人们也曾利用Fc区构建治疗性蛋白质，试图提供较长的半衰期或整合诸如Fc受体结合、A蛋白结合和补体结合的功能。
哺乳动物造血系统的一个特殊且重要的作用是生成红细胞，该红细胞可将氧转运至动物体内的多个组织。生成红细胞的过程(“红细胞生成”)不间断地发生在动物的整个一生中，以弥补被破坏的红细胞。典型的红细胞具有相对短的寿命，通常为100-120天。红细胞生成是一个被精确控制的生理学机制，因而可以生成足量的红细胞，以实现恰当的组织氧合，但不会多至阻碍循环。
目前，已知红细胞生成主要受一种酸性糖蛋白，即多肽促红细胞生成素(EPO)的控制。促红细胞生成素的生成是位于哺乳动物染色体中的单拷贝基因表达的结果。重组人类EPO(“rHuEPO”)的氨基酸序列基本上与获得自人尿来源的EPO的氨基酸序列一致。但rHuEPO的糖基化与尿EPO和人类血清EPO的糖基化不同。
在健康哺乳动物体内，当组织被现有数量的循环红细胞充分氧合时，EPO在血浆中的浓度非常低。EPO的存在刺激了新的红细胞的生成，以替代那些在老化过程中损失的红细胞。另外，EPO的生成在低氧条件下被促进，其中，尽管血液足以充满组织，但对肌体组织的供氧仍然低于正常生理水平。低氧可能是出血、辐射诱发的红血球破坏、各种贫血、高海拔或长期无意识造成的。与之相反，循环中的红细胞数量超过正常组织氧合所需数量时，EPO的生成便减少了。
不过，某些疾病状态涉及异常红细胞生成。许多国家在治疗中利用了重组人类EPO(rHuEPO)。在美国，美国食品及药物管理局(FDA)已批准了rHuEPO在治疗与末期肾病相关的贫血方面的应用。为治疗该病症而接受血液透析的患者典型地患有严重贫血，这是透析治疗所导致的红细胞破裂和成熟前死亡造成的。EPO也被应用在其它类型贫血的治疗中。例如，可采用EPO治疗化学疗法诱发的贫血、与脊髓发育不良相关的贫血、与多种先天性失调相关的贫血、AIDS相关贫血和与早熟相关的贫血。此外，EPO在其它领域也可发挥作用，如促进骨髓移植患者、准备自体输血的患者和铁过载失调患者体内更快地恢复正常血细胞比容。
促红细胞生成素(EPO)是由165个氨基酸和4条糖链组成的糖蛋白激素，且通过与红细胞前体细胞表面的特定受体结合，对红细胞生成发挥了主要调节因子的作用。该结合表明它们将增殖并分化为成熟红细胞。促红细胞生成素受体是对促红细胞生成素具有高亲和性，且含有484个氨基酸的糖蛋白。对该促红细胞生成素受体而言，配体诱发的均二聚化可能是控制活化的关键事件之一。
促红细胞生成素具有相对短的半衰期。静脉内施用的促红细胞生成素的清除率符合一级动力学，其在CRF患者体内的循环半衰期约为3-4小时。在治疗剂量范围内，血浆促红细胞生成素的可检测水平被维持至少24小时。皮下施用促红细胞生成素后，5-24小时内达到峰值血清水平，并在之后缓慢降低。促红细胞生成素施用后的Cmax和t1/2分别为1.80±0.7U/mL和19.0±5.9小时。
促红细胞生成素的起始剂量范围是50-150U/kg，每周三次。促红细胞生成素的剂量必须针对不同个体施用，以使血细胞比容维持在上述建议目标范围内。对外科患者而言，促红细胞生成素的推荐剂量为在手术前皮下注射10天、手术当天和手术后皮下注射4天的300U/kg/天，或可选的每周一次皮下注射600U/kg(手术前21、14和7天)，外加手术当天第四次施用该剂量。
若干研究小组通过从任意噬菌体展示肽文库中筛选出对促红细胞生成素受体具有亲和性的肽，从而鉴定出促红细胞生成素的小肽模拟物。其序列与促红细胞生成素无同源性。在功能性试验中，有若干种上述肽显示了活性，但仅为重组促红细胞生成素的活性的1/100,000。尽管人们通过制备肽模拟物的共价二聚体或多聚体，为提高上述肽的效价进行了若干尝试，但上述化合物的活性按摩尔计仍然比促红细胞生成素低1,000-10,000倍。
促红细胞生成素来源的肽序列也已被权利要求为是增效的。也有报导表明包含多个或全部天然促红细胞生成素序列的二聚化序列的活性被提高了。这些化合物具有很低或者无口服生物利用率，且其活性也使其在目前的商业上不具有可行性。
因此，需要提供EPO治疗性蛋白质的改良和/或修饰版本，以克服上述一个或多个难题，以及本领域已知的其它难题。
                         发明概述
如此处所描述和/或实践的方法，并结合本领域所已知的方法，本发明提供了分离的人类EPO模拟CH1缺失模拟体，包括修饰的免疫球蛋白、裂解产物和其它特定部分及其变体，也提供了EPO模拟CH1缺失模拟体组合物、编码或互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、配方、装置、转基因动物、转基因植物，及其制备和应用方法。
本发明也提供了如此处所描述和/或本领域已知的至少一种分离EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。该EPO模拟CH1缺失模拟体可任选地包含至少一个CH3区，该CH3区与至少一个CH2区直接相连，该CH2区与至少一个铰链区或其片段直接相连，该铰链区或其片段与至少一个部分V区直接相连，该部分V区与任意接头序列直接相连，该接头序列与至少一个治疗性肽直接相连，该治疗性肽则任选地进一步与至少一个可变抗体序列的至少一个部分直接相连。在一对具有任选N末端抗体序列的CH3-CH2-铰链-部分J序列-接头-治疗性肽的一种优选实施方案中，是任选地通过缔合或共价键，例如，但不仅限于Cys-Cys二硫键连接成对。一种实施方案中，EPO模拟CH1缺失模拟体包括分子式(I)：(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1为免疫球蛋白可变区N末端的至少一个部分，Pep为至少一个具有生物活性的EPO模拟多肽，Flex为通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而提供了结构柔性的多肽，V2为免疫球蛋白可变区C末端的至少一个部分，pHtinge为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH 3恒定区的至少一个部分，n和m可为1-10中的整数，模拟不同类型的免疫球蛋白分子，例如，但不仅限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE等，或其组合。
因此，本发明的EPO模拟CH1缺失模拟体在保持固有特性和功能的情况下，模拟了抗体或免疫球蛋白结构或功能的至少一个部分，同时还提供了一种治疗性肽及其体外、体内或原位所固有或获得的特性或活性。采用此处描述的方法，并结合本领域已知的方法，可改变本发明抗体的多个部分和至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体的治疗性肽部分。
本发明一方面提供了包含特定多核苷酸的分离核酸分子，与该特定多核苷酸互补的分离核酸分子，与该特定多核苷酸具有显著同一性的分离核酸分子或与其杂交的分离核酸分子，其中该特定多核苷酸编码特定模拟体或其特定部分或变体，并包括其至少一个特定序列、区域、部分或变体。本发明进一步提供了包含至少一种上述分离EPO模拟CH1缺失模拟体核酸分子的重组载体、含上述核酸和/或重组载体的宿主细胞，以及上述EPO模拟CH1缺失模拟体核酸、载体和/或宿主细胞的制备和/或应用方法。
本发明的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体模拟了该模拟体Pep部分与至少一个配体的结合，或者具有至少一种蛋白质、亚单位、片段、部分或其任意组合的至少一种生物学活性。
本发明也提供了此处所描述和/或本领域已知的至少一种分离EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体，其中EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体具有至少一种活性，例如，但不仅限于与分子式为I的Pep部分对应的至少一种具有生物活性的肽或多肽的已知生物活性。因此，根据已知方法可筛选出具有相应活性的EPO模拟CH1缺失模拟体，该相应活性诸如针对一种蛋白质或其片段的至少一种中和活性。
本发明也提供了至少一种组合物，该组合物包含了(a)编码此处所描述的核酸和/或EPO模拟CH1缺失模拟体的至少一种分离EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体；和(b)一种合适的载体或稀释剂。根据已知方法，该载体或稀释剂可任选地为制药学可接受载体或稀释剂。该组合物可任选地进一步包含至少一种其它的化合物、蛋白质或组合物。
本发明也提供了至少一种用于在宿主细胞内表达至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的方法，包括在特定条件下培养此处所描述和/或本领域已知的宿主细胞，在该条件下，至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体以可检测和/或可回收的量被表达。
本发明进一步提供了特定方法或组合物中的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体、特定部分或变体，当以治疗有效量施用该EPO模拟CH1缺失模拟体、特定部分或变体时，可根据多种不同情况，例如，但不仅限于在本领域已知的相关疾病或治疗条件之前、之后或期间的需要用于调节、治疗或缓解下述至少一种症状，包括骨和关节失调、心血管失调、齿或口失调、皮肤失调、耳、鼻或咽喉失调、内分泌或代谢失调、肠胃失调、妇科失调、肝或胆失调、产科失调、血液失调、免疫或变应性失调、传染病、肌骨骼失调、肿瘤失调、神经失调、营养失调、眼科失调、儿科失调、中毒失调、精神病学失调、肾失调、肺失调或其它任何已知的失调(见例如被完整引入作为参考的TheMerck Manual，17thed.，Merck Research Laboratories，MerckandCo.，Whitehouse Station，NJ(1999))。
本发明进一步提供了特定方法或组合物中的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体、特定部分或变体，当以治疗有效量施用该EPO模拟CH1缺失模拟体、特定部分或变体时，可用于调节、治疗或缓解细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种免疫、心血管、传染性、恶性和/或神经疾病症状，和/或根据多种不同情况，例如，但不仅限于在本领域已知和/或此处所描述的相关疾病或治疗条件之前、之后或期间的需要而施用。
本发明也提供了至少一种用于送递治疗或预防有效量的至少一种本发明EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的组合物、装置和/或方法。
本发明进一步提供了针对本发明至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体的至少一种抗独特型抗体。该抗独特型抗体包括含有特定分子的任意蛋白质或肽，该特定分子包含免疫球蛋白分子的至少一个部分，例如，但不仅限于重或轻链的至少一个互补决定区(CDR)或其配体结合部分、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区，或其任意部分，且该免疫球蛋白分子竞争性地结合本发明至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体的EPO受体结合区。本发明的独特型抗体可包括或来源于任何哺乳动物，例如，但不仅限于人类、小鼠、兔、大鼠、啮齿动物、灵长类动物等的独特型抗体。
本发明也提供了至少一种包含特定多核苷酸的分离核酸分子、与该特定多核苷酸互补的分离核酸分子，或与该特定多核苷酸杂交的分离核酸分子，其中该特定多核苷酸编码至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体抗独特型抗体，并包括其至少一个特定序列、区域、部分或变体。本发明进一步提供了包含上述EPO模拟CH1缺失模拟体抗独特型抗体编码核酸分子的重组载体、含上述核酸和/或重组载体的宿主细胞，以及上述抗独特型抗体核酸、载体和/或宿主细胞的制备和/或应用方法。
本发明也提供了至少一种用于在宿主细胞内表达至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或EPO模拟CH1缺失模拟体抗独特型抗体的方法，该方法包括在特定条件下培养此处描述的宿主细胞，其中在该条件下，至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或抗独特型抗体以可检测和/或可回收的量被表达。
本发明也提供了至少一种组合物，该组合物包含(a)此处描述的分离EPO模拟CH1缺失模拟体编码核酸和/或EPO模拟CH1缺失模拟体；和(b)一种合适的载体或稀释剂。根据已知的载体或稀释剂，该载体或稀释剂可任选为制药学可接受载体或稀释剂。该组合物可任选地进一步包含至少一种其它的化合物、蛋白质或组合物。
本发明进一步提供了至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体方法或组合物，可施用治疗有效量以调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种蛋白质相关状况，和/或施用于本领域已知和/或此处所描述的相关状况之前、之后或期间。
本发明也提供了至少一种用于送递治疗或预防有效量的至少一种本发明EPO模拟CH1缺失模拟体的组合物、装置和/或方法。
本发明进一步提供了至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体方法或组合物，可用于诊断细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种EPO相关状况，和/或应用于本领域已知和/或此处所描述的相关状况之前、之后或期间。
本发明也提供了至少一种用于送递本发明至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体以进行诊断的组合物、装置和/或方法。
一方面，本发明提供了至少一种分离的哺乳动物EPO模拟CH1缺失模拟体，该模拟体包含至少一个Pep(n)区，该区域包含如下表1所示SEQ ID NO：1-42中至少一个序列的至少一个部分，或者任选地具有此处所描述或本领域已知的一个或多个替代、缺失或插入部分。另一方面，本发明提供了至少一种分离的哺乳动物EPO模拟CH1缺失模拟体，其中该EPO模拟CH1缺失模拟体可与特定的至少一个表位特异性结合，或任选地具有此处所描述或本领域已知的一个或多个替代、缺失或插入部分，其中上述表位包含至少1-3个至少一种配体或结合区，而该配体可与下表1所示SEQ ID NO：1-42中至少一个序列的至少一个部分结合。
上述至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体可任选地进一步包含至少一种结合蛋白，该结合蛋白具有选自至少10-9M、至少10-10M、至少10-11M或至少10-12M之一的亲和性；基本上中和了至少一种蛋白质或其部分的至少一种活性。本发明也提供了编码至少一种分离哺乳动物EPO模拟CH1缺失模拟体的分离核酸；包含该分离核酸的分离核酸载体，和/或包含该分离核酸的原核或真核宿主细胞。该宿主细胞可任选地至少为选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤细胞，或上述细胞的任意衍生、无限增殖化或转化细胞之一的细胞。本发明也提供了用于生成至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体的方法，该方法包括在体外、体内或原位条件下翻译EPO模拟CH1缺失模拟体编码核酸，使该EPO模拟CH1缺失模拟体以可检测或可回收的量被表达。
本发明也提供了包含至少一种分离哺乳动物EPO模拟CH1缺失模拟体和至少一种制药学可接受载体或稀释剂的组合物。该组合物可任选地进一步包含有效量的至少一种特定化合物或蛋白质，该特定化合物或蛋白质选自至少一种可检测标记或报道分子、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于体液或电解液平衡的药物、血液药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼、耳或鼻用药、局部用药、营养药、TNF拮抗药、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉剂、非类固醇抗炎症药物(NSAID)、镇痛药、麻醉药、镇静剂、局部麻醉药、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素取代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、气喘药、β增效剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
本发明进一步提供了可与本发明至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体特异性结合的抗独特型抗体或片段。
本发明也提供了用于诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的疾病症状的方法，包括
(a)使细胞、组织、器官或动物接触或对其施用包含有效量的本发明至少一种分离哺乳动物EPO模拟CH1缺失模拟体的组合物。该方法可任选地进一步包括采用每公斤细胞、组织、器官或动物重量施用0.001-50mg的有效量。该方法可任选地进一步包括通过至少一种选自肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮的方式接触或施用。该方法可任选地进一步包括在(a)接触或施用之前、同时或之后施用至少一种组合物，该组合物含有有效量的至少一种特定化含物或蛋白质，该化合物或蛋白质选自至少一种可检测标记或报道分子、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于体液或电解液平衡的药物、血液药物、抗肿瘤、免疫调节药物、眼、耳或鼻用药、局部用药、营养药、TNF拮抗药、抗风湿药物、肌肉松弛剂、麻醉剂、非类固醇抗炎症药物(NSAID)、镇痛药、麻醉药、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、促红细胞生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素取代药物、放射性药物、抗抑郁药、抗精神病药、兴奋剂、气喘药、β增效剂、吸入类固醇、肾上腺素或类似物、细胞因子或细胞因子拮抗剂。
本发明也提供了包含本发明至少一种分离的哺乳动物EPO模拟CH1缺失模拟体的医学装置，其中该装置适合通过至少一种选自肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮的方式接触或施用至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体。
本发明也提供了用于人类药物或诊断用途的制品，包括包装材料和含有溶液或冻干形式的本发明至少一种分离哺乳动物EPO模拟CH1缺失模拟体的容器。该制品可任选地包括将容器作为肠胃外、皮下、肌肉内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮送递装置或系统的一个组成部分。
本发明也提供了用于制备本发明至少一种分离哺乳动物EPO模拟CH1缺失模拟体的方法，该方法包括提供能够表达可回收量的EPO模拟CH1缺失模拟体的宿主细胞或转基因动物或转基因植物或植物细胞。本发明进一步提供了通过上述方法制备的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体。
本发明也提供了至少一种用于在宿主细胞中表达至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或抗独特型抗体的方法，该方法包括在特定条件下培养此处所描述的宿主细胞，在该条件下，至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体以可检测和/或可回收的量被表达。
本发明进一步提供了此处所描述的任何发明。
                      发明详述
本发明提供了分离的、重组的和/或合成的模拟体或特定部分或变体，以及包含至少一种特定多核苷酸的组合物和编码核酸分子，该特定多核苷酸编码至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体。上述本发明模拟体或特定部分或变体包含了特定的EPO模拟CH1缺失模拟体序列、区域、片段及其特定变体，且本发明也提供了上述核酸和模拟体或特定部分或变体的制备和应用方法，包括治疗性组合物、方法和装置。
本发明也提供了此处所描述和/或本领域已知的至少一种分离的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。该EPO模拟CH1缺失模拟体可任选地包含至少一个CH3区，该CH3区与至少一个CH2区直接相连，该CH2区与至少一个铰链区或其片段直接相连，该铰链区或其片段与至少一个部分V区直接相连，该部分V区与任意接头序列直接相连，该任意接头序列与至少一个治疗性肽直接相连，该治疗性肽则任选地进一步与至少一个可变抗体序列的至少一个部分直接相连。
一种优选实施方案中，EPO模拟CH1缺失模拟体包含分子式(I)：(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)其中V1为免疫球蛋白可变区N末端的至少一个部分，Pep为至少一个具有生物活性的肽，Flex为通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而提供了结构柔性的多肽，V2为免疫球蛋白可变区C末端的至少一个部分，pHinge为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n和m可为1-10中的整数，模拟不同类型的免疫球蛋白分子，例如，但不仅限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD、IgE等，或其组合。m＝1时的单体可通过缔合或共价键，例如，但不仅限于Cys-Cys二硫键与其它单体相连。因此，本发明的EPO模拟CH1缺失模拟体模拟了具有抗体固有特性和功能的抗体结构，同时提供了一种治疗性肽及其在体外、体内或原位所固有或获得的特性或活性。采用此处所描述的方法，并结合本领域已知的方法，可改变本发明抗体的多个部分和至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体的治疗性肽部分。
此处所用的“EPO模拟CH1缺失模拟体”、“EPO模拟CH1缺失模拟体部分”、或“EPO模拟CH1缺失模拟体片段”和/或“EPO模拟CH1缺失模拟体变体”和类似模拟物，均具有或刺激至少一种蛋白质，例如，但不仅限于SEQ ID NO：1-1110中至少一种蛋白质的至少一种配体结合或至少一种生物活性，诸如体外、原位和/或优选的体内的配体结合或活性。例如，合适的本发明EPO模拟CH1缺失模拟体特定部分或变体可结合至少一种蛋白质配体，并包括至少一种蛋白质配体、受体、可溶性受体等。合适的EPO模拟CH1缺失模拟体、特定部分或变体也可调节、提高、改变、活化至少一种蛋白质受体的发信号或其它可测定或可检测活性。
在本发明方法和组合物中有用的模拟体的特征在于具有与蛋白质配体或受体结合的合适亲和性，并任选和优选地具有低毒性。具体而言，具有下述情况的EPO模拟CH1缺失模拟体在本发明中均有用，即其中的独立组分，诸如可变区、恒定区(无CH1部分)和框架部分，或其任意部分(例如可变重或轻链的J、D或V区的一部分；铰链区、恒定重链或轻链等)独立和/或共同任选和优选地具有低免疫原性。可应用于本发明的模拟体任选的特征在于其具有可长期治疗患者，并可从良好到极佳地缓解症状，且毒性低的能力。低免疫原性和/或高亲和性，以及其它未明特性均可能对其可实现的治疗效果起作用。“低免疫原性”在此处被定义为在少于大约75％，或优选地少于大约50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2和/或1％经过治疗的患者中出现显著的HAMA、HACA或NAHA应答，和/或在经过治疗的患者中出现低的滴度(采用双抗原酶免疫测定法测定为少于大约300，优选地少于大约100)(见例如Elliott et al.，Lancet344：1125-1127(1994))。
效用
本发明的分离核酸可被用于生成至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体、片段或其特定变体，该EPO模拟CH1缺失模拟体、片段或其特定变体可被用于在细胞、组织、器官或动物(包括哺乳动物和人类)中起作用，以调节、治疗、缓解至少一种蛋白质相关状况，帮助预防其发病，或减少其症状，该蛋白质相关状况选自，但不仅限于，至少一种免疫失调或疾病、心血管失调或疾病、传染病、恶性病和/或神经失调或疾病、贫血；免疫/自身免疫；和/或癌症/传染病，以及其它已知或特定的蛋白质相关状况。
该方法可包括对需要上述调节、治疗、缓解、预防或减少症状、影响或机制的细胞、组织、器官、动物或患者施用有效量的特定组合物或药物组合物，该组合物包含至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。该有效量可包括单次或多次施用大约0.0001-500mg/kg的量，或单次或多次施用使血清浓度达0.0001-5000ug/ml血清的量，或任意有效范围或其中的数值，其施用和浓度测定方法均为此处所描述或相关领域已知的方法。
引证
此处所引用的全部出版物或专利由于体现了与本发明同时的本领域现状，和/或提供了本发明的描述和实施方法，因而被完整引入作为参考。出版物指任何学术或专利出版物，或可以任意媒介格式被提供的其它任何资料，包括所有的记录、电子或打印格式。下述参考文献均被完整引入作为参考：Ausubel，et al.，ed.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley &Sons，Inc.，NY，NY(1987-2002)；Sambrook，et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Mannual，2nd Edition，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow and Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor，NY(1989)；Colligan，et al.，eds.，Current Protocolsin Immunology，John Wiley &Sons，Inc.，NY(1994-2002)；Colligan et al.，Current Protocols in Protein Science，JohnWiley &Sons，NY，NY，(1997-2002)。
本发明的模拟体
EPO模拟CH1缺失模拟体可包含至少一个CH3区，该CH3区与至少一个CH2区直接相连，该CH2区与至少一个铰链区或其片段直接相连，该铰链区或其片段与至少一个部分V区直接相连，该部分y区与一个任选接头序列直接相连，该任选接头序列与至少一个治疗性肽直接相连，该治疗性肽则任选地进一步与至少一个可变抗体序列的至少一个部分直接相连。一种优选实施方案中，一对具有任选N末端抗体序列的CH3-CH2-铰链-部分J序列-接头-治疗性肽是通过缔合或共价键，例如，但不仅限于Cys-Cys二硫键连接成对的。因此，本发明的EPO模拟CH1缺失模拟体模拟了具有抗体固有特性和功能的抗体结构，同时提供了一种治疗性肽及其在体外、体内或原位所固有或获得的特性或活性。采用此处描述的方法，并结合本领域已知的方法，可改变本发明抗体的多个部分和至少一种EP0模拟CH1缺失模拟体的治疗性肽部分。
因此，本发明的模拟体提供了至少一种可与已知蛋白质相比的合适特性，例如，但不仅限于，延长的半衰期、提高的活性、更为特异的活性、提高的亲和力、提高或降低的清除率、特选或更为合适的活性亚型、较小的免疫原性、至少一种预期治疗效果被提高的质量或延长的持续时间、较少的副作用等特性中的至少一种。
式(I)的模拟体的片段可通过本领域已知和/或此处所描述的酶裂解、合成或重组技术制备。利用特定抗体基因也可制备多种截短形式的模拟体，该特定抗体基因中的一个或多个终止密码子已被导入天然终止位点的上游。模拟体的多个部分可通过常规技术被化学连接在一起，或者通过利用遗传工程技术被制备为邻接蛋白。例如，可表达编码人类抗体链中至少一个恒定区的核酸，以生成可应用在本发明模拟体中的邻接蛋白。见例如，Ladner et al.，U.S.Patent No.4,946,778和Bird，R.E.et al.，Science，242：423-426(1988)，有关单链抗体的部分。
此处所用的术语“人类模拟体”指一种抗体，其中该蛋白质的每一部分(例如EPO模拟肽、框架、CL、CH区(例如CH2、CH3)、铰链、(VL、VH))基本上均被要求在人类中基本无免疫原性，且仅具有较少的序列变化或变异。相对于未修饰的人类抗体或本发明模拟体而言，该变化或变异任选并优选地在人类中保留或降低了免疫原性。因此，人类抗体和相应的本发明EPO模拟CH1缺失模拟体与嵌合或人源化抗体截然不同。应指出的是，人类抗体和EPO模拟CH1缺失模拟体可由非人类的动物或细胞生成，该非人类的动物或细胞在功能上能够表达重排的人类免疫球蛋白(例如重链)基因。
针对合适的配体，例如分离的和/或EPO蛋白质受体或配体，或其一部分(包括合成分子，例如合成肽)，可设计出特异于至少一种蛋白质配体或其受体的人类模拟体。利用可鉴定并表征至少一种蛋白质或其部分的配体结合区或序列的已知技术，可制备上述模拟体。
一种优选实施方案中，EPO模拟CH1缺失模拟体包含分子式(I)：
(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1为免疫球蛋白可变区N末端的至少一个部分，Pep为至少一个具有生物活性的EPO模拟肽，Flex为通过使模拟体具有可选取向和结合特性，从而提供了结构柔性的多肽，V2为免疫球蛋白可变区C末端的至少一个部分，pHinge为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n和m可为1-10中的整数，模拟了不同类型的免疫球蛋白分子，例如，但不仅限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、IgE等，或其组合。m＝1时的单体可通过缔合或共价键，例如，但不仅限于Cys-Cys二硫键与其它单体相连。
一种优选实施方案中，本发明的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体由至少一种细胞系、混合细胞系、无限增殖化细胞，或无限增殖化和/或培养细胞的克隆群体生成。采用合适的方法便可获得无限增殖化的蛋白质生产细胞。优选地，该至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体是通过提供特定核酸或载体而得以制备的，该核酸或载体含有来源自至少一个人类免疫球蛋白位点的DNA，或者具有与该至少一个人类免疫球蛋白位点基本上相似的序列，其中上述至少一个人类免疫球蛋白位点被功能重排或可接受功能重排，上述核酸或载体可进一步包含此处所描述的模拟体结构，例如，但不仅限于分子式(I)，其中如本领域所已知的，C-和N-末端可变区部分可被用作V1和V2，铰链区可被用作pHinge，CH2可被用作CH2，CH3可被用作CH3。
此处所用的术语“功能重排”指来源于特定免疫球蛋白位点的核酸片段，其中该免疫球蛋白位点已经历V(D)J重组，从而生成了编码免疫球蛋白链(例如重链)或其任何部分的免疫球蛋白基因。功能重排的免疫球蛋白基因可通过采用下述合适方法直接或间接地得到鉴定，合适的方法例如，核苷酸测序、利用可退火至基因片段之间的编码结合处的探针所进行的杂交(例如蛋白质印迹、RNA印迹)或采用可退火至基因片段之间的编码结合处的引物对免疫球蛋白基因所进行的酶扩增(例如聚合酶链反应)。细胞是否生成了EPO模拟CH1缺失模拟体或其部分或变体也可通过合适的方法得到确定，其中该EPO模拟CH1缺失模拟体或其部分或变体包含了特定的可变区或含特定序列(例如，至少一个Pep序列)的可变区。
本发明的模拟体、特定部分和变体也可通过下述方法制备，即利用至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体编码核酸，以获得转基因动物或哺乳动物，例如山羊、奶牛、马、绵羊等，使其在乳汁中生成上述模拟体或特定部分或变体。采用与应用于抗体编码序列的方法类似的已知方法便可获得上述动物。见，例如，但不仅限于美国专利No.5,827,690；5,849,992；4,873,316；5,849,992；5,994,616；5,565,362；5,304,489等，这些专利均被完整引入此处作为参考。
本发明的模拟体、特定部分和变体也可另外通过下述方法制备，即利用至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体编码核酸，以获得转基因植物和培养的植物细胞(例如，但不仅限于烟草和玉蜀黍)，使其在植物部分或从中所培养的细胞中生成上述模拟体或特定部分或变体。一个非限制性实例，即表达重组蛋白的转基因烟草叶已被成功地用于提供大量的重组蛋白，例如，利用诱导型启动子。见，例如Cramer et al.，Curr.Top.Microbol.Immunol.240：95-118(1999)及其引用的参考文献。同样，转基因玉蜀黍或谷物也已被用于以工业生产水平表达生物学活性等同于由其它重组系统生成或由天然来源纯化所得蛋白质的哺乳动物蛋白质。见，例如Hood etal.，Adv.Exp.Med.Biol.464：127-147(1999)及其引用的参考文献。包括抗体片段，例如单链模拟体(scFv’s)在内的抗体也已被大量地从包括烟草种子和马铃薯块茎在内的转基因植物种子中生成。见，例如Conrad et al.，Plant Mol.Biol.38：101-109(1998)及其引用的参考文献。因此，本发明的模拟体、特定部分和变体也可根据已知方法，利用转基因植物而得以制备。也见，例如Fischer etal.，Biotechnol.Appl.Biochem.30：99-108(1999年10月)，Maet al.，Trends Biotechnol.13：522-7(1995)；Ma et al.，PlantPhysiol.109：341-6(1995)；Whitelam et al.，Biochem.Soc.Trans.22：940-944(1994)；及上述文中所引用的参考文献。上述参考文献均被完整引入在此作为参考。
本发明的模拟体可以广泛的亲和性(KD)结合人类蛋白质配体。一种优选实施方案中，本发明至少一种人类EPO模拟CH1缺失模拟体可任选地以高亲和性结合至少一种蛋白质配体。例如，本发明至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体可以等于或小于大约10-7M的KD，或更为优选的，等于或小于大约0.1-9.9(或任意范围或其中的数值)X10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12或10-13M，或任意范围或其中的数值的KD结合至少一种蛋白质配体。
EPO模拟CH1缺失模拟体对至少一种蛋白质配体的亲和性或亲和力可通过采用任何合适方法得以实验测定，例如用于测定抗体-抗原结合亲和性或亲和力的方法。(见，例如Berzofsky，et al.，在Fundamental Immunology，Paul，W.E.，Ed.，Raven Press：NewYork，NY(1984)中的“Antibody-Antigen Interaction”；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and Company：New York，NY(1992)；及其描述的方法)。不同条件(例如盐浓度、pH)下所测定的特定EPO模拟CH1缺失模拟体-配体相互作用的亲和性不同。因此，优选采用EPO模拟CH1缺失模拟体和配体的标准溶液，和诸如此处所描述的标准缓冲剂测定亲和性及其它配体结合参数(例如KD、Ka、Kd)。
核酸分子
利用此处提供的资料，采用此处描述或本领域已知的方法，可获得诸如编码SEQ ID NO：1-42中至少一个序列的至少90-100％连续氨基酸以及特定抗体的至少一个部分的核苷酸序列，其中上述序列被作为分子式(I)的Pep序列插入，可获得本发明的EPO模拟CH1缺失模拟体，进一步包括其特定片段、变体或一致序列，或者可获得包含了至少一种上述序列的沉积载体，和编码至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的本发明核酸分子。
本发明的核酸分子可以是RNA形式，诸如mRNA、hnRNA、tRNA或其它任何形式，或者是DNA形式，包括，但不仅限于cDNA和通过克隆或合成所获的基因组DNA，或其任意组合。该DNA可为三链、双链或单链，或三种链形式的任意组合。DNA或RNA的至少一条链的任意部分均可为编码链，也是通常所说的有义链，或者可以是非编码链，也被称为反义链。
本发明的分离核酸分子可包括含有一个可读框(ORF)，并任选地具有一个或多个内含子的核酸分子，含有EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的编码序列的核酸分子；和含有与上述核苷酸序列基本上不同的核苷酸序列，但由于遗传密码的简并性，仍然编码此处所描述和/或本领域已知的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体的核酸分子。当然，该遗传密码是本领域熟知的。因此，对本领域技术人员而言，制备编码本发明特定EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的上述简并核酸变体是常规工作。见，例如上述Ausubel，et al.，且上述核酸变体也被包括在本发明中。
如此处所指出的，包含编码EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的核酸的本发明核酸分子可包括，但不仅限于，自身编码EPO模拟CH1缺失模拟体片段的氨基酸序列的核酸分子；完整EPO模拟CH1缺失模拟体或其部分的编码序列；EPO模拟CH1缺失模拟体、片段或部分的编码序列，以及其它序列，诸如至少一种信号前导或融合肽的编码序列，具有或不具有上述其它编码序列，诸如至少一个内含子，连同其它非编码序列，包括但不仅限于非编码5’和3’序列，诸如在转录、mRNA加工，包括剪接和多腺苷酸化信号中发挥作用(例如-mRNA的核糖体结合和稳定性)的转录、非翻译序列；编码其它氨基酸，诸如可提供其它功能性的氨基酸的其它编码序列。因此，编码EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的序列可被融合至标记序列，诸如编码特定肽的序列，该肽有助于纯化含有EPO模拟CH1缺失模拟体片段或部分的融合EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。
与此处所描述的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸
本发明提供了可在选择性杂交条件下与此处公开的多核苷酸或包括其特定变体或部分的其它多核苷酸杂交的分离核酸。因此，该实施方案的多核苷酸可被用于分离、检测和/或定量含有该多核苷酸的核酸。
低或中等严格性杂交条件典型地，但并不专有地应用于与互补序列相比序列同一性被降低的序列。中等和高严格性条件可任选地被用于较高同一性的序列。低严格性条件可实现具有大约40-99％序列同一性的序列的选择性杂交，并可被用于鉴定直向同源或共生同源序列。
任选地，本发明的多核苷酸可编码由此处描述的多核苷酸所编码的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的至少一个部分。本发明的多核苷酸包含了可被用于与编码本发明EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。见，例如，上述Ausubel；上述Colligan，均被完整引入此处作为参考。
核酸的构建
本发明的分离核酸可采用本领域熟知的(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术，或集中方法的组合而得以制备。
该核酸可方便地包含除本发明多核苷酸之外的序列。例如，可将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点插入该核酸中，以助于分离该多核苷酸。同样，可将可翻译序列插入该核酸中，以助于分离本发明的翻译多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供了纯化本发明蛋白质的常规途径。本发明核酸除可作为编码序列外，任选地还可作为用于克隆和/或表达本发明多核苷酸的载体、接合体或接头。
其它序列也可被加入上述克隆和/或表达序列，以优化其在克隆和/或表达方面的功能、以助于分离本发明多核苷酸，或促使本发明多核苷酸被导入细胞。克隆载体、表达载体、接合体和接头的用途均是本领域熟知的。见，例如上述Ausubel；或上述Sambrook。
构建核酸的重组法
利用本领域技术人员已知的多种克隆方法，均可从生物学来源中获得本发明的分离核酸组合物，诸如RNA、cDNA、基因组DNA或其任意组合。某些实施方案中，采用了在合适的严格性条件下可与本发明多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针，以在cDNA或基因组DNA文库中鉴定所需要的序列。RNA的分离、cDNA和基因组文库的构建均是本领域普通技术人员熟知的。(见，例如上述Ausubel；或上述Sambrook)。
用于构建核酸的合成法
本发明的分离核酸也可通过已知的直接化学合成法制备(见，例如上述Ausubel，et al.)。化学合成通常生成单链寡核苷酸，通过与互补序列杂交，或通过以该单链为模板，采用DNA聚合酶进行聚合，可将该单链寡核苷酸转化为双链DNA。本领域任何一位技术人员均会认识到，虽然DNA的化学合成可被局限于大约100个或更多碱基的序列，较长序列可通过较短序列的连接获得。
重组表达组件
本发明进一步提供了包含本发明核酸的重组表达组件。本发明的核酸序列，例如编码本发明EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的cDNA或基因组序列，可被用于构建特定重组表达组件，该组件可被导入至少一种理想的宿主细胞中。重组表达组件将典型地包含被可操作连接至特定转录起动调节序列的本发明多核苷酸，其中该转录起动调节序列将引导本发明多核苷酸在指定宿主细胞中的转录。异源和非异源(即内源)启动子均可被用于引导本发明核酸的表达。
在某些实施方案中，充当启动子、增强子或其它元件的分离核酸可被导入本发明非异源形式多核苷酸的合适位置上(上游、下游或内含子中)，以正或负调节本发明多核苷酸的表达。例如，如本领域已知，内源启动子可通过突变、缺失和/或替代在体内或体外被改变。本发明多核苷酸可按指定的有义或反义方向被表达。应当理解的是，对有义或反义方向基因表达的控制可直接影响可观测特征。抑制的另一种方法是有义抑制。导入被设定为有义方向的核酸已被证明是阻断目标基因转录的一种有效途径。
载体和宿主细胞
本发明也涉及包含本发明分离核酸分子的载体、经由该重组载体遗传改造的宿主细胞，以及通过本领域所熟知的重组技术对至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的制备。见，例如上述Sambrook，et al.；上述Ausubel，et al.，均被完整引入此处作为参考。
本发明多核苷酸可任选地被连接至特定载体，该载体含有用于在宿主内增殖的可选择标记。通常，采用合适的已知方法，诸如电穿孔等方法将质粒载体导入细胞，其它已知方法包括利用可作为沉淀物的载体，如磷酸钙沉淀物，或与带电荷脂质形成复合体。如果该载体为病毒，可采用合适的包装细胞系将其体外包装，并随后将其导入宿主细胞。
DNA插入应被操作性地连接至合适启动子。该表达构建体可进一步含有任选用于至少一种转录起始、终止，且位于转录区内的位点，以及用于翻译的核糖体结合位点。该构建体所表达成熟转录物的编码部分将优选地包括开始的翻译起动和适当地位于待翻译mRNA末端的终止密码子(例如，UAA、UGA或UAG)，以及优选用于哺乳动物或真核细胞表达的UAA和UAG。
表达载体可优选，但也可任选地包括至少一种可选择标记。这样的标记包括，例如，但不仅限于对真核细胞培养而言的氨甲喋呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，US Pat.Nos.4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288；5,149,636；5,179,017)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS、US Pat.Nos.5,122,464；5,770,359；5,827,739)抗性，和用于在大肠杆菌和其它细菌或原核生物中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因(上述专利均被完整引入此处作为参考)。用于上述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。合适的载体应是熟练技术人员熟知的。将载体构建体导入宿主细胞可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、侵染或其它已知方法实现。本领域诸如上述Sambrook，1-4和16-18章；上述Ausubel，1、9、13、15、16章中描述了这些方法。
本发明至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体均可以修饰形式被表达，诸如融合蛋白质，并且可以不仅包括分泌信号，还包括其它异源功能区。例如，一个区域的附加氨基酸，尤其是带电荷氨基酸可被加入EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的N末端，从而改善该EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体在宿主细胞中、纯化期间或后续处理和保存期间的稳定性和持久性。同样，本发明EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体也可加入肽部分，从而有助于其纯化。最终制备EPO模拟CH1缺失模拟体或其至少一个片段之前，可将上述区域除去。许多标准实验室手册，诸如上述Sambrook，17.29-17.42和18.1-18.74章；上述Ausubel，16、17和18章中均描述了上述方法。
本领域的普通技术人员熟知可用于表达编码本发明蛋白质的核酸的诸多表达系统。
对本发明模拟体、特定部分或其变体的制备有用的细胞培养物实例是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统通常为单层细胞形式，但也可采用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器，。本领域已发展出可表达完整糖基化蛋白的大量合适宿主细胞系，包括COS-1(例如ATCC CRL1650)、COS-7(例如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCCCRL-10)、CHO(例如ATCC CRL 1610，DG-44)和BSC-1(例如ATCCCRL-26)细胞系、hepG2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等，均可容易地从例如，American Type CultureCollection(美国典型菌种保藏中心)，Manassas，Va获得。优选宿主细胞包括淋巴来源的细胞，诸如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。尤其优选的宿主细胞为P3X63Ag8.653细胞(ATCC编号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC编号CRL-1851)。
用于上述细胞的表达载体可包括一个或多个下述表达控制序列，例如，但不仅限于复制起点；启动子(例如末期或早期SV40启动子、CMV启动子(例如美国专利Nos.5,168,062；5,385,839)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(例如美国专利No.5,266,491)，至少一种人类免疫球蛋白启动子)；增强子和/或加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag聚腺苷酸加入位点)，和转录终止子序列。见，例如，上述Ausubel et al.；上述Sambrook，et al.。对本发明核酸或蛋白质的制备有用的其它细胞均是已知的，和/或可从，例如American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines andHybridomas(美国典型菌种保藏中心细胞系和杂交瘤目录)(www.atcc.org)或其它已知或商业来源获得。
应用真核宿主细胞时，是将聚腺苷酸化或转录终止序列典型地整合进上述载体中。终止序列的一个实例是牛生长激素基因来源的聚腺苷酸化序列。也可包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列的一个实例是SV40来源的VP1内含子(Sprague，et al.，J.Virol.45：773-781(1983))。另外，如本领域已知，可将控制宿主细胞内复制的基因序列整合进上述载体中。
EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或其变体的纯化
EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体可通过熟知的方法，包括，但不仅限于A蛋白纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水作用色谱、亲和色谱、羟磷灰石色谱和凝集素色谱，从重组细胞中得以回收及纯化。也可应用高效液相色谱(“HPLC”)进行纯化。见，例如Colligan，CurrentProtocols in Immunology，或Current Protocols in ProteinScience，John Wiley &Sons，NY，NY，(1997-2002)，例如1、4、6、8、9、10章，均被完整引入此处作为参考。
本发明的模拟体或特定部分或变体包括天然纯化的产物、化学合成操作的产物，和通过重组技术从真核细胞，包括例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞中获得的产物。根据重组制备操作中应用的宿主，本发明EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体可以是糖基化或非糖基化的，优选糖基化的。许多标准实验室手册，诸如上述Sambrook，17.37-17.42节；上述Ausubel，10、12、13、16、18和20章，上述Colligan，Protein Science，12-14章中均描述了上述方法，均被完整引入此处作为参考。
模拟体、特定片段和/或变体
本发明的分离模拟体包括由此处更完整论述的本发明任意一种多核苷酸编码的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体，或任何分离或制备的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或其变体。
优选的EPO模拟CH1缺失模拟体或配体结合部分或变体结合了至少一个EPO蛋白配体或受体，并从而提供了相应蛋白质或其片段的至少一种EPO生物学活性。多种在治疗或诊断方面具有重要作用的蛋白质均是本领域熟知的，且该蛋白质的合适测定方法或生物学活性也是本领域熟知的。
对本发明而言，合适的EPO模拟肽的非限制性实例见下表1。这些肽可通过已公开和/或本领域已知的方法制备。大部分情况中采用了单字母氨基酸缩写。这些序列中(以及通篇该说明书中，在特定实例中如无另外指明)的X指20种天然存在的氨基酸中的任意一种，或已知的氨基酸残基或其可能存在的已知衍生物，或其任何已知的修饰氨基酸。这些肽中的任意几种均可在有或无接头的情况下串联相连(即连续地)，且该表中提供了几个串联相连的实例。接头被列为“A”，并可为此处描述的任一接头。串联重复和接头由破折号分开以清晰显示。含有半胱氨酰残基的任何肽均可任选地与另一个含半胱氨酸的肽交联，其中一个或二者均可被连接至一个载体上。该表中提供了几个交联实例。任何具有一个以上半胱氨酸残基的肽均可形成肽内二硫键；见，例如，表1中的EPO模拟肽。该表中列出了由肽内二硫键连接的肽的若干实例。这些肽中的任意一种均可通过此处所描述的方法被衍生化，该表中提供了若干衍生化实例。对羧基末端可被氨基基团加盖的衍生物而言，加盖氨基基团被表示为-NH2。对氨基酸残基被非氨基酸残基部分替代的衍生物而言，该替代被表示为δ，代表本领域已知的任何部分，例如被完整引入此处作为参考的Bhatnagar et al.，(1996)，J.Med.Chem.39：3814-9和Cuthbertson et al.(1997)，J.Med.Chem.40：2876-82中描述的部分。在被完整引入此处作为参考的美国专利No.5,608,035、5,786,331和5,880,096中定义了J替代基和Z替代基(Z5、Z6，....Z40)。对EPO模拟序列(表1)而言，被完整引入作为参考的WO 96/40772定义了取代基X2-X11和整数“n”。粗体显示的残基为D-氨基酸，但也可任选地是L-氨基酸。如无另外指出，所有肽均通过肽键连接。缩写词列于本说明书的结束部分。在“SEQ ID NO.”栏中，“NR”指对该特定序列而言无需序列列表。
表1-EPO-模拟肽序列
序列/结构；
SEQ ID NO：
YXCXXGPXTWXCXP                               1
YXCXXGPXTWXCXP-YXCXXGPXTWXCXP                2
YXCXXGPXTWXCXP-A-YXCXXGPXTWXCXP              3
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG                         5
GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG                         6
GGVYACRMGPITWVCSPLGG                         7
VGNYMCHPGPITWVCRPGGG                         8
GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG                         9
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG-10
GGTYSCHPGPLTWVCKPQGG-Δ-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG 11
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK                      12
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK                      13
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK                      14
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK-Δ-GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK
Figure A0382011000322
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGSSK(-Δ-生物素)16
CX4X5GPX6TWX7C                          17
GGTYSCHGPLTWVCKPQGG                          18
VGNYMAHMGPITWVCRPGG                          19
GGPHHVYACRMGPLTWIC                           20
GGTYSCHFGPLTWVCKPQ                           21
GGLYACHMGPMTWVCQPLRG                         22
TIAQYICYMGPETWECRPSPKA                       23
YSCHFGPLTWVCK                                24
YCHFGPLTWVC                                  25
X3X4X5GPX6TWX7X8                 26
YX2X3X4X5GPX6TWX7X8             27
X1YX2X3X4X5GPX6X7X8X9X10X1128
X1YX2CX4X5GPX6TWX7CX9X10X11   29
GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG                     30
GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG                     31
GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG                     32
VGNYMCHFGPITWVCRPGGG                     33
GGVYACRMGPITWVCSPLGG                     34
VGNYMAHMGPITWVCRPGG                      35
GGTYSCHFGPLTWVCKPQ                       36
GGLYACHMGPMT％AIVCQPLRG                  37
TIAQYICYMGPETWECRPSPKA                   38
YSCHFGPLTWVCK                            39
YCHFGPLTWVC                              40
SCHFGPLTWVCK                             41
(AX2)nX3X4X5GPX6TWX7X8        42
EPO生物学活性是本领域熟知的。见，例如Anagnostou A等人在Proceedings of the National Academy of Science(USA)87：5978-82(1990)中的Erythropoietin has a mitegenic andpositive chemotactic effect on endothelial cells.(促红细胞生成素对内皮细胞具有促有丝分裂和正趋化性作用)；Fandrey J和Jelkman WE在Annals of the New York Academy of Science628：250-5(1991)中的Interleukin 1and tumor necrosisfactor-alpha inhibit eryt hropoietin production in vitro.(白细胞间介素和肿瘤坏死因子-α抑制体外促红细胞生成素的生成)；Geissler K等人在Contrib.Nephrol.87：1-10(1990)中的Recombinant human erythropoietin：A multipotentialhemopoietic growth factor in vivo and in vitro.(重组人类促红细胞生成素：体内和体外的多潜能造血生长因子)；Gregory CJ在Journal of Cellular Physiology 89：289-301(1976)中的Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in thehemopoietic system.Studies of three erythropoietic colonyresponses in culture.(在造血系统中作为分化标记的促红细胞生成素敏感性。对培养中的三种促红细胞生成素集落应答的研究。)Jelkman W等人在Life Sci.50：301-8(1992)中的Monokinesinhibiting erythropoietin production in human hepatomacultures and in isolated perfused rat kidneys.(抑制人类肝细胞瘤培养物和分离灌流大鼠肾中生成促红细胞生成素的单核因子)；Kimata H等人在Clinical and Experimental Immunology85：151-6(1991)中的Human recombinant erythropoietindirectlystimulates Bcell immunoglobulin production and proliferationin serum-free medium.(人类重组促红细胞生成素直接刺激B细胞免疫球蛋白在无血清培养基中的生成和增殖)；Kimata H等人在Clin.Immunology Immunopathol.59：495-501(1991)中的Erythropoietin enhances immunoglobulin production andproliferation by human plasma cells in a serum-free medium.(促红细胞生成素在无血清培养基中提高了人类浆细胞的免疫球蛋白产量和增生)；Kimata H等人在Clinical and ExperimentalImmunology 83：483-7(1991)中的Effect of recombinant humanerythropoietin on human IgE production in vitro.(重组人类促红细胞生成素对体外人类IgE生成的影响)；Koury MJ和BondurantMC在Science 248：378-81(1990)中的Erythropoietin retards DNAbreakdown and prevents programmed cell death in erythroidprogenitor cells.(促红细胞生成素延迟了DNA分解，并阻止了红细胞祖细胞中的程序性细胞死亡)；Lim VS等人在KidneyInternational 37：131-6(1990)中的Effect of recombinant humanerythropoietin on renal function in humans.(重组人类促红细胞生成素对人体肾功能的影响)；Mitjavila MT等人在Journal ofClinical Investigation 88：789-97(1991)中的Autocrinestimulation by erythropoiet in and autonomous growth of humanerythroid leukemic cells in vitro.(促红细胞生成素的自分泌刺激和人类红细胞白血病细胞在体外的自主生长)；Andre M等人在Clinical Chemistry 38：758-63(1992)中的Performance of animmunoradiometric assay of erythropoietin and results forspecimens from anemic and polycythemic patients.(免疫放射分析促红细胞生成素的表现和对贫血和红细胞增多患者来源样本的分析结果)；Hankins WD等人在Annals of the New York Academy ofScience 554：21-8(1989)中的Erythropoietin-dependent anderythropoietin-producing cell lines.Implications forresearch and for leukemia therapy.(促红细胞生成素依赖性和促红细胞生成素生成细胞系。对研究和白血病治疗的意义)；Kendall RGT等人在Clin.Lab.Haematology 13：189-96(1991)中的Storage andpreparation of samples for erythropoietin radioimmunoassay.(用于促红细胞生成素放射免疫分析的样本的保存和制备)；KrumviehD等人在Dev.Biol.Stand.69：15-22(1988)中的Comparison ofrelevant biological assays for the determination ofbiological active erythropoietin.(测定具有生物活性的促红细胞生成素所用相关生物学测定方法的比较)；Ma DD等人在BritishJournal of Haematology 80：431-6(1992)中的Assessment of anEIA for measuring human serum erythropoietin as compared withRIA and an in-vitro bioassay.(与RI A和体外生物测定相比，对测定人类血清促红细胞生成素的EIA的评估)；Noe G等人在BritishJournal of Haematology 80：285-92(1992)中的A sensitivesandwich ELISA for measuring erythropoietin in human serum.(一种用于测定人类血清中促红细胞生成素的灵敏夹心ELISA法)；Pauly JU等人在Behring Institut Mitteilungen 90：112-25(1991)中的Highly specific and highly sensitive enzyme immunoassaysfor antibodies to human interleuk in 3(IL3)and humanerythropoietin(EPO)in serum.(针对血清中人类白细胞间介素3(IL3)和人类促红细胞生成素(EPO)的抗体的高特异性和高灵敏性酶免疫测定法)；Sakata S和Enoki Y在Ann.Hematology 64：224-30(1992)中的Improved microbioassay for plasma erythropoietinbased on CFU-E colony formation.(基于CFU-E集落形成对血浆促红细胞生成素的改良微生物测定法)；Sanengen T等人在Acta Physiol.Scand.135：11-6(1989)中的Immunoreactive erythropoietin anderythropoiesis stimulating factor(s)in plasma fromhypertransfused neonatal and adult mice.Studies with aradioimmunoassay and a cell culture assay for erythropoietin.(高度输液新生和成熟小鼠来源血浆中的免疫反应性促红细胞生成素和红细胞生成刺激因子。采用放射免疫测定和针对促红细胞生成素的细胞培养测定进行的研究)；WidnessJA等人在Journal of Lab.Clin.Med.119：285-94(1992)中的A sensitive and specificerythropoietin immunoprecipitation assay：application topharmacokinetic studies.(一种灵敏和特异性促红细胞生成素免疫沉淀分析法：在药物代谢动力学研究中的应用)；其它资料也参见个别生物测定中采用的个别细胞系。上述参考文献均被完整引入此处作为参考。通过应用可应答该因子的细胞系，诸如HCD57、NFS-60、TF-1和UT-7，可测定EPO。通过在集落形成试验中测定骨髓细胞来源CFU-E的量，也可评定EPO活性。一种可选且完全不同的检测法是细胞因子的RT-PCR定量法。
EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或其变体可结合特定蛋白质或片段配体，并从而提供至少一种活性，该活性是通过使蛋白质与至少一种蛋白质配体或受体结合，或通过其它蛋白质依赖或介导机制而被另外介导的，上述EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或其变体部分地或基本上优选地提供了至少一种上述特定蛋白质或片段的至少一种生物活性。此处所用的术语“EPO模拟CH1缺失模拟体活性”指可根据测定方法以大约20-10,000％，优选地以至少大约60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000％或更高比例调节或引起至少一种蛋白质依赖活性。
EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体可提供至少一种蛋白质依赖活性的能力优选地通过此处所描述和/或本领域已知的至少一种合适的蛋白质生物学测定而得以评定。本发明的人类EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体可与任何种类的免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM等)或同种型相似，并可包含至少一个部分的k或λ轻链。一种实施方案中，人类EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体包含了IgG重链可变片段、铰链区、CH2和CH3，例如，至少一种同种型，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体结合了对至少一种蛋白质、亚单位、片段、部分或这几项的任意组合具有特异性的至少一种特定配体。本发明至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体、特定部分或变体的至少一种EPO模拟肽可任选地结合该配体的至少一个特定配体表位。该结合表位可包含至少一种特定氨基酸序列的任意组合，该特定氨基酸序列所含至少1-3个氨基酸，及其连续氨基酸的完整特定部分选自蛋白质配体，诸如EPO受体或其部分之一。
该模拟体可通过下述方法制备，即采用已知技术将式(I)的EPO模拟CH1缺失模拟体的不同部分连接在一起，通过采用已知的重组DNA技术或其它任何合适方法，诸如化学合成法制备并表达编码该EPO模拟CH1缺失模拟体的至少一种(即一种或多种)核酸分子。
采用合适方法，诸如噬菌体展示(Katsube，Y.，et al.，Int.JMol.Med，1(5)：863-868(1998))或本领域已知和/或此处所描述的应用转基因动物的方法，可制备与人类蛋白质配体或受体结合，并包含确定重或轻链可变区的模拟体。通过利用EPO模拟CH1缺失模拟体、特定部分或变体在合适宿主细胞中的编码核酸或其部分便可表达该EPO模拟CH1缺失模拟体、特定部分或变体。
优选地，该模拟体或其配体结合片段可与人类EPO配体或受体高亲和性地结合(例如，小于或等于大约10-7M的KD)。与此处所描述序列基本相同的氨基酸序列包括含有保守氨基酸置换，以及氨基酸缺失和/或插入的序列。保守氨基酸置换指第一个氨基酸被具有与其相似的化学和/或物理特性(例如电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)的第二个氨基酸置换。保守置换包括在下组氨基酸范围内，一种氨基酸被另一种氨基酸置换，即：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、蛋氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。
氨基酸密码
组成本发明模拟体或特定部分或变体的氨基酸通常被缩写。通过由氨基酸的单字母代码、三字母代码、名称或本领域熟知的三个核苷酸密码子标明该氨基酸，便可表示出该氨基酸名称(见Alberts，B.，et al.，Molecular Biology of The Cell，Third Ed.，GarlandPublishing，Ino.，New York，1994)：
  单字母代码   三字母代码   名称   三核苷酸密码子
  A   Ala   丙氨酸   GCA，GCC，GCG，GCU
  C   Cys   半胱氨酸   UGC，UGU
  D   Asp   天冬氨酸   GAC，GAU
  E   Glu   谷氨酸   GAA，GAG
  F   Phe   苯丙氨酸   UUC，UUU
  G   Gly   甘氨酸   GGA，GGC，GGG，GGU
  H   His   组氨酸   CAC，CAU
  I   Ile   异亮氨酸   AUA，AUC，AUU
  K   Lys   赖氨酸   AAA，AAG
  L   Leu   亮氨酸   UUA，UUG，CUA，CUC，CUG，CUU
  M   Met   蛋氨酸   AUG
  N   Asn   天冬酰胺   AAC，AAU
  P   Pro   脯氨酸   CCA，CCC，CCG，CCU
  Q   Gln   谷氨酰胺   CAA，CAG
  R   Arg   精氨酸   AGA，AGG，CGA，CGC，CGG，CGU
  S   Ser   丝氨酸   AGC，AGU，UCA，UCC，UCG，UCU
  T   Thr   苏氨酸   ACA，ACC，ACG，ACU
  V   Val   缬氨酸   GUA，GUC，GUG，GUU
  W   Trp   色氨酸   UGG
  Y   Trp   酪氨酸   UAC，UAU
本发明EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体可包括此处所定义的来源于自然突变或人为操纵的一个或多个氨基酸置换、缺失或添加。
当然，熟练技术人员应根据包括上述因素在内的许多因素确定氨基酸置换的数量。一般来说，对至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体而言的氨基酸置换、插入或缺失数量不应超过40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个氨基酸，如此处指定的1-30或其中的任意范围或数值。
在本发明EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体中，对功能而言必不可少的氨基酸可通过本领域已知的方法而得以鉴定，诸如定位诱变或丙氨酸扫描诱变(例如上述Ausubel，8、15章；Cunninghamand Wells，Science 244：1081-1085(1989))。后一种操作在分子中的每一个残基上均导入了单丙氨酸突变。随后，检验所获突变分子的生物活性，例如，但不仅限于此处说明或本领域已知的至少一种蛋白质相关活性。对EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体结合而言的关键位点也可通过诸如结晶、核磁共振或光亲和标记的结构分析法而得以鉴定(Smith，et al.，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)和de Vos，et al.，Science 255：306-312(1992))。
本发明模拟体或特定部分或变体可包含分子式(I)中的Pep部分，但不仅限于SEQ ID NO：1-42中至少一个序列的至少一个部分、序列或选自SEQ ID NO：1-42中3个序列到所有序列的组合。可增强或保持至少一种上述活性的非限制性变体包括，但不仅限于，任一上述多肽，进一步包含至少一种突变，该突变与不显著影响本发明EPO模拟CH1缺失模拟体的合适生物活性或功能的至少一种置换、插入或缺失对应。
EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体可进一步任选地包含作为分子式(I)中Pep部分的至少一种多肽的至少一个功能部分，该功能部分与SEQ ID NOS：1-42中至少一个序列具有90-100％的同一性”)。EPO模拟CH1缺失模拟体可进一步任选地包含可作为分子式(I)中的Pep部分，并选自SEQ ID NO：2-41中的一个或多个序列的氨基酸序列。
一种实施方案中，Pep氨基酸序列或其部分与SEQ ID NO：1-42中至少一个序列的相应部分的相应氨基酸序列具有大约90-100％同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或其中的任意范围或数值)。优选地，利用本领域已知的合适计算机算法确定90-100％氨基酸同一性(即90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或任意范围或其中的数值)。
本发明模拟体或特定部分或变体可包含来源于本发明EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的任意数量连续氨基酸残基，其中该数量选自由EPO模拟CH1缺失模拟体中连续残基数量的10-100％组成的整数群之一。任选地，连续氨基酸的子序列在长度上至少含有大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250或更多氨基酸，或含有其中任意范围或数值的氨基酸。此外，该子序列的数量可为选自1-20的任意整数，诸如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大的整数。
技术人员应理解的是，本发明包括至少一种具有生物活性的本发明EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。具有生物活性的模拟体或特定部分或变体的特定活性为天然(非合成)、内源或相关和已知的插入或融合蛋白或特定部分或变体的活性的至少20％、30％或40％，优选为至少50％、60％或70％，最为优选的是至少80％、90％或95％-100％。分析并定量测定酶活性和底物特异性的方法是本领域技术人员熟知的。
另一方面，本发明涉及此处所描述通过共价附着有机部分而被修饰的人类模拟体和配体结合片段。该修饰可产生具有改良药物代谢动力学特性(例如延长的体内血清半衰期)的EPO模拟CH1缺失模拟体或配体结合片段。有机部分可以是线型或分支亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。特定实施方案中，亲水聚合基团可具有大约800-大约120,000道尔顿的分子量，并可为聚链烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、糖聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，且脂肪酸或脂肪酸酯基团可包含大约8-大约40个碳原子。
本发明的修饰模拟体和配体结合片段可包含一个或多个与EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体直接或间接地共价结合的有机部分。与本发明EPO模拟CH1缺失模拟体或配体结合片段结合的各有机部分均可独立为亲水聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。此处所用的术语“脂肪酸”包括单羧基酸和双羧基酸。此处所用的术语“亲水聚合基团”指在水中比在辛烷中更易溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更易溶。因此，本发明包括通过共价附着聚赖氨酸而得以修饰的EPO模拟CH1缺失模拟体。适用于修饰本发明模拟体的亲水聚合物可为线型或分支状，且包括，例如聚链烷二醇(例如PEG、单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、糖类(例如葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水氨基酸的聚合物(例如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚环氧链烷(例如聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本发明EPO模拟CH1缺失模拟体的亲水聚合物为单分子实体形式时，具有大约800-大约150,000道尔顿的分子量。例如，可采用PEG2500、PEG5000、PEG7500、PEG9000、PEG10000、PEG12500、PEG1500和PEG20,000，其中下标为该聚合物的道尔顿平均分子量。
亲水聚合基团可被1至大约6个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团置换。被脂肪酸或脂肪酸酯基团置换的亲水聚合物可通过应用合适的方法制备。例如，包含胺基团的聚合物可被偶联至脂肪酸或脂肪酸酯的羧基上，且脂肪酸或脂肪酸酯上的活化羧基(例如经由N，N-羰基二咪唑活化)可被偶联至聚合物上的羟基基团。
适用于修饰本发明模拟体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和或可含有一个或多个不饱和单位。适用于修饰本发明模拟体的脂肪酸包括，例如，n-十二烷酸(C12，月桂酸)、n-四癸酸(C14，肉豆蔻酸)、n-八癸酸(C18，硬脂酸)、n-二十烷酸(C20，廿烷酸)、n-二十二烷酸(C22，山嵛酸)、n-三十烷酸(C30)、n-四十烷酸(C40)、顺-Δ9-十八烷酸(C18，油酸)、所有顺-Δ5，8，11，14-eicosatetraenoate(C20，花生四烯酸)、辛二酸、四癸二酸、八癸二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括含有线型或分支低级烷基基团的二羧酸的单酯。较低级烷基基团可包括1至大约12个，优选的1至大约6个碳原子。
修饰的人类模拟体和配体结合片段可采用诸如，通过与一种或多种修饰剂反应的合适方法制备。此处所用的术语“修饰剂”指包含活化基团的合适有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”指可在适当条件下与第二化学基团反应，从而在上述修饰剂与第二化学基团之间形成共价键的化学部分或功能基团。例如，胺反应性活化基团包括亲电子基团，诸如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤化(氯、溴、氟、碘)、N-羟琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可与硫醇反应的活化基团包括，例如马来酰亚胺、碘乙酰、丙烯酰、吡啶基二硫化物、5-硫羟-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛功能基团可被偶联至含有胺-或酰肼的分子上，且叠氮基团可与三价磷基团反应，从而形成氨基磷酸酯或磷酰胺键。将活化基团导入分子的合适方法是本领域已知的(见，例如Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，AcademicPress：San Diego，CA(1996))。活化基团可被直接结合至有机基团(例如亲水聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)，或通过接头部分，例如二价C1-C12基团实现结合，其中一个或多个碳原子可被诸如氧、氮或硫的杂原子取代。合适的接头部分包括，例如四乙二醇、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-和-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-。包含接头部分的修饰剂可通过下述方法制备，即使单Boc(叔丁基)-烷基二胺(例如单Boc-乙烯二胺、单Boc-二氨基己烷)在1-乙基-3-(3-双甲基氨丙基)碳化二亚胺(EDC)的存在条件下与脂肪酸反应，从而在自由胺与脂肪酸羧酸之间形成酰胺键。通过下述方法可从产物中除去Boc保护基团，即采用三氟乙酸(TFA)处理，以暴露可与所述另一羧酸偶联，或可与马来酸酐反应的伯胺，并使所获产物环化，生成该脂肪酸被活化的马来酰亚胺衍生物(见，例如Thompson，et al.，WO92/16221，其完整内容被引入此处作为参考)。
本发明的修饰模拟体可通过使人类EPO模拟CH1缺失模拟体或配体结合片段与修饰剂反应而得以生成。例如，通过应用胺反应性修饰剂，例如PEG的NHS酯，可以无位点特异性方式将有机部分结合至EPO模拟CH1缺失模拟体。修饰的人类模拟体或配体结合片段也可通过还原EPO模拟CH1缺失模拟体或配体结合片段的二硫键(例如链内二硫键)而得以制备。随后，可使还原的EPO模拟CH1缺失模拟体或配体结合片段与硫醇反应性修饰剂反应，以获得本发明的修饰EPO模拟CH1缺失模拟体。通过采用合适方法，诸如反向蛋白水解(Fisch et al.，Bioconjugate Chem.，3：147-153(1992)；Werlen et al.，Bioconjugate Chem.，5：411-417(1994)；Kumaran et al.，ProteinSci.6(10)：2233-2241(1997)；Itoh et al.，Bioorg.Chem.，24(1)：59-68(1996)；Capellas et al.，Biotechnol.Bioeng.，56(4)：456-463(1997))和Hermanson，G..T.，BioconjugateTechniques，Academic Press：San Diego，CA(1996)所描述的方法，可制备含有特定有机部分的修饰人类模拟体和配体结合片段，其中该特定有机部分被结合至本发明EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的特定位点。
EPO模拟CH1缺失模拟体组合物
本发明也提供了至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物，该组合物包含了此处所描述和/或本领域已知，以非天然存在组合物、混合物或形态被提供的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、至少六种或更多模拟体或特定部分或其变体。该组合物的比例通过重量、体积、浓度、摩尔浓度，或本领域已知或此处所描述的液体或速干剂、混合物、悬液、乳剂或胶体形式的摩尔浓度表示。
该组合物可包括0.00001-99.9999％的重量、体积、浓度、摩尔浓度或本领域已知或此处所描述的液体、气体或速干剂、混合物、悬液、乳剂或胶体形式的摩尔浓度，或其中的任意范围或数值”，例如，但不仅限于0.00001、0.00003、0.00005、0.00009、0.0001、0.0003、0.0005、0.0009、0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9％。因此，本发明的该组合物包括，但不仅限于0.00001-100mg/ml和/或0.00001-100mg/g。
该组合物可任选地进一步包括选自至少一种抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于体液或电解液平衡的药物、血液药物、抗肿瘤、免疫调节药物、眼、耳或鼻用药、局部用药、营养药等药物的有效量的至少一种化合物或蛋白质。上述药物均是本领域熟知的，包括此处所列各药物的配方、适应症、剂量和施用(见，例如Nursing 2001Handbook of Drugs，21st edition，Springhouse Corp.，Springhouse，PA，2001；HealthProfessional’s Drug Guide 2001，ed.，Shannon，Wilson，Stang，Prentice-Hall，Inc，Upper Saddle River，NJ；PharmcotherapyHandbook，Wells et al.，ed.，Appleton &Lange，Stamford，CT，均被完整引入此处作为参考)。
抗感染药物可为选自杀阿米巴药或至少一种抗原生动物药、驱肠虫药、抗真菌药、抗疟药、抗结核药或至少一种抗麻风药、氨基糖苷类药、青霉素、头孢菌素、四环素、磺胺、氟喹诺酮、抗病毒药、大环内酯抗感染药、综合性抗感染药中的至少一种药物。CV药物可为选自变力性药、抗心律不齐药、防心绞痛药、抗高血压药、抗血脂药、综合性心血管药物中的至少一种药物。CNS药物可为选自非麻醉性镇痛药的至少一种药物，或选自退热剂、非类固醇抗炎症药物、麻醉药中的至少一种药物，或至少一种阿片样镇痛药、镇静-催眠药、抗惊厥药、抗抑郁药、抗焦虑药、抗精神病药、中枢神经系统刺激剂、抗帕金森病药、综合性中枢神经系统药物。ANS药物可为选自胆碱能药物(拟副交感神经药)、抗胆碱能药、肾上腺素能药(拟交感神经药)、肾上腺素能阻断剂(抗交感神经药)、骨骼肌松弛药、神经肌肉阻断剂中的至少一种药物。呼吸道药物可为选自抗组胺剂、支气管舒张药、祛痰剂中的至少一种药物或至少一种镇咳药、综合性呼吸药物。GI道药物可为选自抗酸剂的至少一种药物，或至少一种吸附剂，或至少一种抗气胀药、消化酶或至少一种胆结石增溶剂、止泻药、轻泻药、止吐剂、抗溃疡药。激素药物可为选自皮质激素类、雄激素中的至少一种药物，或至少一种促同化激素类、雌激素或至少一种孕酮、促性腺激素、抗糖尿病药物或至少一种胰高血糖素、甲状腺激素类、甲状腺激素类拮抗剂、垂体激素、类甲状旁腺药物。用于平衡体液和电解液的药物可为选自利尿剂、电解质中的至少一种药物或至少一种置换溶液、酸化剂或至少一种碱化剂。血液药物可为选自补血药、抗凝血药、血液衍生物、溶栓酶中的至少一种药物。抗肿瘤药物可为选自烷基化药物、抗代谢物、抗菌素抗肿瘤药物、可改变激素平衡的抗肿瘤药物、综合性抗肿瘤药物中的至少一种药物。免疫调节药物可为选自免疫抑制剂、疫苗中的至少一种药物，或至少一种类毒素、抗毒素或至少一种抗蛇毒素、免疫血清、生物反应调节物。眼、耳和鼻用药可为选自眼科抗感染药、眼科抗炎症药、缩瞳药、扩瞳药、眼部血管收缩剂、综合性眼、耳、鼻用药中的至少一种药物。局部用药可为选自局部抗感染药、抗疥螨剂中的至少一种药物或至少一种抗虱剂、局部皮质激素类。营养药可为选自维生素、矿物质或热质中的至少一种药物。见，例如上述Nursing 2001Drug Handbook中的内容。
上述至少一种杀阿米巴药或抗原生动物药可为选自阿托伐醌、盐酸氯奎、磷酸氯奎、甲硝基羟乙唑、盐酸甲硝基羟乙唑、戊烷脒羟乙基磺酸盐中的至少一种药物。上述至少一种驱肠虫药可为选自甲苯咪唑、双羟萘酸喹嘧啶、噻苯咪唑中的至少一种药物。上述至少一种抗真菌剂可为选自两性霉素B、两性霉素B胆固醇基硫酸盐复合物、两性霉素B脂质复合物、两性霉素B脂质体、氟康唑、氟胞嘧啶、微小尺寸灰黄霉素、超微小尺寸灰黄霉素、伊曲康唑、酮康唑、制霉菌素、盐酸特比萘芬中的至少一种药物。上述至少一种抗疟药可为选自盐酸氯奎、磷酸氯奎、强力霉素、硫酸羟化氯奎、盐酸甲氟奎、磷酸伯氨喹、息疟定、含周效磺胺的息疟定中的至少一种药物。上述至少一种抗结核药或抗麻风药可为选自氯苯吩嗪、环丝氨酸、氨苯砜、盐酸乙胺丁醇、异烟肼、吡嗪酰胺、利福布汀、利福平、利福喷汀、硫酸链霉素中的至少一种药物。上述至少一种氨基糖苷类药物可为选自硫酸丁胺卡那霉素、硫酸艮他霉素、硫酸新霉素、硫酸链霉素、硫酸妥布霉素中的至少一种药物。上述至少一种青霉素可为选自阿莫西林/棒酸钾、三水合阿莫西林、氨苄青霉素、氨苄青霉素钠、三水合氨苄青霉素、氨苄青霉素钠/舒巴坦钠、邻氯苯甲异恶唑青霉素钠、二氯苯甲异恶唑青霉素钠、美洛西林钠、乙氧萘青霉素钠、甲苯异恶唑青霉素钠、苄星青霉素G、青霉素G钾、青霉素G普鲁卡因、青霉素G钠、青霉素V钾、氧哌嗪青霉素钠、氧哌嗪青霉素钠/他唑巴坦钠、羧噻吩青霉素二钠、羧噻吩青霉素二钠/棒酸钾中的至少一种。上述至少一种头孢菌素可为选自至少一种氯头孢菌素、头孢羟氨、头孢钠素、头孢地尼、盐酸头孢吡肟、头孢克肟、氰唑甲氧头孢钠素、头孢尼西钠、氧哌羟苯唑头钠、头孢噻肟钠、头孢双硫唑甲氧二钠、噻吩甲氧头孢钠素、头孢泊肟酯、头孢丙烯、头孢噻甲羧肟、头孢布坦、头孢唑肟钠、头孢三嗪噻肟钠、头孢呋辛酯、头孢呋辛钠、盐酸头孢氨苄、一水合头孢氨苄、头孢环已烯、氯碳头孢中的至少一种。上述至少一种四环素可为选自盐酸地美环素、强力霉素钙、doxycycline hyclate、doxycycline hydrochloride、一水合强力霉素、盐酸米诺环素、盐酸四环素中的至少一种。上述至少一种磺胺可为选自增效磺胺甲基异恶唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺乙酰异恶唑中的至少一种。上述至少一种氟喹诺酮可为选自甲磺酸阿拉曲伐沙星、环丙沙星、依诺沙星、左氧氟沙星、盐酸洛美沙星、萘啶酸、氟哌酸、氧氟沙星、司帕沙星、甲磺酸曲伐沙星中的至少一种。上述至少一种抗病毒药物可为选自硫酸阿巴卡韦、无环鸟苷钠、盐酸金刚烷胺、安普那韦、西多福韦、甲磺酸地拉维定、去羟肌苷、依非韦伦、泛昔洛韦、福米韦生钠、磷甲酸钠、更昔洛韦、硫酸茚地那韦、拉米呋啶、拉米呋啶/齐多呋啶、甲磺酸奈非那韦、内维拉平、磷酸奥司他韦、三氮唑核苷、盐酸金刚乙胺、利托那韦、沙奎那维、甲磺酸沙奎那维、司他呋啶、盐酸伐昔洛韦、扎西他滨、扎纳米韦、齐多呋啶中的至少一种。上述至少一种大环内酯抗感染药可为选自阿奇霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素基质、无味红霉素、琥珀酸乙酯红霉素、乳糖酸红霉素、硬脂酸红霉素中的至少一种。上述至少一种综合抗感染药可为选自氨曲南、杆菌肽、琥珀酸钠氯霉素、盐酸氯洁霉素、盐酸氯洁霉素棕榈酸酯、氯洁霉素磷酸酯、亚胺培南。和西司他丁钠，、美罗培南、呋喃妥因大晶体、呋喃妥因微晶体、奎奴普丁/达福普汀、盐酸壮观霉素、三甲氧苄二氨嘧啶、盐酸万古霉素中的至少一种。(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的24-214页)。
上述至少一种变力性药物可为选自乳酸氨联吡啶酮、地高辛、乳酸米立农中的至少一种。上述至少一种抗心律失常药可为选自腺苷、盐酸乙胺碘呋酮、硫酸阿托品、甲苯磺酸溴苄胺、盐酸硫氮酮、双异丙吡胺、磷酸双异丙吡胺、盐酸艾司洛尔、乙酸哌氟酰胺、富马酸伊布利特、盐酸利多卡因、盐酸麦西雷丁、盐酸莫雷西嗪、苯妥英、苯妥英钠、盐酸普鲁卡因胺、盐酸普罗帕酮、盐酸普奈洛尔、酸式硫酸奎尼定、葡萄糖酸奎尼定、聚半乳糖醛酸奎尼定、硫酸奎尼定、梭达罗、盐酸妥卡尼、盐酸异搏定中的至少一种。上述至少一种防心绞痛药可为选自苯磺酸氨氯地平、亚硝酸戊酯、盐酸苄普地尔、盐酸硫氮酮、二硝酸异山梨醇酯、一硝酸异山梨醇酯、萘羟心安、盐酸尼卡地平、硝苯吡啶、硝酸甘油、盐酸心得安、异搏定、盐酸异搏定中的至少一种。上述至少一种抗高血压药可为选自盐酸醋丁酰心安、苯磺酸阿姆罗赫、氨酰心安、盐酸贝那普利、盐酸贝他洛尔、富马酸比索洛尔、坎地沙坦酯、卡托普利、盐酸山羊豆苷、卡维地洛、可乐宁、盐酸可乐宁、二氮嗪、盐酸硫氮酮、甲磺酸多沙唑嗪、依那普利拉、马来酸依那普利、甲磺酸依普罗沙坦、非洛地平、甲磺酸非诺多泮、福辛普利钠、醋酸氯压胍、硫酸胍那决尔、盐酸谷氨法新、盐酸肼苯哒嗪、厄贝沙坦、伊拉地平、盐酸柳胺苄心定、赖诺普利、氯沙坦钾、甲基多巴、盐酸甲基多巴盐、琥珀酸美多心安、酒石酸美多心安、长压定、盐酸莫昔普利、萘羟心安、盐酸尼卡地平、硝苯吡啶、乳链菌肽、硝普盐钠、硫酸环戊丁心安、perindopril erbumine、甲磺酸芬托拉明、心得静、盐酸哌唑嗪、盐酸普奈洛尔、盐酸喹那普利、雷米普利、替米沙坦、盐酸特拉唑嗪、马来酸噻吗心安、群多普利、缬沙坦、盐酸异搏定中的至少一种。上述至少一种抗血脂药可为选自阿托伐他汀钙、西立伐他汀钠、胆苯烯胺、盐酸考来替泊、非诺贝特(微粉化)、氟伐他丁钠、吉非贝齐、洛伐他汀、烟酸、普伐他汀钠、辛伐他汀中的至少一种。上述至少一种综合性CV药物可为选自阿昔单抗.、前列地尔、盐酸阿布他明、西洛他唑、二硫酸氯吡格雷、双嘧哌胺醇、埃替非巴肽、盐酸甲氧胺福林、己酮可可碱、盐酸噻氯匹定、盐酸替罗非班中的至少一种。(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的215-336页)。
上述至少一种非麻醉性镇痛药或退热剂可为选自醋氨酚、阿司匹林、三水杨酸胆碱镁、二氟苯水杨酸、水杨酸酶中的至少一种。上述至少一种非甾族抗炎症药物可为选自塞来昔布、环氟拉嗪钾、环氟拉嗪钠、伊托多雷、苯氧苯丙酸钙、氟联苯丙酸、异丁苯丙酸、茚甲新、三水合茚甲新钠、酮丙酸、酮咯酸氨丁三醇、萘丁美酮、甲氧萘丙酸、甲氧萘丙酸钠、丙嗪、吡氧噻嗪、罗非昔布、舒林酸中的至少一种。上述至少一种麻醉药或阿片样镇痛药可为选自盐酸阿芬太尼、盐酸丁丙诺啡、酒石酸布托啡诺、磷酸可待因、硫酸可待因、枸橼酸芬太尼、芬太尼经皮系统、芬太尼跨粘膜、盐酸二氢吗啡酮、度冷丁、盐酸美沙酮、盐酸吗啡、硫酸吗啡、酒石酸吗啡、盐酸环丁甲羟氢吗啡、盐酸羟基二氢可待因酮、梳状1，4-羟基二氢可待因酮、盐酸氧吗啡酮、盐酸镇痛新、盐酸镇痛新和盐酸纳络酮、乳酸镇痛新、盐酸丙氧吩、萘磺酸丙氧吩、盐酸瑞芬太尼、柠檬酸舒芬太尼、盐酸曲马多中的至少一种。上述至少一种镇痛药-催眠药可为选自水合氯醛、三唑氮、盐酸氟胺安定、戊巴比妥、戊巴比妥钠、苯巴比妥钠、司可巴比妥钠、双香豆素、三唑苯二氮、扎莱普隆、酒石酸唑吡坦中的至少一种。上述至少一种抗惊厥药可为选自醋唑磺胺钠、卡马西平、氯硝安定、氯氮二钾、安定、双丙戊酸钠、乙琥胺、磷苯妥英钠、加巴喷丁、拉莫三嗪、硫酸镁、苯巴比妥、苯巴比妥钠、苯妥英、苯妥英钠、苯妥英钠(稀释)、普里米酮、盐酸替加宾、托吡酯、丙戊酸钠、丙戊酸中的至少一种。上述至少一种抗抑郁药可为选自盐酸阿米替林、双羟萘酸阿米替林、氯哌氧、盐酸丁氨苯丙酮、氢溴酸西酞普兰、盐酸氯米帕明、盐酸脱甲丙咪嗪、盐酸多虑平、盐酸氟西汀、盐酸丙咪嗪、双羟萘酸丙咪嗪、米氮平、盐酸奈法唑酮、盐酸去甲替林、盐酸帕罗西汀、硫酸苯乙肼、盐酸舍曲林、硫酸反苯环丙胺、马来酸三甲丙咪嗪、盐酸万拉法新中的至少一种。上述至少一种抗焦虑药可为选自阿普唑仑、盐酸丁螺旋酮、甲氨二氮、盐酸甲氨二氮、氯氮二钾、安定、盐酸多虑平、双羟萘酸羟嗪、盐酸羟嗪、双羟萘酸羟嗪、氯羟安定、mephrobamate、盐酸咪达唑仑、去甲羟安定中的至少一种。上述至少一种抗精神病药可为选自盐酸氯丙嗪、氯氮平、癸酸氟非那嗪、庚酸氟非那嗪、盐酸氟非那嗪、氟哌啶醇、癸酸氟哌啶醇、乳酸氟哌啶醇、盐酸克塞平、琥珀酸克塞平、苯磺酸甲砜哒嗪、盐酸莫林酮、奥氮平、奋乃静、哌迷清、普鲁氯嗪、富马酸喹硫平、利培酮、盐酸甲硫哒嗪、氨砜噻吨、盐酸氨砜噻吨、盐酸三氟啦嗪中的至少一种。上述至少一种中枢神经系统刺激剂可为选自硫酸安非他明、咖啡碱、硫酸右旋安非他明、盐酸吗吡啉酮、盐酸脱氧麻黄碱、盐酸利他林、莫达非尼、佩默林、盐酸苯丁胺中的至少一种。上述至少一种抗帕金森病药可为选自盐酸金刚胺、甲磺酸苯托品、盐酸比哌立登、乳酸比哌立登、甲磺酸溴麦角环肽、卡比多巴-左旋多巴、恩他卡朋、左旋多巴、甲磺酸培高利特、二盐酸普拉克索、盐酸罗匹尼罗、盐酸司来吉兰、托卡朋、盐酸三己芬迪中的至少一种。上述至少一种综合性中枢神经系统药物可为选自盐酸丁氨苯丙酮、盐酸多奈哌齐、达哌啶醇、马来酸氟伏沙明、碳酸锂、柠檬酸锂、盐酸纳雷曲坦、nicotine polacrilex(一种戒烟口香糖的活性成分)、烟碱经皮系统、异丙酚、苯甲酸利扎曲普坦、盐酸西布曲明、琥珀酸舒马普坦、盐酸塔克林、佐米曲普坦中的至少一种。(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的337-530页)
上述至少一种胆碱能药(例如拟副交感神经药)可为选自氯化氨甲酰甲胆碱、氯化滕西隆、溴化新斯的明、甲基硫酸新斯的明、水杨酸毒扁豆碱、溴化3-二甲氨基甲酰氧基-1甲基吡啶中的至少一种。上述至少一种抗胆碱能药可为选自硫酸阿托品、盐酸双环胺、胃长宁、茛菪碱、硫酸茛菪碱、溴化丙胺太林、东茛菪碱、丁基溴化东茛菪碱、氢溴化东莨菪碱中的至少一种。上述至少一种肾上腺素能药(拟交感神经药)可为选自盐酸多巴酚丁胺、盐酸多巴胺、酸式酒石酸间羟胺、酸式酒石酸去甲肾上腺素、盐酸苯肾上腺素、盐酸假麻黄碱、硫酸假麻黄碱中的至少一种。上述至少一种肾上腺素能阻断剂(抗交感神经药)可为选自甲磺酸双氢麦角胺、酒石酸麦角胺、马来酸二甲麦角新碱、盐酸普奈洛尔中的至少一种。上述至少一种骨骼肌松弛剂可为选自氯苯氨丁酸、肌安宁、氯羟苯唑、盐酸环苯扎林、硝苯呋海因钠、氨甲酸愈甘醚酯、盐酸替扎尼定中的至少一种。上述至少一种神经肌肉阻断剂可为选自苯磺酸阿曲库铵、苯磺酸顺阿曲库铵、多库氯铵、米库氯铵、泮库溴铵、哌库溴铵、雷库溴铵、罗库溴铵、氯琥珀胆碱、氯化筒箭毒碱、维库溴铵中的至少一种。(见，例如Nuring 2001DrugHandbook中的531-84页)。
上述至少一种抗组胺剂可为选自马来酸溴苯吡胺、盐酸西替利嗪、马来酸氯苯吡胺、富马酸铁线莲亭、盐酸二苯环庚啶、盐酸苯海拉明、盐酸非索非那定、氯雷他定、盐酸异丙嗪、茶异丙嗪、盐酸丙吡咯啶中的至少一种。上述至少一种支气管扩张药可为选自舒喘宁、硫酸舒喘宁、氨茶碱、硫酸阿托品、硫酸麻黄碱、肾上腺素、酒石酸氢肾上腺素、盐酸肾上腺素、异丙托溴铵、异丙基肾上腺素、盐酸异丙基肾上腺素、硫酸异丙基肾上腺素、盐酸左旋沙丁胺醇、硫酸异丙喘宁、胆茶碱、醋酸吡布特罗、羟萘甲酸沙美特罗、硫酸特普他林、茶碱中的至少一种。上述至少一种祛痰剂或镇咳药可为选自退咳露、磷酸可待因、硫酸可待因、氢溴酸右美沙芬、盐酸苯海拉明、愈创木酚甘油醚、盐酸二氢吗啡酮中的至少一种。上述至少一种综合性呼吸药物可为选自乙酰半胱氨酸、二丙酸氯地米松、beractant、布地奈德、calfactant、色甘酸钠、链道酶α、前列腺环素钠、9-去氟肤轻松、丙酸氟替卡松、孟鲁司特钠、奈多罗米钠、帕利珠单抗、丙炎松、扎鲁司特、齐留通中的至少一种。(见Nursing 2001Drug Handbook中的585-642页)
上述至少一种抗酸剂、吸附剂或抗气胀药可为选自碳酸铝、氢氧化铝、碳酸钙、氢氧化镁铝、氢氧化镁、氧化镁、二甲基硅油、碳酸氢钠中的至少一种。上述至少一种消化酶或胆结石增溶剂可为选自胰酶、胰脂肪酶、脱氧熊胆酸中的至少一种。上述至少一种止泻药可为选自硅镁土、碱式水杨酸铋、聚卡波非钙、盐酸氰苯哌酯或硫酸阿托品、洛哌丁胺、醋酸奥曲肽、阿片酊、阿片酊(含樟脑)中的至少一种。上述至少一种抗糖尿病药或胰高血糖素可为选自阿卡波糖、氯磺丙脲、谷胱甘肽、格列甲嗪、胰高血糖素、优降糖、胰岛素、盐酸甲福明二甲双胍、米格列醇、盐酸吡咯列酮、瑞格列奈、马来酸罗格列酮、曲格列酮中的至少一种。上述至少一种甲状腺激素可为选自左旋甲状腺素钠、碘甲腺氨酸钠、复方甲状腺素、干甲状腺粉中的至少一种。上述至少一种甲状腺激素拮抗剂可为选自甲疏咪唑、碘化钾、碘化钾(饱和溶液)、丙硫尿嘧啶、放射性碘(碘化钠131I)、浓碘溶液中的至少一种。上述至少一种垂体激素可为选自促肾上腺皮质激素、α1-24促肾上腺皮质激素、desmophressin acetate、乙酸亮脯利特、长效促肾上腺皮质激素、人蛋氨生长素、生长激素、加压素中的至少一种。上述至少一种类甲状旁腺药物可为选自骨化二醇、降钙素(人类)、降钙素(鲑鱼)、钙三醇、二氢速甾醇、依替膦酸钠中的至少一种。(见，例如Nursing 20001Drug Handbook中的696-796页)
上述至少一种利尿剂可为选自乙酰唑(磺)胺、乙酰唑(磺)胺钠、盐酸氨氯吡脒、丁苯氧酸、氯噻酮、利尿酸钠、利尿酸、利尿磺胺、双氢氯噻嗪、茚磺苯酰胺、甘露醇、美拉托宗、安体舒通、托拉塞米、三氨苯蝶啶、脲中的至少一种。上述至少一种电解质或置换溶液可为选自乙酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、乳酸钙、磷酸钙(二元)、磷酸钙(三元)、葡聚糖(高分子量)、萄聚糖(低分子量)、羟乙基淀粉、氯化镁、硫酸镁、乙酸钾、碳酸氢钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、Ringer氏注射液、Ringers氏注射液(乳酸化)、氯化钠中的至少一种。上述至少一种酸化剂或碱化剂可为选自碳酸氢钠、乳酸钠、氨基丁三醇中的至少一种。(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的797-833页)
上述至少一种补血药可为选自富马酸铁、葡萄糖酸铁、硫酸亚铁、硫酸亚铁(干燥)、右旋糖酐铁、山梨醇铁、多糖-铁复合物、葡萄糖酸铁钠复合物中的至少一种。上述至少一种抗凝血剂可为选自阿地肝素钠.、达肝素钠、达那肝素钠、依诺肝素钠、肝素钙、肝素钠、苄丙酮香豆素钠中的至少一种。上述至少一种血液衍生物可为选自白蛋白5％、白蛋白25％、抗血友病因子、抗抑制剂促凝剂复合物、抗凝血酶III(人类)、IX因子(人类)、IX因子复合物、血浆蛋白组分中的至少一种。上述至少一种溶血栓药可为选自阿替普酶、阿尼链酶、瑞替普酶(重组)、链激酶、尿激酶中的至少一种。(见，例如Nursing2001Drug Handbook中的834-66页)
上述至少一种烷基化药物可为选自白消安、卡铂、卡氮芥、苯丁酸氮芥、顺氯氨铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、环己亚硝脲、盐酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、盐酸苯丙氨酸氮芥、链脲霉素、替莫唑胺、硫替派中的至少一种。上述至少一种抗代谢物可为选自卡培他滨、克拉屈滨、阿糖胞苷、氟苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、羟基脲、巯基嘌呤、氨甲蝶呤、氨甲蝶呤钠、硫鸟嘌呤中的至少一种。上述至少一种抗生素抗肿瘤药物可为选自硫酸博莱霉素、放线菌素D、柠檬酸柔红霉素脂质体、盐酸柔红霉素、盐酸阿霉素、盐酸阿霉素脂质体、盐酸表柔比星、盐酸伊达比星、丝裂霉素、戊糖苷、普卡霉素、valrubicin中的至少一种。上述至少一种可改变激素平衡的抗肿瘤药物可为选自阿那曲唑、比卡鲁胺、雌二醇氮芥磷酸钠、依西美坦、氟他胺、乙酸戈舍瑞林、来曲唑、乙酸亮脯利特、醋酸甲地孕酮、尼鲁米特、柠檬酸三苯氧胺、睾内脂、枸橼酸托瑞米芬中的至少一种。上述至少一种综合性抗肿瘤药物可为选自天冬酰胺酶、杆菌Calmette-Guerin(BCG)(活体膀胱内)、氮烯咪胺、多烯紫杉醇、鬼臼乙叉苷、磷酸鬼臼乙叉苷、盐酸吉西他滨、盐酸伊立替康、邻氯苯对氯苯二氯乙烷、盐酸米托蒽醌、紫杉醇、培加帕酶、卟吩姆钠、盐酸甲基下肼、利妥昔单抗、替尼泊甙、盐酸拓扑替康、曲妥珠单抗、全反维生素A酸、硫酸长春花碱、硫酸长春花新碱、酒石酸长春瑞宾，中的至少一种。(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的867-963页)
上述至少一种免疫抑制剂可为选自硫唑嘌呤、巴利昔单抗、环孢霉素、达克珠单抗、淋巴细胞免疫球蛋白、莫罗单抗-CD3、霉酚酸吗啉乙酯、盐酸霉酚酸吗啉乙酯、西罗莫司、他克莫司中的至少一种。上述至少一种疫苗或类毒素可为选自BCG疫苗、霍乱疫苗、白喉和破伤风类毒素(吸附型)、白喉和破伤风类毒素和非细胞百日咳疫苗吸附型、白喉和破伤风类毒素和全细胞百日咳疫苗、b型嗜血杆菌结合疫苗、甲型肝炎疫苗(灭活)、乙型肝炎疫苗(重组)、流感病毒疫苗1999-2000三联型A&B(纯化的表面抗原)、流感病毒疫苗1999-2000三联型A&B(亚病毒体或纯化的亚病毒体)、流感病毒疫苗1999-2000三联型A&B(全病毒体)、日本脑炎病毒疫苗(灭活)、Lyme氏疏螺旋体病疫苗(重组OspA)、麻疹和腮腺炎和风疹病毒疫苗(活)、麻疹和腮腺炎和风疹病毒疫苗(减活)、麻疹病毒疫苗(减活)、脑膜炎双球菌多糖菌苗、腮腺炎病毒疫苗(活)、鼠疫疫苗、肺炎球菌疫苗(多联)、脊髓灰质炎病毒疫苗(灭活)、脊髓灰质炎病毒疫苗(活、口服、三联)、狂犬病疫苗(吸附型)、狂犬病疫苗(人类二倍体细胞)、风疹和腮腺炎病毒疫苗(活)、风疹病毒疫苗(活、减活)、破伤风类毒素(吸附型)、破伤风类毒素(液体)、伤寒疫苗(口服)、伤寒疫苗(肠胃外施用)、伤寒Vi多糖疫苗、水痘病毒疫苗、黄热病疫苗中的至少一种。上述至少一种抗毒素或抗蛇毒素可为选自黑寡妇蜘蛛抗蛇毒素、响尾蛇科抗蛇毒素(多联)、白喉抗毒素(马)、金黄珊瑚蛇毒血清)中的至少一种。上述至少一种免疫血清可为选自巨细胞病毒免疫球蛋白(静脉内)、乙型肝炎免疫球蛋白(人类)、免疫球蛋白肌肉内、免疫球蛋白静脉内、狂犬病免疫球蛋白(人类)、呼吸道合胞病毒免疫球蛋白静脉内(人类)、Rho(D)免疫球蛋白(人类)、Rho(D)免疫球蛋白静脉内(人类)、破伤风免疫球蛋白(人类)、水痘-带状疱疹免疫球蛋白中的至少一种。上述至少一种生物反应调节物可为选自阿地流津、依泊艾汀α、非拉司汀、注射用glatiramer acetate、干扰素alfacon-1、干扰素α-2a(重组)、干扰素α-2b(重组)、干扰素β-1a、干扰素β-1b(重组)、干扰素γ-1b、盐酸左旋四咪唑、重组人白介素11、沙格司亭中的至少一种。(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的964-1040页)
上述至少一种眼科抗感染药可选自杆菌肽、氯霉素、盐酸环丙沙星、红霉素、硫酸艮他霉素、吡啶羧酶0.3％、硫酸多粘菌素B、磺胺醋酰钠10％、磺胺醋酰钠15％、磺胺醋酰钠30％、托普霉素、阿糖腺苷中的至少一种。上述至少一种眼科抗炎症药可为选自地塞米松、地塞米松磷酸钠、二氯苯胺苯乙酸钠0.1％、氯甲龙、氟比洛芬钠、酮咯酸氨丁三醇、醋酸强的松龙(悬液)、强的松龙磷酸钠(溶液)中的至少一种。上述至少一种缩瞳剂可为选自氯乙酰胆碱、氨甲酰胆碱(眼内)、氨甲酰胆碱(局部)、依可碘酯、毛果芸香碱、盐酸毛果芸香碱、硝酸毛果芸香碱中的至少一种。上述至少一种扩瞳剂可为选自硫酸阿托品、盐酸环戊通、盐酸肾上腺素、硼酸肾上腺素、氢溴酸后马托品、盐酸苯肾上腺素、氢溴酸东莨菪碱、托品酰胺中的至少一种。上述至少一种眼血管收缩剂可为选自盐酸萘唑啉、盐酸羟间唑啉、盐酸四氢萘唑啉中的至少一种。上述至少一种综合性眼药可为选自盐酸阿可乐定、盐酸倍他洛尔、酒石酸溴莫尼定、盐酸山羊豆苷、盐酸地匹福林、盐酸杜塞酰胺、富马酸依美斯汀、荧光素钠、延胡索酸甲哌噻庚酮、拉坦前列素、盐酸左布诺洛尔、盐酸美替卜拉格、氯化钠(高渗)、马来酸噻吗心安中的至少一种。上述至少一种耳用药可为选自硼酸、过氧化氢脲、氯霉素、油酸三乙醇胺多肽-冷凝液中的至少一种。上述至少一种鼻用药可为选自二丙酸氯地米松、布地奈德、硫酸麻黄碱、盐酸肾上腺素、9-去氟肤轻松、丙酸氟替卡松、盐酸萘唑啉、盐酸羟间唑啉、盐酸苯肾上腺素、盐酸四氢萘唑啉、丙炎松、盐酸丁苄唑啉中的至少一种。(见，例如Nursing 2001Drug Handbook中的1041-97页)
上述至少一种局部抗感染药可为选自无环鸟苷、两性霉素B、壬二酸乳脂、杆菌肽、硝酸布康唑、磷酸氯林肯霉素、克霉唑、硝酸益康唑、红霉素、硫酸艮他霉素、酮康唑、醋酸高磺胺、甲硝基羟乙唑(局部)、硝酸霉抗唑、莫匹罗星、盐酸萘替芬、硫酸新霉素、硝基糖腙、制霉菌素、磺胺嘧啶银、盐酸特比奈酚、特康唑、盐酸四环素、噻康唑、发癣退中的至少一种。上述至少一种抗疥螨剂或抗虱剂可为选自克罗他米通、林丹、苄氯菊脂、除虫菊酯中的至少一种。上述至少一种局部皮质类固醇可为选自双丙酸倍他米松、戊酸倍他米松、丙酸氯氟美松、丙缩羟强龙、去氧米松、地塞米松、地塞米松磷酸钠、.双醋二氟松、丙酮肤轻松、氟新诺龙酯、氟氢缩松、丙酸氟替卡松、halcionide、氢化可的松、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、戊酸氢化可的松、糠酸莫美他松、丙炎松中的至少一种。(见，例如Nursing2001Drug Handbook中的1098-1136页)
上述至少一种微生物或矿物质可为选自维生素A、复合维生素B、氰钴胺素、叶酸、羟钴胺素、甲酰四氢叶酸钙、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素C、维生素D、胆钙化醇、麦角钙化醇、维生素D类似物、度骨化醇、帕利骨化醇、维生素E、维生素K类似物、维生素K1、氟化钠、氟化钠(局部)、痕量元素、铬、铜、碘、锰、硒、锌中的至少一种。上述至少一种热质可为选自氨基酸浸剂(晶状)、右旋糖中的氨基酸浸剂、含电解质的氨基酸浸剂、右旋糖中含电解质的氨基酸浸剂、针对肝衰竭的氨基酸浸剂、针对高代谢压力的氨基酸浸剂、针对肾衰竭的氨基酸浸剂、右旋糖、脂肪乳浊液、中链脂肪酸甘油三酯中的至少一种。(见，例如Nursing 2001DrugHandbook中的1137-63页)
本发明CH1缺失模拟体抗体或多肽组合物可进一步包含任何合适的和/或有效量的特定组合物或药物组合物中的至少一种，该特定组合物或药物组合物包含了对需要上述调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者施用的至少一种CH1缺失模拟体蛋白或抗体，该特定组合物或药物组合物任选地进一步包含了选自至少一种TNF拮抗剂(例如，但不仅限于TNF化学或蛋白质拮抗剂、TNF单克隆或多克隆抗体或片段、可溶TNF受体(例如p55、p70或p85)或片段、其融合多肽，或小分子TNF拮抗剂，例如TNF结合蛋白I或II(TBP-1或TBP-II)、nerelimonmab、英利昔单抗、enteracept、CDP-571、CDP-870、阿非莫单抗、来那西普.等)、抗风湿药(例如，氨甲蝶呤、醋硫葡金、金硫代葡萄糖、硝基咪唑硫嘌呤、依那西普、硫代苹果酸金钠、硫酸羟基氯奎、来氟米特、柳氮磺胺吡啶)、肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎症药物(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂(例如氨基糖苷类、抗真菌剂、抗寄生虫药、抗病毒药物、氨基甲酰、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺胺、四环素、其它抗菌剂)、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、糖尿病相关药物、矿物质、营养物质、甲状腺药物、维生素、钙相关激素、止泻药、镇咳药、止吐剂、抗溃疡药、轻泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如依泊艾汀α)、非拉司汀(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环胞多肽、达克珠单抗)、生长激素、激素取代药物、雌激素受体调节物、扩瞳剂、睫状肌麻痹药、烷基化药物、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、塔克林、哮喘药、β增效剂、吸入型类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、链球菌DNA酶α(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂中的至少一种。上述细胞因子的非限制性实例包括，但不仅限于IL-1-IL-23中的任意一种。合适剂量是本领域熟知的。见，例如Wells etal.，eds.，Pharmacotherapy Handbook，2nd Edition，Appleton and Lange，Stamford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon PocketPharmacopoeia 2000，Deluxe Edition，Tarascon Publishing，LomaLinda，CA(2000)，上述参考文献均被完整引入此处，作为参考。
上述组合物也可包括与本发明至少一种抗体或多肽缔合、结合、协同配制或协同施用的毒素分子。该毒素可任选地起选择性杀死病理细胞或组织的作用。该病理细胞可为癌细胞或其它细胞。该毒素可以是，但不仅限于包含了特定毒素的至少一个功能性细胞毒素区的纯化或重组毒素或毒素片段，该特定毒素选自例如，至少一种蓖麻毒蛋白、白喉毒素、蛇毒毒素或细菌毒素之一。术语毒素也包括由任何可在人类和其它哺乳动物中引起包括中毒性休克在内的病理状况，并可导致死亡的天然存在、突变或重组细菌或病毒所生成的内毒素和外毒素。该毒素可包括，但不仅限于产肠毒素的大肠杆菌热不稳定肠毒素(LT)、热稳定肠毒素(ST)、志贺菌细胞毒素、气单胞菌肠毒素、中毒性休克综合征毒素-1(TSST-1)、葡萄球菌肠毒素A(SEA)、B(SEB)或C(SEC)、链球菌肠毒素等。上述细菌包括，但不仅限于产肠毒素大肠杆菌(ETEC)、致肠出血大肠杆菌(例如血清型0157：H7的菌株)、葡萄球菌种(例如金黄色葡萄球菌、酿脓葡萄球菌)、志贺菌种(例如志贺氏痢疾杆菌、福氏志贺杆菌、波伊德氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏杆菌)、沙门氏菌种(例如伤寒杆菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌)、梭状芽胞杆菌种(例如产气荚膜梭状芽胞杆菌、艰难杆菌、肉毒杆菌)、弯曲杆菌种(例如空肠弯曲杆菌、胚胎弯曲杆菌)、螺杆菌种(例如幽门螺杆菌)、气单胞菌种(例如，温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌)、类志贺邻单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌、弧菌种(例如霍乱弧菌、副溶血性弧菌)、克雷白杆菌种、铜绿假单胞菌和链球菌。见，例如Stein，ed.，INTERNAL MEDICINE，3rded.，pp1-13，Little，Brown and Co.，Boston，(1990)；Evanset al.，eds.，Bacterial Infections of Humans；Epidemiology andControl，2d.Ed.，pp 239-254，Plenum Medical Book Co.，New York(1991)；Mandell et al.，Principles and Practice of InfectiousDiseases，3d.Ed.，Churchill Livingstone，New York(1990)；Berkow et al.，eds.，The Merck Manual，16th edition，Merck andCo.，Rahway，N.J.，1992；Wood et al.，FEMS MicrobiologyImmunology，76：121-134(1991)；Marrack et al.，Science，248：705-711(1990)，上述参考文献的内容均被完整引入此处作为参考。
本发明EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物可进一步包括至少一种任意的合适辅助物，例如，但不仅限于稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂溶剂、防腐剂、佐剂等。药物学可接受辅助物是优选的。上述无菌溶液的非限制性实例及制备方法均是本领域熟知的，例如，但不仅限于Gennaro，Ed.，Remington’sPharmaceutical Sciences，18th Edition，Mack Publishing Co.(Eas ton，PA)1990。通过本领域熟知和/或此处描述的常规方法可选择出与EPO模拟CH1缺失模拟体组合物的施用方式、溶解度和/或稳定性相配的药物学可接受载体。
在本发明组合物中有用的药物赋形剂和添加剂包括，但不仅限于可单独或以组合形式存在，包括单独或在组合中以1-99.99％重量或体积比例存在的蛋白质、肽、氨基酸、脂质和糖类(例如，糖、包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，诸如糖醇、糖醛酸、酯化糖等；多糖或糖类聚合物)。蛋白质赋形剂的实例包括血清白蛋白，诸如人类血清白蛋白(HSA)、重组人类白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可发挥缓冲作用的代表性氨基酸/EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、天冬酰苯丙氨酸甲酯等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适用于本发明的糖类赋形剂包括，例如，单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和糖醇，诸如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨糖醇(葡糖醇)、肌醇等。适用于本发明的优选糖类赋形剂为甘露糖醇、海藻糖和棉子糖。
EPO模拟CH1缺失模拟体组合物也可包括缓冲剂或pH调节剂；典型的缓冲剂是从有机酸或碱制备而得的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，诸如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或苯二甲酸的盐；Tris、盐酸三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐缓冲剂。适用于本发明组合物的优选缓冲剂为有机酸盐，诸如柠檬酸盐。
另外，本发明的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物可包括聚合的赋形剂/添加剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、ficolls(一种聚合糖)、葡萄糖结合剂(例如环糊精，诸如2-羟丙基-β环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗菌剂、甜味剂、抗氧剂、抗静电剂、表面活性剂(例如聚山梨醇酯，诸如“TWEEN 20”和“TWEEN 80”)、脂质(例如磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如胆固醇)和螯合剂(例如EDTA)。
适用于本发明EPO模拟CH1缺失模拟体组合物的上述及其它已知药物赋形剂和/或添加剂均是本领域已知的，例如在“Remington：TheScience&Practice of Pharmacy”，19thed.，Williams&Williams，(1995)，和在“Physician’s Desk Reference”，52nded.，MedicalEconomics，Montvale，NJ(1998)中所列出的药物赋形剂和/或添加剂，上述参考文献的公开内容均被完整引入此处作为参考。优选的载体或赋形剂材料为糖类(例如糖类和糖醇)和缓冲剂(例如柠檬酸盐)或聚合剂。
配方
如上所述，本发明提供了稳定配方，该配方可优选地包括含盐水或特定盐的合适缓冲剂，和任选的含有防腐剂，以及适合药用或兽医用途的多用途防腐配方的防腐溶液和配方，并包含了药物学可接受配方形式的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。防腐配方含有至少一种已知的防腐剂，或选自下列的任选防腐剂，即至少一种苯酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氨丁醇、氯化镁(例如六水合物)、烷基对羟基苯甲酸(甲基、乙基、丙基、丁基等)、杀藻胺、氯化苄乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或上述物质在水性稀释剂中的混合物。可根据本领域已知的知识应用任意合适的浓度或混合物，诸如0.001-5％，或其中的任意范围或数值，例如，但不仅限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或其中的任意范围或数值。非限制性实例包括，非代表性的0.1-2％m-甲酚(例如0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)、0.1-3％苯甲醇(例如0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、0.001-0.5％硫柳汞(例如0.005、0.01％)、0.001-2.0％苯酚(例如0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％烷基对羟基苯甲酸(例如0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。
如上所述，本发明提供了一种制品，该制品包括包装材料和至少一个含有特定溶液的小瓶，该特定溶液含有至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体和上述缓冲剂和/或防腐剂，并任选地为水性稀释液形式，其中上述包装材料包括标示了上述溶液可保存超过1、2、3、4、5、6、9、12、18、20、24、30、36、40、48、54、60、66、72小时或更长时间段的标签。本发明进一步包括一种制品，该制品包括包装材料、含至少一种冻干EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的第一个小瓶，和含有上述缓冲剂或防腐剂的水性稀释液的第二个小瓶，其中上述包装材料包括一个标签，可向患者说明如何将至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体重新混入水性稀释液中，并从而形成可保存超过24小时或更长时间段的溶液。
根据本发明应用的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体可通过重组途径，包括从哺乳动物细胞或转基因制品中制备，或者可从此处所描述或本领域已知的其它生物学来源纯化获得。
在本发明的产品中，至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的数量范围包括在湿/干体系中的情况下，在复原基础上可获得大约1.0ug/ml-大约1000mg/ml浓度的量，但较低和较高浓度也是可行的，并取决于特定送递载体，例如溶液配方不同于经皮药帖、肺、跨粘膜，或渗透或微量泵法。
优选地，上述水性稀释液任选地进一步包括药物学可接受防腐剂。优选的防腐剂包括选自下列的防腐剂，即苯酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、烷基对羟基苯甲酸(甲基、乙基、丙基、丁基等)、杀藻胺、氯化苄乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或上述物质的混合物。应用在本发明配方中的防腐剂浓度是足以产生抗微生物效果的浓度。该浓度取决于所选防腐剂，且技术人员可容易地测定该浓度。
其它赋形剂，例如等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、防腐增强剂，均可被任选和优选地加入上述稀释液中。等渗剂，如甘油，通常采用其已知浓度。生理可耐受缓冲剂被优选加入，以改善pH控制。本发明配方可覆盖大范围的pH，诸如大约pH4-大约pH10，优选的范围是大约pH5-大约pH9，最为优选的范围是大约pH6.0-大约pH8.0。本发明配方的优选pH值在大约6.8-大约7.8之间。优选的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂，最为优选的是磷酸钠，尤其是磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
其它添加剂，诸如药物学可接受增溶剂，如Tween 20(聚氧化乙烯(20)山梨糖醇酐单月桂酸酯)、Tween 40(聚氧化乙烯(20)山梨糖醇酐单棕榈酸酯)、Tween 80(聚氧化乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)、Fluronic F68(聚氧化乙烯聚氧化丙烯嵌段共聚物)和PEG(聚乙二醇)或非离子表面活性剂，诸如聚山梨醇酯20或80或聚羟亚烃184或188，Pluronicpolyls、其它嵌段共聚物，和诸如EDTA和EGTA的螯合剂，均可被任选地加入本发明配方或组合物中，以减少凝聚。当采用泵或塑料容器施用本发明配方时，上述添加剂尤其有效。药物学可接受表面活性剂的存在减低了蛋白质凝聚的倾向。
本发明配方可通过特定方法制备，该方法包括将至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体与选自下列之一的防腐剂混合，即苯酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、烷基对羟基苯甲酸(甲基、乙基、丙基、丁基等)、杀藻胺、氯化苄乙氧铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或上述物质在水性稀释液中的混合物。将至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体与防腐剂混合在水性稀释液中，是采用常规溶解和混合操作实现的。为制备合适配方，例如，将缓冲液中精确量的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体与缓冲液中的指定防腐剂按特定量值配伍，该特定量值足以提供蛋白质和防腐剂的指定浓度。本领域任何一位普通技术人员均应认可该方法的改动形式。例如，加入组分的顺序，是否采用其它添加剂，制备该配方的温度和pH，是可被优化从而适用于所采用浓度和施用途径的全部因素。
本发明所要求权利的配方可作为清液或双瓶形式被提供给患者，其中在双瓶中，有一瓶含有至少一种冻干的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体，可利用含有水、防腐剂和/或赋形剂，优选磷酸盐缓冲剂和/或盐水和特定盐，并形成水性稀释液的另一小瓶将其复原。需复原的单溶液瓶或双瓶均可被重复利用多次，并足以满足对患者的单次或多循环治疗需要，因而可提供比现有通用治疗方案更为便利的治疗方法。
本发明所要求权利的制品适用于从立即到24小时或更长时间段跨度的施用。相应地，本发明所要求权利的制品为患者提供了显著的益处。本发明配方可任选地在大约2-大约40℃的温度下安全保存，并长时间地保持蛋白质的生物活性，因而可在包装标签上标示该溶液可在6、12、18、24、36、48、72或96小时或更长的时间段跨度上被保存和/或使用。如采用防腐稀释剂，该标签可包括直至1-12个月中的至少一个月数、半年、一年半和/或两年的使用期。
在本发明中，至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的溶液可通过特定方法制备，该方法包括将至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体混合在水性稀释液中。该混合是采用常规溶解和混合操作实现的。为制备合适的稀释液，例如，以在水或缓冲液中，以特定量值配伍精确量的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体，该量值足以提供蛋白质和任选防腐剂或缓冲剂的指定浓度。本领域任何一位普通技术人员均应认可该方法的改动形式。例如，加入组分的顺序，是否采用其它添加剂，制备本发明配方的温度和pH，是可被优化从而适用于所采用浓度和施用途径的全部因素。
本发明所要求权利的产品可作为清液或双瓶形式被提供给患者，其中在双瓶中，有一瓶含有至少一种冻干的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体，可利用含水性稀释液的另一小瓶将其复原。需复原的单溶液瓶或双瓶均可被重复利用多次，并足以满足对患者的单次或多循环治疗需要，因而可提供比现有通用治疗方案更为便利的治疗方法。
通过向药房、诊所或其它类似机构和设施提供本发明所要求权利的清液或双瓶形式的产品，可将其间接提供给患者，其中在双瓶中，有一瓶含有至少一种冻干的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体，可利用含水性稀释液的另一小瓶将其复原。该情况中的清液可达一升或更大体积，因而需提供一种大的储液器，由其分一次或多次地将较少量的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体溶液转移进较小的瓶中，该储液器可由药房或诊所向其顾客和/或患者提供。
包含上述单瓶体系的公认装置包括用于送递溶液的笔式-注射器装置，诸如Huma ject、NovaPen、B-DPen、AutoPen和OptiPen。包含双瓶体系的公认装置包括可用于将冻干药物在药筒中复原，并送递该复原溶液的笔式-注射器装置，诸如HumatroPen。
本发明所要求权利的产品包括包装材料。除管理机构所要求的信息外，该包装材料还提供了应用该产品的条件。本发明的包装材料向患者提供了说明书，讲述了在产品为双瓶，湿/干形式时，水性稀释剂中复原至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体，形成溶液的方法，以及在超过2-24小时或更长时间段的跨度上使用该溶液的方法。对单瓶溶液产品而言，标签标示了该溶液可被使用超过2-24小时或更长时间段。本发明所要求权利的产品在人类药物产品用途方面有用。
本发明配方可通过特定方法制备，该方法包括将至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体与特定缓冲剂，优选含盐水或特定盐的磷酸盐缓冲剂混合。将至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体与缓冲剂混合在水性稀释液中，是采用常规溶解和混合操作实现的。为制备合适配方，例如，将水或缓冲剂中准确量的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体与水中的指定缓冲剂按特定量值配伍，该量值足以提供蛋白质和缓冲剂的指定浓度。本领域任意一位普通技术人员均应认可该方法的变动形式。例如，加入组分的顺序，是否采用其它添加剂，制备本发明配方的温度和pH，是可被优化从而适用于所采用浓度和施用途径的全部因素。
本发明所要求权利的稳定或防腐配方可以清液或双瓶形式被提供给患者，该双瓶中，有一瓶含有至少一种冻干的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体，可利用含水性稀释液形式的防腐剂或缓冲剂和赋形剂的另一小瓶将其复原。需复原的单溶液瓶或双瓶均可被重复利用多次，并足以满足对患者的单次或多循环治疗需要，因而可提供比现有通用治疗方案更为便利的治疗方法。
根据本发明，此处所描述的稳定或防腐配方或溶液中的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体可通过多种送递方法被施用给患者，包括SC或IM注射；经皮、肺、跨粘膜、移植、渗透泵、药筒、微量泵或本领域熟知，并被熟练技术人员理解的其它途径。
治疗应用
就模拟体而言，本发明也提供了调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者贫血的方法，该贫血包括，但不仅限于任何贫血中的至少一种，癌症治疗相关贫血、放射治疗或化学治疗相关贫血、病毒或细菌感染治疗相关贫血、肾贫血、早熟相关贫血、儿科和/或成人癌症相关贫血，与淋巴瘤、骨髓瘤、多发性骨髓瘤相关的贫血、AIDS相关贫血，该方法包括对具有下列情况的患者进行的伴随治疗，即存在或不存在自体捐血情况下等候选择性手术的患者，在对手术而言的手术前和手术后，接受了自体捐血或输血、牙周炎治疗，患有周期性中性白细胞减少症或Kostmann综合征(先天粒性白细胞缺乏症)、末期肾病、与透析相关的贫血、慢性肾机能不全、原发性造血病，诸如先天再生不良性贫血、重型地中海贫血或镰状细胞(贫血)病、镰状细胞(贫血)病的血管闭塞并发症的患者。Furman et al.，Pediatrics 1992；90：716-728，Goldberg Science.1988；242：1412-1415；Paul et al.，Exp Hematol.1984；12：825-830；Erslev et al.，Arch Intern Med.1968；122：230-235；Ersley et al.，Ann Clin Lab Sci.1980；10：250-257；Jacobs et al.，Nature.1985；313：806-810；Linet al.，Proc Natl Acad Sci USA.1985；82：7580-7584；Law et al.，Proc Natl Acad Sci USA.1986；83：6920-6924；Goldwasser et al.，J Biol Chem.1974；249：4202-4206；Eaves et al.，Blood.1978；52：1196-1210；Sawyer et al.，Blood.1989；74：103-109；Winearls et al.，Lancet.1986；2：1175-1178；Eschbach et al.，N Engl J Med.1987；316：73-78；Eschbach et al.，Ann Intern Med.1989；111：992-1000，上述参考文献均被完整引入此处作为参考。
本发明模拟体也可被应用于由例如，慢性传染病、炎症过程、放射治疗和抑制细胞生长药物治疗所诱发的非肾形式的贫血，并且在非肾贫血患者中所取得的令人鼓舞的结果已被报导。见，例如Abels RI和Rudnick SA在Experimental Hematology 19：842-50(1991)中的Erythropoietin：evolving clinical appliactions.(促红细胞生成素：发展中的临床应用)；Graber SE和Krantz SB在Hematology/Oncol.Clin.North Amer.3：369-400(1989)中的Erythropoietin：biology and clinical use.(促红细胞生成素：生物学和临床用途)；Jelkman W和Gross AJ(eds)Erythropoietin.Springer，Berlin 1989；Koury MJ和Bondurant MC在EuropeanJournal of Biochemistry 210：649-63(1992)中的The molecularmechanism of erythropoietin action.(促红细胞生成素作用的分子机制)；Krantz SB在Blood 77：419-34(1991)中的Erythropoietin(促红细胞生成素)；Tabbara IA在Archivesf Intemal MedicineI53：298-304(1993)中的Erythropoietin.Biology and clinicalapplications.(促红细胞生成素，生物学和临床应用)，上述参考文献均被完整引入此处作为参考。
本发明也提供了调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者贫血或血细胞相关状况的方法，其中上述贫血或血细胞相关状况与下述至少一种疾病相关，包括，但不仅限于至少一种免疫相关病、心血管病、传染病、恶性和/或神经病。该方法可任选地包括将至少一种有效量的特定组合物或药物组合物施用于需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者，该组合物或药物组合物含有至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。
本发明也提供了调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者癌症/传染病的方法，这些疾病包括，但不仅限于至少一种急性或慢性细菌传染、急性和慢性寄生或传染过程，包括细菌、病毒和真菌传染，HIV传染/HIV神经病、脑膜炎、肝炎、脓毒性关节炎、腹膜炎、肺炎、会厌炎、大肠杆菌0157:h7、溶血性尿毒症综合征/溶栓性血小板减少性紫癫、疟疾、登革热出血热、利什曼病、麻风病、中毒性休克综合征、链球菌肌炎、气性坏疽、结核分支杆菌、鸟结核分支杆菌细胞内、间质性浆细胞肺炎、盆腔炎、睾丸炎/附睾炎、军团杆菌、拉姆病、A型流行性感冒、埃-巴二氏病毒、与重要器官相关的血液吞噬细胞综合征、致命脑炎/无菌性脑膜炎等；(ii)白血病、急性白血病、急性淋巴性白血病(ALL)、B-细胞、T-细胞或FAB ALL、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血症(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓发育不良综合征、淋巴瘤、何杰金氏病、恶性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波济肉瘤、结肠癌、胰腺痛、鼻咽癌、恶性组织细胞增生症、肿瘤伴随综合征/恶性高钙血症、实体瘤、腺癌、肉瘤、恶性黑素瘤等；或(iii)神经退化病、多发性硬化、偏头痛、AIDS痴呆复合征、脱髓鞘病，诸如多发性硬化和急性横贯性脊髓炎；锥体外和小脑失调，诸如皮层脊髓系统的损害；基底神经节的失调或小脑失调；运动过度性运动障碍，诸如亨廷顿氏舞蹈病和老年性舞蹈病；药物诱发的运动障碍，诸如由封闭CNS多巴胺受体的药物所诱发的运动障碍；运动功能减退性运动障碍，诸如帕金森氏病；进行性supranucleo麻痹；小脑的结构性损害；脊髓小脑变性，诸如脊髓性共济失调、弗里德赖希氏共济失调、小脑皮层退化、多发性系统退化(Mencel，Dejerine-Thomas，Shi-Drager和Machado-Joseph)；系统性失调(雷弗素姆氏病、无β脂蛋白血症、共济失调、毛细管扩张和线粒体多系统失调)；脱髓鞘核失调，诸如多发性硬化、急性横贯性脊髓炎；和运动单位失调，诸如神经性肌肉萎缩(前角细胞退化，诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化、婴儿脊髓性肌萎缩和少年脊髓性肌萎缩)；阿尔茨海默病；中年唐氏综合征；弥散型路易氏体病；路易氏体型老年性痴呆；Wernicke-Korsakoff综合征；慢性醇中毒；Creutzfeldt-Jakob病；亚急性硬化性全脑炎、Hallerrorden-Spatz病；和拳击员痴呆等。该方法可任选地包括将有效量的特定组合物或药物组合物施用于需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者，该组合物或药物组合物含有至少一种TNF抗体或特定部分或变体。见，例如the Merck Manual，16thEdition，Merck &Company，Rahway，NJ(1992)。
该方法可任选地包括将有效量的至少一种特定组合物或药物组合物施用于需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者，该组合物或药物组合物含有至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。
本发明也提供了调节或治疗细胞、组织、器官、动物或患者至少一种心血管病的方法，该心血管病包括，但不仅限于，至少一种心脏晕厥综合征、心肌梗塞、充血性心力衰竭、中风、局部缺血性中风、出血、动脉硬化、动脉粥样硬化、糖尿病动脉硬化性疾病、高血压、动脉性高血压、肾血管性高血压、晕厥、休克、心血管系统的梅毒、心力衰竭、肺源性心脏病、原发性肺动脉高压、心律失常、房性异位搏动、心房扑动、心房纤维性颤动、(持续或阵发性)、紊乱性或多病灶房性心动过速、规律性狭窄QRS心动过速、特殊心律失常、心室纤颤、His束心律失常、房室传导阻滞、束支性传导阻滞、心肌局部缺血性失调、冠心病、心绞痛、心肌梗塞、心肌病、扩张充血性心肌病、限制性心肌病、瓣膜性心脏病、心内膜炎、心包疾病、心脏肿瘤、主动脉和周围动脉动脉瘤、主动脉解剖、主动脉炎症、腹主动脉及其分枝的闭塞、外周血管失调、闭塞性动脉失调、外周动脉粥样硬化病、血栓闭塞性脉管炎、功能性外周动脉失调、雷诺氏现象和疾病、肢端发绀症、红斑性肢痛症、静脉病、血栓静脉炎、曲张静脉、动静脉瘘、淋巴水肿、脂肪水肿、不稳定心绞痛、再灌注损伤、泵后综合征、局部缺血-再灌注损伤等。该方法可任选地包括将有效量的特定组合物或药物组合物施用于需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者，该组合物或药物组合物含有至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。
本发明的任一方法均可包括将有效量的特定组合物或药物组合物施用于需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者，该组合物或药物组合物含有至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。该方法可任选地进一步包括针对治疗上述免疫病的协同施用或联合治疗，其中上述至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体、特定部分或其变体的施用进一步包括在其之前、同时和/或之后，施用选自下列的至少一种药物，即至少一种TNF拮抗剂(例如，但不仅限于TNF抗体或片段、可溶性TNF受体或片段、其融合蛋白或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿药、肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎症药物(NSAID)、镇痛药、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗菌剂(例如，氨基糖苷类、抗真菌剂、抗寄生虫药、抗病毒药、氨基甲酰、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺胺、四环素、其它抗菌剂)、抗银屑病药、皮质类固醇、促蛋白合成类固醇、糖尿病相关药物、矿物质、营养物、甲状腺药物、维生素、钙相关激素、止泻药、镇咳药、止吐剂、抗溃疡药、轻泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如依泊艾汀α)、非拉司汀(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、Leukine)、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如巴利昔单抗、环孢霉素、达克珠单抗)、生长激素、激素取代药物、雌激素受体调节物、扩瞳药、睫状肌麻痹药、烷基化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药物、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、塔克林、哮喘药、β增效剂、吸入类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸、肾上腺素或类似物、链道酶α(Pulmozyme)、细胞因子或细胞因子拮抗剂。合适的剂量是本领域熟知的。见，例如Wells et al.，eds.，PharmacotherapyHandbook，2nd Edition，Appleton and Lange，Starnford，CT(2000)；PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，DeluxeEdition，Tarascon Publishing，Loma Linda，CA(2000)，各参考文献均被完整引入此处作为参考。
模拟物也可被应用于体外，诸如自体骨髓培养。简言之，在化学治疗之前，从患者体内取出骨髓，并采用TPO和/或EPO处理，任选地结合模拟体，任选地结合一种或多种其它细胞因子。随后，将经过处理的骨髓返还给经过化学治疗的患者，以加速骨髓的恢复。另外，TPO可单独应用和与EPO模拟体和/或EPO联合应用，也可被用于体外扩展骨髓或外周血祖细胞(PBPC)。在化学治疗之前，可采用干细胞生长因子(SCF)或G-CSF刺激骨髓，以将早期祖细胞释放进外周循环中。任选地，从外周血中收集并浓缩这些祖细胞，并随后采用TPO和模拟体处理其培养物，任选地结合一种或多种其它细胞因子，包括，但不仅限于SCF、G-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-6或IL-11，使其分化并增生为高密度巨核细胞培养物，随后将其任选地返还给经过高剂量化学治疗后的患者体内。用于体外处理骨髓的TPO剂量范围应为100pg/ml-10ng/ml，优选的为500pg/ml-3ng/ml。模拟体的剂量应在活性上等同于EPO，可采用的剂量范围是0.1个单位/ml-20个单位/ml，优选地是0.5个单位/ml-2个单位/ml，或其中的任意范围或数值。
适用于本发明组合物、联合治疗、协同施用、装置和/或方法(进一步包括本发明至少一种抗体、特定部分或其变体)的TNF拮抗剂包括，但不仅限于抗TNF抗体、其配体结合片段，和与TNF特异性结合的受体分子；阻止和/或抑制TNF合成、TNF释放或其对目标细胞的作用的化合物，诸如反应停、替尼达普、磷酸二酯酶抑制剂(例如己酮可可碱和咯利普兰)、A2b腺苷受体拮抗剂和A2b腺苷受体增强剂；阻止和/或抑制TNF受体发信号的化合物，诸如促分裂原活化蛋白(MAP)激酶抑制剂；阻滞和/或抑制膜TNF裂解的化合物，诸如金属蛋白醇抑制剂；阻滞和/或抑制TNF活性的化合物，诸如血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂(例如卡托普利)；和阻滞和/或抑制TNF生成和/或合成的化合物，诸如MAP激酶抑制剂。
此处所用“肿瘤坏死因子抗体”、“TNF抗体”、“TNFα抗体”或片段等降低、阻滞、抑制、消除或干扰了体外、原位和/或优选体内的TNFα活性。例如，合适的本发明TNF人类抗体可结合TNFα，并包括抗TNF抗体、其抗原结合片段，和特定突变体或其与TNFα特异性结合的区域。合适的TNF抗体或片段也可降低、阻滞、消除、干扰、阻止和/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白质合成、TNF释放、TNF受体发信号、膜TNF裂解、TNF活性、TNF生成和/或合成。
嵌合抗体cA2由高亲和性中和小鼠抗人TNFαIgG1抗体，即A2的抗原结合可变区和人类IgG1，即K免疫球蛋白的恒定区组成。该人类IgG1Fc区改善了同种异型抗体效应子功能，延长了该抗体的循环血清半衰期，并降低了其免疫原性。嵌合抗体cA2的亲和力和表位特异性来源于鼠科动物抗体A2的可变区。一种特定实施方案中，对编码该鼠科动物抗体A2可变区的核酸而言，优选的来源是A2杂交瘤细胞系。
嵌合A2(cA2)以剂量依赖方式中和了天然和重组人类TNFα二者的细胞毒效应。从嵌合抗体cA2与重组人类TNFα的结合试验中，推算出嵌合抗体cA2的亲和常数为1.04×1010M-1。通过竞争抑制测定单克隆抗体特异性和亲和力的优选方法可参考Harlow，et al.，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，1988；Colligan etal.，eds.，CurrentProtocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience，New York.(1992-2002)；Kozbor et al.，Immunol.Today，4：72-79(1983)；Ausubel et al.，eds.Current Protocolsin Molecular Biology，Wiley Interscience，New York(1987-2002)；和Muller，Meth.Enzymol.，95：589-601(1983)，这些参考文献均被完整引入此处作为参考。
一种特定实施方案中，鼠科动物单克隆抗体A2由被命名为c134A的细胞系生成。嵌合抗体cA2由被命名为c168A的细胞系生成。
本领域已描述了可应用于本发明的其它单克隆抗TNF抗体实例(见，例如美国专利No.5,231,024；Mller，A.et al.，Cytokine2(3)：162-169(1990)；美国申请No.07/943,852(1992年9月11日提交)；Rathjen et al.，International Publication No.WO91/02078(1991年2月21日出版)；Rubin etal.，EPO PatentPublication No.0218868(1987年4月22日出版)；Yone et al.，EPO Patent Publication No.0288088(1988年10月26日)；Liang，et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.137：847-854(1986)；Meager，et al.，Hybridoma 6：305-311(1987)；Fendly et al.，Hybridoma 6：359-369(1987)；Bringman，et al.，Hybridoma6：489-507(1987)；和Hirai，et al.，J.Immunol.Meth.96：57-62(1987)，这些参考文献均被完整引入此处作为参考)。
TNF受体分子
本发明优选采用的TNF受体分子是那些与TNFα高亲和力结合(见，例如Feldmann et al.，International Publication No.WO92/07076(1992年4月30日出版)；Schall et al.，Cell 61：361-370(1990)；和Loetscher et al.，Ce1161：351-359(1990)，这些参考文献均被完整引入此处作为参考)，并任选地具有低免疫原性的TNF受体分子。55kDa(p55TNF-R)和75kDa(p75TNF-R)TNF细胞表面受体在本发明中尤其有用。这些受体的截短形式包括该受体的胞外域(ECD)或其功能部分(见，例如Corcoran et al.，Eur.J.Biochem.223：831-840(1994))，在本发明中也有用。在尿和血清中已检测到该TNF受体包含ECD的截短形式，即30kDa和40kDa的TNFα抑制结合蛋白(Engelmann，H.et al.，J.Biol.Chem.265：1531-1536(1990))。TNF受体多聚体分子和TNF免疫受体融合分子，及其衍生物和片段或部分，是可应用于本发明方法和组合物的其它TNF受体分子实例。可应用于本发明的TNF受体分子的特征在于其具有长期治疗患者，并可良好到极好地缓解症状的能力，且毒性低。低免疫原性和/或高亲和力，以及其它未明确的特征，均可能对所获的治疗效果起作用。
在本发明中有用的TNF受体多聚体分子包括经由一个或多个多肽接头或其它非肽接头，诸如聚乙二醇(PEG)，连接在一起的两个或多个TNF受体的ECD的全部或一个功能部分。该多聚体分子可进一步包括分泌性蛋白的信号肽，以引导该多聚体分子的表达。美国申请No.08/437,533(1995年5月9日提交)中描述了这些多聚体分子及其制备方法，该参考文献的内容被完整引入此处作为参考。
在本发明方法和组合物中有用的TNF免疫受体融合分子包括一个或多个免疫球蛋白分子的至少一个部分，和一个或多个TNF受体的全部或一个功能部分。这些免疫受体融合分子可被装配为单体，或异源多聚体或同源多聚体。该免疫受体融合分子也可为单价或多价。这种TNF免疫受体融合分子的一个实例是TNF受体/IgG融合蛋白。本领域已描述了TNF免疫受体融合分子及其制备方法(Lesslauer et al.，Eur.J.Immunol.21：2883-2886(1991)；Ashkenazi et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Peppel et al.，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991)；Kolls et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219(1994)；Butler et al.，Cytokine 6(6)；616-623(1994)；Baker et al.，Eur.J.Immunol.24：2040-2048(1994)；Beutler et al.，美国专利No.5,447,851；和美国申请No.08/442,133(1995年5月16日提交)，这些参考文献均被完整引入此处作为参考)。制备免疫受体融合分子的方法也可参考Capon et al.，美国专利No.5,116,964；Capon et al.，美国专利No.5,225,538；和Capon et al.，Nature 337：525-531(1989)，这些参考文献均被完整引入此处作为参考。
TNF受体分子的功能等价物、衍生物、片段或区指该TNF受体分子的特定部分，或该TNF受体分子序列中编码TNF受体分子的部分，其尺寸和序列足以使其在功能上与可应用于本发明的TNF受体分子相似(例如，与TNFα高亲和力地结合，并具有低免疫原性)。TNF受体分子的功能等价物也包括在功能上与可应用于本发明的TNF受体分子相似(例如，与TNFα高亲和力地结合，并具有低免疫原性)的修饰TNF受体分子。例如，TNF受体分子的功能等价物可含有“SILENT”密码子或一个或多个氨基酸置换、缺失或添加(例如将一个酸性氨基酸置换为另一个酸性氨基酸；或将一个编码相同或不同疏水氨基酸的密码子置换为另一个编码疏水氨基酸的密码子)。参见Ausubel et al.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene PublishingAssoc.and Wiley-Interscience，New York(1987-2002)。
细胞因子包括，但不仅限于所有已知的细胞因子。见，例如CopewithCytokines.com。细胞因子拮抗剂包括，但不仅限于任何抗体、片段或模拟体、任何可溶受体、片段或模拟体、任何小分子拮抗剂，或上述物质的任意组合。
本发明的任何方法均可包括用于治疗蛋白质介导的失调的方法，该方法包括将有效量的特定组合物或药物组合物施用于需要这种调节、处理或治疗的细胞、组织、器官、动物或患者，该组合物或药物组合物含有至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。该方法可任选地进一步包括针对治疗免疫病的协同施用或联合治疗，其中上述至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体、特定部分或其变体的施用进一步包括在其之前、同时和/或之后，施用选自至少一种其它细胞因子，诸如IL-3、-6和-11；干细胞生长因子；G-CSF和GM-CSF中的至少一种物质。
典型地，对病理情况的治疗是通过施用有效量或剂量的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体组合物实现的，即根据该组合物所含的特定活性，每一剂量的范围共计平均为，每公斤患者体重施用至少大约0.01-500毫克的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体，优选地是每公斤患者体重单次或多次施用至少大约0.1-100毫克EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。可选地，有效血清浓度可包括单次或多次施用所获的0.1-5000ug/ml血清浓度。合适的剂量是医师已知的，并当然地取决于特定疾病状况、所施用组合物的特定活性和正接受治疗的特定患者。某些情况下，为获得指定治疗量，有必要进行重复施用，即以特定监控剂量或计量剂量的重复单独施用，且在获得指定日剂量或效果之前重复该单独施用。
优选剂量可任选地包括每次施用0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和/或30mg/kg，或其中的任意范围、数值或分数，或通过单次或多次施用获得0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000ug/ml血清浓度，或其中的任意范围、数值或分数。
可选地，可根据已知因素，诸如特定药剂的药效特性，及其施用模式和途径；接受者的年龄、健康情况和体重；症状的性质和程度、合并治疗的种类、治疗的频率和预期效果改变施用剂量。通常，有效成分的剂量可为每公斤体重施用大约0.1-100毫克。普通剂量为0.1-50，优选剂量为每公斤体重每次施用0.1-10毫克，或通过续释放形式有效地获得预期效果。
一个非限制性实例是，对人类或动物的治疗可通过一次性或周期性地施用0.0-100mg/kg的本发明至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体剂量，诸如采用单一、输注或重复剂量，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或可选地在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一个周期内的每一天，或上述天数和周数的任意组合周期内的每一天施用0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg的本发明至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。
适合内部施用的剂量形式(组合物)通常每单位或每个容器含有大约0.0001毫克-大约500毫克有效成分。在这些药物组合物中，有效成分的量通常按重量计算应为该组合物总重量的大约0.5-95％。
对肠胃外施用而言，EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体可与药物学可接受的肠胃外赋形剂一起或以分别提供的方式被配制为溶液、悬液、乳浊液或冻干粉。该赋形剂的实例是水、盐水、Ringer氏溶液、葡萄糖溶液和5％人类血清白蛋白。也可采用脂质体和非水性赋形剂，诸如不挥发油。赋形剂或冻干粉可含有维持等渗性(例如氯化钠、甘露糖醇)和化学稳定性(例如缓冲剂和防腐剂)的添加剂。该配方通过已知或合适的技术灭菌。
合适的药物载体在该领域内的标准参考文献，即Remington’sPharmaceutical Sciences，A.Osol的最新版本中均有所描述。
治疗性施用
根据本发明，可采用许多已知和已研发的施用模式，用于施用治疗有效量的本发明至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。虽然下述内容中采用了肺部施用，仍然可根据本发明采用其它施用模式，并获得合适效果。
本发明EPO模拟CH1缺失模拟体可在载体内形成溶液、乳浊液、胶体或悬液，或以粉末形式，通过利用多种适用于吸入或此处所描述或本领域其它已知模式施用的装置和方法中的任意一种，而得以送递。
肠胃外配方和施用
用于肠胃外施用的配方可含有常用赋形剂，无菌水或盐水、诸如聚乙二醇的聚烷撑二醇、植物来源的油、氢化萘等。根据已知方法，可通过采用合适的乳化剂或增湿剂和悬浮剂制备注射用的水性或油性悬液。注射用的药剂可以是无毒、不可口服的稀释剂，诸如在溶剂中形成的水性溶液或无菌可注射溶液或悬液。有效的赋形剂或溶剂可采用水、Ringer氏溶液、等渗盐水等；普通溶剂或悬浮溶剂则可采用无菌不挥发油。就这些用途而言，可采用任何种类的不挥发油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成的甘油单酯或二酯或三酯。肠胃外施用是本领域已知的，包括，但不仅限于，常规注射途径，美国专利No.5,851,198中描述的气压式无针注射装置，和美国专利No.5,839,446中描述的激光穿孔器装置，这两项专利均被完整引入此处作为参考。
可选送递
本发明进一步涉及通过肠胃外、皮下、肌内、静脉内、药丸、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮途径施用至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。蛋白质、EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物可被制备用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)施用，尤以液体溶液或悬液形式为佳；用于阴道或直肠施用时，则尤以半固体形式，诸如膏状物和栓剂为佳；口腔或舌下施用时，则尤以片剂或胶囊形式为佳；鼻内施用时，尤以粉末、滴鼻剂或气雾剂或特定药剂形式为佳；经皮施用则尤以凝胶剂、软膏剂、洗剂、悬液形式为佳，或含有可改变皮肤结构或提高经皮药帖中药物浓度的化学增强剂，诸如二甲亚砜(Junginger，et al.，在“Drug PermeationEnhancement”；Hsieh，D.S.，Eds.，pp59-90(Marcel Dekker，Inc.New York 1994，完整引入此处作为参考))，或含有可使含蛋白质和肽配方应用于皮肤的氧化剂(WO 98/53847)，或可施加电场，而造成短暂送递途径，诸如电穿孔，或可提高带电荷药物穿过皮肤的迁移率，诸如离子电渗疗法，或可应用超声波，诸如超声波导入法(美国专利No.4,309,989和4,767,402)的药帖送递系统(上述出版物和专利均被完整引入此处作为参考)。
肺/鼻部施用
对肺部施用而言，优选地送递颗粒大小的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物，以使其有效地抵达肺或窦下部的呼吸道。根据本发明，可通过本领域已知用于吸入式施用治疗药剂的多种吸入或鼻用装置中的任意一种送递至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。这些可使雾化配方沉积于患者窦腔或肺泡中的装置包括计量剂量吸入器、雾化器、干粉发生器、喷雾器等。适用于引导EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体肺或鼻部施用的其它装置也是本领域已知的。上述所有装置均可应用适合施用的配方，以使EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体分配在气溶胶中。该气溶胶可由溶液(水性和非水性)或固体颗粒组成。计量剂量吸入器，如Yentolion计量剂量吸入器，典型地采用推进气，并需在吸气期间开动(见，例如WO 94/16970，WO 98/35888)。干粉吸入器，如TurbuhalerTM(Astra)、Rotahaler(Glaxo)、Diskus(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、由Inhale Therapeutics经销的装置，和Spinhaler粉末吸入器(Fisons)，均通过呼吸活动吸入混合粉末(US4668218Astra，EP 237507Astra，WO 97/25086Glaxo，WO 94/08552Dura，US 5458135Inhale，WO 94/06498Fisons，完整引入此处作为参考)。雾化器如AERxTM Aradigm、Ultravent雾化器(Mallinckrodt)，和Acorn II雾化器(Marquest MedicalProducts)(US 5404871Aradigm，WO 97/22376)，可由溶液生成气溶胶，而计量剂量吸入器、干粉吸入器等吸入器则可产生小颗粒气溶胶，上述参考文献均被完整引入此处作为参考。商业可提供吸入装置的上述特定实例仅为适用于实践本发明的特定装置的代表，并不对本发明范畴构成限制。优选地，通过干粉吸入器或喷雾器送递包含至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的组合物。适用于施用本发明至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的吸入装置具有若干令人满意的特征。例如，通过吸入装置送递的优势在于可靠、可重现和准确。该吸入装置可任选地送递小的干颗粒，例如对良好的可吸入性而言，该颗粒小于大约10μm，优选地为大约1-5μm。
以喷雾形式施用EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物
包括EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的喷雾可通过迫使至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的悬液或溶液在压力下通过喷嘴而得以制备。该喷嘴的尺寸和构型、应用压力和液体进料速率均可选择以获得预期的输出量和颗粒尺寸。电喷雾可通过，例如电场及毛细管或喷嘴进料获得。通过喷雾器送递至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白颗粒的优势在于，颗粒尺寸小于大约10μm，优选范围是大约1um-大约5μm，最为优选的范围是大约2μm-大约3μm。
适用于喷雾器的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白配方典型地包括水性溶液形式的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白，其浓度为每毫升溶液含有大约1mg-大约20mg的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白。该配方可包括诸如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，和优选的锌。该配方也可包括用于使EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白稳定的赋形剂或试剂，诸如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或碳水化合物。可用于配制EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、鱼精蛋白等。可用于配制EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的典型糖类包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。该EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白配方也可包括表面活性剂，可减少或预防由溶液形成气溶胶时的雾化所导致的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的表面诱导性凝聚。多种常规表面活性剂均可被应用，诸如聚氧乙烯脂肪酸酯和乙醇，和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。其应用量范围通常应为配方重量的0.001-14％。对本发明的应用而言尤其优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。用于配制诸如模拟体或特定部分或变体的蛋白质的其它试剂是本领域已知的，也被包括在配方内。
通过雾化器施用EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物
EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白可通过雾化器，诸如喷射雾化器或超声波雾化器而得以施用。典型地，在喷射雾化器中，采用压缩空气源以通过喷嘴形成高速空气喷射流。当气体从喷嘴扩散出时，形成了低压区，将EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的溶液吸入，并使其通过与贮液器相连的毛细管。来源自毛细管的液流离开该毛细管时，被剪切为不稳定的丝状体和液滴，便形成了气溶胶。可应用一系列的构造、流速和导流片类型，以从特定喷射雾化器中获得预期的性能特征。在超声波雾化器中，采用高频电能以形成震荡的机械能，典型地应用压电式转换器。该能量直接或借助于偶联液被传输给EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白配方，便形成了包含该EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的气溶胶。通过雾化器送递EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白颗粒的优势在于，颗粒尺寸小于大约10μm，优选范围是大约1μm-大约5μm，最为优选的范围是大约2μm-大约3μm。
适用于喷射或起声波型雾化器的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体配方典型地包括水性溶液形式的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白，其浓度为每毫升溶液含有大约1mg-大约20mg的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体蛋白。该配方可包括诸如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂，和优选的锌。该配方也可包括用于使至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白稳定的赋形剂或试剂，诸如缓冲剂、还原剂、填充蛋白或碳水化合物。可用于配制至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白的填充蛋白包括白蛋白、鱼精蛋白等。可用于配制至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的典型糖类包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。该至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体配方也可包括表面活性剂，可减少或预防由溶液形成气溶胶时的雾化所导致的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的表面诱导性凝聚。多种常规表面活性剂均可被应用，诸如聚氧乙烯脂肪酸酯和乙醇，和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。其应用量范围通常应为配方重量的0.001-4％。对本发明的应用而言尤其优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20等。用于配制诸如至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体蛋白质的其它试剂是本领域已知的，也被包括在配方内。
通过计量剂量吸入器施用EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物
在计量剂量吸入器(MDI)中，推进剂，至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体，和任意赋形剂或其它添加剂均被包容在金属罐内，形成了包括液化压缩气体在内的混合物。计量阀的开动将该混合物以气溶胶形式释放，该气溶胶优选地含有尺寸范围小于大约10um的颗粒，优选的尺寸范围是大约1μm-大约5μm，最为优选的尺寸范围是大约2μm-大约3μm。通过应用由本领域技术人员已知的多种方法，包括喷射研磨、喷雾干燥、临界点冷凝等方法制备的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物蛋白配方，可获得理想的气溶胶颗粒尺寸。优选的计量剂量吸入器包括由3M或Glaxo生产的计量剂量吸入器，并应用了氢化氟代烃推进剂。
适用于计量剂量吸入器装置的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体配方通常包括含有至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体，并可在非水性介质中形成悬液的微细粉末，例如，借助于表面活性剂悬浮在推进剂中。该推进剂可以是可用于该用途的任何常规材料，诸如氯氟代烃、氢化氯氟代烃、氢化氟代烃或烃，包括三氯氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇和1，1，1，2-四氟乙烷、HFA-134a氢氟烷-134a”))、HFA-227氢氟代烷-227等。优选的推进剂为氢化氟代烃。可选择表面活性剂，以稳定该推进剂中悬浮形式的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体，以保护该活性剂不被化学降解等。合适的表面活性剂包括山梨糖醇酐三油酸酯、大豆卵磷脂、油酸等。某些情况中，溶液气溶胶优选地采用诸如乙醇的溶剂。本领域已知可用于配制蛋白质，诸如本发明蛋白质的其它试剂也可被包括在本发明配方中。
本领域任何一位普通技术人员均应认识到本发明方法可借助此处未描述的装置通过肺部施用至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体组合物而得以实现。
粘膜配方和施用
对经由粘膜表面的吸收而言，至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的组合物和施用方法包括含有大量超微末微粒、粘膜附着大分子、具有生物活性的肽和水性连续相的乳浊液，可通过实现该乳浊液颗粒的粘膜附着促进其经由粘膜表面的吸收(美国专利No.5,514,670)。适合应用本发明乳浊液的粘膜表面可包括角膜、结膜、口腔、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠的施用途径。用于阴道或直肠施用的配方，例如栓剂，可含有赋形剂，例如聚烷撑二醇、凡士林、可可脂等。用于鼻内施用的配方可为固体，并含有赋形剂，例如乳糖，或者可以是滴鼻剂的水性或油性溶液。对口服而言，赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预糊化淀粉等(美国专利No.5,849,695)。
口服配方和施用
用于口服的配方依赖于佐剂的协同施用(例如间苯二酚和非离子性表面活性剂，诸如聚氧乙烯油醚和n-十六烷基聚乙烯醚)，以人为提高肠壁的通透性，该配方也依赖于酶抑制剂的协同施用(例如胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DFF)和抑肽酶)，以抑制酶降解。用于口服的固体类型剂型的活性组成化合物可与至少一种添加剂混合，该添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露糖醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、葡聚糖、淀粉、琼脂、精氨酸、壳多糖、脱乙酰壳多糖、果胶、黄蓍树胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物，和甘油酯。这些剂型也可含有其它类型的添加剂，例如不活泼稀释剂、润滑剂，诸如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸、诸如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚的防腐剂，诸如半胱氨酸的抗氧化剂、崩解剂、粘合剂、稠化剂、缓冲剂、甜味剂、调味剂、加香剂等。
片剂和丸剂可被进一步加工进肠溶包衣制剂中。用于口服的液体制剂包括乳剂、糖浆、酏剂、混悬剂和可用于医学用途的溶液制剂。这些制剂可含有常用于该领域的不活泼稀释剂，如水。脂质体也曾被描述为是胰岛素和肝素的药物送递系统(美国专利No.4,239,754)。更为新近的是，混合氨基酸人工聚合物的微球体(类蛋白)曾被用于送递药物(美国专利No.4,925,673)。此外，美国专利No.5,879,681和美国专利No.5,5,871,753中描述的载体化合物被用于口服送递本领域已知的生物活性剂。
经皮配方和施用
对经皮施用而言，该至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体被密封于送递装置中，诸如脂质体或聚合毫微粒、微粒、微胶囊或微球体(如无另外指出，可被共同称为微粒)。有许多合适的装置是已知的，包括由合成聚合物，如多羟基酸，如聚乳酸、聚羟基乙酸及其共聚物、聚原酸酯、聚酸酐和聚聚磷腈，和天然聚合物，诸如胶原蛋白、聚氨基酸、白蛋白及其它蛋白质、海藻酸盐及其它多糖，以及上述物质的组合制成的微粒(美国专利No.5,814,599)。
长期施用和配方
某些时候，使本发明化合物跨越较长的时间段再施用于患者是理想的，例如，从单次施用开始一周至一年的时间段。可利用多种缓释、贮存或移植剂型。例如，剂型可含有特定化合物的药物学可接受的无毒盐，该化合物在体液中具有低溶解度，例如，(a)具有多元酸，诸如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、鞣酸、双羟萘酸、海藻酸、多聚谷氨酸、萘磺酸或萘二磺酸、多聚半乳糖醛酸等酸的酸加成盐；(b)具有多价金属阳离子，诸如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等，或具有由例如N，N’-二苯基-乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子的盐；(c)(a)与(b)的组合，例如鞣酸锌盐。另外，本发明化合物，或优选的，相对不溶性盐，如上述盐，可被配制成凝胶，例如适用于注射，并含有例如，芝麻油的一硬脂酸铝凝胶。尤其优选的盐是锌盐、鞣酸锌盐、双羟萘酸盐等。注射用的其它类型缓释贮存配方应含有被分散以密封于缓慢降解、无毒、非抗原性多聚物，诸如美国专利No.3,773,919所描述的聚乳酸/聚羟基乙酸聚合物中的化合物或盐。该化合物或，优选的相对不溶性盐，如上述盐也可被配制在胆固醇基质硅酮丸中，尤其应用于动物。其它缓释、贮存或移植配方，例如气体或液体脂质体可参见本领域参考文献(美国专利Nos.5,770,222和“Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”(持续和控释药物送递系统)，J.R.Robinson ed.，Marcel Dekker，Inc.，N.Y.，1978)。
上文已概述了本发明，通过下述实例将更容易理解本发明，且下述实例仅用于例证，对本发明不构成限制。
实施例1：EPO模拟CH1缺失模拟体在哺乳动物细胞中的克隆化和表达
典型哺乳动物表达载体含有至少一个可介导mRNA转录起始的启动子元件，EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体编码序列，以及转录终止和转录产物聚腺苷酸化所需要的信号。其它元件包括增强子、Kozak序列和两侧伴有RNA剪切供体和受体位点的间插序列。高效转录可通过采用SV40来源的早期和晚期启动子、逆转录病毒，如RSV、HTLVI、HIVI来源的长末端重复序列(LTRS)和巨细胞病毒(CMV)来源的早期启动子实现。但也可采用细胞元件(例如人类肌动蛋白启动子)。可用于实现本发明的合适表达载体包括，例如，pIRESlneo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN，或pLNCX(Clonetech Labs，PaloAlto，CA)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3，1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC67109)。可被采用的哺乳动物细胞包括人类Hela 293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos1、Cos7和CV1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
可选地，基因可被表达于特定的稳定细胞系中，该细胞系含有被整合进入其染色体中的上述基因。具有可选标记，诸如dhfr、gpt、新霉素或潮霉素的共转染可实现对转染细胞的鉴定和分离。
转染基因也可被扩增，以表达大量编码的EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记有助于开发携带了所关心基因的数百或甚至数千个拷贝的细胞系。其它有用的选择标记为谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy，et al.，Biochem.J.227：277-279(1991)；Bebbington，et al.，Bio/Technology 10：169-175(1992))。利用这些标记，可在选择性培养基中培养哺乳动物细胞，并选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有被整合进入其染色体中的扩增基因。中国仓鼠卵巢(CHO)和NSO细胞通常被用于生成EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。
表达载体pC1和pC4含有劳斯肉瘤病毒的强启动子(LTR)(Cu11enet al.，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))，外加CMV-增强子的一个片段(Boshart，et al.，Cell 41：521-530(1985))。多克隆位点，例如具有限制酶裂解位点BamHI、XbaI和Asp718，有助于所关心基因的克隆化。该载体除含有3’内含子外，还含有大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化和终止信号。
在CHO细胞中的克隆化和表达
载体pC4被用于表达EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr的衍生物(ATCC编号为No.37146)。该质粒含有受SV40早期启动子控制的小鼠DHFR基因。通过在补充有化学治疗剂氨甲蝶呤的选择性培养基(例如α负型MEM，LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)中培养细胞，可筛选出由这些质粒转染，并缺乏二氢叶酸活性的中国仓鼠卵巢细胞或其它细胞。许多参考文献均记录了DHFR基因在对氨甲蝶呤(MTX)具有抗性的细胞中的扩增(见，例如F.W.Alt，etal.，J.Biol.Chem.253：1357-1370(1978)；J.L.Hamlin和C.Ma，Biochem.et Biophys.Acta1097：107-143(1990)；和M.J.Pa ge  和M.A.Sydenham，Biotechnology 9：64-68(1991))。在递增浓度MTX中生长的细胞通过因扩增DHFR基因所导致目标酶DHFR的过度产生，从而产生了对药物的抗性。如果将第二基因连接至该DHFR基因，则该第二基因通常被共同扩增并过度表达。本领域已知该方法可被用于开发携带了超过该扩增基因1,000个拷贝的细胞系。随后，当提取出氨甲蝶呤时，可获得含有扩增基因的细胞系，该扩增基因已被整合进宿主细胞的一个或多个染色体中。
质粒pC4含有用于表达所关心基因的劳斯肉瘤病毒长末端重复序列(LTR)的强启动子(Cullen，et al.，Molec.Cell.Biol.5：438-447(1985))，外加分离自人类巨细胞病毒(CMV)立即早期基因增强子的一个片段(Boshart，et al.，Cell 41：521-530(1985))。该启动子的下游是可实现上述基因整合的BamHI、XbaI和Asp718限制酶裂解位点。在这些克隆位点后，该质粒含有3’内含子和大鼠前胰岛素原基因的聚腺苷酸化位点。其它高效启动子也可被用于表达，例如人类b-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或其它逆转录病毒，如HIV和HTLVI来源的长末端重复序列。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表达系统和类似系统可被用于在哺乳动物细胞中以可调节途径表达EPO(M.Gossen，和H.Bujard，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551(1992))。对mRNA的聚腺苷酸化而言，也可采用其它信号，例如来自人类生长激素或球蛋白基因的信号。在采用可选标记，诸如gpt、G418或潮霉素共同转染的基础上，也可选择出携带了所关心基因的稳定细胞系，该基因已被整合进其染色体中。首先采用1种以上可选标记是有优势的，例如G418外加氨甲蝶呤。
通过本领域已知的操作方法，采用限制酶消化质粒pC4，并随后采用小牛肠内磷酸酶脱磷酸化。随后从1％琼脂糖凝胶中分离出该载体。
根据已知方法步骤，采用编码完整EPO模拟CH1缺失模拟体或特定部分或变体的DNA序列，例如SEQ ID NOS：13、14、15、16、17、18所示序列，该DNA序列与本发明EPO模拟CH1缺失模拟体的HC和LC可变区对应。该构建体(如载体p1351中提供的)中也可采用编码合适人类恒定区(即HC和LC区)的分离核酸。
随后使编码DNA的分离可变和恒定区和脱磷酸化载体与T4DNA连接酶连接。随后，转染大肠杆菌HB101或XL-1Blue细胞，并采用，例如限制酶分析法鉴定质粒pC4中含有上述插入片段的细菌。
采用缺乏活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于转染。采用转染试剂lipofectin，由0.5ug质粒pSV20-neo共转染5μg表达质粒pC4。质粒pSV2neo含有显性选择标记，和来源于Tn5的neo基因，该基因编码可使其对一组抗生素，包括G418具有抗性的酶。将该细胞接种进补充有1ug/ml G418的α负型MEM中。2天后，胰蛋白酶消化该细胞，并接种进杂交瘤克隆化平板(Greiner，Germany)中，该平板已加入了补充有10、25或50ng/ml氨甲蝶呤外加1ug/ml G418的α负型MEM。大约10-14天后，胰蛋白酶消化单个克隆，并随后接种进含有不同浓度氨甲蝶呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)的6孔培养皿或10ml摇瓶中。随后，将最高浓度氨甲蝶呤条件下生长的克隆转移至含有还要高浓度氨甲蝶呤(1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)的新6孔平板中。重复相同步骤直至获得可于100-200mM浓度条件下生长的克隆为止。分析预期基因产物的表达，例如，通过SDS-PAGE和蛋白质印迹，或通过反相HPLC分析。
实施例2：本发明CH1缺失模拟体的非限制性实例
背景：EMP-1(EPO模拟肽-1)是有20个氨基酸长的肽，与人类促红细胞生成素(HuEPO)不具有序列同源性，但其具有活化EPO受体的能力(作为二聚体)(Wrighton et al.，1996，Science，vol.273，458-463)。不过，其相对低的活性(比HuEPO低10,000-100,000倍)和短的半衰期(50％血清中的体外半衰期为8小时，体内半衰期未知)限制了其在治疗方面的效用。因此，需要一种可赋予该肽较长半衰期，不干扰其效价，并可能促进其效价的方法。为实现该目标，人们作出若干尝试，通过稳定该肽的二聚化，以提高EMP-1的活性，或通过将该肽整合进较大结构中，以延长其半衰期。Wrighten等人(1997，Nature Biotechnology，vol.15，1261-65)将生物素标记EMP-1与链霉抗生物素蛋白联合，从而使二聚化稳定。他们在体外细胞增殖实验中发现活性提高了100倍。他们也采用了抗生物素抗体，以稳定该肽二聚体，但发现活性仅提高了10倍。他们还制备了在化学上被定义为二聚体的EMPP-1。该情况中，所观测到的体内活性提高了100倍。另一研究小组试图通过使EMP-1与聚乙二醇(PEG)共价连接，以提高EMP-1的活性(Johnson et al.，1997，Chem.&Bio.，vol.4(12)，939-50)。他们报导的效价提高了高达1000倍，但发现该构建体在小鼠中具有免疫原性(该抗体针对该肽)(Dana Johnson，Personalcommunications)。Kuai等人(2000，J.Peptide Res.，vol.56，59-62)将EMP-1肽插入纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的序列中。发现EMP-1被插入该支架结构中后，既可稳定二聚化，也可延长半衰期。在体内实验中，该构建体的效价被发现比EMP-1本身高2500倍。应当指出的是，上述研究中采用了不同的体外实验与体内模型，且所报导效价彼此之间或与此处所介绍结果不可比较。
本发明的EMP-1CH1缺失模拟体
本发明的一个特定非限制性实例是EMP-NfusCG1构建体，其中V是天然存在抗体的最初三个氨基酸，Pep是具有生物活性的EMP-1肽的单拷贝，Flex是Gly-Gly-Gly-Ser柔性接头的串联重复，V2是天然存在IgG的J区，pHinge是完整IgG1铰链区，而CH2&CH3属于IgG1同种型亚类。该结构被认为将约束EMP-1肽，但也具有足够的柔性，可使作为该装配同型二聚体一部分的肽的二聚化稳定。体外细胞增殖实验中，EMP-NfusCG1的活性比EMP-1肽约高了550倍，且仅比重组HuEPO(rHuEPO)低4-6倍，从而证实了上述观点。另外，该构建体的半衰期被认为应是rHuEPO或EMP-1肽本身半衰期的许多倍，并与I gG的半衰期近似。与此一致，经由EMP-Nfus CG1处理的正常小鼠与经由rHuEPO处理的小鼠相比，前者获得了显著较高的最大血细胞比容，当等活性单位一定时，上升水平被维持了较长时间。该构建体被有效地从细胞中分泌，并似乎被适当折叠；克服了与第一代模拟体相关的难题。
除上述基础结构外，本文也描述了具有潜在有利生物学特征的变体。这些变体包括自联接倾向可能降低、免疫效应子功能减弱或免疫原性降低的构建体。本发明也展望了其它可赋予特定特征，诸如可改善具有生物活性的肽的构型，和可跨越血脑屏障的修饰。该建议变体和修饰可以任何方式组合，以获得具有特定活性的构建体。
利用重组DNA法，将EMP-1肽插入中间载体中，位于免疫球蛋白信号肽与人类J序列之间。该操作采用了互补合成寡核苷酸，其末端与该载体中的BstI 107I和KpnI限制位点相容
(5’TACAGGCCCAGATCCAGGGCGGTACCTACAGCTGCCACTTCGGGCCCCTCACGTGGGTGTGCAAGCCCCAGGGCGGCGGAAGCGGGGGAGGCTCCGGTAC3’(SEQ IDNO：43)和3’CGGAGCCTCCCCCGCTTCCGCCGCCCTGGGGCTTGCACACCCACGTGAGGGGCCCGAAGTGGCAGCTGTAGGTACCGCCCTGGATCTGGGCCTGTA5’)(SEQID NO：44)。这些寡核苷酸含有信号肽酶共有位点的编码序列、EMP-1肽和由两个Gly-Gly-Gly-Ser重复组成的柔性接头。含有上述功能元件的XbaI限制片段随后被转移进表达载体中。该载体含有抗CD4免疫球蛋白启动子和增强子、人类IgG1铰链区的编码序列、HC恒定区2(CH2)和恒定区3(CH3)，也含有对细菌内质粒复制和筛选，以及对哺乳动物细胞内稳定表达子的筛选而言所必需的元件。
该质粒被线型化，并通过电穿孔被导入NSO小鼠骨髓瘤细胞系中。筛选抗性细胞，并通过ELISA分析培养上清液，鉴定EMP-NfusCG1的高表达子。通过标准A蛋白亲和色谱从细胞培养上清液中纯化获得该构建体。在变性和还原条件下，使纯化产物通过含SDS的聚丙烯酰胺凝胶，以证实该纯化产物具有预期尺寸。通过质谱分析和N末端测序进一步鉴定该纯化蛋白。
EMP-NfusCG1的氨基酸序列如下所示。功能域为上述肽的编码序列。三个氨基酸信号肽共有序列与天然存在的免疫球蛋白的最初三个氨基酸对应。这些氨基酸被认为通过内质网中的信号肽酶从而促成了对信号肽的有效去除。EMP-1编码序列直接位于该序列后。EMP-l序列的2个C末端氨基酸与邻接的6个氨基酸结合，形成了特征为Gly-Gly-Gly-Ser重复的柔性接头。人类连接(J)区序列紧跟其后。J序列被认为可提供更大的柔性，使EMP-1二聚体呈现正确构型，并使该二聚体从免疫球蛋白的球形结构中突出，并深入至两个EPO受体之间的裂口中。该构建体也包括HC铰链区，J区直接位于其后。IgG1铰链区(被突出显示部分)中含有三个半胱氨酸。第一个半胱氨酸通常与免疫球蛋白轻链(LC)配对，另外两个半胱氨酸则参与了两个HC之间的链间键。该序列的剩余部分由CH2&CH3区组成，构成了该蛋白的填充部分。免疫球蛋白被认为具有长血清半衰期的原因之一是其与FcRn结合的能力，该FeRn可通过将胞饮免疫球蛋白恢复至胞外间隙，从而延长血清半衰期。FeRn的结合位点与CH2和CH3区的连接处重叠(Sheilds et al.，2O01，J.Bio.Chem.，vol.276(9)，6591-6604)。
BMP-NfusCG1的肽序列显示了重要的功能域。
    信号肽酶
    共有序列J区
    ～～～接头～～～～～～～～
             EMP-1肽～～～～～～huG1铰链
          ～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
1QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP
                                     IgG1CH2
61SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
                             IgG1CH2
        ～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～IgG1CH3
～～～～～～～～～～～～～～～～～
         TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD
                   IgG1CH3
        ～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
    181
         TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQ
         IgG1CH3
         ～～～～～～～～～～～～～～～
    241QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK                 (SEQ ID NO：50)
众所周知，两条IgG重链在细胞加工期间通过铰链区中两个半胱氨酸之间的二硫键而被装配在一起，形成了同型二聚体。人们认为该现象也可发生在修饰肽之间，从而形成装配的EMP-NfusCG1构建体。另外，人们认为EMP-1肽中的两个半胱氨酸之间也将形成链间二硫键。EMP-NfusCG1的预期结构含有两个EMP-1肽。该肽在N末端的空间排列，以及邻接序列的柔性使该肽形成了具有生物活性的二聚体。
首先在体外生物活性测定中检验EMP-NfusCG1的活性。对该测定而言，采用了急性成巨核细胞白血病患者来源的EPO依赖性UT-7/EPO细胞系(Komatsu et al.，1993，Blood，vol.82(2)，456-464)。从补充有rHuEPO的培养基中取出这些细胞48-72小时后，它们便开始经历程序性细胞死亡。已在rHuEPO缺乏条件下被培养24小时的细胞如果经过rHuEPO或EPO增效剂的处理，便可被挽救。将EMP-NfusCG1加入在无rHuEPO条件下饥饿的细胞中，并在采用四氮唑化合物MTS(CellTiter 96Aqueous One Solution，Promega)处理后48小时，测定细胞活力，其中该四氮唑化合物MTS可被活细胞代谢，并产生可测定吸光度的产物。典型实验的结果显示摩尔基础EMP-NfusCG1的效价比EMP-1肽高500倍，比rHuEPO低5倍。另外，采用EMP-NfusCG1刺激上述相同细胞，并通过使细胞裂解物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以目测酪氨酸磷酸化模式。EMP-NfusCG1所显示的模式与rHuEPO相似，说明EMP-NfusCG1作用于上述细胞的机制与rHuEPO相似。
在正常小鼠中进行体内研究，比较EMP-NfusCG1与rHuEPO二者的半衰期，并比较二者对红细胞生成的影响。初步研究表明对小鼠施用连续两天的剂量而非单剂量时，对rHuEPO的应答更为显著。在初步研究中也发现，当rHuEPO剂量为2000U/kg时，小鼠的血细胞比容在第4天升至最大值，第7天则跌至基线水平附近。为比较EMP-NfusCG1与rHuEPO二者的效果差异，以体外生物活性测定实验所测定活性为基础，归一化EMP-NfusCG1的剂量；由于该实验中EMP-NfusCG1的活性低于5倍，因而给予约5倍多量的EMP-NfusCG1。也考虑到了分子量上的差异(rHuEPO＝30,400道尔顿，EMP-NfusCG1＝62,200道尔顿)。当基于上述考虑，对小鼠施用相同剂量时，EMP-NfusCG1引发了较高的最大应答，且与rHuEPO相比，该应答被延长了。
通过ELISA测定rHuEPO和EMP-NfusCG1的血清浓度。在对低至2.5mU/ml的rHuEPO浓度灵敏的测定中，从第4天开始，在以1∶8稀释的样本中未发现正信号。该结果与rHuEPO在啮齿类动物中被预期的2-8小时半衰期一致。(PRI Export，Part IC2：T0xico-Pharmacologica1Documentation)。与之相比，第4天所检测到的EMP-NfusCG1水平高达1.5ug/mL，且该高水平保持至研究结束。图6中清除率分布图的线性异常。可能是由于第一个时间点在最后一次注射后3天，在取第一个样本之前便已达最大浓度(Cmax)，因此未观测到指数曲线的峰值。另一种解释是该新构建体的吸收和清除特征使其清除率分布图呈现线性。基于该数据，可计算其半衰期约为10.8天，为rHuEPO半衰期的若干倍。
除了EMP-NfusCG1外，本发明还制备了三个类似的构建体，三者在铰链CH2和CH3区的同种型，或在可使EMP-1肽具有柔性的元件数量方面存在差异。其中一个构建体被称为EMP-NfusCG4，除其铰链和恒定区属于G4亚型外，该构建体其余部分均与EMP-NfusCG1一致。特定地，将用于构建EMP-NfusCG1表达质粒的XbaI限制片段转移进特定载体中，该载体提供了抗CD4免疫球蛋白启动子和增强子、人类IgG4铰链区的编码序列、CH2和CH3，以及对细茵内质粒复制和筛选，和哺乳动物细胞内稳定表达子的筛选而言所必需的元件。该质粒的表达和纯化方式与EMP-NfusCG1相似。EMP-NfusCG4的编码序列如下所示。
                                                           HuG4铰链
                           与BMP-NfusCG1一致的序列～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
      ～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
l     QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVF
                                            IgG4CH2
      ～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
61LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOFNSTYR
                                                               IgG4CH3
                                                   IgG4CH2
      ～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
                ～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
12l   WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN
                        IgG4CH3
                ～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
      ～～
181QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGN
                  IgG4CH3
      ～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
24l   VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK                           SEQ ID NO：51
下文显示了CH1缺失模拟体若干实例之间的比较结果：
     QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSCDKTH-TCPPCP APELL
MG1---......................------------.....................
CG4......................................S.YGPP----..S.....F.
MG4---......................------------.S.YGPP----..S.....F.
muCG2a.......................................RGPTIKPCPPCK....N..
IgG1与IgG4亚型之间的重要差异在于铰链区中半胱氨酸的数量。与G1亚型类似，IgG4铰链中存在两个参与了重链之间二硫键的半胱氨酸。G4铰链中不含有通常涉及与LC的二硫键结合的半胱氨酸；该半胱氨酸位于上述构建体所缺乏的G4CH1区中。IgG4铰链区不如IgG1铰链柔韧，这可能影响EMP-NfusCG1二聚体的潜在构型(Dangl et al.，1997，EMBO Journal，vol 7(7)，1989-94)。另外，两个同种型在其介导补体依赖型细胞毒性(CDC)和抗体依赖型细胞的细胞毒性(ADCC)的能力方面存在差异。G1亚型是互补级联的强诱导物，而G4亚型几乎无活性(Dangl et al.，1997，EMBO Journal，vol 7(7)，1989-94)。另外，G1亚型与Fc受体以高亲和力结合，从而促成了细胞介导的细胞毒性，而G4亚型的结合力微弱(Allan &Seed，1989，Science，vol.423，378-80)。由于需要使目标细胞增殖，因此G4亚型在活化效应子功能方面的相对无效是理想的。FcRn清除剂受体的结合位点存在于IgG4上，并且由于其在结合方面似乎并不存在任何IgG亚类差异，因此其药物代谢动力学被认为与G1亚型相似(West etal.，2000，Biochem.，vol 39，9698-9708)。
与G1的情况一样，构建体EMP-NfusCG4被认为可借助于铰链区中的两个半胱氨酸从而形成同型二聚体。如上所述，G4铰链中不含第三个半胱氨酸，从而否定了两条链之间形成第三个二硫键的可能性。EMP-1二聚体的构型也可能由于铰链区的尺寸和柔性上的差异而不同。考虑到上述差异，EMP-NfusCG4的通用结构被认为与EMP-NfusCG4相似。
如前所述，在体外生物活性测定实验中检验EMP-NfusCG4。实验进行两次，结果相似。该测定中，EMP-NfusCG4的效价比EMP-NfusCG1低13倍，但平均差异约为10倍。由于EMP-NfusCG1的效价比rHuEPO低5倍，因此EMP-NfusCG4与rHuEPO之间的差异被认为应为大约50倍。该实验中的实际差异为60倍。该实验中EMP-NfusCG4与EMP-1之间的差异为40倍，但由于EMP-1的EC50数值比历史平均值低2倍，所以EMP-NfusCG4与EMP-1之间的实际差异可能更大。EMP-NfusCG4被观测到的活性较低，可归因为铰链区中的差异，该差异使EMP-1二聚体不能形成最佳构型。迄今仍未在体内检验过EMP-NfusCG4的活性。
另外两种构建体被设计用于研究活性所必需的功能域。因此，在EMP-1序列与铰链区之间忽略了人类J区和一个Gly-Gly-Gly-Ser重复。上述“完整”版本与这些最小版本之间的差异在于铰链区的同种型亚类(G1对比G4)、CH2和CH3区。
       信号肽酶
       共有序列J区
        ～～～接头～～～～～～～～
              EMP-1肽～～～～
            ～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
完整QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSS..HingeSEQ ID NO：52
最小QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGS..Hinge    SEQ ID NO：53
对被指定为EMP-NfusMG1和EMP-NfusMG4的最小版本而言，表达质粒的构建是通过将合成寡核苷酸插入中间载体而得以实现，其方法与构建针对EMP-NfusCG1和EMP-NfusCG4的表达质粒的方法相同(5’TACAGGCCCAGGGCGGTACCTACAGCTGCCACTTCGGGCCCCTCACGTGGGTGTGCAAGCCCCAGGGCGGCGGATCAGGTAAGTT3’(SEQ ID NO：45)和3’CTAGAACTTACCTGATCCGCCGCCCTGGGGCTTGCACACCCACGTGAGGGGGCCCGAAGTGGCAGCTGTAGGTACCGCCCTGGGCCTGTA5’)(SEQIDNO：46)。上述合成寡核苷酸含有信号肽酶共有位点的编码序列、EMP-1肽和单个Gly-Gly-Gly-Ser重复。不过，在该情况中，寡核苷酸的3’末端与XbaI限制位点相容，与被用于构建完整版本的寡核苷酸不同。通过克隆进位于中间载体J区下游的Xba I位点，忽略了J区的编码序列。最终表达质粒的构建是采用如针对EMP-NfusCG1和EMP-NfusCG4所描述的方法实现的。由于技术问题，迄今，仅EMP-NfusMG4已获得表达和纯化。EMP-NfusMG4的结构被认为具有EMP-1肽从该蛋白质球形结构形成的突出，该突出被认为不如EMP-NfusCG4情况中的突出显著，由于该原因，EMP-1肽二聚体可能不能深入至EPO受体之间的裂口中。另外，有助于EMP-1肽形成最佳二聚体构型的柔性可能被降低。该现象在Livnah等人的观测结果中尤为重要(1998，Nat.Strust.Biol.，vol.5，993-1004)。他们发现肽(EMP-33)可使两个EPO受体二聚化，但不能活化该受体。通过比较EMP-33/EPO受体复合体与EMP-1/EPO受体复合体二者的晶体结构，他们发现在二聚化受体取向上的微小差异使该肽在活化其受体能力上存在差异。因此，如果EMP-1二聚体不能形成最佳构型，它也可能不能使EPO受体二聚化，或者不能将受体带入活化构型中。
在UT7体外生物活性测定实验中检验EMP-NfusMG4构建体的活性。该实验结果如图12所示。该实验仅进行了一次，由于生物活性测定的易变性，因此其结果应被认为是初步结果。该实验中，EMP-NfusMG4的效价比rHuEPO低227倍，比EMP-1肽高44倍。但该实验中rHuEPO的EC50比历史平均值低3倍，所以EMP-NfusMG4与rHuEPO之间的差异可能显著地更低。该实验未在EMP-NfusCG4与EMP-NfusMG4之间进行直接对比。基于EMP-NfusCG4的平均EC50，即3.5×10-10，与该实验中所观测到EMP-NfusMG4的EC50之间的对比，可知差异为2倍。虽然上述结果是初步结果，但说明人类J序列和一个Gly-Gly-Gly-SeT重复的缺乏基本上不会降低EMP-NfusMG4构建体的效价。尚未知该观测结果是否可被延伸至EMP-NfusMG1构建体。
为避免不合需要的活性，目前已研究表达了存在单个或多个氨基酸变化的其它构建体。这些变化可被单独表达，或者以多种变化组合的形式存在于单个构建体中。通常参与HC与LC之间二硫键的半胱氨酸将被转变为丙氨酸。虽然该半胱氨酸可能通过形成第三个二硫键，从而涉及构建体的稳定化，但其也有可能与构建体中的其它半胱氨酸异常地形成二硫键，或者在两个构建体之间形成二硫键。通过移除该半胱氨酸，可加强正确的折叠和装配，并减小自连接的可能性。
已有研究表明，在IgG1较低铰链区中，从两个赖氨酸(L)残基，L234&L235到丙氨酸(A)的突变将消除免疫球蛋白介导补体依赖型细胞毒性(CDC)和抗体依赖型细胞的细胞毒性(ADCC)的能力(Hezerehetal.，2001，J.Virol.，vol.75(24)，12161-68)。初步研究显示EMP-NfusCG1不能介导可表达EPO受体的细胞的补体裂解。这可能是红细胞系祖细胞上被发现存在的受体数量低所致。另外，通过血细胞比容的显著提高所证实的红细胞系祖细胞的体内扩增说明免疫效应子功能可能不具有功能相关性。不过，虽然未观测到与效应子功能相关的影响，仍然可将上述突变介绍为应预防的步骤。
可导致免疫效应子功能的介导作用降低的另一种修饰是移除糖基化附着位点。该修饰可通过使297位上的天冬酰胺(N297)突变为谷氨酰胺(Q)而得以实现。其它变化可任选地包括将苏氨酸(T)取代为可选氨基酸，以减少或修饰O-糖基化作用，例如，已知具有IgG1亚类的糖基化版本的T34或T47是免疫效应子功能的弱中介体(Jefferis et al.，1998，Immol.Rev.，vol.163，50-76)。
Figure A0382011000911
以上为EMP-NfusCG1铰链和CH2编码序列中的建议突变。(SEQ ID NO：47)
目前正被研究的另一种修饰是将EMP-NfusCG1的IgG1CH2和CH3区取代为I gG4亚型的相同区域，同时保留G1铰链区。如前所述，IgG4亚类介导免疫效应子功能的能力远低于G1亚类。也如前所述，据推理，两个IgG亚类中铰链区柔性之间的差异可能是EMP-NfusCG1与EMP-NfusCG4之间存在活性差异的原因。因此该构建体可能保持了EMP-NfusCG1的活性，而未涉及潜在的免疫效应子功能。
其它被展望的修饰是可降低该构建体潜在免疫原性的修饰。免疫原性的一个重要决定因素是蛋白质来源的肽被MHC分子有效结合并呈递至T细胞，并激发以细胞为基础的免疫应答或有助于抗体应答的T细胞的能力。利用通用的针对MHC结合，并以网络为基础的算法(SYFPETHI，Ramensee et al.，1999，Immunogenetics，vol.50，213-19和BIMAS)，分析EMP-NfusCG1中含EMP-1的N末端区域内的潜在MHC结合表位。可降低一种或多种肽的预测免疫原性的突变可被评价为对免疫原性的体内影响。
(SEQ ID NO：48)：被预测与MHC I类分子结合的肽
QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSCDKTHTC
PPC
 IQGGTYSCHF
   GTYSCHFGPL
    TYSCHFGPL
     YSCHFGPLTW
       CHFGPLTWV
                       GSGGGSGTL
                        SGGGSGTLV
                         GGGSGTLVTV
                          GGSGTLVTV
                              TLVTVSSEPK
                               LVTVSSEPK
                                   SSEPKSCDKT
                                   SSEPKSCDK被预测与MHC II类分子结合的肽(SEQ ID NO：49)
QIQGGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSCDKTHTC
PPC
          FGPLTWVCKPQGGGS
             LTWVCKPQGGGSGGG
                            SGTLVTVSSEPKSCD
       SCHFGPLTWVCKPQG
                         GGGSGTLVTVSSEPK
                             GTLVTVSSEPKSCDK
                                VTVSSEPKS
其它序列的非限制性实例包括：
无QIQ：
(SEQ ID NO：62)
GGTYSCHPGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSCDKTHTCPPCPAPELL
EMP1中两个半胱氨酸的突变：
(SEQ ID NO：63)
(QVQ)GGTYSSHFGPLTWVSKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHTCPPCPAPEAA
Leu56和Leu57的突变：
(SEQ ID NO：64)
(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHTCPPCPAPEAA
(SEQ ID NO：65)
(QVQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHTCPPCPAPEAA
(SEQ ID NO：66)
(QVQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHTCPPCPAPELA
(SEQ ID NO：67)
(QVQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHTCPPCPAPEAL
(SEQID NO：68)
(QVQ)GGTYSCHPGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHTCPPCPAPELE
具有IgG1铰链区的IgG4：
(SEQ ID NO：69)
(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSSDKTHTCPPCPAPEFL
具有不同接头长度的G1-G4IgG4：
(SEQ ID NO：70)
(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPSCPAPEFL
(SEQ ID NO：71)
(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPSCPAPEFL
(SEQ ID NO：72)
(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGGGTLVTVSSESKYGPPCPSCPAPEFL
(SEQ ID NO：73)
(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGGGSGTLVTVSSESKYGPPCPSCPAPEFL
具有截短铰链区的IgG1：
(SEQ ID NO：74)
(QVQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSCPPCPAPELL
(SEQ ID NO：75)
(QVQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSTHTCPPCPAPELL
(SEQ ID NO：76)
(QVQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSAKDTHTCPPCPAPELL
O-糖基化位点被敲除的IgG1：
(SEQ ID NO：77)
(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKTHACPPCPAPELL
(SEQ ID NO：78)
(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVAVSSEPKSADKTHTCPPCPAPELL
(SEQ ID NO：79)
(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVTVSSEPKSADKAHTCPPCPAPELL
(SEQ ID NO：80)
(QIQ)GGTYSCHFGPLTWVCKPQGGGSGGGSGTLVAVSSEPKSADKTHACPPCPAPELL
优势：新构建体，即上述EMP-NfusCG1提供了一条展示具有生物活性的肽EMP-1的可选途径。该构建体的活性在rHuEPO的范围内，且其体内半衰期与IgG的半衰期近似。另外，建议修饰被认为可组合在一起，并外加EMP-NfusCG1的新特征，从而增强EMP-NfusCG1构建体的效用。
应当清楚的是，可采用与上述说明和实例中具体描述方法不同的其它方法实践本发明。
根据上述内容，本发明的许多改进和变化均是可能的，因而也在本发明的范畴内。
序列表
<110>Heaver，George A.；Knight，David M.；Ghrayeb，John；Scallon，Bernard J.；Nesspor，Thomas C.；Centocor，Inc.
<120>哺乳动物EPO模拟CH1缺失模拟体、组合物、方法及用途
<130>CEN0311
<140>10/609,783
<141>2003-06-30
<150>60/412,144
<151>2002/09/12
<160>80
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>综合特征
<222>(2)..(2)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(4)..(5)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(11)..(11)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(13)..(13)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>1
 Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro
 1               5                   10
<210>2
<211>28
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>综合特征
<222>(2)..(2)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(4)..(5)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(11)..(11)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(13)..(13)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(16)..(16)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(18)..(19)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(22)..(22)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(25)..(25)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>2
 Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro Tyr Xaa
 1               5                   10                  15
 Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro
             20                  25
<210>3
<211>28
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>综合特征
<222>(2)..(2)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(4)..(5)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(11)..(11)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(13)..(13)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(16)..(16)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(18)..(19)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(22)..(22)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(25)..(25)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>3
Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro Tyr Xaa
1               5                   10                  15
Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro
            20                  25
<210>4
<211>28
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>综合特征
<222>(2)..(2)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(4)..(5)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(11)..(11)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(13)..(13)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(16)..(16)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(18)..(19)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(22)..(22)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(25)..(25)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(27)..(27)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>4
Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro Tyr Xaa
1               5                   10                  15
Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Pro
            20                  25
<210>5
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>5
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
 Pro Gln Gly Gly
             20
<210>6
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>6
Gly Gly Asp Tyr His Cys Arg Met Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
Pro Leu Gly Gly
            20
<210>7
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>7
Gly Gly Val Tyr Ala Cys Arg Met Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Ser
1               5                   10                  15
Pro Leu Gly Gly
            20
<210>8
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>8
Val Gly Asn Tyr Met Cys His Phe Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Arg
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly Gly
            20
<210>9
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>9
Gly Gly Leu Tyr Leu Cys Arg Phe Gly Pro Val Thr Trp Asp Cys Gly
1               5                   10                  15
Tyr Lys Gly Gly
            20
<210>10
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>10
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gln Gly Gly
            20
<210>11
<211>40
<212>PRT
<213>人
<400>l1
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gln Gly Gly Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr
            20                  25                  30
 Trp Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly
         35                  40
<210>12
<211>23
<212>PRT
<213>人
<400>12
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gln Gly Gly Ser Ser Lys
            20
<210>13
<211>23
<212>PRT
<213>人
<400>13
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gln Gly Gly Ser Ser Lys
            20
<210>14
<211>23
<212>PRT
<213>人
<400>14
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
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Pro Gln Gly Gly Ser Ser Lys
            20
<210>15
<211>46
<212>PRT
<213>人
<400>15
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gln Gly Gly Ser Ser Lys Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly
            20                  25                  30
Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Ser Ser Lys
        35                  40                  45
<210>16
<211>23
<212>PRT
<213>人
<400>16
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gln Gly Gly Ser Ser Lys
            20
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>综合特征
<222>(2)..(3)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(6)..(6)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(9)..(9)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>17
Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys
1               5                   10
<210>18
<211>19
<212>PRT
<213>人
<400>18
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys Pro
1               5                   10                  15
Gln Gly Gly
<210>19
<211>19
<212>PRT
<213>人
<400>19
Val Gly Asn Tyr Met Ala His Met Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Arg
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly
<210>20
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>20
Gly Gly Pro His His Val Tyr Ala Cys Arg Met Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Ile Cys
<210>21
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>21
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gln
<210>22
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>22
Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Trp Val Cys Gln
1               5                   10                  15
Pro Leu Arg Gly
            20
<210>23
<211>22
<212>PRT
<213>人
<400>23
Thr Ile Ala Gln Tyr Ile Cys Tyr Met Gly Pro Glu Thr Trp Glu Cys
1               5                   10                  15
Arg Pro Ser Pro Lys Ala
        20
<210>24
<211>13
<212>PRT
<213>人
<400>24
Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10
<210>25
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>25
Tyr Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys
1               5                   10
<210>26
<211>10
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(3)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(6)..(6)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(9)..(10)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>26
Xaa Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Xaa
1               5                 10
<210>27
<211>12
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>综合特征
<222>(2)..(5)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(8)..(8)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(11)..(12)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>27
Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Xaa
1               5                   10
<210>28
<211>14
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(3)..(6)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(9)..(14)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>28
Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10
<210>29
<211>16
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>综合特征
<222>(1)..(1)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(3)..(3)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(5)..(6)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(9)..(9)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(12)..(12)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(14)..(16)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>29
Xaa Tyr Xaa Cys Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Cys Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
<210>30
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>30
Gly Gly Leu Tyr Leu Cys Arg Phe Gly Pro Val Thr Trp Asp Cys Gly
1               5                   10                  15
Tyr Lys Gly Gly
            20
<210>31
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>31
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gln Gly Gly
            20
<210>32
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>32
Gly Gly Asp Tyr His Cys Arg Met Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
Pro Leu Gly Gly
            20
<210>33
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>33
Val Gly Asn Tyr Met Cys His Phe Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Arg
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly Gly
            20
<210>34
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>34
Gly Gly Val Tyr Ala Cys Arg Met Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Ser
1               5                   10                  15
Pro Leu Gly Gly
            20
<210>35
<211>19
<212>PRT
<213>人
<400>35
Val Gly Asn Tyr Met Ala His Met Gly Pro Ile Thr Trp Val Cys Arg
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly
<210>36
<211>18
<212>PRT
<213>人
<400>36
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gln
<210>37
<211>21
<212>PRT
<213>人
<400>37
Gly Gly Leu Tyr Ala Cys His Met Gly Pro Met Thr Ala Ile Val Cys
1               5                   10                  15
Gln Pro Leu Arg Gly
            20
<210>38
<211>22
<212>PRT
<213>人
<400>38
Thr Ile Ala Gln Tyr Ile Cys Tyr Met Gly Pro Glu Thr Trp Glu Cys
1               5                   10                  15
Arg Pro Ser Pro Lys Ala
            20
<210>39
<211>13
<212>PRT
<213>人
<400>39
Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10
<210>40
<211>11
<212>PRT
<213>人
<400>40
Tyr Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys
1               5                   10
<210>41
<211>12
<212>PRT
<213>人
<400>41
Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10
<210>42
<211>13
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>肽
<220>
<221>综合特征
<222>(2)..(2)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(4)..(6)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(9)..(9)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<220>
<221>综合特征
<222>(12)..(13)
<223>Xaa可以是任意天然存在的氨基酸
<400>42
Ala Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Gly Pro Xaa Thr Trp Xaa Xaa
1               5                   10
<210>43
<211>100
<212>DNA
<213>人
<400>43
tacaggccca gatccagggc ggtacctaca gctgccactt cgggcccctc acgtgggtgt    60
gcaagcccca gggcggcgga agcgggggag gctccggtac                          100
<210>44
<211>96
<212>DNA
<213>人
<400>44
cggagcctcc cccgcttccg ccgccctggg gcttgcacac ccacgtgagg ggcccgaagt    60
ggcagctgta ggtaccgccc tggatctggg cctgta                              96
<210>45
<211>85
<212>DNA
<213>人
<400>45
tacaggccca gggcggtacc tacagctgcc acttcgggcc cctcacgtgg gtgtgcaagc    60
cccagggcgg cggatcaggt aagtt                                          85
<210>46
<211>89
<212>DNA
<213>人
<400>46
ctagaactta cctgatccgc egccctgggg cttgcacacc cacgtgaggg gcccgaagtg    60
gcagctgtag gtaccgccct gggcctgta                                      89
<210>47
<211>35
<212>PRT
<213>人
<400>47
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1               5                   10                  15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
            20                  25                  30
Arg Val Val
        35
<210>48
<211>51
<212>PRT
<213>人
<400>48
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Gys
    50
<210>49
<211>51
<212>PRT
<213>人
<400>49
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys
    50
<210>50
<211>269
<212>PRT
<213>人
<400>50
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                 25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
    50                  55                  60
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
65                  70                  75                  80
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
                85                  90                  95
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
            100                 105                 110
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
        115                 120                 125
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
    130                 135                 140
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
145                 150                 155                 160
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
                165                 170                 175
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
            180                 185                 190
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
        195                 200                 205
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
    210                 215                 220
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
225                 230                 235                 240
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
                245                 250                 255
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            260                 265
<210>51
<211>266
<212>PRT
<213>人
<400>51
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys
        35                  40                  45
Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
    50                  55                  60
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
65                  70                  75                  80
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
                85                  90                  95
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
            100                 105                 110
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
        115                 120                 125
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
    130                 135                 140
Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
145                 150                 155                 160
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu
                165                 170                 175
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
            180                 185                 190
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
        195                 200                 205
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
    210                 215                 220
Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn
225                 230                 235                 240
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
                245                 250                 255
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
            260                 265
<210>52
<211>37
<212>PRT
<213>人
<400>52
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser
        35
<210>53
<211>25
<212>PRT
<213>人
<400>53
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser
            20                  25
<210>54
<211>102
<212>PRT
<213>人
<400>54
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
1               5                   10                  15
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
            20                  25                  30
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        35                  40                  45
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    50                  55                  60
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
65                  70                  75                  80
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
                85                  90                  95
Thr Ile Ser Lys Ala Lys
            100
<210>55
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>55
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
l               5                   10                  15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
        35                  40                  45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
    50                  55                  60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65                  70                  75                  80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
                85                  90                  95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            100                 105
<210>56
<211>20
<212>PRT
<213>人
<400>56
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1               5                   10                  15
Leu Gly Gly Pro
            20
<210>57
<211>102
<212>PRT
<213>人
<400>57
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
1               5                   10                  15
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
            20                  25                  30
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        35                  40                  45
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    50                  55                  60
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
65                  70                  75                  80
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
                85                  90                  95
Thr Ile Ser Lys Ala Lys
            100
<210>58
<211>107
<212>PRT
<213>人
<400>58
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
1               5                   10                  15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
        35                  40                  45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
    50                  55                  60
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
65                  70                  75                  80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
                85                  90                  95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
            100                 105
<210>59
<2ll>102
<212>PRT
<213>人
<400>59
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
1               5                   10                  15
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp
            20                  25                  30
Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
        35                  40                  45
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
    50                  55                  60
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
65                  70                  75                  80
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
                85                  90                  95
Thr Ile Ser Lys Ala Lys
            100
<210>60
<2ll>107
<212>PRT
<213>人
<400>60
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
1               5                   10                  15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
        35                  40                  45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
    50                  55                  60
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
65                  70                  75                  80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
                85                  90                  95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
            100                 105
<210>61
<211>4
<212>PRT
<213>人
<400>61
Gly Gly Gly Ser
1
<210>62
<211>54
<212>PRT
<213>人
<400>62
Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp Val Cys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val
            20                  25                  30
Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
        35                  40                  45
Pro Ala Pro Glu Leu Leu
    50
<210>63
<211>57
<212>PRT
<213>人
<400>63
Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Ser His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Ser Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
    50                  55
<210>64
<211>57
<212>PRT
<213>人
<400>64
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
    50                  55
<210>65
<211>57
<212>PRT
<213>人
<400>65
Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala
    50                  55
<210>66
<211>57
<212>PRT
<213>人
<400>66
Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Ala
    50                  55
<210>67
<211>57
<212>PRT
<213>人
<400>67
Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Leu
    50                  55
<210>68
<211>57
<212>PRT
<213>人
<400>68
Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Glu
    50                  55
<210>69
<211>57
<212>PRT
<213>人
<400>69
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
    50                  55
<210>70
<211>50
<212>PRT
<213>人
<400>70
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
            20                  25                  30
Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu
        35                  40                  45
Phe Leu
    50
<210>71
<211>54
<212>PRT
<2l3>人
<400>71
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys
        35                  40                  45
Pro Ala Pro Glu Phe Leu
    50
<210>72
<211>56
<212>PRT
<213>人
<400>72
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
        35                  40                  45
Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
    50                  55
<210>73
<211>58
<212>PRT
<213>人
<400>73
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
            20                  25                  30
Ser Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
        35                  40                  45
Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
    50                  55
<210>74
<211>47
<212>PRT
<213>人
<400>74
Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
        35                  40                  45
<210>75
<211>50
<212>PRT
<213>人
<400>75
Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
        35                  40                  45
Leu Leu
     50
<210>76
<211>53
<212>PRT
<213>人
<400>76
Gln Val Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
        35                  40                  45
Ala Pro Glu Leu Leu
    50
<210>77
<211>57
<212>PRT
<213>人
<400>77
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Ala Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
    50                  55
<210>78
<211>57
<212>PRT
<213>人
<400>78
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Ala Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
    50                  55
<210>79
<211>57
<212>PRT
<213>人
<400>79
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Ala His Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
    50                  55
<210>80
<211>57
<212>PRT
<213>人
<400>80
Gln Ile Gln Gly Gly Thr Tyr Ser Cys His Phe Gly Pro Leu Thr Trp
1               5                   10                  15
Val Cys Lys Pro Gln Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Val Ala Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Ala Asp Lys Thr His Ala Cys
        35                  40                  45
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
    50                  55
1
40

Claims (35)

1.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体核酸，包含编码SEQ ID NO：50-51中至少一种氨基酸序列的至少一种多核苷酸，或与其互补的多核苷酸。
2.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体核酸，包含编码SEQ ID NO：62-80中至少一种氨基酸序列的至少一种多核苷酸，或与其互补的多核苷酸。
3.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体核酸，包含编码式(I)的多肽的至少一种多核苷酸：
(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1为免疫球蛋白可变区N末端的至少一个部分，Pep为至少一个具有生物活性的EPO模拟肽，Flex为通过使模拟体具有可选的取向和结合特性，从而提供结构柔性的多肽，V2为免疫球蛋白可变区C末端的至少一个部分，pHinge为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n和m可以是1-10中的整数。
4.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，包含SEQ ID NO：50-51中的所有连续氨基酸。
5.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，包含SEQ ID NO：62-80中的所有连续氨基酸。
6.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽：
(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1为QIQ，Pep为选自SEQ ID NOS：1-42中的至少一个具有生物活性的肽，Flex包括GGGS(SEQ ID NO：61)，V2为GTLVTVSS(SEQ ID NO：52)，pHinge为EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：53)，CH2为SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO：54)，CH3为GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：55)，n和m为1-10中的整数。
7.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽：
(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1为QIQ，Pep为选自SEQ ID NOS：1-42中的至少一个具有生物活性的肽，Flex包括GGGS，V2为GTLVTVSS(SEQ ID NO：52)，pHinge为ESKYGPPCPSCPAPEFLGGP(SEQ ID NO：56)，CH2为SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO：57)，CH3为GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO：58)，n和m为1-10中的整数。
8.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽：
(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1为人类可变区的N末端部分，Pep为选自SEQ ID NOS：1-42中的至少一个具有生物活性的肽，Flex为通过使模拟体具有可选的取向和结合特性，从而提供结构柔性的多肽，V2为免疫球蛋白可变区C末端的至少一个部分，pHinge为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(SEQ ID NO：54)，CH3为GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：55)，n和m为1-10中的整数。
9.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽：
(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1为人类可变区的N末端部分，Pep为选自SEQ ID NOS：1-42中的至少一个具有生物活性的肽，Flex为通过使模拟体具有可选的取向和结合特性，从而提供结构柔性的多肽，V2为免疫球蛋白可变区C末端的至少一个部分，pHinge为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK(SEQ ID NO：59)，CH3为GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO：60)，n和m为1-10中的整数。
10.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽：
(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1为QIQ，P8p为选自SEQ ID NOS：1-42中的至少一个具有生物活性的肽，Flex为通过使模拟体具有可选的取向和结合特性，从而提供结构柔性的多肽，V2为免疫球蛋白可变区C末端的至少一个部分，pHinge为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n和m为1-10中的整数。
11.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽：
(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1为免疫球蛋白可变区N末端的至少一个部分，Pep为至少一个具有生物活性的EPO模拟肽，Flex包括GGGS(SEQ ID NO：61)，V2为免疫球蛋白可变区C末端的至少一个部分，pHinge为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n和m为1-10中的整数。
12.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽：
(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1为免疫球蛋白可变区N末端的至少一个部分，Pep为至少一个具有生物活性的EPO模拟肽，Flex为通过使模拟体具有可选的取向和结合特性，从而提供结构柔性的多肽，V2为GTLVTVSS(SEQ ID NO：52)，pHinge为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n和m可为1-10中的整数。
13.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽：
(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V 1为免疫球蛋白可变区N末端的至少一个部分，Pep为至少一个具有生物活性的EPO模拟肽，Flex为通过使模拟体具有可选的取向和结合特性，从而提供结构柔性的多肽，V2为免疫球蛋白可变区C末端的至少一个部分，pHinge为EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGP(SEQ ID NO：53)，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n和m可为1-10中的整数。
14.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽：
(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1为免疫球蛋白可变区N末端的至少一个部分，Pep为选自SEQ IDNOS：1-20的至少一个具有生物活性的肽，Flex为通过使模拟体具有可选的取向和结合特性，从而提供结构柔性的多肽，V2为免疫球蛋白可变区C末端的至少一个部分，pHinge为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n和m可为1-10中的整数。
15.至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，包括式(I)的多肽：
(V1(n)-Pep(n)-Flex(n)-V2(n)-pHinge(n)-CH2(n)-CH3(n))(m)，其中V1为免疫球蛋白可变区N末端的至少一个部分，Pep为选自SEQ IDNOS：21-42中的至少一个具有生物活性的肽，Flex为通过使模拟体具有可选的取向和结合特性，从而提供结构柔性的多肽，V2为免疫球蛋白可变区C末端的至少一个部分，pHinge为免疫球蛋白可变铰链区的至少一个部分，CH2为免疫球蛋白CH2恒定区的至少一个部分，CH3为免疫球蛋白CH3恒定区的至少一个部分，n和m可为1-10中的整数。
16.权利要求1-15任一项中的EPO模拟CH1缺失模拟体核酸或EPO模拟CH1缺失模拟体多肽，其中该多肽具有至少一种Pep多肽的至少一种活性。
17.一种抗独特型单克隆或多克隆抗体，融合蛋白，或其片段，可与权利要求1-15任一项中的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽特异性结合。
18.编码权利要求1-17任一项中的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽或EPO模拟CH1缺失模拟体抗体的EPO模拟CH1缺失模拟体核酸。
19.包含权利要求18的至少一种分离核酸的EPO模拟CH1缺失模拟体载体。
20.包含权利要求18的分离核酸的EPO模拟CH1缺失模拟体宿主细胞。
21.权利要求20的EPO模拟CH1缺失模拟体宿主细胞，其中该宿主细胞为选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、NSO、DG44CHO、CHO K1、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤细胞，或上述细胞的任意衍生、无限增殖化或转化细胞中的至少一种细胞。
22.一种生成至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽或EPO模拟CH1缺失模拟体抗体的方法，包括在体外、体内或原位条件下，翻译权利要求18的核酸，使EPO模拟CH1缺失模拟体或抗体以可检测或可回收的数量被表达。
23.一种组合物，包含至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体核酸、EPO模拟CH1缺失模拟体多肤，或权利要求1-17任一项中的EPO模拟CH1缺失模拟体抗体。
24.权利要求23的组合物，其中该组合物进一步包含至少一种药物学可接受的载体或稀释剂。
25.权利要求23的组合物，进一步包括至少一种组合物，该组合物含有治疗有效量的至少一种化合物、组合物或多肽，该化合物、组合物或多肽选自可检测标记或报道分子、TNF拮抗剂、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于平衡体液或电解液的药物、血液药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼、耳或鼻用药、局部用药、营养药、细胞因子或细胞因子拮抗剂中的至少一种。
26.权利要求23的组合物，其形式为选自液体、气体或干燥物、溶液、混合物、悬液、乳浊液或胶体、冻干制剂或粉末中的至少一种。
27.一种诊断或治疗细胞、组织、器官或动物中的EPO配体相关状况的方法，包括
(a)使细胞、组织、器官或动物接触或对其施用一种组合物，该组合物含有有效量的权利要求1-17任一项中的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体核酸、多肽或抗体。
28.权利要求27的方法，其中所述有效量为每公斤上述细胞、组织、器官或动物施用0.001-50mg的EPO模拟CH1缺失模拟体抗体；0.000001-500mg的上述EPO模拟CH1缺失模拟体；或0.0001-100μg的上述EPO模拟CH1缺失模拟体核酸。
29.权利要求27的方法，其中上述接触或施用是通过选自肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病变内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮途径中的至少一种模式实现的。
30.权利要求27的方法，进一步包括在上述(a)接触或施用之前、同时或之后，施用至少一种组合物，该组合物含有治疗有效量的至少一种化合物或多肽，该化合物或多肽选自可检测标记或受体、TNF拮抗剂、抗感染药物、心血管(CV)系统药物、中枢神经系统(CNS)药物、自主神经系统(ANS)药物、呼吸道药物、胃肠(GI)道药物、激素药物、用于平衡体液或电解液的药物、血液药物、抗肿瘤药物、免疫调节药物、眼、耳或鼻用药、局部用药、营养药、细胞因子或细胞因子拮抗剂中的至少一种。
31.一种装置，含有权利要求1-17任一项中的至少一种分离的EPO模拟CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸，其中该装置适用于通过选自肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病变内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮途径中的至少一种模式，接触或施用上述至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸。
32.一种用于人类药物或诊断用途的制品，包括包装材料和容器，该容器含有权利要求1-17任一项中的至少一种分离的EPO模拟CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸。
33.权利要求34的制品，其中上述容器为肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病变内、药团、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮送递装置或系统的一个组成部分。
34.一种用于生成权利要求1-17任一项中的至少一种分离的EPO模拟CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸的方法，该方法包括提供至少一种能够以可检测或可回收的量表达上述多肽、抗体或核酸的宿主细胞、转基因动物、转基因植物、植物细胞。
35.由权利要求34的方法所生成的至少一种EPO模拟CH1缺失模拟体多肽、抗体或核酸。
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