CN1625563A

CN1625563A - 新的真菌脂肪酶

Info

Publication number: CN1625563A
Application number: CN03802915.4A
Authority: CN
Inventors: 托马斯·L·道森; 伊冯娜·M·迪安吉利斯; 凯文·R·约翰通斯; 小约瑟夫·R·卡茨文斯基; 查尔斯·W·桑德斯; 小理查德·L·沃尔特
Original assignee: Procter and Gamble Ltd
Current assignee: Procter and Gamble Ltd
Priority date: 2002-02-19
Filing date: 2003-02-19
Publication date: 2005-06-08
Also published as: WO2003070907A3; WO2003070907A2; EP1476462A4; US6897033B2; JP2005517435A; MXPA04008031A; EP1476462A2; EP1476462B1; ATE512979T1; US20030158385A1; CA2486388A1; AU2003216317A1

Abstract

本发明公开了新的多肽，该多肽包含以下氨基酸序列：基本上如SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列，或与包含在ATCC保藏号PTA－4086中的DNA插入片段所编码的氨基酸序列基本上类似的氨基酸序列。本发明还公开了编码所述多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸基本上如SEQ ID NO：1所示，或与包含在具有ATCC保藏号PTA－4086的所有鉴定特征的质粒中的核苷酸序列基本上类似。本发明还公开了包含上述多核苷酸的表达系统。

Description

新的真菌脂肪酶

发明领域

本发明涉及分离的真菌脂肪酶。本发明还涉及编码真菌脂肪酶的多核苷酸。本发明还涉及制备脂肪酶和编码该脂肪酶的多核苷酸的方法。本发明还涉及使用脂肪酶来筛选该脂肪酶抑制剂的方法。

发明背景

保守估计，有超过50％的人口患有头皮屑。这种常见病症无害，但是有刺激作用，其特征是死亡的皮肤从头皮上脱落。该病症的通常原因是皮脂溢性皮炎-一种在头皮上发生的发痒的有鳞屑的疹。头皮屑的负面影响从影响个体衣服的在头发中和/或在衣领和衣肩上的白色鳞片形式的美观影响，到头皮瘙痒形式的身体不适不等。

近几年已经开发出了几种治疗头皮屑的活性物质。这些抗头皮屑活性物质包括吡啶硫酮锌、煤焦油和硫化硒。虽然这些活性物质具有一定效力，但是仍然需要更有效力的活性物质，和/或具有类似效力但是更低廉的活性物质，和/或提供更大配制灵活性的有效活性物质。还需要鉴定这样的新的抗头皮屑活性物质的新方法。

发明概述

本发明涉及分离的真菌脂肪酶，该多肽包含以下氨基酸序列：基本上如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或与包含在ATCC保藏号PTA-4086中的DNA插入片段所编码的氨基酸序列基本上类似的氨基酸序列。

本发明还涉及编码真菌脂肪酶的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含以下核苷酸序列：基本上如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；与包含在ATCC保藏号PTA-4086中的多核苷酸插入片段基本上类似的核苷酸序列；编码与包含在ATCC保藏号PTA-4086中的DNA插入片段所编码的氨基酸序列基本上类似的氨基酸序列的核苷酸序列；或与任一上述核苷酸序列互补的核苷酸序列。

本发明还涉及包含一种核酸序列的核酸载体。

本发明还涉及包含上述载体的宿主细胞。

本发明还涉及制备包含以下氨基酸序列的多肽的方法：基本上如SEQID NO：2所示的氨基酸序列，或与包含在ATCC保藏号PTA-4086中的DNA插入片段所编码的氨基酸序列基本上类似的氨基酸序列；所述方法包括将编码该多肽的核苷酸序列引入到宿主细胞内，在其中多肽能够由核酸表达的条件下培养所述宿主细胞。

本发明还涉及鉴定脂肪酶抑制剂的方法，包括将脂肪酶多肽与候选抑制剂物质在类脂存在下接触一定时间，然后测定类脂水解；其中所述脂肪酶多肽具有以下氨基酸序列：基本上如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或与包含在ATCC保藏号PTA-4086中的DNA插入片段所编码的氨基酸序列基本上类似的氨基酸序列。

对于本领域技术人员来说，通过阅读本说明书的公开内容，本发明的这些和其它特征、方面和优点将变得显而易见。

发明详述

虽然本说明书以特别指出并清楚地要求保护本发明的权利要求书作为结尾，但应该相信下列说明可帮助更好地理解本发明。

本申请人已满足了以下需要：对于鉴定用以治疗头皮屑的新的活性物质的方法的需要。具体来说，本申请人已经鉴定了据信是与头皮屑有关的真菌生长所必需的多肽和编码该多肽的多核苷酸。

真菌鳞斑霉属(Malassezia)与几种人皮肤疾病和病症，包括花斑糠疹、毛囊炎、皮脂溢性皮炎、特应性皮炎和头皮屑有关(Faergemann，J.Pityrosporum Yeasts-What′s New？，Mycoses(1997)40：29-32)。鳞斑霉属以前称为瓶形酵母属(Pityrosporum)，是一种新描述的真菌属。在该属内有七中描述的物种：pachydermatis、粃糠状鳞斑霉(furfur)、globosa、sympodialis、restricta、sloofiae和obtusa(Gueho，E.，T.Boekhout，H.R.Ashbee，J.Guillot，A.van Belkum，和J.Faergemann，Tne role of Malassezia species in the ecology of human skin and aspathogens，Medical Mycology(1998)36 Suppl.I：220-229)。最近已经通过使用在核糖体DNA区域内的基因组差异(Gupta，A.K.，Y.Kohli，和R.C.Summerbell，Molecular differentiation of seven Malasseziaspecies，J.Clinical Microbiology(2000)38：1869-1875)和在不同类脂乳化剂存在下的生长区别了这些物种(Mayser，P.，P.Haze，C.Papavassilis，M.Pickel，K.Gruender，and E.Gueho，Differentiationof Malassezia species：selectivity of Cremophor EL，castor oil andricinoleic acid for M.furfur，British J.of Dermatology(1997)137：208-213)。除了M.pachydermatis以外，其它物种都在人皮肤上发现过。

在这七种鳞斑霉当中，有六种需要类脂来进行生长，第七种鳞斑霉M.pachydermatis是亲脂性的(Guillot，J.，和R.Bond，Malasseziapachydermatis：a review，Medical Mycology(1999)37：295-306)。在实验室培养物中，该类脂需求可用橄榄油满足(Mayser，P.，M.Pickel，P.Haze，F.Erdmann，C.Papavassilis，and R.Schmidt，DifferentUtilization of Neutral Lipids by Malassezia furfur and Malasseziasympodialis，Medical Mycology(1998)36：7-14)。这提出了一个问题，当存在于人皮肤上时，类脂是否也是这些生物体的生长所必需的。如果是这样的话，破坏类脂代谢将减少人皮肤上鳞斑霉的数目，使得与鳞斑霉有关的人皮肤疾病，包括头皮屑的严重程度降低。

已经有人描述了得自粃糠状鳞斑霉的脂肪酶(Ran，Y.，T.Yoshiike，和H.Ogawa，Lipase of Malassezia furfur：some properties and theirrelationship to cell growth，J.Medical and Veterinary Mycology(1993)31：77-85；Plotkin，L.I.，L.Squiquera，I.Mathov，R.Galimberti，和J.Leoni，Characterization of the lipase activity of Malasseziafurfur，J.Medical and Veterinary Mycology(1996)34：43-48；Muhsin，T.M.，A.H.Aubaid，and A.H.Al-Duboon，Extracellular enzymeactivities of dermatophytes and yeast isolates on solid media，Mycoses(1997)40：465-469)。然而，没有描述过其它鳞斑霉物种的脂肪酶。

从鳞斑霉中分离出的基因非常少。有克隆的壳多糖合酶基因的实例(Kano，R.T.Aizawa，Y.Nakamura，S.Watanabe，和A.Hasegawa，Chitinsynthase 2 gene sequence of Malassezia species，Microbiol.Immunol.(1999)43：813-815)和编码抗原的基因和cDNA的实例(Lindborg，M.，C.G.M.Magnusson，A.Zargari，M.Schmidt，A.Scheynius，R.Crameri，和P.Whitley，Selective cloning of allergens from the skin colonizingyeast Malassezia furfur by phage display technology，J.Investigative Dermatology(1999)113：156-161；Yasueda，H.T.Hashida-Okado，A.Saito，K.Uchida，M.Kuroda，Y.Onishi，K.Takahashi，H.Yamaguchi，K.Takesako，和K.Akiyama，Identificationand cloning of two novel allergens from the lipophilic yeast，Malassezia furfur，Biochemical and Biophysical ResearchCommunications(1998)248：240-244；Schmidt，M.，A.Zargari，P.Holt，L.Lindbom，U.Hellman，P.Whitley，I.van der Ploeg，B.Harfast，和A.Scheynius，The complete cDNA sequence and expression of thefirst major allergenic protein of Malassezia furfur，Mal f l，Eur.J.Biochem(1997)246：181-185；Rasool，O.，A.Zargari，J.Almqvist，H.Eshaghi，P.Whitley，和A.Scheynius，Cloning，characterizationand expression of complete coding sequences of three IgE bindingMalas sezia furfur allergens，Mal f 7，Mal f 8 and Mal f 9，Eur.J.Biochem(2000)267：4355-4361；Crameri，R.R.Kodzius，Z.Konthur，H.Lehrach，K.Blaser，和G.Walter，Tapping allergen repertoires byadvanced cloning technologies，Int Arch Allergy Immunol(2001)124：43-47)，其中一个实例与线粒体苹果酸脱氢酶基因具有相似性(Onishi，Y.M.Kuroda，H.Yasueda，A.Saito，E.Sono-Koyama，S.Tunasawa，T.Hashida-Okado，T.Yagihara，K.Uchida，H.Yamaguchi，K.Akiyama，I.Kato，and K.Takesako，Two-dimensional electrophoresis of Malasseziaallergens for atopic dermatitis and isolation of Mal f 4 homologswith mitochondrial malate dehydrogenase，Eur.J.Biochmistry(1999)261：148-154)。然而，没有任何文献报道过从任何鳞斑霉物种分离出编码脂肪酶的多核苷酸序列。

所有引用文献的相关部分均引入本文以供参考；任何文献的引用不可解释为对其作为本发明的现有技术的认可。

除非另外具体指明，否则所有百分比都是按组合物的总重量计。

除非另外具体指明，所有比率都是重量比。

本文中，“包括”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和其它成分。该术语包括术语“由…组成”和“基本上由…组成”。本发明的组合物和方法可包括、由或基本上由基本成分和本发明所述的限制条件以及任何附加的或任选的成分、组分、步骤或所描述的限制条件组成。

在本文中，关于本发明的多肽实施方案或编码多肽的多核苷酸实施方案的“分离的”是指，多肽或多核苷酸存在于其天然存在的复杂细胞环境之外，并且当与合适的调节序列可操纵地连接时，多肽可在不天然表达它的细胞中从多核苷酸表达出来。具体地讲，当应用于多核苷酸(例如DNA)时，“分离的”是指，DNA与其天然存在的复杂细胞环境基本上分离开(即基本上存在于其天然存在的复杂细胞环境之外)，或者其只是存在于与其天然存在的核酸背景不同的核酸背景中(例如当克隆或呈限制片段形式时)。因此，本发明的多核苷酸或多肽可存在于多种载体，和/或多种宿主细胞(或其它环境例如缓冲剂、病毒或细胞提取物)，和/或任何组合物中；对于在本文所用意义上的分离的，这样的载体、宿主细胞或组合物不是本发明多核苷酸或多肽的天然环境的一部分。

在本文中，关于多肽的“基本上如…所示”或“基本上类似于”是指，在结构或氨基酸序列方面相同或足够类似以保持其主要功能；或者关于多核苷酸的“基本上如…所示”或“基本上类似于”是指，在结构或核苷酸序列方面相同或足够类似以编码所需多肽或基因产物。换句话讲，具体的个体序列(氨基酸或核苷酸序列)，例如通过诱变而改变的序列与参考序列的不同在于一个或多个取代、缺失或插入，其净效应是保持参考多肽的生物活性。或者，如果作为遗传密码简并的结果，核苷酸序列编码基本上类似于参考氨基酸序列的氨基酸序列，则核苷酸序列和类似物“基本上类似于”本文所公开的具体核苷酸序列。此外，“基本上类似于”是指，将与针对本发明多肽或得自本发明多肽的肽而产生的抗体反应的多肽。

在本文中，“序列同一性”是通过为了达到最佳比较目的比较两个个体多肽(氨基酸)或多核苷酸序列而确定的(例如可向第一个与第二个氨基酸或核酸序列当中的一个或两个中引入缺口以达到最佳比较，以及为了比较目的可不考虑非同源序列)。在优选的实施方案中，出于比较目的而排列的参考序列的长度是整个参考序列长度的至少50％，更优选至少60％，甚至更优选至少70％、80％或90％(即100％等于整个编码序列)。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸。当在第一个序列中的一个位置被与第二个序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置上是同一的(本文所用的氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的同一性百分比与序列共有的同一位置的数目有关，不考虑为了达到两个序列的最佳比较而引入的缺口的数目以及每个缺口的长度。

本文所提及的生物保藏物将按照国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的布达佩斯条约的有关条款来保存。因此，这些保藏物可按照此专利申请或其子申请所在国家的专利法的要求获得。然而，申请人对保藏机构发放保藏物样品的许可并不意味着或暗示许可实施在对主题专利申请颁发的任何专利或任何其它专利中所要求的发明。提供保藏物仅仅为方便本领域技术人员，而并不是承认实施本发明必须有该保藏材料。在与本文序列的任何描述发生任何冲突的情况下，包含在保藏材料中的多核苷酸的核苷酸序列，以及由此编码的多肽的氨基酸序列与本文一并参考。需要注意的是，本领域技术人员在由此书面公开部分再现申请人的工作时，利用常规技术可以发现任何这样的测序冲突。

A. 多肽

本发明的一个实施方案涉及具有以下氨基酸序列的分离的多肽：基本上如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或与包含在具有保藏号PTA-4086的所有鉴定特征的质粒中的核苷酸序列所编码的氨基酸序列基本上类似的氨基酸序列(在下文中统称为“脂肪酶多肽”)。

在本文中，“多肽”是指由连接在一起以形成肽键，优选形成原前蛋白、前蛋白、蛋白或其片段的氨基酸组成的聚合物。在本文中，“原前蛋白”是指由信号序列、前区和成熟区组成的多肽；“前蛋白”是指由前区和成熟区组成的多肽。根据在重组生产方法中采用的宿主，本发明脂肪酶多肽可以是糖基化或非糖基化的。本发明脂肪酶多肽还可以包括起始蛋氨酸的氨基酸残基。

本发明脂肪酶多肽可通过纯化由天然来源获得，通过从重组工程来源表达而获得，通过化学合成获得，或通过上述方法的组合来获得。

在一个实施方案中，本发明脂肪酶多肽的氨基酸序列与如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或包含在具有ATCC保藏号PTA-4086的所有鉴定特征的质粒中的氨基酸序列具有至少约60％的序列同一性(即同源性)；更优选至少约80％；更优选至少约90％，更优选至少约95％；更优选至少约98％。序列优选具有能够提供脂肪酶活性的序列同一性。

B. 多核苷酸

本发明的另一个实施方案涉及包含以下核苷酸序列的分离的多核苷酸：基本上如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，与包含在具有ATCC保藏号PTA-4086的所有鉴定特征的质粒中的核苷酸序列基本上类似的核苷酸序列，或编码脂肪酶多肽的核苷酸序列(在下文中统称为“脂肪酶多核苷酸”)。

在本文中，“多核苷酸”是指DNA或RNA聚合物，该DNA或RNA聚合物可以是单链或双链的，任选包含能够掺入到DNA或RNA聚合物中的合成、非天然或改变的核苷酸碱基。多核苷酸可以呈分离的片段形式，或作为较大核苷酸序列构建物的组分，该多核苷酸衍生自以一定量或浓度分离至少一次的核苷酸序列，该量或浓度使得能够利用标准生化方法例如利用克隆载体进行该序列及其组分核苷酸序列的鉴定、操作和回收。也能利用包含有关序列的基因组DNA。非翻译核苷酸的序列可以存在于开放读框的5′或3′端，其中相同的非翻译核苷酸序列不干扰编码区的操作或表达。本发明提供的编码多肽的多核苷酸可以自DNA片段和短的寡核苷酸接头或一系列寡核苷酸装配，以提供能够在重组体转录单位中表达的合成基因。

本发明脂肪酶多核苷酸包括具有任何序列的核苷酸序列，只要其能够编码脂肪酶多肽即可。由于在遗传密码中的简并性，任何特定的氨基酸序列可以由许多不同的核苷酸序列编码。本领域技术人员将会理解，遗传密码的简并性使得不同的核苷酸序列能够提供相同的多肽。在某些情况下，制备编码相同的肽，但不同于天然核苷酸序列的核苷酸序列提供了各种优点，包括：易于测序或合成，增加肽的表达，和/或优先选择用于某些密码子的某些异源宿主。这些实际考虑都是众所周知的，并且能够提供有利于本发明的用户的实施方案。因此，我们将清楚地推断出：天然核苷酸序列或列在序列表中的或与引入本文以供参考的核苷酸序列不是唯一的实施方案或由本发明涉及的核苷酸序列。

本发明脂肪酶多核苷酸可呈RNA例如mRNA形式，或呈DNA形式，包括cDNA和DNA，它们可通过纯化由天然来源获得，通过克隆获得，通过化学合成技术获得，或通过上述方法的组合来获得。核酸，尤其是DNA可以是双链或单链的。单链核酸可以是编码链(有义链)或非编码链(反义链)。

在一个实施方案中，本发明脂肪酶多核苷酸的核苷酸序列与如SEQ IDNO：1所示的核苷酸序列或包含在具有ATCC保藏号PTA-4086的所有鉴定特征的质粒中的核苷酸序列具有至少约60％的序列同一性(即同源性)；更优选至少约80％；更优选至少约90％，更优选至少约95％；更优选至少约98％。具有这样的序列同一性的序列优选能够编码脂肪酶多肽。

C. 表达系统

本发明的另一个方面涉及包含脂肪酶多核苷酸的表达系统。这样的表达系统包括包含脂肪酶多核苷酸的重组表达载体，以及用这样的重组表达载体通过遗传工程产生的宿主(“重组宿主”)。

1. 载体

在本文中，“重组表达载体”是指用来表达多核苷酸的DNA构建体，该多核苷酸编码所需多肽(例如脂肪酶多肽)，并包括包含下列组分的装配体的转录亚单位：1)在基因表达中具有调节作用的遗传因子，例如启动子和增强子，2)转录成mRNA且翻译成蛋白质的结构或编码序列，和3)合适的转录和翻译起始和终止序列。使用本领域众所周知的方法，可以构建本发明的重组表达载体。载体的性质不是本发明的关键，并且可以利用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本发明中的可能的载体包括但不限于染色体的、非染色体的以及合成的DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；得自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，病毒DNA，例如牛痘、腺病毒、家禽痘病毒和假狂犬病。其它有用载体包括但不限于：对于哺乳动物细胞来说，有pcDNA-1(Invitrogen，San Diego，CA)和pSV-SPORT 1(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)；对于昆虫细胞来说，有pBlueBac III或pBlueBacHis杆状病毒载体(Invitrogen，San Diego，CA)；和对于细菌细胞来说，有pET-3(Novagen，Madison，WI)。也可以使用任何其它载体，只要它能在宿主中复制和生存。脂肪酶多核苷酸可以存在于可操纵地与调节元件连接的载体中。

可通过各种方法将脂肪酶多核苷酸插入到载体中。通常使用本领域已知的方法将多核苷酸插入到合适的限制性内切核酸酶位点内。这样的方法和其它方法在本领域技术人员的知识范围内。

载体可优选包括表达元件或可操纵地与脂肪酶多核苷酸连接的元件，以提供适当水平的表达。可以使用任何种类的表达元件。表达元件可例如选自启动子、增强子、核糖体结合位点、操纵子和激活序列。这样的表达元件可以是可调节的，例如可诱导的(通过加入诱导物)。有用启动子的代表性实例包括但不限于：LTR(得自逆转录病毒的长末端重复序列)或SV40启动子、大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λP_L启动子，和已知控制在原核或真核细胞或其病毒中的基因表达的其它启动子。表达载体也优选包含翻译起始和转录终止子的核糖体结合位点。表达载体也可以包括扩增表达的适当序列。

在优选的实施方案中，表达载体还包含一个或多个可选择的标记基因以提供用于选择转化的宿主细胞的表型特征，例如用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性或者例如用于原核细胞培养物的四环素或氨苄青霉素抗性。

通过将具有合适的翻译起始和终止信号的脂肪酶多核苷酸插入到具有功能启动子的可操纵读框中，可以构建在细菌用途中有用的表达载体。载体将优选包含一个或多个表型的选择性标记和复制起点，以确保载体的维持和如果需要的话提供在宿主体内的扩增。

作为一个代表性而非限制性的实例，在细菌用途方面有用的表达载体可包含选择性标记和细菌复制起点，该细菌复制起点得自包含众所周知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的市售质粒。这样的市售载体包括例如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM1(Promega Biotec，Madison，Wisconsin，U.S.A.)。这些pBR322“主链”区段与适当的启动子和所要表达的脂肪酶多肽组合。其它合适的细菌载体包括：pQE70、pQE60和pQE-9(Qiagen)；pbs、pD10、phagescript、psiX174、pBluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A和pNH47A(Stratagene)；和ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540和pRIT5(Pharmacia)。

在利用酵母方面有用的表达载体可包含酵母复制起点或整合入宿主染色体DNA中所需要的DNA片段，选择性标记、合适的启动子和增强子，以及任一必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录终止序列和5′侧翼非转录序列。合适的酵母表达载体包括但不限于pPIC3、pPIC3K、pPIC3.5K、pPIC9、pPIC9K、pAO815、pHIL-D2、pHIL-S1、pPICZaA、pPICZaB和pPICZaC(Invitrogen)(优选用于巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))；pYES2(Invitrogen)，和pRS系列载体(STRATAGENE)(优选用于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。

哺乳动物表达载体将优选包含复制起点，合适的启动子和增强子，和任何必需的核糖体结合位点，聚腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5′侧翼非转录序列。得自SV40剪接和聚腺苷酸化位点的DNA序列可用来提供必需的非转录遗传因子。

合适的哺乳动物载体的非限制性实例包括：pWLNEO、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)；pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)。

2. 宿主

可以使用包含脂肪酶多核苷酸以及合适的启动子或控制序列的重组表达载体来转化合适的宿主，从而使重组宿主能够表达脂肪酶多肽。

重组宿主可包括用本发明重组表达载体转化的细菌、真菌、昆虫、植物或哺乳动物细胞。重组宿主还可以包括用重组表达载体转化的整个植物、昆虫或非人哺乳动物。用于体外生产的合适的宿主的代表性实例包括：细菌细胞例如大肠杆菌(E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)和属于假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)的各种物种，然而也可以使用其它宿主作为选择对象；酵母或真菌细胞，例如巴斯德毕赤酵母、博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)和酿酒酵母；昆虫细胞例如果蝇属(Drosophila)和Sf9；动物细胞例如猴子肾成纤维细胞的COS-7细胞系(由Gluzman，CELL，23：175(1981)描述)、C127(小鼠)、3T3(小鼠)、CHO(仓鼠)和BHK(仓鼠)；人细胞例如HeLa。或者，用于在非人哺乳动物中体内生产的重组宿主包括但不限于母牛、山羊、豚鼠、仓鼠、小鼠、猪、兔子和绵羊；昆虫，包括蚕幼虫；和植物。根据本文的教导对适当宿主的选择在本领域技术人员的知识范围内。

在本文中，“转化”是指将DNA引入到细胞或生物体中，以便DNA作为染色体外元件或通过染色体整合体复制。根据所用的宿主细胞，使用适于这样的细胞的标准技术进行转化。如Cohen，S.N.，PROC.NATL.ACAD.SCI.(USA)，69：2110(1972)；Mandel等人，J.MOL.BIOL.，53：154(1970)；和Lilgestrom等人，GENE，40：241-246(1985)中描述的使用氯化钙的钙处理技术一般用于原核细胞或包含大量细胞壁屏障的其它细胞。对于没有这样的细胞壁的哺乳动物细胞，Graham和van der Eb，VIROLOGY，52：456-457(1978)的磷酸钙沉淀方法是优选的。哺乳动物细胞宿主系统转化的一般方面已经由Axel描述在1983年8月16日授权的美国专利4,399,216中。转化到酵母中通常按照Van Solingen，等人，J.BACT.，130：946(1977)和Hsiao，等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.(USA)，76：3829(1979)的方法进行。或者，通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或在BASIC METHODS INMOLECULAR BIOLOGY(D.L. Davis和I.M.Battey，(1986))中提出的电穿孔法可以将表达载体引入到宿主中。然而，也可以使用将DNA引入到细胞中的其它方法，例如通过核注射或原生质体融合。

D. 重组生产脂肪酶多肽

本发明的一个方面涉及通过重组技术制备分离的脂肪酶多肽。该方法包括将脂肪酶多核苷酸插入到合适的重组表达载体(如上所述)中，然后用该重组表达载体(如上所述)转化合适的宿主。然后使用转化的宿主来表达脂肪酶多肽，之后从宿主中纯化出所得脂肪酶多肽。

在一个实施方案中，产生重组脂肪酶多肽，这样从宿主细胞中分泌出脂肪酶多肽(Mileto，D.，S.Brocaa，M.Lotti，M.Takagi，C.Alquati，和L.Alberghina，Characterization of the Candida rugosa LipaseSystem and Overexpression of the Lipl Isoenzyme in a Non-conventionalYeast，Chemistry of Physics of Lipids(1998)93：47-55)。这可通过将得自不同分泌蛋白的信号序列与脂肪酶多肽融合来进行(Qasim，M.A.，P.J Ganz，C.W.Saunders，K.S.Bateman，M.N.G.James，和M.Laskowski，Jr.，Interscaffolding Additivity.Association of P1 Variants ofEglin c and of Turkey Ovomucoid Third Domain with Serine Proteinases，Biochemistry(1997)36：1598-1607)。或者，可在宿主细胞内产生脂肪酶多肽。在该方法的一个实施方案中，脂肪酶多肽是作为融合蛋白的一部分产生的(Tang，S.，K.Sun，G.Sun，T.Chang，和G.Lee，RecombinantExpression of the Candida rugosa lip4 Lipase in Escherichia coli，Protein Expression and Purification(2000)20：308-313)。

在一个优选的实施方案中，该方法包括将用包含脂肪酶多核苷酸的重组表达载体转化的酵母宿主细胞培养。然后用培养的酵母宿主细胞来产生脂肪酶多肽，之后从培养基中纯化出所得脂肪酶多肽。该方法的一个实施方案包括将脂肪酶多核苷酸与酿酒酵母α-因子的基因融合，这样α-因子信号序列(Kurjan，J.，和I.Herskowitz，Structure of a Yeast PheromoneGene(MFα)：A Putativeα-Factor Precursor Contains Four Tandem Copiesof Matureα-Factor，Cell(1982)30：933-943)指导脂肪酶多肽的分泌。

在转化合适的宿主株和宿主株生长至合适的细胞密度之后，通过合适的方法(例如变温或化学诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。

在改变细胞以将脂肪酶多肽分泌到培养基内的另一个实施方案中，可将宿主改变以产生聚集在细胞内的脂肪酶多肽。一般通过离心收获这样的细胞，通过物理或化学方法将细胞破碎，并保留所得粗提物以进一步纯化。

可通过任何适宜的方法破碎用于表达脂肪酶多肽的微生物细胞，包括冷冻-解冻循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂；这样的方法是本领域技术人员众所周知的。

可使用包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水性相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱在内的方法从重组细胞培养物中收集和纯化脂肪酶多肽。如果需要的话，在完成成熟蛋白构型的过程中，可使用蛋白重叠步骤。最后，可使用高效液相色谱法(HPLC)作为最后的纯化步骤。

E. 化学合成脂肪酶多肽

可使用本领域技术人员众所周知的化学合成蛋白的方法，通过化学合成来产生脂肪酶多肽(参见例如Wilce，J.A.，S.G.Love，S.J.Richardson，P.F.Alewood，和D.J.Craik，Synthesis of an analog ofthe thyroid hormone-binding protein transthyretin viaregioselective chemical ligation)。

F. 化学合成脂肪酶多核苷酸

可使用本领域技术人员众所周知的方法，通过化学合成来产生脂肪酶多核苷酸(参见例如Traub，P.C.，C.Schmidt-Dannert，J.Schmitt，和R.D.Schmid，Gene Synthesis，Expression in E.coli and in vitrorefolding of Pseudomonas sp.KWI 56 and Chromobacterium viscosumlipases and their chaperones，Applied Microbiology and Biotechnology(2001)55：198-204)。这样的方法使得能够优化关于宿主特异性条件的基因合成，例如使用密码子。

G. 分离其它脂肪酶基因

可使用脂肪酶多核苷酸来基于多核苷酸序列的类似性分离其它脂肪酶基因。例如，可在下列测定中取代脂肪酶多核苷酸的白色念珠菌(Candidaalbicans)脂肪酶基因来鉴定其它脂肪酶基因：在B.Hube，Stehr，F.，Bossenz，M.，Mazur，A.，Kretschmar，M.，和W.Schafer，SecretedLipases of Candida albicans：Cloning，Characterisation andExpression Analysis of a New Gene Family with at least Ten Members，Arch Microbiol(2000)174：362-74中提出的Southern印迹杂交测定。

H. 筛选脂肪酶抑制剂的方法

本发明还涉及筛选脂肪酶多肽的抑制剂的方法，包括将脂肪酶多肽与候选抑制剂在类脂存在下接触一定时间；然后测定类脂水解。

脂肪酶是将类脂(例如脂肪)水解(分解)成甘油和脂肪酸的酶。在本发明筛选脂肪酶多肽抑制剂的方法中，可使用多种测定类脂水解的方法。这样的方法包括在与候选抑制剂接触之后测定甘油生成的变化。

甘油生成下降或者没有任何甘油生成意味着候选抑制剂抑制了脂肪酶多肽。或者，可将类脂与比色化合物偶联。如果类脂水解，则该系统将由无色转变为例如黄色。没有颜色改变将意味着候选抑制剂抑制了脂肪酶多肽。参见例如Pablo，G.，A.Hammons，S.Bradley，和J.E.Fulton，Characteristics of the Extracellular Lipases from Corynebacteriumacnes and Staphylococcus epidermidis，J.Investigative Dermatology(1974)63：231-238中关于在脂肪酶测定中使用比色底物的描述。

I. 脂肪酶多肽的其它应用

除了用于筛选抗头皮屑活性物质以外，本发明脂肪酶多肽实施方案还具有其它非抗头皮屑应用。例如，在洗衣用洗涤剂领域中众所周知的是，洗涤剂组合物可有利地包含酶系统。这样的酶系统包括纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。本发明脂肪酶多肽实施方案可用于颗粒状和/或液体洗涤剂组合物中。其中可使用脂肪酶多肽的颗粒状和液体洗涤剂组合物实施方案包括在美国专利6,133,220(在2000年10月17日授予The Procter&Gamble Company)和美国专利5,733,473(在1998年3月31日授予TheProcter&Gamble Company)中公开的那些，其中所公开的脂肪酶可用本发明脂肪酶多肽实施方案代替。在另一个实施方案中，除了已经在这样的颗粒状或液体洗涤剂组合物中采用的脂肪酶以外，还可以包括本发明脂肪酶多肽。

下列实施例进一步描述和说明了在本发明范围内的优选实施方案。给出这些实施例仅仅是为了说明本发明，而非解释为限制本发明，因此在不背离本发明精神和范围的条件下，可以对其进行许多改变。

实施例1

该实施例显示了从天然来源纯化脂肪酶多肽。

将M.globosa细胞在具有棉塞的2升玻璃烧瓶中培养，在NewBrunswick Scientific Co.(Edison，NJ)培养器中于200rpm摇动。我们使用500ml mDixon培养基(每升水：36g麦芽提取物(Difco)，20g干燥的牛胆汁(Fluka)，10ml Tween 40(Aldrich)，24g胨(Difco)，2ml甘油(Sigma)，2ml油酸(Baker)，pH调至6.0(用1N HCl)，具有500μg/ml氯霉素(IBI)。在培养物变得不透明(通常需要5-7天)后，将培养物在31°培养1周。然后通过在冷冻的Sorvall^TM RC3CPLUS离心机中以2900rpm离心10分钟来收获细胞。除去上清液，将细胞小丸重悬在50ml 25mM TrisHCl pH8.0中。将细胞转移到50ml锥形管中，在Beckman GS6K离心机中以3750rpm于室温离心10分钟，除去上清液。将细胞在-80°冷冻。将细胞在室温融化，重悬在8ml提取缓冲液(25mM Tris HCl pH8，90mM NaCl，8mM KCl，1mM CaCl₂)/克细胞中。

将细胞悬浮液在室温培养2小时，通过在Lab Rotator(Lab-Line)上旋转来混和，以提取脂肪酶。然后将细胞在Beckman GS6K中以3750rpm离心10分钟，收集上清液。将细胞以类似方式再提取5次，每次都收集上清液。测定各份上清液的脂肪酶活性(见下文)，合并活性提取物。

为了测定脂肪酶活性，我们首先制备底物贮备液，即50mM油酸对硝基苯酯在异丙醇中的溶液。在测定的当天，用25mM MES pH5.5将底物贮备液稀释40倍。测定是在塑料比色杯中进行的，该比色杯具有1ml液体，所述液体包含125μl 1.25mM底物、最高达125μl脂肪酶，其余体积包含25mM MES pH5.5、90mM NaCl、8mM KCl、1mM CaCl₂。将比色杯在室温培养20分钟，向其中加入20μl 2M Tris HCl pH8以提高pH。然后使用Beckman DU^640分光光度计测定在410nm的吸收度。

实施例2

该实施例显示了如何筛选脂肪酶多肽的抑制剂。

在深孔96-孔板(costar^4412)中进行该测定。向每个孔中加入270μl25mM MES，pH5.5，90mM NaCl，8mM KCl，1mM CaCl₂。然后加入10μl在二甲亚砜中稀释3倍的橄榄油(类脂源)。然后加入候选抑制剂(15μl)。之后加入5μl脂肪酶多肽。之后使用盖子覆盖微量滴定板。将该溶液在室温保持1小时，期间在VX-2500Multi-tube Vortexer(Scientific Products)上剧烈摇动。1小时后，将该微量滴定板在离心机中短暂离心以迫使液体集中在孔的底部。

离心后，通过加入50μl 1M Tris HCl pH8.0来提高pH。将一部分(90μl)转移到标准微量滴定板(costar^3596)中，加入90μl甘油检测溶液。该甘油检测溶液含有：100mM Tris HCl pH7.6，10mM MgCl₂，2mM 4-氨基安替比林，3mM N-乙基-N-(3-磺基丙基)-间甲氧基苯胺，1mM腺苷5′-三磷酸酯，20单位/ml过氧化物酶，8单位/ml甘油-3-磷酸酯氧化酶，0.5单位/ml甘油激酶。将该混合物在Lab-Line Lab Rotator上于室温旋转15分钟。测定在540nm的光密度以作为在该测定中产生的甘油的量的指示。为了确定在该测定中产生的甘油的绝对量，可用已知的甘油浓度产生标准曲线。比较在没有候选抑制剂存在的情况下由脂肪酶多肽生成的甘油的量以及在候选抑制剂存在下由脂肪酶多肽生成的甘油的量。至少2倍的依赖于抑制剂的甘油含量降低表明了脂肪酶多肽分解类脂的能力被抑制。

尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但显而易见的是，本领域的技术人员可在不背离本发明的精神和保护范围的情况下作出许多其它的变化和修改。因此有意识地在附加的权利要求书中指出在本发明范围内的所有这些变化和修改。

序列表

<110>宝洁公司(The Procter&Gamble Company)

托马斯.L.道森(Dawson，Thomas)

伊冯娜.M.迪安吉利斯(Deangelis，Yvonne)

凯文.R.约翰通斯(Johnstone，Kevin)

小约瑟夫.R..卡茨文斯基(Kaczvinsky，Joseph)

查尔斯.W.桑德斯(Saunders，Charles)

小理查德.L.沃尔特(Walter，Richard)

<120>新的真菌脂肪酶

<130>新的真菌脂肪酶

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>918

<212>DNA

<213>malassezia globosa

<220>

<221>CDS

<222>(76)..(912)

<223>

<220>

<221>mat_peptide

<222>(76)..()

<223>

<400>1

atgctcttca gtcgctttgt tcttcttgcg ttcggttcgg tggccgccgt ctcggccagc 60

agtatttacg cccgt ggc cgt ggt ggt agc tct acc gac cag cca gtg gca 111

Gly Arg Gly Gly Ser Ser Thr Asp Gln Pro Val Ala

1 5 10

aac cct tac aac acc aaa gag att tct ctg gct gcc ggt ctt gtc cag 159

Asn Pro Tyr Asn Thr Lys Glu Ile Ser Leu Ala Ala Gly Leu Val Gln

15 20 25

caa act tac tgt gac agc acg gaa aat ggt ctg aag att ggc gac agc 207

Gln Thr Tyr Cys Asp Ser Thr Glu Asn Gly Leu Lys Ile Gly Asp Ser

30 35 40

gag ctc ctt tac acc atg gga gag ggt tac gct cgc cag cgt gtc aac 255

Glu Leu Leu Tyr Thr Met Gly Glu Gly Tyr Ala Arg Gln Arg Val Asn

45 50 55 60

atc tat cac tcg cct agc ctt ggt att gct gtg gcc atc gag ggc acg 303

Ile Tyr His Ser Pro Ser Leu Gly Ile Ala Val Ala Ile Glu Gly Thr

65 70 75

aac ctt ttc tcg ctt aac tcg gac ttg cat gat gcg aag ttc tgg caa 351

Asn Leu Phe Ser Leu Asn Ser Asp Leu His Asp Ala Lys Phe Trp Gln

80 85 90

gaa gac ccg aac gag cgt tac atc cag tac tac ccg aag ggt aca aag 399

Glu Asp Pro Asn Glu Arg Tyr Ile Gln Tyr Tyr Pro Lys Gly Thr Lys

95 100 105

ctt atg cac ggt ttc cag caa gcc tac aat gac ttg atg gat gat atc 447

Leu Met His Gly Phe Gln Gln Ala Tyr Asn Asp Leu Met Asp Asp Ile

110 115 120

ttc act gca gtt aag aag tac aag aaa gag aag aat gaa aag cgc gtg 495

Phe Thr Ala Val Lys Lys Tyr Lys Lys Glu Lys Asn Glu Lys Arg Val

125 130 135 140

act gtc att ggc cac tcg ctt ggt gcc gct atg ggt ttg ctt tgc gct 543

Thr Val Ile Gly His Ser Leu Gly Ala Ala Met Gly Leu Leu Cys Ala

145 150 155

atg gac att gag ctg cgt atg gat ggt ggt ctg tac aag acg tac ctg 591

Met Asp Ile Glu Leu Arg Met Asp Gly Gly Leu Tyr Lys Thr Tyr Leu

160 165 170

ttt gga ctt ccc cgt ctt ggt aac cca aca ttt gct tcg ttc gtt gac 639

Phe Gly Leu Pro Arg Leu Gly Asn Pro Thr Phe Ala Ser Phe Val Asp

175 180 185

caa aag att ggc gac aag ttc cac tca att atc aat ggt cgc gac tgg 687

Gln Lys Ile Gly Asp Lys Phe His Ser Ile Ile Asn Gly Arg Asp Trp

190 195 200

gtt cca acg gtg ccg ccg cgc gct ctt ggt tac cag cac cca tct gac 735

Val Pro Thr Val Pro Pro Arg Ala Leu Gly Tyr Gln His Pro Ser Asp

205 210 215 220

tat gtt tgg atc tac cca ggc aac agc acg agc gcg aag ctt tac cct 783

Tyr Val Trp Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Thr Ser Ala Lys Leu Tyr Pro

225 230 235

ggc caa gag aat gtc cac ggt atc ctc act gtt gct cgc gag ttc aac 831

Gly Gln Glu Asn Val His Gly Ile Leu Thr Val Ala Arg Glu Phe Asn

240 245 250

ttt gac gac cac caa ggt atc tac ttc cac acc cag atc ggt gct gtt 879

Phe Asp Asp His Gln Gly Ile Tyr Phe His Thr Gln Ile Gly Ala Val

255 260 265

atg ggt gag tgc cca gct cag gtt ggt gct cat taatga 918

Met Gly Glu Cys Pro Ala Gln Val Gly Ala His

270 275

<210>2

<211>279

<212>PRT

<213>malassezia globosa

<400>2

Gly Arg Gly Gly Ser Ser Thr Asp Gln Pro Val Ala Asn Pro Tyr Asn

1 5 10 15

Thr Lys Glu Ile Ser Leu Ala Ala Gly Leu Val Gln Gln Thr Tyr Cys

20 25 30

Asp Ser Thr Glu Asn Gly Leu Lys Ile Gly Asp Ser Glu Leu Leu Tyr

35 40 45

Thr Met Gly Glu Gly Tyr Ala Arg Gln Arg Val Asn Ile Tyr His Ser

50 55 60

Pro Ser Leu Gly Ile Ala Val Ala Ile Glu Gly Thr Asn Leu Phe Ser

65 70 75 80

Leu Asn Ser Asp Leu His Asp Ala Lys Phe Trp Gln Glu Asp Pro Asn

85 90 95

Glu Arg Tyr Ile Gln Tyr Tyr Pro Lys Gly Thr Lys Leu Met His Gly

100 105 110

Phe Gln Gln Ala Tyr Asn Asp Leu Met Asp Asp Ile Phe Thr Ala Val

115 120 125

Lys Lys Tyr Lys Lys Glu Lys Asn Glu Lys Arg Val Thr Val Ile Gly

130 135 140

His Ser Leu Gly Ala Ala Met Gly Leu Leu Cys Ala Met Asp Ile Glu

145 150 155 160

Leu Arg Met Asp Gly Gly Leu Tyr Lys Thr Tyr Leu Phe Gly Leu Pro

165 170 175

Arg Leu Gly Asn Pro Thr Phe Ala Ser Phe Val Asp Gln Lys Ile Gly

180 185 190

Asp Lys Phe His Ser Ile Ile Asn Gly Arg Asp Trp Val Pro Thr Val

195 200 205

Pro Pro Arg Ala Leu Gly Tyr Gln His Pro Ser Asp Tyr Val Trp Ile

210 215 220

Tyr Pro Gly Asn Ser Thr Ser Ala Lys Leu Tyr Pro Gly Gln Glu Asn

225 230 235 240

Val His Gly Ile Leu Thr Val Ala Arg Glu Phe Asn Phe Asp Asp His

245 250 255

Gln Gly Ile Tyr Phe His Thr Gln Ile Gly Ala Val Met Gly Glu Cys

260 265 270

Pro Ala Gln Val Gly Ala His

275

Claims

1.包含以下氨基酸序列的分离的多肽：

(a)基本上如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；或

(b)与包含在ATCC保藏号PTA-4086中的DNA插入片段所编码的氨基酸序列基本上类似的氨基酸序列。

2.权利要求1的分离的多肽，其中所述氨基酸序列：

(a)与SEQ ID NO：2具有至少60％的序列同一性；

(b)与包含在ATCC保藏号PTA-4086中的DNA插入片段所编码的氨基酸序列具有至少60％的序列同一性。

3.包含以下核苷酸序列的分离的多核苷酸：

(a)基本上如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

(b)与包含在ATCC保藏号PTA-4086中的DNA插入片段基本上类似的核苷酸序列；

(c)编码与包含在ATCC保藏号PTA-4086中的DNA插入片段所编码的氨基酸序列基本上类似的氨基酸序列的核苷酸序列；或

(d)与(a)、(b)或(c)的任一核苷酸序列互补的核苷酸序列。

4.权利要求3的分离的多核苷酸，其中所述核苷酸序列：

(a)与SEQ ID NO：1具有至少60％的序列同一性；

(b)与包含在ATCC保藏号PTA-4086中的DNA插入片段具有至少60％的序列同一性；或

(c)与(a)或(b)的任一核苷酸序列互补。

5.包含权利要求2的核酸序列的核酸载体。

6.包含权利要求3的载体的宿主细胞。

7.制备包含以下氨基酸序列的多肽的方法：

(a)基本上如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，或

(b)与包含在ATCC保藏号PTA-4086中的DNA插入片段基本上类似的氨基酸序列；

所述方法包括将编码所述多肽的核苷酸序列引入到宿主细胞内，在其中多肽能够由核酸表达的条件下培养所述宿主细胞。

8.鉴定脂肪酶抑制剂的方法，所述方法包括将权利要求1的脂肪酶多肽与候选抑制剂在类脂存在下接触一定时间，然后测定类脂水解。