CN1712414A

CN1712414A - 利用人Rhbdl5基因及其编码产物诊断和治疗秃发的方法

Info

Publication number: CN1712414A
Application number: CN 200410025361
Authority: CN
Inventors: 孔祥银; 滕晓坤; 胡兰靛
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2004-06-23
Filing date: 2004-06-23
Publication date: 2005-12-28

Abstract

本发明提供了一种新的人秃发相关蛋白－Rhbd15蛋白，编码Rhbd15蛋白的多核苷酸和经重组技术产生Rhbd15蛋白的方法。本发明还公开了Rhbd15蛋白和多核苷酸的用途。

Description

利用人Rhbdl5基因及其编码产物诊断和治疗秃发的方法

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的人秃发相关基因Rhbdl5及其编码蛋白。本发明还涉及Rhbdl5多核苷酸和多肽的制备和应用，尤其是在诊断和治疗秃发方面的应用。

背景技术

人类的先天性秃发、稀发常见于男性女性患者较为少见，虽然不影响人的生存质量，但是对于个人来讲由其是女性这种先天性的遗传疾病严重影响其生活质量，遗憾的是迄今为止没有可以从根本上治疗的方法。此外，搜集人类的先天性秃发家系存在较大的困难。

然而，目前还没有发现或分离出与秃发有关的人基因。因此，本领域迫切需要开发新的与秃发有关的蛋白。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的人秃发相关蛋白-Rhbdl5蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的Rhbdl5多肽，它包含：具有SEQID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组：(i)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；(ii)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列且第259位为Met的多肽；(iii)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列且第546位为Ser的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述Rhbdl5多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列选自下组：(c-1)具有SEQ ID NO：1中第1-3118位的序列；(c-2)具有SEQ IDNO：1中第71-2551位的序列；(c-3)具有SEQ ID NO：1中第71-2551位且第846位为T的序列；(c-4)具有SEQ ID NO：1中第71-2551位且第1706位为T的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备Rhbdl5蛋白的方法，该方法包含：(a)在表达Rhbdl5蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出Rhbdl5蛋白。

在本发明的第五方面，提供了与上述的Rhbdl5多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的20-3118个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗Rhbdl5多肽活性的化合物，以及抑制Rhbdl5多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是Rhbdl5多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在Rhbdl5蛋白的方法，它包括：将样品与Rhbdl5蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在Rhbdl5蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与Rhbdl5多肽异常表达相关的疾病或疾病(如秃发)易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。较佳地，所述的突变是SEQ ID NO：1中第846位C→T，第1706为C→T。此外，还提供了相应的试剂盒，它包括特异性扩增Rhbdl5基因或转录本的引物。较佳地，所述试剂盒还含有与突变部位结合的探针。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进Rhbdl5多肽活性的激动剂，或者筛选抑制Rhbdl5多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的Rhbdl5蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的Rhbdl5多肽或其激动剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗秃发等病症。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了Rhbdl5的cDNA序列，其中开放阅读框架(ORF)位于第71-2551位，编码827个氨基酸rhbdl5蛋白。

图2显示了Rhbdl5蛋白的氨基酸序列，其中第205-827位是一个rhomboid蛋白家族高度保守区域(下划线部分)。

图3显示了一秃发病人Rhbdl5基因的测序结果，在Rhbdl5基因的846位存在T/C杂合，该突变造成第259位氨基酸Thr→Met。

图4显示了一秃发病人Rhbdl5基因的测序结果，在Rhbdl5基因的1706位存在T/C杂合，该突变造成第546位氨基酸Pro→Ser。

图5显示了人Rhbdl5蛋白与小鼠Rhor蛋白的氨基酸序列比对图。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，首次分离和证明了一种与秃发密切相关的人基因Rhbdl5，该基因编码类似表皮生长因子受体的蛋白。Rhbdl5的突变或功能下降或缺失将导致秃发。在此基础上完成了本发明。

在本发明中，术语“Rhbdl5蛋白”、“Rhbdl5多肽”或“人秃发相关蛋白Rhbdl5”可互换使用，都指具有人秃发相关蛋白Rhbdl5氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的Rhbdl5蛋白。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的Rhbdl5蛋白或多肽”是指Rhbdl5多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化Rhbdl5蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

本发明还包括Rhbdl5蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然Rhbdl5蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“Rhbdl5多肽”指具有Rhbdl5蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与Rhbdl5蛋白相同功能的、SEQ ID NO：2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括Rhbdl5蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与Rhbdl5 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗Rhbdl5多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含Rhbdl5多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了Rhbdl5多肽的可溶性片段。通常，该片段具有Rhbdl5多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供Rhbdl5蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然Rhbdl5多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“Rhbdl5蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID N0：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
最初的残基	代表性的取代	优选的取代	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu	Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码Rhbdl5蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的Rhbdl5核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Rhbdl5蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的Rhbdl5多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码Rhbdl5多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，Rhbdl5多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Rhbdl5编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，coldSpring Harbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；入噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的Rhbdl5蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗Rhbdl5蛋白功能低下或丧失所致的疾病(如无精子，或精子活力低下等疾病)，和用于筛选促进或对抗Rhbdl5蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组Rhbdl5蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激Rhbdl5蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对Rhbdl5 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于Rhbdl5基因产物或片段。较佳地，指那些能与Rhbdl5基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制Rhbdl5蛋白的分子，也包括那些并不影响Rhbdl5蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的Rhbdl5基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的Rhbdl5基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达Rhbdl5蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的抗体包括能阻断Rhbdl5蛋白功能的抗体以及不影响Rhbdl5蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用Rhbdl5基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与Rhbdl5基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗Rhbdl5蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的Rhbdl5蛋白。此外，与Rhbdl5蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。

多克隆抗体的生产可用Rhbdl5蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Rhbdl5蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：口服、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗和预防，尤其是防治秃发。在使用本发明Rhbdl5蛋白时，还可同时使用其他用于同一病症的治疗剂。

本发明还提供了一种组合物(包括药物组合物)，它含有安全有效量(如0.001-99.9wt％)的本发明Rhbdl5多肽或其激动剂、拮抗剂以及(药学上)可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的Rhbdl5蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约5毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的Rhbdl5蛋白或其激动剂还可添加在洗发膏、洗发水、护发素等头发护理用品中，添加量通常为总重量的0.001-5％(较佳地0.01-1％)，从而在日常使用时就起到防治秃发/脱发的效果。

Rhbdl5蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于Rhbdl5蛋白的无表达或异常/无活性的Rhbdl5蛋白的表达所致的秃发。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将Rhbdl5基因转移至细胞内。另外重组Rhbdl5基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与Rhbdl5蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对Rhbdl5蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测Rhbdl5蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的Rhbdl5蛋白水平，可以用作解释Rhbdl5蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断Rhbdl5蛋白起作用的疾病(如秃发)。

一种检测检测样品中是否存在Rhbdl5蛋白的方法是利用Rhbdl5蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与Rhbdl5蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在Rhbdl5蛋白。

Rhbdl5蛋白的多聚核苷酸可用于Rhbdl5蛋白相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，Rhbdl5蛋白的多聚核苷酸可用于检测Rhbdl5蛋白的表达与否或在疾病状态下Rhbdl5蛋白的异常表达。如Rhbdl5 DNA序列可用于对活检标本的杂交以判断Rhbdl5蛋白的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用Rhbdl5蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测Rhbdl5蛋白的转录产物。

检测Rhbdl5基因的突变也可用于诊断Rhbdl5蛋白相关的疾病。Rhbdl5蛋白突变的形式包括与正常野生型Rhbdl5 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。本发明的试验已表明，Rhbdl5的突变与秃发直接相关。

在本发明的一个实例中，分离的Rhbdl5的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为3118个碱基，其开放读框位于71-2551位，编码全长为827个氨基酸的Rhbdl5蛋白(SEQ ID NO：2)。研究表明，该基因的突变与人类的先天性秃发、稀发密切相关。Rhbdl5为治疗秃发等疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

Rhbdl5基因完整开放阅读框架的获得

按照Qiagen公司的Total RNA纯化试剂盒提供的方法抽提人皮肤细胞总RNA，1％琼脂糖电泳鉴定纯度后用Promega公司的Reverse Transcript System将RNA反转录为cDNA.后用以下引物：

forward 5’TGTACAGAGCAAGGAGAAGACA3’(SEQ ID NO：3)

reverse 5’CTTTCCCACAATGTCCCATC3’(SEQ ID NO：4)

使用ABI公司的TaqGold高温聚合酶进行PCR扩增，PCR热循环条件是：

95℃ 10分钟，1个循环；热循环：95℃ 30秒，56℃ 45秒，72℃ 3分30秒，共40个循环；72℃ 10分钟，1个循环。

0.8％琼脂糖电泳分离，获得长度约3.2kb的扩增产物。割胶纯化，因该产物较长，故使用PRIMER WALKING的方法进行测序。依次使用以下8对测序引物：

Hs.rhbdl5 forward 5’-TGTACAGAGCAAGGAGAAGACA-3’(SEQ ID NO：3)

Hs.rhbdl5 reverse 5’-GGAGCTCCAGGTCACGCT-3’(SEQ ID NO：5)

Hs.rhbdl5 l forward 5’-CCACAGACTGAGGCTTGACA-3’(SEQ ID NO：6)

Hs.rhbdl5 1 reverse 5’-GATGCTCTGGGACAGTGAGG-3’(SEQ ID NO：7)

Hs.rhbdl5 2 forward 5’-ACTTGAAGAGCGTCAGCCTC-3’(SEQ ID NO：8)

Hs.rhbdl5 2 reverse 5’-ATCGACCACATCCTCCTCC-3’(SEQ ID NO：9)

Hs.rhbdl5 3 forward 5’-AGTCCTGTCCCTCACCTCCT-3’(SEQ ID NO：10)

Hs.rhbdl5 3 reverse 5’-GGACGAAGGTCAGCCAGTAG-3’(SEQ ID NO：11)

Hs.rhbdl5 4 forward 5’-CGGCCCTACTTCACCTACTG-3’(SEQ ID NO：12)

Hs.rhbdl5 4 reverse 5’-TTGATCTCGCAGTCCATGTG-3’(SEQ ID NO：13)

Hs.rhbdl5 5 forward 5’-GGCCCGATGACATCACTAAG-3’(SEQ ID NO：14)

Hs.rhbdl5 5 reverse 5’-TGAACAGGAAGAGCACGATG-3’(SEQ ID NO：15)

Hs.rhbdl5 6 forward 5’-CAGTGCCATCTTTCTCCCAT-3’(SEQ ID NO：16)

Hs.rhbdl5 6 reverse 5’-CTGTCTTGGGTCTCTGGCTC-3’(SEQ ID NO：17)

Hs.rhbdl5 7 forward 5’-TGCGAGAAGTATGAGCTGGA-3’(SEQ ID NO：18)

Hs.rhbdl5 7 reverse 5’-CTTTCCCACAATGTCCCATC-3’(SEQ ID NO：4)

测序鉴定，得到Rhbdl5基因的全长序列，如SEQ ID NO：1和图1所示，其中，Rhbdl5基因的开放阅读框架(ORF)位于71-2551位，编码全长为827个氨基酸的Rhbdl5蛋白(SEQ ID NO：2和图2)。

通过结构分析，发现Rhbdl5蛋白的第205-827位氨基酸是一个rhomboid蛋白家族高度保守区域(图2的下划线部分)，这表明，Rhbdl5蛋白属于Rhomboid蛋白家族成员，该家族成员在细菌和真核生物中都有报道，大部分是完整的膜蛋白，它们预测跨膜区存在三个高度保守的组氨酸。

此外，采用常规的微卫星标记的方法对Rhbdl5进行染色体定位。结果表明Rhbdl5基因定位在人类第十五号染色体上。

实施例2

Rhbdl5基因cDNA缺失的鉴定方法

抽提200个正常人和2个秃发患者的头皮细胞基因组DNA，作为模板。然后使用以下引物：

引物对1 Fwd 5-CGTTCAGCTTGCAGAATCTC-3(SEQ ID NO：20)

Rev 5-CCACATAGGACCATGCCACA-3(SEQ ID NO：21)

引物对2 Fwd 5-GACCCACCAGCCTTCTTCT-3(SEQ ID NO：22)

Rev 5-AAGCCTGTGTGGTTGCTCC-3(SEQ ID NO：23)

使用ABI公司的GoldTaq高温聚合酶，进行PCR扩增，条件同实施例1。扩增产物经琼脂糖电泳鉴定后，用Omega公司的Cycle-Pure Kit纯化产物，用ABI公司的BigDye terminal仍用上述引物测序。

测序结果表明，200个正常人的Rhbdl5基因不存在引起氨基酸变化的核苷酸突变，而一秃发病人Rhbdl5基因的846位存在T/C杂合(C→T)，该突变造成第259位氨基酸Thr→Met(图3)。另一秃发病人Rhbdl5基因的1706位存在T/C杂合(C→T)，该突变造成第546位氨基酸Pro→Ser(图4)。这表明Rhbdl5基因与秃发密切相关。

图5显示了人Rhbdl5蛋白(SEQ ID NO：2)与小鼠Rhor蛋白(SEQ ID NO：19)的氨基酸序列比对图。小鼠Rhor蛋白是本发明人以前研究发现的导致了小鼠的先天性无毛的基因(见中国专利申请02145253.9)。Rhbdl5蛋白与小鼠Rhor蛋白具有较高的同源性，这提示了它们具有相似的功能，而本实施例更证实了与秃发的相关性。

实施例3

Rhbdl5在原核细胞中的表达

合成以下引物：

正向引物：5′ATAAAGCTTATGGCCTCAGCTGACAAGAATGGCAGCAACCTCCCA 3′(SEQ ID NO：24)(引入HindIII切点GGATCC，第一个ATA为保护碱基)

反向引物：5′CCGCTCGAGGCTCGATCTGGTCCACGATGTGATT 3′(SEQID NO：25)(引入XhoI切点CTCGAG，起始CCG为保护碱基)

以人头皮细胞的cDNA为模板，PCR扩增编码Rhbdl5蛋白的DNA。

利用HindIII和Hind III位点，将PCR扩增产物克隆到相同酶切的质粒pET32a(Novagen公司)中，然后转化宿主E.Coli：BL21(DE3)。转化的宿主细胞在IPTG的诱导下表达。

表达产物在SDS-PA6E胶中分子量大约为90Kda，与预测值相符。

实施例4

抗体的制备

用实施例3中获得蛋白用作抗原，在兔中制备多克隆抗体。具体程序如下：第一次免疫纯种新西兰兔，蛋白用量为240ug/只，用弗氏完全佐剂。4周后，第二次免疫，蛋白用量为140ug/只，用不完全佐剂。之后2周，第三次免疫，蛋白用量为120ug/只，用不完全佐剂。

获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人Rhbdl5蛋白(实施例3)的能力加以评估。结果发现，抗体可特异性地与Rhbdl5蛋白发生结合。

实施例5

秃发易感性的检测试剂盒

如实施例1-3所述，SEQ ID NO：1中846位C→T(该突变造成第259位氨基酸Thr→Met)和1706位C→T的突变，与秃发密切相关。因此，可基于这些突变设计引物在以病人的基因组为模板进行扩增进行检测，例如SEQ ID NO：20和21，SEQ ID NO：22和23。

序列(5′-3′)	SEQ ID NO：
序列(5′-3′)	SEQ ID NO：	引物对1	Fwd 5-CGTTCAGCTTGCAGAATCTC-3	20
Rev 5-CCACATAGGACCATGCCACA-3	21	引物对1	Fwd 5-CGTTCAGCTTGCAGAATCTC-3	20
Rev 5-CCACATAGGACCATGCCACA-3	21	引物对2	Fwd 5-GACCCACCAGCCTTCTTCT-3	22
Rev 5-AAGCCTGTGTGGTTGCTCC-3	23	引物对2	Fwd 5-GACCCACCAGCCTTCTTCT-3	22

制备一检测SEQ ID NO：1中846位C→T的突变试剂盒(100人次)，它含有：

名称编号数量

正向引物 SEQ ID NO：20 100pmol

反向引物 SEQ ID NO：21 100pmol

PCR缓冲液若干

制备一检测SEQ ID NO：1中1706 C→T的突变试剂盒(100人次)，它含有：

名称编号数量

正向引物 SEQ ID NO：22 100pmol

反向引物 SEQ ID NO：23 100pmol

PCR缓冲液若干

抽提取待检测对象的皮肤细胞的mRNA，转录成cDNA。将秃发易感性检测试剂盒中的PCR引物稀释到1μmol/μl，以所制备的cDNA为模板与所提供的引物进行PCR反应。PCR产物纯化后，用ABI-PRISM^TM 377 DNA测序仪进行荧光标记末端终止法双向测序，用Polyphred软件进行序列的判读和SNP确认。

检测结果表明，具有846位C→T和1706位C→T的检测对象(年龄)的秃发易感性明显高于正常人群。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生物工程研究中心

<120>利用人Rhbdl5基因及其编码产物诊断和治疗秃发的方法

<130>040333

<160>25

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>3118

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(71)..(2551)

<223>

<400>1

gccctttcac agcaagaccc ggaagccgcg ggcaaactca gactcgaagc cctcccgcct 60

cctgcccaca atg gcc tct gct gac aag aat ggc ggg agc gtg tcc tct 109

Met Ala Ser Ala Asp Lys Asn Gly Gly Ser Val Ser Ser

1 5 10

gtg tcc agc agc cgc ctg cag agc cgg aag cca ccc aac ctc tcc atc 157

Val Ser Ser Ser Arg Leu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Leu Ser Ile

15 20 25

acc atc ccg cca ccc gag aaa gag acc cag gcc cct ggc gag cag gac 205

Thr Ile Pro Pro Pro Glu Lys Glu Thr Gln Ala Pro Gly Glu Gln Asp

30 35 40 45

agc atg ctg cct gag agg aag aac cca gcc tac ttg aag agc gtc agc 253

Ser Met Leu Pro Glu Arg Lys Asn Pro Ala Tyr Leu Lys Ser Val Ser

50 55 60

ctc cag gag cca cgc agc cga tgg cag gag agt tca gag aag cgc cct 301

Leu Gln Glu Pro Arg Ser Arg Trp Gln Glu Ser Ser Glu Lys Arg Pro

65 70 75

ggc ttc cgc cgc cag gcc tca ctg tcc cag agc atc cgc aag ggc gca 349

Gly Phe Arg Arg Gln Ala Ser Leu Ser Gln Ser Ile Arg Lys Gly Ala

80 85 90

gcc cag tgg ttt gga gtc agc ggc gac tgg gag ggg cag cgg cag cag 397

Ala Gln Trp Phe Gly Val Ser Gly Asp Trp Glu Gly Gln Arg Gln Gln

95 100 105

tgg cag cgc cgc agc ctg cac cac tgc agc atg cgc tac ggc cgc ctg 445

Trp Gln Arg Arg Ser Leu His His Cys Ser Met Arg Tyr Gly Arg Leu

110 115 120 125

aag gcc tcg tgc cag cgt gac ctg gag ctc ccc agc cag gag gca ccg 493

Lys Ala Ser Cys Gln Arg Asp Leu Glu Leu Pro Ser Gln Glu Ala Pro

130 135 140

tcc ttc cag ggc act gag tcc cca aag ccc tgc aag atg ccc aag att 541

Ser Phe Gln Gly Thr Glu Ser Pro Lys Pro Cys Lys Met Pro Lys Ile

145 150 155

gtg gat ccg ctg gcc cgg ggc cgg gcc ttc cgc cac ccg gag gag atg 589

Val Asp Pro Leu Ala Arg G1y Arg Ala Phe Arg His Pro Glu Glu Met

160 165 170

gac agg ccc cac gcc ctg cac cca ccg ctg acc ccc gga gtc ctg tcc 637

Asp Arg Pro His Ala Leu His Pro Pro Leu Thr Pro Gly Val Leu Ser

175 180 185

ctc acc tcc ttc acc agt gtc cgt tct ggc tac tcc cac ctg cca cgc 685

Leu Thr Ser Phe Thr Ser Val Arg Ser Gly Tyr Ser His Leu Pro Arg

190 195 200 205

cgc aag aga atg tct gtg gcc cac atg agc ttg caa gct gcc gct gcc 733

Arg Lys Arg Met Ser Val Ala His Met Ser Leu Gln Ala Ala Ala Ala

210 215 220

ctc ctc aag ggg cgc tcg gtg ctg gat gcc acc gga cag cgg tgc cgg 781

Leu Leu Lys Gly Arg Ser Val Leu Asp Ala Thr Gly Gln Arg Cys Arg

225 230 235

gtg gtc aag cgc agc ttt gcc ttc ccg agc ttc ctg gag gag gat gtg 829

Val Val Lys Arg Ser Phe Ala Phe Pro Ser Phe Leu Glu Glu Asp Val

240 245 250

gtc gat ggg gca gac acg ttt gac tcc tcc ttt ttt agt aag gaa gaa 877

Val Asp Gly Ala Asp Thr Phe Asp Ser Ser Phe Phe Ser Lys Glu Glu

255 260 265

atg agc tcc atg cct gat gat gtc ttt gag tcc ccc cca ctc tct gcc 925

Met Ser Ser Met Pro Asp Asp Val Phe Glu Ser Pro Pro Leu Ser Ala

270 275 280 285

agc tac ttc cga ggg atc cca cac tca gcc tcc cct gtc tcc ccc gat 973

Ser Tyr Phe Arg Gly Ile Pro His Ser Ala Ser Pro Val Ser Pro Asp

290 295 300

ggg gtg caa atc cct ctg aag gag tat ggc cga gcc cca gtc ccc ggg 1021

Gly Val Gln Ile Pro Leu Lys Glu Tyr Gly Arg Ala Pro Val Pro Gly

305 310 315

ccc cgg cgc ggc aag cgc atc gcc tcc aag gtg aag cac ttt gcc ttt 1069

Pro Arg Arg Gly Lys Arg Ile Ala Ser Lys Val Lys His Phe Ala Phe

320 325 330

gat cgg aag aag cgg cac tac ggc ctc ggc gtg gtg ggc aac tgg ctg 1117

Asp Arg Lys Lys Arg His Tyr Gly Leu Gly Val Val Gly Asn Trp Leu

335 340 345

aac cgc agc tac cgc cgc agc atc agc agc act gtg cag cgg cag ctg 1165

Asn Arg Ser Tyr Arg Arg Ser Ile Ser Ser Thr Val Gln Arg Gln Leu

350 355 360 365

gag agc ttc gac agc cac cgg ccc tac ttc acc tac tgg ctg acc ttc 1213

Glu Ser Phe Asp Ser His Arg Pro Tyr Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe

370 375 380

gtc cat gtc atc atc acg ctg ctg gtg att tgc acg tat ggc atc gca 1261

Val His Val Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Cys Thr Tyr Gly Ile Ala

385 390 395

ccc gtg ggc ttt gcc cag cac gtc acc acc cag ctg gtg ctg cgg aac 1309

Pro Val Gly Phe Ala Gln His Val Thr Thr Gln Leu Val Leu Arg Asn

400 405 410

aaa ggt gtg tac gag agc gtg aag tac atc cag cag gag aac ttc tgg 1357

Lys Gly Val Tyr Glu Ser Val Lys Tyr Ile Gln Gln Glu Asn Phe Trp

415 420 425

gtt ggc ccc agc tcg att gac ctg atc cac ctg ggg gcc aag ttc tca 1405

Val Gly Pro Ser Ser Ile Asp Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser

430 435 440 445

ccc tgc atc cgg aag gac ggg cag atc gag cag ctg gtg ctg cgc gag 1453

Pro Cys Ile Arg Lys Asp Gly Gln Ile Glu Gln Leu Val Leu Arg Glu

450 455 460

cga gac ctg gag cgg gac tca ggc tgc tgt gtc cag aat gac cac tcc 1501

Arg Asp Leu Glu Arg Asp Ser Gly Cys Cys Val Gln Asn Asp His Ser

465 470 475

gga tgc atc cag acc cag cgg aag gac tgc tcg gag act ttg gcc act 1549

Gly Cys Ile Gln Thr Gln Arg Lys Asp Cys Ser Glu Thr Leu Ala Thr

480 485 490

ttt gtc aag tgg cag gat gac act ggg ccc ccc atg gac aag tct gat 1597

Phe Val Lys Trp Gln Asp Asp Thr Gly Pro Pro Met Asp Lys Ser Asp

495 500 505

ctg ggc cag aag cgg act tcg ggg gct gtc tgc cac cag gac ccc agg 1645

Leu Gly Gln Lys Arg Thr Ser Gly Ala Val Cys His Gln Asp Pro Arg

510 515 520 525

acc tgc gag gag cca gcc tcc agc ggt gcc cac atc tgg ccc gat gac 1693

Thr Cys Glu Glu Pro Ala Ser Ser Gly Ala His Ile Trp Pro Asp Asp

530 535 540

atc act aag tgg ccg atc tgc aca gag cag gcc agg agc aac cac aca 1741

Ile Thr Lys Trp Pro Ile Cys Thr Glu Gln Ala Arg Ser Asn His Thr

545 550 555

ggc ttc ctg cac atg gac tgc gag atc aag ggc cgc ccc tgc tgc atc 1789

Gly Phe Leu His Met Asp Cys Glu Ile Lys Gly Arg Pro Cys Cys Ile

560 565 570

ggc acc aag ggc agc tgt gag atc acc acc cgg gaa tac tgt gag ttc 1837

Gly Thr Lys Gly Ser Cys Glu Ile Thr Thr Arg Glu Tyr Cys Glu Phe

575 580 585

atg cac ggc tat ttc cat gag gaa gca aca ctc tgc tcc cag gtg cac 1885

Met His Gly Tyr Phe His Glu Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His

590 595 600 605

tgc ttg gac aag gtg tgt ggg ctg ctg ccc ttc ctc aac cct gag gtc 1933

Cys Leu Asp Lys Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val

610 615 620

cca gat cag ttc tac agg ctc tgg ctg tct ctc ttc cta cat gct ggc 198l

Pro Asp Gln Phe Tyr Arg Leu Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly

625 630 635

gtg gtg cac tgc ctc gtg tct gtg gtc ttt caa atg acc atc ctg agg 2029

Val Val His Cys Leu Val Ser Val Val Phe Gln Met Thr Ile Leu Arg

640 645 650

gac ctg gag aag ctg gcc ggc tgg cac cgt atc gcc atc atc ttc atc 2077

Asp Leu Glu Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Phe Ile

655 660 665

ctc agt ggc atc aca ggc aac ctc gcc agt gcc atc ttt ctc cca tac 2125

Leu Ser Gly Ile Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr

670 675 680 685

cgg gca gag gtg ggc ccg gcc ggc tca cag ttc ggc ctc ctc gcc tgc 2173

Arg Ala Glu Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Leu Leu Ala Cys

690 695 700

ctc ttc gtg gag ctc ttc cag agc tgg ccg ctg ctg gag agg ccc tgg 2221

Leu Phe Val Glu Leu Phe Gln Ser Trp Pro Leu Leu Glu Arg Pro Trp

705 710 715

aag gcc ttc ctc aac ctc tcg gcc atc gtg ctc ttc ctg ttc atc tgt 2269

Lys Ala Phe Leu Asn Leu Ser Ala Ile Val Leu Phe Leu Phe Ile Cys

720 725 730

ggc ctc ctg ccc tgg atc gac aac atc gcc cac atc ttc ggc ttc ctc 2317

Gly Leu Leu Pro Trp Ile Asp Asn Ile Ala His Ile Phe Gly Phe Leu

735 740 745

agt ggc ctg ctg ctg gcc ttc gcc ttc ctg ccc tac atc acc ttc ggc 2365

Ser Gly Leu Leu Leu Ala Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Thr Phe Gly

750 755 760 765

acc agc gac aag tac cgc aag cgg gca ctc atc ctg gtg tca ctg ctg 2413

Thr Ser Asp Lys Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Ile Leu Val Ser Leu Leu

770 775 780

gcc ttt gcc ggc ctc ttc gcc gcc ctc gtg ctg tgg ctg tac atc tac 2461

Ala Phe Ala Gly Leu Phe Ala Ala Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ile Tyr

785 790 795

ccc att aac tgg ccc tgg atc gag cac ctc acc tgc ttc ccc ttc acc 2509

Pro Ile Asn Trp Pro Trp Ile Glu His Leu Thr Cys Phe Pro Phe Thr

800 805 810

agc cgc ttc tgc gag aag tat gag ctg gac cag gtg ctg cac 2551

Ser Arg Phe Cys Glu Lys Tyr Glu Leu Asp Gln Val Leu His

815 820 825

tgaccgctgg gccacacggc tgcccctcag ccctgctgga acagggtctg cctgcgaggg 2611

ctgccctctg cagagcgctc tctgtgtgcc agagagccag agacccaaga cagggcccgg 2671

gctctggacc tgggtgcccc cctgccaggc gaggctgact ccgcgtgaga tggttggtta 2731

aggcggggtt tttctggggc gtgaggcctg tgagatcctg acccaagctc aggcacaccc 2791

aaggcacctg cctctctgag tcttgggtct cagttcctaa tatcccgctc cttgctgaga 2851

ccatctcctg gggcagggtc cttttcttcc caggtcctca gcgctgcctc tgctggtgcc 2911

ttctccccca ctactactgg agcgtgccct tgctggggac gtggctgtgc cctcagttgc 2971

ccccagggct gggtgcccac catgcccctt cctctttctc ctcctacctc tgccctgtga 3031

gcccatccat aaggctctca gatgggacat tgtgggaaag gctttggcca tggtctgggg 3091

gcagagaaca aggggggaga cacaagt 3118

<210>2

<211>827

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Ala Ser Ala Asp Lys Asn Gly Gly Ser Val Ser Ser Val Ser Ser

1 5 10 15

Ser Arg Leu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Leu Ser Ile Thr Ile Pro

20 25 30

Pro Pro Glu Lys Glu Thr Gln Ala Pro Gly Glu Gln Asp Ser Met Leu

35 40 45

Pro Glu Arg Lys Asn Pro Ala Tyr Leu Lys Ser Val Ser Leu Gln Glu

50 55 60

Pro Arg Ser Arg Trp Gln Glu Ser Ser Glu Lys Arg Pro Gly Phe Arg

65 70 75 80

Arg Gln Ala Ser Leu Ser Gln Ser Ile Arg Lys Gly Ala Ala Gln Trp

85 90 95

Phe Gly Val Ser Gly Asp Trp Glu Gly Gln Arg Gln Gln Trp Gln Arg

100 105 110

Arg Ser Leu His His Cys Ser Met Arg Tyr Gly Arg Leu Lys Ala Ser

115 120 125

Cys Gln Arg Asp Leu Glu Leu Pro Ser Gln Glu Ala Pro Ser Phe Gln

130 135 140

Gly Thr Glu Ser Pro Lys Pro Cys Lys Met Pro Lys Ile Val Asp Pro

145 150 155 160

Leu Ala Arg Gly Arg Ala Phe Arg His Pro Glu Glu Met Asp Arg Pro

165 170 175

His Ala Leu His Pro Pro Leu Thr Pro Gly Val Leu Ser Leu Thr Ser

l80 185 190

Phe Thr Ser Val Arg Ser Gly Tyr Ser His Leu Pro Arg Arg Lys Arg

195 200 205

Met Ser Val Ala His Met Ser Leu Gln Ala Ala Ala Ala Leu Leu Lys

210 215 220

Gly Arg Ser Val Leu Asp Ala Thr Gly Gln Arg Cys Arg Val Val Lys

225 230 235 240

Arg Ser Phe Ala Phe Pro Ser Phe Leu Glu Glu Asp Val Val Asp Gly

245 250 255

Ala Asp Thr Phe Asp Ser Ser Phe Phe Ser Lys Glu Glu Met Ser Ser

260 265 270

Met Pro Asp Asp Val Phe Glu Ser Pro Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Phe

275 280 285

Arg Gly Ile Pro His Ser Ala Ser Pro Val Ser Pro Asp Gly Val Gln

290 295 300

Ile Pro Leu Lys Glu Tyr Gly Arg Ala Pro Val Pro Gly Pro Arg Arg

305 310 315 320

Gly Lys Arg Ile Ala Ser Lys Val Lys His Phe Ala Phe Asp Arg Lys

325 330 335

Lys Arg His Tyr Gly Leu Gly Val Val Gly Asn Trp Leu Asn Arg Ser

340 345 350

Tyr Arg Arg Ser Ile Ser Ser Thr Val Gln Arg Gln Leu Glu Ser Phe

355 360 365

Asp Ser His Arg Pro Tyr Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His Val

370 375 380

Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Cys Thr Tyr Gly Ile Ala Pro Val Gly

385 390 395 400

Phe Ala Gln His Val Thr Thr Gln Leu Val Leu Arg Asn Lys Gly Val

405 410 415

Tyr Glu Ser Val Lys Tyr Ile Gln Gln Glu Asn Phe Trp Val Gly Pro

420 425 430

Ser Ser Ile Asp Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys Ile

435 440 445

Arg Lys Asp Gly Gln Ile Glu Gln Leu Val Leu Arg Glu Arg Asp Leu

450 455 460

Glu Arg Asp Ser Gly Cys Cys Val Gln Asn Asp His Ser Gly Cys Ile

465 470 475 480

Gln Thr Gln Arg Lys Asp Cys Ser Glu Thr Leu Ala Thr Phe Val Lys

485 490 495

Trp Gln Asp Asp Thr Gly Pro Pro Met Asp Lys Ser Asp Leu Gly Gln

500 505 510

Lys Arg Thr Ser Gly Ala Val Cys His Gln Asp Pro Arg Thr Cys Glu

515 520 525

Glu Pro Ala Ser Ser Gly Ala His Ile Trp Pro Asp Asp Ile Thr Lys

530 535 540

Trp Pro Ile Cys Thr Glu Gln Ala Arg Ser Asn His Thr Gly Phe Leu

545 550 555 560

His Met Asp Cys Glu Ile Lys Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys

565 570 575

Gly Ser Cys Glu Ile Thr Thr Arg Glu Tyr Cys Glu Phe Met His Gly

580 585 590

Tyr Phe His Glu Glu Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Leu Asp

595 600 605

Lys Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln

610 615 620

Phe Tyr Arg Leu Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Val Val His

625 630 635 640

Cys Leu Val Ser Val Val Phe Gln Met Thr Ile Leu Arg Asp Leu Glu

645 650 655

Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ala Ile Ile Phe Ile Leu Ser Gly

660 665 670

Ile Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu

675 680 685

Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Leu Leu Ala Cys Leu Phe Val

690 695 700

Glu Leu Phe Gln Ser Trp Pro Leu Leu Glu Arg Pro Trp Lys Ala Phe

705 710 715 720

Leu Asn Leu Ser Ala Ile Val Leu Phe Leu Phe Ile Cys Gly Leu Leu

725 730 735

Pro Trp Ile Asp Asn Ile Ala His Ile Phe Gly Phe Leu Ser Gly Leu

740 745 750

Leu Leu Ala Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Thr Phe Gly Thr Ser Asp

755 760 765

Lys Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Ile Leu Val Ser Leu Leu Ala Phe Ala

770 775 780

Gly Leu Phe Ala Ala Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ile Tyr Pro Ile Asn

785 790 795 800

Trp Pro Trp Ile Glu His Leu Thr Cys Phe Pro Phe Thr Ser Arg Phe

805 810 815

Cys Glu Lys Tyr Glu Leu Asp Gln Val Leu His

820 825

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

tgtacagagc aaggagaaga ca 22

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

ctttcccaca atgtcccatc 20

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>5

ggagctccag gtcacgct 18

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>6

ccacagactg aggcttgaca 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>7

gatgctctgg gacagtgagg 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>8

acttgaagag cgtcagcctc 20

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>9

atcgaccaca tcctcctcc 19

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>10

agtcctgtcc ctcacctcct 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>11

ggacgaaggt cagccagtag 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>12

cggccctact tcacctactg 20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>13

ttgatctcgc agtccatgtg 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>14

ggcccgatga catcactaag 20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>15

tgaacaggaa gagcacgatg 20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>16

cagtgccatc tttctcccat 20

<210>17

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>17

ctgtcttggg tctctggctc 20

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>18

tgcgagaagt atgagctgga 20

<210>19

<211>827

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculus)

<400>19

Met Ala Ser Ala Asp Lys Asn Gly Ser Asn Leu Pro Ser Val Ser Gly

1 5 10 15

Ser Arg Leu Gln Ser Arg Lys Pro Pro Asn Leu Ser Ile Thr Ile Pro

20 25 30

Pro Pro Glu Ser Gln Ala Pro Gly Glu Gln Asp Ser Met Leu Pro Glu

35 40 45

Arg Arg Lys Asn Pro Ala Tyr Leu Lys Ser Val Ser Leu Gln Glu Pro

50 55 60

Arg Gly Arg Trp Gln Glu Gly Ala Glu Lys Arg Pro Gly Phe Arg Arg

65 70 75 80

Gln Ala Ser Leu Ser Gln Ser Ile Arg Lys Ser Thr Ala Gln Trp Phe

85 90 95

Gly Val Ser Gly Asp Trp Glu Gly Lys Arg Gln Asn Trp His Arg Arg

100 105 110

Ser Leu His His Cys Ser Val His Tyr Gly Arg Leu Lys Ala Ser Cys

115 120 125

Gln Arg Glu Leu Glu Leu Pro Ser Gln Glu Val Pro Ser Phe Gln Gly

130 135 140

Thr Glu Ser Pro Lys Pro Cys Lys Met Pro Lys Ile Val Asp Pro Leu

145 150 155 160

Ala Arg Gly Arg Ala Phe Arg His Pro Asp Glu Val Asp Arg Pro His

165 170 175

Ala Ala His Pro Pro Leu Thr Pro Gly Val Leu Ser Leu Thr Ser Phe

180 185 190

Thr Ser Val Arg Ser Gly Tyr Ser His Leu Pro Arg Arg Lys Arg Ile

195 200 205

Ser Val Ala His Met Ser Phe Gln Ala Ala Ala Ala Leu Leu Lys Gly

2l0 215 220

Arg Ser Val Leu Asp Ala Thr Gly Gln Arg Cys Arg His Val Lys Arg

225 230 235 240

Ser Phe Ala Tyr Pro Ser Phe Leu Glu Glu Asp Ala Val Asp Gly Ala

245 250 255

Asp Thr Phe Asp Ser Ser Phe Phe Ser Lys Glu Glu Met Ser Ser Met

260 265 270

Pro Asp Asp Val Phe Glu Ser Pro Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Phe Arg

275 280 285

Gly Val Pro His Ser Ala Ser Pro Val Ser Pro Asp Gly Val His Ile

290 295 300

Pro Leu Lys Glu Tyr Ser Gly Gly Arg Ala Leu Gly Pro Gly Thr Gln

305 310 315 320

Arg Gly Lys Arg Ile Ala Ser Lys Val Lys His Phe Ala Phe Asp Arg

325 330 335

Lys Lys Arg His Tyr Gly Leu Gly Val Val Gly Asn Trp Leu Asn Arg

340 345 350

Ser Tyr Arg Arg Ser Ile Ser Ser Thr Val Gln Arg Gln Leu Glu Ser

355 360 365

Phe Asp Ser His Arg Pro Tyr Phe Thr Tyr Trp Leu Thr Phe Val His

370 375 380

Ile Ile Ile Thr Leu Leu Val Ile Cys Thr Tyr Gly Ile Ala Pro Val

385 390 395 400

Gly Phe Ala Gln His Val Thr Thr Gln Leu Val Leu Lys Asn Arg Gly

405 410 415

Val Tyr Glu Ser Val Lys Tyr Ile Gln Gln Glu Asn Phe Trp Ile Gly

420 425 430

Pro Ser Ser Ile Asp Leu Ile His Leu Gly Ala Lys Phe Ser Pro Cys

435 440 445

Ile Arg Lys Asp Gln Gln Ile Glu Gln Leu Val Arg Arg Glu Arg Asp

450 455 460

Ile Glu Arg Thr Ser Gly Cys Cys Val Gln Asn Asp Arg Ser Gly Cys

465 470 475 480

Ile Gln Thr Leu Lys Lys Asp Cys Ser Glu Thr Leu Ala Thr Phe Val

485 490 495

Lys Trp Gln Asn Asp Thr Gly Pro Ser Asp Lys Ser Asp Leu Ser Gln

500 505 510

Lys Gln Pro Ser Ala Val Val Cys His Gln Asp Pro Arg Thr Cys Glu

515 520 525

Glu Pro Ala Ser Ser Gly Ala His Ile Trp Pro Asp Asp Ile Thr Lys

530 535 540

Trp Pro Ile Cys Thr Glu Gln Ala Gln Ser Asn His Thr Gly Leu Leu

545 550 555 560

His Ile Asp Cys Lys Ile Lys Gly Arg Pro Cys Cys Ile Gly Thr Lys

565 570 575

Gly Ser Cys Glu Ile Thr Thr Arg Glu Tyr Cys Glu Phe Met His Gly

580 585 590

Tyr Phe His Glu Asp Ala Thr Leu Cys Ser Gln Val His Cys Leu Asp

595 600 605

Lys Val Cys Gly Leu Leu Pro Phe Leu Asn Pro Glu Val Pro Asp Gln

610 615 620

Phe Tyr Arg Ile Trp Leu Ser Leu Phe Leu His Ala Gly Ile Val His

625 630 635 640

Cys Leu Val Ser Val Val Phe Gln Met Thr Ile Leu Arg Asp Leu Glu

645 650 655

Lys Leu Ala Gly Trp His Arg Ile Ser Ile Ile Phe Ile Leu Ser Gly

660 665 670

Ile Thr Gly Asn Leu Ala Ser Ala Ile Phe Leu Pro Tyr Arg Ala Glu

675 680 685

Val Gly Pro Ala Gly Ser Gln Phe Gly Leu Leu Ala Cys Leu Phe Val

690 695 700

Glu Leu Phe Gln Ser Trp Gln Leu Leu Glu Arg Pro Trp Lys Ala Phe

705 710 715 720

Phe Asn Leu Ser Ala Ile Val Leu Phe Leu Phe Ile Cys Gly Leu Leu

725 730 735

Pro Trp Ile Asp Asn Ile Ala His Ile Phe Gly Phe Leu Ser Gly Met

740 745 750

Leu Leu Ala Phe Ala Phe Leu Pro Tyr Ile Thr Phe Gly Thr Ser Asp

755 760 765

Lys Tyr Arg Lys Arg Ala Leu Ile Leu Val Ser Leu Leu Val Phe Ala

770 775 780

Gly Leu Phe Ala Ser Leu Val Leu Trp Leu Tyr Ile Tyr Pro Ile Asn

785 790 795 800

Trp Pro Trp Ile Glu Tyr Leu Thr Cys Phe Pro Phe Thr Set Arg Phe

805 810 815

Cys Glu Lys Tyr Glu Leu Asp Gln Val Leu His

820 825

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>20

cgttcagctt gcagaatctc 20

<210>21

<211>20

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>21

ccacatagga ccatgccaca 20

<210>22

<211>19

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>22

gacccaccag ccttcttct 19

<210>23

<211>19

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>23

aagcctgtgt ggttgctcc 19

<210>24

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>24

ataaagctta tggcctcagc tgacaagaat ggcagcaacc tccca 45

<210>25

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>25

ccgctcgagg ctcgatctgg tccacgatgt gatt 34

Claims

1.一种分离的Rhbdl5多肽，其特征在于，该多肽选自下组：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、其保守性变异多肽、其活性片段、或其活性衍生物。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(i)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(ii)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列且第259位为Met的多肽；

(iii)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列且第546位为Ser的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组：

(c-1)具有SEQ ID NO：1中第1-3118位的序列；

(c-2)具有SEQ ID NO：1中第71-2551位的序列；

(c-3)具有SEQ ID NO：1中第71-2551位且第846位为T的序列；

(c-4)具有SEQ ID NO：1中第71-2551位且第1706位为T的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。

8.一种Rhbdl5蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在表达Rhbdl5蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出Rhbdl5蛋白。

9.一种检测秃发易感性的试剂盒，其特征在于，它包括特异性扩增Rhbdl5基因或转录本的引物。

10.一种组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的多肽以及药学上可接受的载体。