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CN1608078A - 用于卵泡生成的促性腺激素 - Google Patents

用于卵泡生成的促性腺激素 Download PDF

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CN1608078A
CN1608078A CNA028260090A CN02826009A CN1608078A CN 1608078 A CN1608078 A CN 1608078A CN A028260090 A CNA028260090 A CN A028260090A CN 02826009 A CN02826009 A CN 02826009A CN 1608078 A CN1608078 A CN 1608078A
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Abstract

本发明提供一种具有高度唾液酸化和较高功效的卵泡刺激素(FSH)制剂。

Description

用于卵泡生成的促性腺激素
技术领域
本发明涉及促性腺激素领域，特别是它们在辅助生殖技术、排卵诱导、宫腔内人工受精(IUI)和不孕男性患者中的应用。
发明背景
促性腺激素是一组异二聚体糖蛋白，包括卵泡刺激素(FSH)、黄体生成激素(LH)和绒毛膜促性腺激素(CG)。这些激素调节男性和女性的生殖功能。
这些激素中每一种都由两个非共价连接的亚基组成：一个是FSH、LH和hCG共有的α-亚基，另一个是每一种激素独有的，并赋予各种激素生物特异性的β-亚基。
在所有促性腺激素中，每个亚基都有天冬酰胺连接的(N连接的)寡糖侧链。在人激素的共有α-亚基中，它们在位置52和78上连接。在人FSH和CG中，两条N连接的寡糖侧链与β-亚基相连，FSH的连接位置是7和24，而hCG的连接位置是13和30。在人LH中，一个寡糖附着于β-亚基的位置30上。hCG还有另外四条丝氨酸连接的(O连接的)寡糖侧链，它们位于羧基末端部分。
与所有糖蛋白一样，促性腺激素内的寡糖结构发生变化，产生大量在垂体腺内及在循环中找到的同种型。此外，用唾液酸使末端碳水化合物“加帽”的程度有所不同。可基于它们所带的电荷分离同种型，而电荷主要由唾液酸化N连接的寡糖的数目和分布来确定。高度唾液酸化形式的酸性比平均pl更强，称为“酸性”。较低唾液酸化形式具有较高pl，称为“碱性”。
由于它们结构上的差异，促性腺激素同种型与靶细胞受体结合的能力也不同。唾液酸化程度影响它们在循环中存活的能力。对于FSH，一些企业集团已经证实了高度酸性/唾液酸化同种型在动物模型如小鼠和大鼠模型中具有比较长的血浆半衰期(1)。
已经发现，内源性FSH同种型在人体内的图谱是不同的。酸性同种型在体内的半衰期较长，在体外的生物效价较低，它们主要存在于青春期前儿童、性腺机能减退患者以及卵泡期妇女的血清中。相反，较低唾液酸化、碱性较强的同种型在体内的半衰期较短，在体外的生物活性较高，在青春期、GnRH治疗期间以及妇女促性腺激素峰中段左右发现这些同种型(2)。
唾液酸含量较多的FSH同种型循环时间较长，因为末端唾液酸残基“加帽”半乳糖残基，从而防止与肝脱唾液酸糖蛋白受体相互作用，并防止离开循环系统(3)。
与蛋白连接的寡糖(聚糖)部分是支链型，每个末端糖残基称为一个触角。参数Z数值是衡量糖蛋白中碳水化合物部分有多少比例的触角具有带电残基，如唾液酸。脱唾液酸化FSH的Z数值是0。全唾液酸化FSH的Z数值在230至280之间。
用Steelman-Pohley试验在体外评估FSH制剂的功效，该试验在特定条件下将一种制剂增加未成熟大鼠的卵巢质量的能力与国际标准/参考制剂作比较，以国际单位校准(IU)(4)。
许多企业集已经研究了糖基化与唾液酸化作用在影响FSH生物图谱中的作用。
D’Antonio等人评估了由层析聚集得到的酸性(pl＜4.8)和碱性(pl＞4.8)rhFSH同种型在雌性大鼠体内的代谢清除率。如所预测的一样，发现碱性同种型的清除比酸性同种型快(碱性半衰期是0.4小时，酸性是0.9小时)。当在Steelman-Pohley试验中对酸性和碱性形式进行比较时，发现碱性同种型的活性远远低于酸性同种型(碱性：ED50＝0.9微克/大鼠，酸性：ED50＝0.3微克/大鼠)。当以国际单位为基础比较这些同种型时，二者无差异(5)。
Vitt等人进行了一项体外研究，其中比较了四种不同pl的重组人FSH制剂在促使分离小鼠的卵泡尺寸和雌二醇产量增大的能力。结果发现，碱性FSH(pl＝5.0-5.6)能使卵泡生长更快，并得到最大卵泡尺寸，进而是未分级重组FSH。中间(pl＝4.5-5.0)和酸性(pl＝3.6-4.6)FSH制剂在卵泡生长速率和最大尺寸两方面都不如。碱性FSH与其他同种型相比，能在较早期用较低剂量诱导雌二醇分泌。与酸性FSH一起培育的卵泡，不论酸性FSH的浓度是多少，只在很长的培育期之后才能分泌出可测量浓度的雌二醇(6)。
Timossi等人用层析聚集法使人垂体FSH分离出7种具有不同糖基化/酸性的不同组分。测试这些组分在体外引起大鼠粒细胞内芳香酶(产生雌二醇所必需的)和组织型纤溶酶原激活剂(tPA)表达上调的能力。结果发现，生物活性与免疫反应性之比(B/I)随同种型洗脱pH值下降而降低。作者得出的结论是：碱性同种型诱导芳香酶以及组织型溶酶原激活剂mRNA’s和蛋白表达的能力比酸性变体高(7)。
Zambrano等人利用层析聚集法使人垂体FSH分离出9种有不同pl的组分，并用三个免疫测定法和两个体外试验测试了酸性和碱性同种型：由大鼠粒细胞产生雌二醇，以及由表达FSH受体的人胎儿细胞系产生cAMP。生物试验中活性与免疫反应性之比(B/I)在全部生物试验中都随同种型pl的下降而减少(8)。
Zambrano等人在另一项研究中比较了人垂体FSH酸性和碱性同种型的7种组分在异源受体系统(大鼠粒细胞)和同源受体系统(表达人FSH受体的重组人HEK-293细胞)中的结合亲和力。异源受体的结合亲和力随同种型pl的增大而增加，而同源受体则不是这样的情况。HEK-293细胞中cAMP产量也随同种型pl的增大而增加(9)。
研究显示，当以典型卵巢增重试验来评估时，酸性较强的FSH形式在体内的生物活性最高(以质量计)(10，11)。Timossi等人认为，碱性形式在体内的活性可能更大，但因为半衰期较短，所以未能观察到对大鼠卵巢增重的影响。他们检查了两种制剂对快速反应系统的作用：组织型纤溶酶原激活剂活性的上调(12)。作者得出的结论是：酸性电荷分布较少的rhFSH与强酸性FSH制剂相比，具有较高体外生物活性和血浆清除率，能更快地诱导组织型纤溶酶原激活剂的酶活性。
促性腺激素在生殖周期中发挥关键作用，它们的使用是辅助生殖技术，例如体外受精(IVF)或IVF与卵子胞浆内单精子注射结合(IVF/ICSI)和胚胎移植(ET)，以及在自然地或通过宫腔内人工受精(IUI)接受体内受精的不排卵患者中诱导排卵必不可少的。
辅助生殖技术通常用控制性超排卵(COH)来增加妇女配子的数量(13)。COH的标准方案(14)包括一个向下调节的阶段，在这个阶段中，通过给予促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂来抑制内源性促性腺激素，接着的是一个刺激阶段，在这一阶段中，每日给予FSH，通常约150-225IU/天，诱导卵泡发育(卵泡生成)。另一种选择是在自然月经或诱导月经后开始刺激，(通常约在刺激阶段第6天开始)，通过给予GnRH拮抗剂来防止在不适当的时间出现LH峰。当至少有3个卵泡＞16毫米(其中一个是18毫米)时，一次推注给予hCG(5-10,000IU)模拟自然的LH峰并引发排卵。注射hCG后36-38小时定为回收卵母细胞的时间。
一般来说，每日给予约75-150IU剂量FSH诱导排卵。可采用GnRH激动剂与拮抗剂进行下调，虽然次数比辅助生殖技术指数少。在体内受精之前给予hCG模拟LH峰，这可通过定期性交或IUI来实现。
上述关于辅助生殖技术和排卵诱导的典型方案需要在一段较长时间内即平均10天，对于某些患者可长达20天内每日注射促性腺激素。研制有较高功效的FSH制剂可以减少FSH的每日剂量，和/或可以缩短治疗周期(即注射量较少)，和/或可以减少注射次数。因而使辅助生殖技术和排卵诱导方案更方便，也更有利于患者。
另外，使用体外受精的辅助生殖技术可能伴随着不幸事件。例如，不是每一个卵泡都能产生存活的卵母细胞，也不是每一个存活的卵母细胞都能成功受孕，而有些胚胎也可能无法存活。此外，一旦选取了存活胚胎，转移到子宫和着床也有可能不成功。为了最大限度地提高婴儿安全出生的机率，因此希望能刺激多个卵泡的生长和成熟，以确保采集到多个卵母细胞。
相反，排卵诱导的目的是获得不超过3个，最好1个优势卵泡(避免多胎妊娠)。
对于一些接受辅助生殖技术和排卵诱导的患者，当用常规FSH制剂治疗时，其生长卵泡数目会减少。这是辅助生殖技术获得成功的一个限制因素，因为它限制了可以转移和/或低温保藏的胚胎数目。对于进行IUI(关键之处在于获取一个以上卵泡)的患者而言，它也是获得成功的一个限制因素。出现这种反应的患者包括约33至35岁以上的患者、有FSH基线上升、雌二醇基线上升或抑制素b基线下降的患者。
男性的精子形成取决于FSH对塞尔托利细胞的刺激。缺乏FSH能造成少精液症，从而导致不孕症。用常规FSH制剂治疗男性不孕症需要一星期注射3次FSH，最长持续18个月。
一直以来人们寻求研制出一些FSH制剂，其具有较高的刺激卵泡生成的能力。此外，也一直希望获得在治疗患者时能减弱对FSH的反应的新FSH制剂。还希望制成具有较高功效的FSH制剂，从而缩短辅助生殖技术、排卵诱导和男性不孕症治疗方案的时间和/或减少累计剂量和/或减少给药次数。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种用于排卵诱导和COH，特别是与辅助生殖技术联用的促性腺激素制剂。
本发明的第一方面在于提供一种FSH制剂，其中该制剂的Z数值至少是200或约200。
本发明的第二方面在于提供一种FSH制剂，其中该制剂的平均pl小于3.4或3.4。
本发明的第三方面在于提供一种含有FSH的药物组合物，其中FSH的Z数值至少是200或约200。
本发明的第四方面在于提供FSH在刺激卵泡生成中的应用，其中FSH的Z数值至少是200或约200。
本发明的第五方面在于提供FSH在制备用于刺激卵泡生成的药物中的应用，其中FSH的Z数值至少是200或约200。
本发明的第六方面在于提供一种诱导人患者产生卵泡的方法，该方法包括把FSH给予该患者，其中FSH的Z数值至少是200或约200。
本发明的第七方面在于提供一种制备Z数值至少是200或约200的FSH制剂的方法，该方法包括以下步骤：
·在2，3-唾液酸转移酶存在下使FSH与唾液酸供体反应；
·选择表达重组FSH的合适细胞型；
·在有利于高水平唾液酸化作用的条件下培养表达FSH的细胞，优选是重组细胞；
·用层析技术分离具有较高Z数值的FSH同种型。
本发明的第八方面在于提供FSH在治疗男性不孕症中的应用，其中FSH的Z数值至少是200或约200。
本发明的第九方面在于提供FSH在制备用于治疗男性不孕症的药物中的应用，其中FSH的Z数值至少是200或约200。
本发明的第十方面在于提供一种治疗人患者的男性不孕症的方法，该方法包括把FSH给予该患者，其中FSH的Z数值至少是200或约200。
附图说明
图1所示为用GlycoSepC柱洗脱从rFSH释放出来的聚糖的层析图；柱4.6×100mm，装有带聚合物层的二乙烯苯树脂(5米)，流动相是20∶80的乙腈∶水，5分钟至21分钟期间醋酸铵(500mM)的每分钟线性梯度是0.25％，21分钟至61分钟期间醋酸铵(500mM)的每分钟线性梯度是0.525％。X轴表示滞留时间，以分钟为单位，Y轴表示信号强度，以毫伏(mV)为单位。
图2所示为接受FSH酸性和碱性同种型直至第7天的患者在第8天每种尺寸等级的卵泡数(Y轴)。波浪形线表示酸性同种型的结果，斜线表示碱性同种型的结果。
图3所示为接受FSH酸性和碱性同种型直至第7天的患者在第10天每种尺寸等级的卵泡数(Y轴)。波浪形线表示酸性同种型的结果，斜线表示碱性同种型的结果。
图4所示为给予最后一剂FSH酸性和碱性同种型之后患者体内的平均FSH血清水平。X轴表示第一次注射FSH以后的时间，以小时为单位，Y轴表示免疫反应的血清浓度，以IU/L表示。方形()为注射酸性同种型后的血清浓度；菱形()为注射FSH碱性同种型后的血清浓度。采用日本DaiichiIsotope Laboratory提供的试剂盒通过免疫测定法例如放射免疫测定法测定血清浓度。
图5所示为成熟人FSHα-亚基的氨基酸序列。
图6所示为成熟人FSHβ-亚基的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明人意外地发现高度唾液酸化FSH同种型与较低唾液酸化同种型相比，在诱导人患者产生卵泡方面具有更好的功效。使用本发明的FSH制剂以较低累计剂量FSH就可达到相同或更好的临床效果。
本发明人已经发现，当用相同量的酸性FSH和碱性FSH(以IU计)治疗患者时，用酸性FSH治疗的患者体内生长卵泡的数目大大增多。
以常规试验测定，当用相同量的酸性FSH和碱性FSH(以质量计)治疗患者时，用酸性FSH治疗的患者体内生长卵泡的数目也明显增多。
当用常规FSH制剂治疗时，一些患者的生长卵泡数目减少。这是辅助生殖技术获得成功的限制因素。呈现这种反应的患者包括约33至35岁以上的患者、有FSH基线上升、雌二醇基线上升或抑制素b基线下降的患者。本发明的FSH制剂可以每日注射1次，或者隔一天注射1次，以引发比常规制剂更好的卵巢反应。这样，增加了这些患者怀孕的机率。
本发明人还意外地发现，这些功效更好、能减少给药次数的FSH制剂可用Z数值至少是200或约200，优选至少是210或约210、220或约220、230或约230、240或约240、250或约250、260或约260、270或约270、280或约280以及290或约290的FSH制成，优选次序随Z数值的增大而增加(在这些数值之间的Z数值当然属于本发明范围之内)。要诱导卵泡生成，通常会每日给予约75-600IU/天剂量的常规FSH制剂。对于大多数患者而言，为了获得与每日注射相同的临床效果，可以每隔一日给予相同累计剂量的常规FSH制剂(15)。术语“较少给药次数”指可给予FSH制剂的次数比每隔一日少，就卵泡总体积而言，能获得与每日或每隔一日给予常规制剂相同的临床效果。
术语“酸性”和“碱性”普遍用于指具有不同唾液酸化程度的FSH制剂。因为唾液酸呈酸性，所以分子的唾液酸化程度越高，pl越小。利用等电位聚集、层析聚集、或者其他分离方法如离子交换层析法、快速蛋白液相层析法(FPLC)和高效液相层析法(HPLC)(16)，可将同种型混合物分离成酸性或碱性组分，最好基于Z数值。
术语“唾液酸”指任何九碳羧化糖家族的任何成员。唾液酸家族最常用的成员是N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-二脱氧-D-甘油基-D-半乳糖壬酮糖吡喃糖-1-酸，(2-keto-5-acetamido-3，5-dideoxy-D-glycero-D-galactononulopyranos-1-onic acid，一般缩写为Neu5Ac、NeuAc、或NANA))。该家族的第二个成员是N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基被羟基化。第三个唾液酸家族成员是2-酮-3-脱氧-壬酮糖酸(KDN)(17)。此外，还包括其他一些9-取代的唾液酸，例如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙酰基-Neu5Ac等9-O-C1-C6-酰基Neu5Ac，9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-迭氮基-9-脱氧-Neu5Ac。要了解唾液酸家族，请参见例如Varki；Glycobiology2 1992；25-40；Sialic Acids：Chemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，Ed.(Springer-Verlag，New York(1992))。
碳水化合物(也称“聚糖”)部分通过单糖，或者以O-或N-连接的糖苷键与肽骨架相连。当碳水化合物部分被加工后，会出现支链，导致碳水化合物部分有1、2、3、或4(有时更多)个末端糖残基或“触角”。这些碳水化合物部分被命名为一、二、三或四链。参数触角指数(AI)是衡量碳水化合物残基的支链化程度，也是衡量碳水化合物部分三维尺寸的指数。为了测定该参数，以化学方法处理一个糖蛋白，使其释放出全部碳水化合物残基，例如通过与肼加热，或者可用例如糖苷内切酶(N-聚糖酶)使碳水化合物酶裂解(18)。分离碳水化合物混合物。有需要的话，使碳水化合物混合物与一标记物反应，例如放射性标记物、显色标记物(即紫外可见光活性物)、萤光标记物、免疫反应性标记物等。然后，使标记的碳水化合物混合物与唾液酸酶进行脱唾液酸化反应，生成标记的中性碳水化合物混合物(另一种选择是可将标记与脱唾液酸化步骤的顺序反转)。再用可区分不同种类(一、二、三或四链)的层析法从标记的中性碳水化合物混合物中分离出它的组分。基本上可采用任何方法(包括例如厚层或薄层层析法，或者HPLC)进行层析(正相或反相)。另外，分离出来的中性碳水化合物混合物可与试剂反应，使组分具有挥发性，而混合物也可进行气相层析法(GC)。用适合所使用的标记和层析法的方法可实现目测。例如，如果采用萤光标记，可用萤光计检测；如果采用显色标记，可用紫外可见光分光光度计检测。如果没有标记，可用质谱分析来测量波峰和停留时间。用质谱分析或通过与已知标准物比较可确认一、二、三或四支链不同种类的峰。
然后，把层析图中二、三、和四支链碳水化合物的相关峰综合起来进行分析。再将每一种类占总碳水化合物的百分比代入下列公式计算AI：
AI＝2Pdi+3Ptri+4Ptetra
式中，AI是触角指数，Pdi、Ptri和Ptetra分别表示二、三、和四支链碳水化合物占总碳水化合物的百分比。剩余量的其它组分(例如一个触角)可能是存在的，但不会对AI值有重大影响。
触角指数高表示碳水化合物部分支链化程度高，具有很多触角。重组的人FSH的AI值一般约220-280，或者平均约为255。
参数Z数值衡量一个糖蛋白中碳水化合物部分有多少触角具有带电残基，例如唾液酸。为了测定Z数值，如上所述方法，使碳水化合物部分从肽中释放出来，若需要，可带上标记。混合物经离子交换层析法基于电荷分离出各种类。借助上述标记物，或者其他一些方法如质谱法目测洗脱峰。然后，把层析图中带一、二、三、和四个电荷的碳水化合物种类的相关峰综合起来进行分析。再将每一种类占总碳水化合物的百分比代入下列公式计算Z数值：
Z＝P’mono+2P’di+3P’tri+4P’tetra
式中，Z是Z数值，P’mono、P’di、P’tri和P’tetra分别表示带一、二、三、和四个电荷的碳水化合物占总碳水化合物的百分比。
Z数值高表示很多触角有带电残基，因而糖蛋白为高电荷态，若是唾液酸残基，则呈酸性。重组的人FSH的Z数值一般约150至约190，或者平均约为184。
本发明人意外地发现，Z数值高于200或约200的FSH同种型与“相同剂量”(以IU计)的Z数值少于200的FSH同种型相比，在卵泡数目方面更有效。“相同剂量”指的是当以常规体内试验(通过在特定条件下比较能增加大鼠体内卵巢质量的能力)测量不同同种型的FSH量时，IU剂量是相同的。换言之，当把大鼠体内测定为相同IU剂量的不同同种型给予人时，有不同的临床效果。
有递增Z数值的FSH制剂可以通过任何方式来分离。例如，将一批重组FSH进行等电位聚集、或者层析聚集，例如Mulders等人(19)、Zambrano等人(20)和Timossi等人(21)其中之一所述的方法。也可以分离有不同pl平均值的组分。本发明的优选FSH制剂的pl平均值少于3.4或约3.4，更好是少于3.3或约3.3，特别优选是少于3.2或约3.2，优选程度随pl平均值减少而增加。
参数Z数值反映一批FSH唾液酸化平均程度。可能存在这样的情况：Z数值高的FSH制剂仍然可以有很大比例的碱性(较低唾液酸化)种类。这样一些碱性种类可作为FSH受体的拮抗剂，因此是不希望得到的。所含种类的“扩展”可通过等电位聚集或层析聚集来测定。对Z数值进行分析也可知道各种类的扩展情况。制剂适宜含有少于4％或约4％的中性碳水化合物种类(即聚糖部分不带电荷)，以及少于16％或约16％的单唾液酸化种类，而制剂更好是含有少于3％或约3％、少于2％或约2％、或者少于1％或约3％的中性碳水化合物种类，以及少于15％或约15％、少于12％或约12％、少于10％或约10％、少于8％或约8％、或者少于5％或约5％的单唾液酸化种类，优选程度随百分比减少而增加。
由于蛋白上一或多个附加糖基化位点的唾液酸化程度增加而使卵泡生成功效提高的FSH制剂属于本发明的范围之内。通过例如诱变技术用丝氨酸、苏氨酸、赖氨酸或天冬酰胺残基取代FSH蛋白骨架中的残基可引入这样一些位点。实施例7给出可用来产生这些FSH突变形式的方法例子。对于体内糖基化，引入的位点应该是形成下列序列的“N-糖基化位点”：N-X’-S/T/C-X”，其中X’是除脯氨酸外的任何氨基酸残基，X”是可与X’相同或不同，优选不是脯氨酸的任何氨基酸残基，N是天冬酰胺，S/T/C表示可以是丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸，优选是丝氨酸或苏氨酸，最好是苏氨酸的残基。这些FSH分子的酸性同种型(pl≤3.4)在本发明范围之内。这些带有附加糖基化位点的修饰FSH分子在例如WO 01/58493(Maxygen)中有所描述。下列突变是特别优选的：
在β-亚基中：E4N、A70N、L73N、V78N、G100N、Y103N、F19N/121T、L37N/Y39T、D41N/A43T、E55N/A43T、E59N/V61T和R97N/L99T；
在α-亚基中：E9N、F17T、F17N、R67N、V68T、E56N、H83N和F33N/R35T；
其中A是丙氨酸，D是天冬氨酸，E是谷氨酸，F是苯丙氨酸，G是甘氨酸，H是组氨酸，I是异亮氨酸，L是亮氨酸，N是天冬酰胺，R是精氨酸，T是苏氨酸，V是缬氨酸，Y是酪氨酸，而符号“E4N”表示用天冬酰胺(N)取代位置4上的谷氨酸(E)。对于序列编号，人FSHα的氨基酸序列按照图5或SEQ ID NO：1所示的成熟序列编号。人FSHβ的氨基酸序列按照图6或SEQ ID NO：2所示的成熟序列编号。
由于附属肽上一或多个附加糖基化位点的唾液酸化程度增加而使卵泡生成功效提高的FSH制剂也在本发明范围之内。“附属肽”表示包括糖基化位点，并与FSH的α-和/或β-亚基上氨基和/或羧基末端相连而又对所得分子的FSH活性没有不利影响的任何肽。例如，hCG的β-亚基远远大于其他促性腺激素的β-亚基，这是因为本文所指的C末端上约34个附加氨基酸构成羧基末端部分(CTP)。在尿hCG中，CTP含有4种粘蛋白类O-连接的寡糖。该CTP可与FSH的β-亚基，优选在FSH的β-亚基羧基末端上连接，得到一种有FSH活性并有四个附加糖基化位点的分子。这些FSH分子的酸性同种型(pl≤4.4)属于本发明范围之内。WO 93/06844(Washington University)以及Boime等(22)也揭示了这样一些分子。WO 90/09800(Washington University)公开了具有修饰糖基化位点的其他FSH分子。
在本说明书中，带有附加糖基化位点的FSH制剂将以FSHgly+来表示。当加入了附加糖基化位点时，因为参数Z数值已被标准化(它是百分比的总和)，故该参数不能再与“正常的”FSH制剂(即那些有四个糖基化位点的FSH制剂)作比较。当对FSHgly+制剂进行聚糖种类分析时，可参照Z数值的计算方法计算参数Z+数。本发明FSHgly+制剂的Z+数大于200或约200，最好大于210或约210、大于220或约220、大于230或约230、大于240或约240、大于250或约250、大于260或约260、大于270或约270，优选程度随Z+数增大而增加。
本发明FSHgly+制剂的pl值远远低于正常FSH。特别优选的FSHgly+制剂是其功效有所提高的那些制剂，它们的pl平均值少于4.4或约4.4，更好是pl平均值少于4.2或约4.2、少于4.0或约4.0、少于3.8或约3.8、少于3.6或约3.6、少于3.4或约3.4、少于3.3或约3.3以及少于3.2或约3.2，优选程度随pl平均值减少而增加。
本发明的所有实施例优选使用重组FSH。治疗人患者优选使用人重组FSH。本发明的制剂可从常规重组FSH中分离出来，或者它们可从FSHgly+制剂中分离出来。
本发明还提供一种用本发明人称之“强化唾液酸(sialyl boosting)”方法来增加唾液酸含量的方法。如WO 98/31826(Cytel Corporation)所述那样，在唾液酸供体(例如CMP-唾液酸)存在下，用酶(例如糖基转移酶，特别是唾液酸转移酶)处理重组FSH(优选的)或者重组FSHgly+制剂(也是优选的)或者尿FSH，可以进行强化唾液酸。例如，美国专利号5,541,083(University ofCalifornia；Amgen)描述了重组唾液酸转移酶的例子以及产生重组唾液酸的方法。至今记载了至少15种不同哺乳动物的唾液酸转移酶，其中13种的cDNA已被克隆出来。这些cDNA可用来重组产生唾液酸，它们可再应用于本发明的方法中。
所用的唾液酸转移酶能够把唾液酸转移到序列Galβ1、4GlcNAc，它们是作为唾液酸化糖蛋白上末端唾液酸基础的最常见的次末端部分。可使用的唾液酸转移酶是ST3Gal III，它也称为(2，3)-唾液酸转移酶(EC 2.4.99.6)。这种酶催化唾液酸转移到Gal-β-1，3-糖基NAc或Gal-β-1，4-糖基NAc糖苷的Gal上(23)。唾液酸与半乳糖(Gal)残基相连，在两种糖之间形成α连接。糖间的连接位于NeuAc的2位与Gal的3位之间。该特定酶可从大鼠肝脏中分离出来(24)；人cDNA(25)和基因组(26)DNA序列是公知的，因而有利于通过重组表达产生这种酶。在一优选实施例中，唾液酸化方法使用ST3Gal III(最好来自大鼠)、ST3Gal IV、ST3Gal I、ST6Gal I、ST3Gal V、ST6Gal II、ST6GalNAc I、或者ST6GalNAc II，更好是ST3Gal III、ST6Gal I、ST3GalIV、ST6Gal II、或者ST3Gal V，特别优选是来自大鼠的ST3Gal III。
唾液酸转移酶的量最好在每毫克FSH 50或约50mU或以下的范围内，更好是在每毫克FSH 5-25或约5-25mU的范围内。优选条件下唾液酸转移酶的浓度为10-50或约10-50mU/ml，FSH的浓度为2或约2mg/ml。
用编码唾液酸转移酶的基因转染表达FSH的重组细胞或其他细胞(所用的基因在此细胞内表达)，可以产生富集于酸性同种型的FSH。所述基因可含有基因组编码序列(即有内含子)或者它可含有cDNA编码序列。另一种选择是，如果细胞的基因组含有编码唾液酸转移酶的内源性序列，可将能引起表达FSH的构造物插入细胞的基因组内。通过插入在细胞内具有活性的，并可操作地连接于编码唾液酸转移酶的内源性序列的非天然调节序列，可以增加唾液酸转移酶的表达。也可以插入可操作地连接于编码唾液酸转移酶的序列的扩增基因，以实现扩增基因组唾液酸转移酶编码序列。这些操作可利用同源重组方法来进行，例如参见EP 0505500(Applied Research Systems ARSHolding N.V.)。
通过选择公知有利于唾液酸化的、表达重组FSH的细胞也可增加FSH制剂的唾液酸化程度。这些细胞包括表达高水平唾液酸转移酶的选定垂体细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这样一种细胞中制备的FSH制剂还可用上述分离方法分离出高度唾液酸化同种型。
在有利于高水平唾液酸化的条件下培养表达FSH，优选重组FSH的细胞也可增加FSH制剂的唾液酸化程度。在培养液中加入神经氨酸酶和/或用来合成唾液酸的直接胞内前体，例如乙酰甘露糖胺，可有利于唾液酸化。在这些培养条件下制备的FSH制备也可用上述分离方法分离出高度唾液酸化同种型。
如果采用强化唾液酸方法，希望FSH制剂在酶唾液酸化之前有较高的AI，从而为唾液酸残基的附着提供很多触角。FSH的AI最好应大于220或约220，更好是AI大于240或约240，特别优选AI大于约270。例如，用伴刀豆球蛋白-A(Con-A)衍生琼脂糖的亲和层析法(洗脱液为甲基葡萄糖梯度)，或者用制备HPLC可分离有较高AI的FSH。
本发明强化唾液酸的方法适宜应用于已被修饰引入一或多个附加糖基化位点的FSH制剂(FSHgly+制剂)。这些FSHgly+制剂在进行强化唾液酸之前也可分离出有较高AI的组分。
本发明包括由在不能发生唾液酸化的细胞中表达FSH，再使FSH进行强化唾液酸而制成的FSH制剂。例如，WO 99/13081(Akzo Nobel N.V.)描述了在单细胞真核生物盘基网柄菌属，特别是带有附加糖基化位点的突变蛋白中表达野生型FSH和突变蛋白。盘基网柄菌属不能使聚糖唾液酸化。本发明包括通过使在盘基网柄菌属中表达的野生型FSH或突变蛋白进行强化唾液酸而制成的FSH制剂。
在强化唾液酸之后，用离子交换层析法、等电位聚集、层析聚集、或伴刀豆球蛋白-A(Con-A)层析法可分离出带有所希望的唾液酸化程度的FSH制剂。
本发明FSH的Z数值至少是200或约200，更好是至少210或约210，特别优选是至少约220，最好是至少约230、240、250、260或270，优选程度随Z数值增大而增加。全唾液酸化FSH的Z数值是230或约230至280或约280，取决于触角指数。本发明极好的FSH制剂的Z数值为230或约230至280或约280。
本发明的FSH制剂要制成始终带有至少200或约200的Z数值，或如上所述的优选Z数值。用本领域技术人员公知的许多方法可将本发明的FSH从同种型混合物中分离出来。例如，可用等电位聚集、层析聚集或离子交换层析法基于pl分离同种型。分析不同组分的唾液酸含量，并选用所希望的组分。实施例给出了离子交换层析法的合适条件的例子。这些分离方法可用于将本发明的FSH从常规产生的rFSH或尿FSH(uFSH)中分离出来，或者可通过唾液酸转移酶处理或者上述提到的其他重组技术从FSH中分离出所希望的同种型。
本发明其中一方面提供一种含有本发明FSH(即Z数值至少是200或约200，优选的最小Z数值如上所列出的数值)的药物组合物。这样一些药物组合物可与例如排卵诱导或辅助生殖技术结合用来刺激卵泡生成。因为本发明的FSH在诱导多卵泡发育和成熟特别有效，所以它特别适用于希望采集多卵母细胞的辅助生殖技术中。
另一种选择是，谨慎地选择合适剂量，本发明的FSH可用于在排卵诱导中诱导产生单卵泡，或者在IUI中诱导产生少量卵泡(最多约3个卵泡)，以便进体内受精。与常规FSH制剂相比，降低FSH剂量或减少给予剂量的次数都可以实现产生单卵泡。例如，在排卵诱导中，本发明的FSH制剂可每3天给予225-400IU，或者更少剂量，取决于患者的反应。患者的反应可通过超声波检查法确定。
本发明的FSH通常配制成药物组合物，该药物组合物还含有稀释剂或赋形剂。本领域技术人员知道适合用于配制药物组合物的各种稀释剂或赋形剂。
本发明的FSH通常配制成易于溶解的固体形式单位剂量，从而形成适合肌内或皮下使用的无菌注射溶液。固体一般用冻干法制成。典型的赋形剂和运载体包括蔗糖、乳糖、氯化钠、缓冲剂如磷酸二氢钠和磷酸氢钠。注射溶液可于使用前才用水稀释而成。
本发明的FSH还可制成注射溶液，其包括上述列出的任何一种赋形剂和缓冲剂，以及本领域技术人员公知的其他赋形剂和缓冲剂。
本发明的FSH可用在控制性超排卵(COH)中。COH的标准方案(27)包括一个向下调节的阶段，在这个阶段中，通过给予促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂使内源性黄体生成激素下调，接着的是一个刺激阶段，在这一阶段中，每日给予卵泡刺激素(FSH)，通常为75-600或约75-600IU/天，优选150-225或约150-225IU/天，诱导卵泡发育(卵泡生成)。另一种选择是在自然月经或诱导月经后开始用FSH刺激，再给予GnRH拮抗剂(通常在刺激阶段约第6天开始)。当至少有3个卵泡＞16毫米(其中一个是18毫米)时，一次推注给予hCG(5-10,000IU)模拟自然的LH峰并诱导排卵。一般而言，在第10天至第14天中任一天注射hCG，但也可以在较后时间注射hCG，取决于满足上述参数的时间。注射hCG后36-38小时定为回收卵母细胞的时间。
本发明的FSH也可用于排卵诱导和IUI中。例如，在自然月经或诱导月经后开始以本发明的FSH制剂刺激，每日剂量为75-150IU。当1或3个卵泡的直径达到至少16毫米时，一次推注给予hCG诱导排卵。通过定期性交或IUI进行体内受精。
因为相对于已知的FSH制剂，本发明的FSH具有较好的功效，故诸如上述方案可采用较低IU剂量FSH，和/或缩短FSH刺激周期来修改这些方案，能够在卵泡数和卵泡的存活能力方面获得相同或更好的反应。例如，采用本发明的FSH制剂，以50-150或约50-150IU FSH，优选50-100或约50-100IUFSH，更好是50-75或约50-75IU FSH可达到足够的卵泡生成。通常，每日或每半日给予FSH。给药周期可少于14天或约14天，优选少于12天或约12天，更好是少于11天或约11天或者10或约10天。
对于排卵诱导，本发明的FSH制剂可以25-150IU FSH/天，优选以50-125IU FSH/天的剂量给予。
要治疗男性不孕症，本发明的FSH制剂可每星期给予3次150-300IU，直至通过定期性交或辅助生殖技术产生的精子达到足够进行受精的水平。
本发明人还发现，因为Z数值至少是200或约200的FSH制剂具有较好的功效，所以给予这些制剂的次数可以比Z数值少于200的FSH制剂少。(为了清楚描述起见，以术语FSH+200、FSH+210、FSH+220等来表示Z数值在约200-210或约200-210、211-220或约211-220、221-230或约221-230等范围内的FSH制剂。)这意味着对于通常要求每日给予例如150IU常规FSH以达到足够的卵泡生成的患者而言，只需要例如每3日给予225IU FSH+200，或者每4日给予300IU FSH+200，就可获得同样的效果。因为相对于常规FSH制剂，FSH+200的功效较高，所以在呈现良好反应的那些患者中可降低上面引述的剂量。对于Z数值不少于230或约230的本发明FSH制剂，可每5日、每6日或每7日给予注射，取决于患者的反应。该反应可通过超声波检查法和/或通过测量血清雌二醇水平来评估。其他合适的方案如下：每2日100IUFSH+210；每3日200IU FSH+210；每4日275或300IU FSH+210；每2日80-100IU FSH+220；每3日180-200IU FSH+220；每4日260-300IU FSH+220；每2日75-100IU FSH+230；每3日170-200IU FSH+230；每4日250-300IU FSH+230；每5日275-400IU FSH+250；每6日375-450IU FSH+250；每7日450-525IUFSH+250。
本文所用关于卵泡生成效果的术语“较高的功效”包括例如当与一个或多个以相同剂量(IU/IU)治疗的患者体内卵泡数和/或卵泡存活能力相比，该个体的卵泡数和/或卵泡存活能力有任何可测到的改善或提高，方法如常规试验中测定大鼠卵巢增重，或者测定Z数值少于200的FSH制剂那样。这种改善或提高最好具有统计学意义，p值优选小于0.05。测定具有统计学意义的结果的方法已为本技术领域公知和有记载，可采用任何一种合适的方法。
以下，将以下列非限制性的实施例对本发明作进一步描述。
实施例
实施例1 Z数值的测定
根据聚糖谱图可以测定糖蛋白的Z数值。
在100℃下使重组人FSH与肼反应5小时，用Oxford GlycoSciencesGlycoPrep1000全自动分析仪或同类仪器可将聚糖部分释放出来。
用带玻璃珠涂层的柱将聚糖类与未反应的肼和氨基酸酰肼分离。用醋酸钠试剂洗脱出聚糖类。
用醋酐使聚糖类乙酰化。用混合床离子交换柱除去过量试剂。将任何未还原的聚糖类收集于稀释的醋酸盐缓冲溶液中。
在0.5米过滤器(Oxford GlycoSciences)上收集聚糖类，并使其冻干。在酸性条件下，使干燥聚糖类与带有萤光团(例如2-氨基苯甲酰胺)的还原剂在65℃反应120分钟，使该干燥聚糖类带上标记。
用亲水吸收膜将标记聚糖类与过量试剂分离，聚糖类保留在吸收膜上。用水回收聚糖类，冻存至层析分离。
通过阴离子交换层析法分离标记聚糖类。按以下步骤进行层析程序：
·柱是GlycoSepC柱，4.6×100mm，装有带聚合物层的二乙烯苯树脂(5米)；
·流动相的流速是0.4毫升/分钟；
流动相A：乙腈(层析梯度)
流动相B：醋酸铵500mM pH4.5
流动相C：超纯水
·用萤光计检测，设定λ激发：330nm，λ发射：420nm；
·在下列洗脱条件下洗脱：
初始条件：20％流动相A，80％流动相C
从5至21分钟流动相B为线性梯度(每分钟0.25％)，流动相A恒定保持20％
从21至61分钟流动相B为线性梯度(每分钟0.525％)，流动相A恒定保持20％
·柱的温度保持在30±2℃。
聚糖类按照它们的带电情况分中性、一、二、三和四个唾液酸基而洗脱出来。典型的层析图见图1。
按照停留时间的范围把所得到的层析图上的峰分组，停留时间对应于表1列出的唾液酸化程度。
    表1  从rFSH释放出来的聚糖类的停留时间和电荷数
    停留时间(分钟)   聚糖类     电荷数
    2至4   中性     0
    15至21   一个唾液酸基     Pmono
    21至35   二个唾液酸基     Pdi
    35至45   三个唾液酸基     Ptri
    45至52   四个唾液酸基     Ptetra
每一组糖的结果均以不同组的聚糖(中性、一、二、三和四个唾液酸基)占总面积的百分比表示，Z数值由不同糖类(Pglycan)的比例计算：
Z＝P’mono+2P’di+3P’tri+4P’tetra
实施例2 触角指数(AI)的测定
如实施例1所述，通过肼解作用从肽骨架释放出聚糖，然后用2-氨基苯甲酰胺使这些糖类带萤光标记。
2-氨基苯甲酰胺标记的聚糖于37℃下在含有20mM氯化钙的250mMpH5.5醋酸铵中用唾液酸酶(霍乱弧菌)酶解脱唾液酸化18小时。起始量为100微克rhFSH的聚糖使用约0.05U唾液酸酶。
脱唾液酸化聚糖真空干燥，于-20℃下储存至用制备反相HPLC分离，条件如下：
·柱是GlycoSepR柱；
·流动相的流速是0.7毫升/分钟；
洗脱液A：醋酸铵50mM pH6.0
洗脱液B：含8％乙腈的醋酸铵50mM pH6.0
·用萤光计检测，设定λ激发：330nm，λ发射：420nm；
·柱的温度：30℃。
干燥样本在装入柱之前用洗脱液A(200微升)重建：加入50微升该溶液。
采用下列梯度：
t＝0(分钟)  55％A；45％B
t＝15(分钟) 55％A；45％B
t＝70(分钟) 0％A；100％B
t＝75(分钟) 0％A；100％B
t＝76(分钟) 55％A；45％B
用电喷雾质谱(ESMS)和基体辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)确认二、三和四个的触角峰。
结果以二个触角、三个触角和四个触角的相对百分比表示，100％是全部聚糖的总和。然后按下列公式计算AI：
AI＝2Pdi+3Ptri+4Ptetra
式中，AI是触角指数，Pdi、Ptri和Ptetra分别表示二、三、和四支链碳水化合物占总碳水化合物的百分比。
实施例3基于唾液酸化程度使FSH分离出不同组分
用DEAE琼脂糖FF的阴离子交换层析法使重组FSH分离出酸性和碱性组分。
·所用的柱装有DEAE琼脂糖FF树脂：对于实验级纯(约60毫克整体蛋白)，柱为Φ1.6×20厘米(XK Pharmacia或等同物)，对于较大规模级纯，柱为Φ3.4×40厘米(Vantadge Amicon或□□物)；
·流动相的流速是150-250厘米/小时；
平衡缓冲液1：2M Tris-HCl pH7.0±0.1；
平衡缓冲液2：25mM Tris-HCl pH7.0±0.1，导电率是2.15±1.5mS/cm；
洗脱缓冲液1：25mM Tris pH7.0±0.1，35mM氯化钠，导电率是5.8±0.4mS/cm(这种缓冲液洗脱较强碱性的同种型)；
洗脱缓冲液2：25mM Tris pH7.0±0.1，150mM氯化钠，导电率是18.3±0.5mS/cm(这种缓冲液洗脱较强酸性的同种型)；
再生溶液：0.5M氢氧化钠，1M氯化钠；
储存溶液：10mM氢氧化钠
·柱的温度保持在23±3℃或5±3℃。
按以下方法制备装入柱内的FSH：
整体冷冻rhFSH在5±3℃下解冻。待解冻完成后，按下列比例用2MTris-HCl pH7.0±0.1稀释溶液(每毫升树脂3-4毫克rhFSH，以276.4nm处的光密度估算)：1份缓冲液配79份整体rhFSH。Tris-HCl的终浓度是25mM。用1M HCl调pH至7.0±0.1。
先用3床体积(BV)0.5M氢氧化钠再用6BV水冲洗制成柱。用4-5BV平衡缓冲液1冲洗进行平衡操作，直至测到的pH达到约7。再用7-8BV平衡缓冲液2继续冲洗。
将按上述方法制成的一个rhFSH样本装入柱内。完成装柱后，用3BV平衡缓冲液1冲洗柱。
然后，开始用洗脱缓冲液1洗脱，当吸光值(276.4nm)开始上升时，开始收集碱性组分，持续至20±1床体积。然后，将洗脱液换成洗脱缓冲液2，当吸光值(276.4nm)开始上升就开始收集酸性组分，持续至3±1床体积。
接着，用装有YM3膜(用于碱性组分)和YM10膜(用于酸性组分)的超滤细胞型8400(Amicon或等同物)将组分超滤浓缩。所有操作在5±3℃下进行。
实施例4  比较FSH同种型的临床研究
评估两批实验性rhFSH在志愿者上的比较功效。
如上面实施例3中所述，用离子交换层析法使rhFSH分离出两种组分，从而得到两种FSH制剂。批号A定为“酸性”，Z数值为220(即实施例3的酸性组分)，而批号B定为“碱性”，Z数值为160(即实施例3的碱性组分)。
采用大鼠卵巢增重的常规试验，在批号A和B的安瓿中加入FSH至各含有约150IU FSH。
两种批号的特性列于表2中。应当注意，因为这些瓶子以IU为单位加入FSH，所以碱性批号B安瓿中FSH的实际量约是酸性批号A的250％(约24微克对约9微克)。
表2临床研究中所用批号FSH的特性
  批号A“酸性”   批号B“碱性”
每安瓿的FSH含量   8.7微克/安瓿   23.8微克/安瓿
比生物活性   19,753IU/毫克   7,386 IU/毫克
Z数值   220   160
触角指数(AI)   274   237
比生物活性的计算是将活性(以IU表示)除蛋白重量。
由32个绝经前妇女志愿者组成一组患者。这些患者通过每日接受注射达必佳(decapeptyl)(0.1毫克)使垂体下调。14天后，进行超声波检查，在不存在胞囊的情况下，用批号A或批号B的rFSH(150IU/天)开始刺激。每日以超声波检查法和血清雌二醇浓度来评估卵泡生长。
在FSH刺激阶段中，卵泡发育，直径逐渐增大。在刺激的第8天和第10天测量各个患者的卵泡，并计算卵泡数，记录属于0-10mm、11-15mm和16-25mm尺寸等级的卵泡数。图2所示为接受酸性和碱性同种型治疗的患者在第8天每种尺寸等级的平均卵泡数/患者。图3表示在第10天所作的同一种图形。
研究结果显示，碱性组中卵泡尺寸随着时间有规律地长大，而酸性组中产生第二组卵泡，稍稍迟于第一组，结果卵泡形成增长很快，大约是碱性组的2倍。第二组卵泡的尺寸从第8天至第10天增大。结果是：用“酸性”FSH治疗的患者在第10天平均共有18个卵泡大于11mm，而用“碱性”同种型治疗的患者在第10天平均仅有11个卵泡大于11mm。
“酸性”组中卵泡的平均总数是28，而“碱性”组是19。
用超声波检查法测定每个患者的平均总卵泡体积(TFV)。接受“酸性”FSH的组的TFV比接受“碱性”FSH的组高30％。
同注射的蛋白质量所预测一样□通过放射性免疫测定法测得“碱性”组患者的FSH血清水平较高；然而，与250％的给予差别，该差别仅仅约30％(见图4)，这与酸性同种型有较高代谢耐受性相一致。
实施例5基于触角指数(AI)使FSH分离出不同组分
以伴刀豆球蛋白-A(Con-A)衍生琼脂糖的HPLC或亲和层析法可分离出具有比正常触角指数高的FSH制剂。
实施例6用唾液酸转移酶进行“强化唾液酸”
将重组人FSH(“起始材料”；10毫克)溶于浓度为4.3毫克/毫升缓冲液(0.1M HEPES，pH 7.5)中。向该溶液加入100mU/ml重组大鼠唾液酸转移酶(ST3Gal III)以及作为唾液酸供体的20mM胞苷-5’-一磷酸盐-N-乙酰神经氨酸(CMP-NeuAc)。另一种选择是唾液酸供体可在CMP-唾液酸合成酶存在下用20mM NeuAc和2mM CMP原位产生。反应在37℃培育24小时。用实施例3所述的技术把富集于唾液酸的组分离出来。
进行强化唾液酸也可使用由实施例5制成的有较高触角指数的FSH组成的起始材料。
另外，进行强化唾液酸可使用相对于常规重组FSH已经有较高Z数值的FSH起始材料。这些起始材料可用实施例3的技术分离。
实施例7 FSH突变体的产生
把人FSH的α-和β-亚基的cDNA亚克隆至pDONR载体(Invitrogen)。使用QuikChangeTM定点诱变试剂盒(Stratagene)在FSH的α-和β-亚基中引入N-连接的糖基化位点。QuikChangeTM系统使用两种含有所希望突变的合成寡核苷酸引物。使用以下寡核苷酸对引入N-连接的糖基化位点：V78N是CC TTGTAT ACA TAC CCA AAC GCC ACC CAG TGT CAC和GTG ACA CTG GGTGGC GTT TGG GTA TGT ATA CAA GG，A70N是GC TGT GCT CAC CATAAC GAT TCC TTG TAT ACA TAC C和GGT ATG TAT ACA AGG AAT CGTTAT GGT GAG CAC AGC，D41N/A43T是GAT CTG GTG TAT AAG AACCCA ACT AGG CCC AAA ATC CA和TGG ATT TTG GGC CTA GTT GGGTTC TTA TAC ACC AGA TC，G100N是TGT ACT GTG CGA GGC CTG AACCCC AGC TAC TGC TCC和GGA GCA GTA GCT GGG GTT CAG GCC TCGCAC AGT ACA，E56N是G AAC GTC ACC TCA AAC TCC ACT TGC TG和CA GCA AGT GGA GTT TGA GGT GAC GTT C，以及F17T是CAG GAAAAC CCA ACC TTC TCC CAG CC和GG CTG GGA GAA GGT TGG GTTTTC CTG。利用ABI PRISM BigDyeTM Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle测序试剂盒确认突变cDNA的DNA序列，再以ABI PRISM 310基因分析仪进行分析。
使用GATEWAY载体转换系统(Invitrogen)把pCI哺乳动物表达载体(Promega)转为GATEWAY目的载体。用GATEWAYTM克隆技术(Invitrogen)把α-和β-突变体与野生型亚基一起亚克隆至pCI表达载体。pCI表达载体含有人细胞巨化病毒即刻早期(immediate-early)增强子/启动子(用来调控插入基因的表达)□基因上游内含子(用来启动表达)以及插入基因下游的猴病毒40晚期多聚腺苷酸信号(用来终止转录)。pCI中E56N和F17T α-突变体与pCI中野生型FSH β共转染，而pCI中A70N、G100N、V78N和D41N/A43T β-突变体与pCI中野生型α-亚基共转染。作为对照，使pCI中FSH的野生型β-亚基与pCI中α-亚基共转染。用磷酸钙方法(例如，参见WO 96/07750中描述)把质粒瞬时转染至HEK293细胞(ATTC，CRL-10852)。此外，使含有野生型β-亚基或V78N β-突变体的pCI质粒与pCI中野生型α-亚基共转染。也可以将质粒瞬时或稳定地转染至CHO细胞中。转染后一天将培养液换成含1微克/毫升胰岛素(Invitrogen，18140-020)、6.8纳克/毫升亚硒酸钠(Sigma，S5261)和12.2纳克/毫升柠檬酸铁的DMEM/F12(Invitrogen，11320-033)。转换培养液之后一天，收集条件培养液，4℃下以约800xg离心5分钟去除任何细胞残余。移走上清液，并使其在Biofuge fresco(Heraeus Instruments)中16,000xg离心5分钟，然后经0.45m Acrodisc过滤器(Gelman Sciences，4184)过滤进一步澄清培养液。在澄清的细胞抽提物中加入1M pH7.4 Tris，至终浓度50mM Tris，加入Tween20至终浓度0.1％Tween20。
用免疫亲和层析法从细胞抽提物提纯FSH突变体，层析法使用以二乙烯基砜固定的抗FSH单抗衍生而来的琼脂糖(免疫树脂抗FSH-单抗-二乙烯基砜-琼脂糖)。这些树脂可用本领域技术人员公知的方法制备，例如参见WO88/10270的描述。
在4℃下用平衡缓冲液平衡树脂，所述平衡缓冲液由0.1M Tris-HCl、0.3MpH7.5氯化钠缓冲液组成。柱装有大量IU FSH(通过放射性免疫测定法，(RIA)，相当于柱总FSH结合容量的80-90％。
用平衡缓冲液(同上)洗脱出非停留的蛋白，直至洗脱液的OD280低于0.02。
在4℃下用1M氨水溶液从免疫树脂中洗脱出被吸收的突变FSH。4℃下合并得到相当于约4倍免疫树脂体积的洗脱液，加入冰醋酸调pH值至9.0，收集后立即将溶液置于Amicon装置(膜截留分子量为10,000Da)中超滤，浓缩成小体积。
然后，使浓缩的突变FSH溶液进行反相HPLC步骤，使用装有紫外光检测仪和制备梯度发生器的Waters Prep LC 500A液相层析仪。装入柱之前，先将溶液的pH值调至约5.6。再将溶液装入C18反相柱(Prepak 500 C18cartridges Waters)，该反相柱已于室温下先用0.05M pH5.6醋酸铵缓冲液平衡。流速为100毫升/分钟，在280nm处监测洗脱液。
用流动相中异丙醇最高是50％的梯度洗脱出突变FSH。经分析气相层析法(GPC)和放射性免疫测定法(RIA)检查组分。在低于40℃的温度下真空蒸馏除去有机溶剂，溶液冷存和冻干。
如实施例3所述，使在CHO细胞中表达的突变FSH制剂进行离子交换层析，以便分离出Z+数大于180、190、200、210、220、230、240、250和更高的组分。
如实施例6所述，使在CHO细胞或HEK293细胞中表达的突变FSH制剂进行强化唾液酸。经过强化唾液酸之后，参照实施例3的方法使突变FSH进行离子交换层析，以便分离出Z+数大于180、190、200、210、220、230、240、250和更高的组分。
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14.for example，a technique is described in EP 0 170 502(Serono Laboratories，Inc.).
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27.for example，a conventional technique is described in EP 0 170 502(SeronoLaboratories，Inc.).
序列表
<120>用于卵泡生成的促性腺激素
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.0
<210>1
<211>92
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro
1               5                   10                  15
Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys
            20                  25                  30
Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu
        35                  40                  45
Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser
    50                  55                  60
Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr
65                  70                  75                  80
Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
                85                  90
<210>2
<211>111
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1               5                   10                  15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys
            20                  25                  30
Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
        35                  40                  45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro
    50                  55                  60
Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr
65                  70                  75                  80
Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val
                85                  90                  95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu
            100                 105                 110

Claims (39)

1.一种FSH制剂，其特征在于：所述制剂的Z数值至少是200或约200。
2.如权利要求1所述的FSH制剂，其特征在于：所述制剂的Z数值至少是210或约210。
3.如权利要求1所述的FSH制剂，其特征在于：所述制剂的Z数值至少是220或约220。
4.如权利要求1所述的FSH制剂，其特征在于：所述制剂的Z数值至少是230或约230。
5.如权利要求1所述的FSH制剂，其特征在于：所述制剂的Z数值至少是240或约240。
6.如权利要求1所述的FSH制剂，其特征在于：所述制剂的Z数值至少是250或约250。
7.如权利要求1所述的FSH制剂，其特征在于：所述制剂的Z数值至少是260或约260。
8.一种含有FSH的药物组合物，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是200或约200。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是210或约210。
10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是220或约220。
11.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是230或约230。
12.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是240或约240。
13.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是250或约250。
14.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是260或约260。
15.如上述权利要求8至14中任一项所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物用于控制性超排卵中。
16.FSH制剂在卵泡生成中的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是200或约200。
17.如权利要求16所述的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是210或约210。
18.如权利要求16所述的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是220或约220。
19.如权利要求16所述的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是230或约230。
20.如权利要求16所述的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是240或约240。
21.如权利要求16所述的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是250或约250。
22.如权利要求16所述的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是260或约260。
23.FSH在制备用于卵泡生成的药物中的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是200或约200。
24.如权利要求23所述的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是210或约210。
25.如权利要求23所述的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是220或约220。
26.如权利要求23所述的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是230或约230。
27.如权利要求23所述的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是240或约240。
28.如权利要求23所述的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是250或约250。
29.如权利要求23所述的应用，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是260或约260。
30.一种制备Z数值至少是200或约200的FSH制剂的方法，其特征在于：
所述方法包括在2，3-唾液酸转移酶存在下使FSH与唾液酸供体反应的步骤。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是210或约210。
32.如权利要求30所述的方法，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是220或约220。
33.如权利要求30所述的方法，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是230或约230。
34.如权利要求30所述的方法，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是240或约240。
35.如权利要求30所述的方法，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是250或约250。
36.如权利要求30所述的方法，其特征在于：所述FSH的Z数值至少是260或约260。
37.如权利要求30至36中任何一项所述的方法，其特征在于：所述唾液酸供体是胞苷-5’-一磷酸盐-唾液酸(CMP-唾液酸)。
38.如权利要求30至37中任何一项所述的方法，其特征在于：所述唾液酸转移酶是大鼠ST3Gal III。
39.一种制备Z数值至少是200或约200的FSH制剂的方法，其特征在于：所述方法包括离子交换层析法步骤。
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