CN1726281B - 在原核宿主中生产il-21 - Google Patents

Abstract

本专利描述了用大肠杆菌表达系统大规模生产IL-21的表达载体和方法。载体使用了IL-21编码序列，其中的核苷酸有特异的改变，目的是为在大肠杆菌中翻译而优化密码子和mRNA二级结构。使用表达载体，在补料批量发酵中大肠杆菌表达IL-21的基因(应该是蛋白)，表达水平大于1克每升。本发明还包括转化了IL-21表达载体的OmpT缺陷大肠杆菌菌株。

Description

在原核宿主中生产IL-21

发明背景

从人类和其他生物的基因组中可以鉴定并且获得更多的基因，增加了对于有效表达和纯化重组蛋白质的需要。到目前为止在细菌中进行蛋白质的表达是最为广泛使用的生产克隆基因蛋白质的途径。由于许多原因，人们优先选择原核而不是真核细胞进行表达。例如，培养细菌要比培养真核细胞容易得多。更特别的是，由于现在已经有大量复杂精妙的分子遗传学工具以及上千的突变体，使得大肠杆菌已经成为蛋白质生产中极为有用的表达宿主。但是在大肠杆菌中大量生产有功能的蛋白质，特别是那些真核来源的蛋白质，常常是很困难的。

IL-21(以前被命名为Zalphal 1配基)是IL-2细胞因子家族的一个成员，该家族还包括IL-4，IL-7，IL-9，IL13，和IL-15。已经证明该家族的蛋白质具有抗癌和抗病毒的作用。IL-21由辅助T细胞产生，辅助T细胞是关键的免疫调节者。根据IL-21相应受体的表达模式以及使用IL-21给药，已经证明IL-21激活CD8⁺杀伤T细胞以及天然杀伤(NK)细胞，它们是两种清除肿瘤和受病毒感染细胞的淋巴细胞。IL-21还促进B细胞种类的选择(Parrish et al.，Nature 408：57-63，2000)。

已经在原核细胞中，特别是大肠杆菌中表达产生了重组的IL-21。由细菌产生的蛋白质没有被糖基化，并且是以聚集状态产生的。从大肠杆菌中制备IL-21要求将聚集状态的蛋白质被从不溶性的包含体中溶解出来，并且复性或者重折叠。如果没有复性，则重组蛋白的特异活性会显著降低。

尽管在细菌宿主中表达重组蛋白质取得了进展，仍然需要有改进的方法用来在原核系统中生产具有生物活性、纯化的IL-21蛋白质，因为用原核系统生产蛋白质，产量要高得多。在参阅了下面的详述之后，就会对本发明的这些方面以及其他方面有清晰明显的认识。此外下面还有许多不同的参考文献，这里以它们的整体引用作为参考。

发明概述

一方面，本发明提供用于制备IL-21的表达载体，它包含操作性连接的以下元件：原核复制起点、转录起始DNA元件、如SEQ ID NO：27所示的多聚核苷酸序列以及转录终止子。另一方面，表达载体是载体pTAP337。其他实施方案提供的表达载体可以包含选择性标记。

另一方面，本发明提供转化了表达载体——包含SEQ ID NO：27、编码SEQ ID NO：28所示多肽的多聚核苷酸序列，或者转化了pTAP337载体的原核宿主细胞。在一个实施方案中，宿主菌株是大肠杆菌W3110菌株或者zGOLDI菌株，它们被保藏于位于弗吉尼亚州Manassas的美国典型培养物保藏中心。

另一方面，本发明提供了在IL-21蛋白被表达的条件下制备IL-21蛋白的方法。在一个实施方案中，此方法包含培养转化了pTAP337后表达IL-21的宿主细胞。在另一个实施方案中，此方法包含对转化了包含SEQ ID NO：27所示序列的表达载体的宿主细胞进行培养。该方法还包含从生长培养基中回收宿主细胞，然后从宿主细胞中分离出IL-21蛋白。

在其他方面，本发明提供了在补料批量发酵过程中或者批量发酵过程中制备IL-21的方法，这些方法包含了以上所述的步骤。

另一方面，本发明提供了制备IL-21的方法，这些方法包含一下的步骤：在摇瓶中用生长培养基培养上述宿主细胞至OD600达到5到20；用含有宿主细胞的摇瓶培养物以比例1-12％(v/v)接种发酵容器；在pH6.2-7.2的生长培养基中培养宿主细胞，在流逝发酵时间(EFT)15小时之前将补料溶液添加到发酵容器内；在20-30小时EFT时向发酵容器内加入诱导剂；在48-56小时EFT时收获宿主细胞。在一个实施方案中，诱导剂是0.5到2mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。在另一个实施方案中，补料溶液包含选自甘油和葡萄糖的糖，且补料的添加速度是每小时5到15克糖。在另一个实施方案中，补料溶液中的甘油含量是40-70％(v/v)的甘油，或者葡萄糖是40-70％(w/v)的葡萄糖。在另一些实施方案中，甘油含量大约是70％(v/v)，或者葡萄糖含量是60％(w/v)。

一方面，本发明提供了制备IL-21的方法，该方法包含以下步骤：在烧瓶内接种接种物，其包含表达SEQ ID NO：28所示IL-21多肽的大肠杆菌W3110宿主细胞，或者包含其中有IL-21表达的含有pTAP337载体的大肠杆菌W3110宿主细胞；生长培养基包含大约5克/升的甘油；接种物在大约30摄氏度在生长培养基内培养16-20小时，将培养好的生长培养基中的接种物转移至批量发酵罐内，浓度为0.5-5％接种物，在大约37摄氏度和pH大约6.8进行发酵，含大约2％的甘油；在大约8小时EFT时引入葡萄糖补料，速度为9.5克葡萄糖/升/小时，且一直补充到一轮发酵过程运行结束；在大约24小时EFT时加入IPTG至终浓度为0.5-2mM，发酵大约28小时的IPTG；从发酵罐中收获发酵液，加入等体积的水，匀浆，离心收集包含IL-21蛋白物质的细胞沉淀或者细胞浆。

另一方面，本发明提供了一种分离包含SEQ ID NO：28所示氨基酸残基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，该方法包括以下步骤：从细胞沉淀或者细胞浆中分离出不溶于水的IL-21蛋白，将不溶的IL-21物质溶解于一种离液序列高的溶剂；稀释该离液序列高的溶剂并使IL-21蛋白重折叠；并分离IL-21蛋白，其中分离出的IL-21蛋白能具有生物活性。在本发明的一个实施方案中，分离出的IL-21蛋白的纯度至少为90％。在另一个实施方案中，分离出的IL-21蛋白的纯度至少为90％，且内毒素水平为每毫克IL-21蛋白中的内毒素小于10个内毒素单位。

另一方面，本发明提供了一种分离包含SEQ ID NO：28所示氨基酸残基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，该方法包括以下步骤：从发酵液中分离出含有不溶性IL-21物质的细胞沉淀或者细胞浆；匀浆细胞沉淀或者细胞浆收集包含体；将不溶的IL-21物质溶解于包含胍盐的离液序列高的溶剂；通过加入包含精氨酸盐以及还原性和氧化性组分混合物的重折叠缓冲液稀释该离液序列高的溶剂；由过滤去除未折叠的以及聚集的蛋白，分离IL-21蛋白；并用阳离子交换柱纯化重折叠的IL-21蛋白，其中分离出的和纯化的IL-21能具有生物活性。

另一方面，本发明提供了一种分离包含SEQ ID NO：28所示氨基酸残基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，该方法包含以下步骤：从发酵液中分离出含有不溶性IL-21物质的细胞沉淀或者细胞浆；匀浆细胞沉淀或者细胞浆收集包含体；将不溶的IL-21蛋白质物质溶解于包含胍盐的离液序列高的溶剂；通过加入包含精氨酸盐以及还原性和氧化性组分混合物的复性缓冲液稀释该离液序列高的溶剂；由过滤去除未折叠的以及聚集的蛋白，分离IL-21蛋白；用阳离子交换柱纯化重折叠的IL-21蛋白；在疏水相互作用柱上纯化IL-21洗脱液，其中分离出的和纯化的IL-21能具有生物活性。

另一方面，本发明提供了一种分离包含SEQ ID NO：28所示氨基酸残基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，该方法包括以下步骤：从发酵液中分离出含有不溶性IL-21物质的细胞沉淀或者细胞浆；将不溶的IL-21蛋白质物质溶解于包含大约6M盐酸胍、40mM二硫苏糖醇(DTT)的离液序列高的溶剂中，于室温作用大约1小时；通过加入包含2mMDTT、4mM胱氨酸氧化还原对的重折叠缓冲液稀释离液序列高的溶剂至少20倍而使溶解的包含体重折叠；用约20％的乙酸调节pH至大约5.5，并使溶液反应至少5小时，用约1-1.4体积的25mM乙酸盐缓冲液pH5.5稀释溶液，过滤，将滤液上样于用乙酸钠缓冲液平衡至pH5.5的Tosohaas SP-550C树脂柱上，用约0.4M的氯化钠洗树脂柱，再用大约0.75M的氯化钠洗树脂柱以洗脱结合的IL-21蛋白，向洗脱液中加入硫酸铵至浓度约为1.5M并过滤洗脱液，滤液上样于用含有1.5M硫酸铵、0.05M氯化钠的乙酸钠缓冲液平衡的Tosohaas丁基650-M柱上，将洗脱液在用乙酸钠缓冲液平衡的SP Sepharose HP柱上稀释，用20倍柱体积的0.3-7M线性梯度氯化钠洗柱，浓缩IL-21蛋白，并使用切向流超滤将缓冲液交换为制剂缓冲液。在其他实施方案中，上述分离不溶性IL-21蛋白的方法包含使用IL-21受体结合试验测定生物活性。

另一方面，本发明提供包含IL-21蛋白的组合物，该组合物包含SEQ ID NO：28的2-163号氨基酸残基组成的多肽，在约10mM组氨酸，4.7％甘露醇，pH5.3的溶液中IL-21蛋白浓度为10毫克/毫升。

附图简述

图1图示了表达质粒pTAP337，该质粒含有密码子优化了的IL-21核苷酸序列。人的zalphall配基被命名为IL-21。该质粒被保藏于位于弗吉尼亚州Manassas的美国典型培养物保藏中心，专利保藏编号为PTA-4853。

发明详述

提供下面的定义以帮助对本发明的理解。

如这里所使用的，“核酸”或者“核酸分子”是指多聚核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)、寡聚核苷酸、聚合酶链式反应(PCR)产生的片段以及连接、剪切、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用中的任何一种所产生的片段。核酸分子可以由天然存在核苷酸的单体组成(例如DNA和RNA)，或者天然存在的核苷酸的类似物(例如天然存在核苷酸的α-光学对映体)或者二者的组合。修饰的核苷酸可以有糖成分的改变和/或嘧啶或嘌呤碱基成分的改变。糖的修饰包裹，例如一个或者更多羟基基团被卤素、烷基、氨基和叠氮基团取代，或者糖可以被功能化为醚或者酯。而且，整个的糖部分可以被空间排列和电子相似的结构取代，例如氮杂糖以及环状糖类似物。碱基部分被修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、乙酰化的嘌呤或嘧啶、或者其他众所周知的杂环取代物。核酸单体可以通过磷酸二酯键或这种连接的类似物被连起来。磷酸二酯键连接的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯(phosphoranilidate)、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、phosphoroanilothioate，酰基苯胺磷酸酯，氨基磷酸酯等等。术语“核酸分子”还包括所谓的“多肽核酸”，它包含附着在聚酰胺骨架上的天然存在或者修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或者双链的。

术语“核酸分子的互补物”是指相对于参考核苷酸序列，具有互补核苷酸序列和相反方向的核酸分子。

“增强子”是一类调控元件，它们可以提高转录的效率，而无论增强子相对于转录起始位点的距离和方向如何。

“异源DNA”是指在给定宿主细胞中不是天然存在的一个或者一群DNA分子。只要宿主DNA与非宿主DNA(即外源DNA)相组合，则对于某个宿主细胞是异源DNA的DNA分子可能含有来自该宿主细胞物种的DNA(即内源DNA)。例如编码某多肽的非宿主DNA片段，可操作地与包含转录启动子的宿主DNA片段相连，两片段连接得到的DNA就被认为是一个异源DNA分子。相反，一个异源DNA分子可以包含一个内源基因，可操作地与一个外源启动子相连。作为另一个例子，包含来自野生型细胞基因的DNA分子如果被引入一个没有该野生型基因的突变体细胞中，则被认为是异源DNA。

术语“重叠群”是指一个核酸分子，它具有与另一个核酸分子邻近的一段连续的相同或者互补的序列。认为邻近序列或者全部或者沿着核酸分子的某部分延伸与该核酸分子的一段给定序列“重叠”。

“互补DNA(cDNA)”是指通过逆转录酶从一个mRNA模板合成的单链DNA分子。通常使用一个与mRNA中某些部分互补的引物来起始逆转录。那些本领域的技术人员还使用术语“cDNA”来指一个由这样的单链DNA分子及其互补DNA链组成的双链DNA分子。术语“cDNA”还指从RNA模板合成的cDNA分子的克隆。

一个“分离出的核酸分子”是指不再整合在生物体基因组DNA中的核酸分子。例如从一个细胞基因组DNA中分离出的编码一种生长因子的DNA分子就是一个分离出的DNA分子。分离出的核酸分子的另一个实例是没有整合在生物体基因组中的化学合成的核酸分子。从某个特定物种中分离出的核酸分子小于该物种的染色体完整DNA分子。

“线形DNA”是指具有自由5′和3′端的非环状DNA分子。线形DNA可以由酶切或者物理破坏而从闭环DNA分子如质粒来制备。

一个“启动子”是一段指导结构基因转录的核苷酸序列。通常，启动子位于一个基因的5′非编码区内，靠近结构基因的转录起始位点。启动子内在转录起始中起作用的序列元件表征为共有核苷酸序列。这些启动子包括，例如，但不止限于，可被IPTG诱导型的启动子、细菌噬菌体T7启动子和细菌噬菌体λp_L启动子。参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.，Cold SpringHarbor Labora tory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001.典型的启动子具有三个组分，由-35和-10处的共有序列组成，二者之间间隔16-19个核苷酸(Lisset，S.和Margalit，H.，Nucleic Acids Res.21：1512，1993)。这种类型的启动子包括lac，trp，trp-lac(tac)以及trp-lac(trc)启动子。如果启动子是可诱导型启动子，则转录的速率应答于诱导剂而增加。相反，如果启动子是一个组成型启动子，则转录的速率不受诱导剂的调控。也已知有可抑制型启动子。

“核心启动子”含有启动子作用(包括转录起始)的必需核苷酸序列。根据该定义，在没有可能提高活性或赋予组织特异活性的特异序列时，一个核心启动子可能有或者没有可检测到的活性。

“调控元件”是一段调节核心启动子活性的核苷酸序列。例如，一个真核调控元件可能含有一段与细胞内的因子结合的核苷酸序列，这些因子使得仅仅在或者优先在特定的细胞、组织或者细胞器中激活转录。这些类型的调控元件通常与具有“细胞特异”、“组织特异”或者“细胞器特异”表达型式的基因相关。细菌启动子具有与核心启动子结合并且调节其活性的调控元件，例如与激活因子或者抑制因子分子结合的操纵子序列。

“克隆载体”是一个核酸分子，例如质粒、柯斯质粒或者细菌噬菌体，它们具有在宿主细胞内自主复制的能力。克隆载体通常含有一个或者少量的限制性内切酶识别位点，这些位点允许核酸分子以可确定的方式插入到载体中而载体的基本生物功能不会丧失；克隆载体中还含有编码标记基因的核苷酸序列，这些序列编码的标记基因适用于鉴定和筛选被克隆载体转化了的细胞。标记基因通常包括提供抗生素抗性的基因。

“表达载体”是编码在宿主细胞内表达的基因的核酸分子。通常情况下，表达载体包含转录启动子、基因、复制起始点、选择性标记以及转录终止子。基因的表达通常是在启动子的控制下，这样的基因“可操作地连接在”启动子上。类似的，如果调控元件调节核心启动子的活性，则可操作地将调控元件与核心启动子连接。表达载体还可以被称作表达构建体。

“重组宿主”是含有异源核酸分子--例如克隆载体或者表达载体——的细胞。

术语“表达”是指一个基因产物的生物合成。例如，对于一个结构基因而言，表达涉及结构基因转录为mRNA以及mRNA翻译成为一个或者更多的多肽。

术语“分泌信号序列”是指编码一个多肽(“分泌肽”)的一段DNA序列，该肽是一个更大多肽的一部分，它指导这个大的多肽在其被合成的细胞内通过一条分泌途径。在这个大的多肽通过分泌途径的转运过程中分泌肽通常被切割去掉。

“多肽”是由肽键连接起来的氨基酸残基的多聚体，不论它们是天然产生的还是合成的。小于大致10个氨基酸的多肽通常被称为“肽”。

“蛋白质”是包含一个或者更多多肽链的大分子。蛋白质还可能包含非肽组分，例如糖基团。可以在蛋白质中加入糖和其他非肽取代基。在这里蛋白质根据它们的氨基酸骨架结构定义；取代基例如糖基和非肽基团一般不指明，但是它们可能存在。

由非宿主DNA分子编码的肽或者多肽是“异源的”肽或者多肽。

“分离的多肽”所指的多肽基本上没有被细胞组分如糖、脂类或者其他天然情况下与该多肽结合的蛋白性杂质污染。通常分离的多肽制备物包含该多肽高度纯化的形式，即至少大约80％纯、至少约90％纯、至少大约95％纯、大于95％纯或者大于99％纯。证明某蛋白质制备物含有分离的多肽的一种方法是对该蛋白质制备物进行十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳之后，用考马斯亮蓝染色出现单一条带。但是术语“分离的”并不排除同一多肽以其他物理形式存在，例如二聚体或者其他的糖基化或衍生的形式。

这里使用术语“氨基末端”或“N末端”以及“羧基末端”或“C末端”以指示多肽内部的位置。在上下文允许时，这些术语的使用是指一个多肽的特定序列或者部分，以表明邻近程度或者相对位置。例如，一个多肽内部相对于参考序列位于其羧基末端指邻近参考序列的羧基末端，但是并不一定位于整个多肽的羧基末端。

“融合蛋白”是由至少包含两个基因的核苷酸序列的核酸分子表达出的杂合蛋白质。

这里使用术语“亲和标签”以表示一个多肽片段，该片段可以被连接在第二个多肽上以纯化或检测第二个多肽，或者为第二个多肽与底物结合提供位点。原则上，对于任何肽或者蛋白质只要有抗体或者其他特异结合试剂，则这些肽或蛋白质就可以被用作亲和标签。亲和标签包括多聚组氨酸、蛋白A(Nilsson et al.，EMBO J.4：1075(1985)；Nilsson et al.，Methods Enzymol.198：3(1991))，谷胱甘肽硫转移酶(Smith和Johnson，Gene 67：31(1988))，谷氨酸-谷氨酸亲和标签(Grussenmeyer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：7952(1985))，P物质，FLAG肽(Hopp et al.，Biotechnology 6：1204(1988))，链亲和素结合蛋白或者其他抗原性表位或结合结构域。一般地参见Ford et al.，Protein Expressionand Purification 2：95(1991)。可以从商品化供应商(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)处获得编码亲和标签的DNA分子。

术语“等渗的”在这里使用的是其通常含义，即与血液相同的渗透压，相当于0.9％的氯化钠溶液。一种盐类的“等渗量”是指制备等渗溶液或者在重溶冻干制品时产生等渗溶液所需要的量。

这里的浓度规定为液体组合物的摩尔浓度单位或者单位体积内的质量百分含量。当组合物的形式是冻干粉时，各个组分的浓度应该保证冻干粉重溶后得到规定的浓度。

由于标准分析方法的不精确性，我们理解分子量和多聚体的长度为大致的数值。当这样的一个数值表示为“大约”X或者“大致”X时，所述X数值理解为精确到X±10％。

重组IL-21的表达

本发明提供了从原核宿主中生产重组IL-21的表达载体和方法。IL-21以前被命名为zalphal 1配基，在通常所指的美国专利6,307,024中有详尽的描述，这里引用作为参考。特别地，本发明的表达载体和方法包含用于大规模生产IL-21的大肠杆菌表达系统，它使用的IL-21编码序列中有为大肠杆菌中的翻译而优化密码子和mRNA的二级结构的核苷酸特异改变。使用本发明的表达载体和方法，在补料批量发酵中IL-21基因在大肠杆菌中的表达水平大于1克/升。本发明的发明者发现使用大肠杆菌OmpT蛋白酶缺陷株UT5600作为生产宿主克服了IL-21met的稳定性问题。IL-21met是在5′端加上一个编码N末端甲硫氨酸的密码子的IL-21编码多聚核苷酸序列。使用这里描述的表达载体显著提高了从细菌中回收的重组蛋白的产量。使用该生产宿主菌株，从摇瓶培养得到产量大于50毫克/升的IL-21met包含体。在另一个实施方案中，为了有助于开发高细胞密度补料批量发酵，选择了另外一种大肠杆菌菌株W3110作为IL-21大规模生产的宿主。该宿主菌株没有病原性，且在最低限度的发酵培养基中可以生长至高细胞密度。使用摇瓶和批量发酵，大肠杆菌菌株W3110中IL-21met的生产能力与大肠杆菌菌株UT5600相当。

本发明还提供在IL-21被原核宿主表达之后在宿主细胞内形成未糖基化的不溶性包含体时，从宿主中回收重组IL-21蛋白的方法。当裂解原核细胞以分离包含体(也被称为折射体)时，包含体是IL-21的聚集物。因此，必须将包含体解聚并且溶解以分离IL-21蛋白，通常这需要使用具有变性作用的离液序列高的溶剂，结果回收的多肽必须进行重折叠才能具有明显的生物活性。IL-21蛋白重折叠后，必须对其进行捕获和纯化。因此，本发明提供的方法用于从原核细胞中分离不溶性IL-21蛋白、将不溶性IL-21蛋白溶解于一种离液序列高的溶剂、稀释离液序列高的溶剂使IL-21蛋白重折叠和分离之。本发明还包括使用阳离子交换层析从稀释的重折叠缓冲液中捕获复性的IL-21的方法以及使用疏水相互作用层析纯化重折叠的IL-21蛋白的方法。在使用IL-21受体等的结合试验中使用阴离子交换对IL-21蛋白进一步纯化。

人IL-21基因编码一个162个氨基酸组成的多肽。全序列包括如SEQ ID NO：1和2所示的29个氨基酸的信号肽，以及包含氨基酸残基30号(Gln)到162号(Ser)的共133个氨基酸的成熟蛋白质。使用原核表达系统表达的IL-21序列具有N末端甲硫氨酸，且核苷酸序列以及相应的氨基酸序列由SEQ ID NO：27和28表示。SEQ ID NO：27的核苷酸序列显示了经密码子优化的序列，该序列属于本发明的范畴。

使用哺乳动物表达系统生产重组人IL-21的产量大致是20毫克/升的蛋白。因此需要更为划算的表达系统来进行IL-21的大规模生产。大肠杆菌系统是大规模生产的一个更好的选择。存在一个潜在的天冬酰胺连接的糖基化位点，但是在使用哺乳动物系统于CHO细胞系中表达蛋白时或者使用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达蛋白时该位点不被占据。这一结构特性使IL-21成为进行原核表达的良好候选者。在大肠杆菌中的表达比在其他表达系统中表达有很多优势，特别是低的开发成本和高的产量。

在大肠杆菌中表达的具有N末端残基的重组IL-21(IL-21met)，在细胞破碎之后以不溶性包含体的形式被分离出来。这种物质没有正确地折叠因此不具有所需的生物活性。大多数情况下包含体需要在具变性作用的离液序列高的溶剂中溶解，并稀释离液序列高的溶剂使蛋白质重折叠，然后进行纯化。蛋白质重折叠所需的最佳环境差异很大。影响正确折叠的且有生物活性物质回收的因素包括：起始蛋白质浓度、氧化状态、pH、赋形剂、盐、去污剂、温度、重折叠缓冲液加入的方式等等。与IL-21结构和序列相似的蛋白质IL-2，已经在大肠杆菌系统中表达并且成功地重折叠(Weir et al.，J.Biochem.245：85，1987.)。一种人IL-2的重组突变蛋白ALDESLEUKIN

已经在大肠杆菌系统中作为包含体表达并且在体外重折叠。

对人IL-21cDNA使用的密码子进行考查显示其含有过量的大肠杆菌中极少使用的密码子。含有大量稀有密码子的基因往往在大肠杆菌中表达的水平较低(Kane，Curr Opin Biotechnol.6(5)：494-500，1995)。另一个与人IL-21在大肠杆菌中表达有关的问题是在IL-21序列中有四个潜在的OmpT切割位点。OpmT是一种内肽酶，它特异地在两个连续碱性氨基酸中间切割，该酶在变性条件下(例如8M尿素和6M盐酸胍)具有活性(White et al.，J Biol Chem.270(22)：12990-4，1995；Dekker et al.，Biochemistry，40(6)：1694-701，2001)。这引起了对于大肠杆菌细胞提取物中IL-21稳定性的担心，原因就是OmpT的蛋白酶活性。

一些实验室已经证明如果在宿主体内增加某些稀有tRNA的水平，则含有稀有密码子的基因的表达水平会有显著提高。(Zdanovsky etal.，Appl Environ Microbiol.66(8)：3166-73，2000；Calderoneet al.，J Mol Biol.262(4)：407-12；Kleber-Janke et al.，Protein Expr Purif.19(3)：419-24，2000；You et al，.Biotechniques.27(5)：950-4，1999.)。pRARE质粒编码大肠杆菌内稀有的tRNA基因(argU，argW，leuW，proL，ileX和glyT)及其天然的启动子(Novy et al.，InNovations，12：2-3，2001)。在大肠杆菌内与pRARE共同表达使IL-21met的产量提高了5-10倍。在大肠杆菌内与pRARE共同表达还降低了大肠杆菌细胞裂解物中截断的IL-21met的水平，这提示使用更为适当的密码子重新合成IL-21met基因是有益的。

本发明还提供了一个表达载体，该载体包含为在大肠杆菌中进行翻译而进行了密码子优化的IL-21的编码序列。编码IL-21met的合成基因是通过重叠PCR得到的。最后的PCR产物引入一个表达载体，用于在Tac启动子的控制下的表达。但是表达水平低。对IL-21met cDNA的二级结构进行检查发现极其稳定的发夹结构。怀疑该发夹环就是阻止已经完全优化的序列有效进行表达的结构元件。当使用SEQ ID NO：1中的序列代替优化序列中的前80个碱基之后，发夹结构被除去。SEQ IDNO：27显示了杂合的IL-21，该所得基因在大肠杆菌中有高水平的表达。使用新表达构建体的表达水平增加到细胞总蛋白的大约20％或者100毫克/升。

适合于在原核细胞中生产所需蛋白质的表达载体通常包含：(1)编码细菌复制起点的原核DNA元件，用于维持细菌宿主中的表达载体；(2)控制转录起始的DNA元件，例如启动子；(3)控制转录产物加工的DNA元件，例如转录终止子；以及(4)编码选择标记例如抗生素抗性的基因。原核宿主细胞在引入表达载体以及适当的诱导剂之后产生IL-21。因此，本发明着重考虑的是包含启动子、优化的IL-21核苷酸序列以及终止子的表达载体。SEQ ID NO：27给出了优化的IL-21核苷酸序列的示例。在另一个实施方案中，表达载体还包含选择性标记。在一个实施方案中，选择标记是卡那霉素抗性。

表达载体还包含编码肽标签的核苷酸序列以帮助纯化目的蛋白质。在分离重组多肽中有用的肽标签包括，例如，多聚组氨酸标签(与镍螯合的树脂有亲和性)、c-myc标签、钙调蛋白结合蛋白(通过用钙调蛋白亲和层析分离)、P物质、RYIRS标签(与抗RYIRS抗体结合)、谷氨酸-谷氨酸标签以及FLAG标签(与抗FLAG抗体结合)。参见例如Luo et al.，Arch.Biochem.Biophys.329：215(1996)，Morgantiet al.，Biotechnol.Appl.Biochem.23：67(1996)，和Zheng et al.，Gene 186：55(1997)。可以从例如Sigma-Aldrich Corporation(St.Louis，MO)得到编码这些肽标签的核酸分子。

本领域内具有普通技术的人员熟悉多种用于制备表达载体的分子技术。例如IL-21多聚核苷酸可以通过使用相互引发的长的寡聚核苷酸以及这里描述的核苷酸序列(参见例如Ausubel(1995)8-8到8-9页)合成核酸分子来制备。使用聚合酶链式反应已经建立的技术使得能够合成至少2kb长的DNA分子(Adang et al.，Plant Molec.Biol.21：1131(1993)，Bambot et al.，PCR Methods and Applications2：266(1993)，Dillon et al.，″Use of the Polymerase ChainReaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes，″inMethods in Molecular Biology，Vol.15：PCR Protocols：CurrentMethods and Applications，White(ed.)，263-268页，(HumanaPress，Inc.1993)，以及Holowachuk et al.，PCR Methods Annal.4：299(1995))。

另外一种构建表达系统的方法使用的是利用酵母系统的同源重组。参见美国专利6,207,442号--通过同源重组构建质粒，在这里引用作为参考。该系统提供了一个通用的受体质粒，该质粒可以用于克隆编码任何目标多肽(包括融合多肽)的DNA。该系统提供了制备双链环形DNA的方法，此DNA包含了编码目标蛋白的DNA区域。一个或者更多编码目标蛋白质如IL-21的供体DNA片段在啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主细胞内与受体质粒、第一DNA连接物以及第二DNA连接物结合，由此供体DNA片段与受体质粒通过供体DNA、受体质粒以及连接物之间的同源重组连接进入受体质粒形成闭合的环形质粒。

还可以使用例如氨基磷酸酯方法的实验方案，利用“基因机器”来合成本发明的核酸分子。如果一项应用，例如合成基因或者基因片段需要化学合成的双链DNA，则每条互补DNA链分别合成。短基因(60-80bp)的制备在技术上可以直接进行，并可由合成互补的链之后使其退火而实现。但是对于长基因(＞300bp)的制备则需要特殊的策略，因为在DNA化学合成中每一个循环的偶联效率很少能达到100％。为了解决这个问题，从长度为20-100个核苷酸的单链片段以模块形式装配成合成基因(双链)。对于多聚核苷酸合成的综述参见例如Glick和Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles andApplications of Recombinant DNA(ASM Press 1994)，Itakura etal.，Annu.Rev.Biochem.53：323(1984)，以及Climie et al.，Proc.Na t′1 Acad.Sci.USA 87：633(1990)。

其他可以用于制备IL-21基因和表达载体的技术包括，例如限制性内切酶消化和连接以及聚合酶链式反应，它们都是本领域内众所周知的。

多种类型的选择性标记基因可以利用(见例如Kaufman，Meth.Enzymol.185：487(1990)；Kaufman，Meth，Enzymol.185：537(1990))表达载体中通常包含选择性标记，例如四环素抗性、氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、新霉素抗性或者氯霉素抗性。选择标记使被表达载体转化的细胞从没有被转化的细胞中被选择和/或检测出来。一个表达载体可以携带一个以上的这种抗生素抗性基因。一个没有使用抗生素抗性的选择标记的实例使用来自R1质粒的hok/sok系统。hok基因编码52个氨基酸长的有毒的HoK蛋白质，且sok基因编码一个反义RNA，它与hok mRNA的引导序列互补。本领域内的技术人员知道该选择标记，并其在Gerdes，K.et al.，Genetic Engineering，19：49-61，1997中有更详细的描述。

本发明包括了多种不同的适宜重组宿主细胞，它们包括，但是不限于，革兰氏阴性原核宿主生物体。适宜的大肠杆菌菌株包括W3110，K12-衍生的菌株MM294，TG-1，JM-107，BL21，和UT5600。其他适宜的菌株包括：BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysE，DH1，DH4I，DH5，DH5I，DH5IF′，DH5IMCR，DH10B，DH10B/p3，DH11S，C600，HB101，JM101，JM105，JM109，JM110，K38，RR1，Y1088，Y1089，CSH18，ER1451，ER1647，E.coli K12，E.coliK12RV308，E.coliK12C600，E.coliHB101，E.coliK12C600R.sub.k-M.sub.k-，E.coliK12RR1(参见例如Brown(ed.)，Molecular Biology Labfax(Academic Press 1991))。其他革兰氏阴性原核宿主可以包括粘质沙雷菌(Serratia)、假单孢菌(Pseudomonas)、柄杆菌(Caulobacter)。原核宿主可以包括革兰氏阳性生物体，例如芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌以色列变种，还有链霉菌，例如铅青链霉菌(S.lividans)，生二素链霉菌(S.ambofaciens)，弗氏链霉菌(S.fradiae)，和灰褐链霉菌(S.griseofuscus)。适宜的枯草芽孢杆菌菌株包括BR151，YB886，MI119，MI120，以及B170(参见例如Hardy，″Bacillus Cloning Methods，″in DNACloning：A Practical Approach，Glover(ed.)(IRL Press 1985))。在原核宿主中扩增载体的标准技术对于本领域内的技术人员是众所周知的(参见例如Ausubel et al.(eds.)，Short Protocols inMolecular Biology 3rd Edition(John Wiley&Sons 1995)；Wu etal.，Methods in Gene Biotechnology(CRC Press，Inc.1997))。对于原核生物中蛋白酶缺陷菌株的综述，参见Meerman et al.，Biotechnology 12：1107-1110，1994。本发明使用W3110菌株作为示例，该菌株被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，编号为ATCC#27235。

操作克隆的DNA分子以及向多种不同宿主细胞中引入外源DNA的技术在Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989，以及Ausubel et al.，eds.，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987.中予以公开。用常规的步骤培养转化的或者转染的宿主细胞，使用的培养基中含有营养物和被选宿主细胞生长所需的其他组分。本领域内已知有多种不同的适宜培养基，包括成分明确的培养基和复合培养基，且一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素以及矿物质。培养基中还可以根据需要含有例如生长因子或者血清等组分。生长培养基一般通过例如药物选择或者必需营养物的缺失来选择含有外源DNA的细胞，药物选择或者一种必需营养物的缺失通过表达载体上携带的或者共转染入宿主细胞内的选择标记得到弥补。用常规的方法，例如振荡小型摇瓶或者向发酵罐内通气，为液体培养基提供充足的通气。可以对转化的细胞进行选择和扩增以提供表达目标基因的重组宿主细胞。可以使用MBP(麦芽糖结合蛋白)融合系统(New England Biolabs(NEB；Beverly，MA))在大肠杆菌中表达IL-21。在该系统中，IL-21的cDNA连在malE基因的3′端，形成MBP-IL-21融合蛋白。tac启动子驱动融合蛋白的表达，但是在加入1mmolIPTG诱导启动子之前表达是“关闭”的。可以按照pMAL-c2载体(NEB)的多克隆位点(MCS)以及生产商的说明将构建体与MBP形成符合读码框的融合。

发酵

在本发明的一个实施方案中可以使用批量发酵，特别是当需要使用本发明的表达系统进行IL-21的大规模生产时。一般地，批量发酵包含第一阶段的种子摇瓶培养，将表达IL-21的大肠杆菌菌株置于适宜的培养基中摇瓶振荡培养使细菌生长到600nm光密度(OD)达到5-20。适宜的培养基含有的氮来源于例如硫酸铵、磷酸铵、氯化铵、酵母提取物、水解动物蛋白、水解植物蛋白或者水解酪蛋白。由磷酸钾、磷酸铵、磷酸或者磷酸钠提供磷。其他的组分有氯化镁或者硫酸镁，硫酸铁或者氯化铁以及其他微量元素。生长培养基中可以补充糖，例如果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖以及甘油以提高生长。在某些实施方案中，加入的糖是甘油或者葡萄糖，加入的量是1-20克每升培养基。在某些实施方案中，甘油或者葡萄糖是5-10克/升。从含有抗生素(例如10-50微克/毫升的卡那霉素)的琼脂培养基上或者冷冻的储存培养物中取大肠杆菌接种到含有优选的生长培养基的摇瓶(500-2000毫升带挡板的摇瓶)中开始培养。在摇瓶中的培养温度是28到40摄氏度。在某些实施方案中，摇瓶在30到37摄氏度培养。摇瓶在培养中的振荡速度设置为200到300rpm。

使用适宜的生长培养基准备发酵容器，并将容器灭菌。培养基的pH调节为6.5到7.5。在某些实施方案中，pH是6.8，6.9，7.0，7.1或7.2。为容器设置适当的通气和振荡水平，从生长10到20小时的600nmOD值达到5-20的第一阶段种子摇瓶培养物中取出一定量的培养物进行接种。接种的水平是1到12％(v/v)。在某些实施方案中，接种的水平是3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％或10％v/v。通过提高振荡速度、提高通气率、向培养基中通氧或不同方式的组合，使溶解氧的水平保持在20％饱和以上。培养物生长直至600nm的OD值达到2-20的OD单位，然后向培养物中加入IPTG至浓度为0.1-2.0mM。IPTG诱导tac启动子表达IL-21。或者可以在24小时时以10克/升加入30％的乳糖溶液诱导。让培养物继续生长2至8小时。在某些实施方案中，培养物继续生长3至4小时。

在另一个实施方案中，使用补料批量培养来得到高产量的IL-21蛋白。生产IL-21的大肠杆菌菌株生长在适宜的培养基中，在摇瓶中培养至600nmOD值达到5-20。适宜的培养基含有的氮来源于例如硫酸铵、磷酸铵、氯化铵、酵母提取物、水解动物蛋白、水解植物蛋白或者水解酪蛋白。由磷酸钾、磷酸铵、磷酸或者磷酸钠提供磷。其他的组分有氯化镁或硫酸镁，硫酸铁或者氯化铁以及其他微量元素。生长培养基中可以补充糖，例如果糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖以及甘油以提高生长。在某些实施方案中，加入的糖是甘油或者葡萄糖，加入的量是1-20克/升培养基。在某些实施方案中，甘油或者葡萄糖是5-10克/升。从含有抗生素(例如10-50微克/毫升的卡那霉素)的琼脂培养基上或者冷冻的储存培养物中取大肠杆菌接种到含有优选生长培养基的摇瓶(500-2000毫升带挡板的摇瓶)中开始培养。在摇瓶中的培养温度是28到40摄氏度。在某些实施方案中，摇瓶在30到37摄氏度培养。摇瓶在培养中的振荡速度设置为200到300rpm。

使用适宜的生长培养基准备第二阶段的发酵容器，并将容器灭菌。适宜的培养基可以是例如Super Broth II(Becton Dickenson，Franklin Lakes，NJ)，APS-Super Broth，Luria Broth，或者ZSM(参见表1-4)以及卡那霉素。生长培养基中可以补充糖以促进生长。在某些实施方案中，加入的糖是甘油或者葡萄糖，加入的量是1-40克/升培养基。在一个实施方案中，甘油或者葡萄糖是5-10克/升。培养基的pH调节为6.5到7.5。在某些实施方案中，pH是6.8，6.9，7.0，7.1或7.2。为容器设置适当的通气和振荡水平，从生长了10-20小时的600nmOD值达到5-20的第一阶段种子摇瓶培养物进行接种。接种的水平是1-12％(v/v)。在某些实施方案中，接种的水平是3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％或10％v/v。通过提高振荡速度、提高通气速率、向培养基中通氧或上述方法的不同组合，使溶解氧的水平保持在20％饱和以上。

使用适宜的生长培养基准备发酵容器(如上所述)，并将容器灭菌。培养基的pH调节为6.2，6.3，6.4，6.5，6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1或7.2。在一个实施方案中，调节培养基pH为6.8。生长培养基中可以补充糖以促进生长。在某些实施方案中，加入的糖是甘油或者葡萄糖，加入的量是5-40克/升培养基。在某些实施方案中，甘油或者葡萄糖是15-20克/升。为容器设置适当的通气和振荡水平，并从培养了10-20小时的600nmOD值达到5-20的第一阶段种子摇瓶培养物进行接种。接种的水平是1-12％(v/v)。在某些实施方案中，接种的比例是5％，6％，7％，8％，9％或10％v/v。通过提高振荡速度、提高通气速率、向培养基中通氧或以上方式的不同组合，使溶解氧的水平保持在20％饱和以上。

以发酵运行开始时预先确定的速率向发酵罐内补充糖溶液，但一般是在6小时流逝发酵时间(EFT)以后，且不超过12小时EFT。补料一直持续到发酵结束。补料溶液可以是40-70％v/v的甘油或者40-70％w/v的葡萄糖。在某些实施方案中甘油或者葡萄糖分别是70％v/v甘油和60％w/v葡萄糖。补料速率可以为5-15克葡萄糖或甘油每升每小时。在一个实施方案中补料速率是8、9或10克每升培养基每小时。在20到30小时EFT时，例如在24小时EFT时，向培养物中加入IPTG至浓度为0.5-2mM。或者，可以在24小时时以10克/升加入30％的乳糖溶液进行诱导。在48-56小时EFT时，收获发酵物。或者再向发酵液补充0.5到2mmol/L的IPTG。然后在52-56小时EFT收获发酵物。

在发酵进行的末尾，将温度向下调节至4到20摄氏度，维持pH或者将其调整为5.0-9.0。在某些实施方案中，这个范围是6.0-8.0pH单位。通过给发酵容器增压，收获发酵液，通过取样端口收集培养物。或者可以通过一个取样端口将培养物泵出。发酵液可以含有10-30％w/v的固体。

IL-21的回收

发酵之后离心收获细胞，重悬于匀浆缓冲液中，使用例如APV-Gaulin匀浆器(Invensys APV，Tonawanda，New York)或者其他类型的细胞破碎装置，如珠磨机或者超声波破碎仪进行匀浆。或者从发酵罐中直接取出细胞，在APV-Gaulin匀浆器中匀浆。或者，在匀浆前用水或缓冲液稀释发酵液。

在一个实施方案中，细胞直接在发酵液中匀浆。例如在4-15摄氏度冷却APV-Gaulin 1000或APV-Gaulin 2000匀浆器至少30分钟。将发酵液通过匀浆器，收集细胞悬液。为了获得最大的细胞破碎，匀浆器的压力应该设置在6000到14,000磅/平方英寸。在一个实施方案中，匀浆器的压力设置在10000磅/平方英寸。悬液通过匀浆器1到5次，例如通过3次。在另一个实施方案中，在匀浆前用等体积的水稀释培养物。在匀浆过程中或者匀浆之后可以通过加入PEI、精胺或者benzonase降低DNA的含量。

离心匀浆产物，倾出上清得到含有包含体的沉淀。用水或者含或不含不同水平的下列化合物的Tris缓冲液洗涤包含体沉淀：氯化钠、尿素、Triton X-100、氯化锌、月桂基硫酸钠、蔗糖。

在另一个实施方案中，将发酵液转移至离心瓶中，2-8℃离心20-60分钟，收获细胞。例如，可以使用带KompSpin KAJ7.100转头的Beckman J6MI离心机(Beckman Coulter，Fullerton，CA)，用7500×G离心收获细胞。可以使用带Beckman JLA-8.1固定角度转头的Avanti JHC离心机8000到15800×G离心或者用Aries JS 5.0旋转斗转头以2.25升的瓶子在7500×G离心。还可以使用如CarrSeparations，Inc.(Franklin，MA)或Westfalia Separator，Inc.(Northvale，NJ)提供的连续离心机。

从离心瓶中取出培养物或者上清。细胞沉淀以每10-30％w/v固体重悬于匀浆缓冲液(100mM Tris，5mM氯化锌，pH7.5)。发酵液通过APVGaulin匀浆器，并收集细胞悬液。匀浆器的压力应设置为6000-14000磅/平方英寸，以获得最大的细胞破碎。在一个实施方案中，压力是10000磅/平方英寸。悬液反复通过匀浆器1-5次，例如3次。

此外，回收IL-21的方法可以进一步包含IL-21的沉淀、漂洗以及重溶。漂洗后的包含体在6M盐酸胍或者8M尿素中溶解，在水或者缓冲液中稀释6-10倍，孵育30分钟，并离心或者过滤。或者，可以使用超滤或大量过滤漂洗匀浆后的包含体。得到的沉淀用2-6M的尿素漂洗，并含IL-21蛋白。在重溶之前用水再洗沉淀。可以加入Al³⁺或者Fe³⁺或者阴离子和阳离子聚合物或者如精胺、PEI和benzonase之类的试剂，以沉淀细胞残渣、可溶性蛋白、DNA、RNA和糖。

包含体的溶解

漂洗过的包含体制备的可以使用含有还原剂，例如β巯基乙醇(10-100mM)或二硫苏糖醇(5-50mM)的盐酸胍(5-8M)、硫氰酸胍(5-6M)或者尿素(7-8M)中溶解。溶液可以使用Tris、磷酸、HEPES或者其他适当的缓冲液制备。包含体还可以使用含有月桂基硫酸钠(0.1-2％)的尿素(2-4M)溶解。可以使用50-200毫升上述的溶液溶解来自1升发酵液的包含体。一种方法是用150毫升在100mM Tris，pH 8.0、40mM DTT的溶液中制备的6M盐酸胍溶解来自1升发酵液的包含体沉淀。在另一个实施方案中，用50-100毫升的8M盐酸胍溶解包含体浆。用刮铲混和包含体浆使其重悬然后使用Omni EZ匀浆器(OmniInternational，Warrenton，VA)，或者用机械装置使其重悬。悬液在3-37度混和30-120分钟。在一个实施方案中，悬液在15-25摄氏度混和以完成溶解过程。然后使用适当的离心机以7,500-16,000×G的转速在4度离心样品10-30分钟。上清中含有溶解的IL-21，将其倾出并保留。

由反相HPLC确定溶解的级分中IL-21的浓度。使用乙腈/三氟乙酸作为Jupiter C5柱(Phenomenex，Torrance，CA)的流动相。在含有胍/DTT/Tris的缓冲液中稀释IL-21标准物，向层析柱中注入不同量的标准物。IL-21峰下面的面积用于构建标准曲线。在注射到HPLC层析柱之前，用微量离心机离心溶解的IL-21样品以除去小颗粒。确定IL-21峰下面的面积，则可以根据标准曲线对IL-21进行定量。

此外，可以在这个阶段使用切向流过滤、固定化金属亲和层析的反相HPLC来纯化溶解的IL-21。

重折叠

在本发明的一个方面，从以折射包含体的形式表达IL-21的转化的大肠杆菌宿主菌株中回收纯化IL-21的过程是，破碎细胞并通过离心回收包含体。

然后使用含有还原剂的6M盐酸胍对包含体进行溶解和变性。然后使用控制的复性步骤氧化被还原的IL-21。该步骤涉及在含有精氨酸盐酸盐、盐以及一种氧化穿梭系统的重折叠缓冲液中进行稀释。氧化穿梭系统用来起始IL-21分子中二硫键的形成，该系统是基于氧化的和还原的分子的混合物，例如半胱氨酸和胱氨酸、DTT和胱氨酸、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽以及DTT和氧化型谷胱甘肽。还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的比例可以从1∶1到6∶1，浓度的范围从0.5到8mM。在一个实施方案中，最佳的浓度是4mM还原型谷胱甘肽比2mM氧化型谷胱甘肽。半胱氨酸和胱氨酸的比例可以从2∶1到1∶1，每一种试剂的浓度范围可以从4mM到1mM。在一个实施方案中，最佳的浓度是4mM半胱氨酸和2mM胱氨酸。还可以使用形成4mM半胱氨酸和2mM胱氨酸的4mM胱氨酸和2mM DTT，获得最佳的重折叠。还可以在亚硫酸钠和四硫代硫酸钠等试剂存在的条件下通过亚硫酸盐解进行重折叠。使用阳离子交换层析从稀释的重折叠缓冲液中捕获复性的IL-21，使用疏水相互作用层析和高效阳离子交换层析纯化复性的IL-21。

在搅拌下，将含有IL-21的溶液迅速(1-5分钟)或者缓慢(0.5-5小时)地加入到重折叠缓冲液中。重折叠缓冲液含有精氨酸(0.5到1.25M)、PEG和盐。还可以含有甘油、盐酸胍、尿素、EDTA、蛋白酶抑制剂和分子伴侣、乙醇、去污剂、甘油和硫酸铜。IL-21可以一次加入、多次加入或者连续不断地补充。IL-21加入到重折叠混合物中的终浓度为0.05到1.2毫克/毫升。温度的范围是4-30度。pH是7.3到8,5。将含有重折叠混合物的容器暴露在空气中，或者在复性过程中通入空气或者氮气。重折叠的时间要1到26小时。

还可以在EDTA存在的条件下进行重折叠，以降低甲硫氨酸的氧化，或者使用分子大小排组柱、或者使用切向流过滤或电泳。

重折叠IL-21的澄清和浓缩

将重折叠IL-21的pH调节为5.5，然后通过1.2微米的滤膜进行澄清并除去不溶解的蛋白。使用板框式系统上的切向流过滤或者中空纤维滤器对过滤后的溶液浓缩10-30倍。然后使用缓冲液或者水将浓缩产物稀释3-10倍，使未折叠的和聚集的蛋白沉淀。然后通过一个滤膜使溶液澄清并取出不溶解的蛋白。

或者在水或25mM乙酸钠pH5.5中将重折叠的IL-21稀释2倍到10倍。沉淀或者凝絮物形成并且在大约30分钟到5小时之后过滤除去。可以先后使用1.2微米的标称滤膜和然后0.45微米的滤膜或者使用具有正zeta电势的深滤膜除去凝絮物。还可以使用其他滤膜如分级密度滤膜。还可以离心或者微过滤除去凝絮物。

IL-21的捕获

在本发明的另一个方面，在IL-21蛋白重折叠和浓缩之后，本发明的方法包含使用阳离子交换柱从稀释缓冲液中捕获IL-21蛋白，以及使用疏水相互作用层析和高效阳离子交换层析纯化IL-21蛋白。

捕获步骤的目的是捕获稀释、折叠的IL-21并且开始初步的纯化。为了使IL-21结合到层析柱上，首先进行稀释。澄清、稀释的IL-21在pH5.5的阳离子交换柱上被捕获。通常使用SP Sepharose XL(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)或者TOYOPEARL SP 550C(Tosoh Biosep，Montgomery，PA)。平衡缓冲液是25mM乙酸钠、0.2-0.45M氯化钠，pH5.5，且使用增加的盐梯度洗脱结合的IL-21。使用SP Sepharose XL层析柱在大约0.6M氯化钠处洗脱IL-21，使用TOYOPEARL SP 550C层析柱在大约0.8M氯化钠处洗脱IL-21。

也可以使用膨胀床层析在重折叠之后捕获IL-21。这种情况中在将IL-21上样到柱上的同时在线进行稀释。使用25mM乙酸钠、0.2M氯化钠pH5.5平衡Streamline SP XL(Amersham Biosciences)。将IL-21以向上流动的模式上样于平衡好的Streamline SP XL树脂中，树脂维持在两倍固定柱床高度处，同时用水进行1∶3在线稀释。以向上流动和向下流动两种方式洗柱之后，以向下流动的方式用0.6M氯化钠或者氯化钠梯度洗脱IL-21。

本发明的方法提供了多种不同的阳离子交换树脂在该步骤中的用途，包括弱阳离子交换剂例如羧甲基、不同类型的固相支持物，例如琼脂糖或纤维素以及不同的颗粒大小。本发明的方法还提供了在5.0到7.0范围中的不同pH值下以及使用不同的缓冲液和盐进行层析。或者可以使用其他的层析方法，例如疏水相互作用、阴离子交换及金属螯合等捕获重折叠的IL-21。

纯化

在本发明的一方面中，有IL-21蛋白的中间纯化步骤。该步骤的目的是使用疏水相互作用层析对IL-21进行进一步的纯化。通常该步骤使用的树脂是Butyl Sepharose FF(Amersham Biosciences)或者是TOYOPEARL丁基650M(Tosoh Biosep)。使用25mM乙酸钠，50mM氯化钠，1.5M硫酸铵，pH 5.5的溶液平衡树脂。阳离子交换层析后纯化出的IL-21调节硫酸铵的浓度至1.5M，然后通过0.45微米的标称滤膜。将经过这些处理的IL-21上样于平衡好的树脂上，使用平衡缓冲液洗涤树脂除去未结合的物质。使用至25mM乙酸钠、50mM氯化钠的梯度进行洗脱，在大约0.75M硫酸铵到0.3M硫酸铵时IL-21被洗脱出来。

可以用于该步骤的其他疏水相互作用层析树脂包括，例如，那些被苯基或者己基取代的介质、不同类型的固体支持物，例如琼脂糖或纤维素，以及不同的颗粒大小。本发明还提供了在5.0到9.0范围中的不同pH值下以及使用不同的缓冲液和盐进行层析。本发明还提供了在IL-21不结合的情况下进行层析的方法。

进一步通过高效阳离子交换层析纯化IL-21。通常将IL-21稀释至电导率为30ms/cm，用0.5M磷酸一氢盐调节pH至6.0，上样至Sepharose SP HP(Amersham Biosciences)柱上。使用25mM磷酸钠，0.3M氯化钠pH6.0的溶液平衡层析柱。先用平衡缓冲液洗柱，然后用氯化钠梯度洗脱IL-21。本发明还提供了使用其他高效阳离子交换树脂。柱可以在5.0到7.5范围内的不同pH值、在不同缓冲体系，例如磷酸缓冲体系中进行层析。上样的物质可以使用水或者缓冲液稀释至电导率范围在5-35ms/cm之间。

纯化IL-21的方法可以包含浓缩以及蛋白质的缓冲液交换。该步骤的目的是浓缩高效阳离子交换柱的洗脱产物，并且将其转换为制剂缓冲液。使用5kD截留分子量的切向流过滤板框式膜将最后汇集的层析柱洗脱物浓缩大约10倍，对磷酸盐缓冲液pH6.0或者对10mM组氨酸，4.72％(w/v)甘露醇pH5.0、5.1、5.2或者5.3进行渗滤(diafiltered)，然后第二次浓缩进一步提高IL-21的浓度。

可以使用其他的滤膜，例如3kD或8kD截留分子量的板框式滤膜或者10kD截留分子量的中空纤维系统，来完成这个超滤/渗滤的步骤。根据SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，在高效阳离子交换层析之后IL-21的纯度至少是95％，通常大于98％。在阳离子交换层析捕获、疏水相互作用层析纯化以及缓冲液交换之后IL-21的内毒素水平一般小于10内毒素单位每毫克IL-21蛋白，通常小于2内毒素单位每毫克IL-21蛋白。在高效阳离子交换层析之后的内毒素水平一般小于1内毒素单位每毫克IL-21

对使用Streamline SP XL以及丁基Sepharose IF(在阳离子交换层析之前没有进行20倍浓缩)产生的物质进行分析显示：通过大小排阻HPLC测得的聚集物小于0.2％，通过阳离子交换HPLC测得得电荷异质性大约是10％，通过反相HPLC测得的纯度大约是90％。对使用Toyopearl SP 550C、Toyopearl丁基650M以及Separose SP HP产生的物质进行分析显示：通过大小排阻HPLC测得的聚集物小于2％，通过反相HPLC测得的纯度大约是90％，通过阳离子交换HPLC测得的电荷异质性大约是4％。

可能需要对IL-21进行进一步纯化以去除剩余的杂质和污染物。例如可以使用阴离子交换层析柱来降低内毒素水平。将IL-21稀释至电导率水平小于10mS/cm，调节pH至8.0。上样至Q Sepharose FF柱(Amersham Biosciences)上，该柱事先平衡至20mMTris pH8.0。与上样物相比，通过层析柱后的IL-21其内毒素水平降低了大约80％。也可以使用Mustang Q或者Mustang E(Pall，Port Washington，NY)膜在pH5.0到9.0之间降低内毒素水平。

其他有可能用来进一步纯化IL-21的纯化步骤包括金属螯合层析、阴离子交换层析或者苯基柱上的疏水相互作用层析。还可以在IL-21重折叠之前进行纯化，使用例如反相HPLC、离子交换层析或者金属螯合层析。因此本发明进一步提供了包含额外纯化步骤的方法，这些纯化步骤在这里予以公开。

纯化IL-21的特性鉴定

BaF3是一种来自于小鼠骨髓的依赖于白细胞介素3(IL-3)的前类淋巴细胞系(Palacios和Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；MatheyPrevot et al.，Mol.Cell.Biol.6：4133-4135，1986)。已经构建了表达全长IL-21受体的BaF3细胞，并且其在美国专利6,307,024号中有全面的描述。该细胞系必须要依赖于与IL-21受体相连的途径才能存活，所以在没有其他生长因子的条件下培养该细胞系可以用来检测出具有生物活性的IL-21。可以使用多种不同稀释度的纯化的IL-21蛋白加入到细胞中，比较接受处理的细胞与没有IL-21蛋白的细胞的生长，来评价BaF3/IL-21R细胞的增殖。

测量细胞增殖或者分化的试验是本领域内众所周知的。例如，测量增殖的试验方法包括对中性红染料的化学敏感性的(Cavanaugh etal.，Investigational New Drugs 8：347-354，1990，这里引用作为参考)，对放射性标记核苷酸掺入的试验(Cook et al.，AnalyticalBiochem.179：1-7，1989，这里引用作为参考)，或者对增殖细胞DNA中5-溴-2′-脱氧尿嘧啶(BrdU)掺入的试验(Porstmann et al.，J.Immunol.Methods 82：169-179，1985，这里引用作为参考)，以及使用四唑盐的试验(Mosmann，J.Immunol Methods 65：55-63，1983；Alley et al.，Cancer Res.48：589-601，1988；Marshall et al.，Growth Reg.5：69-84，1995；以及Scudiero et al.，Cancer Res.48：4827-4833，1988；所有的在这里引用作为参考)。测量分化的试验方法包括例如测量与组织、酶活性、功能活性或者形态变化的阶段特异表达相关的细胞表面标记(Watt，FASEB，5：281-284，1991；Francis，Differentiation 57：63-75，1994；Raes，Adv.Anim.CellBiol Technol.Bioprocesses，161-171，1989；所有的在这里引用作为参考)。通过这里描述的方法制备的IL-21能够促进BaF3/IL-21R细胞的增殖。

纯化的IL-21可以通过多种物理方法进行鉴定。最理想的，氨基酸分析显示所有残基的氨基酸组成在预期值正负10％范围之内。N末端序列给出了一个以甲硫氨酸开始的单一序列，且与根据IL-21表达载体预测的序列相对应。使用质谱进行全分子量分析给出了在IL-21预测分子量(15593.84Da)正负0.01％范围内的数值。使用内切蛋白酶LysC消化后进行液相层析-质谱可以用来产生一个肽图，在肽图中所有的峰全部对应于预测的IL-21中由胰蛋白酶作用产生的肽，并且在肽图中鉴定出了所有预测的IL-21的胰蛋白酶肽。肽图作图还显示二硫键成键与对一个属于IL-2家族的蛋白质进行的二硫键成键预测是一致的，还显示没有出现甲硫氨酸的氧化。

制剂

选择pH以使以下层析中观察到的降解最小化：大小排阻HPLC(形成可溶性二聚体、含量减少)、阳离子交换HPLC(虚脱酰胺化作用)、反相HPLC(通过尚不知道的途径发生的氧化和降解)。在某些实施方案中，根据缓冲液的缓冲容量、稳定性以及是否适用于注射给药等方面使用组氨酸缓冲液使pH范围为5.0到5.6。或者可以使用柠檬酸盐或琥珀酸盐缓冲液。在一个实施方案中，依据其稳定性和对冷冻干燥的适合性，选择甘露醇作为渗透压调节剂(等渗溶液)。在其他实施方案中可以使用山梨醇或者甘氨酸。可以使用氯化钠，但是较不稳定。可以使用海藻糖或蔗糖，但是它们可能在这些弱酸性条件下水解。但是制剂可以包含1毫克/毫升到100毫克/毫升的IL-21。在一个实施方案中，IL-21蛋白配制为在10mM组氨酸，4.7％w/v甘露醇，pH 5.3溶液中浓度为10毫克/毫升。产物在-20摄氏度冻存。确定一个溶液产物是否是有活力的取决于认为可以接受的规格范围，本领域内的技术人员会明确这些范围使产物回收最大化、聚集最小化、电荷不均匀性最小化、杂质最少化以及维持可接受的生物活性。当设置了二聚体＜3％(高分子量)，阳离子交换HPLC和反相HPLC的纯度范围为90％，内容物的标签含量大于90％等规格，则冷冻的溶液产物是稳定的，并且认为是合理的替代。用于静脉内快速注射给药，0.1到3毫克每千克体重的IL-21剂量一般不超过30毫升。

也可以制备冻干产物，这也在本发明的范畴内。在本发明的组合物内还可以包含其他赋形剂。例如，可以接受的赋形剂包括二糖，例如使用0.5％到10％的海藻糖和蔗糖作为稳定剂；0.001％到0.1％的聚乙二醇作为稳定剂或者润湿剂；0.001％到0.1％的表面活性剂，如Tween 20，Tween 80或TritonX-100作为稳定剂或者润湿剂；或者其他的填充剂，如0.5％到5％范围内的甘氨酸、羟乙基淀粉。

可以在加速条件下如在提高的温度(25到45摄氏度)下储存或者振荡的条件下，进行稳定性研究。例如，对IL-21制剂进行多次冻融循环，显示浓度为20毫克/毫升的制剂是稳定的。在一个实施方案中，使用pH5.25降低降解速率。但是冻干产品的最佳pH范围是4.75到7.5，而非冻干产品的pH范围为5到5.6。

本发明的组合物中还可以包含一种或者多种防腐剂，特别是在那些包装用于多种用途的组合物中。可以在本发明中使用的防腐剂包括那些通常在药物制剂中使用的防腐剂，例如对羟基苯甲酸甲酯，对羟基苯甲酸丙酯，苯甲醇，间甲苯酚，硫代水杨乙汞，苯酚，柳硫汞等等。

药用目的的IL-21组合物应该是无菌和无热源的，应该根据公认的制药步骤进行生产和包装。组合物可以以单剂量包装或者多剂量包装。组合物通常包装于密封的玻璃瓶中，具有聚四氟乙烯衬里的塞子和适当的标签。冻干的组合物可以成套包装，其中包含适当量的适宜的稀释剂，例如注射用水(WFI)或者含有5％右旋葡萄糖的注射用水。

使用以下非限制性的实施例进一步具体阐述本发明。

实施例

实施例1

实施例1表达载体pTAP237的构建

通过同源重组在pTAP186的SmaI位点处插入一个由PCR产生的连接物，由此得到质粒pTAP237。质粒pTAP186来源于质粒pRS316(一个啤酒酵母的穿梭载体)以及质粒pMAL-c2(一个来源于pKK223-2的大肠杆菌表达质粒且包含tac启动子和rrnb终止子)。质粒pTAP186包含一个卡那霉素抗性基因，该基因中的SmaI位点被破坏，而具有由位点NotI和SfiI包围的酵母ARS-CEN6和URA3序列，使得这两个序列可以被NotI酶切下来。PCR产生的连接物用合成的RBSII序列代替了pTAP186中的表达偶联序列。该序列的制备使用了100pmol的各种寡核苷酸zc29,740和zc29,741(分别如SEQ ID NO：3和4所示)以及大约5pmol的各种寡核苷酸(分别如SEQ ID NO：5和6所示)。将这些寡核苷酸由下面10个循环的PCR混和在一起：94℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，然后4℃浸泡。得到的PCR产物使用两倍体积的100％乙醇沉淀进行浓缩。沉淀重悬于10微升的水，用于重组进入由SmaI酶切的受体载体pTAP186中，产生包含合成RBSII序列的构建体。将大约1微克经PCR产生的连接物和100纳克经SmaI酶切的pTAP186载体混和，并转化酵母感受态细胞(啤酒酵母)。然后将酵母涂布于URA D平板上，室温培养约72小时。挑取一个平板上的Ura+转化子，重悬于1毫升水中，微离心以沉淀酵母细胞。细胞沉淀重悬于0.5毫升的裂解缓冲液中。提取DNA并转化大肠杆菌MC1061。根据以上公开的方法，使用20pmol的各种寡核苷酸zc29,740和zc29,741(如SEQ IDNO：3和4分别所示)进行菌落PCR以筛选克隆。对在琼脂糖凝胶上显示正确大小条带的克隆进行序列分析。正确的质粒被命名为pTAP237。

实施例2

pTAP252的构建

通过PCR扩增产生人IL-21的编码序列(如SEQ ID NO：1所示)，使用CD3+cDNA文库作为模板，以及寡核苷酸引物zc29,084和zc22,127(分别由SEQ ID NO：7和8所示)。为了优化大肠杆菌中的翻译过程，使用引物zc29,084(SEQ ID NO：7所示)在IL-21编码序列的5′端加上一个ATG起始密码子。得到的基因序列编码在N末端具有一个额外甲硫氨酸的成熟L-21(IL-21met)。最终的PCR产物通过酵母同源重组插入表达载体pTAP237(在实施例1中已描述)中(Raymond et al.，Biotechniques.26(1)：134-8，140-1，1999；美国专利6,027,442号，这里引用作为参考)。从酵母中提取表达构建体pTAP252并转化感受态大肠杆菌MC1061。通过菌落PCR鉴定卡那霉素抗性克隆。阳性克隆通过测序和转化生产宿主菌株E104或者UT5600进行证实。

实施例3

密码子优化

在大肠杆菌菌株E104中引入pTAP252表达人IL-21met，产生大约2-5％的总细胞蛋白。对IL-21编码序列中使用的密码子进行检查，显示密码子中含有过量的大肠杆菌中很少使用的密码子，CAI值为0.181。CAI是同义密码子偏好的一个统计量度，可以用于预测蛋白质表达的水平(Sharp et al.，Nucleic Acids Res.15(3)：1281-95，1987)。编码高水平表达蛋白的基因常常具有高的CAI值(＞0.6)，而具有低CAI值(＜0.2)的基因编码的蛋白质一般表达效率较低。这提示了IL-21在大肠杆菌中产量低的一个原因。此外，稀有密码子成簇聚集在信息链的后半部分，使翻译停顿、翻译提前终止以及氨基酸错误掺入的可能性很高(Kane JF.Curr.Opin.Biotechnol.6(5)：494-500，1995)。

已经证明如果在宿主内提高某些稀有tRNA的水平，则含有稀有密码子的基因的蛋白质表达水平会有显著的提高(Zdanovsky et al.，同上，2000；Calderone et al.，同上，1996；Kleber-Janke et al.，同上，2000；You et al，.同上，1999)。pRARE质粒携带编码大肠杆菌中很少使用的密码子tRNA的基因(argU，argW，leuW，proL，ileX和glyT)。这些基因在它们自身的启动子(Novy，同上)的控制下。与pRARE共表达使大肠杆菌中IL-21met的表达提高了5-10倍。与pRARE共表达还降低了大肠杆菌裂解物中截断的IL-21met的含量。这些数据提示使用更为适当的密码子重新合成编码IL21-met的基因，提供了表达大量IL-21的优化载体。

从16个重叠的寡核苷酸构建密码子优化的IL-21met编码序列：zc22,913(SEQ ID NO：9)，zc22,914(SEQ ID NO：10)，zc22,915(SEQID NO：11)，zc22,916SEQ ID NO：12)，zc22,961(SEQ ID NO：13)，zc22962(SEQ ID NO：14)，zc22,963(SEQ ID NO：15)，zc22,964(SEQID NO：16)，zc22,965(SEQ ID NO：17)，zc22,966(SEQ ID NO：18)，zc22,968(SEQ ID NO：20)，zc22,969(SEQ ID NO：21)，zc22,967(SEQID NO：19)，zc22,970(SEQ ID NO：22)，zc22,971(SEQ ID NO：23)，以及zc22,972(SEQ ID NO：24)。对这些重叠的寡核苷酸进行引物延伸，然后进行PCR扩增，产生全长的IL-21met基因，其密码子已经被优化，用于在大肠杆菌中的表达。通过酵母同源重组将最终的PCR产物插入表达载体pTAP168中。从酵母中提取表达构建体，转化感受态大肠杆菌MC1061。通过菌落PCR鉴定抗卡那霉素的克隆。阳性克隆通过测序和转化生产宿主菌株E104或者UT5600进行证实。具有优化IL-21met序列的表达载体被命名为pTAP196。将最终的PCR产物插入载体pTAP168中，用于在Tac启动子控制下的表达。但是表达非常低，产物只能使用IL-21的单克隆抗体通过蛋白质印迹分析检测到。

对IL-21met信使序列的二级结构进行检查发现了在36号到64号碱基之间(SEQ ID NO：1)有一个极其稳定的发夹结构。怀疑该结构元件阻止了IL-21met序列的有效翻译。因此通过重叠PCR产生一个杂合IL-21met编码序列。使用pTAP252作为模板和寡核苷酸引物zc29,740(SEQ ID NO：3)和zc40,133(SEQ ID NO：25)进行PCR扩增，产生的片段含有未优化的IL21-met序列的前80个碱基。使用pTAP196作为模板和寡核苷酸引物zc22,971(SEQ ID NO：23)和zc40,107(SEQ ID NO：26)进行PCR扩增，产生的片段含有优化的IL21-met区域的81到450号碱基(SEQ ID NO：27)。混和这两个PCR产物，使用寡核苷酸引物zc22,971(SEQ ID NO：23)和zc29,740(SEQ IDNO：3)，通过重叠PCR产生全长的IL-21met。最终的PCR产物通过酵母同源重组插入表达载体pTAP237中。从酵母中提取表达构建体，转化感受态大肠杆菌MC1061。通过菌落PCR鉴定抗卡那霉素的克隆。阳性克隆通过测序和转化生产宿主菌株E104或者UT5600进行证实。具有杂合IL-21met编码序列的表达载体被命名为pTAP337。

当使用未优化的IL-21met序列(SEQ ID NO：1所示)的前80个核苷酸代替了优化序列的前80个核苷酸，除去了发夹结构，得到的基因在大肠杆菌中表达得很好。使用新构建体的表达水平提高到总细胞蛋白的大约20％。

实施例4

IL-21met的表达

将大肠杆菌接种到100毫升含有0.01％Antifoam289(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和30微克每毫升卡那霉素的Superbroth II(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)培养基中，在37℃培养过夜。取10毫升接种物加入到500毫升的同样培养基中，在2升的培养摇瓶中，37℃275rpm振荡培养至培养物的OD600达到4。然后加入IPTG至终浓度为1mM，继续振荡2.5小时。在4℃4000×g离心10分钟，得到细胞。在-80℃冻存细胞沉淀，备用。

更大规模的IL-21met的表达在25毫升的培养基中于37℃培养。IPTG诱导之后2小时取1毫升的培养物。将大肠杆菌细胞重悬于等体积的BugBuster蛋白质提取试剂(Novagen，Madison，WI)中，于4℃孵育20分钟。4℃16000×g离心10分钟分离可溶性和不溶的级分。

重组的IL-21met聚集为不溶性的包含体。IL21-met从大多数大肠杆菌菌株中的回收较低。在4℃裂解细胞和孵育后20分钟内包含体内80-90％的IL-21met都丢失了。用8M尿素裂解细菌没有提高回收。但是在细胞裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，例如5mM氯化锌和0.5mM苯甲脒，抑制了来自E104株(W3110 arabinose-)的IL21-met丢失。这表明在变性条件下能够切割IL21-met的细菌蛋白酶与包含体被共同纯化出来。观察到IL-21met在UT5600的细胞裂解物中是稳定的，但是在E104的细胞裂解物中不稳定。这提示在E104中存在蛋白酶而在UT5600中没有。比较两个菌株的基因型发现在E104中存在在双碱性残基之间切割的OmpT，而在UT5600中没有。OmpT是热稳定的，即使在变性条件下也具有活性(White et al.，同上1995)。对IL-21的氨基酸序列进行检查显示其含有至少4个可能的OmpT切割位点。IL-21met还在另一个OmpT缺陷的大肠杆菌菌株BL21中显示了高度的稳定性。这些数据提示OmpT蛋白酶的活性对于IL-21的回收和稳定性是至关重要的。用大肠杆菌UT5600作为生产宿主显著地提高了IL-21met的回收。将改进构建体和宿主菌株结合起来，使整体产量由2毫克/升提高到50-100毫克/升。

实施例5

IL-21的鉴定

对于蛋白质印迹分析，在还原条件下用4-20％MES SDS NuPAGE凝胶(Invitrogen)分离蛋白质样品并转移至硝酸纤维素膜(Invitrogen)上，30伏转移1小时。使用含有5％脱脂牛奶的TTBS缓冲液(20mMTris pH 7.4，160mM氯化钠，0.1％Tween 20)封闭膜。将人IL-21特异的多克隆抗体加入到含有5％脱脂牛奶的TTBS缓冲液中孵育1小时。使用TTBS洗膜后，使用偶联HRP的山羊抗兔IgG(Bio-Rad)探测膜1小时。然后使用TTBS漂洗印迹3次，之后使用Pierce的ECL试剂进行化学发光检测。

实施例6

质粒稳定性分析

将大肠杆菌接种到25毫升含有0.01％Antifoam 289(Sigma)和30微克每毫升卡那霉素的Superbroth II(Becton Dickinson)培养基中，在37℃培养过夜。取25微升接种物加入到25毫升不含卡那霉素的同样培养基中，在25毫升细胞培养摇瓶中37℃275rpm振荡培养至OD600分别达到2、4、6和8。稀释样品并涂布于没有任何添加物质的LB琼脂培养平板上。37℃培养过夜后，将100个大肠杆菌菌落复制到一个LB琼脂平板和一个含有30微克每毫升卡那霉素的琼脂平板上。37度培养过夜后，计数每个平板上形成的菌落并进行比较。在含有卡那霉素的LB平板上长出的菌落数目与在不含抗生素的平板上长出的菌落数目之比，反映了仍然带有表达载体的细胞的百分比。

当携带pTAP337表达载体的W3110克隆在不含卡那霉素的培养基中培养12小时后，90％以上的克隆仍然带有质粒。带有不含IL-21基因的表达载体的克隆显示了相似的质粒保留。这些数据证明携带IL-21的pTAP337表达载体在W3110中是稳定的。

由于IL-21的低产率和严重的质粒不稳定性，大肠杆菌菌株TG1和MM294没有被选作生产宿主。最鼓舞人心的结果来自对使用大肠杆菌菌株W3110(ATCC编号27325)生产IL-21的研究。W3110的产率与UT5600的产率相当。质粒的稳定性研究证明表达载体pTAP337在W3110中也得到保持。UT5600是一个营养缺陷型菌株，大规模培养更为困难。这些考虑的结果就是选择了W3110作为优选的宿主菌株用于生产IL-21。

实施例7

批量发酵

使用添加5克/升甘油和25微克每毫升卡那霉素的Difco APSSuper Broth(Difco Laboratories，Detroit，MI)准备第一阶段种子摇瓶(带有挡板的500毫升摇瓶中加入100毫升培养基)。从长了24小时的琼脂平板(Luria琼脂(Difco Laboratories)，含有25微克每毫升的卡那霉素)上用接种环挑取一满环含有表达载体pTAP337(EE410)的大肠杆菌W3110，接种于摇瓶中开始培养。摇瓶中的生长在30℃下进行。摇瓶振荡的速度设置在250rpm。

使用3.0升Difco APS Super Broth加入到6升的发酵容器内并灭菌。在培养基中添加10克/升的甘油和25微克每毫升的卡那霉素。调节培养基的pH至7.2。向容器内的通气设置为1vvm，振荡速率设置为350rpm。温度设置为37℃。取生长16小时、600nm光吸收达到16的第一阶段种子摇瓶培养物接种发酵罐，接种比例为5％v/v。通过提高振荡速度保持溶解氧在20％饱和以上。

使培养物生长至OD600达到2.5(大约2.5小时)。向培养物中加入IPTG至浓度为1.0mM。继续培养3小时。

实施例8

A.补料批量发酵

使用添加5克/升甘油和25微克每毫升卡那霉素的Difco APSSuper Broth(Difco Laboratories，Detroit，MI)准备第一阶段种子摇瓶(带有挡板的500毫升摇瓶中加入100毫升培养基)。从长了24小时的琼脂平板(Luria琼脂(Difco Laboratories)，含有25微克每毫升的卡那霉素)上用接种环挑取一满环含有表达载体pTAP337(以上描述的)的大肠杆菌W3110，接种于摇瓶中开始培养。摇瓶中的培养在30℃下进行。摇瓶振荡的速度设置在250rpm。

将3.0升ZymoM生长培养基加入到6升的发酵容器内并灭菌。在培养基中添加20克/升的甘油和25微克每毫升的卡那霉素。调节培养基的pH至6.4。向容器内的通气设置为1vvm，振荡速率设置为350rpm。温度设置为32℃。取生长16小时、600nm光吸收达到16的第一阶段种子摇瓶培养物接种发酵罐，接种比例为5％v/v。通过提高振荡速度保持溶解氧在20％饱和以上。

在10小时EFT时向发酵罐中补充糖溶液。持续补充直至发酵结束。补料溶液是70％v/v的甘油溶液。根据最开始的体积，补料速率是每升每小时6克甘油。在24小时EFT时，向培养物中加入IPTG至浓度为2mM。在48小时EFT时收获发酵物。

在另一种补料批量发酵过程中，使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM准备第一阶段种子摇瓶(带有挡板的500毫升摇瓶中加入100毫升培养基)。从冻存于20％甘油中的含有表达载体pTAP337的大肠杆菌W3110中取出300微升接种于摇瓶中，开始培养。摇瓶中的培养在30℃下进行。摇瓶振荡的速度为250rpm。

将3.0升ZymoM生长培养基加入到6升的发酵容器内并灭菌。在培养基中添加20克/升的葡萄糖和25微克每毫升的卡那霉素。调节培养基的pH至6.8。向容器内的通气设置为1vvm，振荡速率设置为350rpm。温度设置为37℃。取生长16小时、600nm光吸收达到16的第一阶段种子摇瓶培养物接种发酵罐，接种比例为5％v/v。通过提高振荡速度保持溶解氧在20％饱和以上。

在10小时EFT时向发酵罐中补充糖溶液。持续补充直至发酵结束。补料溶液是60％v/v的葡萄糖。根据最开始的体积，补料速率是每升每小时9.5克葡萄糖。在24小时EFT时，向培养物中加入IPTG至浓度为2mM。48小时EFT时向培养物中加入2mmol/L的IPTG使IPTG的浓度达到4mM。在56小时EFT时收获发酵物。

表1

ZSM培养基(摇瓶和种子发酵罐)

成分	含量克/升或毫升/升
		酵母提取物	5.0
硫酸钠	2.0
		硫酸铵	2.5
氯化铵	0.5
		磷酸氢二钾	14.6
磷酸二氢钾	3.6
		dH2O	1.0升
高压灭菌后加入
		60％葡萄糖	20克/升(33毫升)
微量D溶液	3毫升
		1M硫酸镁	3毫升
卡那霉素(25毫克/毫升储液浓度)	1.0毫升

表2

用于补料发酵的60％葡萄糖溶液

成分	含量克/升
		H2O	800毫升
葡萄糖	1200克
		用水调整体积至：	2.0升
高压灭菌后加入：
		1M MgSO4(30毫升/升)	60毫升

表3

ZymoM(补料批量发酵培养基)

成分	含量克/升或毫升/升
		硫酸铵	14.0
磷酸二氢钾	2.0
		磷酸氢二钾	16.5
酵母提取物	5.5
		甘油	20.0
Antifoam AF208	0.1毫升
		浓磷酸	1.5
dH2O	1.0升
		高压灭菌后加入：
1M硫酸镁	10毫升
		微量D溶液*	17.0毫升
卡那霉素(25毫克/毫升储液浓度)	1毫升

表4

微量“D”溶液(用于ZymoM和ZSM培养基)

成分	含量克/升
		FeCl3.6H2O	6.48
ZnSO4.7H2O	1.68
		MnCl2.4H2O	1.20
Na2MoO4.2H2O	0.50
		CuSO4.5H2O	0.24
H3BO3	0.72
		浓H3PO4	48.0毫升
dH2O	1.0升

B.使用PCOL22培养基进行补料批量发酵

使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM准备第一阶段种子摇瓶(带有挡板的500毫升摇瓶中加入100毫升培养基)。从融化的冷冻保藏的含有生产菌株EE410(含有表达载体pTAP337的大肠杆菌W3110)的小管中取出300微升接种于摇瓶中，开始培养。摇瓶中的培养在32℃下进行。摇瓶振荡的速度设置为250rpm。

将2.7升PCOL22生长培养基加入到6升的发酵容器内并灭菌。冷却后在培养基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸镁、氯化钙和25微克每毫升的卡那霉素。用5N的NH₄OH调节培养基的pH至6.8。向容器内的通气设置为1vvm，振荡速率设置为350rpm。温度设置为37℃。取生长16小时、600nm光吸收达到16的EE410第一阶段种子摇瓶培养物接种发酵罐，接种比例为5％v/v。通过提高振荡速度保持溶解氧在20％饱和以上。通过加入5N的NH₄OH控制pH。

在8小时EFT时开始向发酵罐中补充葡萄糖溶液(60％w/v)。在整个发酵过程中维持恒定的补料速率，每升起始体积每小时9.5克葡萄糖。在24小时EFT时，向培养物中加入IPTG至浓度为0.5mM。48小时EFT时收获发酵物。

C.使用不含卡那霉素的PCOL22培养基进行补料批量发酵

使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM准备第一阶段种子摇瓶(带有挡板的500毫升摇瓶中加入100毫升培养基)。从融化的冷冻保藏的含有生产菌株EE410(含有表达载体pTAP337的大肠杆菌W3110)的小管中取出300微升接种于摇瓶中，开始培养。摇瓶中的培养在32℃下进行。摇瓶振荡的速度设置为250rpm。

将2.7升PCOL22培养基加入到6升的发酵容器内并灭菌。冷却后在培养基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸镁和氯化钙，不加入卡那霉素。用5N的NH₄OH调节培养基的pH至6.8。向容器内的通气设置为1vvm，振荡速率设置为350rpm。温度设置为37℃。取生长16小时、600nm光吸收达到16的EE410第一阶段种子摇瓶培养物接种发酵罐，接种比例为5％v/v。通过提高振荡速度保持溶解氧在20％饱和以上。通过加入5N的氨水控制pH在6.8。

在8小时EFT时开始向发酵罐中补充葡萄糖溶液(60％w/v)。在整个发酵过程中维持恒定的补料速率，每升起始体积每小时9.5克葡萄糖。在24小时EFT时，向培养物中加入IPTG至浓度为0.5mM。48小时EFT时收获发酵物。

D.使用PCOL22-L培养基进行补料批量发酵

使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM准备第一阶段种子摇瓶(带有挡板的500毫升摇瓶中加入100毫升培养基)。从融化的冷冻保藏的含有生产菌株EE410(含有表达载体pTAP337的大肠杆菌W3110)的小管中取出300微升接种于摇瓶中，开始培养。摇瓶中的培养在32℃下进行。摇瓶振荡的速度为250rpm。

将2.7升PCOL22-L培养基加入到6升的发酵容器内并灭菌。该培养基含有柠檬酸并且盐的含量减少了三分之一以防止沉淀。冷却后在培养基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸镁、氯化钙和25微克每毫升的卡那霉素。用5N的NH₄OH调节培养基的pH至6.8。向容器内的通气设置为1vvm，振荡速率设置为350rpm。温度设置为37℃。取生长16小时、600nm光吸收达到16的EE410第一阶段种子摇瓶培养物接种发酵罐，接种比例为5％v/v。通过提高振荡速度保持溶解氧在20％饱和以上。通过加入5N的NH₄OH控制pH在6.8。

在8小时EFT时开始向发酵罐中补充不含有硫酸镁的葡萄糖溶液(60％w/v)。在整个发酵过程中维持恒定的补料速率，每升起始每小时9.5克葡萄糖。在24小时EFT时，向培养物中加入IPTG至浓度为0.5mM。48小时EFT时收获发酵物。

E.使用PCOL22-L培养基的补料批量发酵

使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM培养基准备第一阶段种子摇瓶(带有挡板的500毫升摇瓶中加入100毫升培养基)。从融化的冷冻保藏的含有生产菌株EE410(含有表达载体pTAP337的大肠杆菌W3110)的小管中取出300微升接种于摇瓶中，开始培养。摇瓶中的培养在32℃下进行。摇瓶振荡的速度为250rpm。

将2.7升PCOL22-L培养基加入到6升的发酵容器内并灭菌。该培养基的盐含量减少了四分之一以防止沉淀。冷却后在培养基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸镁、氯化钙和25微克每毫升的卡那霉素。用5N的NH₄OH调节培养基的pH至6.8。向容器内的通气设置为1vvm，振荡速率设置为350rpm。温度设置为37℃。取生长16小时、600nm光吸收达到16的EE410第一阶段种子摇瓶培养物接种发酵罐，接种比例为5％v/v。通过提高振荡速度保持溶解氧在20％饱和以上。通过加入5N的NH₄OH控制pH在6.8。

在8小时EFT时开始向发酵罐中补充不含有硫酸镁的葡萄糖溶液(60％w/v)。在整个发酵过程中维持恒定的补料速率，每升起始的体积每小时9.5克葡萄糖。在24小时EFT时，向培养物中加入IPTG至浓度为0.5mM。48小时EFT时收获发酵物。

F.使用PCOL22-R培养基补料批量发酵

使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM培养基准备第一阶段种子摇瓶(带有挡板的500毫升摇瓶中加入100毫升培养基)。从融化的冷冻保藏的含有生产菌株EE410(含有表达载体pTAP337的大肠杆菌W3110)的小管中取出300微升接种于摇瓶中，开始培养。摇瓶中的培养在32℃下进行。摇瓶振荡的速度为250rpm。

将2.7升PCOL22-R培养基加入到6升的发酵容器内并灭菌。该培养基中酵母提取物和葡萄糖的含量提高，目的是在开始葡萄糖补料之前提高宿主菌株的生长。冷却后在培养基中添加40克/升的葡萄糖、硫酸镁、氯化钙和25微克每毫升的卡那霉素。用5N的NH₄OH调节培养基的pH至6.8。向容器内的通气设置为1vvm，振荡速率设置为350rpm。温度设置为37℃。取生长16小时、600nm光吸收达到16的EE410第一阶段种子摇瓶培养物接种发酵罐，接种比例为5％v/v。通过提高振荡速度保持溶解氧在20％饱和以上。

在8小时EFT时开始向发酵罐中补充葡萄糖溶液(60％w/v)。在整个发酵过程中维持恒定的补料速率，每升起始体积每小时9.5克葡萄糖。在24小时EFT时，向培养物中加入IPTG至浓度为0.5mM。48小时EFT时收获发酵物。

G.20L容器内的补料批量发酵

在另外一种补料批量发酵过程中，使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的3.0升ZSM培养基准备第一阶段种子容器(6升)。从融化的冷冻保藏的含有生产菌株EE410(含有表达载体pTAP337的大肠杆菌W3110)的小管中取出3.0毫升接种于摇瓶中，开始培养。通气设置在1vvm，振荡的速度为350rpm，温度设置在32℃。

使用10.8升PCOL22培养基准备20升的发酵容器内并灭菌。该冷却后在培养基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸镁、氯化钙和25微克每毫升的卡那霉素。用5N的NH₄OH调节培养基的pH至6.8。向容器内的通气设置为1vvm，振荡速率设置为350rpm。温度设置为37℃。取生长16小时、600nm光吸收达到16的EE410第一阶段种子摇瓶培养物接种发酵罐，接种比例为5％v/v。通过提高振荡速度保持溶解氧在20％饱和以上。通过添加5N NH₄OH控制培养物的pH在6.8。

在8小时EFT时开始向发酵罐中补充葡萄糖溶液(60％w/v)。在整个发酵过程中维持恒定的补料速率，每升起始体积每小时9.5克葡萄糖。在24小时EFT时，向培养物中加入IPTG至浓度为0.5mM。48小时EFT时收获发酵物。

H.使用第二阶段种子进行补料批量发酵

使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM培养基准备第一阶段种子摇瓶(带有挡板的500毫升摇瓶中加入100毫升培养基)。从融化的冷冻保藏的含有生产菌株EE410(含有表达载体pTAP337的大肠杆菌W3110)的小管中取出300微升接种于摇瓶中，开始培养。摇瓶中的培养在32℃下进行。摇瓶振荡的速度为250rpm。

使用3.0升ZSM培养基加入到6升的第二阶段种子容器内，在培养基中添加20克/升的葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素。接种100毫升来自第一阶段种子摇瓶含有生产菌株EE410的物质(含有表达载体pTAP337的大肠杆菌W3110)开始生长。向容器内的通气设置为1vvm，振荡速率设置为350rpm。温度设置为32℃。

使用10.8升PCOL22培养基准备20升的发酵容器内并灭菌。冷却后在培养基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸镁、氯化钙和25微克每毫升的卡那霉素。用5N的NH₄OH调节培养基的pH至6.8。向容器内的通气设置为1vvm，振荡速率设置为350rpm且温度设置为37度。取生长12小时、600nm光吸收达到16的第二阶段种子容器培养物接种发酵罐。接种比例为5％v/v。通过提高振荡速度保持溶解氧在20％饱和以上。通过加入5N的NH₄OH控制培养物的pH在6.8。

在8小时EFT时开始向发酵罐中补充葡萄糖溶液(60％w/v)。在整个发酵过程中维持恒定的补料速率，每升起始体积每小时9.5克葡萄糖。在24小时EFT时，向培养物中加入IPTG至浓度为0.5mM。48小时EFT时收获发酵物。

I.使用ZGOLD1进行补料批量发酵

表达载体zGOLD1的构建在实施例19中予以描述。使用添加20克/升葡萄糖和25微克每毫升卡那霉素的ZSM培养基准备第一阶段种子摇瓶(带有挡板的500毫升摇瓶中加入100毫升培养基)。从融化的冷冻保藏的含有生产菌株(含有表达载体pTAP337的大肠杆菌W3110ompT^-(ZGOLD1))的小管中取出300微升接种于摇瓶中，开始培养。摇瓶中的培养在32℃下进行。摇瓶振荡的速度为250rpm。

将2.7升PCOL22培养基加入到6升的发酵容器内并灭菌。冷却后在培养基中添加20克/升的葡萄糖、硫酸镁、氯化钙和25微克每毫升卡那霉素。用5N的NH₄OH调节培养基的pH至6.8。向容器内的通气设置为1vvm，振荡速率设置为350rpm。温度设置为37℃。取生长16小时、600nm光吸收达到16的EE410第一阶段种子摇瓶培养物进行接种，接种比例为5％v/v。通过提高振荡速度保持溶解氧在20％饱和以上。通过加入5N的NH₄OH控制培养物的pH在6.8。

在8小时EFT时开始向发酵罐中补充葡萄糖溶液(60％w/v)。在整个发酵过程中维持恒定的补料速率，每升起始体积每小时9.5克葡萄糖。在24小时EFT时，向培养物中加入IPTG至浓度为0.5mM。48小时EFT时收获发酵物。

PCOL22生产培养基

表5

成分	含量克/升或毫升/升
		(NH4)2SO4	14.0
KH2PO4	2.0
		K2HPO4	16.5
Antifoam AF208	0.1毫升
		dH2O	0.920升
		高压灭菌后加入：
1M MgSO4	10毫升
		Trace D溶液*	34.0毫升
卡那霉素(25毫克/毫升储液浓度)	1毫升
		1M CaCl2.2H2O	2毫升
葡萄糖(60％w/v)	33.0毫升

PCOL22-L培养基

表6

成分	含量克/升或毫升/升
		(NH4)2SO4	9.25
KH2PO4	1.32
		K2HPO4	10.90
柠檬酸	1.0克
		Antifoam AF204	0.1毫升
dH2O	0.920毫升
		高压灭菌后加入：
1M MgSO4	10毫升
		Trace D溶液*	34.0毫升
卡那霉素(25毫克/毫升储液浓度)	1毫升
		1M CaCl2.2H2O	2毫升
葡萄糖(60％w/v)	33.0毫升

使用PCOL22-L和PCOL 12L培养基的补料批量发酵的60％葡萄糖

表7

成分	含量克/升
		H2O	800毫升
葡萄糖(60％w/v)	1200克
		用水调整体积至：	2.0升
高压灭菌

PCOL12-R培养基

表8

成分	含量克/升或毫升/升
		(NH4)2SO4	14.0
KH2PO4	2.0
		K2HPO4	16.5
酵母提取物	20.0
		Antifoam AF204	0.1毫升
dH2O	0.920升
		高压灭菌后加入：
1M MgSO4	10毫升
		Trace D溶液*	34.0毫升
卡那霉素(25毫克/毫升储液浓度)	1毫升
		1M CaCl2.2H2O	2毫升
葡萄糖(60％w/v)	66.0毫升

PCOL12L培养基

表9

成分	含量克/升或毫升/升
		(NH4)2SO4	10.5
KH2PO4	1.50
		K2HPO4	12.4
酵母提取物	5.0
		Antifoam AF204	0.1毫升
dH2O	0.920升
		高压灭菌后加入：
1M MgSO4	10毫升
		Trace D溶液*	34.0毫升
卡那霉素(25毫克/毫升储液浓度)	1毫升
		1M CaCl22H2O	2毫升
葡萄糖(60％w/v)	33.0毫升

实施例9

IL-21的回收

A.破碎收获的细胞

收获的大肠杆菌细胞沉淀由补料批量发酵产生，其含有大约5-6克每升的以包含体的形式存在的IL-21met。发酵液(1升)在8000×g离心30分钟得到沉淀。沉淀重悬于850毫升破碎缓冲液(100mM Tris，pH 7.2，5mM氯化锌)中，在冰上冷却。在10000磅每平方英寸的压力下，使培养物三次通过APV匀浆器。然后培养物在8000×g离心30分钟。弃上清，小心保留沉淀。沉淀通过在800毫升去离子水中重悬并在8000×g离心40分钟两次进行洗涤。弃上清，并小心保留蓬松的沉淀。包含体沉淀在-80℃保藏或者不冷冻直接重折叠。

B收获培养物的直接破碎

收获的大肠杆菌培养物由补料批量发酵产生，其含有大约6-7克每升的以包含体的形式存在的IL-21met。发酵液(0.5升)用去离子水稀释至1升，在10000磅每平方英寸的压力下，使培养物三次通过APV匀浆器。然后培养物在15000×g离心30分钟。弃上清，并小心保留蓬松的沉淀。沉淀重悬于500毫升去离子水，在15000g离心30分钟。弃上清，并小心保留蓬松的沉淀。重复洗涤的步骤，包含体沉淀在-80℃保藏或者不冷冻直接重折叠。

C.溶解和沉淀

1.将洗涤好的包含体沉淀悬浮于200毫升的100mM Tris，6M盐酸胍，5mM氯化锌，pH 7.2溶液中，室温作用1小时，达到溶解的目的。悬液在12000×g离心30分钟。上清在4℃保藏。用100mM Tris，5mM氯化锌，pH 7.2的溶液将上清稀释8倍(v/v)。悬液在12000×g离心10分钟。弃上清。沉淀用200毫升的100mM Tris，8M尿素，pH 7.2的溶液重悬。悬液在12000×g离心30分钟。弃上清。再重复两次洗涤步骤。将洗涤的沉淀悬于200毫升的100mM Tris，6M盐酸胍，10mM DTT，pH 7.2中达到重溶解的目的。悬液在12000g离心30分钟。上清中的蛋白质浓度经HPLC蛋白质检测为10毫克/毫升。然后将IL-21样品存放于4℃。

2.将洗涤的包含体沉淀悬于在100mMTris pH8.0中制备的6M盐酸胍，40mM的DTT(GDT40)中达到溶解的目的。每升原始的发酵液要使用约150毫升的GDT40。溶解在室温下进行1小时。然后离心悬液。来自溶解的包含体上清通过在含有0.75M精氨酸和DTT/胱氨酸氧化还原对的重折叠缓冲溶液中稀释20至30倍进行重折叠5-16小时，此后调节混合物的pH至5.5，在纯化前进行过滤。

D.直接破碎收获自ZGOLD1的培养物

收获的大肠杆菌ZGOLD1培养物由PCOL22培养基(如上描述)中的补料批量发酵产生，其含有大约9-10克每升的IL-21met，以包含体的形式存在。发酵液(0.5升)用去离子水稀释至1升，并在10000磅每平方英寸的压力下，使培养物三次通过APV匀浆器。然后培养物在15000×g离心30分钟。弃上清，并小心保留蓬松的沉淀。沉淀重悬于500毫升去离子水，在15000×g离心30分钟。弃上清，并小心保留蓬松的沉淀。重复洗涤的步骤--沉淀重悬于500毫升去离子水，在15000×g离心30分钟。弃上清，并小心保留蓬松的沉淀。包含体沉淀在-80℃保藏或者不冷冻直接重折叠。

实施例10

A.溶解洗涤后的包含体

将洗涤好的包含体沉淀悬浮于150毫升的100mM Tris，6M盐酸胍，20mM DTT，pH 7.5，室温作用1小时，达到溶解的目的。悬液在12000×g离心30分钟。上清中的蛋白质浓度经HPLC蛋白质检测为21毫克/毫升。然后将IL-21样品存放于4℃。

B.溶解来自ZGOLD1的洗涤后的包含体

将洗涤好的包含体沉淀(来自1升发酵液)悬浮于150毫升的100mM Tris，6M盐酸胍，40mM DTT，pH 8.0的溶液中，室温作用1小时，达到溶解的目的。悬液在15000×g离心30分钟。上清中的蛋白质浓度经HPLC蛋白质检测为29毫克/毫升。然后将IL-21样品存放于4℃。

C.溶解后包含体的澄清

用固定化金属亲和层析(IMAC)树脂来澄清溶解后的IL-21包含体沉淀。在一个实施例中，洗涤后的包含体沉淀在6M盐酸胍，10mM咪唑，pH7.5的条件下室温溶解1小时。用0.5毫升的0.1M硫酸镍负载1.0毫升的His-Trap柱(Amersham Biosciences)。负载后用水洗柱，再使用5.0毫升含有6M盐酸胍、20mM咪唑、0.5M氯化钠和20mM磷酸的结合缓冲液平衡层析柱。

溶解的样品(1.0毫升)上层析柱，之后用5.0毫升结合缓冲液洗柱。向层析柱中加入2.5毫升的洗脱缓冲液(6M盐酸胍、0.5M咪唑、0.5M氯化钠和20mM磷酸盐)。重复洗脱过程，并用SDS-PAGE凝胶分析样品的纯度和澄清度。

实施例11

重折叠

A.用GSH和GSSG的复性

在溶解的级分中IL-21的浓度由反相HPLC确定为21毫克/毫升。确定重折叠缓冲液的体积是根据溶液的量以及溶液中IL-21的浓度。重折叠缓冲液(50mM Tris，10mM氯化钠，0.5mM氯化钾，2mM氯化镁，2mM氯化钙，0.05％(w/v)PEG3350，1.1M L-精氨酸，2mM GSH，1mM GSSG，pH 7.5)冷却至室温(21度)。临用前溶解GSH和GSSG。

含有IL-21的溶液(175毫升)在混和下缓慢(1.5小时)加入到重折叠缓冲液(11升)中。在重折叠混合物中加入的IL-21至终浓度为0.30毫克/毫升。温度范围是20-22度。含有重折叠混合物的容器敞口与空气接触。令重折叠进行16小时。重折叠的IL-21浓度确定为0.165毫克/毫升，这代表了55％的复性产量。

B.使用DTT和GSSG进行复性

在溶解的级分中IL-21的浓度由反相HPLC确定为15.02毫克/毫升。确定重折叠缓冲液的体积是根据溶液的量以及溶液中IL-21的浓度。重折叠缓冲液(50mM Tris，10mM氯化钠，0.5mM氯化钾，2mM氯化镁，2mM氯化钙，0.05％(w/v)PEG3350，1.1M L-精氨酸，2mM DTT，4mM GSSG，pH 7.5)冷却至室温(21度)。临用前溶解DTT和GSSG。

含有IL-21的溶液(88毫升)在混和下缓慢(1.0小时)加入到重折叠缓冲液(1L)中。在重折叠混合物中加入的IL-21至终浓度为0.50毫克/毫升。温度范围是20-22度。含有重折叠混合物的容器敞口与空气接触。令重折叠进行16小时。重折叠的IL-21浓度确定为0.27毫克/毫升，这代表了59.5％的复性产量。

C.使用半胱氨酸和胱氨酸二盐酸盐进行复性

在溶解的级分中IL-21的浓度由反相HPLC确定为18.6毫克/毫升。确定重折叠缓冲液的体积是根据溶液的量以及溶液中IL-21的浓度。重折叠缓冲液(50mM Tris，10mM氯化钠，0.5mM氯化钾，2mM氯化镁，2mM氯化钙，0.05％(w/v)PEG3350，1.0M L-精氨酸，4mM半胱氨酸，2mM胱氨酸盐酸盐，pH 7.5)冷却至室温(21度)。临用前溶解半胱氨酸和胱氨酸二盐酸盐。

含有IL-21的溶液(20.5毫升)在混和下缓慢(0.5小时)加入到重折叠缓冲液(0.78升)中。在重折叠混合物中加入的IL-21至终浓度为0.49毫克/毫升。温度范围是20-22度。含有重折叠混合物的容器敞口与空气接触。令重折叠进行21小时。重折叠的IL-21浓度确定为0.29毫克/毫升，这代表了58％的复性产量。

D.使用DTT和胱氨酸二盐酸盐进行复性

在溶解的级分中IL-21的浓度由反相HPLC确定为18.6毫克/毫升。确定重折叠缓冲液的体积是根据溶液的量以及溶液中IL-21的浓度。重折叠缓冲液(50mM Tris，10mM氯化钠，0.5mM氯化钾，2mM氯化镁，2mM氯化钙，0.05％(w/v)PEG 3350，1.1M L-精氨酸，2mMDTT，4mM胱氨酸二氯化物，pH7.5)冷却至室温(21度)。临用前溶解DTT和胱氨酸二盐酸盐。

含有IL-21的溶液(20.5毫升)在混和下缓慢(0.5小时)加入到重折叠缓冲液(0.78升)中。在重折叠混合物中加入的IL-21至终浓度为0.49毫克/毫升。温度范围是20-22度。含有重折叠混合物的容器敞口与空气接触。令重折叠进行16小时。重折叠的IL-21浓度确定为0.28毫克/毫升，这代表了58％的复性产量。

E.时间脉冲重折叠

时间脉冲重折叠提供了一种方法，将人IL-21met重折叠至终浓度为0.3-0.9毫克/毫升。在批量重折叠中，重折叠缓冲液中IL-21蛋白的终浓度优化为0.2-0.3毫克/毫升。需要高浓度的精氨酸(1M)，且重折叠步骤的产量为40％到50％。尽管根据一般的蛋白质折叠标准，这已经令人满意了，但是将IL-21met重折叠至更高的浓度仍然是非常理想的。

根据实施例4中的描述准备溶解的包含体，只是最终蛋白浓度为15毫克/毫升。使用描述的重折叠缓冲液将溶液稀释50倍。溶液在室温下搅拌3小时。在3小时结束时取样并离心。上清用HPLC分析。然后重复该过程4次。

在前三次重复中正确重折叠的IL-21met的百分比产率保持恒定，但是在第四次重复后下降。没有产量损失的最高蛋白质终浓度达到0.9毫克/毫升。在重折叠早期(＜3小时)期间高的蛋白质浓度(＞0.3毫克/毫升)由于聚集导致低产量。一旦重折叠完成(＞3小时)，可以开始加入重折叠储液，而没有产量的损失。最终的重折叠缓冲液中盐酸胍的最大浓度是0.3-0.6M。

F.在降低的精氨酸浓度中使用DTT和胱氨酸进行重折叠

在溶解的级分中IL-21的浓度由反相HPLC确定为14.53毫克/毫升。重折叠缓冲液(50mM Tris，10mM氯化钠，0.5mM氯化钾，2mM氯化镁，2mM氯化钙，0.05％(w/v)PEG3350，0.75M L-精氨酸，2mMDTT，4mM胱氨酸，pH 8.0)冷却至21℃。将胱氨酸溶解于0.25M的氢氧化钠溶液终至浓度为80mM，并在临用前加入DTT。

含有IL-21的溶液(96毫升)在混和下缓慢(1.0小时)加入到重折叠缓冲液(1.0升)中。在重折叠混合物中加入的IL-21至终浓度为0.61毫克/毫升。温度范围是14-16度。含有重折叠混合物的容器敞口与空气接触。令重折叠进行16小时。重折叠的IL-21浓度确定为0.40毫克/毫升，这代表了66％的复性产量。

G.使用DTT和胱氨酸进行的容量重折叠

容量重折叠根据的是IL-21溶液的体积而不是溶液中IL-21的浓度。在溶解的级分中IL-21的浓度由反相HPLC确定为26.1毫克/毫升。重折叠缓冲液(50mM Tris，10mM氯化钠，0.5mM氯化钾，2mM氯化镁，2mM氯化钙，0.05％(w/v)PEG3350，0.75M L-精氨酸，2mMDTT，4mM胱氨酸，pH8.0)冷却至15℃。将胱氨酸溶解于0.25M的氢氧化钠溶液至终浓度为80mM，并在临用前加入DTT。

含有IL-21的溶液(935毫升)在混和下缓慢(2.0小时)加入到重折叠缓冲液(28.0升)中。在重折叠混合物中加入的IL-21至终浓度为0.83毫克/毫升。温度范围是14-16℃。含有重折叠混合物的容器敞口与空气接触。令重折叠进行16小时。重折叠的IL-21浓度确定为0.51毫克/毫升，这代表了61％的复性产量。

H.来自ZGOLD1的洗涤过的包含体的容量重折叠

在溶解的级分中IL-21的浓度由反相HPLC确定为29.9毫克/毫升。重折叠缓冲液(50mM Tris，10mM氯化钠，0.5mM氯化钾，2mM氯化镁，2mM氯化钙，0.05％(w/v)PEG3350，0.75M L-精氨酸，2mMDTT，4mM胱氨酸，pH 8.0)冷却至15度。将胱氨酸溶解于0.25M的氢氧化钠溶液中至浓度为80mM，并在临用前加入DTT。

含有IL-21的溶液(935毫升)在混和下缓慢(2.0小时)加入到重折叠缓冲液(27.3升)中。在重折叠混合物中加入的IL-21至终浓度为0.96毫克/毫升。温度范围是14-16度。含有重折叠混合物的容器敞口与空气接触。令重折叠进行16小时。重折叠的IL-21浓度确定为0.60毫克/毫升，这代表了62.3％的复性产量。

实施例12

A.重折叠IL-21的澄清

此步骤的目的是终止重折叠反应并且从重折叠的IL-21溶液终除去颗粒物质。通常调节重折叠IL-21至pH 5.5然后通过一个1.2微米的标称滤膜。在一些情况下在过滤之前不调节pH，另一些情况下可以使用不同大小(0.45-2.0微米)的或者其他类型的滤膜。可以通过离心，使用Carr powerfuge连续离心机(Carr Separations，Inc.，Franklin，MA)或者在瓶中离心，除去颗粒物质。

重折叠后，需要降低缓冲液的电导率，才能上样至SP550C捕获树脂上。还需要过滤混浊的溶液以除去未折叠的IL-21和沉淀的大肠杆菌蛋白。在一个实施例中，含有重折叠的IL-21的29.5升重折叠缓冲液用1.4倍(42.0升)25mM乙酸盐缓冲液pH5.5稀释。令溶液在室温沉淀4小时。然后使溶液通过一个1.2-0.8微米的Cuno Zeta Plus深滤器进行过滤。

B.重折叠IL-21的稀释和澄清

这一步骤终止重折叠反应、稀释重折叠的物质使其能结合于阳离子交换层析柱，并且从重折叠的IL-21溶液中去除颗粒物质。调节重折叠IL-21的pH至5.5，然后用25mM乙酸盐缓冲液pH5.5稀释1.4倍。该溶液在室温下沉降4小时，目的是增加稀释的重折叠溶液中可溶与不溶性蛋白的物理分离。沉降并稀释的重折叠溶液通常已经没有颗粒物质，然后通常通过一个1.2-0.8微米的深滤器(Cuno Zeta PlusA30M03)。

实施例13

澄清的、重折叠的IL-21的浓缩

通过切向流过滤将澄清的、重折叠的IL-21浓缩10倍到30倍。切向流过滤装置和膜系统(Millipore Pellicon Biomax 5kDa分子量截留板(Millipore，Bedford，MA)和框架系统或者AmershamBiosciences 10kDa分子量截留中空纤维系统)用0.5M氢氧化钠清洁，然后用水润洗。对于来自1升发酵液的重折叠IL-21，使用0.2到0.3平方米的膜面积，交叉流速率大约为48升每小时，跨膜的压力是20磅每平方英寸到30磅每平方英寸。

实施例14

重折叠IL-21的捕获

A.使用TOYOPEARL SP 550 C树脂进行阳离子交换

浓缩后用阳离子交换层析柱捕获IL-21。在一个实施例中，浓缩的IL-21用水或者25mM乙酸钠pH5.5稀释3倍。室温孵育30分钟后过滤除去形成的沉淀。使用Millipore 1.2um Polysep II滤膜(Millipore)或者1.2-0.8微米Cuno Zeta Plus A30MO3膜(Cuno，Meriden，CN)。过滤后的IL-21上样于用平衡缓冲液(25mM 乙酸钠，0.2M氯化钠，pH 5.5)平衡的TOYOPEARL SP550C树脂(Tosoh Biosep)柱上。层析柱的上样量是每升树脂上6-10克IL-21，柱床高度是15厘米，监测280nm和215nm的紫外吸收。流速是150厘米每小时。上样后层析柱用平衡缓冲液洗至紫外吸收返回基线。然后使用4倍柱体积的50％平衡缓冲液和50％洗脱缓冲液(25mM乙酸钠，1.0M氯化钠，pH 5.5)的混合液洗柱。使用25％平衡缓冲液和75％洗脱缓冲液从柱上洗脱IL-21。或者在IL-21上样至层析柱上、用平衡缓冲液洗柱以后，用10倍柱体积的100％平衡缓冲液到100％洗脱缓冲液的线性梯度洗脱IL-21。

或者在调节pH、稀释、终止、用深度滤膜过滤之后，用阳离子交换层析捕获IL-21。将过滤后的溶液上样于平衡至平衡缓冲液(25mM乙酸钠，pH 5.5，0.4M氯化钠)的TOYOPEARL SP550C树脂(TosohBiosep)柱上。层析柱的上样量是每升树脂6到15克IL-21。监测280nm和215nm的紫外吸收。使用的流速是150厘米每小时。上样后层析柱用平衡缓冲液平衡至紫外吸收返回基线。用至100％洗脱缓冲液(25mM乙酸钠，pH 5.5，0.75M氯化钠)的分级梯度从层析柱上洗脱IL-21。

B.使用SP Sepharose XL树脂进行阳离子交换层析

浓缩的IL-21用25mM乙酸钠pH5.5稀释10倍。室温孵育30分钟后过滤除去形成的沉淀。使用Millipore 1.2um Polypro XI滤膜(Millipore)和然后的0.45微米Whatman Polycap 75AS滤膜(Maidstone，Kent，UK)过滤。过滤后的IL-21上样于用平衡缓冲液(25mM乙酸钠，0.2M氯化钠，pH 5.5)平衡的SP Sepharose XL树脂(Amersham Biosciences)柱上。层析柱的上样量是每升树脂上3-6克IL-21，柱床高度是15厘米，监测280nm和215nm的紫外吸收。流速是150厘米每小时。上样后层析柱用平衡缓冲液平衡至紫外吸收返回基线。然后使用4倍柱体积的25％平衡缓冲液和75％洗脱缓冲液(25mM乙酸，1.0M氯化钠，pH 5.5)的混合液洗柱。使用50％平衡缓冲液和50％洗脱缓冲液的混合液洗脱IL-21。

C.使用Streamline SP XL树脂进行阳离子交换层析

在另一个实施例中，在用阳离子交换层析捕获IL-21之前不使用切向流浓缩。重折叠之后，调节pH至5.5，然后使用1.2微米标称的截留滤膜过滤。将Amersham Biosciences Streamline SP XL树脂填充Amersham Biosciences Streamline柱用平衡缓冲液(25mM乙酸钠，0.2M氯化钠，pH 5.5)平衡。平衡后，经过过滤和调节pH的重折叠IL-21上样至层析柱上，使用在线稀释，即使用层析系统上样30％经过滤的、调节pH的重折叠IL-21和70％的水以获得正确的比例。IL-21的上样采取向上流动的方式，使用的流速使柱内树脂与固定的柱床高度相比扩张2倍。经过滤、调节pH的重折叠IL-21上样完成后，换成平衡缓冲液。然后连续向柱内泵入30％平衡缓冲液和70％的水，直至层析柱入口处记录的电导率小于10mS/cm。然后用平衡缓冲液洗柱，采取向上流动的方式，具有2倍的沉降柱床高度，平衡至280nm紫外吸收返回基线。然后停止流动，令树脂沉降。将Streamline柱的柱塞降低至沉降床高度，用2倍体积的平衡缓冲液洗柱，方向是向下流动，流速是150厘米/小时。然后用向下流动的方式，用50％平衡缓冲液和50％洗脱缓冲液(25mM乙酸钠，1.0M氯化钠，pH5.5)洗脱IL-21，流速为150厘米/小时。

实施例15

通过疏水相互作用层析进行IL-21的中间纯化

A.使用丁基Sepharose树脂进行疏水相互作用层析(HIC)

每升IL-21溶液中加入198克固体硫酸铵，使硫酸铵的浓度达到1.5M。搅拌溶液直至硫酸铵溶解，然后通过0.45微米标称的截留滤膜过滤除去固体物质。在一个实施例中，用平衡缓冲液(25mM乙酸钠，50mM氯化钠，1.5M硫酸铵，pH 5.5)平衡一个15厘米高的AmershamBiosciences丁基Sepharose 4FF柱。将调节的并过滤的IL-21溶液上样至层析柱上，上样量是每升树脂1.0-2.5克IL-21，监测280mm和215nm的紫外吸收。监测280nm和215nm的紫外吸收。流速是150厘米每小时。上样后层析柱用平衡缓冲液平衡至紫外吸收返回基线。使用50％平衡缓冲液和50％洗脱缓冲液(25mM乙酸钠，50mM氯化钠，pH 5.5)洗脱IL-21。或者在IL-21上样至层析柱上、用平衡缓冲液洗柱以后，用10倍柱体积的从100％平衡缓冲液到100％洗脱缓冲液的线性梯度洗脱IL-21。

B.使用TOYOPEARL 650M树脂进行HIC

在另一个实施例中使用一种不同的树脂Tosoh Biosep TOYOPEARL丁基650M纯化IL-21。除了以下的不同以外，该方法与使用丁基Sepharose FF树脂的方法是一样的：用3.5M硫酸铵储液调节阳离子交换的洗脱液至硫酸铵浓度为1.5M；将调节过硫酸铵浓度并过滤的IL-21溶液上样至层析柱上，上样量是每升树脂10-12克IL-21；上样后层析柱用平衡缓冲液平衡至紫外吸收返回基线；使用100％洗脱缓冲液(25mM乙酸钠，pH 5.5，0.05M氯化钠，0.15M硫酸铵)洗脱IL-21。

实施例16

A.浓缩IL-21并使用磷酸盐缓冲液进行缓冲液交换

IL-21在纯化之后进行超滤和渗滤，使其浓缩，将其缓冲液系统交换为一种适于储存的系统。使用0.5M氢氧化钠清洁切向流过滤装置和膜系统(Millipore Pellicon Biomax 5 kDa分子量截留板和框式系统)，并用水润洗。对于来自1升发酵液的纯化IL-21，使用0.1平方米或者更小面积的膜，交叉流速率为大约20-25升/小时，跨膜压力是10-15磅每平方英寸。将IL-21浓缩至大约15-20毫克/毫升，然后向渗滤体积(diavolume)为5-10的磷酸盐缓冲液pH6.0进行渗滤。经过浓缩和缓冲液交换的IL-21储存于-80℃。

B.浓缩IL-21并使用组氨酸/甘露醇缓冲液进行缓冲液交换

IL-21在用SP HP Sepharose纯化之后进行超滤和渗滤，使其浓缩，将其缓冲液系统交换为一种适于储存的系统。使用0.5M氢氧化钠清洁切向流过滤装置和膜系统(Millipore Pellicon Biomax 5kDa分子量截留板和框式系统)，并用水润洗。对于来自1升发酵液的纯化的IL-21，使用0.1平方米或者更小面积的膜，交叉流速率为大约30升/小时，跨膜压力是25磅每平方英寸。将I L-21浓缩至大约10-15毫克/毫升，然后向渗滤体积为5-10的10mM组氨酸，4.72％(w/v)甘露醇pH5.0-5.3的溶液进行渗滤。得到的溶液进行过滤除菌。

实施例17

IL-21的进一步纯化

A.使用用于精制的SP HP Sepharose树脂进行阳离子交换层析

使用SP HP Sepharose进行进一步纯化，进一步提高整体纯度。TOYOPEARL butyl 650M的洗脱液用水稀释至电导率为30mS/cm，然后使用磷酸氢二钠储液调节pH至6.0。将调节pH的溶液使用0.22微米的滤膜过滤。过滤后的物质上样到用50mM磷酸盐，pH 6.0，0.3M氯化钠平衡的层析柱上，上样量是10-15克IL-21每升树脂。使用紫外280nm和紫外215nm监测层析。上样后层析柱用平衡缓冲液洗至紫外吸收返回基线。使用20倍柱体积的至100％洗脱缓冲液(50mM磷酸盐，0.7M氯化钠，pH 6.0)的梯度洗脱IL-21。

B.阴离子交换层析

将IL-21通过阴离子层析柱去除内毒素。Amersham Biosciences QSepharose FF层析柱用平衡缓冲液(20mM Tris，pH 8.0)平衡。用平衡缓冲液调节IL-21溶液的电导率小于10mS/cm。经过调节的IL-21溶液上样于层析柱上，流速为150厘米/小时。IL-21并不结合到层析柱上，所以从流出物中收集。在其他实施例中，可以使用AmershamBiosciences DEAE Sepharose FF树脂或者Pall Mustang Q膜代替QSepharose FF纯化IL-21。在另外的实施例中，证明5.0至9.0的pH值范围可以使IL-21通过阴离子交换介质。

C.疏水相互作用层析

在其他实施例中，使用与上述应用丁基树脂不同的条件进行疏水相互作用纯化IL-21。Amersham Biosciences苯基Sepharose FF highsub，Amersham Biosciences苯基Sepharose HP以及AmershamBiosciencesSGH AD Sepharose 4FF可以在结合及流过方式中作为树脂。用50mM氯化钠，25mM乙酸钠，1.5M硫酸铵，pH 5.5的溶液平衡柱以结合IL-21。在搅拌下加入固体硫酸铵直至溶解，调节IL-21溶液的硫酸铵浓度至1.5M。调节好的IL-21溶液上样于平衡好的层析柱上，流速为150厘米/小时。监测280nm和215nm的紫外吸收。在洗柱之后，使用10倍柱体积的从100％平衡缓冲液到100％洗脱缓冲液(25mM  酸钠，50mM氯化钠，pH 5.5)的线性梯度洗脱IL-21。在流过模式中，含IL-21的溶液调节至1.0M或更低硫酸铵，并上样于用25mM乙酸钠，50mM氯化钠，1.0M硫酸铵，pH 5.5的溶液平衡的柱上。收集流出液。

在其他实施例中，使用硫酸钠而不是硫酸铵作为盐，通过疏水相互作用纯化IL-21。Amersham Biosciences苯基Sepharose FF highsub，Amersham Biosciences苯基Sepharose HP以及AmershamBiosciences丁基Sepharose 4FF可以用作为树脂。用25mM乙酸钠，50mM氯化钠，1.5M硫酸铵，pH 5.5的溶液平衡层析柱。在搅拌下加入固体硫酸铵直至溶解，调节IL-21溶液的硫酸铵浓度至1.5M。调节好的IL-21溶液上样于平衡好的层析柱上，流速为150厘米/小时。监测280nm和215nm的紫外吸收。在洗柱之后，使用10倍柱体积的从100％平衡缓冲液到100％洗脱缓冲液(25mM 乙酸钠，50mM氯化钠，pH5.5)的线性梯度洗脱IL-21。

在另一个实施例中，在装配丁基Sepharose 4FF层析柱(Amersham Biosciences)的BIOCAD 700E FPLC系统(PerseptiveBiosystems，Framingham，MA)上进行HIC FPLC流出方式。使用25mM乙酸钠，600mM氯化钠，1M硫酸铵，pH5.5平衡柱。在阳离子交换洗脱液中加入固体硫酸铵至终浓度为1M。将溶液上样于层析柱上，在流出物中收集IL-21。

D.使用金属螯合Sepharose进行固定化金属亲和层析

使用Amersham Biosciences Chelating Sepharose(Amersham)进一步纯化IL-21。将含有IL-21的阳离子交换洗脱液上样于一个负载了铜、锌或镍离子的已用25mM乙酸钠，0.8M氯化钠，pH 5.5平衡的层析柱上。使用280nm和215nm的紫外吸收监测层析。使用平衡缓冲液洗柱至基线，用10倍柱体积的至100％洗脱缓冲液(25mM乙酸钠，0.8M氯化钠，0.5M咪唑，pH 5.5)的梯度洗脱IL-21。

实施例18

A.在乙腈缓冲液中对溶解的IL-21进行反相HPLC分析

这里描述的方法用于对溶解后的包含体样品和纯化样品中的IL-21进行定量。在Agilent Technologies 1100系列HPLC系统上使用4.6×50毫米Jupiter C5层析柱(3005微米，Phenomenex)，HPLC系统上配有恒温自动进样器和恒温层析柱温箱。在柱前放置一个0.2微米的柱前滤膜。流动相A是溶于HPLC级水的0.1％三氟乙酸，且流动相B是溶于乙腈的0.1％三氟乙酸。

纯化样品的洗脱梯度/时间表如下：

表10

时间	％B
		0	5
3.5	5
		4	41
14	48
		14.5	95
17	95
		17.5	5
20	5

溶解包含体样品的洗脱梯度/时间表如下：

表11

时间	％B
		0	5
4.0	5
		5.5	40
20.0	50
		21.0	95
22.0	95
		23.0	5
30.0	5

将层析柱平衡至洗脱梯度/时间表中的初始条件，直至得到稳定的基线。

方法的参数如下：

1.流速：1毫升/分钟.

2.总的运行时间：20分钟

3.层析柱温度：40度

4.自动进样器温度：8度

5.最大层析柱压力：240巴

6.注射器吸液速度：100微升/分钟

7.注射器喷液速度：100微升/分钟

8.二极管阵列检测器数据收集波长：信号A：280nm，带宽25nm

9.二极管阵列检测器数据监测波长：信号B：215nm，带宽10nm

10.二极管阵列检测器数据参考波长：信号A：350nm，带宽25nm；信号B：350nm，带宽25nm

11.二极管阵列检测器自动平衡：运行前/运行后方式

12.峰宽响应时间：＞0.1分钟。

13.狭缝宽度：4nm

14.针洗功能：设定程序以降低盐酸胍在针和针座上的堆积。

对于未折叠的IL-21的定量，使用50mMTris，pH 7.5，6M盐酸胍，10mM DTT稀释IL-21参比标准至0.5毫克/毫升，并在40度加热20分钟。将稀释的参比标准注射入层析柱内，在10微克和50微克之间至少设5个水平(例如注射10，20，30，40和50微克)。溶解的IL-21样品在微量离心机中离心，并用50mMTris，pH 7.5，6M盐酸胍稀释，然后向层析柱内注射25微升。

对于折叠的IL-21的定量，使用磷酸盐缓冲液pH6.0稀释IL-21参比标准至1.0毫克/毫升。折叠的IL-21样品不用经过任何处理直接上HPLC。层析后对IL-21峰下的面积进行积分。构建标准曲线，从标准曲线读取样品中IL-21的浓度。

B.使用基于甲醇的反相HPLC定量IL-21

也可以使用一种15分钟的基于甲醇的RP-HPLC方法对从溶解的包含体到最终产品范围的IL-21制品进行评估。

基于甲醇的RP-HPLC分析定量IL-21的方法参数如下：

层析柱：Zorbax 300SB-CN(4.6×50毫米)，3.5微米

流动相A：0.154％三氟乙酸，HPLC级水

流动相B：0.154％三氟乙酸，甲醇

洗脱梯度/时间表

表12

时间	％B	流速(毫升/分钟)
			0	50	1.0
1.0	50	1.0
			11.0	100	1.0
12.0	100	1.0
			12.5	50	1.5
15.0	50	1.5

全程运行时间：15分钟

层析柱温度：40度

自动进样器温度：5度

注射器吸液速度：90微升/分钟

注射器喷液速度：90微升/分钟

二极管阵列监测器波长：信号A：280nm，8nm带宽

        信号B：215nm，8nm带宽

        信号C：280nm，6nm带宽(参考波长关闭)

二极管阵列数据收集波长：信号A：280nm，8nm带宽

二极管阵列参考波长：信号A和B，360nm，16nm带宽

二极管阵列自动平衡：运行前/运行后方式

峰宽响应时间：大于0.1分钟

狭缝宽度：4nm

负吸收限度：100mAu

标准曲线上样量的范围：1-20微克

最小注射体积：5微升

最大注射体积：100微升

压力限制：350巴

标准运行压力：130-220巴

实施例19

用于表达IL-21的OmpT缺陷型菌株

A.构建新型宿主菌株用于生产IL-21

目前生产IL-21的方法包括在大肠杆菌宿主W3110[F^-mcrA mcrBIN(rrnD^-rrnE)1λ^-]中的表达。尽管W3110是生产IL-21的强壮宿主，但是对于下游加工它并不是理想的宿主。细菌裂解后，IL-21在74号亮氨酸(如SEQ ID NO：28所示)位置被外膜中存在的OmpT蛋白酶切割。已知该蛋白酶还切割其他异源的重组蛋白质，包括FGF-18。IL-21的蛋白酶解在没有OmpT的菌株如BL21[F-ompT hsdSB(rB^-mB^-)gal dcm lon]中并不出现。尽管在细胞裂解过程中可以加入硫酸锌或硫酸铜以使OmpT的活性降低到最小，仍然需要对纯化方案进行设计以除去最终产物中截断的IL-21。为了使IL-21的生产过程更为简单有效，将从W3110中除去OmpT蛋白酶产生一个新的生产菌株。以下描述该新型大肠杆菌宿主菌株的构建。

B.构建质粒pCHAN1用于表达Red重组酶操纵子

使用以同源重组为基础的策略，从W3110中去除OmpT3110蛋白酶。为了有效地从大肠杆菌染色体中通过同源重组删除基因，细胞内必须具有某些具有重组酶活性的酶。为了达到这个目的，构建一个质粒，它包含来自lambda细菌噬菌体的Red重组酶操纵子。使用重组特异的引物zc43,586(SEQ ID NO：29)和zc43,587(SEQ ID NO：30)，通过PCR从lambda细菌噬菌体DNA(New England Biolab)中合成出一个含有Red重组酶基因的片段。反应中包含100pmol的两个引物zc43,586和zc43,587，10微升的10×PCR缓冲液(Boehringer Mannheim)，1微升的Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)，10微升的0.25mM三磷酸核苷酸混合物(Perkin Elmer)，且加水至终体积为100微升。PCR反应由以下步骤组成：94℃5分钟；接下来是30个循环的：94℃1分钟，50℃1分钟，和72℃1分钟；之后是72℃5分钟延伸，最后在4℃过夜。产生的1964bp的片段含有Red重组酶操纵子(SEQ ID NO：31)。SEQ ID NO：31中的核苷酸序列编码3个基因，41-514号核苷酸编码Gam(γ)，463-1245号核苷酸编码Bet(β)，且1245-1922号核苷酸编码Exo。

在酵母中通过同源重组将Red重组酶操纵子整合进一个质粒中。将感受态酵母细胞(100微升啤酒糖酵母SF838-9Da)与100纳克SmaI酶切的pTAP399(保藏于美国典型培养物保藏中心，在提交申请时未命名)、受体载体和1微克上面得到的PCR片段混和。酵母和DNA混合物被转移到0.2厘米的电穿孔小杯中，在0.75千伏(5千伏/厘米)，电阻无穷大，25微法电容时脉冲。然后在转化混合物中加入1毫升1.2M山梨醇，于30℃孵育1小时。500微升份的细胞涂布于两个URA DS平板(2％右旋葡萄糖，2％山梨醇)上，于30℃孵育两天。48小时后，将平板上的Ura⁺酵母转化子悬于2毫升水中，离心取沉淀。沉淀重悬于1毫升Qiagen P1裂解缓冲液(Qiagen)，转移至一个含有1毫升0.5毫米氧化锆/二氧化硅研磨珠(Biospec Products Inc.)的干净小管中。裂解细胞，沉降样品，取250微升的裂解物转移至新的小管中，使用Qiagen Spin Miniprep试剂盒，根据生产商的使用说明提取质粒DNA。

用1微升酵母质粒DNA提取物转化电感受态的大肠杆菌DH10B细胞(Invitrogen)。在0.1厘米的小杯中以2.0千伏、25微法、100欧姆条件下脉冲细胞。电穿孔后，向每一个样品中加入250微升SOC(2％细菌胰蛋白胨(Difco，Detroit，MI)，0.5％酵母提取物(Difco)，10mM氯化钠，2.5mM氯化钾，10mM氯化镁，10mM硫酸镁，20mM葡萄糖)。细胞在37℃复苏2小时。将整个的250微升一份的样品涂布于一块含有25毫克/升卡那霉素(Sigma)的LB平板(LB培养基(Lennox)，1.8％细菌琼脂(Difco))上。在37℃培养平板过夜。通过限制性酶切，鉴定出携带Red重组酶操纵子的单个克隆，从而证明插入片段的存在。对阳性克隆的插入片段进行测序。含有正确插入片段的质粒被命名为pCHAN1。

从pCHAN1的载体骨架上去除酵母的序列。3.0微升的质粒DNA与24.3微升水和2.7微升缓冲液H(Roche)和2.0微升NotI(New EnglandBiolabs)一起在37℃孵育过夜。5微升的过夜酶切产物与1微升6×DNA上样染料(25％Ficoll Type 400(Sigma)，0.25％溴酚蓝(EMScience)，0.25％二甲苯蓝(Kodak Biomedicals Inc.))混和，取4微升混合液在1％琼脂糖凝胶(EM Science)上电泳，证明酶切完全。14微升的过夜NotI酶切产物与4微升5×连接缓冲液(Invitrogen)和2微升连接酶(Invitrogen)混和，使质粒重新环化。连接体系在25℃孵育过夜。

重新连接的pCHAN1转化W3110。1微升pCHAN1DNA转化电感受态的W3110细胞(50微升)，使用以上描述的大肠杆菌电转化方法。复苏后，将整个250微升一份的转化混合物涂布于一块含有25毫克每升卡那霉素的LB平板上。平板在37℃孵育过夜，挑取10个产生的克隆进行进一步分析。它们培养在2.0毫升含有25微克每毫升卡那霉素的Superbroth II(Becton Dickinson)中在37℃生长过夜。第二天取1.0毫升的过夜酶切物来确证pCHAN1的存在。根据生产商的使用说明用Qiagen Spin Miniprep试剂盒提取质粒DNA。使用EcoRI(Gibco BRL)和NotI(New England Biolabs)酶切对质粒进行鉴定。选择第三号分离物用于进行接下来的实验，将其命名为EE670。

产生一个四环素片段用于在W3110中进行基因替代

选择四环素基因作为适宜同源重组进入OmpT基因座中的标记，使该基因失活。使用重组特异的引物ZG45,112(SEQ ID NO：32)和ZG45,171(SEQ ID NO：33)通过PCR从pBR322DNA(New England Biolabs)中扩增出四环素启动子::四环素(tet^p::tet)片段。反应混合物中包含100pmol的两个引物ZG45,112和ZG45,171，10微升的10×PCR缓冲液(Boehringer Mannheim)，1微升的Pwo聚合酶(BoehringerMannheim)，10微升的0.25mM三磷酸核苷酸混合物(Perkin Elmer)，加水至终体积为100微升。PCR反应的条件如下：94℃2分钟；接下来是30个循环的：94℃30秒，50℃1分钟，72℃2分钟；之后是72℃7分钟延伸，最后在4℃过夜。得到的1590bp片段带有tet^p::tet(SEQID NO：34)。

将PCR反应物上样到1％的琼脂糖制备胶上，以纯化tet^p::tet片段。从胶上切下tet^p::tet片段，置于一个0.5毫升的微量离心管中，在管的底部有一个小洞，下面有玻璃(aquarium)滤棉(FinnyProducts，Inc.，Cincinnati，OH)。将小管插到一个1.5毫升的微量离心管中，在台式离心机中于25℃14000rpm离心10分钟。将1.5毫升管底部的液体与10％(v/v)3M乙酸钠和2倍体积的100％乙醇混和。样品在-20℃放置10分钟，并在台式离心机中于4℃离心10分钟沉淀PCR片段。吸走上清，沉淀重悬于50微升水中。tet^p::tet片段的工作浓度是50纳克/升。

将PCR片段连接进入pCR4.0-BLUNT TOPO

载体(Invitrogen)中，作为基因替代实验的阳性对照。根据生产商的使用说明进行连接反应。用2微升的tet^p::tetDNA片段转化大肠杆菌DH10B细胞(Invitrogen)，使用上面描述的电穿孔转化方法。复苏后，将整个250微升转化混合物涂布于一块含有100毫克/升氨苄青霉素(Sigma)的LB平板上，平板在37度孵育过夜。

挑取10个克隆进一步分析。它们培养在2.0毫升的含有100微克/毫升氨苄青霉素的Superbroth II(Becton Dickinson)中在37℃生长过夜。第二天取1.0毫升的过夜培养物来确证pCHAN1的存在。根据生产商的使用说明用Qiagen Spin Miniprep试剂盒提取质粒DNA。使用SalI(New England Biolabs)和PstI(New England Biolabs)酶切对质粒和插入片段的方向进行鉴定。选择第1号分离物用于进行接下来的实验，将该质粒命名为pSDH185，将该克隆命名为EE686。

W3110中的基因替代：删除OmpT基因

在500毫升的SOB培养基[20克/升胰蛋白胨，5克/升酵母提取物，0.5克/升氯化钠，每升培养基加10毫升250mM氯化钾，5毫升2M氯化镁，pH7.0]中，37℃培养W3110/pCHAN1至OD600达到0.6。培养物分成4瓶125毫升的培养物。将一瓶留作未诱导的对照，其他三瓶用1mM IPTG分别诱导15分钟、30分钟或60分钟。在三个诱导孵育时间结束时，按照下面的方法对所有四瓶培养物制备感受态细胞。5000rpm离心10分钟沉淀细胞。倾倒干净上清，每份沉淀用62.5毫升冰冷的水重悬。再次离心培养物，倾倒干净上清，且各沉淀用31.5毫升冰冷的10％甘油重悬。8000rpm再次离心5分钟，倾倒干净上清，用残留的10％甘油重悬细胞沉淀。

所有的四个培养物都分成6个50微升的小份。按照以下方式转化：1)没有DNA的阴性对照，2)转化1微升(1微克/微升)pBR322(NewEngland Biolabs)阳性对照，3)转化1微升(1微克/微升)pTAP279阳性对照，4)1微升pSDH185阳性对照，5)2微升(50纳克/微升)tet^p::tet片段，以及6)4微升(50纳克/微升)tet^p::tet片段。按照上面描述的大肠杆菌转化方法电转化细胞。将所有的转化混合物涂布于含有10毫克/升四环素(Sigma)的LB平板上，而pTAP279对照涂布于含有35毫克/升氯霉素(Sigma)的LB平板上。平板在37℃培养过夜。此外，四个培养物都用水稀释至10^-6和10^-7，涂布于LB平板上，通过确定细胞数目估计重组过程的整体效率。

第二天，从培养箱内去除对照平板进行分析。在检测以前，转化tet^p::tet片段的样品继续孵育24小时。鉴定出26个最大的克隆用于进一步的分析。

ompT缺失克隆的性质鉴定

26个选择的克隆全部在含有5微克每毫升四环素的1毫升LB培养基中培养过夜。第二天，根据生产商的使用说明，用Genomic Prep DNA提取试剂盒(Amersham Pharmacia)提取26个克隆的基因组DNA。

所有克隆的基因组DNA用水稀释100倍，作为PCR分析的模板。用三组不同的PCR引物对所有的稀释样品进行检测(每个克隆作三个PCR反应)。反应混合物中包含100pmol的1号引物组中的两个引物ZG45,357(SEQ ID NO：35)和ZG45,350(SEQ ID NO：36)；或者2号引物组中的两个引物ZG45,353(SEQ ID NO：37)和ZG45,355(SEQID NO：38)；或者3号引物组中的两个引物ZG45,354(SEQ ID NO：39)和ZG45,359(SEQ ID NO：40)。100μl终体积的剩余体积由10微升的10×PCR缓冲液(Boehringer Mannheim)，1微升的Pwo聚合酶(Boehringer Mannheim)，10微升的0.25mM三磷酸核苷酸混合物(Perkin Elmer)和水组成。PCR反应的条件如下：94℃5分钟；接下来是30个循环的：94℃30秒，50℃1分钟和72℃2分钟；之后是72℃7分钟延伸，最后在4℃过夜。如果W3110中的OmpT基因被四环素基因成功替代，1号引物组应该扩增出一条1584bp的条带(SEQ ID NO：41)；2号引物组应该扩增出一条1190bp的条带(SEQ ID NO：42)。结果显示筛选的26个克隆中有25个都是ompt-。选择W3110ompT^-克隆1号和3号进行接下来的分析。

为了确证蛋白酶解活性的丧失，将IL-21与新得到的ompT-菌株的细胞裂解物以及W3110亲本的细胞裂解物一同孵育。来自ompT-菌株BL21的裂解物被用作阳性对照。将细胞接种于Superbroth II中37℃生长过夜。每一种过夜培养物取四个1毫升的小份，室温离心，根据生产商的使用说明用BugBuster(Novagen)裂解细胞。细胞裂解物在25℃与1)0.332毫克/毫升的IL-21，或者2)含有5mM氯化锌的0.332毫克/毫升的IL-21分别孵育4小时。每一个样品与等体积的含β巯基乙醇(Sigma)2％的NuPAGE 4×样品缓冲液(Invitrogen)混和。将还原后的样品在100度加热5分钟，取10微升上10％NuPAGE聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)。在变性条件下，130伏进行电泳(SDS-PAGE)，使用1×MES电泳缓冲液(Invitrogen)。根据生产商的使用说明用Simply Blue Safestain(Invitrogen)对胶进行染色。

结果表明基因替代使OmpT蛋白酶失活。在与BL21、W3110ompT^-1号菌株和W3110ompT^-3号菌株的裂解物共同孵育4小时以后，IL-21完全没有损失；而与W3110亲本的裂解物孵育后，IL-21完全降解。OmpT蛋白酶的活性被锌抑制。在与含有5mM氯化锌的裂解物共同孵育时，IL-21没有受到损失，这证明了OmpT是导致降解的原因。新构建的W3110ompT^-菌株被命名为ZGOLD1(W3110ompT^-1号菌株；(保藏于美国典型培养物保藏中心(提交申请时未命名)))以及ZGOLD3(W3110ompT^-3号菌株)。

ZGOLD1和ZGOLD3的性质鉴定

ZGOLD1和ZGOLD3与W3110亲本一同生长，以评价其生长。所有三个菌株的培养物在LB培养基中37℃生长至OD600达到1.0。每小时测定细胞密度以评价生长。每个培养物用水进行稀释(10^-6，10^-7和10^-8)，涂布于LB卡那霉素平板上(参见上面)以确定细胞数目。结果显示ZGOLD菌株的生长与W3110亲本株的生长是相当的。

为了评价转化效率，收获细胞根据以上描述制备感受态用于转化。每个菌株取一份感受态细胞，转化1)1微升pTAP337(IL-21表达质粒；ATCC No.PA-4853)，或者2)没有DNA(阴性对照)。根据以上描述进行电穿孔转化。复苏之后，每一个转化混合物涂布于含有25毫克/升卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。数据显示W3110的转化效率未受到去除opmT基因的影响。

对每个ZGOLD菌株选择转化有IL-21表达载体的10个克隆，评价其蛋白生产。克隆在Superbroth II(含有25微克/毫升卡那霉素)培养基中在37℃生长过夜。用过夜的培养物接种含有25微克/毫升卡那霉素Superbroth II的滚瓶。37℃使细胞生长。培养其中一个克隆的第二个培养物作为未诱导的对照。当每一个培养物的OD600达到1.5-2.0时，用1mM IPTG(ICN Biomedicals Inc.)诱导。继续培养这些培养物5小时。从每一个培养物中取样，用4-12％梯度NuPAGE凝胶(Invitrogen)，使用上面描述的还原条件进行SDS-PAGE分析。结果表明ZGOLD1和ZGOLD3的IL-21生产与W3110亲本株的IL-21生产是相同的。选择ZGOLD1/pTAP337的1号分离物(保藏于美国典型培养物保藏中心(提交申请时未命名))对用于IL-21生产的过程进行进一步开发。

从以上详述，可以理解尽管为了举例说明在这里已经描述了本发明的特异实施方案，但在不偏离本发明精神和范畴的前提下，可以进行多种不同的改动。因此除了附带的权利要求的限制以外，本发明是没有限制的。

Claims (18)

1.用于生产IL-21蛋白的表达载体，其包含以下操作性连接的元件：(a)原核复制起点；(b)转录起始DNA元件；(c)如SEQ ID NO：27所示的多聚核苷酸序列；以及(d)转录终止子。

2.权利要求1的表达载体，该载体还包含选择性标记。

3.用根据权利要求1或2的表达载体转化的原核宿主细胞。

4.权利要求3的宿主细胞，其中该宿主细胞是大肠杆菌菌株W3110。

5.生产IL-21蛋白的方法，包含：(a)在生长培养基中，在IL-21被表达的条件下培养根据权利要求4的宿主细胞；(b)从生长培养基中回收宿主细胞；以及(c)从宿主细胞中分离IL-21蛋白。

6.权利要求5的方法，包含：(a)在生长培养基中由补料批量发酵培养根据权利要求4的宿主细胞；(b)从生长培养基中回收宿主细胞；以及(c)从宿主细胞中分离IL-21蛋白。

7.生产IL-21蛋白的方法，包含：(a)用摇瓶在生长培养基中培养根据权利要求3或者权利要求4的宿主细胞，直至OD600达到5-20；(b)用1-12％v/v的含有宿主细胞的摇瓶培养基接种发酵容器；(c)在pH6.2到7.2的生长培养基中培养宿主细胞，其中在15小时流逝发酵时间以前将补料溶液补充到发酵容器内；(d)在20-30小时EFT时向发酵容器中加入选自异丙基硫代吡喃半乳糖苷和乳糖的诱导剂；以及(e)在48-56小时EFT时收获宿主细胞。

8.权利要求7的方法，其中所述诱导剂是浓度为0.5-2mM的异丙基硫代吡喃半乳糖苷。

9.权利要求7的方法，其中的补料溶液包含选自甘油和葡萄糖的糖，其浓度为1-40克/升生长培养基，补料的速率为每小时5-15克糖。

10.权利要求9的方法，其中甘油是40-70％v/v或者其中葡萄糖是40-70％w/v。

11.权利要求9的方法，其中甘油是70％v/v或者其中葡萄糖是60％w/v。

12.分离包含如SEQ ID NO：28所示氨基酸残基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，包含以下步骤：(a)从细胞沉淀或者细胞浆中分离出不溶于水的IL-21蛋白物质；(b)将不溶性的IL-21蛋白物质溶于包含盐酸胍和二硫苏糖醇的离液序列高的溶剂中；(c)稀释所述离液序列高的溶剂并使IL-21蛋白重折叠；以及(d)通过过滤去除未折叠的和聚集的蛋白而分离IL-21蛋白，并在阳离子交换柱上纯化重折叠的IL-21蛋白，其中分离且纯化的IL-21蛋白能够具有生物活性，其中所述IL-21蛋白由SEQ ID NO：27所示的多聚核苷酸序列编码。

13.权利要求12的方法，其中分离的IL-21蛋白其纯度至少为90％。

14.权利要求12的方法，其中分离的IL-21蛋白其纯度至少为90％，且内毒素水平为每毫克IL-21蛋白小于10个内毒素单位。

15.分离包含如SEQ ID NO：28所示氨基酸残基序列的不溶性IL-21蛋白的方法，包含以下步骤：(a)从发酵液中分离出包含不溶于水的IL-21蛋白物质的细胞沉淀或者细胞浆；(b)匀浆细胞沉淀或者细胞浆以收集包含体；(c)将不溶性的IL-21蛋白物质溶解于包含盐酸胍的离液序列高的溶剂中；(d)通过加入包含精氨酸盐和选自半胱氨酸、胱氨酸、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的氧化还原组分混合物的重折叠缓冲液而稀释所述离液序列高的溶剂；(e)通过过滤去除未折叠的和聚集的蛋白而分离出IL-21蛋白；以及(f)在阳离子交换柱上纯化重折叠的IL-21蛋白；其中分离出的和纯化的IL-21蛋白能够具有生物活性，其中所述IL-21蛋白由SEQ IDNO：27所示的多聚核苷酸序列编码。

16.权利要求15的方法，包含以下步骤：(a)从发酵液中分离出包含不溶于水的IL-21蛋白物质的细胞沉淀或者细胞浆；(b)匀浆细胞沉淀或者细胞浆以收集包含体；(c)将不溶性的IL-21蛋白物质溶解于包含盐酸胍的离液序列高的溶剂中；以及(d)通过加入包含精氨酸盐和选自半胱氨酸、胱氨酸、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽的氧化还原组分混合物的重折叠缓冲液而稀释所述离液序列高的溶剂；(e)通过过滤去除未折叠的和聚集的蛋白而分离出IL-21蛋白；(f)在阳离子交换柱上纯化重折叠的IL-21蛋白；以及(g)在疏水相互作用柱上纯化步骤(f)产生的IL-21洗脱液，其中分离出的和纯化的IL-21蛋白能够具有生物活性。

17.权利要求16的方法，包含以下步骤：(a)从发酵液中分离出包含不溶于水的IL-21蛋白物质的细胞沉淀或者细胞浆；(b)匀浆细胞沉淀或者细胞浆以收集包含体；(c)将不溶性的IL-21蛋白溶于包含6M盐酸胍，40mM二硫苏糖醇(DTT)的离液序列高的溶剂中，在室温下作用1小时；(d)将含包含体的离液序列高的溶剂向包含0.75M精氨酸，2mM DTT/4mM胱氨酸氧化还原对的重折叠缓冲液中稀释至少20倍而使溶解的包含体在溶液中重折叠；(e)用20％的乙酸调节pH至5.5并使溶液反应至少5小时；(f)用1倍到1.4倍体积的pH5.5的25mM乙酸盐稀释溶液；(g)将溶液过滤；(h)将溶液上样于事先用乙酸钠缓冲液平衡至pH5.5的树脂柱上；(i)用0.4M的氯化钠洗树脂柱；(j)用0.75M的氯化钠洗树脂柱以洗脱结合的IL-21蛋白；(k)向洗脱液中加入硫酸铵至浓度为1.5M并过滤洗脱液；(l)将洗脱液上样于事先用含有1.5M硫酸铵、0.05M氯化钠的乙酸钠缓冲液平衡的Tosohaas丁基650-M柱上；(m)用含有0.15M硫酸铵、0.05M氯化钠的乙酸钠缓冲液洗柱；(n)用水将洗脱液稀释至电导率为30mS/cm；(o)将洗脱液上样于用乙酸钠缓冲液平衡的SP SepharoseHP柱上；(p)用20倍柱体积的0.3到0.7M氯化钠溶液的线性梯度洗柱；(q)浓缩IL-21蛋白；以及(r)使用切向流超滤将缓冲液更换为制剂缓冲液。

18.根据权利要求12、13或者14的方法，其中的生物活性是用IL-21受体结合细胞测定法测量的。