CN1706845A - 季胺白屈菜生物碱硫代磷酸衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了可从以下过程中获得的生物碱反应产物：生物碱与烃化剂(最好是硫替派)进行反应，之后通过水洗或利用适当的水溶剂洗涤，将未反应的烃化剂和其它溶于水的成分从反应混合物中去除，然后利用强酸，最好是硫化氢(HCl)对反应混合物进行处理，以沉淀反应物的水溶性盐。沉淀的反应产物至少包含一个季胺生物碱衍生物，并可用作疾病预防或治疗应用的药物，尤其是用作治疗免疫功能紊乱或代谢紊乱以及癌症的药物。

Description

季胺白屈菜生物碱硫代磷酸衍生物

发明领域

本发明主要涉及了药物开发和卫生保健领域，其与白屈菜生物碱及其衍生物有关，其中，白屈菜生物碱分子中的氮为四元氮。此外，本发明还与这种化合物的制作方法、包含这种化合物的混合物以及对各种疾病和身体状况的治疗有关。

技术发展水平

白屈菜生物碱以及含有白屈菜生物碱的混合物在此项技术领域中众所周知，因为它们是白屈菜生物碱或某些白屈菜生物碱衍生物在治疗各种身体状况和疾病(包括代谢紊乱和肿瘤)方面的治疗应用。

通过将某些Chelidonium majus L.生物碱与三(1-吖啶基)磷化氢硫化物在有机溶剂中进行反应，DE 2 028 330与US 3 865 830揭示了硫代磷酰胺-异喹啉加合物的制备。

通过与制癌的磷化合物(通过将其转化成它们的盐并以水溶形式提供的)进行反应，AT354 644与AT 377 988描述了生物碱的磷衍生物制备工艺。这种已公开工艺的缺点是反应产物没有完全转化成水溶性盐，大部分反应产物仍不溶于水。

US 5 981 512揭示了在AT 377 988和AT 354 644中所得出的物质在治疗辐射伤害时的效用。

上述专利中描述的化合物具有不同的抑止细胞生长和制癌活性。生物碱混合物，尤其是Chelidonium majus L.的总生物碱，已证明最有希望成为治癌新药，其中的约效已在有关癌症治疗的多项研究中加以展示。未反应的反应物从反应完成后的合成混合物中去除。由于三(1-吖啶基)磷化氢硫化物(以下也称为″硫替派″)可溶于苯、乙醚或氯仿等有机溶剂中，建议在先前的工艺方法中，用乙醚洗涤反应产物将未反应的三(1-吖啶基)磷化氢硫化物从合成的混合物中去除。

尽管上述制造具有药物活性的白屈菜生物碱衍生物的先前工艺方法同样需要利用易燃甚或具有爆炸性的有机溶剂净化最终产物，但目前已发现，还可以使用水溶剂来完成净化，这样甚至会得到更好的效果。

本发明简述

一方面，本发明是涉及了利用相应的烃化剂进行的生物碱反应产物——尤其是白屈菜生物碱、氧化白屈菜碱或甲氧基白屈菜生物碱——的新型制备工艺，该工艺最少包含一步在烃化反应完成后利用水溶剂(最好是水)进行洗涤的步骤。

该工艺还包含了将生物碱衍生物转化成水溶性盐骤，以制成低毒性且具有宽作用光谱范围的可注射药剂的步骤。

另一方面，本发明涉及了水溶性反应产物，例如合成白屈菜生物碱衍生物，其中该生物碱分子开头的二元氮已被转化成四元氮，其中该四元氮的第四个配位基很少为烷基原子团，而大多是甲基或乙基原子团，或替代的甲基或乙基原子团，例如硫替派原子团。在首先具体形态中，季胺白屈菜生物碱衍生物具有的性质如在目标组织——尤其是癌组织——中选择性地进行积聚。

另一方面，本发明涉及了包含上述其中一种季胺生物碱的药物成分，尤其是季胺白屈菜生物碱——可从按照本发明的工艺中获得的衍生物。

本发明还涉及了包含作为医疗用药物的季胺生物碱衍生物的反应产物，以及将上述衍生物用于制作医疗各种疾病或身体状况的药物成分。

本发明涉及的其它方面在以下要求中进行了说明。

本发明详述

按照本发明进行的过程包含了在带有烃化剂(最好是本身具有医疗活性的烃化剂，例如毒害细胞的磷酰胺或至少包含一个吖啶基的磷酸衍生物)的有机溶剂中对生物碱或生物碱混合物进行反应，然后用水洗涤反应产物。用水或类似的水溶剂(例如适度的盐溶液)进行的洗涤步骤促进了将水溶性差或非水溶性反应产物即季胺生物碱烃化剂转化成水溶性化合物(例如盐)的其它后续步骤。如果烃化剂是对细胞有毒害的物质，则该烃化剂最好也是水溶性的，或至少一接触水便分解成水溶性成分，以便通过水洗将未反应的烃化剂或烃化成分从反应混合物中去除。

水洗步骤可充分简化制作过程，因为这无需对纯有机溶剂(例如甲醚)的爆炸危险采取复杂的安全防范措施，从而可不断简化该过程。而且，还将反应混合物中存在的非理想的水溶性成分从反应产物中分离出来并去除。令人吃惊的是，人们还发现，将产物转化成水溶性的后续步骤的效率比用纯有机溶剂进行洗涤的步骤高出10到15倍，通过这种方式，水洗步骤对反应产物的结构和组成具有积极影响，从而极大改善了理想的最终产物的产生。

例如，本过程可用于生物碱与含有AT 377 988要求1中提到的化合物的制癌磷进行烃化反应，这些磷化合物如图3所示，图3为尤其适用的当前应用，特别是那些具有吖啶基的应用。

此处使用的术语“白屈菜生物碱”应同样指从包含白屈菜生物碱、氧化白屈菜碱和甲氧基白屈菜生物碱的分组中选择的任一成员，除非另行要求或从描述中以隐含方式另行推论。与本发明相符的相应有机溶剂为任何用于反应的生物碱可溶于其中的药剂。例如，生物碱能够在促进和导致生物碱反应的有机溶剂中进行分解，例如从由氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷和三氯乙烷的分组中选择的溶剂。

生物碱的烃化反应在较高温度下进行反应，在溶剂达到沸点时效果最佳。

水洗后，最终反应产物被转化成水溶性的。这可以按照AT 377 988和AT 354 644中所述的过程通过转化成水溶性盐，尤其是转化成盐酸盐来实现，例如，在出现盐酸盐沉淀的过程中或之后将最终反应产物放入强酸液体或气体(例如HCl气体)中，或将HCl溶液加入洗涤的反应产物的有机溶剂中。似乎通过这种酸处理，大多数烃化剂从生物碱和烃化剂之间形成的中间反应化合物中分离出来，留下了变异的生物碱衍生物，其中开头的三元氮原子已被转化成四元氮，在四元氮中，氢原子团或产生于烃化剂的原子团作为第四个配合基收到限制，该原

子团最好是从由甲基、乙基和三(1-吖啶基)磷化氢硫化物原子团组成的分组中选择出来的。为了更好的理解，随后的公式(1)阐明了本发明以白屈菜生物碱为例的典型四元生物碱反应产物：

R1＝甲基、乙基、三(1-吖啶基)磷化氢硫化物、methyl-R2、ethyl-R2、属于三(1-吖啶基)磷化氢硫化物一部分的R2

根据本发明(见实例3)，从沉淀的其中一个反应产物进行元素分析，似乎——不受理论限制——至少在烃化反应(例如四元反应)终止后通过对反应混合物进行酸处理获得的一部分烃化剂或分解化合物可能会被某种程度地吸留在沉淀物的晶体中，或通过某种方式牢牢地吸附于晶体上，因此利用乙醚和二氯甲烷等有机溶剂洗涤沉淀物的纯化过程不能将其去除。然而，可证明，即使掺入了这种伴随物质，反应产物的全部作用仍可以完全发挥。

反应产物的水溶性盐适合注射溶液的应用。

在本发明的具体体现中，反应是与三(1-吖啶基)磷化氢硫化物(CAS No.52-24-4)进行的，在药典中，该物质也称为硫替派。其他同义词为ledertepa、Onco硫替派、TESPA、tespamine、thiophosphamide、thio-TEPA、thiotriethylenephosphoramide、tifosyl、triaziridinylphosphine sulphide、N，N′，N″-tri-1，2-ethanediylphosphorothioine triamide；N，N′，N″-tri-1，2-ethanediylthiophosphoramide、tri-(ethyleneimino)thiophosphoramide；N，N′，N″-triethylenethiophosphoramide、triethylenethiophosphorotriamide、m-triethylenethiophosphoramide、m-tris(aziridin-1-yl)phosphine sulphide、triethylenethiophosphoramide、tris(1-aziridinyl)phosphine sulphor、tris(ethylene-imino)thiophosphate、TSPA及WR 45312。

在本发明的具体体现中，生物碱(随意，可为Chelidonium majus L.的总生物碱)的萃取物在有机溶剂中与tris(1-aziridinyl)-phosphine sulphide(硫替派)以及最终反应产物(随意，可作为化合物的混合物)进行反应，然后用水进行至少洗一遍。由于硫替派遇水分解，通过这种方法可将反应过后剩余未转化的硫替派残留物从有机相中析出。较好的方法是对包含中间反应产物(即在烃化剂和生物碱之间形成的化合物)的有机溶液用水洗数次，每一次均使其达到饱和。尤为可取的方法是，反复水洗，直至残余的高毒性硫替派已被完全从反应物中去除。

此外，利用水相可将在医疗应用中会导致逆反应甚至会导致肝硬化的某些溶于水的毒性生物碱从合成的混合物中去除，或使其浓度降低。通过艾姆斯氏试验表明，根据本发明制备的这种反应产物可引起突变。

当从Chelidonium majus L.的总生物碱萃取物开始时，最终反应产物为含有分子质量较高的硫替派反应产物的生物碱与生物碱的混合物，以及生物碱降解产物的混合物。由于合成过程不同，生物碱的溶解度可能有所变化。反应产物包含约60～70％的未反应的白屈莱碱与约30～40％的三(1-吖啶基)磷化氢硫化物反应产物这二者的混合物。

叔胺生物碱代表了从Chelidonium majus L.获得的生物碱萃取物最初成分的主要部分。例如，在合成的混合物中可作为最初成分获得以下叔胺生物碱：白屈菜生物碱、普托品、stylopin、别隐品、α高白屈菜生物碱、chelamidine、chelamine、L-金雀花碱、二聚体白屈菜默碱、二氢血根碱、氧化血根碱，氧化白屈菜碱以及甲氧基白屈菜生物碱。

烃化反应终止后，通过水洗步骤将未反应的四元生物碱(例如黄连素)从反应混合物中完全去除，而未反应的水溶性生物碱和烃化的生物碱反应产物仍留在有机溶剂中。根据用于烃化反应的有机溶剂和/或烃化剂的性质，最终的中间反应产物可能包含由硫替派链接的化合物，其中一个硫替派分子与一个、两个或三个白屈菜生物碱、oxy-chelidonine或methoxy-chelidonine分子相链接。此外，它还可能包含烃化的生物碱衍生物，其中，白屈菜生物碱、oxy-chelidonine或methoxy-chelidonine等生物碱分子在其四元氮上与短链的线性烷基原子团相连，尤其是与甲基或乙基相连。而且其他烃化的反应化合物在烃化反应终止后可能位于反应混合物中。

按照本发明从具有硫替派的Chelidonium majus L.的总生物碱中获得的反应产物比从利用diethylether等有机溶剂进行洗涤的类似过程中获得的反应产物具有更好的医疗活性光谱。至少本发明的反应产物中存在的某些化合物，尤其是季胺白屈菜生物碱衍生物能够在癌组织中有选择地积聚，并通过使癌细胞死亡来破坏癌细胞，同时——相比于大多数人都了解的细胞生长抑止剂——还不会攻击健康细胞。这利用该制剂实现了良好的医疗容忍度，并且能够普遍适应因遗传排列而导致癌细胞扩散危险较高的医疗使用甚至个人疾病预防使用。其处理简单，且在医疗剂量中不会出现重大的逆反应。

从具有硫替派的Chelidonium majus L.的总生物碱中获得的反应产物展示了新陈代谢规则中的生物活性，其不仅适用于预防和治疗代谢疾病，例如骨质疏松症，而且还适用于预防和治疗风湿病、过敏症、病毒感染、癫痫症、多发性脑脊髓硬化症、伤疤、皮肤肿瘤、手术后创伤和辐射损伤。

Chelidonium majus L干躁根的提取物可用作合成物的起始反应物。这些根比叶和茎含有更多的生物碱。

令人惊讶的是，最近发现，当从具有商用价值的白屈菜生物碱、氧化白屈菜碱或甲氧基白屈菜生物碱开始并将其作为单独的生物碱源是，按照本发明的方法(例如参见以上实例3)获得的最终反应产物所展示的医疗质量和活性至少可与按照实例1的总白屈菜生物碱烃化反应得到的反应产物相媲美。

常规药物赋形剂，尤其是液剂(例如注射液或浸液)、软膏、压布或悬带，适用于包含按照本发明制备的反应产物的药物。

说明书附图

图1为Chelidonium majus L.根部处获得的全部生物碱成分构成的HPLC图谱。

图2为根据实例1制得的制剂的HPLC指纹图谱。

图3为可用作反应物的某些磷衍生物。

图4为反应产物U-KRS的核磁共振谱。

图5为反应产物U-KRS的UV谱。

图6为白屈菜生物碱盐酸盐的UV谱。

图7为反应产物U-KRS质谱的第一部分。

图8为清晰度更高的反应产物U-KRS质谱的第二部分。

图9为白屈菜生物碱盐酸盐的质谱。

为进一步阐述本发明，列举了以下实例。

实例1：

A)生物碱的萃取：

a.将25克生物碱盐混合物置于水中，然后倒入分液漏斗中。添加100毫升二氯甲烷后，摇动分液漏斗。有机相便会分离出来，然后将其过滤到玻璃瓶中。

b.将1N氢氧化钠(pH8-9)添加到水相中，直至出现浑浊。添加100毫升二氯甲烷后，摇动混合物。有机相便会分离出来，将其与步骤a的二氯甲烷相进行混合。重复该过程，例如重复3遍。过滤并混合有机相。

c.通过添加氢氧化钠将水相的PH值调到10。添加二氯甲烷后，摇动混合物。有机相便会分离出来，将其过滤并与其他有机相进行混合。现在利用氢氧化钠将水相的PH值调到13，然后利用二氯甲烷充分萃取。

d.将这些合并的有机相蒸发至产生一种油状褐色物质。

B)与三(1-吖啶基)磷化氢硫化物进行反应：

将生物碱残余物在二氯甲烷中溶解，然后添加三(1-吖啶基)磷化氢硫化物。在80℃的温度对该混合物进行2小时回流。当冷却至室温后，澄清该反应混合物。然后进行过滤，之后在分液漏斗中利用250毫升的水洗涤滤出物数遍，例如3遍或更多遍。

C)与HCl进行反应

将洗过的溶液装入玻璃烧杯中，加入HCl气体不断搅拌使其达到饱和，盐酸盐便会析出来。将析出物过滤出来，用乙醚洗涤，干燥后将其溶入水中。

在老鼠体内，对于例1制得的反应产物，测定到的LD50值为485mg/kg。在小鼠和大鼠中的验机表明，根据发明制得的产品调节了胸腺的荷尔蒙水平，并在那些胸腺摘除的动物体内诱导合成了具有有类似胸腺素活性的物质。此效果是基于剂量而获得的。该制剂增加了外周血中T-淋巴细胞的数量将近50％(4.04±0.43×109/l处理前，6.24±0.73×109/l处理后)，调节了穿透抗原的体液免疫反映以及脾脏细胞的自然杀伤细胞活性(198.20±17.69％，对照组为71.50±9.10％)，并且提高了动物试验中白血球的干扰素释放能力。动物试验的结果是经过临床观察而确定的。因此，在癌症病人身上也观察到免疫指数得到了改进。

对于预防和免疫学应用，例1中的制剂的使用量为5毫克/70千克体重。对于癌症治疗，每20千克体重使用5毫克该制剂是比较适宜的。

实例2：HPLC指纹

该测定通过离子对反相梯度层析以及使用一个DAD探测器在285纳米处测量吸光度来完成。同时，色谱图通过使用参照生物碱来绘出。另外，进行一种HPLC-MSD分析，通过这个分析可以得出没有哪个峰值在这些生物碱范围之外的。基于下列实验数据可以获得图1和2的HPLC图谱：

柱：LiChrospher 60RP Select B，5μm，125×24mm ID

洗脱液：A)200ml(乙腈)+800ml(水)+1.5g(己烷磺酸)+0.3ml(85％磷酸)

B)900ml(乙腈)+100ml(水)+1.5g(己烷磺酸)+0.3ml(85％磷酸)

梯度：5分钟等度洗脱100％ A；

24分钟到40％ B

1分钟到100％ B

5分钟100％ B；

5分钟100％ A平衡

探测：UV灯285纳米处

洗脱流率：1ml/min，35分钟后停止

进样体积：10μl

样品制备：

反应之前萃取(图1)：将25毫克生物碱通过超声波溶解在40毫升甲醇，接近50毫升，然后通过膜滤器过滤。

反应产物(图2)：将反应产物转化为盐酸盐，以1mg/ml的浓度溶解在水中并调节pH在2.5和6.5之间。

实例3

根据实例1中所述的条件，具有商业可用性的已纯化的白屈菜生物碱(Sigma)与三(1-吖啶基)磷化氢硫化物(＝硫替派)进行了反应。烃化反应终止后，进行洗涤和利用HCl气体进行转化的步骤，按照下列方式进一步处理最终产物：

将340克经过HCl处理的水溶性反应物溶于水中，并使其浓度接近饱和，然后将其置于8℃的冰箱中。数小时后出现自然产生的沉淀，取出264毫克沉淀物(以下称为U-KRS)。该沉淀物由淡黄色的吸水性晶体组成，这种晶体的熔点范围非常小，介于205-207℃(指完全结晶的产物)，用366纳米的UV光照射时会发出浅蓝色的荧光，同时还可以看到黄色的轨迹，橙色和红色的荧光带。当利用薄层色谱分析该产物时，其没有移动，仍然位于起始位置(R_f＝0)，只是轨迹移动到R_f＞0.1。从核磁共振(NMR)谱(图4)中可以清楚地看到U-KRS包含与白屈菜生物碱分子中含有的芳环同类的芳环。UV光谱(图5)显示吸收最大值为148、155、160、205、230及282纳米，非常类似于白屈菜生物碱的UV光谱(图6)，不同于在白屈菜生物碱为240纳米而U-KRS为230纳米时单独出现在峰值中的光谱。这表面U-KRS中的氮为四元，而白屈菜生物碱中的为三元。

从图7与图8(U-KRS)以及图9(白屈菜生物碱)中所示的质谱中可得出进一步的详细分析，从U-KRS的元素分析结果中揭示了以下事物成分(表1)：

表1：U-KRS的元素成分占总体的百分比

元素	总体百分比(％)
		C	45.7045.05
H	5,84
		N	6.566.37
O	22.2519.6
		P	3.273.27
S	2.783.06
		Cl	17.29

以下实例说明了从实例3产生的化合物U-KRS的各种应用：

实例4：通过抗肿瘤药U-KRS对体外细胞增长的选择性抑止

材料和方法

细胞培养是在含有8％ CO₂的潮湿空气中在温度为37-37.5℃的Roux瓶中进行的。合流培养由0.01％的胰岛素和0.2％的EDTA与磷酸盐缓冲盐水的溶液加以分离的，分离比例为1∶5到1∶25。

人类内皮细胞通过胶原酶处理与脐静脉相隔离。内皮细胞的培养液是利用15％热钝化的胎牛血清、200μg/ml内皮细胞增长因子以及90μg/ml的肝磷脂补充的的M199。

荧光显微镜检术

细胞在35毫米的器皿中生长，在U-KRS为100μg/ml时30-60分钟便可孵化。将培养液的空气排空，细胞利用PBS洗涤两遍。将盖玻片安装在细胞上，利用配有氩激光器的共焦激光扫描显微镜使荧光感光，。在]光电倍增器通道上检测所发射的光。其信号便成像于使用MRC 600影像处理软件的视频监视器上。

结果

1.在20-40μg/ml U-KRS范围内测出，内皮细胞的增长约55％收到抑止。该浓度杀死了人类骨肉瘤细胞系。这两种细胞类型的杂和具有于正常细胞几乎相同的敏感性。

2.由于自身荧光的特点，因此可在细胞内对U-KRS进行检测。激光扫描显微镜显示了在恶性细胞中对U-KRS的高度摄取。

实例5：U-KRS用作抗癌剂-耗氧量

材料和方法

在老鼠体内进行试验。两到五只对照动物均被注射了50μl的Ehrlich鼠腹水悬浮液i.p.，该悬浮液为8d old，是从完全成年的捐赠动物身上摄取的。该对照组未加以进一步治疗。在肿瘤培植后立即在测试组的腹部注射了10毫克U-KRS/千克动物质量。

结采

在U-KRS腹腔内注射或皮下注射后植入了腹水肿瘤的老鼠存活时间长于未经其他方法治疗的植入动物。

通过在体外使用电极的方式对腹水肿瘤悬浮液的耗氧量进行测试发现，添加U-KRS后耗氧量略微增加，但随后快速下降，不同于未混有U-KRS的对照悬浮液。

实例6：在啮齿动物中使用U-KRS的吗啡止痛效果的改进。

材料和方法

动物：在雄性Albino Swiss鼠和雄性Wistar鼠身上进行试验。

治疗：将最低剂量为20mg/kg和25mg/kg的U-KRS分别注射到Albino Swiss鼠和Wistar鼠上。

试验过程：在每次试验中，这四组动物均注射了)安慰剂，2)吗啡，3)U-KRS，4)U-KRS与吗啡

结果：

结果表明，同时注射U-KRS和吗啡改进了麻醉止痛药的药效。在老鼠身上反复进行的测试中，这两种物质产生了止痛效果，并且迹象显示止痛持续时间更长。

此结果显示，同时结合吗啡使用的U-KRS将试验动物的敏感度转变成了所描述测试中的感受伤害反应。此结果表明，U-KRS能够与用于癌症的止痛药物互相作用。

实例7：通过衍生的U-KRS在恶性细胞中产生的双模程序化细胞的死亡。

材料和方法

使用K562 erythroleukaemia细胞系，U-KRS产生完全结晶形式，并溶于浓度为1.2mg/ml的水中。

利用亚丙基和流式细胞测量计分析在各种浓度的U-KRS中显示的K562细胞的DNA内容。

结果

此项研究的结果表明，U-KRS产生了双模细胞死亡程序，其中第一个形态——细胞调亡——是由对奎尼丁敏感的Ca²⁺-dependent K⁺通道导致的；第二个形态——水泡细胞死亡——是通过防止微管形成从而产生多倍性而导致的。

实例8：U-KRS对DNA、RNA和蛋白质在恶性细胞中的合成等的影响

材料和方法

将标有溶于20μl介质中0.5μCi的标有³H的胸腺嘧啶核苷；尿核苷，溶于20μl介质中0.5μCi的白氨酸；溶于20μl介质中1.0μCi的20μl放置在U-KRS浓度不同的四个槽中2-4小时。在这之前，使该细胞系、豚鼠肝细胞、C1L肝细胞人类扁桃体细胞、鼠科淋巴瘤、鼠科骨髓瘤、Yoshida细胞、两个HeLa族、EsB-、EB、淋巴瘤、ZAC/1、P815在37℃、96 microtiter的槽内成长24小时。

在U-KRS浓度为1、4、8及14μg/ml时WiDr细胞在6小时至24小时内开始以不同的方式孵化。

结果

荧光评估显示了U-KRS与针对其它癌细胞区域的癌细胞原子核元素的更强吸引力。荧光现象可能清楚地显示U-KRS在肿瘤和转移区域中所显露的强大且快速的吸引力。在以迄今测试的对癌细胞具有100％抑止作用的方式对待的正常细胞中未发现有毒性作用。

实例9：U-KRS对人类异种移植物的影响

材料和方法

从人类肿瘤异种移植物中摄取肿瘤细胞，并连续将其移植到裸鼠体内。这些细胞用于体外集落形成化验。利用多种浓度的药物U-KRS，肿瘤细胞至少一个星期的时间不断孵化。这是利用六个不同类型实现的，并且针对每个肿瘤对集落形成进行记分。其药效在本T/C(测试/对照)中进行了报道。

结果

许多不同类的肿瘤均对与U-KRS测试的种类相应的U-KRS产生敏感。此处该肿瘤影响似乎取决于免疫器官的再生能力，刺激和调节工作可能由U-KRS来完成。

实例10：U-KRS对人类恶性细胞系的影响

材料和方法

使用四个不同的恶性细胞系：1)鼠恶性毒瘤；2)女性乳房癌；3)人类结肠癌；4)人类黑素瘤

向培养液中添加U-KRS和PP9AA02衍生物。

照射后，每个幻灯片均使200个细胞镀有金色，这些细胞孵化一个星期，然后对其进行着色和计数。

结果

此处显示的结果表明U-KRS和PP9AA02衍生物会作为毒性物质协同作用于人类恶性细胞系。

实例11：U-KRS在人类表皮癌细胞系中诱发的G2/M吸引和调亡

材料和方法

将主要人类角化细胞与新生皮肤样本相隔离。使表皮薄片受胰蛋白酶作用，并通过离心过滤来获取单细胞悬浮液。

结果

U-KRS根据剂量来抑止细胞周期进程。

U-KRS治疗影响细胞周期分配，并在A431和ME180中引发细胞调亡。

细胞周期素、CDKs与CDKp27抑止因素的表达在利用U-KRS进行治疗后会发生变化。

实例12：U-KRS的抗代谢影响及其对带有黑素瘤B-16的老鼠的氧代谢与能量代谢的影响

材料和方法

在133 C57B/6雄性鼠身上进行试验。将B-16移植到每只老鼠的正确皮肤肌肉上。在该肿瘤移植后的第10天，将试验动物划分为两组。对于第一组，将体积为0.05毫升、剂量为1mg/kg的U-KRS注射到眼睛的静脉窦中：两天内一次注射五次。对于第二组以同样的方式将消毒的生理溶液注射到静脉窦中。

结果

结果

本研究显示了在对U-KRS进行初次静脉注射一天后，肌肉组织中的氧疗法指数得到了显著改善。pO₂水平的变化速率在氧吸入过程中增加到最大值，并且在吸入停止以后，其速率又从最大值降低到初始水平。在动物实验组中，在服用制剂一天以后，肝脏线粒体中的氧化磷酸化的某种指数得到了改善。众所周知，在恶化过程中，氧吸入和代谢受到抑止。在小鼠中，经过5次U-KRS注射以后，此种抑止效果减弱。在对照动物组中，肌肉组织中的氧气密度水平和对该组织的输氧速率较高。概括所获得的数据，或许可以下定这么一个结论，U-KRS可以改善对带有B/16黑素瘤的小鼠中的组织的输氧，也可以从机体生物能学角度上考虑可以抑止了恶化过程中的破坏性效果。

下面的诸多实例解释了U-KRS的免疫调节和代谢调节性能，指出了U-KRS尤其适合用于过敏反映、病毒疾病(HIV、甲乙丙肝、大肠杆菌、流行性感冒)、骨质疏松症、多发性关节炎、牛皮癣、和其他疾病或身体状况的治疗处理。

实例13：通过U-KRS来提高巨噬细胞抗肿瘤活性

材料和方法

在实验室中BALB/c小鼠通过兄妹交配来获得。通过皮下注射来将D1DMBA/3肿瘤常规移植到BALB/c中。在经过培植5天后，肿瘤变得明显。

在皮下肿瘤培植后5天时，用U-KRS进行体内处理。此过程中使用了三种使用路线，即静脉内、腹膜内、和皮下注射、这三个实验组，每组至少10只小鼠，注入了5.0μU-KRS浓度的0.15ml PBS溶液。该剂量选择用于预备实验。

结果

经过处理的小鼠中肿瘤增长的速率明显得到了降低。注入U-KRS的小鼠没有显示任何有毒的药物相关副作用。

实例14：U-KRS对正常人淋巴细胞显型的体外影响

材料和方法

该项研究通过对10位志愿者外周血中分离得到的淋巴细胞进行研究来完成。这些细胞通过Ficoll-Paque密度梯度离心来分离得到。细胞的发育能力通过0.1％的台盼蓝着色来测定，结果为95％。

淋巴细胞子总体式通过萤光免疫检验法测定相对于总T细胞、T-helper细胞和T-suppressor细胞的单克隆抗体数量来测定。然后，细胞使用FITC/conjugatedrabbit F/ab/2 fragments anti-mouse IgG进行处理，并用PBS进行洗涤，并使用聚乙烯醇和甘油将其固定在片子上。在制作对照时，使用PBS或正常小鼠血清来代替单克隆抗体。

结果

目前的这个研究显示了U-KRS对T细胞子人口数量直接影响的可能性，并证明了早期观察结果，就是U-KRS是癌症病人细胞免疫性能的一种良好的免疫激励因子。

实例15：U-KRS对人类外周血单核细胞的致有丝分裂属性

材料和方法

外周血单核细胞。外周血通过包含1mM EDTA并且pH7.5的等体积PBS进行稀释，并在Histopaque 1077上部进行分层。然后以2000rmp的转速离心30分钟。收集表面层并用RPMI组织培养介质洗涤3次，其中含有淋巴细胞。

结果

研究发现，甚至采用U-KRS进行某个很短时间的预处理会对PHA有丝分裂产生一个强力的协作效应，和那些只有PHA存在的情况相比，会获得更多的细胞刺激。而且，还发现PHA对细胞的短期处理对于U-KRS产生协作效应来说是必需的。

本研究展示，用U-KRS对处理恶化末期阶段的病人，将可以大大增加循环淋巴细胞的数量。

实例16：免疫效应因子通过U-KRS对体内细胞溶解活性和肿瘤增长抑止的调节

材料和方法

肿瘤细胞：肥大细胞瘤P815和AKR白血病AKIL细胞系，生长于DMEM培养基，带有9.0％胎牛血清，包含青霉素和链霉素。

结果

当前的体内研究是一种有效的生物应答调节剂，使得异源免疫小鼠脾脏淋巴细胞的细胞溶解活性增加了48倍。通过将U-KRS加入到细胞介导性消退测定血清中，IL-2处理的脾脏细胞和腹膜浆淋巴细胞得到的细胞溶解活性也得到了显著增加。

将这些结果与U-KRS也能提高脾脏淋巴细胞的细胞溶解活性的结果联系起来，得出体内观察到的U-KRS治疗效果能够通过刺激免疫效应细胞的细胞溶解活性来进行调停。

实例17：U-KRS对体内体外免疫血液性状的影响

材料和方法

96只Wistar大鼠用于此项研究。雌鼠和雄鼠的最初年龄均为16周。

U-KRS和PHA通过对T淋巴细胞的一项#Hthymidine检测而被检测，以此来评估从0.01到20μg/ml不同浓度剂量的激励指标。

结果

U-KRS刺激了属于造血和免疫系统的不同的子系统。在该实验中，引起了网状细胞过多症，它可能是某些干细胞刺激或红血球生成系统全面激活的一个迹象。就绝对白血球数量没有改变这一点，可以假定通过U-KRS的作用，仅仅可以增强调节属性，比如在本实验中会出现不同子系统的混乱。

还可以发现体外刺激，和这些实验中获得的刺激具有可比性，它主要包括癌症细胞的凋亡。

实例18：U-KRS对小鼠体内卵清蛋白抗原性和抗卵清蛋白IgE抗体响应的抑止效应

材料和方法

在BALB/c和F1(BALB/c×C57B1/6J)小鼠中，检测了U-KRS对卵清蛋白诱导的致敏作用的抑止能力。将U-KRS加入到小鼠里，该小鼠处在含有抗原(卵清蛋白)和辅佐剂(明矾)混合物中，可以抑止小鼠的致敏作用，主要反映在抗-OA IgE抗体响应较低以及从激活小鼠腹膜腔分离得到的肥大细胞上的抗原诱导组胺释放降低。在过敏性反映中U-KRS对卵清蛋白抗原性的影响可以通过大鼠异源PCA反应来进行检测。

结果

结果显示，使用U-KRS而在混合物中制得的OA与抗-OA IgE抗体的反应能力下降，这些抗-OA IgE抗体的产生是用来对抗小鼠中和在异源PCA反应中固定在大鼠肥大细胞表面上的天然OA。结果暗示，U-KRS的OA预处理可以影响其抗原性属性和与用于对抗天然IgE分子的抗-OA IgE抗体的反应能力。

实例19：使用U-KRS对早期骨质疏松症治疗的影响

材料和方法

U-KRS以30毫克/千克的剂量对患有卵巢切除术诱导的早期骨质疏松症的雌大鼠每两天进行腹腔给药持续六个月。在手术的第二天，开始进行U-KRS给药。在采用U-KRS长期治疗的最后，测定每只大鼠的肱骨强度和大鼠腿节的一些性能。

结果

结果显示，通过六个月的U-KRS治疗可以阻止肱骨的机械强度降低以及卵巢切除术导致的腿节变化。

实例20：U-KRS制剂对流行性感冒病毒和大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的影响

材料和方法

APR8/HON1/34菌株的流行性感冒病毒，在老母鸡胚胎上培养10天时间；

使用大肠杆菌为当前应用的临床材料以及金黄色葡萄球菌菌株209P。290614系列U-KRS制剂。

结果

本研究证明，U-KRS制剂在受感染巨大机体中具有抗感染性能。这个影响通过宿主免疫系统中的一些部分的刺激来完成，而这个刺激由微生物或经这些微生物感染的细胞的二级破坏来实现。

实例21：对于流行性感冒病毒的生物活性

材料和方法

A型病毒，Port-Chalmers 1/73 culture，抗原性的H3N2变种。每个胚胎分别以1、10和100 EID₅₀浓度注入。U-KRS重新溶解在Hanks溶液中。

结果

研究证明，U-KRS对感染过程具有牵制行为。

实例22：U-KRS对辐射影响的行为

材料和方法

16/20g体重的CBA/J雄小鼠。

对小鼠进行范围从6.0Gy到7.5Gy的短期全身γ辐射。使用CEGO装置并使用8.75Gy的累积量来完成长期辐射。

U-KRS以0.1、1.4和12毫克/千克体重的剂量进行腹腔给药。

结果

对小鼠通过使用0.1到12毫克/千克的U-KRS药物剂量来研究改变辐射影响的能力。研究发现U-KRS对于5.00到7Gy辐射量来说小鼠的存活率增加了50-60％，而对于7.5Gy的辐射量没有产生影响。变化药物剂量不会影响辐射的结果。

目前研究的主要结果是发现了U-KRS在同时使用预防和治疗方法时能够改变辐射影响。

实例23：抵抗电离辐射的效果

材料和方法

布雷斯特癌科，结肠直肠腺癌，恶性脑瘤和胰腺癌细胞系。U-KRS制剂。

测试了U-KRS在0.2μG ML向上浓度范围内对细胞存活的效果。暴露时间为1、3和24小时，此后细胞用磷酸盐缓冲液和新配培养液进行洗涤。

结果

U-KRS治疗导致了克隆细胞存活上的分化时间和剂量依赖性的降低。对全部检测的人体肿瘤细胞系显示，它们对于U-KRS具有不同的灵敏性，与经过24小时的人体纤维原细胞相比较，克隆存活率下降了高达100倍。

Claims (25)

1.一种生物碱反应产品，至少包括一种来自于一种或多种生物碱与烷化剂反应得到的生物碱衍生物，这里在季胺衍生物中含有一个首位叔基氮，作为第四个配基，连接有一个氢残基或来自于烷化剂的一个残基，该残基最好从下列基团中选用：甲基、乙基和三(1-吖啶基)磷化氢硫化物残基，或来自于三(1-吖啶基)磷化氢硫化物的一部分。

2.根据要求1获得的生物碱反应产物，其中至少一种生物碱衍生物以水溶盐的形式存在，最好以盐酸盐的形式存在。

3.根据要求1获得的生物碱反应产物，其中生物碱至少为一种存在于Chelidoniummajus L.药草中的生物碱，最好为Chelidonium majus L.几种或全部生物碱的混合物。

4.根据要求1到3中任意一条获得的生物碱反应产物，其中生物碱从下列物质中选择：白屈菜碱，普托品，stylopin，别隐品，高白屈菜碱，血根碱，chelamidine，chelamine，L-金雀花碱和氧化白屈菜碱。

5.根据要求1到4中任意一条获得的生物碱反应产物，其中自屈菜碱、氧化白屈菜碱或甲氧基白屈菜碱作为一种单独的生物碱来源而存在。

6.根据要求1到5中任意一条获得的生物碱反应产物，其中产品至少包括一种化合物，来自于下列物质：未反应的叔胺生物碱、未反应的烷化剂和烷化剂的分解产物。

7.根据要求1到6中任意一条获得的生物碱反应产物，其中产品至少采用下列一种分析手段来显示其结果：图4中的NMR光谱，图5中的紫外光谱，图7和8中的质谱，和表1中的基本分析。

8.根据要求1到7中任意一条获得的生物碱反应产物，可以根据在要求11-22中限定的工艺来生成。

9.一种白屈菜碱衍生物，其中天然产生的白屈菜碱按照下列分子式(I)并以一种季胺形式存在，

其中作为第四个配基，可以为氢或甲基或乙基残基。

10.要求9中的白屈菜碱衍生物呈现水溶形态，最好是一种强酸的盐，尤其更好的是一种盐酸盐。

11.生产一种生物碱反应产物的一种工艺限定在要求1中，包括：

a)提供了一种反应混合物，包括一种有机溶剂、和至少一种化学结构上有叔基氮的生物碱、和一种烷化剂，并且在有机溶剂存在的情况下，让至少一种生物碱和烷化剂进行一个烷化反应，来使得形成至少一种反应产物，其中烷化发生在生物碱叔基氮位置，因此可以将叔基氮转化成一个季基氮；

b)在反应结束并得到相应的反应产物后，用液态溶剂或水至少进行一次洗涤步骤，以此来除去存在于反应产物中的可溶成分；以及

c)使得气态或液态的强酸来处理反应产物，最好为气体氯化氢或一种盐酸溶液，来用于将至少一种剩余反应产物转化成一种水溶形态，尤其为一种水溶盐。

12.要求11的工艺，其中在步骤c)中在用酸进行处理后，反应产物出现沉淀，然后沉淀从有机溶剂中分离，更好的是使用有机溶剂可选择的进行进一步纯化。

13.要求11或12的工艺，其中烷化反应在较高温度下进行，尤其在溶剂的沸点温度最合适。

14.根据要求11到13中任意一条工艺，其中至少一种生物碱存在于Chelidoniummajus L.药草中，最好为Chelidonium majus L.几种或全部生物碱，可以作为生物碱源使用。

15.与要求11-14的任意一条相关的流程，其中生物碱是从由白屈菜生物碱、普托品、stylopin、别隐品、高白屈菜生物碱、血根碱、chelamidine、chelamine、L-金雀花碱及氧化白屈菜碱中组成的分细中选择出来的。

16.与要求11-15的任意一条相关的流程，其中白屈菜生物碱、氧化白屈菜碱或甲氧基白屈菜生物碱可用作单独的生物碱源。

17.与要求11-16的任意一条相关的流程，其中烃化剂在生理机能上为活性剂，更适宜的说，应为细胞毒剂。

18.与要求11-17的任意一条相关的流程，其中烃化剂可溶于水，或遇水分解为可溶于水的成分。

19.与要求11-18的任意一条相关的流程，其中有机溶剂促进或导致生物碱反应，这种溶剂最好是从由氯甲烷、二氯甲烷、氯仿、氯乙烷、二氯乙烷和三氯乙烷的分组中选择的。

20.与要求11-19的任意一条相关的流程，其中烃化剂为三(1-吖啶基)磷化氢硫化物(CAS52-24-4)。

21.与要求11-20的任意一条相关的流程，其中，反应产物至少包含一个从由白屈菜生物碱、氧化白屈菜碱和甲氧基白屈菜生物碱组成的分组中选择的化合物，其中所说的化合物具有四元氮原子，作为该原子的第四个配合基，氢原子团或源自烃化剂的原子团收到限制，该原子团最好是从由甲基、乙基和三(1-吖啶基)磷化氢硫化物原子团组成的分组中选择出来的。

22.与要求21的任意一条相关的流程，其中三(1-吖啶基)磷化氢硫化物用作烃化剂，其中所说的残留物为所说的烃化剂的一部分，由于使用酸来进行处理，因此可随意形成分解产物。

23.将要求1到10的任意一条中定义的反应产物用作药物或药剂。

24.将要求1到10的任意一条中定义的反应产物用于制造预防或治疗从由以下疾病组成的分组中选择的疾病或身体状况的药物成分：病毒感染、癌症、免疫功能紊乱、代谢紊乱和辐射损伤。

25.按照要求24加以使用，在该要求中，疾病是从由过敏症、骨质疏松症、皮肤肿瘤、流感病毒感染、风湿性疾病、伤疤、手术后创伤、癫痫症和多发性脑脊髓硬化症组成的分组中选择的。

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