CN1721435A

CN1721435A - 番茄rna病毒寄主因子及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1721435A
Application number: CN 200510076654
Authority: CN
Inventors: 陈保善; 蒙姣荣
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2005-06-13
Filing date: 2005-06-13
Publication date: 2006-01-18
Anticipated expiration: 2025-06-13
Also published as: CN100368434C

Abstract

本发明公开了一种番茄RNA病毒寄主因子及其编码基因与应用。其目的是提供一种番茄RNA病毒寄主因子及其编码基因与其在植物抗病毒育种上的应用。该番茄RNA病毒寄主因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有支持病毒复制作用的蛋白质。通过转反义基因片段或RNA干扰的方法沉默植物体内的该蛋白的编码基因可得到抗病毒的植物。本发明的番茄RNA病毒寄主因子基因ToTOM3及其抑制该基因表达的方法，在抗病毒植物培育和育种中具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

Description

番茄RNA病毒寄主因子及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中的蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种番茄RNA病毒寄主因子及其编码基因与其在植物抗病毒育种上的应用。

背景技术

番茄是一种重要的水果型蔬菜。在其生长发育过程中，容易受到各种病害的危害，其中以病毒性病害最为严重。目前报道的侵染番茄的病毒大多数是RNA病毒，其中最常见的RNA病毒有7种，即黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)、烟草花叶病毒(Tabacco mosaic virus，TMV)、番茄花叶病毒(Tomato mosaic virus，ToMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus，TBSV)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus，TAV)和番茄褪绿斑病毒(Tomatochlorotic spot virus，TCSV)。

植物病毒病是造成农业生产重大损失的重要病害之一。由于病毒是严格的专性寄生物，至今还没有严格选择性的化学药剂用于植物病毒病的防治。在生产实践中主要以清除毒源、切断病毒的传播途径如用化学药剂杀灭介体昆虫和种植抗病品种等预防性措施来控制病毒病的危害，其中以种植抗病品种最为经济有效。然而，常规的抗病育种方法过程繁琐，需要大量的人力物力，更重要的是抗病基因常与不良农艺形状基因连锁，难以达到抗病优质的生产要求；另一方面，抗性基因资源的缺乏也限制了常规育种方法的应用。植物基因工程在育种上的应用为植物病毒病的防治开辟了新的途径。目前获得抗病毒转基因植株的方法主要有两种：一是将来源于病毒自身的基因或基因的调控序列(如病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因及其片段、运动蛋白基因及其3’或5’端非编码区、病毒反义RNA、核酶基因以及病毒卫星RNA等)导入受体植物，从而获得病毒起源的抗性(pathogen-derived resistance)的抗病毒植株(Lomonossoff G.P.，1995.Pathogen-derived Resistance to Plant Viruses，Annu.Rev.Phytopathol.，33：323-343)。然而，这些转基因植物在抗病毒功能方面存在一定的局限性，如特异性高，甚至出现株系专化性等，而且还存在生物安全性等潜在的危险因素；另一种方法是利用植物本身的抗病基因(如N基因)来获得抗病毒植物(Goldbach R.，Bucher E.，and Prins M.2003.Resistance mechanisms to plantviruses：an review.Virus Research.，92：207-212)，但是，迄今为止，经克隆和鉴定的植物抗病毒基因仅有少数几个，限制了这一策略的进一步发展。

病毒侵入细胞后，在寄主细胞内复制增殖并造成系统侵染需经历以下过程：病毒的脱衣壳、病毒的基因组复制及蛋白质的合成、新的病毒颗粒的组装及病毒粒子在细胞中和细胞间的运输等。在此过程中，寄主细胞提供给病毒的一切便利条件被称为寄主因子(Host Factors)，也称寄主蛋白(host proteins)或细胞蛋白(cellularproteins)。寄主细胞内如果缺少这些寄主因子，病毒便不能复制或复制的效率大大降低(Ahlquist P.，Noueiry，A.O.，and Lee，W.M.，et al.，2003.Host Factor inPositive-Strand RNA Viruses Genome Replication.Journal ofVirology，77(15)：8181-8126.)。因此，通过抑制或沉默寄主细胞中支持病毒复制的基因，将有可能使其不支持病毒在寄主细胞内的复制和维持，从而获得广谱性的抗病毒植株。因此，对病毒寄主因子基因的研究，为抗病毒基因工程提供了一条新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种番茄RNA病毒寄主因子及其编码基因。

本发明所提供的番茄RNA病毒寄主因子，名称为ToTOM3，来源于番茄属番茄(Lycopersicon esculentum Miller)，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有支持病毒复制作用的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：1由295个氨基酸残基组成。包含多个高疏水性的区域，推测该蛋白是一种具有7个跨膜结构域的跨膜蛋白，与拟南芥AToTOM3在氨基酸水平上的同源性为76.9％。

编码序列表中SEQ ID №：1蛋白质序列的多核苷酸也属于本发明的保护范围。

番茄RNA病毒寄主因子的编码基因(ToTOM3)包括番茄RNA病毒寄主因子的cDNA基因和番茄RNA病毒寄主因子的基因组基因。其基因组基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID №：2由8129个碱基组成，具有11个外显子和10个内含子，自5′端的第1245-1487位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端的第3519-3609位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第3765-3817位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端的第3895-3987位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端的第4065-4136位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5′端的第4791-4863位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5′端的第4939-4984位碱基为该基因组基因的第七个外显子，自5′端的第6259-6322位碱基为该基因组基因的第八个外显子，自5′端的第6403-6456位碱基为该基因组基因的第九个外显子，自5′端的第6790-6867位碱基为该基因组基因的第十个外显子，自5′端的第7730-8129位碱基为该基因组基因的第十一个外显子，自5′端的第1317-1319位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端的第7821-7822位碱基为该基因组基因的终止密码子TGA；自5′端的第1488-3518位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端的第3610-3764位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5′端的第3818-3894位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5′端的第3988-4064位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5′端的第4137-4790位碱基为该基因组基因的第五个内含子，自5′端的第4864-4938位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5′端的第4985-6258位碱基为该基因组基因的第七个内含子，自5′端的第6323-6402位碱基为该基因组基因的第八个内含子，自5′端的第6457-6789位碱基为该基因组基因的第九个内含子，自5′端的第6868-7729位碱基为该基因组基因的第十个内含子。

其cDNA序列，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

序列表中的SEQ ID №：3由1282个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′端第73-957位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

上述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

含有上述番茄RNA病毒寄主因子编码基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌以及扩增番茄RNA病毒寄主因子编码基因中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗病毒植物的方法。

本发明所提供的培育抗病毒植物的方法，是将ToTOM3的反义RNA或ToTOM3的RNA干扰表达载体导入植物中，得到转基因植株。

可按照植物基因工程领域中的常规方法，将ToTOM3的反义RNA或ToTOM3的RNA干扰表达载体导入转化植物细胞或组织，如农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法等。被转化的植物宿主可为茄科、十字花科或葫芦科的植物。

本发明所提供的番茄RNA病毒寄主因子ToTOM3是一种RNA病毒在植物体内存活的相关蛋白，通过转反义RNA或RNA干扰载体的方法沉默植物体内的该RNA病毒寄主因子基因可得到抗病毒的植物。实验证明，与非转基因植株相比，转ToTOM3反义RNA和RNA干扰载体的转基因番茄植株CMV和TMV的积累量显著减少，发病时间明显推迟，甚至无症状表现，表明番茄ToTOM3是CMV和TMV的一个寄主因子基因，通过抑制或沉默ToTOM3可获得抗CMV和TMV的植物品种。本发明的番茄RNA病毒寄主因子基因ToTOM3及抑制该基因表达的方法，在抗病毒植物的培育和育种中具有较大的实际意义和广阔的应用前景。

附图说明

图1为ToTOM3的3’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为含有ToTOM3的3’RACE PCR片段的克隆载体的酶切鉴定结果

图3为ToTOM3的5’RACE产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图4为含有ToTOM3的5’RACE PCR片段的克隆载体的酶切鉴定结果

图5为ToTOM3的PCR扩增片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图6为番茄总DNA与ToTOM3的PCR扩增片段(探针)的Southern杂交结果

图7为用菌落原位杂交法获得的阳性克隆

图8为ToTOM3基因组基因3’端片段PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图9为连接ToTOM3基因组基因3’端片段的重组质粒的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图10为PCR扩增的ToTOM3全长基因组基因片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图11为ToTOM3全长基因组片段重组质粒的酶切鉴定

图12为ToTOM3反义RNA表达质粒的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图13为反义RNA表达质粒的PCR鉴定结果

图14为PCR扩增获得RNAi(A)片段

图15为RNA干扰质粒pUToT3R(A-)的BglII和SpeI双酶切鉴定结果

图16为RNA干扰质粒pUToT3R(A)SalI和XhoI双酶切鉴定结果

图17为RNA干扰表达质粒pBIToT3R(A)的BglII酶切鉴定结果

图18为RNA干扰表达质粒pBIToT3R(A)的PCR鉴定结果

图19为BglII和SpeI双酶切pTTOM3-3获得的RNAi(B)片段的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图20为RNA干扰质粒pUToT3R(B-)BglII和SpeI双酶切鉴定结果

图21为RNA干扰质粒pUToT3R(B)的SalI和XhoI双酶切鉴定结果

图22为重组RNA干扰表达质粒pBIToT3R(B)的BglII酶切鉴定结果图23为重组RNA干扰表达质粒pBIToT3R(B)的PCR鉴定结果

图24为转反义RNA表达质粒pBIToT3(A)转基因番茄的PCR检测结果

图25为转反义RNA表达质粒pBIToT3(A)转基因番茄(总DNA BamHI单酶切)Southern杂交分析结果

图26为转RNA干扰质粒pBIToT3R(A)转基因番茄的PCR检测结果

图27为8B.转RNA干扰质粒pBIToT3R(A)的转基因番茄(总DNAEcoRI单酶切)Southern杂交分析结果

图28为9A.转RNA干扰质粒pBIToT3R(B)转基因番茄的PCR检测结果

图29为9B.转RNA干扰质粒pBIToT3R(B)的转基因番茄(总DNA EcoRII单酶切)Southern杂交分析结果

图30A为接种TMV 10天转基因番茄苗的症状

图30B为接种TMV 10天非转基因番茄苗的症状

图30C为接种CMV 10天转基因番茄苗的症状

图30D为接种CMV 10天非转基因番茄苗的症状

图31A为接种TMV 90天转基因番茄苗的症状

图31B为接种TMV 90天非转基因番茄苗的症状

图31C为接种CMV 90天转基因番茄苗的症状

图31D为接种CMV 90天非转基因番茄苗的症状

图32为植物表达载体pBI121的物理图谱

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用番茄品种为购自广西农科院的“超级大明星”。

实施例1、番茄寄主因子基因ToTOM3的全长cDNA序列的克隆

1、ToTOM33’端cDNA的克隆

根据GenBank搜寻到的与拟南芥ATOM3(gi：15425640)具有一定同源性的番茄EST序列BI923910(250nt)(gi：16225384)设计两条正向引物扩增ToTOM3 3’端的cDNA序列，引物序列如下：

ttom3-1：5’-CGGAGATGGTTGTAGGCCCG-3’；

ttom3-A：5’-TGAATGATGCAATCAATTGG-3’

利用3’RACE System for Rapid Ampiication of cDNA Ends试剂盒(Invitrogen公司，目录号18373-027)合成ToTOM33’端的cDNA。提取番茄的总RNA，反转录合成其第一链cDNA，反应体系及反应条件为：8μL ddH₂O(RNase-Free)，1μL AP(10μM)(AP：5’-GCCACGCGTCGACTAGTACT(T)₁₆-3’)，3μL番茄总RNA(约5μg)和1μL dNTP(10mM)，混匀后，72℃水浴10分钟，迅速置冰上5分钟，然后再加入4μL 5×第一链缓冲液和2μL 0.1M DTT，混匀，42℃水浴3min后，加入1μL SuperScript II RT(Invitrogen公司)，42℃反应1小时。反应结束后，70℃加热15min使转录酶失活。以反转录合成的第一链cDNA为模板，在引物ttom3-1和上述试剂盒提供的引物AUAP：5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’的引导下，进行第一次PCR，再以第一次PCR产物为模板，在引物ttom3-A和引物AUAP的引导下，进行第二次PCR，反应结束后对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道M：100bp DNA Ladder泳道1：ToTOM3的3’RACE PCR产物)，表明扩增出一条长度约1200bp的特异性条带，与预期结果相符。回收该特异性PCR产物，利用TOPO TA Cloning Kits(Invitrogen公司)对3’RACE PCR产物进行克隆，反应体系为：2μL PCR产物，0.5μL Salt Solution和0.5μL pCR 2.1-TOPO载体。将反应液置于室温下反应30分钟将目的片段与载体pCR 2.1-TOPO连接，然后将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后挑选白色单菌落提质粒，用限制性内切酶EcoR I进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图2所示(泳道M：GeneRuler 1kb DNA ladder，泳道CK1：载体pCR2.1-TOPO的EcoRI酶切产物，泳道CK2：ToTOM3的3’RACE PCR片段，泳道1-3：重组质粒的EcoR I酶切产物)，表明克隆到的长度约1200bp的ToTOM3的3’RACE PCR片段已正确插入到载体pCR 2.1-TOPO中，将该重组载体命名为pCToT3-3。对pCToT3-3进行DNA序列测定，测序结果表明所插入的DNA片段长度为1149bp，具有序列表中SEQ ID №：3的自5’端第134-1282位的DNA序列，该DNA片段的3’端具有长度为15个碱基的poly(A)尾。

2、ToTOM3 5’端cDNA的克隆

根据GenBank搜寻到的与拟南芥ATOM3(gi：15425640)具有一定同源性的番茄EST序列BI923910(250nt)(gi：16225384)设计两条反向引物扩增ToTOM3 5’端的cDNA序列，引物序列如下：

ttom3-2：CCATTCACAAAGAAATTGAG；

ttom3-B：GAGCAACGACGGCGACAACGCCGTAGAG

利用SMART^TM RACE cDNA Amplification试剂盒(Clontech公司，目录号K1881-1)合成ToTOM3 5’端的cDNA。提取番茄的总RNA，反转录合成其第一链cDNA，反应体系及反应条件为：3μL番茄总RNA(1μg/μL)，1μL 5’-CDS引物(5’-(T)₂₅N_-1N-3’)(10μM)和1μL SMART II A Oligo(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3’)(10μM)，混匀后，72℃水浴2分钟，迅速置冰上2分钟，然后再加入2μL 5×第一链缓冲液，1μL 20mM DTT，1μL 10mM dNTP Mix和1μL Power Script反转录酶，混匀，42℃水浴反应90分钟，加入100μL Tricine-EDTA缓冲液，72℃水浴7分钟，然后置冰上，停止反应。以反转录合成的第一链cDNA为模板，在引物ttom3-2和上述试剂盒提供的引物UPM：5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’的引导下，进行第一次PCR，再以第一次PCR产物为模板，在引物ttom3-B和引物NUP：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’的引导下，进行第二次PCR，反应结束后对PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图3所示(泳道M：1kb DNA Ladder，泳道1：ToTOM3的5’RACE PCR片段)，表明扩增出一条长度约250bp的特异性条带，与预期结果相符。回收该特异性PCR产物，利用TOPO TA Cloning Kits对5’RACE PCR产物进行克隆，首先将目的片段与载体pCR2.1-TOPO连接(反应体系及反应条件同步骤1中ToTOM33’端cDNA的克隆)，然后将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后挑选白色单菌落提质粒，用限制性内切酶EcoR I进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图4所示(泳道M：GeneRuler 1kb DNA ladder，CK1：5’RACE PCR片段，CK2：pCR2.1-TOPO(3913bp)，泳道1-5：连接有5’RACE PCR片段的重组质粒的EcoR I酶切产物)，表明克隆到的长度约250bp的ToTOM3的5’RACE PCR片段已正确插入到载体TOPO中，将该重组载体命名为pCToT3-5。对pCToT3-5进行DNA序列测定，测序结果表明5’RACE PCR片断的长度为241bp，具有序列表中SEQ ID №：3的自5’端第1-241位核苷酸的DNA序列。

3、ToTOM3全长cDNA的获得

对步骤1和步骤2获得的ToTOM3的5’RACE PCR片段和3’RACE PCR片段进行序列分析，分析结果表明5’RACE PCR片段的自5’端第148位碱基处有一个限制性内切酶Mun I的酶切位点与3’RACE PCR片断重叠。在载体pCToT3-5上有一个Xba I酶切位点，利用Mun I和Xba I两个酶切位点将3’RACE和5’RACE的cDNA连接起来，得到ToTOM3的全长cDNA。对该全长cDNA进行测序，测序结果表明该序列具有序列表中SEQ ID №：3的核苷酸序列，序列表中SEQ ID №：3由1282个核苷酸组成，3’端具有长度为15个碱基的poly(A)尾。用Vector NTI软件对ToTOM3全长的cDNA序列进行序列分析，分析结果表明其开放阅读框架(ORF)为自5’端第73-957位碱基，其5’端非编码区长度为72个碱基，3’端非编码区长度为307个碱基，编码序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列，序列表中的SEQ ID №：1由295个氨基酸残基组成，将ToTOM3与拟南芥AtTOM3编码的氨基酸残基序列进行同源性比较，ToTOM3与拟南芥AtTOM3在氨基酸水平上的同源性为76.9％。用Kyte & Doolittle的方法(Kyte &Doolittle，A simple method for displaying the hydropathic character of a protein，Journal Molecular Biology，157(1)：105-132)对ToTOM3编码的蛋白质的疏水性进行分析，结果表明ToTOM3编码的蛋白质具有高疏水性的区域，用在线软件TMPred(http：//www.ch.embnet.org/cgi-bin/TMPREN-FORM-PARSER)进行跨膜结构区预测，推断该蛋白是一种具有7个跨膜结构域的跨膜蛋白。

实施例2、ToTOM3基因组基因的克隆

根据已获得的ToTOM3的全长cDNA序列设计引物扩增ToTOM3的基因组序列，引物序列如下：

ttom3-1：5’-CGGAGATGGTTGTAGGCCCG-3’；

ttom3-2：5’-CCATTCACAAAGAAATTGAG-3’

以番茄总DNA为模板，在引物ttom3-1和引物ttom3-2的引导下，进行PCR扩增，反应结束后对PCR进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示(泳道M：1KbDNA Marker，泳道1：PCR扩增的ToTOM3的基因片段)，表明扩增出一条大小约2.3kb的ToTOM3的基因片段，对该DNA片段进行测序，测序结果表明该片段包含ToTOM3的部分序列。将番茄总DNA用限制性内切酶EcoR V进行酶切，酶切产物经0.7％琼脂糖凝胶电泳后转移到尼龙膜上，与用³²P标记的上述PCR扩增的2.3kb的DNA片段进行Southern杂交检测，结果如图6所示(泳道M：1Kb DNA Marker，泳道1：杂交条带)，表明获得了大小约6.5kb的杂交带。用限制性内切酶EcoRV对番茄总DNA进行酶切，经0.7％琼脂糖凝胶电泳分离，回收大小为6.0-6.5kb的片段，将这些回收的DNA片段克隆到经EcoRV酶切并且去磷酸化的载体pSL118(Promega公司)中，转化大肠杆菌DH5a，得到番茄基因组DNA EcoR V酶切产物的部分基因文库。采用菌落原位杂交的方法筛选约10000个转化子，获得一个阳性克隆(图7)，命名为pSLToT3-6K，双向双链测定该阳性克隆的DNA序列，结果表明该EcoR V酶切片段的大小为6533bp，具有序列表中序列表中SEQ ID №：2的自5’端第1-6533位的核苷酸序列。以番茄总DNA为模板，在引物ttom3-RNAi-1F：CCTCAGATCTGGGCTGAGATATACTAC和引物ttom3-G2：GAGAACAACGTGAAGTTTCAGGAG的引导下，PCR扩增ToTOM3基因组基因的3’端片段，反应结束后对PCR进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图8所示(泳道M：1KbDNA Marker，泳道1：PCR产物)，表明获得了大小约为4.0kb的特异性条带。回收该特异性扩增产物，将其与T载体pCR2.1-TOPO连接，对连接产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图9所示(泳道CK：pCR2.1-TOPO，泳道1-3：连接ToTOM3基因组基因3’端片段的重组质粒)，得到3种比对照pCR2.1-TOPO大的重组载体，对泳道1和泳道3的重组载体进行双向双链DNA序列测定，结果表明该PCR产物的大小为4165bp，具有序列表中SEQ ID №：2的自5’端第3965-8129位的核苷酸序列，其中，自5’端第5595位碱基处为限制性内切酶Sac I的酶切位点，在载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)的序列上有一个BamHI酶切位点，利用这两个酶切位点将上述大小为6533bp和4165bp的两段DNA片段连接起来，得到番茄ToTOM3的全长基因组基因片段，测序结果表明其基因组基因具有序列表中SEQ ID №：2的核苷酸序列，序列表中的SEQ ID №：2由8129个碱基组成，具有11个外显子和10个内含子，自5′端的第1245-1487位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端的第3519-3609位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端的第3765-3817位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5′端的第3895-3987位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5′端的第4065-4136位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5′端的第4791-4863位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5′端的第4939-4984位碱基为该基因组基因的第七个外显子，自5′端的第6259-6322位碱基为该基因组基因的第八个外显子，自5′端的第6403-6456位碱基为该基因组基因的第九个外显子，自5′端的第6790-6867位碱基为该基因组基因的第十个外显子，自5′端的第7730-8129位碱基为该基因组基因的第十一个外显子，自5′端的第1317-1319位碱基为该基因组基因的起始密码子ATG，自5′端的第7821-7822位碱基为该基因组基因的终止密码子TGA；自5′端的第1488-3518位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端的第3610-3764位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5′端的第3818-3894位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5′端的第3988-4064位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5′端的第4137-4790位碱基为该基因组基因的第五个内含子，自5′端的第4864-4938位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5′端的第4985-6258位碱基为该基因组基因的第七个内含子，自5′端的第6323-6402位碱基为该基因组基因的第八个内含子，自5′端的第6457-6789位碱基为该基因组基因的第九个内含子，自5′端的第6868-7729位碱基为该基因组基因的第十个内含子。

实施例3、转基因番茄植株的获得

一、植物表达载体的构建

1、含ToTOM3反义RNA的植物表达载体的构建

根据番茄ToTOM3的全长cDNA的5’端和3’端非编码区序列设计引物，引物序列如下：

ttom3-F：GTGAGTTTGATTTTGGAATCTCCG；

ttom3-G2：GAGAACAACGTGAAGTTTCAGGAG

以番茄总DNA为模板，在引物ttom3-F和引物ttom3-G2的引导下，PCR扩增ToTOM3全长基因组基因片段，反应结束后对PCR进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图10所示(泳道M：1Kb DNA Marker，泳道1：PCR产物)，表明扩增到一条约6.5kb的特异性条带。回收该特异性PCR产物，将其与载体pCR2.1-TOPO(Invitrogen公司)连接，结果获得了3种比对照pCR2.1-TOPO大的重组质粒，进一步用限制性内切酶BamH I和Xho I对其进行酶切，将酶切产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图11所示(泳道M：1Kb DNA Marker，泳道1-3：重组质粒，泳道CK1：pCR2.1-TOPO的BamH I和XhoI酶切产物，泳道CK2：ToTOM3全长基因组基因的PCR产物)，表明3组重组质粒均含大小为6.5kb的外源DNA片段。对泳道2和泳道3所示的克隆用正向和反向通用引物M13F和M13R进行测序，测序结果表明扩增得到的6.5kb的PCR产物为ToTOM3的基因组DNA，且均正向插入(通用引物M13F测序序列与ToTOM35’端cDNA序列对应)，将重组质粒命名为pCToT3-6K。用限制性内切酶Xho I对pCToT3-6K进行酶切，经T₄聚合酶补平后，再用BamH I进行酶切，回收6.5kb的外源DNA片段，将其定向克隆到经限制性内切酶Sma I和BamH I酶切的载体pBI121(Clontech)上，转化大肠杆菌，挑选长出的单菌落在含卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中振荡培养过夜，提质粒，对所提质粒进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图12所示(泳道CK：pBI121，泳道1-2：重组表达质粒)，得到2个比对照pBI121大的条带。以所提质粒为模板，在引物ttom3-F和引物ttom3-G2的引导下进行PCR鉴定，反应结束后对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图13所示(泳道M：1Kb DNA Marker，泳道CK：pBI121，泳道1-2：重组表达质粒)，扩增出了6.5kb的特异性条带，表明全长ToTOM3已插入到载体pBI121上，将重组质粒命名为pBIToT3-A。

2、ToTOM3的RNA干扰质粒pBIToT3R-A的构建

根据番茄ToTOM3的全长cDNA序列设计一对引物扩增ToTOM3的小干扰RNA的编码基因，引物序列如下：

ttom3-RNAi-1F：5’- CCTCAGATCTGGGCTGAGATATACTAC-3’(划线部分碱基为限制性内切酶Bgl II识别位点)；

ttom3-RNAi-1R：5’- TCTCACTAGTAGAGGAGAAATCCCAATG-3’(划线部分碱基为限制性内切酶Spe I识别位点)。

以ToTOM3的3’RACE克隆质粒pTTOM3-3为模板，在引物ttom3-RNAi-1F和引物ttom3-RNAi-1R的引导下进行PCR扩增，并使扩增产物的两端分别添加上限制性内切酶Bgl II和Spe I识别位点。对PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图14所示(泳道M：100bp DNA ladder，泳道1：PCR产物)，得到大小约200bp的特异片段(RNAi(A)片段)。用限制性内切酶BglII和SpeI双重酶切获得的PCR产物并与经相同酶双酶切的RNA干扰质粒pUCGA(构建方法：以马铃薯总DNA为模板，在引物GA-F：5’-AGG GAGCTC CTCGAG ACTAGT AGATCTGGTACGGACCGTACTACTCTATTCG-3’(划线部分碱基依次为限制性内切酶Sac I、Xho I、Spe I和Bgl II的识别位点)和引物GA-R：5’-AGGGGATCCCTATATAATTTAAGTGGAAAAAAAGGTTAAC-3’(划线部分碱基为限制性内切酶BamHI的识别位点)的引导下进行PCR扩增，得到马铃薯GA20氧化酶基因的第一个内含子片段(199bp)，对该片段用Sac I和BamH I酶切，与经同样酶双酶切的载体pUC18(TaKaRa公司)连接，将获得的重组载体命名为pUCGA)连接，将连接产物转化大肠杆菌，涂布在含氨苄青霉素(100mg/L)的LBA培养基上培养12-24小时。挑选长出的3个单菌落在含氨苄青霉素(50mg/L)的LB液体培养基中振荡培养12-24小时，提取重组质粒并用限制性内切酶Bgl II和SpeI进行酶切鉴定，结果如图15所示(泳道M：100bp DNA ladder，泳道CK1：RNAi(A)片段，泳道CK2：pUCGA，泳道1-3：重组质粒)，酶切释放出长度约200bp的片段，表明PCR扩增的RNAi(A)片段已插入到pUCGA载体中，将该重组质粒命名为pUToT3R(A-)。用限制性内切酶Xba I和BamH I对pUToT3R(A-)进行双酶切，然后与经限制性内切酶Bgl II和SpeI双酶切的RNAi(A)片段连接。将连接产物转化大肠杆菌，涂布在含氨苄青霉素(100mg/L)的LBA培养基上培养12-24小时。挑选3个单菌落在含氨苄青霉素(50mg/L)的LB液体培养基中振荡培养过夜，提取质粒并用限制性内切酶SalI和XhoI进行酶切鉴定，结果如图16所示(泳道M：1kb DNA ladder，泳道CK：pUToT3R(A-)，泳道1-3：重组质粒)，3个重组质粒均可释放出长度约600bp的片段，而第一次连接获得的质粒pUToT3R(A-)释放的片段约400bp，表明ToTOM3的RNAi(A)片段分别以正反两个方向连接到pUCGA上，将该重组RNA干扰中间质粒命名为pUToT3R(A)。用限制性内切酶SalI对pUToT3R(A)进行酶切，用T₄DNA聚合酶补平末端，再用限制性内切酶SpeI进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳后回收600bp的小片段，将回收片段与经SmaI和XbaI双酶切的载体pBI121连接，将连接产物转化大肠杆菌，涂布在含卡那霉素(100mg/L)的LBA培养基上培养12-24小时。挑取5个单菌落在含卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中振荡培养过夜，提取质粒进行酶切鉴定。由于pBI121的第2349及第9149位碱基处各有一个BglII的酶切位点(其物理图谱如图32所示)，ToTOM3的RNA干扰片段有一个BglII位点，如果将该片段插入多克隆位点，用限制性内切酶BglII酶切重组的RNA干扰表达质粒将获得三个片段，其中一个为7948bp，另外两个片段的长度约为3700bp。酶切鉴定结果如图17所示(泳道M：1Kb DNA Marker，泳道1-2：重组RNA干扰表达质粒，泳道3：pBI121)，用限制性内切酶BglII酶切后，重组质粒被切为三个片段，其中有一片段与对照pBI121的7948bp片段大小一致，其余两片段长度约为3700bp(电泳结果显示这两个片段重叠)。以重组质粒为模板，在特异性引物ttom3-RNAi-1F和引物35S-F：5’-AATCTTCGTCAACATGGTGGAGCAC-3’的引导下，进行PCR检测，将PCR产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图18所示(泳道M：pUC Mix8 DNAMarker，泳道1-2：重组RNA干扰表达质粒)，扩增出长度约为640bp的特异性条带，表明RNA干扰片段已连接到表达载体pBI121上，将该ToTOM3的RNA干扰载体命名为pBIToT3R-A。

3、ToTOM3的RNA干扰质粒pBIToT3R-B的构建

用限制性内切酶BglII和SpeI双酶切ToTOM3的3’RACE克隆质粒pTTOM3-3，将酶切产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图19所示(泳道M：100bp DNAladder，泳道1：RNAi(B)片段)，回收并纯化大小为334bp的RNAi(B)片段，将该334bp大小的片段与经限制性内切酶BglII和SpeI双酶切的RNA干扰载体pUCGA进行连接，将连接产物转化大肠杆菌，涂布在含氨苄青霉素(100mg/L)的LBA培养基上培养12-24小时。挑取3个单菌落进一步培养，提取质粒用限制性内切酶BglII和SpeI进行酶切鉴定，结果如图20所示(泳道M：1kb DNA ladder，泳道CK1：RNAi(A)片段，泳道CK2：pUCGA，泳道1-2：重组质粒)，经BglII和SpeI双酶切可释放出长度约300bp的片段，表明RNAi(B)片段已插入到pUCGA的BglII和SpeI酶切位点之间，将该重组质粒命名为pUToT3(B-)。将pUToT3(B-)用限制性内切酶XbaI和BamHI双酶切后与RNAi(B)片段连接，将连接产物转化大肠杆菌，涂布在含氨苄青霉素(100mg/L)的LBA培养基上培养12-24小时。挑取2个单菌落进一步培养，提取质粒用限制性内切酶SalI和XhoI做进一步的酶切鉴定，结果如图21所示(泳道M：100bp DNAladder plus，泳道CK：pUToT3R(B-)，泳道1-2：重组质粒)，所获得的2个重组质粒均可释放出长度约900bp的片段，而第一次连接获得的质粒pUToT3R(B-)释放的片段约600bp，表明ToTOM3的RNAi(B)片段分别以正反两个方向连接到载体pUCGA上，将此ToTOM3的重组RNA干扰中间质粒命名为pUToT3R(B)。

用限制性内切酶SalI对上述RNA干扰中间质粒pUToT3R(B)酶切后，用T₄DNA聚合酶补平，再用限制性内切酶SpeI酶切，经0.8％琼脂糖凝胶电泳回收900bp的小片段，与经SmaI和XbaI双酶切的载体pBI121进行连接，将连接产物转化大肠杆菌，挑取5个单菌落进一步培养，提取质粒用限制性内切酶BglII进行酶切鉴定，酶切鉴定结果如图22所示(泳道M：1Kb DNA Marker，泳道1-2：重组RNA干扰表达质粒，泳道3：pBI121)，泳道1-2所示的重组质粒被切为三个片段，其中有一片段与对照pBI121的7948bp片段大小一致，其余两片段均约3700bp(电泳结果显示这两个片段重叠)，以重组质粒为模板，在特异性引物ttom3-g：5’-CCGTCTGTCCTCACACTAGGCAG-3’和引物35S-F的引导下作进一步的PCR鉴定，PCR鉴定结果如图23所示(泳道M：pUCMix8 DNA Marker，泳道1-2：重组RNA干扰表达质粒)，PCR扩增出长度约440bp的特异性条带，表明RNA干扰片段均已连接到表达载体pBI121上，将该ToTOM13的RNA干扰载体命名为pBIToT3R-B。

二、番茄的遗传转化

1、三亲结合法将植物表达质粒转化农杆菌

用三亲结合法将步骤一构建的三种植物表达质粒pBIToT3-A、pBIToT3R-A和pBIToT3R-B(Rogers S.G.，Horsch R.B.，and Fraley R.T.1986.Gene transfer inplant：production of transformed plants using Ti-plasmid vectors.MethodsEnzymol.，118：627-640)分别转化农杆菌EHA105，在含50mg/mL利福平(Rif)和50mg/mL卡那霉素的LA平板进行筛选，得到含有上述3种植物表达质粒的农杆菌转化子。

2、番茄的遗传转化

用下述方法分别将转化有pBIToT3-A、pBIToT3R-A和pBIToT3R-B的农杆菌转化子导入番茄，下述用于番茄组织培养和转化的培养基为MS基本培养基。

1)Flamingo Bill外植体的制备

参考Javier Pozueta-Romero等人的方法(Pozueta-romero，J.，Houlnè，G.，Ca

as，L.，et al.2001.Enhanced regeneration of tomato and pepper seedlingexplants for Agrobactereium-mediated transformatlon.Plant cell，Tissue andorgan culture.，67：173-180)制备Flamingo Bill外植体，具体方法为：将番茄种子一个个地分开，用蒸馏水洗3次，然后用80％乙醇浸泡并不停地搅动2分钟，加入4-6滴100％的Tween-80，倒去乙醇溶液，再用无菌水洗涤2-3次。加入有效氯为1％的NaClO溶液与4-6滴100％Tween-80在搅拌器上不停地搅动15分钟，倒去NaClO溶液，用无菌水洗2次，再重复二次，直至番茄种子的颜色由褐色变为金黄色，至此，番茄种子基本无菌，再用无菌水冲洗6-10次，将其置于无菌滤纸上晾干。晾干后把种子接入倒有1/2MS培养基(含3％的蔗糖)的培养瓶中，封口，在25-28℃的光照培养箱中培养7天，再把培养瓶放在超净台中，打开盖子，补充培养瓶中的水分，使无菌苗在开放的环境下培养15个小时，使其直立生长，子叶平展，以利下一步操作。将培养的无菌苗的一侧子叶从叶柄基部连同顶芽及周围分生组织全部切去，只留一侧子叶，另外将无菌苗的大部分根系切去只保留长度为2-3cm的胚根。

2)用农杆菌EHA105感染外植体Flamingo-Bill

将转化有pBIToT3-A、pBIToT3R-A和pBIToT3R-B的农杆菌在含50mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的YEB平板上划线，置28℃恒温培养约24h，长出菌落后挑取单菌落接种于含相应抗生素的YEB液体培养基中，28℃恒温摇床(200转/分)培养约24h至OD₆₀₀为04-0.6，转入无菌离心管中，3000rpm离心10min，弃上清液，将收集的菌体用MS培养液清洗一次并重新悬浮，稀释50倍后用于番茄的转化。

将步骤1)制备的外植体Flamingo-Bill放入含步骤2)中活化的农杆菌的MS液体培养基中(另加终浓度为100μmol/L的乙酰丁香酮)，不停地摇动10分钟，将外植体取出并用无菌水冲洗两次，然后一根根地放入倒有MS共培养培养基(在MS基本培养基的基础上添加了6-BA 2.0mg/L，吲哚乙酸0.1mg/L，AS 100μmol/L)的15cm直径的大培养皿中，封口，在光照培养箱中培养2天。

3)分化诱导

培养2天后，将其转接入分化筛选培养基(在MS基本培养基的基础上添加了ZT1.0mg/L，IAA 0.1mg/L，Km 50mg/L和Cef 200mg/L)中，继续在光照培养箱中培养2-3个星期，培养条件为25-28℃，每天15小时光照/9小时黑暗。

4)转基因植株的生根、炼苗及移栽

将在分化筛选培养基中生长正常的植株(长到约2-3cm长)从愈伤组织上切下(注意不要连带愈伤组织)。切下后插入生根培养基中(在MS基本培养基的基础上添加了Km 50mg/L，Cef 150mg/L和NAA 0.2mg/L)，继续培养使其生根。生根后，将培养瓶的盖子打开并补充水分，使植株逐渐适应外界环境，3-4天后将植株慢慢地拔出，洗净根部所带的琼脂，移植到土壤中，保持土壤的湿度，培养温度设为25-30℃。

三、转基因植株的分子鉴定

将卡那霉素抗性植株盆栽于防虫网室中，一个月后取其叶片，按常规方法提取总DNA，并以此为模板，在引物Kam-R：5’-GATCTGGATCGTTTCGCATG-3’和引物Kam-F：5’-AAGGCGATAGAAGGCGATGC-3’的引导下，进行PCR检测，共获得26株可扩增出800bp的特异性条带的转基因植株，其中转反义RNA质粒pBIToT3-A的13株，转RNA干扰质粒pBIToT3R-A的10株，转pBIToT3-B的3株。以下用35S-F和相对应的特异性引物对这26株转基因植株进行进一步的PCR和Southern杂交检测。

1、反义RNA转基因植株的分子鉴定

提取13株转pBIToT3-A的转基因植株的总DNA，并以其为模板，在引物35S-F和引物ttom3-G(5’-CAATTGAATTCATTATTTCTCC-3’)的引导下，进行PCR检测，以非转基因番茄为对照，结果如图24所示(泳道M：pUCMix8 DNA Marker，泳道CK：非转基因番茄，泳道1-13：转基因番茄)，扩增出长度约400bp特异性条带的为转基因植株。用限制性内切酶BamH I对转基因植株的总DNA进行酶切，用P³²标记的RNAi(B)片段进行Southern杂交，杂交结果如图25所示(泳道M：1kb DNA Marker，泳道CK：非转基因番茄，泳道1-13：转pBIToT3(A)的转基因番茄)，所有植株都有一条内源6.2kb的内源杂交带，而转基因植株除了内源杂交带外还可出现一条大小不同的杂交带，表明ToTOM3的反义RNA片段已整合到番茄基因组的不同位置上。

2、RNA干扰转基因植株的鉴定

以转化有RNA干扰表达质粒pBIToT3R-A的转基因植株的总DNA为模板，在引物35S-F和引物ttom3-RNAi-1F的引导下，进行PCR检测，检测结果如图26所示(泳道M：pUCMix8 DNA Marker，泳道CK：非转基因番茄，泳道1-10：转基因番茄)，可扩增出长度约600bp特异性条带的为转基因阳性植株；用上述同样方法在引物35S-F和引物ttom3-g的引导下对转化有pBIToT3R-B的转基因植株进行PCR检测，检测结果如图28所示(泳道M：1kb DNA Marker，泳道CK：非转基因番茄，泳道1-10：转pBIToT3(A)转基因番茄)，可扩增出长度约400bp特异性条带的为转基因阳性植株。用限制性内切酶EcoRI对上述植株的总DNA进行酶切，将转pBIToT3R-A的与P³²标记的RNAi(A)片段进行Southern杂交，杂交结果如图27所示(泳道M：1kb DNA Marker，泳道CK：非转基因番茄，泳道1-10：转pBIToT3(A)转基因番茄)，将转pBIToT3R-B的与P³²标记的RNAi(B)片段进行Southern杂交，杂交结果如图29所示(泳道M：1kb DNA Marker，泳道CK：非转基因番茄，泳道1-3：转基因番茄)。所有的植株都有一条内源5.8kb的内源杂交带，而转基因植株除了内源杂交带外，均出现一条大小不同的杂交带，表明两个RNA干扰片段已分别整合到番茄基因组的不同位置上。

实施例4、转基因植株的抗病性检测

采用摩擦接种法，分别用CMV和TMV对所有实施例3获得的5-6叶期的转基因番茄进行接种实验，以相同生长期的非转基因番茄为对照，定期进行症状观察，并在接种75天后用常规的生物学测定方法和DAS-ELISA法测定转基因番茄植株内的病毒含量。

1、症状表现

接种10天后，接种TMV的非转基因番茄苗表现斑驳的症状(图20B)，接种CMV非转基因番茄苗表现出典型的花叶症状(图20D)，转基因苗则无任何症状表现(图20A，图20C)。接种30天后，除少数转基因苗出现轻微的斑驳症状外，大部分转基因苗仍无任何症状表现。接种90天后，接种TMV非转基因植株仍表现为斑驳症状(图21B)，转基因植株无任何症状表现(图21A)接种CMV非转基因番茄苗的叶片严重黄化，形成凹突不平的疱斑(图21D)，转基因植株则表现出轻微的班驳症状，形成少量的疱斑(图21C)。

2、转基因植株内TMV相对含量

接种TMV 75天后，分别取转基因植株和对照植株的新生叶(倒数第三张新生叶)，剪取相同的面积(约2×2cm²)，用1mL磷酸缓冲液(0.02M Na2HPO₄，0.001M KH2PO4，pH7.2)磨成匀浆，用磷酸缓冲液将匀浆稀释100倍，接种接种到苋色藜叶片上，五天后统计枯斑数。统计结果如表1所示，以转基因番茄为接种源，在苋色藜上形成的枯斑数均显著低于对照实生番茄植株，其中转反义RNA表达质粒的单株简写为An(n为单株的编号)，转RNA干扰质粒的单株分别简写为R(A)n及R(B)n。

另取0.1g叶片，加1mL包被缓冲液(0.015M Na₂CO₃，0.035M NaHCO₃，pH9.6)磨成匀浆，稀释1000倍后用于DAS-ELISA检测，检测结果如表2所示，表明所有转基因植株内TMV的浓度均明显低于非转基因植株，与枯斑测定结果一致，所有转基因植株内TMV含量显著降低，对TMV具有较强的抗性。

表1 转基因植株内TMV相对含量的生物学测定结果(接种75天)

株系	平均枯斑数	标准差(S.D.)	标准误(S.E.)	显著性
株系	平均枯斑数	标准差(S.D.)	标准误(S.E.)	显著性	非转基因植株(对照)	171.00	3.61	2.08
A6	20.33	3.22	1.86	极显著	非转基因植株(对照)	171.00	3.61	2.08
A6	20.33	3.22	1.86	极显著	A25	25.67	1.53	0.88	极显著
A36	40.67	7.02	4.06	极显著	A25	25.67	1.53	0.88	极显著
A36	40.67	7.02	4.06	极显著	A52	52.67	3.22	1.86	极显著
A53	12.00	2.65	1.53	极显著	A52	52.67	3.22	1.86	极显著
A53	12.00	2.65	1.53	极显著	A59	51.67	4.04	2.33	极显著
A94	24.00	3.61	2.08	极显著	A59	51.67	4.04	2.33	极显著
A94	24.00	3.61	2.08	极显著	A99	24.33	2.52	1.45	极显著
A119	22.00	3.61	2.08	极显著	A99	24.33	2.52	1.45	极显著
A119	22.00	3.61	2.08	极显著	A121	34.33	3.06	1.76	极显著
A123	20.67	2.52	1.45	极显著	A121	34.33	3.06	1.76	极显著
A123	20.67	2.52	1.45	极显著	A134	90.67	5.13	2.96	极显著
A155	58.67	4.51	2.60	极显著	A134	90.67	5.13	2.96	极显著
A155	58.67	4.51	2.60	极显著	R(A)6	31.00	4.58	2.65	极显著
R(A)8	26.00	2.65	1.53	极显著	R(A)6	31.00	4.58	2.65	极显著
R(A)8	26.00	2.65	1.53	极显著	R(A)12	37.00	7.55	4.36	极显著
R(A)55	86.67	5.86	3.38	极显著	R(A)12	37.00	7.55	4.36	极显著
R(A)55	86.67	5.86	3.38	极显著	R(A)66	22.33	3.06	1.76	极显著
R(A)69	25.00	2.65	1.53	极显著	R(A)66	22.33	3.06	1.76	极显著
R(A)69	25.00	2.65	1.53	极显著	R(A)71	38.33	3.06	1.76	极显著
R(A)111	23.67	2.31	1.33	极显著	R(A)71	38.33	3.06	1.76	极显著
R(A)111	23.67	2.31	1.33	极显著	R(A)114	90.67	6.43	3.71	极显著
R(A)139	64.67	3.79	2.19	极显著	R(A)114	90.67	6.43	3.71	极显著
R(A)139	64.67	3.79	2.19	极显著	R(B)16	17.00	2.00	1.16	极显著

R(B)28	25.33	2.52	1.45	极显著
R(B)28	25.33	2.52	1.45	极显著	R(B)46	14.67	3.06	1.76	极显著

表2 转基因植株内TMV相对含量的DAS-ELISA测定结果(接种75天)

株系	平均OD值	标准差(S.D.)	标准误(S.E.)	显著性
株系	平均OD值	标准差(S.D.)	标准误(S.E.)	显著性	非转基因植株(对照)	1.982	0.003	0.002
A6	0.235	0.002	0.001	极显著	非转基因植株(对照)	1.982	0.003	0.002
A6	0.235	0.002	0.001	极显著	A25	0.229	0.003	0.001	极显著
A36	0.362	0.003	0.002	极显著	A25	0.229	0.003	0.001	极显著
A36	0.362	0.003	0.002	极显著	A52	0.527	0.003	0.002	极显著
A53	0.235	0.004	0.002	极显著	A52	0.527	0.003	0.002	极显著
A53	0.235	0.004	0.002	极显著	A59	0.512	0.003	0.001	极显著
A94	0.222	0.003	0.002	极显著	A59	0.512	0.003	0.001	极显著
A94	0.222	0.003	0.002	极显著	A99	0.220	0.003	0.002	极显著
A119	0.220	0.001	0.001	极显著	A99	0.220	0.003	0.002	极显著
A119	0.220	0.001	0.001	极显著	A121	0.405	0.004	0.002	极显著
A123	0.216	0.003	0.002	极显著	A121	0.405	0.004	0.002	极显著
A123	0.216	0.003	0.002	极显著	A134	0.948	0.003	0.002	极显著
A155	0.669	0.002	0.001	极显著	A134	0.948	0.003	0.002	极显著
A155	0.669	0.002	0.001	极显著	R(A)6	0.275	0.003	0.002	极显著
R(A)8	0.211	0.003	0.002	极显著	R(A)6	0.275	0.003	0.002	极显著
R(A)8	0.211	0.003	0.002	极显著	R(A)12	0.433	0.003	0.002	极显著
R(A)55	0.770	0.002	0.001	极显著	R(A)12	0.433	0.003	0.002	极显著
R(A)55	0.770	0.002	0.001	极显著	R(A)66	0.213	0.002	0.001	极显著
R(A)69	0.281	0.003	0.001	极显著	R(A)66	0.213	0.002	0.001	极显著
R(A)69	0.281	0.003	0.001	极显著	R(A)71	0.381	0.003	0.001	极显著
R(A)111	0.204	0.003	0.001	极显著	R(A)71	0.381	0.003	0.001	极显著
R(A)111	0.204	0.003	0.001	极显著	R(A)114	0.748	0.003	0.002	极显著
R(A)139	0.504	0.003	0.001	极显著	R(A)114	0.748	0.003	0.002	极显著
R(A)139	0.504	0.003	0.001	极显著	R(B)16	0.254	0.003	0.002	极显著
R(B)28	0.313	0.003	0.002	极显著	R(B)16	0.254	0.003	0.002	极显著
R(B)28	0.313	0.003	0.002	极显著	R(B)46	0.215	.005	0.003	极显著

3、转基因植株内CMV的相对含量

接种CMV 70天后，分别取转基因植株和对照植株的新生叶(倒数第三张新生叶)，剪取相同的面积(约2×2cm²)，用1mL磷酸缓冲液磨成匀浆，直接接种到苋色藜叶片上，五天后统计枯斑数。统计结果如表3所示，以转基因番茄为接种源，在苋色藜上形成的枯斑数均显著低于对照实非转基因植株。

另取0.1g叶片，加1mL包被缓冲液磨成匀浆，稀释10倍后用于DAS-ELISA检测，检测结果如表4所示，所有的转基因植株内TMV的浓度均明显低于非转基因植株，与枯斑测定结果一致，表明所有的转基因植株对CMV均有一定的抗性。

表3 转基因植株内CMV相对含量的生物学测定结果(接种70天)

株系	平均枯斑数	标准差(S.D.)	标准误(S.E.)	显著性
株系	平均枯斑数	标准差(S.D.)	标准误(S.E.)	显著性	非转基因植株(对照)	148.00	2.65	1.53
A6	22.00	4.36	2.52	极显著	非转基因植株(对照)	148.00	2.65	1.53
A6	22.00	4.36	2.52	极显著	A25	18.33	2.08	1.20	极显著
A36	22.67	3.79	2.19	极显著	A25	18.33	2.08	1.20	极显著
A36	22.67	3.79	2.19	极显著	A52	23.67	8.02	4.63	极显著
A53	28.33	2.52	1.45	极显著	A52	23.67	8.02	4.63	极显著
A53	28.33	2.52	1.45	极显著	A59	22.00	2.65	1.53	极显著
A94	21.33	3.22	1.87	极显著	A59	22.00	2.65	1.53	极显著
A94	21.33	3.22	1.87	极显著	A99	26.67	3.79	2.19	极显著
A119	30.67	4.04	2.33	极显著	A99	26.67	3.79	2.19	极显著
A119	30.67	4.04	2.33	极显著	A121	74.33	5.13	2.96	极显著
A123	31.00	6.00	3.46	极显著	A121	74.33	5.13	2.96	极显著
A123	31.00	6.00	3.46	极显著	A134	78.00	2.65	1.53	极显著
A155	60.00	7.00	4.04	极显著	A134	78.00	2.65	1.53	极显著
A155	60.00	7.00	4.04	极显著	R(A)6	25.00	4.00	2.31	极显著
R(A)8	85.67	5.69	3.28	极显著	R(A)6	25.00	4.00	2.31	极显著
R(A)8	85.67	5.69	3.28	极显著	R(A)12	62.00	5.57	3.22	极显著
R(A)55	76.00	5.57	3.22	极显著	R(A)12	62.00	5.57	3.22	极显著
R(A)55	76.00	5.57	3.22	极显著	R(A)66	25.33	4.51	2.60	极显著
R(A)69	28.33	3.06	1.76	极显著	R(A)66	25.33	4.51	2.60	极显著
R(A)69	28.33	3.06	1.76	极显著	R(A)71	58.33	5.51	3.18	极显著
R(A)111	28.00	3.61	2.08	极显著	R(A)71	58.33	5.51	3.18	极显著
R(A)111	28.00	3.61	2.08	极显著	R(A)114	74.67	5.69	3.28	极显著
R(A)139	46.33	5.86	3.38	极显著	R(A)114	74.67	5.69	3.28	极显著
R(A)139	46.33	5.86	3.38	极显著	R(B)16	21.67	3.06	1.76	极显著
R(B)28	29.00	2.65	1.53	极显著	R(B)16	21.67	3.06	1.76	极显著
R(B)28	29.00	2.65	1.53	极显著	R(B)46	20.00	2.65	1.53	极显著

表4 转基因植株内CMV相对含量的DAS-ELISA测定结果(接种70天)

株系	平均0D值	标准差(S.D.)	标准误(S.E.)	显著性
株系	平均0D值	标准差(S.D.)	标准误(S.E.)	显著性	非转基因植株(对照)	1.512	0.003	0.001
A6	0.192	0.003	0.002	极显著	非转基因植株(对照)	1.512	0.003	0.001
A6	0.192	0.003	0.002	极显著	A25	0.213	0.003	0.001	极显著
A36	0.231	0.003	0.002	极显著	A25	0.213	0.003	0.001	极显著
A36	0.231	0.003	0.002	极显著	A52	0.243	0.003	0.002	极显著
A53	0.224	0.003	0.001	极显著	A52	0.243	0.003	0.002	极显著
A53	0.224	0.003	0.001	极显著	A59	0.251	0.003	0.002	极显著
A94	0.213	0.003	0.002	极显著	A59	0.251	0.003	0.002	极显著
A94	0.213	0.003	0.002	极显著	A99	0.201	0.002	0.001	极显著
A119	0.209	0.002	0.001	极显著	A99	0.201	0.002	0.001	极显著
A119	0.209	0.002	0.001	极显著	A121	0.384	0.002	0.001	极显著
A123	0.195	0.003	0.002	极显著	A121	0.384	0.002	0.001	极显著
A123	0.195	0.003	0.002	极显著	A134	0.892	0.003	0.002	极显著
A155	0.625	0.002	0.001	极显著	A134	0.892	0.003	0.002	极显著

R(A)6	0.209	0.001	0.001	极显著
R(A)6	0.209	0.001	0.001	极显著	R(A)8	0.608	0.003	0.001	极显著
R(A)12	0.503	0.002	0.001	极显著	R(A)8	0.608	0.003	0.001	极显著
R(A)12	0.503	0.002	0.001	极显著	R(A)55	0.572	0.001	0.001	极显著
R(A)66	0.201	0.003	0.002	极显著	R(A)55	0.572	0.001	0.001	极显著
R(A)66	0.201	0.003	0.002	极显著	R(A)69	0.259	0.002	0.001	极显著
R(A)71	0.363	0.003	0.002	极显著	R(A)69	0.259	0.002	0.001	极显著
R(A)71	0.363	0.003	0.002	极显著	R(A)111	0.184	0.002	0.001	极显著
R(A)114	0.403	0.003	0.001	极显著	R(A)111	0.184	0.002	0.001	极显著
R(A)114	0.403	0.003	0.001	极显著	R(A)139	0.334	0.003	0.002	极显著
R(B)16	0.203	0.002	0.001	极显著	R(A)139	0.334	0.003	0.002	极显著
R(B)16	0.203	0.002	0.001	极显著	R(B)28	0.284	0.003	0.001	极显著
R(B)46	0.195	0.003	0.002	极显著	R(B)28	0.284	0.003	0.001	极显著

序列表

<160>3

<210>1

<211>295

<212>PRT

<213>番茄属番茄(Lycopersicon esculentum Miller)

<400>1

Met Gly Arg Ala Glu Met Val Val Gly Pro Ser Glu Lys Val Ala Val

1 5 10 15

Val Ala Tyr His Leu Asn Asp Ala Ile Asn Trp Trp Asp Asp Val Asn

20 25 30

Arg Ser Leu Asp Trp Gln Asn Arg Ile Phe His Val Leu Ala Val Leu

35 40 45

Tyr Gly Val Val Ala Val Val Ala Leu Val Gln Leu Ile Arg Ile Gln

50 55 60

Met Arg Val Pro Glu Tyr Gly Trp Thr Thr Gln Lys Val Phe His Phe

65 70 75 80

Leu Asn Phe Phe Val Asn Gly Val Arg Ser Leu Val Phe Thr Phe Arg

85 90 95

Arg Asp Val Gln Lys Leu His Pro Glu Ile Val Gln His Ile Met Leu

100 105 1l0

Asp Met Pro Ser Leu Ala Phe Phe Thr Thr Tyr Ala Leu Leu Val Leu

115 120 125

Phe Trp Ala Glu Ile Tyr Tyr Gln Ala Arg Ala Val Ser Thr Asp Gly

130 135 140

Leu Arg Pro Ser Phe Phe Thr Ile Asn Gly Val Val Tyr Ala Ile Gln

145 150 155 160

Ile Ile Leu Trp Leu Ile Met Trp Trp Lys Pro Ile Arg Val Leu Phe

165 170 175

Ile Leu Ser Lys Met Phe Phe Ala Gly Val Ser Leu Phe Ala Ala Leu

180 185 190

Gly Phe Leu Leu Tyr Gly Gly Arg Leu Phe Leu Met Leu Gln Arg Phe

195 200 205

Pro Val Glu Ser Arg Gly Arg Arg Lys Lys Leu Gln Glu Val Gly Tyr

210 215 220

Val Thr Thr Ile Cys Phe Ser Cys Phe Leu Ile Arg Cys Val Met Met

225 230 235 240

Cys Phe Asn Ala Phe Asp Lys Ala Ala Asp Leu Asp Val Leu Tyr His

245 250 255

Pro Ile Leu Asn Leu Ile Tyr Tyr Leu Leu Val Glu Ile Leu Pro Ser

260 265 270

Ser Leu Val Leu Phe Ile Leu Arg Lys Leu Pro Pro Lys Arg Gly Ile

275 280 285

Thr Gln Tyr His Pro Ile His

290 295

<210>2

<211>8129

<212>DNA

<213>番茄属番茄(Lycopersicon esculentum Miller)

<400>2

aaatgttaga ggttttacca acatccgttc cccaaaagcc ccaaaaatcc aacaagacac 60

cacgtataac gtgatcttag aattattcat atgaacgttc aacattttct ttattataaa 120

gaaagatatt ttactctcta ctgtttctcg taatagaaaa tagctaaaga attatctata 180

tttacaacaa tgcgaaatcc taatcctata ttattagact aaagttttta ttagttgatt 240

tcttctccta atgcatgaag gacatgggtt taaaaaaatc gaacataccg ataaatcgaa 300

tcgaaaaaat gttattgggg tattgttatt gtgttattga tttattgggg tttaatgagt 360

ttataaaaat aatttattag gttattggtt cggcatcagt ttttactatt ggattattgg 420

taaatcgata acccaataaa atggtaataa tttattattt tgcccttcct aattattaat 480

attaatactt taatatataa ttaaacacta taactatatc aaattattag aactctacca 540

acttcaccgt atgccatttt actagctttt actatttact caaaacctaa agattaaagt 600

aaggggttca caattgaagc tatttgattt tagttttagt tttagcttta gtgttggact 660

agtttatttt agttttagtt tgtaattgta ggttgtagca tttgcaagtt tgtaaaggtt 720

cataatttga ttaacataaa aaattacata ctatgttttg gcgataacat gtaattataa 780

ccttcgaact atatattctc ttattgatgt aatttctcat tatctttctt gtttcactat 840

atcaaaacat ctagagaagt gaaaagacat ataatatttc acgggcattt tcttattgga 900

taaatcgaaa tcgaactgat aatgattaaa aatcggtaca tcgaaaaccg ataaagaata 960

tcttattggt ttgttattgg attagcatat ttaaaaacca aaaaccgata atccgaaccg 1020

aaccgaccgg tgcacacccc taatcaagga tatatatata tatcggacaa cattacccct 1080

ctaaacgttt tttttaatat tgtatttgtt tttatatata ataaaataat accttttttt 1140

tctagccgtc cattttgaaa aacaaaagaa aaaaaagtac aaatttaaat aaacaaaaat 1200

agtaaatgaa tttttttaaa aattaatttc tgaaaaaggt agttgccgat tttggtgttt 1260

gatttttttt tggggggatt ttgaaattgg tgagtttgat tttggaatct ccggtgatgg 1320

gacgggcgga gatggttgta ggcccgtcgg agaaggtggc ggtggtggca tatcatctga 1380

atgatgcaat caattggtgg gacgatgtga acagatctct tgattggcaa aaccgtatat 1440

tccatgtcct tgctgttctc tacggcgttg tcgccgtcgt tgctcttgta aattctgtct 1500

ctctatcttt acgtctcagc gtttgagttt tgaattttat gagttaattt taacataatt 1560

gttatgttga ttgggataag agaggttcca tcaggtggta agcatccttc cttgtgaact 1620

agaagaaagg aggtctagga ggtaagttgt tgtcatgtta gtatgatgtg acaggttcga 1680

gcggtgtaaa taggcttttt gcatccaata gaccaatgtg gttcagtgca tagtaggagc 1740

ttagtataga agaaaggagg tcgtctagac gggaaagatg ttgtcatgtt agtaggatgt 1800

gacaggtttg agctgtgtaa ataggctttt tgcatccaat agagctttgt ggttcagtgc 1860

atagcaggag cttagtatac tgggctgctc tttttatatt gttatgttga ttggtaaagt 1920

aagattgggc tcatatatgt gttggagatg tatgaagaat ctgaatattt gttttatgtt 1980

gcttgttagt tgtttgaatt gaatgtcatg tgcatcatgt aactccaaac tttgatgttt 2040

tcgtcaaggg aagaattcta ggtggaactt ttgaatttga ggcattttag acttgttttt 2100

gatggtcctt gaaacgggga tagataactc atagagtatg catcaagctt tcaaggggcg 2160

cttactagaa ctatcactca gcagagcttt agtttcggct catatcagtg ttttagacgg 2220

caaaaggcga caagggtctg ccttgccata aggcgaggcg accggcgagg cactcacctt 2280

tttgaagtgt ggcaccaatt aataccaaaa aattaaaata ttgaattgca tatgtaaata 2340

ataaaaatct caatagcaat aacatattag caaatagttt aattcaaaac taaaaataga 2400

tagtacatac tataattcta gaacatgaat gagaaaaaaa caaaacaaaa gtcaaaacag 2460

aggtagaagt gactctgaag tccgaagaag aaggaaaaag aaacccaaaa aagaagaagt 2520

ttgaagaaga aaagaagaaa catgtcttgg ttggactttc gagtagccgg aaaagtttgc 2580

ctggtcgtcg aaggagtcta atcgtaagcc ctaaaattac cttttaactt ttaaaatcct 2640

aaattggtag tcttttttta agaatataca aaaggtgacg cctttcttgc ttttcttgca 2700

tctcacctct cgccttttgt cgccatggct cgcttcgcca caaagttaaa aggcgatgag 2760

gggtcgcctc gcctctcgcc cattggcgac gaggcgatcg cctttcgcaa cacttggctc 2820

atatggatag ggataggaaa aagagagatt ttcgtcgttt tgggatcatt cggataaaca 2880

cagtaatttg cggaagtgga gtattctata gttatagtag attaatacac aatttgttca 2940

agagacaatt gcttcttaac cggaaaatac ttgcttaaat agatatatca aataggaatt 3000

gtctttatat gatttcatat agacacttga aagtgattaa aactgaaatt tgaaactaaa 3060

aagggaagtt gttgaagtag gtaaaacttt taaaggattg catcttttcc tccctgaaag 3120

ttcatgatta ttatttccgg tatggcgggt gttgttgttg gtgttcaggt gtttagtcat 3180

ggcaaaacta ttatatgttt ccagggagaa tatgcactta tagtatgtat atttttggca 3240

aaagttgaaa ttgtctaatt tccactaatt ggtttatgta tgcaaaaaag agggggcaca 3300

tggcctggag tttgaaattt aaattttgcc aattggtttg tttgtgtctc attgattgat 3360

tttggtatac ttgtttaaat tttcatgcat gttcttgcgc attggatgat catattgtta 3420

ttcagttatt gctctacaaa attattatta ccagtaccaa tacttcaatt tatgtgcggc 3480

tctggaattt gtttcttact ttgcaacttg gcaatcaggt acaattaatt cgcattcaaa 3540

tgagagttcc tgaatatggc tggaccactc aaaaagtctt ccactttctc aatttctttg 3600

tgaatggagg tcagtatctt tcttttcttt acttctaatt attttttgaa catcctgatg 3660

ggaagttcca ttacacatgc ttttcaaatg attgttcctg tacactccac tttgttttga 3720

cgtgttgtct ttgttattta actgtgtctt catgttcttg gcagttcgct cgctagtttt 3780

tacatttcgt cgggatgttc agaagttgca cccggaggtt aagcaacaga gtatcttgat 3840

gttttttgtc ttacactcct ttaattttta acgctttata ctacattttt gcagattgtg 3900

caacatatta tgcttgatat gccaagtctt gcattcttca caacttatgc tctgctagta 3960

ttattctggg ctgagatata ctaccaggtt cttgtggtct gtctcaattt ttgtgtagat 4020

atatatcttc tcaaggttaa catatttgtt ttttccatga caaggcacgt gctgtgtcca 4080

cggatgggct tagacctagt ttcttcacaa tcaacggagt ggtttatgct attcaggtaa 4140

atatgtgaca gttatgcaat acttatataa actgcttgtt tcaatttatt cgtctttctt 4200

tcctttttgg tccatttcaa aagaatccct tggcaggcgc atcaatttat tttggtgctt 4260

gctagaaata aactctggtc tgggagtttt gacatcaata tatttctaaa agtgacaaca 4320

agtttcatct gatcagaatt tttctcaaca ttcttaaaca tgtcgttcat agggtacttc 4380

actcagtacc ccggccatcc tctccaactc ccaaacgtta aggataccct ccacctgagc 4440

atcagcaatt actacaattt tcccttctta agggtattct attagcagaa atgagagcac 4500

agtgcctaat atttcacaaa atgctgagac cactcataaa tcttagggat atatcaaacg 4560

aagtgtcatt gataaggaaa tatgtttctg tcatttggag atactttatc aagactacat 4620

tttgtttgga tgagatgttc agtgcccgca gttagacatg gtgactttta tgttttctca 4680

tggaaactgt tgcatgaaac atgtgagaca agggtttact cttttaaatt gctgtaccta 4740

tttggtggat gttcattgct gattttcttt gtttcttata tatcttgcag attatattat 4800

ggctgataat gtggtggaaa cctattcgag tactcttcat cttatccaag atgttttttg 4860

caggttcttg ttttagattt aacttatttt tagtattgca tggatctgtt gcgaagtatt 4920

aacataatgt acttgcaggt gtatccctat ttgcagcatt gggatttctc ctctacggtg 4980

gaaggtaaaa tcttgatttt tagtatcagt cactttgtca ccgacaggaa ttaccgaatg 5040

tacatttgtt aaatcgcata cagaatgggt ataaatcaag cacataagca taaagcttag 5100

cacttgtttc tatcgttcgt taaaggatgt tttatcttct gattcgttgc tattcttaac 5160

acttctttag aaggtagaga tggatatgta gtcaattgtt gtttgctttg atcaaaagcc 5220

aatttttttg gacgaaaagg tgatctgctt cctagcctat acatccacag atctaaacct 5280

tcacgagatg acttctgttg tgtcctaagc gtcaccattt tctgaaatta agtatcttgt 5340

atattggcat gtatcttatg cgatcatcgg ttactttcag taacctgtac ttcattagtt 5400

tgatatttga taccaggagc acacattgac aaagaggaca taagtaagaa gaagatgtag 5460

aaggaaggag ggaaaagaag gagggggcgg gagtgaagaa ggaaaatgaa agaaacatac 5520

cctaatatgg tgaattagag aagagaggag caaaagattg aaaattggaa ccttcgagaa 5580

atgaatggag agctcattag gaggagagat gagtggagga gtttcccatt cttgaccaac 5640

tattttgaca atgcaaccat taacctctgt tttgcccttg tcgcattcga cacctgctat 5700

atcgatcatt tttatcctcc tagctaaaaa gtggaagatt ccccattgaa gtcttccctc 5760

atctctaaag agtactctag agtgaagttc ctaatacata ggaaaagaaa ttggcaggtg 5820

ctagattgaa tgaacgcagc aaccacggca gtaatagatg acaaacatat aaaaaagtaa 5880

aatatcttca attacactta cttttagtga aagttcatgt gaccttttat tgccctgcct 5940

aatgaaagtt caaaagtctt ctcaagcatt atcttagttt gtcggcacgg tcgtacaaag 6000

atgcatagtg ttgttgaacg tgctgcttaa aaataaaatt agtaatttaa atattaagat 6060

actgcaaaaa aagttcttac agcactgcgt atagcacatg tttgtttagt ttgtggattg 6120

acctttgcta tatctcgctt gagtaccttg tgtactctta tgtttgaata attgggtcca 6180

tgcaacttgt atgtcattca tattcatcct tcaatatcac cttactgttt ggcttgatat 6240

tctttcactt tcttccaggc tttttcttat gttacagcgg tttccagtag aatcaagagg 6300

gagacgcaag aagctgcagg aggtatgtta ttagtacttc tctttcttgg tatttcattc 6360

ttattaggtc ttttgacttc tccggcattt tggcttctgt aggttggtta tgtcacgaca 6420

atatgttttt catgcttcct cattagatgc gttatggtaa gtccatattc ctcgtgaact 6480

aaacattttt tagctgatca taactaaccc atgtttgtag tgtgtgaatg atatctatat 6540

tttgctttag atggtttctt ttttgtctaa aacctttctt gatacaataa gttactctta 6600

gctgagatgc gtgcaagctg ggtcagacac ccttttttcc ggaaaaaaaa agtcttagct 6660

gatgcattga ttttctttct atagggcatc tttctcaaat tttttccttt ctatctatag 6720

ggcataaagc ctctttggtt attctatatg gcttaatggt tagtcactct attattatct 6780

ttgctacaga tgtgcttcaa tgcatttgat aaagctgcag atcttgatgt tttgtatcat 6840

cctattttga atttgatata ttacctggtg agttccatat cactgaactt ctattagcac 6900

ttctttaggt aaaatattgg ttgctgcgcc ataatcaaaa gaagtattgg cagtcagtat 6960

attttatata attattgcca aatcacgata aattggataa ttcacatgat atttcagctt 7020

gtggcatctt acaatcagtt ttatgcgcca aaattctgtt tggctccttt tctatgtagt 7080

cttttgagtt gggatggggg tttcttactt gtgccatgaa ctcaggtttc tttctcttcg 7140

tttgacattt tgtttaaatt gaaaattgga ttcaaaatct taagattatg gtgaaatatt 7200

tgagacacag ggagtggaaa tcatgttctg aaattatagc atggttatta ttttggcaca 7260

tacataaaca gacacttaaa cttggcctca acgggcatat aagcattgca actttgagaa 7320

agcacatcta gacacctcaa ctaaacattc caactcatcc ccactctata tcttgtggac 7380

actctgatgt ggctcataaa ttttggaggt gtctagatga tcactttgta agtcggagtg 7440

ttcaactgac acaatggaga cgagttgagg tgtcgtgtgt gcatactcaa agttggagtg 7500

gttacttgcc agttgaggcc gattttgagt gtctgtttat gtattatgcc tattatttca 7560

cttgatcgtg tcctatccaa accttagttt catccaaatt tcaaatcatg agtatatact 7620

tagacatggt gttttttact ttgcgctttg gggggtagaa agtggagaaa atggagtaat 7680

atttttctgt atgttttgag actaagcaaa ctttttaacc tcttcgcagt tagtggagat 7740

actgccttct tctcttgtcc tttttatttt aaggaagttg cctccaaagc gagggatcac 7800

ccaataccac cctattcact aatacattaa gagggtagat aatgatgaaa atcaggctcc 7860

gggatcaggt attaagtaag ttggctttta cctggatgtg atttgcaagc aagaaatacg 7920

agaggagtga taatgtaaat tgaagtatgg ttcgtctata ctgaaatatc cgtctgtcct 7980

cacactaggc agattgtagc tctgttttgt accactagtt atagatggaa ttgtgaagta 8040

tcttacgacc tttagtgtat tatttcgcct ttgtatgtgt cagatttcaa ttgaattcat 8100

tatttctcct gaaacttcac gttgttctc 8129

<210>3

<211>1282

<212>DNA

<213>番茄属番茄(Lycopersicon esculentum Miller)

<400>3

gccgattttg gtgtttgatt tttttttggg gggattttga aattggtgag tttgattttg 60

gaatctccgg tgatgggacg ggcggagatg gttgtaggcc cgtcggagaa ggtggcggtg 120

gtggcatatc atctgaatga tgcaatcaat tggtgggacg atgtgaacag atctcttgat 180

tggcaaaacc gtatattcca tgtccttgct gttctctacg gcgttgtcgc cgtcgttgct 240

cttgtacaat taattcgcat tcaaatgaga gttcctgaat atggctggac cactcaaaaa 300

gtcttccact ttctcaattt ctttgtgaat ggagttcgct cgctagtttt tacatttcgt 360

cgggatgttc agaagttgca cccggagatt gtgcaacata ttatgcttga tatgccaagt 420

cttgcattct tcacaactta tgctctgcta gtattattct gggctgagat atactaccag 480

gcacgtgctg tgtccacgga tgggcttaga cctagtttct tcacaatcaa cggagtggtt 540

tatgctattc agattatatt atggctgata atgtggtgga aacctattcg agtactcttc 600

atcttatcca agatgttttt tgcaggtgta tccctatttg cagcattggg atttctcctc 660

tacggtggaa ggctttttct tatgttacag cggtttccag tagaatcaag agggagacgc 720

aagaagctgc aggaggttgg ttatgtcacg acaatatgtt tttcatgctt cctcattaga 780

tgcgttatga tgtgcttcaa tgcatttgat aaagctgcag atcttgatgt tttgtatcat 840

cctattttga atttgatata ttacctgtta gtggagatac tgccttcttc tcttgtcctt 900

tttattttaa ggaagttgcc tccaaagcga gggatcaccc aataccaccc tattcactaa 960

tacattaaga gggtagataa tgatgaaaat caggctccgg gatcaggtat taagtaagtt 1020

ggcttttacc tggatgtgat ttgcaagcaa gaaatacgag aggagtgata atgtaaattg 1080

aagtatggtt cgtctatact gaaatatccg tctgtcctca cactaggcag attgtagctc 1140

tgttttgtac cactagttat agatggaatt gtgaagtatc ttacgacctt tagtgtatta 1200

tttcgccttt gtatgtgtca gatttcaatt gaattcatta tttctcctga aacttcacgt 1260

tgttctcaaa aaaaaaaaaa aa 1282

Claims

1、一种番茄RNA病毒寄主因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2、权利要求1所述的番茄RNA病毒寄主因子的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：其基因组基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

4、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：其cDNA基因，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；

5、含有权利要求2或3或4所述编码基因的表达载体。

6、含有权利要求2或3或4所述编码基因的转基因细胞系。

7、含有权利要求2或3或4所述编码基因的宿主菌。

8、一种培育抗病毒植物的方法，是将权利要求2或3或4编码基因的反义RNA或其RNA干扰表达载体导入植物中，得到转基因植株。

9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述被转化的植物宿主为茄科、十字花科或葫芦科的植物。

10、权利要求2或3或4所述编码基因在培育抗病毒植物中的应用。