CN1689574A

CN1689574A - 泽泻醇b23－单乙酸酯及泽泻提取物在逆转癌细胞多药耐药性中的应用

Info

Publication number: CN1689574A
Application number: CN 200410038420
Authority: CN
Inventors: 方宏勋; 王承; 张锦霞; 沈小玲
Original assignee: City University of Hong Kong CityU
Current assignee: City University of Hong Kong CityU
Priority date: 2004-04-26
Filing date: 2004-04-26
Publication date: 2005-11-02
Anticipated expiration: 2024-04-26
Also published as: CN100553638C

Abstract

本发明涉及泽泻醇B23－单乙酸酯及泽泻提取物在逆转癌细胞多药耐药性中的应用，本发明还涉及泽泻提取物或泽泻醇B23－单乙酸酯所制成的各种药物制剂的应用。所述泽泻醇B23－单乙酸酯及泽泻提取物作用于由P－糖蛋白过量表达而引起的多药耐性症状，可提高多药耐性细胞对各类抗癌药物的敏感性、在与抗癌药物的联合用药中呈协同效用，并且毒副作用小。

Description

泽泻醇B23-单乙酸酯及泽泻提取物在逆转癌细胞多药耐药性中的应用

技术领域

本发明涉及泽泻醇B23-单乙酸酯及泽泻提取物在逆转癌细胞多药耐药性中的应用。本发明所述的泽泻是指泽泻科植物泽泻(Alisma plantagoOrientale(Sam)Juzep)及其根茎药物泽泻(Rhizoma Alismatis)。

背景技术

接受长期化疗的癌症病人往往会在治疗中出现多药耐性(MDR)的现象：部分癌细胞在某单一抗癌药物的作用下仍然可以存活生长，并且随后表现出可以同时耐受大量结构与功能不相关的抗癌药物，从而大大削弱了化学治疗的疗效。

引起多药耐性的分子机理很多，其中一些已经被论证确定：包括细胞表面转运蛋白(P-糖蛋白，MRP和LRP)的过量表达及活化，谷胱甘肽解毒系统酶的过度活化，DNA拓扑异构体酶基因表达的下调或基因突变，肿瘤抑制基因p53的突变以及Bcl-2基因的过度表达。

其中，由P-糖蛋白(P-gp)的过量表达所引致的多药耐性是最早被发现的，并且也是被研究得最为透彻的一种分子机理。P-gp是一种位于细胞膜上的转运蛋白，它可以依靠ATP水解产生的能量将细胞内的化学物质运输至细胞外。科学家已经证明，在P-gp过量表达的癌细胞里，由于P-gp的运输作用，各种疏水性抗肿瘤药物的积累量被大大降低，从而无法达到治疗所要求的有效浓度。

目前，科学家发现一些现有的临床药物或单一化合物可以治疗这种由P-gp引起的多药耐性，如：异博定(Verapamil)(一种冠状动脉扩张药)，利血平(一种降压药)，头孢菌素(cephalosorin)，短杆菌肽(一种抗生素)，环孢菌素A及其衍生物(大多为免疫抑制剂)，以及一些亲脂化合物。这些药物或化合物通常都是疏水性芳香族的小分子，它们可以竞争性的结合在P-gp上，从而抑制P-gp对抗癌药物的运输。然而，这些被开发出来的P-gp抑制剂往往在临床上表现出严重的毒副作用，从而没有得到广泛的应用。因此，寻找低毒并且专一有效的P-gp抑制剂成为了科学家的研究开发热点。

另一方面，在中国，传统的中草药用于癌症治疗已有很长的历史，并且中草药还经常与抗肿瘤西药结合使用以提高疗效。基于此，我们设想在这些草药中，可能含有可以逆转由P-糖蛋白过量表达所导致的多药耐性的天然药物，而且因为中药往往较西药温和低毒，所以由中药开发出来的逆转剂可能取代原有的药物成为临床有效的逆转剂。在这种设想下，经过试验得到了具有逆转活性的泽泻醇B23-单乙酸酯及含有该物质的泽泻提取物，其克服了现有逆转剂的局限性(有明显的毒副作用)，而且作用机理明确。

发明内容

本发明的目的在于提供了泽泻醇B23-单乙酸酯(简称MG-02)和包含泽泻醇B23-单乙酸酯的泽泻提取物(简称RAE)的新用途，即逆转癌细胞多药耐药性的应用。泽泻醇B23-单乙酸酯和包含泽泻醇B23-单乙酸酯的泽泻提取物的逆转作用明确，可逆转由P-gp过量表达所导致的多药耐药性，并提高癌细胞对抗癌药物的敏感性及增加抗癌药物的药效。同时，本发明还涉及泽泻醇B23-单乙酸酯和包含泽泻醇B23-单乙酸酯的泽泻提取物在制备逆转癌细胞多药耐药性药物中的应用。

本发明所述的泽泻提取物是通过下述方法之一而获得，但具有本发明所述用途的泽泻提取物并不只限于从这些方法而获得：

(1)泽泻干品粗粉用8-20倍量甲醇或乙醇常温、加热或回流提取，提取1-5次。提取液常压或减压除去溶剂，加适量水后用氯仿充分提取，氯仿提取液经常压或减压浓缩除去溶剂，即得到泽泻提取物；

(2)泽泻干品粗粉用8-20倍量氯仿常温、加热或回流提取，提取1-5次。常压或减压除去溶剂，即得泽泻提取物；

(3)泽泻干品粗粉，用超临界二氧化碳流体(内含2.5％-10％乙醇)，在50℃以下至室温，于超临界二氧化碳流体萃取釜内循环提取，提取物减压蒸发除去溶剂，加氯仿充分提取，常压或减压浓缩除去溶剂，即得泽泻提取物。

此外，泽泻提取物也可通过其它方法获得：用中等极性的溶剂加丙酮、乙酸乙酯等提取，或者用含水甲醇、含水乙醇、含水丙酮等提取，再通过萃取或是柱层析方式得到主要含泽泻醇B23-单乙酸酯的混合物。

本发明所述的逆转癌细胞多药耐药的药物包括口服制剂或注射制剂。其中口服制剂包括片剂、胶囊、颗粒、口服液或丸剂。上述制剂可按常规工艺制备。在制备口服剂型时，泽泻醇B23-单乙酸酯或泽泻提取物中加入所需的各种常规辅料，如崩解剂，润滑剂，粘合剂等以常规的口服制剂方法制备成任何一种常用口服剂型。例如，可将泽泻醇B23-单乙酸酯或泽泻提取物与适当的赋型剂如淀粉或其衍生物、乳糖、纤维素衍生物等混合，装入胶囊中制成胶囊剂。或者在加入上述辅料的同时，加入羧甲基纤维素、阿拉伯树胶等粘合剂和水得到颗粒剂；加入蜂蜜等制成丸剂。也可以将泽泻醇B23-单乙酸酯或泽泻提取物加入羧甲基纤维素、阿拉伯树胶等粘合剂，加入微晶纤维素、改良淀粉等作填充剂和崩解剂，通过常规制备片剂的机器压制成片剂。制备用于肠外途径的可注射制剂时，可将泽泻醇B23-单乙酸酯或泽泻提取物与所需附加剂及适宜注射用溶剂混合，然后进行灭菌处理而制得。例如，将泽泻醇B23-单乙酸酯或泽泻提取物溶于具有增溶剂和/或助溶剂的无菌蒸馏水液或无菌生理盐水液中，也可使用稳定剂和/或缓冲液，进行注射制剂的制备。

本发明的突出进步和显著效果在于泽泻醇B23-单乙酸酯和含有泽泻醇B23-单乙酸酯的泽泻提取物的毒副作用小，具有明确的逆转癌细胞多药耐药性的作用，并且具有提高抗癌药物药效的作用。

附图说明

图1泽泻提取物、泽泻醇B 23-单乙酸酯及异博定与各抗癌药物联合用药中的相互关系

图2泽泻提取物及泽泻醇B 23-单乙酸酯对多药耐性癌细胞中长春新碱的细胞毒作用的恢复性影响

图3泽泻提取物、泽泻醇B 23-单乙酸酯及异博定对多药耐性癌细胞中阿霉素积累量的影响

图4泽泻提取物及泽泻醇B 23-单乙酸酯对多药耐性细胞中罗丹明-123运输的影响

图5泽泻提物对P-gp表达的影响检测

具体实施方式

本发明所述的泽泻活性提取物，以及提取物药理活性是按如下实施例所示方法获得的。所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但是，以下实施例不得理解为任何意义上的对本发明权利要求的限制。

实施例1：泽泻提取物的制备(方法一)

江西泽泻干品粗粉1-kg，用95％乙醇回流提取3次，每次2小时，乙醇用量为10L、8L、8L。过滤，合并三次提取液，减压除去乙醇，残留物加500mL水混悬，用氯仿充分提取3次，每次用量400mL，合并氯仿提取液，减压浓缩除去溶剂，即得到泽泻提取物30g，收率3％。

实施例2：泽泻活性提取物的制备(方法二)

江西泽泻干品粗粉1kg，用氯仿回流提取3次，每次2小时，氯仿用量为10L、8L、8L。放冷，过滤，合并三次提取液，减压除去溶剂，即得到泽泻提取物25g，收率2.5％。

实施例3：泽泻活性提取物的制备(方法三)

江西泽泻干品粗粉1kg，用超临界二氧化碳流体(内含5％乙醇作为夹带剂)，在40℃、压力10Mpa的条件下，在超临界二氧化碳流体萃取釜内进行循环提取，提取2小时后，在室温下，调整解析釜温度压力释放出二氧化碳。所得浸膏即为泽泻的超临界二氧化碳流体萃取提取物。取该提取物加氯仿充分提取(3次，每次用量为500ml)，合并氯仿提取液，减压浓缩除去溶剂，即得泽泻提取物34g，收率3.4％。

实施例4：泽泻活性提取物中具有逆转由P-gp过量表达所导致的多药耐性的有效成分的分离鉴定

有效部位化学成分的分离

取实施例1所得氯仿提取物(30g)用甲醇溶解，分散于适量硅胶，干法装硅胶(200-300目)柱。用石油醚-乙酸乙酯(10∶2，10∶5，2∶10)依次洗脱，得到1，2，3三个馏分。经测定，馏分1显示生物活性。将馏分1再次经硅胶柱层析，依次用苯-乙酸乙酯(20∶1---4∶1)洗脱，每50mL为一个馏分，用硅胶薄层色谱(TLC)监测，合并相同组成的馏分并测试各洗脱部位，从4∶1洗脱物得一活性馏分，所得活性馏分经反复硅胶柱层析，苯-乙酸乙酯(4∶1)洗脱，得单一活性成分I。I经正己烷-苯多次重结晶后，得到白色晶体130mg。经HPLC分析，纯度大于98％。

I MG-02，白色晶体，经MS，¹H，¹³C-NMR，其数据与泽泻醇B23-单乙酸酯相同。经¹H NMR、¹³C NMR和MS确定分子式为C₃₂H₅₀O₅。FABMSm/z：537(M+Na)，515(M+H)。¹H-NMRδ(CDCL3)ppm：4.61(1H，td，J＝8.8，2.4Hz，23-H)，3.81(1H，td，J＝10.8，5.6Hz，11-aH)，2.74(1H，d，J＝8.8Hz，24-H)，2.55(1H，dd，J＝13.2，5.6Hz，11-eH)，2.16(1H，ddd)，2.08(3H，s，CH₃CO)，1.72(1H，d，J＝10.8Hz，9-aH)，1.34，1.32，1.15，1.08，1.06，1.05，0.98(3Heach，s，CH₃)，1.03(3H，d，J＝6.8Hz，21-CH₃)。

¹³C-NMRδ(CDCL3)ppm见附表一。

表一

No.	1	泽泻醇B23-单乙酸酯	No.	1	泽泻醇B23-单乙酸酯
No.	1	泽泻醇B23-单乙酸酯	No.	1	泽泻醇B23-单乙酸酯	12345678910111213141516	30.936.7220.146.948.420.034.140.749.936.970.234.5138.157.030.629.1	30.936.7220.146.948.420.034.140.749.936.970.134.4138.157.030.629.1	1718192021222324252627282930Ac	134.223.125.627.820.033.771.465.058.419.424.629.520.023.8169.921.1	134.123.125.627.820.033.771.465.058.419.324.629.520.023.8169.921.1

结构如下：

实施例5：泽泻提取物及泽泻醇B 23-单乙酸酯对由P-gp过量表达所导致的多药耐性的逆转作用

(一)体外癌细胞体生长抑制检测

1.材料和方法

1.1药物：测试药物分别为泽泻提取物、泽泻醇B23-单乙酸酯、放线菌素D，嘌呤霉素，紫杉醇，长春新碱、阿霉素以及异博定。

1.2敏感性及多药耐性癌细胞：实验所用细胞系为人体肝癌细胞系HepG2、白血病细胞系K562及其多药耐性亚细胞系HepG2-DR和K562-DR，皆来自香港中文大学Dr.Judy Chan实验室，这两种多药耐性细胞系都是用阿霉素对敏感性母细胞系进行选择性逐步培养而建立的(即在敏感性癌细胞的培养中不断提高阿霉素的浓度，保留下存活的耐药细胞从而起到筛选的目的)。所有细胞的培养条件如下：在37℃，C0₂含量5％的环境中，生长于含10％胎牛血清和100U/mL抗生素的RPMI-1640培养液中。为维持多药耐性的表型特征，HepG2-DR和K562-DR的培养液中分别加入了1.2μM和0.1μM阿霉素。

1.3药物应用：将待检测细胞分散成单个细胞悬液，按5×10³细胞/孔分种于96孔板，24小时后换用含药培养液，每3孔为一个检测浓度，药物与细胞作用72小时后用硫罗丹明B(SRB)法测定药物细胞毒性，实验另设培养液空白对照组-I及未加药处理的细胞对照组-II。

1.4SRB法测定药物对细胞生长的半数细胞抑制剂量浓度(IC₅₀)：药物与细胞作用72小时后，在所有的孔中(包括培养夜空白对照组)加入预冷的50％三氯乙酸在4℃下固定细胞一小时。弃去固定液并用蒸馏水洗漂，晾干，用0.4％的SRB染色10分钟，再用1％的乙酸洗去多余的染色液并风干。最后，将与细胞结合的SRB溶解于10mM的Tris缓冲溶液(PH10.5)中，用紫外分光光度计515nm波长测定吸光度A值，同条件下测定SRB的颜色强度，此时SRB的颜色强度与细胞数目呈正相关，可以此作为细胞数量进行估算比较。细胞存活率(％)＝(实验孔A值/对照孔-IIA值)×100％，IC₅₀为细胞存活率为50％时的药物浓度。

2.结果

2.1抗肿瘤药、泽泻提取物和泽泻醇B 23-单乙酸酯对于HepG2和HepG2-DR细胞的细胞毒作用：如表1所示，HepG2对放线菌素D，嘌呤霉素，紫杉醇，长春新碱和阿霉素都显示出高度敏感性，而泽泻提取物和泽泻醇B 23-单乙酸酯对药物敏感细胞HepG2和耐药细胞HepG2-DR的细胞毒作用都较低：无论是泽泻提取物还是泽泻醇B 23-单乙酸酯的IC₅₀都高于本研究所采用的抗癌药100-100,000倍(表1)。本试验所用的多药耐性细胞系HepG2-DR是在阿霉素的作用下选择培养出来的，但该多药耐性细胞除显示强烈的耐阿霉素外，对放线菌素D，嘌呤霉素，紫杉醇，长春新碱也表现出强烈的耐药性。该细胞对不同药物的耐药程度可通过耐受因子进行评估(耐受因子等于药物作用于HepG2-DR的IC₅₀值与作用于HepG2的I_C50的比值(表1))。泽泻提取物和泽泻醇B 23-单乙酸酯的耐受因子很小，即表明它们对于两种细胞系的作用差别很小。

表1：泽泻提取物、泽泻醇B 23-单乙酸酯及抗癌药物对肝癌细胞

HepG2、多药耐性细胞HepG2-DR的生长抑制效果

	IC₅₀ ^*
	IC₅₀ ^*				HepG2	HepG2-DR	耐受因子^**
泽泻提取物(μg/mL)	35.79±1.43	46.80±3.62	1.3		HepG2	HepG2-DR	耐受因子^**
泽泻提取物(μg/mL)	35.79±1.43	46.80±3.62	1.3	泽泻醇B 23-单乙酸酯(μM)	18.69±3.56	19.44±3.86	1.1
放线菌素D(μM)	0.002±0.0004	2.19±0.50	1095	泽泻醇B 23-单乙酸酯(μM)	18.69±3.56	19.44±3.86	1.1
放线菌素D(μM)	0.002±0.0004	2.19±0.50	1095	嘌呤霉素(μM)	0.35±0.01	311±92.6	888
紫杉醇P(μM)	0.003±0.0003	4.30±0.23	1433	嘌呤霉素(μM)	0.35±0.01	311±92.6	888
紫杉醇P(μM)	0.003±0.0003	4.30±0.23	1433	长春新碱(μM)	0.0004±0.0002	0.46±0.03	1150
阿霉素(μM)	0.055±0.004	41.6±2.30	756	长春新碱(μM)	0.0004±0.0002	0.46±0.03	1150

(二)多药耐性细胞中联合用药的评估

1.材料和方法

1.1药物：测试药物分别为泽泻提取物、泽泻醇B23-单乙酸酯、放线菌素D，嘌呤霉素，紫杉醇，长春新碱，阿霉素以及异博定(阳性对照)。

1.2敏感性及多药耐性癌细胞：如(一)1.2所述。

1.3药物应用：将抗癌药物与泽泻提取物、泽泻醇B23-单乙酸酯或者异博定按1∶1混合。另一方面，将待检测细胞分散成单个细胞悬液，按5×10³细胞/孔分种于96孔板，24小时后换用含药培养液，每3孔为一个检测浓度，药物与细胞作用72小时后用硫罗丹明B(SRB)法测定药物细胞毒性，实验另设培养液空白对照组-I及未加药处理的细胞对照组-II。

1.4细胞生长测定：如(一)1.4所述。

1.5联合用药评估：通过SRB方法检测联合用药的作用并与单独用药的作用进行比较。所得比较结果，即药物间的相互作用可以用联合指数(CI)来表示：CI大于4表示拮抗作用，而CI小于0.8表示协同作用。如果CI值在0.8与4之间，则表示加合作用，参见图1，其中MG-02为泽泻醇B 23-单乙酸酯。

2.结果：我们的研究显示无论泽泻提取物还是泽泻醇B 23-单乙酸酯都能够提高多药耐性HepG2-DR细胞对于抗肿瘤药的敏感度。如表2所示，在泽泻提取物或泽泻醇B 23-单乙酸酯的作用下，HepG2-DR细胞对抗癌药的敏感程度有大幅度提高。由IC₅₀值可见，二者都几乎完全恢复了嘌呤霉素对HepG2-DR的毒性作用，同时HepG2-DR细胞对于阿霉素的敏感度亦提高了30倍，对放线菌素D和紫杉醇的敏感度分别提高了10倍。此外，我们还观察到泽泻提取物和泽泻醇B 23-单乙酸酯逆转多药耐性的能力较为相似，而与异博定相比，都显示了更强的逆转作用。

通过对药物联合指数(CI)的分析，泽泻提取物或泽泻醇B 23-单乙酸酯在与不同抗癌药的联合使用中都显示出不同程度的协同作用(图1)，其中放线菌素D与泽泻提取物或泽泻醇B 23-单乙酸酯，紫杉醇与泽泻提取物或泽泻醇B 23-单乙酸酯的联合用药都显示了最为显著的协同作用。同时，无论泽泻提取物还是泽泻醇B 23-单乙酸酯都不能增强HepG2细胞对抗癌药的敏感度，并且无论泽泻提取物或泽泻醇B 23-单乙酸酯在HepG2细胞中与抗癌药物联合使用都表现出明显的附加作用。这说明，泽泻提取物与泽泻醇B 23-单乙酸酯对癌细胞药敏度的提高与P-gp的活性功能相关。

表2.泽泻提取物，泽泻醇B 23-单乙酸酯以及异博定对HepG2与HepG2-DR细胞对抗癌药物敏感性的影响

	IC₅₀-HepG2-DR	IC₅₀-HepG2	耐受因子*
	IC₅₀-HepG2-DR	IC₅₀-HepG2	耐受因子*	放线菌素D(μM)+泽泻提取物+泽泻醇B 23-单乙酸酯+异博定嘌呤霉素(μM)+泽泻提取物+泽泻醇B 23-单乙酸酯+异博定紫杉醇(μM)+泽泻提取物+泽泻醇B 23-单乙酸酯+异博定长春新碱(μM)+泽泻提取物+泽泻醇B 23-单乙酸酯+异博定阿霉素(μM)+泽泻提取物+泽泻醇B 23-单乙酸酯+异博定	2.19±0.500.21±0.030.31±0.180.58±0.06311±92.61.18±0.401.93±0.746.45±1.634.30±0.230.43±0.150.60±0.090.75±0.050.46±0.030.12±0.020.18±0.020.16±0.0141.6±2.301.42±0.381.18±0.251.40±0.04	0.002±0.00040.002±0.00020.002±0.00030.002±0.00080.35±0.010.196±0.0130.242±0.1040.290±0.0610.003±0.00030.002±0.0010.003±0.0020.002±0.0010.0004±0.00020.0003±0.00010.0003±0.00010.0003±0.00020.055±0.0040.049±0.0190.053±0.0190.046±0.018	1095105155290888682214332152003751150400600533756292230

(三)泽泻提取物和泽泻醇B 23-单乙酸酯对长春新碱在多药耐性细胞中诱导G₂/M停滞作用的恢复性影响

1.材料和方法

1.1药物：测试药物分别为泽泻提取物，泽泻醇B23-单乙酸酯，长春新碱，及异博定(阳性对照)。

1.2仪器：FACSCAN流式细胞仪测定(Becton DickinsonImmunocytometry Systems，San Jose，CA)，所得数据则采用MacintoshCellQuest软件进行分析。

1.3敏感性及多药耐性癌细胞：如(一)1.2所述。

1.4药物应用：HepG2或HepG2-DR细胞分别由长春新碱(300ng/mL)及长春新碱与不同浓度的泽泻提取物(2.5μg/mL或25μg/mL)的混合物，或与泽泻醇B 23-单乙酸酯(1μM or 10μM)的混合物处理24小时，并采用未处理细胞为对照组。

1.5样品处理及分析：处理后的细胞用预冷的PBS洗涤两次后，用70％的乙醇于-20℃固定过夜。被固定的细胞用PBS洗涤后，用200μg/mL核糖核酸酶在37℃下处理30分钟。最后加入碘化丙啶溶液(终浓度为40μg/mL)，使其与DNA结合。处理10分钟后，细胞立即用FACSCAN流式细胞仪进行分析。

2.结果：参见图2，泽泻提取物及泽泻醇B 23-单乙酸酯对多药耐性癌细胞中长春新碱的细胞毒作用的恢复性影响，其中，图2(A)为泽泻提取物在HepG2细胞中的影响，图2(B)为泽泻提取物在HepG2-DR细胞中的影响，图2(C)为泽泻醇B 23-单乙酸酯在HepG2细胞中的影响，图2(D)为泽泻醇B 23-单乙酸酯在HepG2-DR细胞中的影响。长春新碱对于癌细胞的细胞毒作用表现在抑制有丝分裂的纺锤体形成和诱导细胞周期停滞在G2/M-阶段从而使细胞进入程序性凋亡。经长春新碱处理24小时，可导致HepG2细胞明显停滞于G₂/M-阶段(图2A，C)。但在相同条件下对多药耐性HepG2-DR细胞的细胞周期没有类似作用。经长春新碱与泽泻提取物或泽泻醇B 23-单乙酸酯联合处理后，HepG2-DR细胞停滞在G₂/M阶段的比例随着泽泻提取物或泽泻醇B 23-单乙酸酯剂量的增加而增加。此结果表明泽泻粗提物及单一化合物都可逆转多药耐性细胞对长春新碱的显型耐药作用。

实施例6 泽泻提物及泽泻醇B 23-单乙酸酯对P-gp功能性运输作用的检测

(一)泽泻提物及泽泻醇B 23-单乙酸酯对多药耐性细胞中阿霉素积累的作用检测

1、材料和方法

1.1药物：测试药物分别为泽泻提取物，泽泻醇B23-单乙酸酯，阿霉素及异博定(阳性对照)。

1.2细胞：如实施例5(一)1.2所述。

1.3仪器：如实施例5(三)1.2所述。

1.4阿霉素积累量测试：1×10⁶个细胞在含有10μM阿霉素与不同浓度的泽泻提取物或泽泻醇B 23-单乙酸酯的培养液中于37℃培养1小时。培养后细胞中的阿霉素含量可通过流式细胞仪测定，所得数据用Macintosh CellQuest软件进行分析。实验中，异博定作为已知的P-gp抑制剂用作阳性对照。

2.结果：HepG2-DR和K562-DR细胞系对化疗制剂的耐受作用归咎于P-gp的过量表达，与其敏感性母细胞系相比，这些细胞中所积累的抗肿瘤药物含量由于无法达到所需的有效浓度而使其作用减弱。参见图3，泽泻提取物、泽泻醇B 23-单乙酸酯及异博定对多药耐性癌细胞中阿霉素积累量的影响。泽泻提取物，泽泻醇B 23-单乙酸酯都是按各自的IC₅₀的倍数加入，即在同样毒性条件下比较各自的逆转作用。各组阿霉素的含量通过与对照组(仅有阿霉素处理的样品)的比值来表示。本研究中，细胞于含有10μM阿霉素连同不同浓度的泽泻提取物、泽泻醇B 23-单乙酸酯或异博定的培养液中培养1小时，随后通过流式细胞仪测定细胞中阿霉素的荧光强度。HepG2-DR(图3A)和K562-DR细胞(图3B)在泽泻提取物或泽泻醇B 23-单乙酸酯的作用下，细胞内的阿霉素含量明显提高，此外，无论是泽泻提取物或泽泻醇B 23-单乙酸酯都可较异博定积累更多的阿霉素，这表明逆转剂泽泻提取物或泽泻醇B 23-单乙酸酯对P-gp过量表达的多药耐性细胞的有着比异博定更强的逆转作用。

(二)泽泻提物及泽泻醇B 23-单乙酸酯对多药耐性细胞中罗丹明-123运输影响的检测

1、材料和方法

1.1药物：测试药物分别为泽泻提取物，泽泻醇B23-单乙酸酯，罗丹明-123及异博定(阳性对照)。

1.2细胞：如实施例5(一)1.2所述。

1.3仪器：如实施例5(三)1.2所述。

1.4罗丹明-123运输测试：在含1×10⁶个细胞的细胞悬液中加入Rh-123，使终浓度5ug/mL，随后在37℃培养1小时以吸收Rh-123，再用预冷的PBS洗涤细胞2次以去除细胞外多余Rh-123，洗涤后的细胞重悬于新鲜培养液中，加入RAE或者泽泻醇B 23-单乙酸酯并继续在37℃培养1小时，此时Rh-123可通过P-gP的作用从细胞内释放出来。细胞内Rh-123的荧光强度可以通过FACSCAN流式细胞仪测定(BectonDickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)，所得数据则采用Macintosh CellQuest软件进行分析。

2.结果：采用流式细胞仪可以测定泽泻提取物或泽泻醇B 23-单乙酸酯对P-gp过量表达细胞中罗丹明-123(P-gp的一种荧光底物)运输的影响。参见图4，泽泻提取物及泽泻醇B 23-单乙酸酯对多药耐性细胞中罗丹明-123运输的影响，细胞在含有罗丹明-123的培养液里37℃培养一个小时，粗线表示的是这一个小时后细胞内罗丹明-123的荧光强度。随后细胞外的罗丹明-123被移去，加入或不加入泽泻提取物(25μg/mL)、泽泻醇B 23-单乙酸酯(1-40μM)或异博定(10μM)继续培养一个小时。细线代表后一个小时后细胞内残留的罗丹明-123荧光强度，虚线代表后一个小时后在泽泻提取物、泽泻醇B 23-单乙酸酯或异博定作用下细胞内残留的罗丹明-123的荧光强度。从图4可见，吸收了罗丹明-123的HepG2和K562细胞，在染料从细胞培养液中移走1小时后，细胞中的荧光强度仍基本保持不变。而相同情况下HepG2-DR和K562-DR细胞中罗丹明-123的含量则大幅降低，以此我们进一步确认了P-糖蛋白的运输活性功能。实验结果表明，无论泽泻提取物还是泽泻醇B 23-单乙酸酯都明显减慢了耐药细胞中荧光物质的流失(图4)，而且泽泻醇B 23-单乙酸酯的逆转作用在研究中与所用剂量呈正比。其中，图4A为敏感性细胞中罗丹明-123测试，图4B为泽泻提取物在多药耐性细胞中。loaded：第一个小时后细胞内罗丹明-123的荧光强度；residual：第二个小时后细胞内残留的罗丹明-123荧光强度；异博定：第二个小时后在异博定作用下细胞内残留的罗丹明-123的荧光强度；RAE：第二个小时后在泽泻提取物作用下细胞内残留的罗丹明-123的荧光强度，图4C：泽泻醇B 23-单乙酸酯在多药耐性细胞中的作用。DMSO为溶剂对照组。

实施例7 泽泻提物对P-gp表达的影响检测

1、材料和方法

1.1药物：测试药物为泽泻提取物。

1.2细胞：如实施例5(一)1.2所述。

1.3细胞内P-gp表达的免疫印渍技术检测分析：用泽泻提取物处理各种细胞0，4，8及12个小时。处理后的细胞在预冷的缓冲液(50mMTrisPH7.4，100mMNaCl，2mMEDTA，1％去氧胆酸钠，0.1％SDS，1％triton X-100，2mM PMSF，1％抑肽酶)中放置30分钟后离心取得总蛋白。用布莱德福检测法(Bradford assay)检测样品蛋白浓度。本试验中，40μg总蛋白经8％SDS/PAGE电泳分离后，通过电迁移法转移至硝化纤维膜上。用5％脱脂牛奶/0.1％Tween-20/TBS(10mM Tris pH7.5，100mM NaCl)封闭该膜，随后在室温下加入抗-P-gp抗体反应1小时，再在室温下加入辣根过氧化酶标记的二级抗体反应1小时，最后被抗体标记的蛋白通过ECL进行测定及显影。

2.结果：实验结果如图5所示，泽泻提物对P-gp表达的影响检测。HepG2-DR和K562-DR细胞与其母细胞比较，都表达了高水平的P-gp(图5A，图5B)。经50ug/mL的泽泻提取物处理12小时后，无论在HepG2-DR还是K562-DR细胞中都没有能检测到可观察到的P-gp蛋白水平的改变(图5A，图5B)。

Claims

1.泽泻醇B23-单乙酸酯在制备逆转癌细胞多药耐药性药物中的应用。

2.泽泻提取物在制备逆转癌细胞多药耐药性药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，所述泽泻提取物是通过下述方法之一获得：

(3)泽泻干品粗粉，用含2.5％-10％乙醇的超临界二氧化碳流体，在50℃以下至室温，于超临界二氧化碳流体萃取釜内循环提取，提取物减压蒸发除去溶剂，加氯仿充分提取，常压或减压浓缩除去溶剂，即得泽泻提取物。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物是口服制剂或注射制剂。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物是口服制剂或注射制剂。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述口服制剂包括片剂、胶囊、颗粒、口服液或丸剂。